BE1030348B1 - NANO-FORMULATION DE SAIKOSAPONINE b1, PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET APPLICATION POUR PRÉPARER DES MÉDICAMENTS POUR PRÉVENIR ET TRAITER LA FIBROSE HÉPATIQUE - Google Patents
NANO-FORMULATION DE SAIKOSAPONINE b1, PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET APPLICATION POUR PRÉPARER DES MÉDICAMENTS POUR PRÉVENIR ET TRAITER LA FIBROSE HÉPATIQUE Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une nano-formulation de saikosaponine b1, son procédé de préparation et son application pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique, appartenant au domaine de la médecine traditionnelle chinoise. Encapsuler ladite nano-formulation de saikosaponine b1 selon la présente invention par un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique approuvé par la FDA, disperser dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique et réduire le permanganate de potassium en dioxyde de manganèse pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1, la nano-formulation ayant une structure noyau-enveloppe sphérique de taille d'environ 150 nm.
Description
NANO-FORMULATION DE SAIKOSAPONINE bl, PROCÉDÉ
DE PRÉPARATION ET APPLICATION POUR PRÉPARER
DES MÉDICAMENTS POUR PRÉVENIR ET TRAITER LA
FIBROSE HÉPATIQUE
DOMAINE TECHNIQUE
[0001] La présente invention concerne une nano-formulation de saikosaponine b1, son procédé de préparation et son application pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique, appartenant au domaine de la médecine traditionnelle chinoise.
CONTEXTE TECHNIQUE
[0002] Avec l'augmentation du taux de l'obésité et de la fréquence d’apparition des syndromes métaboliques dans le monde, surtout dans les pays développés, la fibrose hépatique et la cirrhose du foie sont devenues un problème grave pour la santé publique.
La fibrose hépatique est une réponse cicatrisante à une lésion hépatique chronique, caractérisée par une production et un dépôt excessifs de matrices extracellulaires, ce qui conduira à une perte des fonctions hépatiques et une destruction de la structure hépatique, affectera l'apport en oxygène et de nutriments au foie, et généra un micro-environnement très anoxique dans la région hépatique. Pendant le processus de la fibrose hépatique, le micro-environnement anoxique du foie peut induire la génération de l'oxygène réactive et favoriser davantage l'activation des cellules stellaires hépatiques, accélérant ainsi le processus de la fibrose hépatique. Il est donc très intéressant de soulager l'anoxie du tissu hépatique pour inverser le processus de la fibrose hépatique, méritant ainsi une exploration plus approfondie.
[0003] La médecine traditionnelle chinoise est utilisée depuis des milliers d'années dans le traitement des hépatopathies. Certaines prescriptions de la médecine traditionnelle BE2029/5705 chinoise contenant Bupleurum, tels que la décoction de Xiao Chaihu et la poudre de
Chaihu Shugan sont devenues des méthodes traditionnelles pour traiter les hépatopathies dans les pays asiatiques. La saikosaponine bl est l'un des principes actifs biologiques isolés de Bupleurum, qui présente un bon effet d’inhibition sur les cellules stellaires hépatiques activées et peut être bien utilisée dans le traitement de la fibrose hépatique.
Cependant, dans le micro-environnement anoxique du foie, l'effet thérapeutique de la
Ssbl (saikosaponine bl) est relativement simple et les voies traditionnelles d'administration (voie orale, voie d’injection, etc.) présentent les inconvénients tels qu’une disponibilité faible de médicament et une haute dose de médicament. Par conséquent, il existe un besoin de développer un nouveau formulation pharmaceutique composite, qui joue un rôle important pour favoriser l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique en améliorant l'anoxie dans la région hépatique, en réduisant la stimulation des
ROS et en libérant Ssb1 de manière sélective dans la région hépatique.
[0004] Afin de soulager la fibrose hépatique et de renforcer l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique, la présente invention propose une nano-formulation de saikosaponine b1 qui présente un effet thérapeutique renforcé considérablement sur la fibrose hépatique.
