CN101500602A - 控制肥胖症的疫苗及方法 - Google Patents

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CN101500602A CNA2007800298733A CN200780029873A CN101500602A CN 101500602 A CN101500602 A CN 101500602A CN A2007800298733 A CNA2007800298733 A CN A2007800298733A CN 200780029873 A CN200780029873 A CN 200780029873A CN 101500602 A CN101500602 A CN 101500602A
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Abstract

本发明涉及减慢个体体重增长和治疗个体肥胖的免疫偶联物。该免疫偶联物包含特定生长激素释放因子多肽和适合的载体半体。

Description

控制肥胖症的疫苗及方法
交叉参考相关应用
本申请要求申请日为2006年8月1日的美国临时申请号为No.60/821,071的专利申请的优先权，全部引入该申请以供参考。
前言
肥胖通过并存疾病(comorbidity)如心脏病、癌症、2型糖尿病、卒中、关节炎和多数抑郁症危及世界各地数百万人的生命。世界各地约10亿人超重或肥胖(体重指数分别等于25-30或≥30kg/m2)，并且在富裕国家呈不相称的较高患病率。例如，在美国，全国健康和营养检查调查(the National Health and Nutrition Examination Survey，NHANES)机构发现，2003-2004年期间，大约有66％的20岁或20岁以上的所有美国成年人超重或肥胖。每5名年龄在40-59岁之间的成年男子中有近4人超重或肥胖。即使是在年龄介于6-11岁和12-19岁儿童和青少年中，也分别有19％和17％的人超重。令人震惊的是，青少年肥胖的患病率在过去二十年中增至三倍。超重或肥胖人口数目的增加跨越所有年龄、种族和人种，以及男女两性，是全球化的增加。例如，中国城市学龄前儿童于1989至1997年间肥胖的患病率增长超过8倍，而1980至2002年间英国成年人的肥胖率增长近3倍。3组NHANES的混杂校正分析显示，2000年美国超过110,000死亡病例均与肥胖相关，并且在美国肥胖症经济成本估计已经达$1.17千亿美元。
这个时候，肥胖可用的包括药物治疗在内的非手术治疗方法，是治标不治本的，只有当持续治疗时才有效。当治疗停止，体重增加是不可避免的结果。起效的肥胖治疗方法，这些方法必须影响能量摄入、吸收、消耗或储存。虽然许多药物已经上市或正处在能否治疗肥胖症的研究当中，但一些药物存在不利的副作用，包括失眠、无力、大便失禁、高血压、心动过速、心脏瓣膜异常、甚至死亡。因此，一些减肥药品已被食品和药物管理局禁止，包括第一个批准用于减肥的药物去氧麻黄碱(desoxyephedrine)(1946年)和更近的d-芬氟拉明(d-fenfluramine/fenfluramine)(1997年9月)和麻黄素生物碱类(2004年4月)。
幸运的是，过去十五年的研究使得对于稳态控制体重和脂肪的分子机制的理解发生了巨大的变化。越来越多的实验结果支持能量守衡的脂肪稳衡假说，该假说认为大脑试图将储存的长期不变的能量以脂肪组织的形式保留下来。因此，高度整合的、多余的神经体液能量平衡反馈系统，通过行为和代谢机制能尽量减少能量平衡的短期波动的影响，尤其是负面的能量平衡对脂肪量的影响。人或啮齿类动物的突变引起功能丧失导致单基因性肥胖综合征或获得肥胖症抵抗的基因的鉴定为鉴别调节能量平衡相互关联的途径提供了重要的遗传学切入点。这些个体和配体的鉴定导致研究工作对准能量谱两端的信号分子，但是，尚未研究出活疫苗或治疗方式。
发明内容
本发明的发明人已经发现通过主动免疫接种生长激素释放因子(ghrelin)来源的多肽免疫偶联物调节胃内分泌激素生长激素释放因子的生物可利用度是调节能量平衡和减慢体重增长并节约瘦体重的手段。
因此，一方面，本发明提供包含生长激素释放因子多肽和载体半体的免疫偶联物，其中生长激素释放因子多肽通过连接半体偶联到载体半体上。含生长激素释放因子多肽的免疫偶联物包含下列序列：
Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C
其中A和B定义如下：
A是具有下列结构的半体：
Figure A200780029873D00051
其中，Y1和Y2独立地选自O、CH2或NH；n是0或1；Z是C、PO或SO；并且R是具有约3至约10个碳原子的饱和或不饱和、支链或非支链的、取代或未取代的烃基基团，或是具有约3至约13个碳原子的环烷基或芳基基团；并且
B包含SEQ ID NO：2的0至23个连续氨基酸残基的子序列；并且C包含载体半体。
另一方面，本发明提供包含致免疫效量的上述免疫偶联物和生理学上可接受载体的组合物。
另一方面，本发明提供诱导个体产生抗生长激素释放因子的免疫应答的方法，该方法包含对个体使用包含免疫有效量的上述免疫偶联物和生理学上可接受载体的组合物。
另一方面，本发明提供控制个体肥胖的方法。该方法包含对个体使用上述组合物。
附图说明
图1显示如实施例中所述用于诱导生长激素释放因子特异性免疫应答的生长激素释放因子半抗原免疫偶联物Ghr1、Ghr2和Ghr3。
图2图解代表接种生长激素释放因子半抗原免疫偶联物对全身能量平衡的影响，以对每日体重增长(A图)、每日食物摄入(B图)和饲养效率(C图)的影响衡量。
图3示意性代表血浆抗生长激素释放因子-半抗原结合力与全身能量平衡、肥胖症和脑/血浆生长激素释放因子比例的关系，上述关系经高血浆滴度和低血浆滴度的个体(图A)的血浆亲和力(B图)、每日体重增长(C图)、每日食物摄入(D图)、饲养效率(E图)、相对无脂肪干重(F图)、血浆来普汀(leptin)水平(G图)和脑/血浆总生长激素释放因子比例(G图)间的比较证实。
