CN114767661B - 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114767661B
CN114767661B CN202210252175.6A CN202210252175A CN114767661B CN 114767661 B CN114767661 B CN 114767661B CN 202210252175 A CN202210252175 A CN 202210252175A CN 114767661 B CN114767661 B CN 114767661B
Authority
CN
China
Prior art keywords
saikosaponin
preparation
nano
plga
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210252175.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114767661A (zh
Inventor
曹岗
彭梦云
邵玫钰
王一凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Original Assignee
Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU filed Critical Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority to CN202210252175.6A priority Critical patent/CN114767661B/zh
Publication of CN114767661A publication Critical patent/CN114767661A/zh
Priority to BE20225705A priority patent/BE1030348B1/fr
Application granted granted Critical
Publication of CN114767661B publication Critical patent/CN114767661B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/32—Manganese; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及一种柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用，属于中医药技术领域。本发明所述的柴胡皂苷b1纳米制剂，通过FDA批准的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物进行包载，在2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲液中进行分散，通过高锰酸钾还原生长二氧化锰，得柴胡皂苷b1纳米制剂，该纳米制剂为球形核‑壳结构，大小约为150nm。动物实验证明，与柴胡皂苷b1单体给药对比，本发明的柴胡皂苷b1纳米制剂显著减少了炎性细胞浸润和组织的胶原沉积，说明其具有增强的抗肝纤维化效果。该柴胡皂苷b1纳米制剂对肝纤维化治疗有明显增强疗效。

Description

柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤 维化药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用，属于中医药技术领域。
背景技术
随着全球特别是发达国家肥胖率和代谢综合征患病率的上升，肝纤维化、肝硬化等疾病已成为一个重要的公共卫生问题。肝纤维化是对慢性肝损伤的一种伤口愈合反应，其特征是细胞外基质的过量产生和沉积，会导致肝功能丧失和肝结构破坏，并影响肝脏氧气与养分的供给，造成肝脏区域的严重缺氧微环境。在肝纤维化进程中，肝脏乏氧微环境可以诱导活性氧产生，进一步促进肝星状细胞的活化，从而加速肝纤维化的发展。因此，改善肝脏组织缺氧对逆转肝纤维化进程可能具有非常重要的意义，并值得进一步探索。
中药在治疗肝脏相关疾病方面已被使用了数千年。一些含柴胡的中药处方，包括小柴胡汤、柴胡疏肝散等，在亚洲国家已成为用于治疗各种肝病的传统方法。柴胡皂苷b1是柴胡中分离的主要生物活性成分之一，对活化的肝星状细胞具有很好的抑制效果，可以较好地应用于肝纤维化的治疗。但在肝脏乏氧微环境下，Ssb1药物治疗效果较为单一，并且传统给药方式(口服、注射等)存在药物利用率低、用药剂量大的问题。因此，研发一种新型的复合药物制剂，通过改善肝脏区域乏氧，减少ROS刺激，同时在肝脏区域选择性释放Ssb1，对肝纤维化的治疗效果有着重要的促进作用。
