CN103479656A - 柴胡皂苷d在制备治抗肝纤维化疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了柴胡皂苷d在制备治抗肝纤维化疾病药物中的应用，属于医药技术领域。本发明的目的是提供柴胡皂苷d在治疗肝纤维化症状中所表现的药理学活性及相关机制。柴胡皂苷d具有较好的抗肝纤维化作用，其作用机制可能与提高超氧化物歧化酶活性、减少氧自由基的生成、抑制TGF-β1信号通路的活化有关。
Description
技术领域
本发明涉及柴胡皂苷d（SS-d）的用途，具体地说，是涉及在制备治抗肝纤维化疾病药物中的用途。
背景技术
化合物SS-d属于五环三萜类齐果烷型衍生物，其结构式为 
该化合物的分子式为C42H68O13，分子量为780.98，白色粉末状。该化合物可由柴胡根部提取制得，已知其具有抗炎、抗肿瘤、抗肾肝纤维化等药理作用。
肝纤维化是各种致病因子导致肝内结缔组织异常增生，细胞外基质蛋白过度沉淀形成纤维瘢痕的病理过程，是许多慢性肝脏疾病的最终结果，再进一步发展常常会导致肝硬化、肝功能衰竭或者门脉高压。肝纤维化是肝硬化的前期病变，是可逆性病变，但目前仍缺少疗效确切的抗肝纤维化药物，因此寻找有效的克服肝纤维化的药物具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供SS-d的新用途，即在制药中的新应用。
实际上，本发明涉及SS-d在制备治抗肝纤维化疾病药物中的应用。
为了更好的理解本发明的实质，下面将用SS-d的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
采用猪血清免疫法建立大鼠肝纤维化模型，实验分为6组：正常对照组、模型组、高中低剂量SS-d用药组及秋水仙素（Col）用药组。放射免疫分析法测定大鼠血清透明质酸酶（HA）、层粘连蛋白（LN）和III型前胶原（PCIII）的水平。分光分析法检测标本中超氧化物歧化酶（SOD）活性和羟脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）的含量。荧光定量PCR和Western blot检测肝组织中TGF-β1 mRNA和蛋白表达的变化。
所述高中低剂量SS-d用药组中SS-d用量为20、10、5mg/kg大鼠；所述Col用药组中Col用量为0.1mg/kg大鼠。
成功构建了免疫性大鼠肝纤维化模型，模型鼠中血清HA、LN和PCIII显著高于正常对照组（P<0.01），SS-d可以剂量依赖性的抑制模型组血清中HA、LN和PCIII肝纤维化指标的升高（P<0.05）。与模型组比较SS-d可以剂量依赖性的减低肝组织中Hyp和MDA的含量，同时也剂量依赖性的升高SOD的活性（P<0.05）。荧光定量PCR和Western blot检测结果显示SS-d可以剂量依赖性的下调模型鼠肝组织中TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。
本发明优点在于：SS-d具有较好的抗肝纤维化作用，其作用机制可能与提高SOD活性、减少氧自由基的生成、抑制TGF-β1信号通路的活化有关。
附图说明
附图1是TGF-β1蛋白的Western blot检测；
附图2是TGF-β1蛋白的相对表达量；与模型鼠组比较**，P<0.01，Col作为阳性对照。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
柴胡皂苷d（SS-d）购白中国中药鉴定所（纯度>98%），秋水仙碱（colchicine，Col）购白昆明股份制药有限公司，Tri-zol购白分子探针公司，荧光定量检测PCR试剂盒购白天根生化科技（北京）有限公司，TGF-β1、GAPDH抗体购白美国Santa Cruz公司。
1.2 实验动物、分组以及免疫性大鼠肝纤维化模型的建立
Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重（140±15）g，购自上海市实验动物中心，所有大鼠按清洁级动物分笼喂养，饲养环境通风、安静。60只Wistar大鼠随机分成6组，正常对照组（n=10）、模型组（n=10）、高中低剂量SS-d用药组（20、10、5 mg/kg，每组10只）及Col用药组（0.1 mg/kg，n=10）。本发明采用注射猪血清法对大鼠进行免疫性肝纤维化造模：注射无菌猪血清（3 ml/kg），1 次/3 d，共6周。造模成功后给药组每天2次腹腔注射给药，共6周，颈椎脱臼法处死大鼠进行后续实验。
1.3 血清透明质酸酶（HA）、层粘连蛋白（LN）和III型前胶原（PCIII)的检测
抽取的3 ml血液，3 000 r/min离心15 min分离上清，放射免疫分析法测定HA、LN和PCIII，试剂盒购自南京建成生物技术研究所，严格按照说明书操作。
1.4 肝组织羟脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的检测
处死动物后，取出0.5 g肝组织，用冷生理盐水制成10%的组织匀浆，严格按照南京建成生物技术研究所试剂盒的说明书操作，测定肝组织Hyp、MDA含量和SOD活性的变化。
