CN104436158A - Apelin-13在治疗糖尿病肾病中的应用 - Google Patents

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黄昆
陈红
焦丽华
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Abstract

本发明提供了一种用于治疗糖尿病肾病的药物，该药物是Apelin-13，它是由13个氨基酸组成的短肽。本发明揭示了Apelin-13能有效降低肾小球系膜细胞系HBZY-1和SV40以及Akita小鼠肾皮质细胞中HDAC1的表达水平从而抑制组蛋白ac-K，ac-H3K9和ac-H3K18的乙酰化，进而抑制由高糖引起的炎症因子MCP-1，ICAM-1和VCAM-1的水平的升高，最终抑制Akita小鼠由糖尿病引起的肾小球过度肥大和肾小球系膜的增大。本发明发现Apelin-13能够以降低组蛋白的乙酰化为靶点，能作为治疗糖尿病肾病的药物。

Description

Apelin-13在治疗糖尿病肾病中的应用
技术领域
本发明属于生物药学领域，涉及治疗糖尿病肾病的药物。
背景技术
近年来中国已成为全球糖尿病发病率高速增长的地区之一。随着糖尿病病人人数的急剧增多，糖尿病肾病已经成为晚期肾脏疾病的主要原因，并且是引起糖尿病病人发病和死亡的主要原因(参见Susztak，K，Bottinger,EP：Diabeticnephropathy：a frontier for personalized medicme.J Am Soc Nephrol2006；17(2)：361-367.)。
糖尿病肾病作为糖尿病严重并发症之一，其最早表现为肾脏增大，随着病程增长，肾小球毛细血管逐渐出现基底膜增厚，系膜细胞增生，系膜基质增多；进一步发展可出现蛋白尿、肾小球硬化性病变和肾小管间质纤维化，最后导致肾衰竭。探索治疗糖尿病肾病的有效治疗方法和药物是领域长期以来的努力目标。
Apelin是1998年由日本学者Tatemoto等利用反向药理学的方法从牛胃的分泌物中提取并纯化出的孤儿G蛋白偶联受体-血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ)的天然配体(参见张宝红等，Apelin-新发现的孤儿G蛋白偶联受体APJ的天然配体[J]。国外医学·生理、病理科学与临床分册，2003，23(6)：591-593)。Apelin是一个由77个氨基酸组成的蛋白质前体，在体内可以进一步分解成具有生理功能的由36、17、13或12个氨基酸组成的短肽(分别命名为Apelin-36、Apelin-17、Apelin-13和Apelin-12)，然后与APJ受体结合以发挥生理作用。其中Apelin-13(QRPRLSHKGPMPF)的生物活性最高，其生理功能包括调节葡萄糖的利用、血压和食物的摄取。
发明内容
本发明的任务是提供一种用于治疗糖尿病肾病的药物。
实现本发明的技术方案是：本发明提供的这种用于治疗糖尿病肾病的药物是Apelin-13，它是由以下13个氨基酸组成的短肽：
Pyr-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
所述的Apelin-13为序列表中序列1所示的由13个氨基酸组成的短肽。本发明使用固相多肽合成仪合成了apelin-13，合成后的apelin-13使用高效液相色谱纯化后，经质谱鉴定其序列正确。本发明研究了apelin-13在对糖尿病肾病发挥作用中对肾脏组蛋白乙酰化的影响。本发明发现Apelin-13能有效降低肾小球系膜细胞系HBZY-1和SV40以及Akita小鼠肾皮质细胞中HDAC1的表达水平从而抑制组蛋白ac-K，ac-H3K9和ac-H3K18的乙酰化，进而抑制由高糖引起的炎症因子MCP-1，ICAM-1和VCAM-1的水平的升高，最终抑制Akita小鼠由糖尿病引起的肾小球过度肥大和肾小球系膜的增大。本发明发现Apelin-13能够以降低组蛋白的乙酰化为靶点，在制备治疗糖尿病肾病药物中具有极大的应用价值。本发明研究发现Apelin-13可以有效降低糖尿病引起的肾脏中组蛋白乙酰化水平升高，进而抑制肾脏炎症因子基因的过度激活，从而降低由糖尿病引起的肾小球增大和肾脏系膜的扩张，为Apelin-13在制备治疗糖尿病肾病的药物中奠定了基础。本专利申请在具体实施方式部分披露了本发明的具体实验结果。根据本发明所揭示的结果，以Apelin-13作为活性成分加上药学上可接受的载体，可以制成用于治疗糖尿病肾病的药物。多肽Apelin-13可以调节葡萄糖的利用、血压和食物的摄取。本研究发现揭示Apelin-13可以抑制一型糖尿病小鼠(Akita)的肾脏中由高糖引起的组蛋白的乙酰化水平升高，进而抑制炎症因子基因的过度激活，从而降低由糖尿病引起的肾小球增大和肾脏系膜的扩张，为Apelin-13在制备治疗糖尿病肾病的药物中奠定了基础。本发明研究了Apelin-13在对糖尿病肾病发挥作用中对肾脏组蛋白乙酰化的影响。糖尿病患者中的高糖环境会导致肾脏病变，出现肾脏增大，肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜细胞增生，系膜基质增多，蛋白尿等症状。Apelin具有扩张血管、减少抗利尿激素释放、降低血压、调节垂体激素释放、调节葡萄糖的利用、血压和食物的摄取等生物作用。