发明内容
为缓解肝纤维化、增强肝纤维化的治疗效果，本发明提供一种对肝纤维化治疗有明显增强疗效的柴胡皂苷b1纳米制剂。
本发明还提供一种所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种柴胡皂苷b1纳米制剂，该柴胡皂苷b1纳米制剂是由如下方法制得：
S1、柴胡皂苷b1(Ssb1)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)在溶剂中溶解后滴加至聚乙烯醇(PVA)水溶液中形成微球，
S2、使微球分散在0.1-1.0mol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，向该溶液逐渐滴加1-10mmol/L的高锰酸钾溶液，充分搅拌，离心，得到柴胡皂苷b1纳米制剂。
本发明所述的柴胡皂苷b1纳米制剂，通过FDA批准的聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行包载，在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中进行分散，通过高锰酸钾还原生长二氧化锰，得柴胡皂苷b1纳米制剂，该纳米制剂为球形核-壳结构，大小约为150nm。该柴胡皂苷b1纳米制剂对肝纤维化治疗有明显增强疗效。
本发明中药物的药理作用为：肝郁脾虚证是肝纤维化的主要证候，柴胡始载于清代，其味苦、辛，性微寒，归肝胆经，具解表退热，疏肝解郁，升举清气之功，药理活性明显。柴胡单独水煎剂被发现具有较强的抗肝纤维化作用。现代药理学研究结果表明，柴胡中药理活性作用最强的成分主要是柴胡皂苷。Ssb1的抗肝纤维化效果是基于中医理论基础的有效实践，可以高效地诱导活化的肝星状细胞的死亡。但是，单独采用Ssb1对于抗肝纤维化的临床治疗效果并不理想，在肝脏乏氧微环境下，Ssb1药物治疗效果较为单一，并且传统给药方式(口服、注射等)存在药物利用率低、用药剂量大的问题。
本发明中柴胡皂苷b1纳米制剂的药理基础为：纤维化的发生会促进组织缺氧，加重疾病进程。逆转肝脏区域乏氧状态可以较大地缓解对肝星状细胞的刺激，对肝纤维化的治疗非常必要。本发明针对肝脏微环境缺氧的特征，通过MnO2催化过氧化氢(H2O2)分解产生氧气，在减少氧化应激压力的同时缓解组织乏氧情况，从而在源头上减少对肝星状细胞的刺激，协同增强肝纤维化治疗效果。本发明提供的柴胡皂苷b1纳米制剂可以在肝脏区域进行Ssb1和MnO2的选择性释放，有效提高药物利用率。同时，MnO2催化肝脏区域H2O2分解产生氧气，在降低组织氧化应激压力的同时改善肝脏的乏氧状态，增强Ssb1的抗肝纤维化治疗效果。
作为优选，PVA水溶液中PVA的质量百分含量是6-15mg/mL。
作为优选，Ssb1与PLGA的重量比为(2-8)：(5-20)。
作为优选，所述柴胡皂苷b1纳米制剂为球形核-壳结构，大小为150nm±5nm。
一种所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、将柴胡皂苷b1(Ssb1)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)在溶剂中溶解后滴加至聚乙烯醇(PVA)水溶液中，搅拌2-3小时，待丙酮挥发后，以5000至10000转/分钟速度离心，水洗后得到PVA稳定的PLGA/Ssb1微球；
S2、将制备的PLGA/Ssb1微球分散在0.1-1.0mol/LMES缓冲液中，向该溶液逐渐滴加1-10mmol/L的高锰酸钾溶液，通过PLGA链段上的羟基基团还原作用，逐渐在微球表面生成二氧化锰(MnO2)，充分搅拌后离心，水洗，得到柴胡皂苷b1纳米制剂。
作为优选，PVA水溶液中PVA的质量百分含量是6-15mg/mL。优选的是，PVA水溶液中PVA的质量百分含量是10mg/mL。
作为优选，Ssb1与PLGA的重量比为(2-8)：(5-20)。最优选的是，Ssb1与PLGA的重量比为1：10。
一种含有1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的中药组合物。本发明所述的柴胡皂苷b1纳米制剂可以与其他药物组分或者药物中常用的辅料配伍，用于制备预防和治疗肝纤维化的药物。
一种所述的柴胡皂苷b1纳米制剂在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用。
动物实验证明，与柴胡皂苷b1单体给药对比，本发明的柴胡皂苷b1纳米制剂显著减少了炎性细胞浸润和组织的胶原沉积，说明其具有增强的抗肝纤维化效果。因此，本发明提供的柴胡皂苷b1纳米制剂配伍合理，经过药理学验证，使用安全，能够有效减轻肝纤维化的症状，逆转肝纤维化进程，且未见不良反应。