1.5 肝组织TGF-β1基因表达的荧光定量PCR检测
取50～60 mg肝组织匀浆，按照Trizol和反转录试剂盒说明书操作，提取细胞总RNA和反转出cDNA的第一链，按照荧光定量检测PCR试剂盒说明书操作使用ABI 7000荧光定量PCR仪检测TGF-β1基因的mRNA表达。TGF-β1基因：上游引物5'-TGGAAACCCACA ACGAAATC-3'，下游引物5'-CTA AGG CGAAAG CCCTCAAT-3'；内参照GAPDH基因：上游引物5'- GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游引物5'-GGAA-GATGGTGATGGGATT-3'，反应条件为：95°C 15 s，60°C 1min，30个循环。Ct值说明基因扩增达到阈值的循环数，故Ct值越小说明该基因的表达就越多，根据内参的Ct值可以计算出△Ct值，△Ct值=目的基因Ct值－内参基因Ct值，△△Ct值=△Ct值（处理组）一△Ct值（对照组），△△Ct值可以间接反映出的基因的相对表达水平，△△Ct值越小也说明该基因的表达就越多，目的基因的表达量采用2一△△Ct评估。
1.6蛋白免疫印迹分析
取50～60 mg肝组织匀浆，1×SDS上样缓冲液裂解细胞，95°C 10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，8%～12% SDS-PAGE胶电泳，电转移蛋白至PVDF膜，在含5%脱脂奶粉的TBST中浸PVDF膜1小时封闭非特异性结合，加入TGF-β1蛋白特异性一抗（1:1 000）4°C过夜，加入HRP标记的二抗（1:5 000）窒温1 h，最后加入发光底物X-ray曝光显示目的蛋白条带。扫描曝光胶片，Bio Rad凝胶成像仪分析软件测定各蛋白条带密度值，目的蛋白与内参GAPDH的比值为蛋白表达相对定量值。
1.7 统计分析
实验数据连续住资料以± s表示，应用SPSS12.0统计软件处理数据，两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 柴胡皂苷D（SS-d）对肝纤维化血清检查指标的影响
造模完成后，大鼠尾静脉取血测定肝纤维化血清学指标（HA、LN和PCIII）显示其显著高于正常对照组（P<0.01），说明造模成功。从表1可以看出柴胡皂苷D可以剂量依赖性的抑制模型组中肝纤维化血清学指标的升高（P<0.05）。秋水仙素（Col）作为阳性对照，结果显示其亦抑制了模型组肝纤维化血清学指标的升高（P<0.01）。
表1 SS-d对肝纤维化大鼠血清HA、LN和PCIII的影响（ng/ml）
| 组别 | n | HA | LN | PCIII |
| 对照组 | 10 | 132.64±21.66 | 4.21±0.85 | 34.51±6.47 |
| 模型组 | 10 | 326.78±42.10 a | 9.76±1.13 a | 98.61±12.42 a |
| SS-d处理组 | 30 | |||
| 高剂量 | 10 | 210.13±24.32 ac | 6.11±1.03 ac | 61.88±7.65 ac |
| 中剂量 | 10 | 246.34±30.21 ac | 7.02±0.95 ac | 72.28±8.94 ac |
| 低剂量 | 10 | 264.61±33.77 ab | 7.66±1.24 ab | 78.64±11.34 ab |
| Col处理组 | 10 | 223.47±31.65 ac | 6.46±0.85 ac | 63.52±9.82 ac |
注：与对照组比较a P<0.01。与模型组比较b P< 0.05；c P<0.01。
2.2 柴胡皂苷D（SS-d）对肝纤维化大鼠肝组织羟脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
与模型组比较柴胡皂苷D可以剂量依赖性的减低肝组织中Hyp和MDA的含量，同时也剂量依赖性的升高SOD的活性（P<0.05）。秋水仙素（Col）作为阳性对照，也显示了具有降低模型组肝组织中Hyp、MDA的含量和升高SOD活性的作用（P<0.01）。
表2 SS-d对肝纤维化大鼠血清Hyp、SOD和MDA的影响
| 组别 | n | Hyp（μg/ml） | SOD（U/ml） | MDA（nmol/ml） |
| 对照组 | 10 | 9.34±1.76 | 214.23±25.64 | 6.52±1.07 |
| 模型组 | 10 | 32.18±4.22 b | 64.34±7.23 b | 22.62±3.16 b |
| SS-d处理组 | 30 | |||
| 高剂量 | 10 | 15.66±3.04 bd | 178.65±14.23 ad | 8.48±1.15 ad |
| 中剂量 | 10 | 18.34±3.67 bd | 142.38±9.54 bd | 12.28±1.83 bd |
| 低剂量 | 10 | 24.67±2.14 bc | 86.77±12.61 bc | 17.61±2.14 bc |