[0005] La présente invention propose également un procédé de préparation de la nano- formulation de saikosaponine bl.
[0006] Pour réaliser le but ci-dessus, la présente invention propose une solution technique suivante :
[0007] Une nano-formulation de saikosaponine bl est préparée par le procédé suivant :
[0008] S1. dissoudre la saikosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) pour former des microsphères.
[0009] S2. disperser les microsphères dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivement une solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, bien agiter et centrifuger pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1. BE2029/5705
[0010] Encapsuler ladite nano-formulation de saikosaponine bl selon la présente invention par un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique approuvé par la
FDA, disperser dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique et réduire le permanganate de potassium en dioxyde de manganèse pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1, la nano-formulation ayant une structure noyau-enveloppe sphérique de taille d'environ 150 nm. La nano-formulation de saikosaponine b1 présente un effet thérapeutique renforcé considérablement sur la fibrose hépatique.
[0011] Les effets pharmacologiques du médicament selon la présente invention consiste à ce que : le syndrome de stagnation du foie et d'insuffisance splénique est l’un des principaux syndromes de la fibrose hépatique, Bupleurum a été enregistré pour la première fois sous la dynastie Qing, avec un goût amer et âcre, et une nature légèrement froid, qui retourne au méridien du foie et de la vésicule biliaire, et présente des effets de soulager des syndromes externes et de réduire la fièvre, de dégager l'énergie hépatique, et de monter le clair QI, avec une activité pharmacologique évidente. Il a été constaté que la décoction de Bupleurum seul présentait un bon effet anti-fibrose hépatique. Les résultats des études pharmacologiques modernes ont montré que l’ingrédient le plus actif de Bupleurum était la saikosaponine. L'effet anti-fibrose hépatique de la Ssbl est une pratique efficace basée sur les théories de la médecine traditionnelle chinoise, qui peut efficacement induire l’apoptose des cellules stellaires hépatiques activées. Cependant, l'effet thérapeutique clinique de la Ssb1 seul sur la fibrose hépatique n'est pas idéal, dans le micro-environnement anoxique du foie, l'effet thérapeutique de la Ssb1 est relativement simple et les voies traditionnelles d'administration de médicaments (voie orale, voie d’injection, etc.) présentent les inconvénients tels qu’une disponibilité faible de médicament et une haute dose de médicament.
[0012] La base pharmacologique de la nano-formulation de saikosaponine b1 selon la présente invention est que l'apparition de la fibrose favorise l'anoxie du tissu et aggrave le processus de la maladie. L'inversion de l'état anoxique dans la région du foie permet de soulager considérablement la stimulation sur les cellules stellaires hépatiques, ce qui est très nécessaire pour le traitement de la fibrose hépatique. En visant la caractéristique d'anoxie dans le micro-environnement hépatique, l'invention consiste à décomposer le BE2029/5705 peroxyde d'hydrogène (H202) pour générer l'oxygène sous catalyse de MnO: réduire la pression de stress oxydatif tout en soulageant l'anoxie du tissu, réduisant ainsi à la source la stimulation sur les cellules stellaires hépatiques, et renforçant de manière synergique l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique. La nano-formulation de saikosaponine b1 fournie par la présente invention peut libérer de manière sélective la Ssb1 et MnO: dans la région du foie, améliorant ainsi efficacement la disponibilité du médicament. De plus,
MnOz catalyse la décomposition de H,O, dans la région du foie pour générer l'oxygène, ce qui permet de réduire la pression de stress oxydatif tout en soulageant l’état d'anoxie dutissu et renforçant l'effet thérapeutique de la Ssb1 sur la fibrose hépatique.
[0013] De préférence, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 6 à 15 mg/ml.
[0014] De préférence, le rapport en poids de Ssb1 à PLGA est (2-8) :(5-20).
[0015] De préférence, la nano-formulation de saikosaponine bl a une structure noyau- enveloppe sphérique de taille de 150 nm+5 nm.