具体实施方式
本发明提供生长激素释放因子多肽免疫偶联物，其中免疫偶联物的生长激素释放因子多肽部分包括如本文所述位于第三氨基酸位置的修饰的丝氨酸残基。下列序列可适当地代表免疫偶联物：
Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C
其中A和B定义如下：
A是具有下列结构的半体：
Figure A200780029873D00071
其中：Y1和Y2独立地选自O、CH2或NH；n是0或1；Z是C、PO或SO；R是具有约3至约10个碳原子的饱和或不饱和的、分支或非分支的、取代或未取代烃基基团或是具有约3至约13个碳原子的环烷基或芳基基团；
B包含SEQ ID NO：2序列的0至23个连续氨基酸残基的子序列；
并且C包含载体半体。
免疫偶联物与生理学上可接受的载体可适当地包括在疫苗组合物中。本发明还提供诱导个体产生抗生长激素释放因子免疫应答和控制个体肥胖症的方法。
生长激素释放因子多肽
正如本文和本领域所用，术语“多肽”是指通过酰胺键连接起来的两个或多个氨基酸半体，并既包括肽也包括蛋白质。本发明的生长激素释放因子多肽可纯化或合成。“纯化”是指将物质从其原始状态下与其正常相伴的组分中至少部分分离出来。正如技术人员所理解的那样，多肽的纯度是通常用如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析技术测定。正如本文所用的那样，“合成”是指本领域技术人员所知的既可重组产生也可通过固相技术制备产生。
本发明的生长激素释放多肽具有至少包含Gly Ser Xaa Phe Leu(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中A表示具有结构式(I)的结构的修饰丝氨酸残基：
Figure A200780029873D00081
提及结构式(I)，Y1和Y2独立地选自O、CH2或NH；并且n是0或1。而且结构式(I)中Z适当地选自C、PO或SO。R是具有约3至约10个碳原子的饱和的或不饱和的、分支的或非分支的、取代的或未取代的烃基基团，或是具有约3至约13个碳原子的环烷基或芳基基团。正像本文所用的那样，“烃基基团”是指其链上具有特定数目的碳原子的脂肪族烃基基团。该烃基基团可包含，例如烷基、烯基或炔基基团。在特别适合的具体实施方式中，Y1是O，Z是C，n是0，且R是-CH2CH2CH3。在下面详细列出的序列中，A是Xaa。
生长激素释放因子多肽可进一步包含B，其中B是生长激素释放因子多肽全长的羧基末端子序列。该子序列包括任何SEQ ID NO：2序列或SEQ ID NO：2的全长序列。换句话讲，生长激素释放因子多肽包含SEQ ID NO：1序列和SEQ ID NO：2序列或其子序列。例如，全长生长激素释放因子多肽序列可包含下列任意序列：
Gly Ser Xaa Phe Leu(SEQ ID NO：1)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser(SEQ ID NO：3)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro(SEQ ID NO：4)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu(SEQ ID NO：5)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His(SEQ ID NO：6)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln(SEQ ID NO：7)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg(SEQ ID NO：8)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val(SEQ IDNO：9)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln(SEQID NO：10)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln(SEQ ID NO：11)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg(SEQ ID NO：12)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys(SEQ ID NO：13)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu(SEQ ID NO：14)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser(SEQ ID NO：15)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys(SEQ ID NO：16)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys Lys(SEQ ID NO：17)；Gly Ser Xaa Phe Leu Ser ProGlu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro(SEQID NO：18)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro(SEQ ID NO：19)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala(SEQ ID NO：20)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser LysLys Pro Pro Ala Lys(SEQ ID NO：21)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu(SEQ ID NO：22)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln(SEQ ID NO：23)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro(SEQ ID NO：24)；或
