CN107485614A

CN107485614A - 罗汉果醇在抗肝纤维化药物中的应用

Info

Publication number: CN107485614A
Application number: CN201610402898.4A
Authority: CN
Inventors: 谢海峰; 张朝凤; 胡云岭; 谢期林; 罗明锋
Original assignee: Chengdu Universal Drug Development Co Ltd
Current assignee: Chengdu Universal Drug Development Co Ltd
Priority date: 2016-06-12
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2017-12-19
Also published as: WO2017215349A1

Abstract

本发明属于天然药物领域，具体涉及罗汉果醇在制备预防或/和治疗肝纤维化药物或/和保健品中的应用。本发明通过实验证明，罗汉果醇能够显著抑制肝细胞胶原蛋白的沉积，抑制肝脏成纤维细胞的增生，降低肝组织中α‑SMA的分泌，能够显著改善肝纤维化。罗汉果醇结构明确、稳定性好、质量易控制，来源于天然植物提取物，活性明确，毒性小副作用低，且成本易控制，为治疗或/和预防肝纤维化提供了一种新的选择和手段，具有广泛的实用价值。

Description

罗汉果醇在抗肝纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体地，涉及罗汉果醇抗肝纤维化的医疗新用途。

背景技术

肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是指肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原物质)过度沉积, 是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应, 是肝硬化的早期可逆阶段. 如不及时治疗则可能进展成为失代偿期肝硬化并出现各种终末期肝病并发症。肝纤维化持续发展可导致肝硬化、甚至肝癌。肝细胞炎症、坏死是肝纤维化的始动因素，又是其向前发展的推动因素。由于对其机制尚未明确，因此，在治疗药物方面受到一定的限制，而中医药具有整体调节及明确的抗氧化、降酶护肝、毒性低、价廉的优点而逐渐被重视。

在肝纤维化过程中，各种致病因子通过TGF-β/Smad途径促进肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)激活,在HSC活化早期刺激细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成与沉积，主要包括I型胶原、III型胶原IV型胶原。活化的HSC 也能合成分泌大量的TGF-β₁，使TGF-β1水平持续增高。在持续阶段，活化的HSC不断增殖，分泌大量的ECM，促使肝纤维化逐渐加重。在肝纤维化过程中HSC的活化是中心环节，TGF-β是活化HSC的关键因素，在肝纤维化过程中扮演重要角色。活化的HSC是产成ECM的主要细胞，它在ECM代谢和各种细胞介质的产生过程中处于中心地位，α-SMA是HSC的活化的标志之一。CCl₄诱导小鼠肝纤维化是经典的筛选抗肝纤维化药物的体内药效模型，CCl₄可引起体内氧化与抗氧化失衡, 氧自由基产生增多, 从而启动脂质过氧化反应，降低其TGF-β₁含量可减缓小鼠肝纤维化进程。

罗汉果为葫芦科(Cucurbitaceae)植物罗汉果(Siratia grosvenorii(Swingle)C. Jeffrey)的成熟果实，主产于广西永福、临桂和龙胜等县，为广西著名特产。罗汉果性凉、味甘，归肺、大肠经，具有润肺止咳、清热解暑、利咽开音、凉血滑肠的功效，是我国特有的药食同源性经济作物，同时被收载于中华人民共和国药典，作为常用中药使用，在治疗咽喉炎、百日咳、急慢性气管炎、胃肠疾病方面疗效显著。罗汉果总苷是罗汉果中主要的有效成分，具有广泛的生物特性和药理价值。现代医学研究证明，罗汉果总苷不仅具有镇咳、平喘、祛痰、抗炎、调节消化道功能之功效，还能增强免疫力、保肝降酶、治疗急性肺损伤、抗氧化以及防衰老。罗汉果提取物的主要成分为罗汉果苷，罗汉果中的总苷为葫芦烷型三萜苷类化合物，包括罗汉果苷V(Mogroside V); 罗汉果苷IVe(Mogroside IVe); 罗汉果苷IIIe(Mogroside IIIe); 罗汉果苷 II A2(Mogroside II A2); 罗汉果苷 III A1(Mogroside III A1); 罗汉果苷 IVa(Mogroside IVa); 罗汉果苷VI(Mogroside VI); 赛门苷I(Siamenoside I); 11-O-罗汉果苷V(11-Oxomogroside V)等。罗汉果醇是罗汉果苷类化合物的苷元，可以通过酸水解得到。

迄今为止，尚无罗汉果醇在抗肝纤维化药物中的应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种罗汉果醇的医药新用途，即其在制备预防和/或治疗肝纤维化药物和/或保健品中的用途。

本发明的另一目的是提供罗汉果醇或罗汉果醇制剂在抗肝纤维化相关疾病如肝硬化、急性肝损伤、病毒性肝炎、肝癌等方面的应用。

本发明所述罗汉果醇是采用市售罗汉果提取物，用5%的硫酸水解，经硅胶柱分离、精制、纯化得到，纯度95%以上，其结构式如下：

本发明所述罗汉果醇还可以使用经化学修饰得到的罗汉果醇衍生物代替，所述罗汉果醇衍生物包括但不限于罗汉果醇的卤化物、酯化物、胺基化合物、醚化物以及罗汉果醇的盐等衍生物。

本发明所述的罗汉果醇制剂，其制备方法均属于现有常规技术，可以从现有专利、公知文献中获得，或者根据公开的药品标准制备。

进一步地，所述罗汉果醇制剂，是以罗汉果醇为主要有效成分制成的药物组合物，该组合物可以根据需要含有药物可接受的载体，药物可接受的载体在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9%。

本发明的罗汉果醇制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂、贴剂。

本发明的罗汉果醇制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体包括但不限于以下物质，选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA 钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β- 环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明所述药物或保健品，是指能够降低肝纤维化组织间质中胶原堆积量的药物或保健品。

本发明所述药物或保健品，是指能抑制炎性因子释放，减轻炎症程度，抑制胶原形成、保护肝组织的抗肝纤维化的药物或保健品。

本发明所述药物或保健品，是指通过抗炎及抑制肝细胞增殖而发挥抗肝纤维化的药物或保健品。

有益效果

肝纤维化是多种肝部疾病或肝损伤发展到一定时期的一种常见的病理变化，肝纤维化持续发展可导致肝硬化、肝癌等后续并发疾病。由于肝纤维化病理机制的多环节、复杂性，单一环节或靶向干预的效果尚不理想，临床上仍然缺乏特异有效药物。本发明人通过体内外实验证明罗汉果醇可显著改善改善体内小鼠肝组织纤维化程度，降低胶原沉积，减弱TGF-β1诱导HSC-T6的体外肝纤维化，显示对体内外肝纤维化模型的干预作用。

本发明的罗汉果醇具有结构明确、稳定性好、质量易控制等特点，可以用于制备预防或/和治疗肝纤维化相关药物。本发明所涉及实验材料来自原植物，原植物分别范围广，成本低，提取物活性明确，具有广泛的实用价值。

附图说明

图1 ：MG、Mogrol对CCl₄诱导肝纤维化小鼠体重变化的影响。

图2： MG、Mogrol对各组肝组织炎症程度的影响(HE染色x200)，以及MG、Mogrol对各组肝组织纤维化程度的影响(Masson染色x200)。

图3：MG、Mogrol对CCl₄诱导肝纤维化小鼠中α-SMA蛋白含量影响。^## p < 0.01,versus control；^**p < 0.01,^***p < 0.001 versus model。

图4： MG、Mogrol对TGF-β1诱导HSC-T6中α-SMA蛋白含量影响。^## p < 0.01,versuscontrol； ^**p < 0.01,^***p < 0.001versus model。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对罗汉果醇抗肝纤维化的部分药效学试验及其结果进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。

实施例1 罗汉果醇改善CCl₄诱导小鼠的肝纤维化

取MG、Mogrol进行下述体内药效学研究。CCl₄诱导小鼠肝纤维化模型是一种经典方法,而且与人类肝纤维化相近。

1.材料与仪器

ICR小鼠，雌性，体重18-22g，由南京市青龙山动物繁殖场提供。娃哈哈纯净水；α-SMA单克隆抗体（abcam）；羊抗兔IgG（bioworld）。

2.实验方法

ICR雌性小鼠，分空白组、模型组、MG组(250 mg/kg)、Mogrol组(10 mg/kg)，药物分别灌胃给药，每组各20只。小鼠腹腔注射40%的CCl4（橄榄油悬浊液）2ml/kg，每周2次，建立肝纤维化小鼠模型；空白组腹腔注射橄榄油2ml/kg，每周2次。造模同时灌胃药物进行治疗。于造模后第6周处死小鼠，取血，离心后吸取上层血清分装冻存于-80℃；取肝脏，将部分肝放入4%中性甲醛固定，逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋后，常规切片，HE染色，Masson染色，观察肝组织损伤及纤维化变化，其余肝组织分装冻存于-80℃，用以检测α-SMA蛋白含量。CCl₄诱导肝纤维化小鼠体重变化，结果如图1，造模6周后肝组织形态学观察，结果如图2。

所有数据均用均数±SD(x±s)表示。应用SPSS11.5统计软件处理，统计采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示差异有统计学意义。

3.实验结果

3.1罗汉果醇对肝纤维化小鼠体重的影响

由CCl₄诱导肝纤维化小鼠体重变化可知，较空白组小鼠，模型组小鼠体重下降最多，在给予MG、Mogrol药物组小鼠体重均有所增加，并高于模型组（图1），说明罗汉果总苷及罗汉果醇均能一定程度上改善因肝纤维化引起的小鼠体重下降。

3.2 罗汉果醇对肝纤维化小鼠肝组织形态的影响

病理组织切片经HE、Masson染色，结果表明空白组小鼠肝组织结构完整较清晰，未见炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生，对照组小鼠的肝组织内可见少量染成蓝色的胶原纤维，是细胞外基质的主要组成部分。模型组小鼠肝细胞结构破坏，坏死、钙化，成纤维细胞增生，大量胶原沉积，形成肝纤维化。Masson染色后可见多量致密被染成蓝色的胶原纤维，呈束状或片状沉积，基本符合肝纤维化的特点, 则说明实验小鼠肝纤维化模型造模成功。经MG、Mogrol治疗后，可见小鼠肝组织结构完整较清晰，炎性细胞浸润及成纤维细胞增生程度均比模型组轻，并且胶原沉积均减少。给药各组与模型组相比，肝纤维化程度均有所减轻，且Mogrol治疗效果更好（图2）。

罗汉果醇对模型小鼠肝组织中α-SMA蛋白含量的影响。

α-SMA是肝纤维化的标志，所以可通过检测α-SMA蛋白含量来判断肝纤维化的程度。

本实验采用Western Blotting方法检测α-SMA蛋白含量，首先取肝组织50mg，剪切成细小的碎片，加入1mL的RIPA裂解液和10µL的PMSF(100mM)。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解(裂解1h)。12000g 4℃离心15分钟，取上清，分装用BCA测蛋白含量。按4:1与上样缓冲液混匀，100℃水浴变性10min，3000 g 离心10分钟后，分装保存于-80℃冰箱。然后取分装的变性蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(堆积胶为5%，分离胶为12%)分离，上样量为70ug；堆积胶电压80V，持续35min，分离胶电压120V，持续90min；用恒压110V湿法转模45min，PVDF膜，转膜时间依据电流可作调整；将PVDF膜用10%脱脂奶粉封闭120min；TBST洗涤1次；α-SMA单克隆抗体(用封闭液稀释，比例1:1000) 4℃孵育过夜；TBST 洗涤3次；羊抗兔IgG二抗（用TBST稀释，比例1:3000）室温孵育120min；TBST 洗涤3次； ECL化学发光法显色，暗室中压片曝光。以β-actin作为内参，检测蛋白质印迹条带灰度。

实验结果表明，与空白组小鼠肝组织相比，模型组小鼠肝组织中α-SMA蛋白含量显著增加(P<0.01)，MG、Mogrol药物组肝组织中α-SMA蛋白含量均显著降低(P<0.01或P<0.001)，且Mogrol治疗肝纤维化作用更好（图3），提示MG、Mogrol可以减轻CCl₄诱导小鼠体内肝纤维化。

实施例2罗汉果醇对TGF-β1诱导HSC-T6中α-SMA蛋白表达影响

HSC-T6是肝纤维化的效应细胞。转化生长因子(TGF-β)是促进肝纤维化的关键因子，其可活化HSC-T6，活化的HSC-T6可通过自分泌或旁分泌的形式释放细胞因子，持续ECM大量沉积，最终引起肝纤维化。本实验通过检测α-SMA蛋白含量来判断肝纤维化的程度。

HSC-T6购于南京凯基生物科技发展有限公司。HSC-T6采用含有10%国产小牛血清的DMEM培养基，置37℃，5% CO₂培养箱中培养。每2天换1次培养基，细胞生长90% 密度时用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞并传代。

取对数生长细胞，胰蛋白酶消化，将细胞浓度调整为2×10⁵/ml，2ml/孔接种于6孔板中，培养24h后去除培养液，分别设置空白组，TGF-β1模型组(10ng/ml)，药物组同时分别给予MG(40μM)、Mogrol(10μM)。培养24h后，拿出置于冰盒上弃培养基，预冷PBS洗两遍并弃掉，每孔加入100μl上样缓冲液，静置2-3min后，用细胞刮轻轻刮取细胞至500μl ep管中，100℃水浴变性10min，得变性后的蛋白分装保存于-80℃冰箱。同样按照上述WB法测各组细胞α-SMA蛋白。

实验结果表明，与空白组相比，TGF-β1模型组中细胞α-SMA蛋白含量显著增加(P<0.01)，MG、Mogrol药物组中α-SMA蛋白含量均显著降低(P<0.01或P<0.001)，且Mogrol治疗肝纤维化作用更好（图4），提示MG、Mogrol也可以减轻TGF-β1诱导HSC-T6体外肝纤维化。

以上实验结果表明,在MG、Mogrol给药组中，HE、Masson染色病理切片显示给药组肝纤维化程度均明显改善，提示MG、Mogrol具有抑制胶原形成、保护肝组织的作用。在CCl₄诱导小鼠体内肝纤维化和TGF-β1诱导HSC-T6体外肝纤维化实验中，MG、Mogrol药物组均可以降低α-SMA蛋白表达，证实了MG、Mogrol的抗肝纤维药物用途，且Mogrol治疗肝纤维化作用更好。

Claims

1.罗汉果醇在制备预防或/和治疗肝纤维化的药物或/和保健品中的应用。

2.如权利要求1所述罗汉果醇，其特征在于，所述罗汉果醇，是由罗汉果提取物经酸水解得到，且结构式如下所示：

。

3.如权利要求2所述的罗汉果醇还可以使用经化学修饰得到的罗汉果醇衍生物代替，所述罗汉果醇衍生物包括但不限于罗汉果醇的卤化物、酯化物、胺基化合物、醚化物以及罗汉果醇的盐等衍生物。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述应用，包括在与肝纤维化相关的疾病中的应用。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述应用，包括在抗急性肝损伤、肝硬化、病毒性肝炎、肝癌方面的应用。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用，包括降低胶原蛋白沉积，减少炎性因子释放，降低肝组织中α-SMA的表达，抑制肝脏成纤维细胞增殖。

7.如权利要求1所述的药物或/和保健品，其特征在于，所述药物或/和保健品，是以罗汉果醇为主要活性成分制备成的制剂。

8.如权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述制剂包括片剂、胶囊剂、注射剂、口服液、丸剂、散剂。