附图说明
图1为本发明柴胡皂苷b1纳米制剂的形貌表征，Scale bar＝100nm；
图2为本发明柴胡皂苷b1纳米制剂体外模拟释放曲线；
图3为本发明柴胡皂苷b1纳米制剂催化H2O2产生氧气的效果曲线；
图4为本发明柴胡皂苷b1对HSC-T6细胞中Collagen I，α-SMA，Caspase 3蛋白表达的影响，Scale bar＝100nm；
图5为本发明柴胡皂苷b1纳米制剂对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化组织的缺氧缓解作用；
图6为本发明柴胡皂苷b1纳米制剂对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化治疗效果，Scale bar＝100nm；
图7为本发明柴胡皂苷b1纳米制剂对正常小鼠的急性毒性评价，Scale bar＝100nm；
图中，A—空白对照组；B—四氯化碳模型组；C—柴胡皂苷b1单体组；D—MnO2组；E—PLGA/Ssb1微球组；F—柴胡皂苷b1纳米制剂组。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
为了更好的说明本发明的实质，下面通过本发明药物组合的药理作用实验结果来进一步说明它的效果。
重要的，本发明提供一种柴胡皂苷b1纳米制剂，该柴胡皂苷b1纳米制剂是由如下方法制得：
S1、柴胡皂苷b1(Ssb1)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)在溶剂中溶解后滴加至聚乙烯醇(PVA)水溶液中形成微球，
S2、使微球分散在0.1-1.0mol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，向该溶液逐渐滴加1-10mmol/L的高锰酸钾溶液，充分搅拌，离心，得到柴胡皂苷b1纳米制剂。
实施例1
一种柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法，该方法步骤是：
S1、将20mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与2mg Ssb1溶解到500μL丙酮溶液中，在搅拌下将该溶液逐滴加入10mg/mL聚乙烯醇(PVA)水溶液中，搅拌大约3小时，待丙酮挥发后，得到柴胡皂苷b1微球，以5000转/分钟速度离心10分钟，采用二次水洗涤3次，得到PVA稳定的PLGA/Ssb1微球；
S2、将S1制备的PLGA/Ssb1微球分散在0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(pH＝5.9)中，超声分散后搅拌，向该溶液逐渐滴加200μL的5mmol/L的高锰酸钾溶液，通过PLGA链段上的羟基基团还原作用，逐渐在微球表面生成二氧化锰(MnO2)，室温搅拌约24小时，在搅拌下反应至溶液颜色变为棕黄色，然后在8000转/分的转速下离心，并使用二次水洗三次，超声分散，得到柴胡皂苷b1纳米制剂。
应用例
实验方法：
1、柴胡皂苷b1纳米制剂表征
取实施例1中合成PLGA/Ssb1微球与柴胡皂苷b1纳米制剂，对其形貌、药物释放速率以及催化产氧效率等参数进行表征。
1.1形貌表征
首先将制得的纳米颗粒分散到水中，滴到铜网及导电玻片上并用氮气吹干，之后通过透射电子显微镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(SEM)对形貌进行表征。表征结果如图1所示。
图1中显示，本发明设计的PLGA/Ssb1微球大小约为150nm，呈规整圆球形，柴胡皂苷b1纳米制剂在PLGA/Ssb1微球表面有一层明显的MnO2薄层。在SEM镜下,软质的PLGA/Ssb1微球出现了团聚融合的情况，而表面覆盖了MnO2薄层的柴胡皂苷b1纳米制剂则较为刚性，很好地保持了圆球形貌。
1.2药物释放率
将PLGA/Ssb1微球与柴胡皂苷b1纳米制剂分别装载到截留分子量为2000的透析袋中，对十倍体积PBS缓冲液(pH 7.4)进行透析，固定时间点取样后补充对应体积缓冲液继续透析。待取好各时间点样品溶液后，通过紫外分光光度计测定柴胡皂苷b1的释放量，模拟肝组织的药物释放效果，结果见图2。
图2中显示了PLGA/Ssb1微球与柴胡皂苷b1纳米制剂的药物释放曲线，在本发明设计的柴胡皂苷b1纳米制剂中，Ssb1缓慢均匀地释放出来，时间长达10小时左右，有效延长了药物的作用时间，有利于增强对肝纤维化的治疗效果。
1.3催化产氧效率