[0016] Un procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine blm comprend les étapes suivantes :
[0017] S1. dissoudre la satkosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution — aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA), agiter pendant 2-3 heures, centrifuger à une vitesse de 5 000 à 10 000 tr/min une fois que l’acétone s'est évaporée, et laver avec l'eau pour obtenir des microsphères PLGA/Ssb1 stabilisées au PVA ;
[0018] S2. disperser les microsphères PLGA/Ssb1 préparées dans un tampon MES à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivement une solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, de sorte de générer le dioxyde de manganèse (MnO2) progressivement sur la surface des microsphères par la réduction du groupe hydroxyle sur le segment PLGA, bien agiter, puis centrifuger, et laver avec l'eau pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.
[0019] De préférence, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 6 à 15 mg/mL. De préférence, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 10 mg/mL. BE2029/5705
[0020] De préférence, le rapport en poids de Ssbl à PLGA est (2-8) :(5-20). Le plus préférentiel, le rapport en poids de Ssb1 à PLGA est 1 :10.
[0021] Une composition pharmaceutique traditionnelle chinoise comprend la nano- 5 formulation de saikosaponine bl selon 1. La nano-formulation de saikosaponine b1 selon la présente invention peut être compatible avec d'autres ingrédients pharmaceutiques ou des excipients couramment utilisés dans les médicaments pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique.
[0022] Une application de la nano-formulation de saikosaponine b1 pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique est proposée.
[0023] Des tests chez animaux ont montré que, par rapport à l'administration de la monomère de saikosaponine b1l, la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention réduit considérablement l'infiltration cellulaire inflammatoire et le dépôt de collagène dans le tissu, ce qui montre son effet thérapeutique renforcé sur la fibrose hépatique. Par conséquent, la nano-formulation de saikosaponine bl fournie par la présente invention a une compatibilité raisonnable, et présente une sécurité d’utilisation montrée par des validations pharmacologiques, elle peut soulager efficacement les symptômes de la fibrose hépatique, inverser le processus de la fibrose hépatique sans effets indésirables rapportés.
[0024] La figure 1 montre une caractérisation morphologique de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention, où barre d'échelle = 100 nm ;
[0025] la figure 2 montre des courbes de libération simulée in vitro de la nano- formulation de saikosaponine b1 de la présente invention ;
[0026] la figure 3 montre une courbe de l'effet de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention pour générer l'oxygène en catalysant HO; ;
[0027] la figure 4 montre l'effet de la saikosaponine bl de la présente invention sur l'expression des protéines Collagène I, a-SMA et Caspase 3 dans les cellules HSC-T6, où BE2029/5705
Barre d'échelle = 100 nm ;
[0028] la figure 5 montre l'effet de la nano-formulation de saikosaponine bl de la présente invention pour soulager l'anoxie du tissu de souris atteinte la fibrose hépatique induite par le tétrachlorure de carbone ;
[0029] la figure 6 montre l'effet thérapeutique de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention sur la fibrose hépatique induite par le tétrachlorure de carbone, où Barre d'échelle = 100 nm ; et
[0030] la figure 7 montre une évaluation sur la toxicité aiguë de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention sur les souris normales, où barre d'échelle = 100 nm;
[0031] Sur les figures, A - Groupe témoin blanc ; B - Groupe modèle de tétrachlorure de carbone ; C - Groupe de monomère de saikosaponine bl ; D - Groupe MnO; ; E - groupe de microsphères PLGA/Ssb1 ; F - Groupe de nano-formulation de saikosaponine bl.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODE DE RÉALISATION
[0032] La solution technique de la présente invention sera décrite en plus détaillé ci- dessous via les exemples de réalisation spécifiques. On comprendra que, la mise en œuvre de la présente invention n’est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessous, et touts les variations et/ou changements sous toute forme effectués sur la présente invention doivent être inclus dans le cadre de protection de la présente invention.