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln GlnArg Lys Glu SerLys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg(SEQ IDNO：25)，
其中，Xaa是A，是上文定义的修饰丝氨酸。还应特别注意，上文所列氨基酸可被适合的非天然氨基酸取代，例如Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，vol.7，ed.B.Weinstein(1983)中所述的非天然氨基酸，这里引入以供参考。
还应注意到，生长激素释放因子序列应对应于免疫接种的物种特异的生长激素释放因子序列，并如本文所述在其3位上具有修饰丝氨酸。应注意由于物种之间序列保守并仅有轻微变异，所以应注意肽和物种之间的交叉反应。
载体半体
本发明的免疫偶联物包含用本领域所知的标准方法以共价或非共价偶联到C这个载体半体上的上述生长激素释放因子多肽。“载体半体”，如本文所指，是指能够增强多肽的免疫原性的偶联伴随物。例如，能用聚合体，例如碳水化合物如右旋糖酐、甘露糖或甘露聚糖。来自例如大肠杆菌和其它细菌的完整膜蛋白也可是有用的偶联伴随物。传统载体分子如钥孔戚血蓝素(KLH)、破伤风类毒素、白喉类毒素和牛血清白蛋白(BSA)也同样适合。
连接半体
如本领域所知，将可用的多肽连接到载体半体上的方法范围很广，这些方法中的任何一种都适合用于本发明。大多数策略包含通过多肽和载体的活性基团之间共价键的形成将多肽偶联到载体半体上的衍生分子上。适合地，生长激素释放因子多肽序列中带有的活性基团的一个或多个氨基酸可用于连接多肽和载体半体。适合的连接半体是那些具有氨基基团、羧基基团或巯基基团的半体。应理解，生长激素释放因子多肽序列氨基酸功能基团中可作为连接半体以使多肽偶联到载体上。这种氨基酸可包括赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸和/或组氨酸。使用生长激素释放因子多肽的抗体结合结构域外的半胱氨酸残基的二硫键偶联是一个特别适合偶联的策略，其中半胱氨酸适合用标准重组技术导入。在一个具体实施方式中，半胱氨酸残基位于生长激素释放因子多肽的末端，如羧基或氨基末端。
另外的合适的将多肽半体连接到载体上的方法为本领域所知并可用于本发明。
免疫原性组合物
生长激素释放因子免疫偶联物，如上所述，可以其免疫原性有效量与生理学上可接受的载体包含在组合物中。“免疫原性有效量”，如本文和本领域所指，是一定量的免疫偶联物，该量的免疫偶联物能够诱导免疫应答，该免疫应答显著地由具有与免疫原(例如天然内源性生长激素释放因子)相同免疫特征的试剂引起。“生理学上可接受的”载体是任何适合用于体内给药(如口服、经皮或肠外给药)或体外应用，即细胞培养。
合适地，包含本发明的生长激素释放因子免疫偶联物的组合物可配制成体内使用即对个体的治疗性或预防性给药。在特定具体实施方式中，该组合物可配制成疫苗组合物。如本文所指，“疫苗”是能够诱导个体免疫应答的组合物，包括但不限于鳌合抗体的制备。
包含将多肽序列作为活性成分的疫苗的制备通常为本领域所熟知，如示例见于U.S.Pat.Nos.4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770，本文引入以供参考。通常，这类疫苗制成可注射的液体溶液或是悬浮液；也可注射前制成适合配制成溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可是乳化剂。该生长激素释放因子免疫偶联物可与药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等类和其组合物。此外，如果需要，疫苗可包含少量辅料如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗有效性的佐剂，如下所述。
疫苗常规可经肠外给药，通过注射，例如皮下、皮内、真皮内、真皮下或肌内注射。适合其它给药模式的其它制剂包括栓剂和在某些情况下，口服、口腔含化、舌下、腹膜内、阴道内、肛门、硬脑膜、脊柱及颅内给药制剂。就栓剂而言，传统的粘合剂和载体可包括，例如，聚烷撑二醇或甘油三脂；这种栓剂可形成于包含活性成分的范围为0.5％至10％，优选是1至2％的混合物。口服制剂包括正规使用的赋形剂，例如，制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些成分的形式是溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末并包含活性成分10至95％，优选是25至70％。
应理解，疫苗以与剂量组成相容的方式给药，并以预防或治疗有效的和产生免疫原性的量给药。给药量取决于接受处理的个体，包括，例如，个人免疫系统产生免疫应答的能力和期望保护的程度。合适的剂量范围从约0.1μg/kg体重至约10mg/kg体重，如约500μg/kg体重至约1000μg/kg体重的范围。还应注意初次给药和加强注射的合适的方案，典型的该合适的方案是初次给药，接着接种或其它给药方式。