柴胡皂苷b1纳米制剂催化H2O2分解产生氧气的效率由溶氧仪测定。将柴胡皂苷b1纳米制剂分散到水溶液中，并在水溶液中持续鼓入30分钟氩气去除溶解的氧气，直到溶解的氧气降至4mg/L以下。之后，加入不同量的3％H2O2溶液，分别是0mM、11mM、33mM和44mM，使用溶氧仪实时监测氧气的产生情况，每10秒钟记录读数一次，共记录50次。
图3显示了本发明的柴胡皂苷b1纳米制剂催化过氧化氢产生氧气的效果。对于不同浓度的过氧化氢溶液，柴胡皂苷b1纳米制剂均能够快速有效地催化氧气的产生，其中更高浓度的过氧化氢对应更快的氧气产生速率，说明本发明的柴胡皂苷b1纳米制剂可以快速地清除肝脏积累的过氧化氢，减少肝脏细胞的氧化损伤，同时催化产生的氧气可以缓解肝纤维化区域氧气供应不足，调整肝纤维化区域的环境，使其更利于肝脏细胞维持正常状态。
2、细胞实验
2.1细胞造模
细胞肝纤维化模型通过转化生长因子-β蛋白(TGF-β)刺激大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞活化来构建。将HSC-T6细胞以1×106密度接种到6孔板上，贴壁过夜后更换无血清培养基培养12小时，之后，保留两个空白孔，其他加入10ng/mL的TGF-β活化，24小时后将细胞刮下，提取蛋白后煮沸变性，通过蛋白质免疫印迹实验(Western Blot，WB)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen 1)的表达，以检测HSC-T6细胞活化的肝纤维化模型成功与否。
2.2抗肝纤维化效果
验证细胞模型构建成功后，取对数期生长的HSC-T6细胞制成细胞悬液，之后将HSC-T6细胞以1×106密度接种到6孔板上，贴壁过夜后更换无血清培养基培养12小时，之后，保留一个空白孔，其他加入10ng/mL的TGF-β活化。在活化的HSC-T6细胞孔中给柴胡皂苷b1单体药物进行抗肝纤维化药效考察。共培养24小时后，将细胞刮下，提取蛋白后通过WB实验检测α-SMA和Collagen 1的表达，重复三次。HSC-T6细胞经TGF-β刺激活化后会分泌α-SMA蛋白，以指示HSC-T6细胞的活化状态。进一步，HSC-T6会分化为成纤维细胞，分泌胶原蛋白等物质形成胶原纤维，从而使肝脏发生纤维化。图4为本发明柴胡皂苷b1对HSC-T6细胞中Collagen I，α-SMA，Caspase 3蛋白表达的影响，Scale bar＝100nm。图4中说明，柴胡皂苷b1单体可以有效降低α-SMA和Collagen1的表达，说明柴胡皂苷b1对HSC-T6活化具有很好的抑制作用，从而起到抗肝纤维化效果。
之后，通过WB实验检测HSC-T6细胞凋亡酶3(Caspase 3)蛋白的表达变化，重复三次。Caspase 3(正常状态下分子量32KD)是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白，在早期凋亡阶段被激活，裂解成分子量12KD的亚基Cleaved-Caspase 3，最终介导细胞凋亡。柴胡皂苷b1在较高给药浓度(15μM)时诱导HSC-T6出现Cleaved-Caspase 3亚基表达，说明柴胡皂苷b1可以诱导活化HSC-T6细胞发生凋亡，从而抑制肝纤维化。
3、动物实验
3.1动物实验造模
选用Balb/c雄性小鼠，5-6周龄，20g左右60只，随机分为空白对照组；四氯化碳模型组；柴胡皂苷b1单体组；二氧化锰组；PLGA/Ssb1微球组；柴胡皂苷b1纳米制剂组，每组10只。空白对照组小鼠皮下注射橄榄油，其他组注射3mL/kg的40％四氯化碳橄榄油混合液诱导小鼠肝纤维化，一周两次，连续注射5周后取小鼠牺牲，检测肝脏纤维化状态。
3.2给药方案
注射四氯化碳5周后，肝纤维化小鼠造模成功。除空白对照小鼠外，其他肝纤维化小鼠分别经尾静脉注射100μL的PBS缓冲液、CMC钠分散的柴胡皂苷b1单体、二氧化锰微球溶液、PLGA/Ssb1微球溶液、柴胡皂苷b1纳米制剂溶液。每周给药1次，同时每周继续腹腔注射3mL/kg的40％四氯化碳橄榄油混合液以维持肝纤维化状态，连续3周。
3.3动物实验取材
于末次注射给药24小时后，用水合氯醛(生理盐水配制成4％浓度，小鼠每100g注射1ml)轻度麻醉小鼠，之后通过心脏取血，脱颈处死，取得的血液样本室温静置3小时后，1500转/分钟离心，取上清血浆于四度保存。小鼠肝脏经解剖后，取相同部位同样大小的肝组织1块，4％多聚甲醛固定一周后石蜡包埋。另外于相同部位取1.0cm×1.0cm×1.0cm大小肝组织低温下加生理盐水匀浆，剩余肝组织置于-80度保存。
3.4相关指标检测
将冷冻肝组织在相应部位剪下一小块，通过ICG进行包埋，使用冷冻切片机切成4μm厚的片层，进行组织免疫荧光(Immunofluorescence，IF)分析，检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在组织中的表达情况。HIF-1α由缺氧状态下的细胞过度表达，诱导细胞进行不依赖氧气的糖酵解代谢，使其在缺氧状态下生存。但在缺氧代谢过程中，由于氧气供应不足，线粒体内会产生大量具有高反应活性的活性氧，刺激HSC-T6细胞的活化。HIF-1α作为细胞缺氧状态的指示蛋白，可以较好地说明细胞生长状态。
