CN107303295A - 二羟基苯甲酸内酯5z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二羟基苯甲酸内酯5Z‑7在制备治疗骨关节炎药物中的应用，属于生物医药领域。该二羟基苯甲酸内酯5Z‑7是一种针对TAK1的小分子抑制剂，在关节腔内可通过靶向抑制TAK1的酶活性来抑制滑膜及软骨组织中由炎性细胞因子、基质降解产物等成分所介导的NF‑κB、p38及JNK等免疫相关通路的活化，从而通过调控上述通路下游与骨关节炎相关的一系列基因表达，以达到减轻滑膜炎症反应、抑制软骨降解、改善关节腔内微环境等目的，对于延缓骨关节炎进程、进而有效治疗骨关节炎具有重要的意义。此外，该二羟基苯甲酸内酯5Z‑7为小分子类化合物，其作用靶点单一、特异性高，经检测对软骨组织无毒副作用，更加安全可靠。

Description

二羟基苯甲酸内酯5Z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种二羟基苯甲酸内酯5Z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，简称OA)是一种常见的慢性、退行性关节病变，临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等，严重干扰患者的日常生活。所以，有必要对骨关节炎进行及时有效的治疗。

治疗骨关节炎的现有技术主要包括非药物治疗和药物治疗两种方式，一般来说，非药物治疗方式包括减少负重、适度锻炼、理疗及手术治疗，理疗周期长且见效慢，手术治疗可选择关节镜下关节清理术、截骨术及人工关节置换等，但该类治疗方式普遍存在包括手术风险及人工关节使用寿命在内的多种局限性；而药物治疗中所使用的治疗骨关节炎的药物主要包括软骨润滑剂、糖皮质激素、以及解热镇痛剂和非甾体类抗炎药物等。

然而，发明人发现现有的药物治疗方式至少存在以下技术问题：

现有技术提供的治疗骨关节炎药物均局限于对疼痛等症状的缓解，不可逆转早期骨关节炎疾病进程，且存在胃肠道反应、肾脏毒性等多种副作用，可能对患者造成其他潜在伤害。

发明内容

为解决现有的技术问题，本发明实施例提供了一种TAK1小分子抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7在治疗骨关节炎药物中的应用，及其延缓骨关节炎进程的作用机理。具体技术方案如下：

第一方面，本发明实施例提供了二羟基苯甲酸内酯5Z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

第二方面，本发明实施例提供了一种用于治疗骨关节炎的药物，所述药物包括治疗有效量的TAK1小分子抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7。

具体地，所述骨关节炎为软骨组织损伤和/或滑膜组织损伤所致的骨关节炎。

可选地，所述二羟基苯甲酸内酯5Z-7可被进一步修饰，且修饰后的所述二羟基苯甲酸内酯5Z-7保持原有活性。

作为优选，所述药物还包括与所述二羟基苯甲酸内酯5Z-7相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

具体地，作为优选，所述药物的剂型为溶液剂、悬液剂、干粉剂或乳剂。

具体地，作为优选，所述药物的给药方式为体内关节腔注射。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明实施例以TAK1小分子抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7应用于骨关节炎疾病的缓解及治疗，该二羟基苯甲酸内酯5Z-7在关节腔内可通过靶向抑制TAK1酶活性来抑制滑膜及软骨组织中由炎性细胞因子、基质降解产物等成分所介导的NF-κB、p38及JNK等免疫相关通路的活化，从而通过调控上述通路下游与骨关节炎相关的一系列基因表达，以达到减轻滑膜炎症反应、抑制软骨降解、改善关节腔内微环境等目的，对于延缓骨关节炎进程、进而有效治疗骨关节炎具有重要的意义。此外，该二羟基苯甲酸内酯5Z-7为小分子类化合物，其作用靶点单一、特异性高，经检测对软骨组织无毒副作用，更加安全可靠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a是本发明实施例1提供的向各组大鼠中注射空载腺病毒、以及不同剂量的TAK1腺病毒一个月后，各组大鼠的关节整体外观图；

图1b是本发明实施例1提供的向各组大鼠中注射空载腺病毒、以及不同剂量的TAK1腺病毒一个月后，各组大鼠的关节软骨外观图；

图1c是本发明实施例1提供的向各组大鼠中注射空载腺病毒、以及不同剂量的TAK1腺病毒一个月后，各组大鼠的关节软骨组织切片的H&E及甲苯胺蓝染色图；

图1d是本发明实施例1提供的向各组大鼠中注射空载腺病毒、以及不同剂量的TAK1腺病毒一个月后，各组大鼠关节软骨组织切片的病理损伤评分结果示意图；

图1e是本发明实施例1提供的向各组大鼠中注射空载腺病毒、以及不同剂量的TAK1腺病毒一个月后，各组大鼠关节软骨组织切片中MMP13、IL6及II型胶原的免疫组化染色结果示意图；

图2a是本发明实施例2提供的向骨关节炎患者软骨细胞、滑膜细胞，以及大鼠原代软骨细胞中加入不同浓度的5Z-7二十四小时后，其对以上各类细胞活性影响的结果示意图；

图2b-1是本发明实施例2提供的5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代软骨细胞中的NF-κB及MAPK通路活性影响的结果示意图；

图2b-2是本发明实施例2提供的5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代软骨细胞中NF-κB反应元件转录活性影响的结果示意图；

图2b-3是本发明实施例2提供的5Z-7对骨关节炎患者软骨细胞中的NF-κB及MAPK通路活性影响的结果示意图；

图2b-4是本发明实施例2提供的5Z-7对骨关节炎患者软骨细胞中NF-κB反应元件转录活性影响的结果示意图；

图2c-1是本发明实施例2提供的5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代滑膜细胞中的NF-κB及MAPK通路活性影响的结果示意图；

图2c-2是本发明实施例2提供的5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代滑膜细胞中NF-κB反应元件转录活性影响的结果示意图；

图2c-3是本发明实施例2提供的5Z-7对骨关节炎患者滑膜细胞中的NF-κB及MAPK通路活性影响的结果示意图；

图2c-4是本发明实施例2提供的5Z-7对骨关节炎患者滑膜细胞中NF-κB反应元件转录活性影响的结果示意图；

图3a是本发明实施例3提供的5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代软骨细胞中各骨关节炎相关基因表达水平影响的示意图；

图3b是本发明实施例3提供的5Z-7对骨关节炎患者软骨细胞中各骨关节炎相关基因表达水平影响的示意图；

图3c是本发明实施例3提供的5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代滑膜细胞中各骨关节炎相关基因表达水平影响的示意图；

图3d是本发明实施例3提供的5Z-7对骨关节炎患者滑膜细胞中各骨关节炎相关基因表达水平影响的示意图；

图4a是本发明实施例4提供的第一组、第二组、第三组和第四组的滑膜与软骨共培养体系中，各组软骨细胞中骨关节炎相关基因的表达结果示意图；

图4b是本发明实施例4提供的第一组、第二组、第三组和第四组的滑膜与软骨共培养体系中，各组滑膜细胞中骨关节炎相关基因的表达结果示意图；

图4c是本发明实施例4提供的骨关节炎患者软骨块的培养上清液中加入不同浓度的5Z-7处理10天后的H&E及甲苯胺蓝染色图；

图4d是本发明实施例4提供的向DMM法建立的各组大鼠模型的关节腔中注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的H&E及甲苯胺蓝染色图；

图4e是本发明实施例4提供的向由DMM法建立的各组骨关节炎大鼠模型关节腔分别注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的OARSI病理评分结果示意图；

图4f是本发明实施例4提供的向由DMM法建立的各组骨关节炎大鼠模型关节腔分别注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的MMP13、IL6、II型胶原的免疫组化结果示意图；

图4g是本发明实施例4提供的向由DMM法建立的各组骨关节炎大鼠模型关节腔分别注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨表面的扫描电镜图。

具体实施方式

除非另有定义，本发明实施例所用的所有技术术语均具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。在对本发明实施方式做进一步详细描述之前，对理解本发明实施例一些术语给出如下解释。

在本发明实施例中，术语“TAK1”指的是本领域的转化生长因子β活化激酶1(英文全称是TGF-β-activated kinase 1)，其还可称为MAP3K7或MEKK7，是一种参与固有免疫及适应性免疫反应的关键激酶，其属于丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)家族。

在本发明实施例中，术语“二羟基苯甲酸内酯5Z-7”指的是本领域常见的5Z-7-oxozeaenol或(5Z)-7-Oxozeaenol，其化学结构式如下所示：

本领域技术人员可以理解的是，5Z-7-oxozeaenol为本领域所常见的，其可以通过商购而得到，举例来说，在本发明实施例中，由Calbiochem公司所生产，型号为499610的5Z-7-oxozeaenol、或者由Tocris Bioscience公司所生产，型号为3604的5Z-7-oxozeaenol、或者由Bertin Pharma公司所生产，型号为17459的5Z-7-oxozeaenol等均可以实现本发明。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式做进一步的详细描述。

第一方面，本发明实施例提供了二羟基苯甲酸内酯5Z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用及其作用机理。

第二方面，本发明实施例提供了一种用于治疗骨关节炎的药物，该药物包括治疗有效量的TAK1小分子抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7。

可以理解的是，上述的“治疗有效量”是指对人或动物体产生功能或活性，且可被人或动物所接受的量。

本发明实施例以TAK1小分子抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7应用于骨关节炎疾病的缓解及治疗，该二羟基苯甲酸内酯5Z-7在关节腔内可通过靶向抑制TAK1的酶活性来抑制滑膜及软骨组织中由炎性细胞因子、基质降解产物等成分所介导的NF-κB、p38及JNK等免疫相关通路的活化，从而通过调控上述通路下游与骨关节炎相关的一系列基因表达，以达到减轻滑膜炎症反应、抑制软骨降解、改善关节腔内微环境等目的，对于延缓骨关节炎进程、进而有效治疗骨关节炎具有重要的意义。此外，该二羟基苯甲酸内酯5Z-7为小分子类化合物，其作用靶点单一、特异性高，经检测对软骨组织无毒副作用，更加安全可靠。

前人研究发现，核转录因子κB(简称NF-κB)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路在骨关节炎关节组织中通常处于异常活化状态，且对骨关节炎进程发挥多方面促进作用。NF-κB是一种具有多向性转录调节作用的蛋白质因子，属于Rel蛋白家族，其成熟体为由RelA(p65)和p50组成的异二聚体。在机体免疫应答、炎症反应及细胞生长调控等方面发挥重要作用。在骨关节炎疾病进程中，异常机械应力、细胞外基质降解产物及炎性因子信号均可激活关节软骨组织及滑膜细胞中的NF-κB信号通路。而且，前人研究结果显示，人关节软骨细胞中由IL-1β引起的NF-κB活化程度可随患者的年龄增加而升高。活化的NF-κB入核后可激活多种基质降解酶类的表达，从而影响到软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的含量及重塑过程。此外，NF-κB还可通过调控多种细胞因子、血管生成因子、趋化因子、粘附分子等下游靶基因的表达，进一步加速软骨的降解及滑膜炎症的发展。

MAPKs家族由一组保守的丝/苏氨酸蛋白激酶组成，其被证实在细胞增殖、分化、凋亡、应激反应等多种细胞事件发挥关键作用。在哺乳类细胞中存在着三大主要的MAPK家族成员，分别为细胞外信号调节激酶(extracellular regulatedprotein kinases，简称ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，简称JNK)和p38激酶。前人研究表明，MAPKs信号通路参与到软骨形成、成熟及软骨内成骨的不同阶段中，对于软骨基质的合成及其稳态发挥重要作用。与正常软骨细胞相比，骨关节炎软骨细胞中磷酸化p38及JNK的水平均呈显著上调。

基于上述可知，在发生骨关节炎病变的关节腔内，NF-κB、JNK及p38信号通路共同组成了一个复杂的调控网络，从多个角度对骨关节炎发挥协同促进作用。因此，单独抑制上述任一个通路可能都无法起到延缓骨关节炎进程的最佳效果。基于此，发明人研究发现，通过使用二羟基苯甲酸内酯5Z-7来抑制上述各通路的共有上游信号传导分子TAK1的活性，进而达到同时抑制NF-κB、p38及JNK通路活化的目的，这对于预防、缓解以及治疗骨关节炎具有积极的作用。

本发明实施例中所述的骨关节炎不仅可以为软骨组织和/或滑膜组织损伤所致的骨关节炎。可以理解的是，上述骨关节炎可以为软骨受损后所导致的骨关节炎、滑膜受损后所导致的骨关节炎、软骨和滑膜共同受损所导致的骨关节炎。当然，软骨、滑膜及关节腔内其他组织，例如半月板、软骨下骨等共同损伤所致的骨关节炎也在本发明的保护范围内。

本领域技术人员可以理解的是，关节软骨退变是骨关节炎的最重要特征，此外，伴有血管密度增加及炎性细胞浸润的滑膜炎也是骨关节炎疾病进程中(包括早期)的常见特征之一。正常状态下，滑膜细胞可合成透明质酸与润滑素，促进关节的润滑。但是，在骨关节炎患者体内，滑膜的润滑能力显著减弱，且由增生滑膜分泌到关节滑液中的促炎因子，例如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等，可通过作用于软骨细胞来加速软骨的降解并抑制软骨细胞外基质的合成，对骨关节炎的发展产生重要影响。因此，骨关节炎的发生发展不仅与软骨有关，还会受到其它关节腔内组织如滑膜的影响。在骨关节炎的发生过程中，软骨、滑膜以及软骨下骨等关节腔内组织所共同维持的微环境稳态被打破，且这些处于病变状态的组织会通过自分泌及旁分泌途径相互影响，从而进一步加速疾病进程。由此可见，针对骨关节炎的干预手段不仅要靶向软骨组织，还要靶向滑膜组织。本发明实施例提供的二羟基苯甲酸内酯5Z-7，是一种真菌来源的小分子化合物，可显著并特异地抑制TAK1的酶活性，发明人研究发现其可发挥有效减轻滑膜炎症反应、抑制软骨降解及改善关节腔内微环境的作用，对于治疗骨关节炎具有良好的效果。

可选地，在本发明实施例中，该二羟基苯甲酸内酯5Z-7可被进一步修饰，且修饰后的二羟基苯甲酸内酯5Z-7保持原有活性。为了保持二羟基苯甲酸内酯5Z-7在体内或者体外操作时的稳定性，可以对其进行进一步修饰，但是，修饰后的二羟基苯甲酸内酯5Z-7保持原有活性，即修饰后的二羟基苯甲酸内酯5Z-7在提高其稳定性的基础上，其仍然能够缓解并治疗骨关节炎。

进一步地，该药物还包括与二羟基苯甲酸内酯5Z-7相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

当二羟基苯甲酸内酯5Z-7用于缓解或治疗骨关节炎时，其可以单独使用，也可以与其他可配伍的药类以及药学上可接受的载体和/或辅料配合使用。其中，“药学上可接受的载体和/或辅料”指的是适用于人或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的载体和/或辅料。举例来说，该载体可以为纳米颗粒、脂质体、胆固醇、壳聚糖等。

在使用过程中，为了便于储存及应用，该药物的剂型可以为溶液剂、悬液剂、干粉剂或乳剂。为了保证二羟基苯甲酸内酯5Z-7能够发挥最佳效果，优选其给药方式为体内关节腔注射。

以下将通过具体实施例进一步地描述本发明。

在以下具体实施例中，所涉及的操作未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用原料未注明生产厂商及规格者均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例明确了大鼠关节腔内TAK1的过表达能够引起骨关节炎相关病理性改变，具体操作步骤如下：

将15只体重100g左右的雄性SD大鼠随机分为三组，每组5只，分别向各组大鼠右后肢膝关节腔内注射对照的空载腺病毒、1×10⁷pfu剂量的TAK1腺病毒及1×10⁸pfu剂量的TAK1腺病毒，以对应作为空载腺病毒对照组、低剂量TAK1腺病毒组和高剂量TAK1腺病毒组，(其中，pfu表示腺病毒的数量单位)。每周两次，持续注射一个月后，处死大鼠。取出各组大鼠关节软骨，并拍摄大体照，随后分别置于质量浓度为4％的多聚甲醛中固定48小时，再置于脱钙液中48小时进行脱钙，再依次进行脱水、石蜡包埋及软骨组织切片。其中，软骨组织切片进行H&E染色及甲苯胺蓝染色，以用来比较各组软骨磨损情况及蛋白多糖的含量差异，并依据染色结果按照国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis ResearchSociety International，简称OARSI)制订标准对各组的软骨组织切片进行病理学评分。同时，还检测了各组大鼠的软骨组织切片中MMP13、IL6及II型胶原的免疫组化染色，其中，MMP13和IL6分别为代表性的软骨细胞外基质降解酶和炎性因子，II型胶原为软骨组织细胞外基质的主要组成成分，也是软骨的特异性标志物。

实验结果：由图1a所示的一个月后(即注射上述各病毒一个月后)各组大鼠的关节整体外观以及图1b所示的一个月后各组大鼠的关节软骨外观可知，注射TAK1腺病毒的大鼠关节软骨发生显著破坏并有肥大化趋势，且表面包覆有增生滑膜，其中，高剂量TAK1腺病毒组的大鼠关节表面有明显的血管生成。

由图1c所示的一个月后各组大鼠的关节软骨组织切片的H&E染色及甲苯胺蓝染色结果可知，低剂量TAK1腺病毒组和高剂量TAK1腺病毒组的大鼠关节软骨中蛋白多糖含量相较于正常大鼠及对照组的大鼠有显著降低。

由图1d所示的一个月后各组大鼠的关节软骨组织切片的病理损伤评分结果可知，低剂量TAK1腺病毒组和高剂量TAK1腺病毒组的大鼠的病理损伤评分显著高于正常组和对照组，且损伤程度随TAK1腺病毒注射剂量增加而升高。

由图1e所示的一个月后各组大鼠的关节软骨组织切片中MMP13、IL6及II型胶原(即COLII)的免疫组化染色结果可知，低剂量TAK1腺病毒组和高剂量TAK1腺病毒组的大鼠关节软骨中MMP13、IL6的表达水平显著上调，而II型胶原的表达水平则显著下降。

基于上述可知，以上各个实验结果均证实了当在大鼠关节腔内过表达TAK1时，能够引起与骨关节炎相关的病理性改变。

实施例2

本实施例明确了TAK1抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7(以下简称5Z-7)对软骨细胞与滑膜细胞增殖的影响，以及其对于NF-κB及MAPK通路活性的影响，具体操作步骤如下所示：

一、CCK-8法(Cell Counting Kit-8)检测5Z-7对软骨细胞及滑膜细胞活性的影响

分离培养骨关节炎患者的软骨细胞与滑膜细胞，以及正常大鼠原代软骨细胞，分别以10⁴/200μL的密度接种于96孔板的各孔中，置入细胞培养箱内预培养24小时(温度为37℃，通入体积分数为5％的CO₂)，然后依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3μmol/L的5Z-7(每个浓度6个复孔)，培养24小时后向各孔加入10μL的CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内孵育1小时，随后用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度，从而明确5Z-7对软骨细胞的数量有无影响，以及其对正常与处于骨关节炎病变状态的软骨细胞的影响是否存在差异。同样地，对大鼠原代滑膜细胞也进行上述同样的操作与检测。

实验结果：由图2a所示的5Z-7对骨关节炎患者(即OA患者)的软骨细胞和滑膜细胞，以及对大鼠原代软骨细胞的活性影响结果可知，TAK1抑制剂5Z-7对于骨关节炎患者的软骨细胞与滑膜细胞、以及正常大鼠原代软骨细胞均无明显毒性，当其使用量增至3μmol/L时，软骨细胞的死亡比例仅接近10％，而滑膜细胞的死亡比例为20％，稍高于前者。但是，可以理解的是，由于滑膜细胞的增生是骨关节炎进程中一个重要特征，因此5Z-7对滑膜细胞增殖的抑制作用从另一个方面来说也对骨关节炎的发生发展起到了延缓作用。

二、Western blot(蛋白质印迹实验)及双荧光素酶实验检测5Z-7对软骨细胞中NF-κB及MAPK通路活性的影响

本实施例研究了经白细胞介素IL-1β刺激后的正常大鼠原代软骨细胞，以及骨关节炎患者的软骨细胞中，在用5Z-7靶向抑制TAK1活性后NF-κB通路以及JNK和p38通路的活化程度改变：1)首先将IL-1β单独或与5Z-7一起加入大鼠原代软骨细胞培养上清中处理2小时及4小时后分别收集细胞沉淀，采用western blot方法检测NF-κB、JNK、p38信号通路中效应分子IKKα/β及IκB、JNK、p38的磷酸化状态。另外，将带有NF-κB反应元件的荧光素酶表达载体及海肾荧光素酶(Actin-Renilla，即内参对照)表达载体一起共转染大鼠原代软骨细胞，24小时后在该细胞中单独加入IL-1β或同时加入IL-1β与5Z-7，再过24小时后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组细胞中的荧光素酶活性。

2)将5Z-7单独加入骨关节炎患者软骨细胞培养上清中，处理2小时及4小时后收集细胞沉淀，采用western blot方法检测IKKα/β及IκB、JNK、p38激酶的磷酸化状态。将带有NF-κB反应元件的荧光素酶表达载体及海肾荧光素酶表达载体一起共转染骨关节炎患者软骨细胞，24小时后在该细胞中加入不同剂量的5Z-7(其浓度分别为0μmol/L、1μmol/L以及2μmol/L)，再过24小时后检测各组转染细胞的荧光素酶活性。

实验结果：图2b-1示出了5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代软骨细胞中NF-κB及MAPK通路活性的影响结果，在图2b-1中，符号“-”表示“不加入或者不存在”。举例来说，对于该图中的第一列来，其表示无IL-1β和5Z-7加入的测量结果；对于该图中的第2列来说，其表示只加入IL-1β，而不加入5Z-7后2小时的测量结果，同时，对于该图中的第4列来说，其表示同时加入IL-1β和5Z-7后2小时的测量结果。可以理解的是，在本发明实施例以下所附的各个附图中，符号“-”均表示与图2b-1所描述的相同的含义。另外，在该图2b-1中出现了IL-1β(10ng/mL)，其指的是IL-1β的加入剂量为10ng/mL；还出现了5Z-7(2μM)，其指的是5Z-7的加入剂量为2μmol/L。

如图2b-1所示，与未经处理的大鼠原代软骨细胞相比，经IL-1β刺激2小时以及4小时后的软骨细胞中p-IKKα/β、p-IκBα、p-JNK及p-p38的表达水平显著上调。然而，在将5Z-7与IL-1β同时加入时，5Z-7显著逆转了由IL-1β所引起的上述各激酶磷酸化表达水平的变化。

进一步地，图2b-2示出了5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代软骨细胞中NF-κB反应元件转录活性的影响结果(在本发明实施例中，该转录活性在图中由大鼠原代软骨细胞中NF-κB的荧光素酶活性表示)，由图2b-2可知，与未处理的大鼠原代软骨细胞相比，IL-1β可显著上调大鼠原代软骨细胞中NF-κB反应元件的转录活性，而5Z-7与IL-1β同时加入，则可显著逆转IL-1β引起的变化。

图2b-3示出了5Z-7对骨关节炎患者软骨细胞中的NF-κB及MAPK通路活性的影响结果，结果表明，与未经处理的骨关节炎软骨细胞相比，经5Z-7处理后的骨关节炎软骨细胞中p-IKKα/β、p-IκBα、p-JNK及p-p38的本底水平均有显著下调。

图2b-4示出了5Z-7对骨关节炎患者软骨细胞中NF-κB反应元件的转录活性的影响结果，在该图中，分别展示了5Z-7的浓度为0μmol/L、1μmol/L以及2μmol/L时的影响结果，结果表明，5Z-7可显著抑制骨关节炎软骨细胞中NF-κB反应元件的转录活性，且随着5Z-7浓度的提高，其对NF-κB反应元件的转录活性的抑制效果增强。

基于上述可知，以上结果均证实了利用5Z-7靶向抑制TAK1可有效阻断正常软骨细胞中由IL-1β介导的NF-κB、JNK及p38MAPK通路活化，并降低骨关节炎软骨细胞中上述通路的本底活化水平，对于治疗骨关节炎具有积极的意义。

三、Western blot及双荧光素酶实验检测5Z-7对滑膜细胞中NF-κB及MAPK通路活性的影响

为进一步确认在滑膜细胞中靶向抑制TAK1是否也可达到相同的效果，本实施例利用正常滑膜细胞及骨关节炎患者的滑膜细胞同样进行了与上述相同的检测。1)首先将IL-1β单独或与5Z-7一起加入正常滑膜细胞培养上清中，处理2小时及4小时后收集细胞沉淀，采用western blot方法检测IKKα/β及IκB、JNK、p38的磷酸化状态。将5Z-7单独加入骨关节炎患者滑膜细胞培养上清中，处理2小时及4小时后收集细胞沉淀，采用western blot方法检测IKKα/β及IκB、JNK、p38的磷酸化状态。2)将带有NF-κB反应元件的荧光素酶表达载体及海肾荧光素酶表达载体一起共转染入人骨关节炎滑膜细胞，24小时后在该细胞中单独加入不同剂量的5Z-7(其浓度分别为0μmol/L、1μmol/L以及2μmol/L)，再过24小时后检测各组转染细胞的荧光素酶活性。

实验结果：图2c-1示出了5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代滑膜细胞中NF-κB及MAPK通路活性的影响结果，由图2c-1所示，与未经处理的正常滑膜细胞相比，经IL-1β刺激2小时以及4小时后的滑膜细胞中p-IKKα/β、p-IκBα、p-JNK及p-p38的表达水平显著上调。然而，在将5Z-7与IL-1β同时加入后，5Z-7显著逆转了由IL-1β所引起的上述各因子磷酸化表达水平的变化。

图2c-2示出了5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代滑膜细胞中NF-κB反应元件转录活性的影响结果，结果表明，与未处理的大鼠原代滑膜细胞相比，IL-1β可显著上调大鼠原代滑膜细胞中NF-κB反应元件的转录活性，而5Z-7与IL-1β同时加入，则可显著逆转IL-1β引起的变化。

图2c-3示出了5Z-7对骨关节炎患者滑膜细胞中的NF-κB及MAPK通路活性的影响结果，结果表明，与未经处理的骨关节炎滑膜细胞相比，经5Z-7处理后的骨关节炎滑膜细胞中p-IKKα/β、p-IκBα、p-JNK及p-p38的水平均有显著下调。

图2c-4示出了5Z-7对骨关节炎患者滑膜细胞中NF-κB反应元件的转录活性的影响结果，在该图中，分别展示了5Z-7的浓度为0μmol/L、1μmol/L以及2μmol/L时的影响结果，结果表明，5Z-7可显著抑制骨关节炎滑膜细胞中NF-κB反应元件的转录活性，且随着5Z-7浓度的提高，其对NF-κB反应元件的转录活性的抑制效果增强。

基于上述可知，以上结果均证实了利用5Z-7靶向抑制TAK1可有效阻断正常滑膜细胞中由IL-1β介导的NF-κB、JNK及p38MAPK通路活化，并降低骨关节炎滑膜细胞中上述通路的本底活化水平，对于治疗骨关节炎具有积极的意义。

实施例3

本实施例明确了TAK1抑制剂5Z-7对软骨细胞与滑膜细胞中与骨关节炎相关基因的表达调控作用，具体操作过程如下：

1)明确5Z-7对软骨细胞中骨关节炎相关基因的表达调控作用

本实施例就5Z-7对于软骨细胞中基质降解酶类、炎性因子及细胞外基质成分的表达有何种影响进行了实验，具体是将IL-1β单独或与5Z-7一起加入正常大鼠原代软骨细胞培养上清中，处理2小时及4小时后用Trizol收集细胞沉淀，使用实时荧光定量PCR仪检测各组细胞中骨关节炎相关基因的表达。其中，基质降解酶类包括：MMP1、MMP13、ADAMTS1、ADAMTS5，炎性因子包括IL6，细胞外基质成分包括ACAN(蛋白多糖)、COL2A1(II型胶原)，SOX9为成软骨分化过程中的特异性转录因子。

实验结果：

图3a示出了5Z-7对由IL-1β诱导的大鼠原代软骨细胞中各骨关节炎相关基因表达水平影响的示意图，结果显示，与未经处理的大鼠原代软骨细胞相比，经由IL-1β刺激后，软骨细胞中基质降解酶类MMP1、MMP13、ADAMTS1、ADAMTS5，以及炎性因子IL6的mRNA表达水平均有所上调，而细胞外基质成分COL2A1、ACAN以及成软骨特异性转录因子SOX9的表达则有一定程度的下调。然而，在将5Z-7与IL-1β同时加入后，5Z-7则显著逆转了由IL-1β引起的以上各相关基因水平的变化。

与上述操作类似，本实施例随后将5Z-7单独加入骨关节炎患者软骨细胞培养上清中，处理2小时及4小时后分别用Trizol收集细胞沉淀，检测骨关节炎患者软骨细胞中骨关节炎相关基因的表达。

图3b示出了5Z-7对骨关节炎软骨细胞中各骨关节炎相关基因的表达水平示意图，结果显示，与未经处理的骨关节炎软骨细胞相比，加入5Z-7处理后，软骨细胞中基质降解酶类MMP1、MMP13、ADAMTS1、ADAMTS5，以及炎性因子IL6的mRNA表达水平均有所下调，而细胞外基质成分COL2A1、ACAN以及成软骨特异性转录因子SOX9的表达则有显著上调。

基于上述可知，本实施例利用5Z-7可改善软骨细胞中一系列相关基因的表达来抑制软骨的降解及炎性因子的产生，并促进细胞外基质生成，对于治疗骨关节炎具有积极的意义。

2)明确5Z-7对滑膜细胞中骨关节炎相关基因的表达调控作用

本实施例就5Z-7对于滑膜细胞中的基质降解酶类及炎性因子的表达水平影响进行了研究，具体是将IL-1β单独或与5Z-7一起加入正常大鼠原代滑膜细胞培养上清中，处理2小时及4小时后用Trizol收集细胞沉淀，使用实时荧光定量PCR仪检测各组细胞中基质降解酶类及炎性因子的表达情况。其中，基质降解酶类包括：MMP1、MMP13、ADAMTS1、ADAMTS5，炎性因子包括IL6。

实验结果：

图3c示出了5Z-7对由IL-1β刺激的大鼠原代滑膜细胞中各骨关节炎相关基因的表达水平影响示意图，结果显示，与未经处理的正常滑膜细胞相比，经由IL-1β刺激后，滑膜细胞中基质降解酶类MMP1、MMP13、ADAMTS1、ADAMTS5，以及炎性因子IL6的mRNA表达水平均有所上调。然而，在将5Z-7与IL-1β同时加入后，5Z-7则显著逆转(抑制)了由IL-1β引起的以上各相关基因的变化。

与上述操作类似，本实施例随后将5Z-7单独加入骨关节炎患者滑膜细胞培养上清中，处理2小时及4小时后分别用Trizol收集细胞沉淀，检测骨关节炎滑膜细胞中骨关节炎相关基因的表达。

图3d示出了5Z-7对骨关节炎滑膜细胞中各骨关节炎相关基因表达水平的影响示意图，结果显示，与未经处理的骨关节炎滑膜细胞相比，加入5Z-7处理后的各滑膜细胞中，基质降解酶类MMP13、ADAMTS1、ADAMTS5，以及炎性因子IL6的mRNA表达水平均明显下调，而MMP1的表达水平下调幅度不大。

基于上述可知，本实施例利用5Z-7可改善滑膜细胞中骨关节炎相关基因的表达来抑制软骨的降解及炎性因子的产生，并促进细胞外基质生成，对于治疗骨关节炎具有积极的意义。

实施例4

本实施例就5Z-7在滑膜与软骨共培养体系、体外培养骨关节炎软骨块及骨关节炎大鼠模型中，对其延缓骨关节炎进程所发挥的具体作用进行了研究，具体操作如下：

1)将相对正常的人软骨细胞接种于6孔板的各孔中预培养24小时，同时将健康人及骨关节炎患者的滑膜细胞分别接种于transwell迁移小室底部，并放入另一个6孔板中预培养，24小时后将各transwell小室分组成第一组、第二组、第三组和第四组。然后置于铺有软骨细胞的6孔板中，并分别加入含有或不含2μmol/L 5Z-7的培养基。共培养24小时后分别用Trizol收取Transwell迁移小室底部的滑膜细胞及6孔板底部的软骨细胞，提取RNA，进行逆转录合成cDNA，并利用实时荧光定量PCR法检测软骨细胞及滑膜细胞中细胞外基质成分、基质降解酶类及炎性细胞因子等基因的表达。其中，第一组中接种有正常滑膜细胞，且加入不含5Z-7的培养基，第二组中接种有正常滑膜细胞，且加入含有2μmol/L5Z-7的培养基，第三组中接种有骨关节炎患者的滑膜细胞，且加入不含5Z-7的培养基，第四组中接种有骨关节炎患者的滑膜细胞，且加入含有2μmol/L 5Z-7的培养基。

实验结果：

图4a示出了第一组、第二组、第三组和第四组的滑膜与软骨共培养体系中，各组软骨细胞中骨关节炎相关基因的表达结果，结果显示，软骨细胞中基质降解酶MMP1、MMP13及炎性细胞因子IL6的本底表达水平均可被5Z-7显著抑制，而骨关节炎滑膜细胞培养上清液可显著促进软骨细胞中MMP1、MMP13以及IL6的表达，与正常滑膜细胞相比，5Z-7对与骨关节炎滑膜细胞共培养的软骨细胞的抑制效果更为明显；另外软骨细胞中ACAN、COL2A1以及SOX9的表达水平均可被5Z-7所上调，这种上调作用也是在与骨关节炎滑膜细胞共培养的软骨细胞中更为明显。

图4b示出了第一组、第二组、第三组和第四组的滑膜与软骨共培养体系中，各组滑膜细胞中骨关节炎相关基因的表达结果，结果显示，5Z-7可显著抑制滑膜细胞中MMP1、MMP13及IL6的表达，且相对于正常滑膜细胞，其对骨关节炎滑膜细胞的抑制作用更为显著。

基于上述可知，5Z-7在软骨与滑膜细胞共培养体系中可发挥对骨关节炎相关基因表达的改善作用，且其对处于骨关节炎病变状态的软骨细胞及滑膜细胞可发挥更为显著的修复及调控作用。可见，5Z-7对于治疗骨关节炎具有积极的意义。

2)本实施例还采用体外软骨组织块培养法对上述步骤1)进行了验证。具体是选取骨关节炎患者行关节置换术后取出的退化软骨，将同一部位、相同状态的软骨平均分为四小块，分别用含不同浓度5Z-7(0μmol/L、1μmol/L以及2μmol/L)的培养基进行培养，持续培养一周后将软骨块固定、石蜡包埋及切片，进行H&E染色(苏木精-伊红染色)及甲苯胺蓝染色，检测软骨块中蛋白多糖含量的变化。

图4c示出了骨关节炎软骨块的培养上清液中加入0μmol/L、1μmol/L以及2μmol/L的5Z-7处理10天后的H&E及甲苯胺蓝染色结果，结果显示，利用含不同浓度的5Z-7处理骨关节炎软骨块后，软骨块中的蛋白多糖含量明显升高，且该作用呈剂量依赖性，这证实了5Z-7可渗透入软骨细胞外基质并进入到软骨细胞中发挥上调蛋白多糖表达的作用。

3)本实施例还选取15只体重70g左右的雄性SD大鼠，经质量浓度为10％的水合氯醛(剂量为300μL/100g)进行麻醉及消毒，暴露其右后肢膝关节并切断半月板胫骨韧带，再缝合关节腔，造成其半月板失稳，从而建立由半月板失稳术(destabilization of the medial meniscus，DMM)诱发的骨关节炎大鼠模型。三天后将15只大鼠随机分为3组，每组5只。每周两次分别向各组大鼠右后肢关节腔内注射对照用二甲基亚砜溶剂DMSO、0.5mg/kg剂量的5Z-7及1mg/kg剂量的5Z-7，一个月后采取断颈法处死大鼠。

将各组关节软骨分别置于质量浓度为4％的多聚甲醛中固定48小时，再置于脱钙液中48小时进行脱钙，再依次进行脱水、石蜡包埋及切片，进行H&E染色及甲苯胺蓝染色，比较各组软骨中蛋白多糖的含量差异，并依据染色结果对各组样本进行OARSI评分。同时对获取的组织样本切片进行免疫组化染色，比较各组软骨组织中MMP13、IL6以及COLII的表达水平，确定利用5Z-7靶向抑制TAK1活性是否可延缓OA大鼠关节腔内软骨细胞外基质的降解，并抑制炎性因子的产生。另取每组大鼠部分关节软骨，置入戊二醛固定液48小时进行固定，风干后进行喷金，利用扫描电镜技术对各组关节软骨表面磨损情况进行比较。

实验结果：

图4d示出了向DMM法建立的各组大鼠模型关节腔中注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的H&E及甲苯胺蓝染色结果，结果显示，进行DMM手术并注射DMSO溶剂组(即DMM+DMSO组)中，大鼠关节软骨中的蛋白多糖发生明显丢失，进行DMM手术并注射0.5mg/kg剂量5Z-7组(即DMM+低剂量5Z-7组)中，大鼠关节软骨中蛋白多糖含量有所回升，而进行DMM手术并注射1mg/kg剂量5Z-7组(即DMM+高剂量5Z-7组)中，大鼠蛋白多糖含量则恢复到与正常组大鼠较为接近的水平。

图4e示出了向DMM法建立的各组大鼠模型的关节腔中注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的OARSI病理评分结果，结果显示，进行DMM手术并注射DMSO溶剂组(即DMM+DMSO组)中，大鼠关节软骨的病理损伤评分显著高于健康的正常组大鼠，而进行DMM手术并注射5Z-7的两组中，大鼠关节软骨损伤程度则明显降低，且其损伤程度随5Z-7注射剂量的增加而进一步降低。

图4f示出了向DMM法建立的各组大鼠模型的关节腔中注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的MMP13、IL6、COLII的免疫组化结果。结果显示，单纯进行DMM手术并注射DMSO溶剂组(即DMM+DMSO组)中，大鼠关节软骨中MMP13、IL6的水平显著上调，II型胶原COLII表达水平显著下降，而DMM+低剂量5Z-7组和DMM+高剂量5Z-7组中，注射5Z-7则可逆转这种效应，且该逆转作用呈剂量依赖性。

图4g示出了向DMM法建立的各组大鼠模型关节腔中注射DMSO以及不同剂量的5Z-7一个月后，各组大鼠关节软骨的电镜结果。结果显示，健康的正常组大鼠的关节表面光滑平整，DMM+DMSO组的大鼠关节表面则粗糙程度明显增加，而在关节腔内注射低或高剂量的5Z-7后，DMM+低剂量5Z-7组和DMM+高剂量5Z-7组中，大鼠的关节表面则逐渐恢复光滑。

基于上述可知，本实施例从体内水平证实了5Z-7对于骨关节炎的疾病进程起到了显著的延缓作用。可见，将其用于制备预防和/或治疗骨关节炎的药物具有积极的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.二羟基苯甲酸内酯5Z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

2.一种用于治疗骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的TAK1小分子抑制剂二羟基苯甲酸内酯5Z-7。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述骨关节炎为软骨组织损伤和/或滑膜组织损伤所致的骨关节炎。

4.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述二羟基苯甲酸内酯5Z-7可被进一步修饰，且修饰后的所述二羟基苯甲酸内酯5Z-7保持原有活性。

5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物还包括与所述二羟基苯甲酸内酯5Z-7相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

6.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为溶液剂、悬液剂、干粉剂或乳剂。

7.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式为体内关节腔注射。