[0033] Dans la présente invention, sauf indication contraire, toutes les parts et tous les pourcentages sont unités de poids, et les matériels et les matières premières utilisés peuvent être achetés sur le marché ou couramment utilisés dans l'art. Les procédés dans les exemples de réalisations ci-dessous, sauf indication contraire, sont des procédés classiques dans l'art.
[0034] Afin de mieux illustrer l'essence de la présente invention, les effets de la présente invention seront davantage illustrés ci-après par les résultats de tests des effets BE2029/5705 pharmacologiques de la combinaison pharmaceutique de la présente invention.
[0035] Il est important que la présente invention fournisse une nano-formulation de saikosaponine bl, qui est préparée par le procédé suivant :
[0036] S1. dissoudre la saikosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) pour former des microsphères.
[0037] S2. disperser les microsphères dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivementune solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, bien agiter et centrifuger pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.
[0038] Exemple de réalisation 1
[0039] Un procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine blm comprend les étapes suivantes :
[0040] S1. dissoudre 20 mg de copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) et 2 mg de Ssb1 dans 500 uL de solution d’acétone, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) à 10 mg/mL sous agitation, agiter pendant 3 heures, obtenir des microsphères de saikosaponine b1 une fois que l’acétone s' est évaporée, centrifuger à une vitesse de 5000 tr/min pendant 10 mins, et laver avec l'eau secondaire pour trois fois pour obtenir des microsphères PLGA/Ssb1 stabilisées au PVA ;
[0041] S2. disperser les microsphères PLGA/Ssb1 préparées à S1 dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) 0.1 mol/L (pH=5.9), disperser aux ultrasons puis agiter, ajouter goutte à goutte progressivement à cette solution 200 uL de solution de permanganate de potassium à 5 mmol/L, de sorte de générer le dioxyde de manganèse (MnO») progressivement sur la surface des microsphères par la réduction du groupe hydroxyle sur le segment PLGA, agiter à température ambiante pendant 24 heures, laisser réagir sous agitation jusqu'à ce que la solution devient jaune brunâtre, centrifuger à une vitesse de 8000 tr/min, laver avec l'eau secondaire pour trois fois, et disperser aux ultrasons pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.
[0042] Exemples d'application
[0043] Procédés de tests : BE2029/5705
[0044] 1. Caractérisation de la nano-formulation de saikosaponine b1
[0045] Prelever les microsphères PLGA/Ssb1 et la nano-formulations de saikosaponine b1 synthétisées dans l'exemple de réalisation 1 et caractériser les paramètres tels que la morphologie, la vitesse de libération du médicament et l’efficacité de génération d'oxygène sous catalyse.
[0046] 1.1 Caractérisation morphologique
[0047] Tout d'abord, disperser les nanoparticules dans l'eau, gouter sur des mailles de cuivre et une lame de verre conductrice, sécher avec l'azote, puis caractériser la microscopie à l’aide d’une microscopie électronique à transmission (TEM) et d’une microscopie électronique à balayage à émission de champ (SEM). Les résultats de la caractérisation sont présentés dans la figure 1.
[0048] Comme montrée la figure 1, la taille des microsphères PLGA/Ssb1 conçues selon la présente invention était d'environ 150 nm, et en forme sphérique régulière, et la nano-formulation de saikosaponine bl formait une fine couche évidente de MnO2 sur la surface des microsphères PLGA/Ssbl. Au microscope SEM, les microsphères molles
PLGA/Ssb1 présentaient une agglomération-fusion, tandis que la nano-formulation de saikosaponine bl recouverte de la fine couche de MnO2 sur la surface était relativement rigide et bine maintenait la forme sphérique.
[0049] 1.2 Vitesse libération du médicament
[0050] Charger respectivement les microsphères PLGA/Ssb1 et la nano-formulation de saikosaponine b1 dans des sacs de dialyse ayant un seuil de retenue moléculaire de 2000, respectivement, et dialyser avec dix volumes de tampon PBS (pH 7,4), prélever aux heures définies puis compléter avec le tampon de volume correspondant pour poursuivre la dialyse. Une fois le prélèvement aux heures définies effectué, déterminer la quantité de libération de saikosaponine bl à l’aide d’un spectrophotomètre ultraviolet pour simuler l'effet de libération du médicament dans le tissu hépatique. Les résultats sont présentés dans la figure 2.