图5中，肝纤维化模型小鼠肝脏组织具有最高的HIF-1α荧光，二氧化锰微球和柴胡皂苷b1纳米制剂注射给药的小鼠中，其肝脏组织HIF-1α表达出现了明细的降低，说明本发明中二氧化锰微球和柴胡皂苷b1纳米制剂高效催化肝脏过氧化氢产生氧气，从而有效缓解纤维化肝脏组织的供氧不足，降低了肝脏组织的氧化压力，对肝脏具有很好的保护作用。
取石蜡包埋的肝脏组织，切成4μm厚度的薄片，进行苏木精-伊红(H&E)染色分析，其中细胞核被染为蓝色，细胞质则被染为红色。相比于正常组，模型组肝组织中有大量炎性细胞浸润，表现为较多细胞核聚集(图6)。经过治疗的小鼠中，与柴胡皂苷b1单体给药对比，本发明的柴胡皂苷b1纳米制剂显著减少了炎性细胞浸润。同时，将组织石蜡切片进行Masson染色分析，肝纤维化区域的胶原被染成蓝色，图6中显示，与柴胡皂苷b1单体给药组相比较，本发明的柴胡皂苷b1纳米制剂有效减少了组织的胶原沉积，说明其具有增强的抗肝纤维化效果。
3.5活体安全性评价
小鼠实验前禁食12小时，按体重随机分为5组：空白对照组、柴胡皂苷b1单体药物组、二氧化锰组、PLGA/Ssb1微球组和柴胡皂苷b1纳米制剂组，每组6只。每组按照20mL/kg的剂量进行尾静脉注射给药，PBS对照组尾静脉注射等体积PBS，每天一次，连续3天，检测药物对小鼠的生物安全性。注射完成后按照“3.3”部分所述进行动物取材，主要脏器为：心、肝、脾、肺、肾，通过4％多聚甲醛固定一周后，石蜡包埋，切片，进行H&E染色分析。图7中显示为不同组主要脏器的H&E染色结果，从组织形态学分析，所涉及给药组小鼠均没有出现明显变化，说明本发明涉及的药物及纳米制剂均没有明显毒性，具有良好的生物安全性。
综上所述，本发明柴胡皂苷b1纳米制剂可以有效抑制并减轻肝纤维化水平，且生物安全性良好，具有很好的保肝护肝的作用。
最后，需要说明的是，本发明保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，凡在本发明的精神和原则之内，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柴胡皂苷b1纳米制剂，其特征在于该柴胡皂苷b1纳米制剂是由如下方法制得：
S1、柴胡皂苷b1（Ssb1）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)在溶剂中溶解后滴加至聚乙烯醇（PVA）水溶液中形成微球，
S2、使微球分散在0.1-1.0 mol/L 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液中，向该溶液逐渐滴加1-10 mmol/L的高锰酸钾溶液，充分搅拌，离心，得到柴胡皂苷b1纳米制剂。
2. 根据权利要求1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂，其特征在于：PVA水溶液中PVA的质量百分含量是6-15 mg/mL。
3. 根据权利要求1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂，其特征在于：Ssb1与PLGA 的重量比为（2-8）：（5-20）。
4.根据权利要求1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂，其特征在于：所述柴胡皂苷b1纳米制剂为球形核-壳结构，大小为150nm±5nm。
5.一种权利要求1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
S1、将柴胡皂苷b1（Ssb1）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)在溶剂中溶解后滴加至聚乙烯醇（PVA）水溶液中，搅拌2-3小时，待丙酮挥发后，以5000至10000转/分钟速度离心，水洗后得到PVA稳定的PLGA/Ssb1微球；
S2、将制备的PLGA/Ssb1微球分散在0.1-1.0 mol/L MES缓冲液中，向该溶液逐渐滴加1-10 mmol/L的高锰酸钾溶液，通过PLGA链段上的羟基基团还原作用，逐渐在微球表面生成二氧化锰（MnO2），充分搅拌后离心，水洗，得到柴胡皂苷b1纳米制剂。
6. 根据权利要求5所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法，其特征在于：PVA水溶液中PVA的质量百分含量是6-15 mg/mL。