附图说明
图1正常小鼠和Akita小鼠的肾脏组织染色；
图2注射Apelin-13后Akita小鼠肾皮质中的组蛋白乙酰化水平变化；
图3注射Apelin-13后Akita小鼠肾皮质中的炎症因子的变化水平；
图4大鼠系膜细胞HBZY-1的组蛋白乙酰化和炎症因子的变化水平；
图5小鼠系膜细胞MES13的组蛋白乙酰化和炎症因子的变化水平。
具体实施方式
下面结合具体实验，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。Akita小鼠购于南京大学动物模型研究中心，Apelin-13按照标准的固相多肽合成步骤合成。本发明使用固相多肽合成仪合成了apelin-13，其序列为：Pyr-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe，合成后的apelin-13使用高效液相色谱纯化后，经质谱鉴定其序列正确。
实验1：Akita小鼠尾静脉注射Apelin-13抑制糖尿病引起的肾脏功能异常。
具体操作：九周龄的小鼠分为三组：正常小鼠组、Akita小鼠组和Akita小鼠注射Apelin组。正常小鼠组和Akita小鼠组尾静脉注射磷酸盐缓冲液每天两次，Akita小鼠注射Apelin组按照每千克体重注射400pM的Apelin-13每天两次。
在小鼠20周龄时取肾脏测重，并收集血液。在取肾脏24h前，收集小鼠尿液。血清白蛋白和球蛋白含量分别使用相应的试剂盒检测(上海复兴长征医学科学有限公司)。尿液中的肌氨酸酐和总蛋白量使用肌氨酸酐试剂盒测量(上海复兴长征医学科学有限公司)。
结果如表1所示，糖尿病小鼠的肾脏重量、肾脏／体重值、蛋白尿、血清白蛋白／球蛋白和肾小球滤过率与正常组相比显著性升高，在注射Apelin-13后，这些指标均显著地下降致接近正常水平。
Table1.注射Apelin-13对各项生理指标的影响
*p<0.05与正常小鼠相比；#p<0.05与Akita小鼠相比，n＝9-11／组.
实验2：Akita小鼠尾静脉注射Apelin-13降低糖尿病引起的肾脏组织病变。
具体操作：小鼠肾脏用石蜡包埋，切成5μM厚的切片。切片用periodicacid-schiff and hematoxylin(PASH)法染色观察。每只小鼠用OlympusBX60显微镜观察35-40个肾小球，肾小球的横断面面积用ImagePlus6.0软件分析，并将平均值归一到对照组的小鼠得到最终结果。
IV型胶原蛋白在肾小球中的积累的用抗IV型胶原蛋白的抗体进行免疫组织化学染色观察。
结果如图1所示，在糖尿病小鼠中出现了显著的肾小管损伤，包括肾小管增大、系膜基质积累和肾小球基底膜增厚(见图1A)。在注射Apelin-13小鼠中，这些病变显著减少。
糖尿病小鼠中肾小球面积与正常组相比显著增大，注射Apelin-13组小鼠的肾小球面积显著性的降低(见图1B)。
肾小球中胶原蛋白IV在糖尿病小鼠中升高了1.9倍，注射Apelin-13组小鼠的肾小球IV型胶原蛋白的积累得到抑制(见图1C-D)。
实验3：注射Apelin-13降低糖尿病引起的小鼠肾皮质组蛋白乙酰化水平升高。
具体操作：提取新鲜分离的小鼠肾脏皮质并提取蛋白，20μg总蛋白样品通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上，用相应的乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9、ac-H3K18和ac-H3K23以及H3的抗体检测目标蛋白在各组小鼠之间的变化情况，并用Quantity One 1-D软件进行定量分析。
结果如图2糖尿病肾病小鼠(Akita小鼠)肾皮质中的乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9、ac-H3K18和ac-H3K23的水平与正常组升高了2.1、3.3、9.7和2.5倍。在给Apelin-13治疗后，乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9、ac-H3K18和ac-H3K23的水平显著性地降低至接近正常组水平(见图2A-B)。
实验4：注射Apelin-13降低糖尿病引起的小鼠肾皮质中炎症因子的水平升高。
具体操作：新鲜分离的小鼠肾脏皮质并提取蛋白，80μg总蛋白样品通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上，用相应的炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS以及β-actin的抗体检测目标蛋白在各组小鼠之间的变化情况，并用QuantityOne 1-D软件进行定量分析。
结果如图3糖尿病肾病小鼠肾皮质中的炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS的水平与正常组相比升高了7.8、2.3和4.0倍。在给Apelin-13治疗后，炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS的水平显著性地降低(见图3A-B)。