[0051] La figure 2 montre des courbes de libération du médicament des microsphères
PLGA/Ssbl et de la nano-formulation de saikosaponine bl, dans laquelle la nano-
formulation de saikosaponine bl conçue selon la présente invention libère la Ssbl BE20225705 lentement et uniformément pendant environ 10 heures, prolongeant ainsi la durée d'action effectif du médicament, ce qui est bénéfique pour renforcer l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique.
[0052] 1.3 Efficacité de génération d'oxygène sous catalyse
[0053] L'efficacité de la nano-formulation de saikosaponine b1 pour générer l'oxygène en catalysant la décomposition de H,O, a été mesurée à l’aide d’un compteur d'oxygène dissous. Disperser la nano-formulation de saikosaponine b1 dans une solution aqueuse et introduire l'argon en continu dans la solution aqueuse pendant 30 minutes pour éliminer l'oxygène dissous jusqu'à ce que l'oxygène dissous tombe en dessous de 4 mg/L. Puis ajouter différentes quantités de solution de H,O, à 3 %, soit 0 mM, 11 mM, 33 mM et 44 mM, surveiller en temps réel la génération d'oxygène à l'aide d'un compteur d'oxygène dissous, lire et enregistrer toutes les 10 secondes, 50 enregistrements au total.
[0054] La figure 3 montre un effet de la nano-formulation de saikosaponine bl de la présente invention pour générer l'oxygène en catalysant la décomposition de peroxyde d'hydrogène. Pour différentes concentrations de solutions de peroxyde d'hydrogène, la nano-formulations de saikosaponine bl pourrait catalyser la génération d'oxygène de manière rapide et efficace, des concentrations élevées de peroxyde d'hydrogène correspondant à des hautes vitesse de génération d'oxygène, ce qui montre que la nano- formulation de saikosaponine b1 de la présente invention pourrait éliminer rapidement le peroxyde d'hydrogène accumulé dans le foie et réduire les dommages dûs à la oxydation des cellules hépatiques, de plus, l'oxygène généré sous catalyse pourrait soulager l’apport insuffisant en oxygène dans la région de la fibrose hépatique et ajuster l'environnement de la région de la fibrose hépatique et le rendre plus propice au maintien des cellules hépatiques à l’état normal.
[0055] 2. Tests cellulaires
[0056] 2.1 Modélisation cellulaire
[0057] Le modèle de fibrose hépatique cellulaire a été construit en stimulant l'activation des cellules stellaires hépatiques HSC-T6 des rats par la protéine recombinante induite par le facteur de croissance transformant-B (TGF-B). Inoculer les cellules HSC-T6 sur une plaque à 6 puits à 1 x 10°, laisser adhérent sur la paroi pendant BE2029/5705 la nuit, remplacer par un milieu sans sérum et cultiver pendant 12 heures, laisser deux puits vierges, ajouter TGF-B à 10 ng/mL dans les autres puits pour activer pendant 24 heures, gratter les cellules, extraire la protéine puis la bouillir pour dénaturer, détecter les expressions de l'actine musculaire lisse a (a-SMA) et du collagène de type I (Collagène 1) par test Western blot (WB) pour vérifier le succès ou l'échec de la modélisation de fibrose hépatique activé par les cellules HSC-T6.
[0058] 2.2 Effet anti-fibrose hépatique
[0059] Une fois le succès de la modélisation de cellules vérifié, préparer une suspension cellulaire à partir des cellules HSC-T6 en phase logarithmique de croissance, puis inoculer les cellules HSC-T6 sur une plaque à 6 puits à 1 x 10°, laisser adhérent sur la paroi pendant la nuit, remplacer par un milieu sans sérum, cultiver pendant 12 heures, laisser un puits vierge, et ajouter TGF-B à 10 ng/mL dans les autres puits pour activer.