本发明的生长激素释放因子免疫偶联物的一些具体实施方式是免疫原性充分的，但是对于其它一些具体实施方式而言，如果疫苗进一步包含佐剂物质则免疫应答将增强。佐剂及其使用为本领域所熟知。术语“佐剂”本文是指下列物质：1)本身不能启动抗疫苗中的免疫偶联物的免疫应答，但是2)然而能够增强抗免疫偶联物的免疫应答。各种达到佐剂效果的方法是已知的。一般原则和方法详见The Theory andPractical Application of Adjuvants，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6，还见于Vaccines：NewGeneration Immunological Adjuvants，1995，Gregoriadis G et al.(eds.)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9。皆列于此以供参考。用于本发明的特别合适的佐剂是氢氧化铝或磷酸铝(明矾)，一般用缓冲盐溶液的0.05％至0.1％。
诱导抗生长激素释放因子免疫应答的方法
本发明的一些具体实施方式提供诱导个体产生抗生长激素释放因子免疫应答的方法。“个体”是脊椎动物，优选是哺乳动物，更优选是人。优选的个体可还包括驯养动物如猫、犬和马。应理解，出于研究目的，优选的个体是动物模型如小鼠或大鼠。应理解对于其它物种如犬、猫、马或小鼠，生长激素释放因子多肽免疫偶联物能基于物种选择。如本文所指，“抗生长激素释放因子免疫应答”特别是指诱导个体免疫系统介导的治疗性或预防性生长激素释放因子鳌合效应。这种免疫应答优选促进个体内源性生长激素释放因子清除或免疫调控，以致观察到个体全身系统范围内的效应，例如预防或减缓体重增长、节约瘦体重、降低饲养效率和降低相对肥胖。
抗生长激素释放因子免疫应答优选通过以下实施例中描述的检测评价。诱导符合本发明的个体的抗生长激素释放因子免疫应答可通过对个体使用上述生长激素释放因子免疫偶联物组合物而获得。
控制肥胖的方法
本发明的一些具体实施方式提供了一种控制个体肥胖的方法。“控制肥胖”，如本文所指，包括但不限于防止或减缓个体的体重增加，节约个体的瘦体重，降低个体的饲养效率和降低个体的相对肥胖。控制肥胖的方法可通过对个体使用上述生长激素释放因子免疫偶联物组合物而达到。最优选的是，本发明防止个体肥胖的发展。
对个体使用符合本发明的生长激素释放因子免疫偶联物组合物似乎显示出剂量依赖性有益效果。因此，在广泛的范围内，使用较大量的生长激素释放因子免疫偶联物组合物比使用较小量有望在更大程度上控制肥胖。此外，也应注意低于出现毒性作用的剂量的疗效。而且，实际上，通常在将肥胖症治疗至理想的终点时使用较大剂量，而通常在用于预防目的或减缓体重增加时使用较小的剂量。
应理解，正如本领域技术人员所熟知的那样，任何给定病例中使用的特定剂量将可根据个体的条件和其它可改变生长激素释放因子免疫偶联物活性或个体应答的相关医学因素而调整。例如，特殊患者的特定剂量取决于年龄、体重、一般健康状况、饮食、服药周期和模式、排泄速率和一同服用的药物。对于给定患者的剂量能用如通过适当的常规药理学或预防性的流程的方式的常规须考虑的事项确定。
个体的最大剂量是不会导致不良或不能忍受的副作用的最高剂量。有关个体预防或治疗方案变化的数值很大，并且预期有相当广泛的剂量范围。预计应注意免疫偶联物的剂量的范围是从约0.1μg/kg体重至约10mg/kg体重，如在约500μg/kg体重至约1000μg/kg体重的范围内的剂量，与治疗前症状相比，可防止或减少至少50％的症状。特别应注意，本发明的疫苗制品和组合物可减慢或缓和体重增长而非治愈，或在一些具体实施方式中可用于治疗或预防肥胖。
特别应注意，本发明的任何方法或组合物的任何具体实施方式可与本发明的任何其它方法或组合物一起使用。
如在说明书中和所附权利要求中所指，单数形式的“a”“an”和“the”包括其复数除非其内容另行明确指明。因此，例如，包含“多肽”的组合物包括两个或多个多肽的混合物。还应注意术语“或”一般是“和/或”的意思除非其内容另行明确指明。
还应特别理解本文叙述的任何数值包括从低值至高值的所有数值，即最低值和最高值之间所有可能的数值组合均应视为已被本申请清楚地陈述。例如，如果某范围陈述为1％至50％，该范围是指例如2％至40％、10％至30％或1％至3％等数值清楚地列举于说明书中。
实施例
提供下列实施例以帮助进一步理解本发明。所用的特定物质和条件旨在进一步说明本发明并不限制所附权利要求的合理范围。
实施例1.生长激素释放因子半抗原免疫偶联物的合成
合成Ghr1-Ghr3，并将其偶联到载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)上，产生免疫偶联物Ghr1-KLH、Ghr2-KLH和Ghr3-KLH。对于多肽合成而言，所有半抗原和底物在CS Bio 136自动肽合成仪上用Fmoc/tBuSPPS的常规记录的DIC/HOBt流程以C末端酰胺的方式以1.0mmol的规模制备。对带有Ser-3侧链酯化的肽，10mmol的必需酸用于10mLDCM中的5mmol DIC预激活20分钟，此后加入10mL DMF。所得浆液加入到部分保护的肽树脂中，接着加入0.5mmol DMAP，并在轨道摇床上混和过夜。试验性TFA剪切用于验证定量酰化作用，对于Lys(Mca)偶联，肽-树脂与于1:1 DMF:DCM中的0.2eq.Pd(PPh3)4和10eq.N，N’-二甲基巴比妥酸震荡12小时。然后用5％DIEA/DMF处理使新暴露的游离胺中和，此后根据标准DIC/HOBt流程将7-甲氧基香豆素-4-乙酸偶联上。对于正丁酸偶联，5mmol正丁酸用于10mL DCM中的5mmol DIC预激活20分钟，此后加入10mL DMF。将所得浆液加入到保护的肽-树脂中，接着加入0.5mmol DMAP，使其反应1小时，并将完整流程进行两次以达到定量的正-丁酰化。用DMF和DCM(每次洗涤以2x20秒流量)洗涤之后，将完整的肽-树脂真空干燥过夜。通过用95:2.5:2.5 TFA：水：三异丙基甲硅烷(TIPS)分批处理2小时达到全面脱保护和剪切，接着通过旋转蒸发滤过和去除TFA。然后从10体积的Et2O(在20℃预冷)中磨碎肽。然后用50％AcOH抽提肽并直接用RP-HPLC纯化。
生长激素释放因子(1-10)Ser-3(丁酰基)半抗原，Ghr1。ESI-MS：理论值，MW＝1406.4；M1+＝1407.4，M2+＝704.2。测定值，M1+＝1408.3，M3+＝704.0。
生长激素释放因子(13-28)半抗原，Ghr2。ESI-MS：理论值，MW＝2166.5；M2+1084.3，M3+＝723.2。测定值，M2+＝1084.5，M3+＝723.2。
大鼠生长激素释放因子(1-28)Ser-3(丁酰基)半抗原，Ghr3。ESI-MS：理论值，MW＝3506.0；M2+＝1754.0，M3+＝1169.7。测定值，M2+＝1754.1，M3+＝1169.7。
实施例2.个体和疫苗接种流程
将成年雄性Wistar大鼠(n＝17，M+SEM：413+8g初始，502+12g四次接种后；Charles River，Hollister，CA)分别关在室内的可持续获得食物和水的12小时：12小时灯照(6点开启灯照)，湿度-(60％)和温度控制(22℃)的动物饲养所内。片状食物饮食(LM-485饮食7012；Harlan Teklad，Madison，W1，USA))是主要是玉米的，包含65％碳水化合物、13％脂肪、21％蛋白质，代谢能为3.41kcal/g的挤压谷类。饲养过程参照National Institutes of Health的Care and Use of LaboratoryAnimals指南(NIH公布号85-23，1996年修订)和Principles ofLaboratory Animal care(http://www.nap.edu/readingroom/bookslabrats)并经the Institutional Animal Care and Use Committee of The ScrippsResearch Institute批准。
年龄和体重匹配的成年大鼠免疫接种用Qi等人的论文《Δ9-Tetrahydrocannabinol immunochemical studies：Haptens，monoclonalantibodies，and a convenient synthesis of radiolabeledΔ9-Tetrahydrocannabinol，Journal of Medical Chemistry，(2005)，48：7389-7399》(在此引入以供参考)中所述的我们的实验室流程进行。免疫接种包含5次超过12周的免疫接种。于实验日第0、21、35、56和84天，在黑暗周期之前90分钟，使年龄和体重匹配大鼠接受免疫接种(腹腔注射0.4ml)。前3次免疫接种构成如下：pH7.4的RibiMPL-TDM乳剂型佐剂(RIBI Immunochemical Research Inc.)，其在100mM PBS中含有250μg Ghr1-KLH、Ghr2-KLH、Ghr3-KLH或KLH。后两次用明矾(Pierce)作为佐剂。接种后1周采集尾血，离心血浆用于分析抗体滴度和生长激素释放因子的结合亲和力。
实施例3.疫苗接种大鼠中血浆疫苗抗体滴度和生长激素释放因子的结合亲和力
将大鼠按实施例2所述方法进行疫苗接种。血浆抗体滴度通过ELISA测定。将每孔含3ng Ghr3-BSA(溶于50μL的pH7.2的10mMPBS中)的ELISA平皿(96-孔，COSTAR 3590)干燥过夜，接着进行常规乙醇固定并用于PBS中的blotto(脱酯奶)封闭。大鼠血浆样品在Blotto中从1:100稀释开始进行系列稀释。使血浆结合在37℃潮湿仓室内进行1小时。洗涤过后，每孔加入200ng于50μLPBS-blotto中的与碱性磷酸酶(Southern Biotech)偶联的山羊抗大鼠IgG，并于在37℃潮湿仓室内温育1小时。平皿用水彻底洗涤、空气干燥和每孔加入200μL于100mM，pH7.4的4-吗啉基丙磺酸(4-morpholinepropanesulphonicacid，MOPS)的200μM对硝基苯酚磷酸盐(Pierce)显色。室温3小时后，在微孔板读出器(分子生物学仪器)上测量405nm的吸光度值。结果如下表1所示。
血浆的生长激素释放因子的特异性用两种分析方法测定：平衡透析分析和竞争性ELISA。用系列稀释的[125I]-大鼠生长激素释放因子(丝氨酸-3-正辛酰基，Bachem，用非标记的生长激素释放因子原位稀释的)作为配基和不变的血浆量(用pH7.4的PBS以1:1稀释)进行平衡透析分析。在一块微量滴定平皿(每个样品12)的孔中加入170μL于PBS中的放射性标记的生长激素释放因子，并将第二块板的孔中加入于PBS中的大鼠血浆(170μL/孔)(用生长激素释放因子-KLH免疫偶联物或仅用KLH免疫接种的大鼠)。这两块板紧紧连接在一起，液体填充的孔彼此相对并用透析膜分离(截断14,000道尔顿)。将滴定板垂直地系在摇床上并于室温震荡24小时，此后将其小心分离。将膜去除并从每孔中取100μL移至试管中进行γ放射线计数。测定生长激素释放因子每种稀释度相对的孔间每分衰变数(DPM)的差异的均值，产生近似的结合常数(Kd-app)。结果如下表1所示。
对于竞争性ELISA而言，平皿(96孔)于4℃用新鲜制备的生长激素释放因子-BSA偶联物包被过夜。平皿用4％脱脂奶封闭，洗涤并加入适当稀释度的血浆样品。洗涤平皿并将始于100μM的浓度系列的丝氨酸-3正辛酰基-生长激素释放因子加入到每孔中。平皿于37℃温育1小时，彻底洗涤并加入山羊抗小鼠-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(Pierce)。室温温育1小时后，再次彻底洗涤平皿并加入HRP底物(TMB底物试剂盒，Pierce)，是反应显色15分钟并通过加入2M H2SO4使反应终止。读出吸光度(450nm)并用GraFit(Erithacus Software Ltd)绘出数值。其吸光度值是最大吸光度值的50％的游离抗原浓度被认为是血浆生长激素释放因子的平均KD-app。结果如下表1所示：
表1
Figure A200780029873D00171
数据以M盨EM表示。滴度和血浆亲和力是变换成相对于计算平均数、选择性比例的对数，并用于统计学分析。数值反映逆对数变换(antilog transformations)。
如表1所示，至9周时或第四次免疫接种之后，Ghii-KLH和Ghr3-KLH生长激素释放因子免疫偶联物皆产生良好的免疫应答(使疫苗抗体滴度增加)。应答是适度特异性的，Ghr1-KLH诱导产生的抗体并不与Ghr2-BSA发生交叉反应，并且Ghr2-KLH诱导产生的抗体同样与Ghr1-BSA具有低亲和力(数据未显示)。尽管每个免疫接种组发生抗以免疫偶联物(作为疫苗接种)的免疫应答，仅免疫接种Ghr1-KLH或Ghr3-KLH的组的大鼠对正-辛酰基化的生长激素释放因子这一推定的活性循环中的形式显示出良好的血浆结合力。接种Ghr1-KLH或Ghr3-KLH疫苗的大鼠的血浆不能有效地结合循环中占优势的失活的去辛酰基形式的生长激素释放因子(至少1.8∶1的比例)(Sato等人，Molecular forms of hypothalamic ghrelin and its regulation by fasting and2-deoxy-d-glucose administration(2005)，Endocrinology，146：2510-6，这里引入作为参考)，并可能以另外的方式竞争中和抗体，导致与酰基化的生长激素释放因子而不是与去酰基化的生长激素释放因子亲和力更大。
实施例4.免疫接种后体重增长、食物摄入和饲养效率
根据实施例2的描述对大鼠进行免疫接种。在以最大的抗体滴度进行第四和第五次免疫接种之后的各周中，每日在黑暗循环开始之前2小时测定体重和食物摄入(精确到0.1g)。以每单位能量摄入(mg/kcal)获得的体重增长计算饲养效率。
图2显示一旦数只大鼠接种的疫苗滴度增加到1:10,000的范围，免疫接种大鼠的相应的体重增长率、每日食物摄入和饲养效率作为个体接受的疫苗的功能。接受Ghr1-KLH和Ghr3-KLH免疫偶联物的大鼠每日体重增长少于那些第四次免疫接种之后用Ghr2-KLH或KLH免疫接种超过7天观察期的大鼠(图2A)。尽管大鼠吃(图2B)和喝(未显示)正常，上述增长还是出现了，这提示Ghr1-KLH和Ghr3-KLH疫苗接种的个体其饲养效率下降(图2C)。在这个时间之前，在5-8周之间，当滴度适中并仍引起免疫应答，每日体重增长的疫苗有关的区别(KLH：1.22±0.32相对于Ghr3-KLH：0.92±0.12和Ghr1-KLH：1.01±0.15g/天)和饲养效率(KLH：44.4±5.5相对于Ghr3-KLH：28.5±3.0和Ghr1-KLH：33.6±4.4mg/kca1)呈同向变化，但相应减小，支持推测的依赖于抗生长激素释放因子的血浆结合亲和力的观点。
实施例5.血浆抗生长激素释放因子结合能力与全身能量平衡、肥胖和脑/血浆生长激素释放因子比例的关系
为测定循环中的抗生长激素释放因子结合能力是否与体重增长减弱有关，将按照实施例2所述接种疫苗的个体分成那些对Ghr3-BSA产生高或低抗体滴度的组(图3，A图)并于第四和第五次免疫接种后的数周内进行比较。如图3所示，B图，经每个竞争性ELISA分析，每个产生高Ghr3-BSA滴度的个体同样呈现出对正-辛酰基生长激素释放因子的良好的血浆亲和力(KD-app<650nM)，一个以上的顺序均值大于那些产生低Ghr3-BSA滴度的个体。与那些较低血浆生长激素释放因子亲和力的大鼠相比，那些较高血浆生长激素释放因子结合能力的大鼠的每日体重少增长～0.5g(图3C所示)，尽管食物摄入正常(图3D)，再次提示减少了饲养效率(图3E)并且每次免疫接种之后观察到的结果大致相同。甚至较低的但是可测定的血浆生长激素释放因子结合能力的大鼠与KLH对照组相比呈现出降低的饲养效率(图3E)。
将胃肠束从解冻(25℃)的尸体上摘除。然后将尸体干燥(70℃)至质量不变以确定水分含量并在Soxhlet装置上用石油醚抽提以确定无脂肪干重，与脂肪干重相比其包含蛋白质和灰分。(Dobush等人，(1985)，Canadiaon Journal of Zoolology，63：1917-1920，这里引入作为参考)。如图3F和下表2所示，尸体分析表明，与那些产生弱的抗生长激素释放因子免疫应答的大鼠相比，产生强的抗生长激素释放因子应答的大鼠增长的无脂肪干重优先地超过脂肪干重，并且两者在水分含量上没有区别。
表2
Figure A200780029873D00191
数据用M盨EM表示。*p<0.05，*p＝0.06相对于Ghr3-BSA低滴度组，Welch′s校正t检验。
大鼠血浆和脑样品中总生长激素释放因子(辛酰基和去辛酰基组合的)的浓度用生长激素释放因子酶免疫检测试剂盒(PhoenixPharmaceuticals，Belmont，CA)测定。根据Shibata等人描述的下列方法(48)获得组织提取物(据报道生长激素释放因子的回收率可达到>95％)。简言之，全脑在干冰冷冻的2-甲基丁醇上速冻并于用前贮存于-80℃。脑组织分成10-15块并在水(10ml)中煮沸7分钟，冷却后加入乙酸(580μl，100％)以产生1M AcOH。该悬浮液用Tekmar匀浆器搅匀并于10,000rpm离心10分钟。将上清液低压冻干，重新溶解于EIA缓冲液中(Phoenix Pharmaceuticals)，并根据生产商提供的指南进行分析。与脂肪相对减少一致，强血浆生长激素释放因子亲和力的大鼠脂肪细胞激素来普汀的最终血浆水平下降(图3G)。作为血浆生长激素释放因子结合亲和力达到的功能，循环胰岛素水平确实并无区别(M±SEM：高：0.8±0.2相对于低：1.3±0.2ng/ml)。可能与循环生长激素释放因子到达中央室的量减少一致，与其血浆抗生长激素释放因子结合亲和力相关的的大鼠总生长激素释放因子脑/血浆水平的比例下降(图3H)。
实施例6.疫苗接种大鼠中血浆炎症调节因子水平
为了检测疫苗接种效应可能产生非特异性系统性免疫应答的可能性，按照实施例2所述的方法测定了疫苗接种大鼠包括白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1和总纤溶酶原激活物抑制因子1型的促炎性调节因子。
于实验第92天，进入黑暗循环的1-4小时内将大鼠断头处死，并将躯干血用含有0.5M EDTA(～1/10v/v)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(～1/100v/v)(Sigma，St.Louis，MO)的冷冻聚丙烯试管收集。离心(3000rpm，4℃，20分钟)获得血浆，并将其贮存于-80℃直至通过多重大鼠脂肪因子嵌板(Linco，St.Charles，MO)，基于xMAPTM技术的用
Figure A200780029873D0020150021QIETU
仪器进行的免疫测定方法，进行分析。TNF-α、MCP-1和IL-1β灵敏度的限制是4.9pg/ml，来普汀、IL-6、胰岛素和总PAI-1灵敏度的限制是12.2pg/ml。典型批内分析的变异系数是<4％。
如下表3所示，血浆水平在处理组间的绝对基数之上是低的，并与血浆酰化生长激素释放因子的特异性无关。
表3
Figure A200780029873D00211
数据用M盨EM表示或用达可检测出的水平的频率表示。
实施例7.统计学
使用变异数分析(ANOVA)鉴定组间差异。F测验保护最小显著差法(Fisher′s protected LSD tests)用于事后比较。Welch′s t-检验(以多重比较进行校正)，用于不等变量的组间比较。为了减少变量的不均一性并达到更加正态的分布，IL-6、TNF-α、总PAI-1、MCP-1、血浆抗体滴度、血浆生长激素释放因子的外观上的结合亲和力常数和脑/血浆总生长激素释放因子比例的的数据首次变换成统计分析的对数，包括滴度选择性比例的计算。表或图中列出的相应数值代表反对数变换。卡方分析用于检验个体是否含有的可检测的循环细胞因子水平的频率上有区别。软件包是Systat 11.0(SPSS，Chicago，III.，USA)。
序列表
<110>斯克里普斯研究院
<120>控制肥胖症的疫苗及方法
<130>017968-9004-WO00
<140>国际新申请
<141>2007-08-01
<150>US 60/821,071
<151>2006-08-01
<160>31
<170>PatentIn version 3.3
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<211>5
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<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>1
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<223>位置6上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
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<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<221>杂项特征
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<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<221>杂项特征
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<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
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<221>杂项特征
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<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
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<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
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<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa选自Lys(K)或Arg(R)
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<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa选自Ala(A)或Val(V).
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<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
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<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
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<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
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<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
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<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
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<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>17
Figure A200780029873D00281
<210>18
<211>21
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>18
Figure A200780029873D00282
<210>19
<211>22
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>19
Figure A200780029873D00291
<210>20
<211>23
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>20
<210>21
<211>24
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>21
Figure A200780029873D00293
Figure A200780029873D00301
<210>22
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>22
<210>23
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>23
<210>24
<211>27
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>24
Figure A200780029873D00311
<210>25
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>智人或褐鼠
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<220>
<221>杂项特征
<222>(11)..(11)
<223>位置11上的Xaa是Lys(K)或Arg(R).
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>位置12上的Xaa是Ala(A)或Val(V).
<400>25
Figure A200780029873D00312
<210>26
<211>27
<212>PRT
<213>猫
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>26
Figure A200780029873D00321
<210>27
<211>28
<212>PRT
<213>野猪
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>27
Figure A200780029873D00322
<210>28
<211>28
<212>PRT
<213>家犬
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>28
<210>29
<211>28
<212>PRT
<213>恒河猴
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>29
Figure A200780029873D00324
<210>30
<211>28
<212>PRT
<213>原鸡
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>30
Figure A200780029873D00331
<210>31
<211>28
<212>PRT
<213>野马
<220>
<221>杂项特征
<222>(3)..(3)
<223>位置3上的Xaa是修饰的通式(I)的丝氨酸.
<400>31
Figure A200780029873D00332
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1、一种免疫偶联物，该免疫偶联物包含下列部分：
a)包含Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C的生长激素释放因子多肽，其中：
A包含：
其中
Y1和Y2独立地选自O、CH2或NH；
每个n独立地是自0或1；
Z是C、PO或SO；并且
R是具有约3至约10个碳原子的饱和或不饱和的、分支或非分支的、取代的或未取代的烃基基团，或是具有约3至约13个碳原子的环烷基或芳基基团；
B包含SEQ ID NO：2的0至23个连续氨基酸残基的子序列；并且
b)C包含载体半体，
其中生长激素释放因子多肽通过连接半体连接到载体半体上。
2、根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中A包含
Figure A200780029873D00381
3、根据权利要求1或权利要求2所述的免疫偶联物，其中B包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至5。
4、根据权利要求1至3任一项所述的免疫偶联物，其中连接半体是半胱氨酸残基。
5、根据权利要求4所述的免疫偶联物，其中半胱氨酸残基位于生长激素释放因子多肽的末端。
6、根据权利要求5所述的免疫偶联物，其中末端是羧基末端。
7、根据权利要求1至6任一项所述的免疫偶联物，其中载体是KLH或BSA。
8、一种包含免疫有效量的权利要求1至7任一项所述的免疫偶联物和生理学上可接受的载体的组合物。
9、一种诱导个体抗生长激素释放因子免疫应答的方法，该方法包含对个体使用权利要求8的组合物。
10、一种控制个体肥胖的方法，该方法包含对个体使用权利要求8的组合物。
11、根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中Y1是O，Z是C，n是0并且R是-CH2CH2CH3。
根据条约第19(1)条修改时的声明：
根据条约第19条对权利要求书所作的修改对于附图无影响，且未超出本国际申请最初提交时的范围。
按照修改，权利要求1-11提及的主题名称未在国际检索报告中列举的现有技术中发现。

Claims (10)

1、一种免疫偶联物，该免疫偶联物包含下列部分：
a)包含Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C的生长激素释放因子多肽，其中：
A包含：
Figure A200780029873C00021
其中
Y1和Y2独立地选自O、CH2或NH；
n是0或1；
Z是C、PO或SO；并且
R是具有约3至约10个碳原子的饱和或不饱和的、
分支或非分支的、取代的或未取代的烃基基团，或是
具有约3至约13个碳原子的环烷基或芳基基团；
B包含SEQ ID NO：2的0至23个连续氨基酸残基的子序列；并且
b)C包含载体半体，
其中生长激素释放因子多肽通过连接半体连接到载体半体上。
2、根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中Y1是O，Z是C，n是0，并且R是-CH2CH2CH3。
3、根据权利要求1或权利要求2所述的免疫偶联物，其中B包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至5。
4、根据权利要求1至3任一项所述的免疫偶联物，其中连接半体是半胱氨酸残基。
5、根据权利要求4所述的免疫偶联物，其中半胱氨酸残基位于生长激素释放因子多肽的末端。
6、根据权利要求5所述的免疫偶联物，其中末端是羧基末端。
7、根据权利要求1至6任一项所述的免疫偶联物，其中载体是KLH或BSA。
8、一种包含免疫有效量的权利要求1至7任一项所述免疫偶联物和生理学上可接受载体的组合物。
9、一种诱导个体抗生长激素释放因子免疫应答的方法，该方法包含对个体使用权利要求8的组合物。
10、一种控制个体肥胖的方法，该方法包含对个体使用权利要求8的组合物。
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