7. 根据权利要求5所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法，其特征在于：Ssb1与PLGA的重量比为（2-8）：（5-20）。
8. 根据权利要求5所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的制备方法，其特征在于：Ssb1与PLGA的重量比为1：10。
9.一种含有权利要求1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂的中药组合物。
10.一种权利要求1所述的柴胡皂苷b1纳米制剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
CN202210252175.6A 2022-03-15 2022-03-15 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用 Active CN114767661B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210252175.6A CN114767661B (zh) 2022-03-15 2022-03-15 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用
BE20225705A BE1030348B1 (fr) 2022-03-15 2022-09-06 NANO-FORMULATION DE SAIKOSAPONINE b1, PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET APPLICATION POUR PRÉPARER DES MÉDICAMENTS POUR PRÉVENIR ET TRAITER LA FIBROSE HÉPATIQUE

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210252175.6A CN114767661B (zh) 2022-03-15 2022-03-15 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114767661A CN114767661A (zh) 2022-07-22
CN114767661B true CN114767661B (zh) 2023-08-08

Family

ID=82425770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210252175.6A Active CN114767661B (zh) 2022-03-15 2022-03-15 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114767661B (zh)
BE (1) BE1030348B1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101628021A (zh) * 2009-03-13 2010-01-20 江西本草天工科技有限责任公司 柴胡有效部位的制备方法及其用途
CN103479656A (zh) * 2012-06-12 2014-01-01 上海市中医医院 柴胡皂苷d在制备治抗肝纤维化疾病药物中的应用
CN105906822A (zh) * 2016-04-29 2016-08-31 郑州大学 一种包覆二氧化锰片层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的制备方法及应用
CN114053227A (zh) * 2021-10-13 2022-02-18 江苏大学 一种表面镶有金属化合物颗粒的多功能纳米粒及其制备方法和抗肿瘤中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI492751B (zh) * 2013-06-04 2015-07-21 Univ Kaohsiung Medical 柴胡皂苷製備之醫藥組合物、其用途及其製備方法
WO2021236789A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of treating obesity-induced glucose intolerance and liver fibrosis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101628021A (zh) * 2009-03-13 2010-01-20 江西本草天工科技有限责任公司 柴胡有效部位的制备方法及其用途