Observer l'efficacité anti-fibrose hépatique du médicament de monomère de saikosaponine bl dans les puits de cellules HSC-T6 activés. Co-cultiver pendant 24 heures, gratter les cellules, extraire la protéine, détecter les expressions de l’a-SMA et du
Collagen 1, et répéter pour trois fois. Les cellules HSC-T6 sécrètent la protéine a-SMA après avoir été stimulées et activées par le TGF-B pour indiquer l'état d'activation des cellules HSC-T6. De plus, HSC-T6 se différencie en fibroblastes, sécréte le collagène et autres substances pour former des fibres de collagène, entraînant ainsi une fibrose dans le foie. La figure 4 montre l'effet de la saikosaponine bl de la présente invention sur l'expression des protéines Collagène 1, a-SMA et Caspase 3 dans les cellules HSC-T6, où
Barre d'échelle = 100 nm. La figure 4 montre que la monomère de saikosaponine b1 pourrait réduire efficacement l'expression de l'u-SMA et du collagène 1, ce qui montre que la saikosaponine b1 présentait un bon effet d’inhibition sur l’activation des cellules
HSC-T6 et présentait donc un effet anti-fibrose hépatique.
[0060] Après cela, déterminer le changement d'expression de la protéine de l’enzyme d’apoptose 3 (Caspase 3) des cellules HSC-T6 par test WB, et répéter pour trois fois. La
Caspase 3 (poids moléculaire de 32KD à l'état normal) est une protéine exécutive clé dans le processus d’apoptose celullaire, qui est activée à la phase d’apoptose précoce et se décompose en sous-unités de Cleaved-Caspase 3 ayant un poids moléculaire de 12KD, BE2029/5705 qui médie finalement 1’ apoptose celullaire. La saikosaponine b1 induit l'expression de la sous-unité clivée-caspase 3 dans HSC-T6 à une haute concentration (15 uM), ce qui montre que la saikosaponine bl pourrait induire l'apoptose dans les cellules HSC-T6 activées, inhibant ainsi la fibrose hépatique.
[0061] 3. Tests chez animaux
[0062] 3.1 Modélisation des tests chez animaux
[0063] Sélectionner 60 souris mâles Balb/c d'environ 20 g âgées de 5 à 6 semaines, les diviser au hasard en un groupe témoin blanc ; un groupe modèle de tétrachlorure de carbone ; un groupe de monomère de saikosaponine bl ; un groupe de dioxyde de manganèse ; un groupe de microsphères PLGA/Ssb1 ; un groupe de nano-formulation de saikosaponine bl, 10 souris pour chaque groupe. Injecter l’huile d'olive par voie sous- cutanée chez les souris du groupe témoin blanc, et injecter un mélange à 3mL/kg composé de 40 % de tétrachlorure de carbone et de l'huile d'olive chez les souris des autres groupes pour induire la fibrose hépatique chez les souris, deux fois par semaine pendant 5 semaines, tuer les souris et détecter l’état de fibrose hépatique.
[0064] 3.2 Protocole d’administration
[0065] Le modèle de souris atteinte de la fibrose hépatique a été construit avec succès à la fin de cinq semaines de l'injection de tétrachlorure de carbone. À l'exception des souris témoins blanc, d'autres souris atteintes de la fibrose hépatique ont reçu une injection par voie intraveineuse caudale de 100 uL de tampon PBS, de monomère de saikosaponine bl dispersé dans le sodium CMC, d'une solution de microsphères de dioxyde de manganèse, d'une solution de microsphères PLGA/Ssb1 et d'une solution de nano-formulation de saikosaponine bl. Administrer toutes les semaines, et en mêmes temps, injecter un mélange à 3mL/kg composé de 40 % de tétrachlorure de carbone et de l'huile d'olive par voie abdominale pendant 3 semaines pour maintenir l’état de fibrose hépatique.
[0066] 3.3 Prélever pour les tests chez animaux
[0067] 24 heures après la dernière injection, anesthésier légèrement les souris avec l'hydrate de chloral (à une concentration de 4 % préparée avec le sérum physiologique, 1 ml pour 100 g de souris), puis prélever un échantillon de sang du cœur, tuer par BE2029/5705 décapitation, laisser l’échantillon à température ambiante pendant 3 heures, centrifuger à 1500 tr/min, prélever le plasma surnageant et stocker à 4 °C. Disséquer le foie des souris, prélever un morceau de tissu hépatique de même taille, fixer avec 4 % paraformaldéhyde pendant une semaine, et enrober avec la paraffine. Parallèlement, prélever un morceau de tissu hépatique de 1,0 cm x 1,0 cm x 1,0 cm au même site, homogénéiser avec le sérum physiologique à basse température, et stocker le tissu hépatique restant à -80°C.
[0068] 3.4 Détection des indicateurs pertinents
[0069] Prélever un petit morceau de tissu hépatique congelé en découpant au site correspondant, l’enrober avec ICG, découper en tranches ayant une épaisseur de 4 um à l'aide d'un cryotrancheuse, effectuer une analyse par immunofluorescence tissulaire (IF) pour détecter l’expression du facteur lo inductible par l'anoxie (HIF-1a) dans le tissu.
HIF-1« est surexprimé par les cellules à l’état anoxique et induit les cellules à effectuer un métabolisme glycolytique indépendant de l'oxygène, leur permettant de survivre à l’état anoxique. Cependant, dans le processus de métabolisme anoxique, en raison d'un apport insuffisant en oxygène, une grande quantité de l'oxygène à haute réactivité sera générée dans les mitochondries, stimulant l'activation des cellules HSC-T6. HIF-10, comme protéine indicatrice de l'état anoxique cellulaire, peut bien indiquer l'état de croissance cellulaire.
[0070] Sur la figure 5, le tissu hépatique des souris de modèle de fibrose hépatique présente le plus haut niveau de fluorescence HIF-lo, chez les souris injectés avec les microsphères de dioxyde de manganèse et la nano-formulations de saikosaponine b1, l'expression de HIF-1a dans leur tissu hépatique a présenté une diminution significative, ce qui montre que les microsphères de dioxyde de manganèse et la nano-formulations de saikosaponine bl de la présente invention pouvaient catalyser efficacement le peroxyde d'hydrogène pour générer l'oxygène dans le foie, soulager donc efficacement l'apport insuffisant en oxygène au tissu fibrose hépatique, réduire le stress oxydatif du tissu hépatique, et présenter un bon effet protecteur sur le foie.
[0071] Prélever le tissu hépatique enrobé avec la paraffine, couper en tranches ayant une épaisseur de 4 um et effectuer une analyse par coloration à l'hématoxyline-éosine
(H&E), dans laquelle le noyau était coloré en bleu et le cytoplasme était coloré en rouge. BE2029/5705
Par rapport au groupe normal, une grande quantité de cellules inflammatoires ont été infiltrées dans le tissu hépatique chez le groupe modèle, ce qui se présente par une accumulation de nombreux noyaux (Figure 6). Chez les souris traitées, par rapport à l'administration de la monomère de saikosaponine bl, la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention réduit considérablement l'infiltration cellulaire inflammatoire. De plus, préparer le tissu en coupes de paraffine et effectuer une analyse de coloration Masson, le collagène dans la région de fibrose hépatique étant coloré en bleu, et comme montrée la figure 6, par rapport à l'administration de la monomère de saikosaponine b1, la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention réduit efficacement le dépôt de collagène du tissu, ce qui indique son effet thérapeutique renforcé sur la fibrose hépatique.
[0072] 3.5 Évaluation de la sécurité in vivo
[0073] Les souris ont été mises à jeun pendant 12 heures avant les tests et réparties au hasard en 5 groupes en fonction de leur poids corporel : un groupe témoin blanc, un groupe de monomère de saikosaponine bl, un groupe de dioxyde de manganèse, un groupe de microsphères PLGA/Ssb1 et un groupe de nano-formulation saikosaponine b1, 6 souris pour chaque groupe. Injecter le médicament par voie intraveineuse caudale à une dose de 20 mL/kg chez chaque groupe, et injecter un volume égal de PBS par voie 1ntraveineuse caudale chez le groupe témoin de PBS, une fois par jour pendant 3 jours consécutifs, et détecter la sécurité biologique du médicament sur les souris. Après l'injection, prélever sur les animaux comme décrit dans la section "3.3", en particulier les organes suivants : le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, fixer avec 4 % paraformaldéhyde pendant une semaine, et enrober avec la paraffine, découper en tranches et effectuer une analyse par coloration H&E. La figure 7 montre les résultats de coloration H&E sur les principaux organes de différents groupes, dans une analyse histomorphologique, il n'y avait aucun changement évident chez les souris du groupe d'administration du médicament, ce qui a montré que les médicaments et la nano- formulations de la présente invention ne présentait pas de toxicité évidente et présentait une bonne sécurité biologique.
[0074] En conclusion, la nano-formulation de saikosaponine bl de la présente BE2029/5705 invention peut efficacement inhiber et réduire le niveau de fibrose hépatique, présente une bonne sécurité biologique et un bon effet de protection du foie.
[0075] Enfin, il faut noter que, le cadre de protection de la présente invention n’est pas limité aux exemples de réalisations ci-dessous, les exemples de réalisations ci-dessous ne sont que pour expliquer et illustrer la présente invention, au lieu de limiter le cadre de protection de la présente invention, toutes modifications, remplacements équivalents et améliorations obtenus par l’homme de l’art sans travail créatif et en respectant les esprits et les principes de la présente invention doivent être inclus dans le cadre de protection de la présente invention.
Claims (10)
1. Nano-formulation de saikosaponine b1, caractérisée en ce que la nano-formulation de saikosaponine bl est préparée par le procédé suivant :
S1. dissoudre la saikosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) pour former des microsphères.
S2. disperser les microsphères dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivementune solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, bien agiter et centrifuger pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.
2. Nano-formulation de saikosaponine b1 selon la revendication 1, caractérisée en ce que, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 6 à 15 mg/mL.
3. Nano-formulation de saikosaponine b1 selon la revendication 1, caractérisée en ce que, le rapport en poids de Ssbl à PLGA est (2-8) :(5-20).
4. Nano-formulation de saikosaponine b1 selon la revendication 1, caractérisée en ce que, la nano-formulation de saikosaponine bl a une structure noyau-enveloppe sphérique de taille de 150 nm+5 nm.
5. Procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine bl selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
S1. dissoudre la saikosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA), agiter pendant 2-3 heures, centrifuger à une vitesse de 5 000 à 10 000 tr/min une fois que l’acétone s'est évaporée, et laver avec l'eau pour obtenir des microsphères PLGA/Ssb1 stabilisées au PVA ;
S2. disperser les microsphères PLGA/Ssb1 préparées dans un tampon MES à 0,1- 1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivementune solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, de sorte de générer le dioxyde de manganèse (MnO2) progressivement sur la surface des microsphères par la réduction du groupe hydroxyle sur le segment PLGA, bien agiter, puis centrifuger, et laver avec l'eau pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1. BE2029/5705
6. Procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine bl selon la revendication 5, caractérisé en ce que, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 6 à 15 mg/mL.
7. Procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine bl selon la revendication 5, caractérisée en ce que, le rapport en poids de Ssb1 à PLGA est (2-8) :(5-
20).
8. Procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine bl selon la revendication 5, caractérisée en ce que, le rapport en poids de Ssb1 à PLGA est 1 : 10.
9. Composition pharmaceutique traditionnelle chinoise comprenant la nano-formulation de saikosaponine b1 selon la revendication 1.
10. Application de la nano-formulation de saikosaponine b1 selon la revendication 1 pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique est proposée.
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