实验5：Apelin-13可以降低大鼠系膜细胞HBZY-1由于高糖引起的组蛋白乙酰化水平升高和炎症。
具体操作：收集HBZY-1细胞，超声裂解提取总蛋白。20g总蛋白用SDS-PAGE分离，用相应的乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9和ac-H3K18以及H3的抗体检测目标蛋白在各组之间的变化情况，并用Quantity One1-D软件进行定量分析。提取HBZY-1细胞的总RNA，并反转为cDNA，用相应的引物进行小鼠的炎症因子Mcp-1、Icam-1和Vcam-1基因的进行实时定量PCR来分析目标基因在个细胞处理之间的表达情况。
结果如图4在高糖条件下培养的HBZY-1细胞的乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9和ac-H3K18水平与正常条件下培养的细胞相比显著性地升高，在给以Apelin-13后，乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9和ac-H3K18水平随着给以Apelin-13浓度的升高而下降(见图4A-B)。同时，在高糖条件下培养的HBZY-1细胞的炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS的mRNA水平分别升高了1.8、1.6和3.7倍，在给以Apelin-13后，炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS的mRNA水平显著性地下降至接近正常水平(见图4C)。
实验6：Apelin-13可以降低小鼠系膜细胞MES13由于高糖引起的乙酰化水平升高和炎症。
具体操作：收集MES13细胞，超声裂解提取总蛋白。20g总蛋白用SDS-PAGE分离，用相应的乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9和ac-H3K18以及H3的抗体检测目标蛋白在各组之间的变化情况，并用Quantity One1-D软件进行定量分析。提取MES13细胞的总RNA，并反转为cDNA，用相应的引物进行小鼠的炎症因子Mcp-1、Icam-1和Vcam-1基因的进行实时定量PCR来分析目标基因在个细胞处理之间的表达情况。
结果如图5在高糖条件下培养的小鼠系膜细胞MES13的乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9和ac-H3K18水平与正常条件下培养的细胞相比分别升高了2.0、32和83倍，在给予Apelin-13后，乙酰化组蛋白ac-K、ac-H3K9和ac-H3K18水平随着给以Apelin-13浓度的升高而下降。同时，在高糖条件下培养的HBZY-1细胞的炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS的mRNA水平与正常条件下培养的细胞分别上升了1.3、3.2和1.7倍，在给予Apelin-13处理后，炎症因子MCP-1、ICAM-1和iNOS的mRNA水平显著性地下降至接近正常水平。
糖尿病患者中的高糖环境会导致肾脏病变，出现肾脏增大，肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜细胞增生，系膜基质增多，蛋白尿等症状。研究表明，Apelin具有扩张血管、减少抗利尿激素释放、降低血压、调节垂体激素释放、调节葡萄糖的利用、血压和食物的摄取等生物作用。本研究发现Apelin-13可以有效降低糖尿病引起的肾脏中组蛋白乙酰化水平升高，进而抑制肾脏炎症因子基因的过度激活，从而降低由糖尿病引起的肾小球增大和肾脏系膜的扩张，为Apelin-13在制备治疗糖尿病肾病的药物中奠定了基础。
<110>  华中科技大学
<120>  Apelin-13在治疗糖尿病肾病中的应用
<160>  1    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  13
<212>  PRT
<213>  牛
<400>  1
Pyr Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe
1              5               10    
 

Claims (3)

1. Apelin-13在制备用于治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述的Apelin-13为序列表中序列1所示的由13个氨基酸组成的短肽。
2.一种用于治疗糖尿病肾病的药物，其特征在于以Apelin-13为活性成分，所述的Apelin-13为序列表中序列1所示的由13个氨基酸组成的短肽。
3.一种用于治疗糖尿病肾病的药物制剂，由作为活性成分的Apelin-13和药学上可接受的载体组成，所述的Apelin-13为序列表中序列1所示的由13个氨基酸组成的短肽。
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