| Col处理组 | 10 | 14.47±1.69 bd | 186.45±12.83 ad | 8.52±1.06 ad |
注：与对照组比较a P<0.05；b P< 0.01。与模型组比较c P< 0.05；d P<0.01。
2.3 柴胡皂苷D（SS-d）对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1基因表达的影响
荧光定量PCR结果显示柴胡皂苷D可以剂量依赖性的下调肝纤维化模型鼠肝组织中TGF-β1 mRNA的表达（P<0.05）。阳性对照秋水仙素（Col）也减低了模型组肝组织中TGF-β1 mRNA的表达量（P<0.01）。见表3。
表3 SS-d对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1基因表达的影响
| 组别 | n | 2一△△Ct值 |
| 对照组 | 10 | 0.112±0.034 |
| 模型组 | 10 | 0.634±0.076 b |
| SS-d处理组 | 30 | |
| 高剂量 | 10 | 0.216±0.047 ad |
| 中剂量 | 10 | 0.334±0.061 bd |
| 低剂量 | 10 | 0.487±0.114 bc |
| Col处理组 | 10 | 0.209±0.048 ad |
注：与对照组比较a P<0.01；b P<0.01。与模型组比较c P< 0.05；d P<0.01。
2.4 柴胡皂苷D（SS-d）对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达的影响
正常大鼠肝组织中仅见少量TGF-β1表达，而模型鼠TGF-β1蛋白表达量显著性升高（P<0.01），SS-d可以剂量依赖性的抑制模型鼠肝组织中TGF-β1的上调。见图1和图2，SS-d下调了肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1蛋白的表达。
3 讨论
血清透明质酸酶（HA）、层粘连蛋白（LN）和III型前胶原（PCIII）是临床上衡量肝脏炎症活动度、纤维化程度的重要检测指标，其血清含量与肝纤维化程度相一致，上述因子主要由慢性炎症所导致的肌成纤维细胞和肝星形细胞产生，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，比肝活检更能完整的反映出肝纤维化病情的全貌。羟脯氨酸（Hyp）是机体内构成胶原的非必需氨基酸，其在肝组织中含量的变化可以间接反映出组织中胶原的合成状况。因此，本发明使用上述四个指标监测SS-d对肝纤维化的抑制活性，结果显示SS-d可以剂量依赖性的减低模型鼠血清中HA、LN、PCIII的水平和肝组织中Hyp的含量，为SS-d克服肝纤维化作用提供了客观的证据。
各种原因所导致的肝组织氧白由基的产生和TGF-β1的激活是肝细胞损伤和诱发肝纤维化的主要原因。机体活性氧的清除主要依靠SOD，本发明显示模型鼠中肝组织出现了SOD活性的减低和相应的MDA含量升高，而SS-d可以显著的升高纤维化肝组织中SOD的活性和减低MAD的含量，提示了其抑制肝纤维化的作用与降低组织的氧化应激损伤密切相关。肝纤维化过程中80%以上的胶原是肝星形细胞所产生，TGF-β1是静息状态肝星形细胞激活和转化的初始信号，而且TGF-β1可以通过其经典的下游效应蛋白Smad诱导细胞的间变，对ECM的合成与降解也起着一定的调控作用，可见TGF-β1是肝纤维化形成的始动因子，在肝纤维化发生发展过程中占有重要的地位。本发明显示正常大鼠肝组织TGF-β1仅见少量表达，而模型鼠表达量显著性的升高（P<0.01），预示了TGF-β1信号通路的激活参与了模型鼠肝纤维化病变的过程，随后的药物处理结果显示SS-d可以剂量依赖性的抑制肝组织中TCF-β1的升高，说明下调TGF-β1的表达也参与了SS-d抗肝纤维化的作用。
综上所述，本发明显示柴胡皂苷D （SS-d）具有较好的抗肝纤维化作用，其作用机制可能与提高SOD活性减少氧自由基的生成和抑制TGF-β1信号通路的激活相关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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| CN104688759A (zh) * | 2015-02-02 | 2015-06-10 | 山东省中医药研究院 | 一种用于预防和治疗免疫性肝纤维化和肝硬化的复方制剂 |
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| CN114767661A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-07-22 | 浙江中医药大学 | 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用 |
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