CN103479656A (zh) * 2012-06-12 2014-01-01 上海市中医医院 柴胡皂苷d在制备治抗肝纤维化疾病药物中的应用
CN105906822A (zh) * 2016-04-29 2016-08-31 郑州大学 一种包覆二氧化锰片层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的制备方法及应用
CN114053227A (zh) * 2021-10-13 2022-02-18 江苏大学 一种表面镶有金属化合物颗粒的多功能纳米粒及其制备方法和抗肿瘤中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邹小波等主编.《现代食品检测技术》.中国轻工业出版社,2021,第393页. *

Also Published As

Publication number Publication date
BE1030348B1 (fr) 2023-10-17
BE1030348A1 (fr) 2023-10-09
CN114767661A (zh) 2022-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2001052868A1 (en) Combinations for treating neoplasms
CN109876008B (zh) 一种用于肿瘤治疗的药物及其制备方法和应用
KR102413205B1 (ko) 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 보습, 피부진정, 항염, 세포재생 및 주름개선용 화장료 조성물
TW201618801A (zh) 用於輔助化療藥物之醫藥組合物及其用途
Wang et al. Novel bone tumor cell targeting nanosystem for chemo-photothermal therapy of malignant bone tumors
CN114767661B (zh) 柴胡皂苷b1纳米制剂、制备方法及其在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用
CN109481396B (zh) 一种富勒烯水溶液、注射剂及其制备方法
CN111956806B (zh) 一种药物载体、胶束、药剂及其制备方法和应用
CN1943707B (zh) 一种用于抗衰老的中药组合物及其制备方法
CN109248177B (zh) 鳄鱼甲有效组分的制备及其抗氧化、抗肝纤维化的应用
CN107485614A (zh) 罗汉果醇在抗肝纤维化药物中的应用
CN1954812B (zh) 依达拉奉的新用途
CN111557948A (zh) 核苷水凝胶在制备防止或延缓口腔黏膜潜在恶性疾患癌变的药物中的用途
AU2021105462A4 (en) Use of fructus corni nano-powder in resisting type 2 diabetes mellitus
CN102846668A (zh) 一种纳米美洲大蠊的制备方法
EP4275692A2 (en) Dried-cell-secretome-based therapeutic agent for treating osteoarthritis
WO2022047779A1 (zh) 烟酰胺单核苷酸在制备提高损伤皮肤肌膜中Na+-K+-ATP酶水平试剂中的应用
CN111249300B (zh) 褪黑素联合甲钴胺在治疗糖尿病创面愈合障碍中的应用
CN110613724B (zh) 一种具有治疗肝细胞癌功效的药物
CN111317746B (zh) 一种富勒烯结构在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用
CN102895671A (zh) 一种微小rna在预防和/或治疗心脏疾病中的用途
CN114225034A (zh) 一种用于序贯治疗的纳米凝胶及其制备方法和应用
CN106344511B (zh) 纳米六神丸溶液及制备方法
Xu et al. A simple endogenous zinc-activated and accumulated nanocluster platform for memory immunotherapy of spinal cord injury
CN104306326B (zh) 含有hpph的水性药物组合物和注射液

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant