BRPI0715345A2 - vacinas e mÉtodos para controle da adiposidade - Google Patents
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Abstract
VACINAS E MÉTODOS PARA CONTROLE DA ADIPOSIDADE. A invenção se refere aos imunoconjugados para impedir o ganho de peso e ao tratamento da obesidade em um indivíduo. Os imunoconjugados compreendem polipeptideos de ghrelina específicos e uma fração veículo apropriada.
Description
"VACINAS E METODOS PARA CONTROLE DA ADIPOSIDADE，， REFERgNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS CORRELATOS
Esse pedido reivindica prioridade com relagao ao Pedido Provisorio dos Estados Unidos niimero 60/821.071, depositado em 1° de agosto de 2006, que e incorporado como referencia em sua totalidade.
INTRODUCAO
A obesidade amea^a as vidas de milhdes de pessoas mundialmente, atraves da co- morbidez, por exemplo, doengas cardiacas, canceres, diabetes do tipo 2，acidente vascular, art rite e depressao maior. Cerca de 1 bilhao de pessoas mundialmente estao acima do peso ou obesas (indice de massa corporea = 25-30 ou >30 kg/m2’ respectivamente) com taxas prevalentes desproporcionalmente altas em paises ricos. Por exemplo, nos Estados Unidos da America, ο National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) verificou que, em 2003-2004, aproximadamente 66% de todos os adultos americanos com 20 anos de idade ou mais velhos estavam acima do peso ou obesos. Quase 4 de cada 5 adultos ho- mens com idades entre 40-59 anos tambem foram classificados dessa forma. Mesmo em crian9as e adolescentes entre as idades de 6-11 e 12-19，19% e 17%, respectivamente, es- tavam acima do peso. De modo alarmante, a prevalencia da obesidade triplicou em adoles- centes nas iiltimas duas decadas. O aumento no niimero de pessoas que estao acima do peso ou obesas se encontra em todas as idades, grupos raciais e etnicos e de ambos os sexos e vem crescendo mundialmente. Por exemplo, a prevalencia da obesidade em alunos pre-escolares urbanos na China teve um salt。mais de 8 vezes entre 1989-1997, e a taxa de obesidade em adultos Britanicos subiu quase 3 vezes de 1980-2002. Em 2000，mais de 110.000 obitos nos Estados Unidos estavam associados a obesidade，conforme mostrado pela analise ajustada de 3 coortes NHANES e ο custo economico da obesidade nos Estados Unidos da America foi estimado como sendo de $117 bilh5es.
Ate ο momento, os tratamentos nao ciriirgicos disponiveis para obesidade, incluin- do medicamentos sao paliativos e eficazes apenas enquanto ο tratamento e mantido. Quan- do os tratamentos sao descontinuados, ο ganho de peso e inevitavel. Para que os tratamen- tos contra obesidade funcionem, eles devem afetar a ingestao de energia, absorgao, gasto ou armazenamento. Embora muitos medicamentos tenham sido comercializados ou estejam atualmente sob investigagao para ο tratamento da obesidade, varios efeitos colaterais ad- versos se encontram atualmente sob investigagao para ο tratamento da obesidade, varios possuem efeitos colaterais ad versos, incluindo insonia, astenia, incontinencia fecal, hiper- tensao, taquicardia, anormalidades das valvulas do cora?ao e mesmo a morte. ConseqCien- temente, varios medicamentos para perda de peso foram banidos pela Food and Drug Ad- ministration, incluindo ο primeiro aprovado para essa indicagao, a desoxiefedrina (1946) e
mais recentemente cf-fenfluramina/fenfluramina (setembro de 1997) e alcaloides de efedrina (abril de 2004).
Felizmente, a pesquisa nos Ciltimos quinze anos revolucionou ο entendimento dos mecanismos moleculares que controlam homeostaticamente ο peso corporeo e a gordura. Verifica50es ja realizadas sustentam uma hipotese Iipostatica da homeostasia da energia, na qual ο cerebro busca manter a energia armazenada constante, como tecido adiposo, por periodos de tempo maiores. Conseqiientemente, um sistema de retorno da homeostasia de energia neuro-humoral redundante’ altamente integrado, atraves dos mecanismos compor- tamentais e metabolicos, serve para minimizar ο impacto de flutuagdes de curto prazo no equilibrio da energia e especialmente ο equilibrio de energia negative na massa de gordura. A identificaQao dos genes cuja perda de mutag5es funcionais resulta em sindromes de obe- sidade moriogenicas ou conferem resistencia a obesidade em seres humanos ou roedores obteve pontos de entrada geneticos importantes para caracterizagao das vias interconecta- das que regulam a homeostasia da energia. A identifica?ao desses receptores de Iigantes conduziu aos esforgos de pesquisa para alvejar sinais em ambas as extremidades do espec- tro de energia, contudo, nenhuma vacina viavel ou modalidade de tratamento se encontra disponivel ainda.
sumArio da invencao
Os inventores descobriram que a modulagao da biodtsponibilidade do hormonio en- docrino gastrico ghrelina atraves da imunizagao ativa com imunoconjugados de polipeptideo derivados de ghrelina obtem um meio para regular ο equilibrio de energia e ganho de peso lento enquanto sparing a massa magra.
Conseqijentemente1 em um aspecto, a invengao obtem um imunoconjugado que compreende um polipeptideo de ghrelina e uma fragao veiculo, onde ο polipeptideo de ghre- lina e Iigado a fra^ao veiculo por uma fragao ligante. O imunoconjugado de polipeptideo de ghrelina compreende a seqijencia que se segue: Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C onde AeB sao definidos como se segue: A e uma fragao possuindo a seguinte estrutura: ο
il
yzz “
(h2C( 1
I n H I -N-CH-C-
il
ο
onde: Y1 e Y2 sao selecionados independentemente de O, CH2 e NH; η e O ou 1; Z e C, PO ou SO; e R e um grupo hidrocarboneto saturado ou insaturado, ramificado ou linear,
substituido ou nao substituido tendo cerca de 3 a cerca de 10 atomos de carbono, ou e um grupo cicloalquila ou arila tendo cerca de 3 a cerca de 13 atomos de carbono; e
B compreende uma subseqiiencia de O a 23 residuos de aminoacido consecutivos da SEQ ID NO: 2; e C compreende a fragao veiculo.
Em outro aspect。，a inven9§o obtem uma composigao compreendendo uma quan- tidade imunogenicamente eficaz do imunoconjugado descrito acima e um veiculo fisiologi- camente aceitavel.
Ainda em outro aspecto, a invengao obtem um metodo de indugao de uma resposta imune antighrelina em um individuo compreendendo admiriistragao ao individuo de uma composigao compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz do imunoconjugado descrito acima e um veiculo fisiologicamente aceitavel.
Em um aspecto adicional, a invengao obtem um metodo de controle de adiposidade em um individuo. O metodo engloba administragao ao individuo da composigao descrita acima.
BREVE DESCRICAO DOS DESENHOS A figura 1 ilustra imunoconjugados de ghrelina-hapteno Ghrl，Ghr2 e Ghr3 empre-
gados para gerar respostas imunes especificas para ghrelina, conforme descrito nos exem- plos.
A figura 2 representa graficamente os efeitos da vacina9§o com imunoconjugados de ghrelina-hapteno na homeostasia de energia corporea integral, como uma fungao do ga- nho de peso corporeo diario (painel A), ingestao diaria de alimentos (painel B) e eficiencia do alimento (painel C)·
A figura 3 representa graficamente a rela9ao da capactdade de IigagSo plasmatics antighrelina para homeostasia de energia corporea integral, adiposidade e taxas de ghrelina no cerebro/plasma, conforme demonstrado por comparagoes de individuos com titulagdes plasmaticas alta e baixa (painel A) em termos de afinidade de plasma (painel B), ganho de peso diario (painel C), ingestao diaria de alimentos (painel D), eficiencia da alimenta^ao (painel E), massa seca isenta de gordura relativa (painel F), niveis de Ieptina no plasma (painel G) e taxa de ghrelina total no cerebro/plasma (painel G).
DESCRICAO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS A presente invengao obtem imunoconjugados de polipeptideo de ghrelina, onde a
porgao de polipeptideo de ghrelina do imunoconjugado inclui um residuo de serina modifica- do na terceira posi^ao do aminoacido, conforme descrito aqui. Os imunoconjugados sao representados apropriadamente pela seqiiencia que se segue:
Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C onde AeB sao definidos como se segue:
A e uma fra^ao possuindo a estrutura que se segue: onde: Y1 e Y2 sao selecionados independentemente de O1 CH2 e NH; η e O ou 1 ； Z e C1 PO ou SO; e R e um grupo hidrocarboneto saturado ou insaturado, ramificado ou linear, substituido ou nao substituido tendo cerca de 3 a cerca de 10 atomos de carbono, ou e um grupo cicloalquila ou arila tendo cerca de 3 a cerca de 13 atomos de carbono;
B compreende uma subseqiiencia de O a 23 residuos de aminoacido consecutivos da SEQ ID NO: 2; e
C compreende uma fragao veiculo.
Os imunoconjugados sao apropriadamente incluidos em uma composigao de vaci- na com um veiculo fisiologicamente aceitavel. A invengao tambem obtem metodos de indu- ?ao de uma resposta imune antighrelina em um individuo e controle da adiposidade em um individuo.
Polipeptideos de qhrelina
Conforme empregado nesse documento e na tecnica, ο termo "polipeptideo" se re- fere a duas ou mais fragoes de aminoacido unidas por Iigagoes amida e inclui am bos pepti- deos e proteinas. Os polipeptideos de ghrelina da inverigao podem ser purificados ou sinte- ticos. "Purificados" se refere ao material que e pelo menos parcialmente separado dos com- ponentes que normalmente acompanham ο mesmo em seu estado nativo. Como e aprecia- do pelos versados na tecnica, a pureza dos polipeptideos e determinada tipicamente em- pregando tecnicas analiticas, tais como, eletroforese de gel poliacrilimida ou cromatografia de Iiquido de alto desempenho. Conforme usado aqui, "sintetico" se refere a ambas as tec- nicas de produgao recombinante e preparado atraves de fase solida, como e conhecido na arte.
Os polipeptideos de ghrelina da invengao possuem, no minimo, uma seqGencia de aminoacidos compreendendo Gly SerXaa Phe Leu (SEQ ID N0:1)，onde A indica um resi- duo de serina modificado possuindo a estrutura da formula (I): Com referencia a formula (I), Y1 e Y2 sao selecionados independentemente de O, CH2 e NH; e η e O ou 1. Tambem na formula (I), Z e apropriadamente selecionado de C, PO ou SO R e um grupo hidrocarboneto saturado ou insaturado, ramificado ou linear, substitui- do ou nao substituido tendo cerca de 3 a cerca de 10 atomos de carbono, ou e um grupo cicloalquila ou arila tendo cerca de 3 a cerca de 13 atomos de carbono. Conforme emprega- do nesse document。，"grupo hidrocarboneto" se refere a um grupo hidrocarboneto alifatico possuindo um nijmero especifico de atomos de carbono na cadeia. O grupo hidrocarboneto pode compreender, por exemplo, um grupo alquila, alquenila ou alquinila. Em uma modali- dade especificamente apropriada Y1^O, ZeC, neOeRe -CH2CH2CH3. Nas Iistagens de sequencia detalhadas a seguir A e identificado como Xaa.
O polipeptideo de ghrelina pode compreender adicionalmente B, onde B e uma subseqiiencia de termino carboxi do polipeptideo de ghrelina de comprimento pleno. A sub- seqiiencia inclui qualquer uma das SEQ ID N0:2 ou seqdencia plena da SEQ ID NO: 2. Em outras palavras, ο polipeptideo de ghrelina compreende a SEQ ID NO: 1 e uma seqiiencia ou subseqiiencia da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, a seqiiencia de polipeptideo de ghrelina plena pode compreender qualquer uma das seqGencias que se seguem:
Gly SerXaa Phe Leu (SEQ ID N0:1);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser (SEQ ID N0:3);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro (SEQ ID N0:4);
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu (SEQ ID N0:5);
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu His (SEQ ID NO:6);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln (SEQ ID N0:7);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg (SEQ ID NO:8);
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val (SEQ ID NO:9);
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln (SEQ ID NO: 10);
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln (SEQ ID NO:11)；
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg (SEQ ID
N0:12);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys (SEQ ID
N0:13);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu (SEQ ID NO: 14);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser (SEQ ID NO: 15);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys (SEQ ID NO: 16);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys (SEQ ID NO: 17);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Pro (SEQ ID NO:18);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Pro Pro (SEQ ID NO: 19);
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala (SEQ ID N0:20);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Pro Pro Ala Lys (SEQ ID N〇:21);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Pro Pro Ala Lys Leu (SEQ ID NO:22);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Pro Pro Ala Lys Leu Gln (SEQ ID NO:23);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro (SEQ ID NO:24); ou
Gly SerXaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg (SEQ ID NO:25),
onde Xaa e A, a seria modificada conforme definida acima. E tambem especifica- mente contemplado que qualquer um dos aminoacidos Iistados acima pode ser substituido por um aminoacido sintetico apropriado, por exemplo, conforme descrito em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, ed. B. Weinstein (1983), incor- porado nesse documento como referencia.
E tambem contemplado que a seqCiencia de peptideo de ghrelina correspondera a seqtiencia de ghrelina especifica para as especies a serem imunizadas e possuindo a serina modificada na posigao 3, conforme descrito nesse documento. Isso e contemplado, uma vez que as seqQencias entre as especies seja conservada e possua apenas Iigeiras varia- ςδβε, a reatividade cruzada entre os peptideos e especies e contemplada.
FracSes veiculo
Os imunoconjugados da inven?ao compreendem os polipeptideos de ghrelina des- critos acima covalente ou nao covalentemente conjugados a C, uma fragao veiculo, usando os metodos padrao conhecidos na arte. Uma "fragao veiculo," conforme empregado nesse documento se refere a um parceiro de conjugagao capaz de melhorar a imunogenicidade de um polipeptideo. Por exemplo, podem ser usados polipeptideos, tais como, dextrano, mano- se ou manano. As proteinas de membrana integral, por exemplo, de E.colie outras bacterias sao tambem parceiros de conjugagao Citeis. As moleculas veiculo tradicionais, tais como, "keyhole limpet" hemocianina (KLH), toxoide de tetano, toxoide de difteria e albumina de soro bovino (BSA) sao tambem apropriados.
Lys Lys Lys Lys
Lys Lys
10
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Fracoes de Iiqacao
Como e conhecido na tecnica, existe uma ampla variedade de metodos disponiveis para Iigagao dos polipeptideos as frames conhecidas, qualquer um dos quais sendo apro- priadamente adaptado para uso com a invengao. A maioria das estrategias envolve a conju- gagao do polipeptideo a uma molecula derivatizada na fragao veiculo atraves da formagao de uma Iiga^ao covalente entre os grupos reativos no polipeptideo e veiculo. Apropriada- mente, um ou mais aminoacidos possuindo um grupo reativo incorporado a seqtiencia de polipeptideo de ghrelina e usado para Iigar ο polipeptideo a fragao veiculo. Fragdes de Iiga- gao apropriadas sao aquelas possuindo grupos amino, grupos carboxila ou grupos sulfidrila. Conforme sera apreciado, os grupos funcionais de aminoacidos na seqQencia do polipepti- deo de ghrelina podem ser usados como uma fra^ao de Iigagao para acoplar ο polipeptideo ao veiculo. Tais aminoacidos podem incluir lisina, arginina，cisteina, aspartate, glutamato, tirosina e/ou histidina. O acoplamento de dissulfeto usando residues de cisteina fora do do- minio de Iigagao do anticorpo do polipeptideo de ghrelina e uma estrategia de acoplamento especificamente apropriada, onde a cisteina e introduzida apropriadamente usando tecnolo- gia recombinarite padrao. Em uma concretizagao, um residuo de cisteina e posicionado no termino do polipeptideo de ghrelina, por exemplo, no termino carboxi ou amino.
Dispositivos apropriados adicionais de Iigagao das frames de polipeptideo aos vei- culos sao conhecidos na arte e podem ser usados com a presente invengao. Composicoes imunoqenicas
Os imunoconjugados de ghrelina, conforme descrito acima, sao apropriadamente incluidos em uma quantidade imunogenicamente eficaz em uma composigao com um veicu- lo fisiologicamente aceitavel. Uma "quantidade imunogenicamente eficaz," conforme empre- gado nesse documento e na tecnica, e uma quantidade de um imunoconjugado que e capaz de induzir uma resposta imune que engaja significativamente agentes que compartilham aspectos imunologicos com ο imunogeno, isto e, ghrelina endogena, nativa. Um veiculo "fi- siologicamente aceitavel" e qualquer veiculo que seja apropriado para administragao in vivo (por exemplo, administra^ao transdermica ou parenteral) ou uso in vitro , isto e, cultura d celula.
Apropriadamente, as composites compreendendo imunoconjugados de ghrelina
da invengao podem ser formuladas para uso in vivo, isto e, administragao terapeutica ou profilatica a um individuo. Nas modalidades especificas, as composites sao formuladas como composigdes de vacina. Conforme usado aqui, uma "vacina" e uma composi^ao que e capaz de induzir uma resposta imune em um individuo, incluindo porem nao Iimitado a pro- dugao de anticorpos sequestrantes.
A preparagao das vacinas que contem seqiiencias de polipeptideo como ingredien- te ativo e geralmente bem entendida na tecnica, conforme exemplificado pelas Patentee US niimeros 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 e 4.578.770, todas incorpo- radas nesse documento como referencia. Tipicamente, tais vacinas sao preparadas como injetaveis, tan to como solugdes Iiquidas ou suspensoes; formas solidas apropriadas para formulagao em solu^o ou suspensao antes da injegao podem tambem ser preparadas. A preparagao pode tambem ser emulsionada. O imunoconjugado de ghrelina pode ser mistu- rado com excipientes que sao farmaceuticamente aceitaveis e compativeis com ο ingredien- te ativo. Excipientes apropriados sao, por exemplo，agua, salmoura, dextrose, glicerol, eta- nol ou semelhantes e combinag5es dos mesmos. Alem disso，caso desejado, a vacina pode conter quantidades menores de substancias auxiliares, tais como, agentes umectantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH ou adjuvantes que melhoram a eficacia das vacinas, conforme descrito abaixo.
As vacinas sao administradas convencionalmente de forma parenteral, por injegao, por exemplo, subcutanea, intracutanea, intradermica, subdermica ou intramuscular. Formu- la?5es adicionais que sao apropriadas para outros modos de administragao incluem suposi- torios e, em alguns casos, formula?5es orais, bucais, sublinguals, intraperitoneal, intra vagi- nal, anal, epidural, espinal e intracraniana. Para os supositorios, Iigantes tradicionais e vei- culos podem incluir, por exemplo, polialcaleno glicois ou triglicerideos; tais supositorios po- dem ser formados de misturas contendo ο ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferi- velmente 1 a 2%. As formula^des orais incluem ambos excipientes empregados normalmen- te, tais como, por exemplo, classificag5es farmaceuticas de manitol, lactose, amido, esteara- te de magnesio, sacarina de sodio, celulose, carbonato de magnesio e semelhantes. Essas composites tomam a forma de solu?5es, suspensdes, comprimidos, pilulas, capsulas，for- mulagoes de Iiberagao prolongada ou pos e contem 10 a 95% do ingrediente ativo, preferi- velmente 27 a 70%.
Conforme apreciado, as vacinas sao administradas de modo compativel com a for-
muIa^ao de dosagem e em tal quantidade de modo a serem profilatica ou terapeuticamente eficazes e imunogenicas. A quantidade a ser administrada depende do individuo a ser trata- do incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imune do individuo de fornecer resposta imune e ο grau de prote^ao desejada. As faixas de dosagem apropriadas sao de cerca de 0,1 pg/kg de peso corporeo a cerca de 10 mg/kg peso corporeo, tal como na faixa de cerca de 500 pg/kg de peso corporeo a cerca de 1.000 pg/kg de peso corporeo. Regimes apropri- ados para administra^ao inicial e doses de refor^o sao tambem contemplados e sao tipifica- dos por uma administragao inicial seguida por inoculagdes subseqOentes ou outras adminis- tra?5es.
Algumas modalidades da vacina de imunoconjugado de ghrelina da invengao sao
suficientemente imunogenicas, porem para outras, a resposta imune sera melhorada se a
vacina compreender, adicionalmente, uma substancia adjuvante. Os adjuvantes e seu uso sao bem conhecidos na arte. O termo "adjuvante" se refere nesse documento a uma subs- tancia que e 1) nao propriamente capaz de promover uma resposta imune contra ο imuno- conjugado da vacina，porem que seja 2) nao obstante capaz de melhorar a resposta imune contra ο imurioconjugado. Varios metodos para obtengao de um efeito adjuvante sao conhe- cidos. Os principios gerais e metodos sao detalhados em "The Teoria and Practical Applica- tion of Adjuvantes", 1995，Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN O- 471-95170-6, e tambem em "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvantes", 1995, Gregoriadis G e outros (eds·), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, ambos sendo incorporados como referenda nesse documento. Um adjuvante especificamente apropriado para uso com a invengao e ο hidroxido ou fosfato de aluminio (alume), geralmente usado como solugao a 0,05 a 0,1% em salmoura tamponada.
Metodos para iriduzir resposta imune aritighrelina
Algumas modalidades da invengao obtem um metodo de indugao de uma resposta imune antighrelina em um individuo. Um "individuo" e um vertebrado, apropriadamente um mamifero, mais apropriadamente um ser humano. Individuos apropriados podem tambem incluir animais domesticos, por exemplo, gatos, cachorros e cavalos. Conforme sera aprecl· ado, para fins de estudo, ο individuo e apropriadamente um modelo animal, por exemplo, um camundongo ou rato. Sera apreciado que para outras especies, por exemplo, caes，ga- tos, cavalos ou camundongos，a porgao de polipeptideo de ghrelina do imunoconjugado po- de ser selecionada com base nas especies. Conforme usado aqui’ uma "resposta imune aritighrelina" se refere especificamente a indugao de um efeito terapeutico ou de seqiiestro de ghrelina profilatico, que e mediado pelo sistema imune do individuo. Tal resposta imune promove, apropriadamente, a Iimpeza ou controle imune da ghrelina endogena no individuo, tal que, efeitos amplos no sistema sao observados no individuo, por exemplo, prevengao ou Ientidao de ganho de peso, sparing de massa magra corporea, eficiencia de alimentagao diminuida e adiposidade relative diminuida.
Uma resposta imune antighrelina e apropriadamente avaliada pelos ensaios descri- tos nos exemplos a seguir. A indugao de uma resposta imune antighrelina em um individuo, de acordo com a invengao pode ser acompanhada por administragao ao individuo das com- pos'igoes de imunoconjugado de ghrelina descritas acima.
Metodos de controle da adiposidade
Algumas modalidades da invengao fornecem um metodo de controle de adiposida- de em um individuo. "Controle de adiposidade," conforme empregado nesse documento, inclui, porem nao esta Iimitado a prevengao ou Ientidao de ganho de peso, sparing de massa magra corporea, diminuigao de eficiencia da alimerita^ao e diminuigao de adiposidade relati- ve no individuo. Os metodos de controle de adiposidade podem ser realizados por adminis-
tra?ao ao individuo das composi?5es de imunoconjugado de ghrelina descrita acima. Mais apropriadamente, a invengao previne ο desenvolvimento da obesidade no individuo.
A administragao a um individuo das composig5es de imunoconjugado de ghrelina de acordo com a inven^ao parece exibir efeitos benefices em uma maneira dependente da dose. Assim, dentro de Iimites amplos, espera-se que a administragao de quantidades gran- des das composites de imunoconjugado de ghrelina controle a adiposidade a um grau maior que a administragao de uma quantidade menor. Alem disso，a eficacia tambem e con- templada em dosagens abaixo do nivel no qual a toxicidade e vista. Adicionalmente, na pra- tica, doses maiores sao geralmente usadas, onde ο tratamento terapeutico da obesidade e ο fim desejado, enquanto doses menores sao geralmente usadas para fins profilaticos ou de ganho de peso lento.
Sera apreciado que a dosagem especifica administrada em um dado caso sera a- justada de acordo com a condigao do individuo e outros fatores medicos relevantes que possam modificar a atividade do imunoconjugado de ghrelina ou a resposta do individuo, como e bem conhecido pelos versados na tecnica. Por exemplo, a dose especifica para um paciente em particular depende da idade, peso corporeo, estado geral de saiide, dieta e tempo e modo de administragao, taxa de excregao e medicamentos usados em combina^ao. As dosagens para um dado paciente podem ser determinadas usando considera?5es con- vencionais, tais como por meio de um protocolo farmacologico ou profilatico convericional e apropriado.
A dosagem maxima para um individuo e a dosagem maior que nao causa efeitos
colaterais indesejaveis ou intoleraveis. O niimero de variaveis com relagao ao regime de tratamento ou profilatico individual e grande, sendo esperada uma faixa consideravel de do- ses. E antecipado que dosagens de imunoconjugado na faixa de cerca de 0,1 pg/kg de peso corporeo a cerca de 10 mg/kg de peso corporeo sao contempladas, tal como na faixa de cerca de 500 pg/kg de peso corporeo a cerca de 1.000 pg/kg de peso corporeo que preveni- rao ou reduzirao os sintomas em pelo menos 50% em compara?ao aos sintomas de pre- tratamento. E especificamente contemplado que prepara?5es de vacina e composigdes da invengao possam aliviar ο ganho de peso, sem prover uma cura ou em algumas modalida- des, possam ser usadas para curar ou prevenir a obesidade. E especificamente contemplado que qualquer modalidade de qualquer metodo ou
composigao da invengao possa ser usada com qualquer outro metodo ou composi^ao da irivengao.
Conforme empregado nesse relatorio descritivo e nas reivindicagdes apenas，as formas singulares "um, uma" e "o, a" incluem referencias ao plural, a menos que ο context。 indique claramente de outra forma. Assim, por exemplo, referencia a uma composigao con- tendo um "polipeptideo" inclui uma mistura de dois ou mais polipeptideos. Deve ser aprecia-
do que ο termo "ou" e empregado geralmente em seu sentido incluindo "e/ou" a menos que ο teor claramente indique de outra forma.
E tambem especificamente entendido que qualquer valor numerico citado nesse document。inclui todos os valores do valor mais baixo ao valor mats alto, isto e, todas as combinag5es possiveis de valores numericos entre ο valor mais baixo e ο valor mais baixo enumerados sendo considerados como expressamente declarados nesse pedido. Por e- xemplo, se uma faixa e declarada como sendo de 1% a 50%, entende-se que os valores, tais como, 2% a 40%, 10% a 30% ou 1% a 3%, etc., estejam expressamente enumerados nesse relatorio descritivo. EXEMPLOS
Os exemplos que se seguem sao fornecidos de modo a ajudar no entendimento a-
dicional da inven^ao. Os materials e condi?5es especificos empregados se destinam a ilus- tragao e riao como uma Iimitagao do escopo razoavel das reivindicagoes apensas. Exemplo 1. Siritese do imunoconiuaado de qhrelina-hepateno Ghr1-Ghr3 foram sintetizados e acoplados a proteina veiculo "keyhole limpet" he- mocianina (KLH)1 rendendo imunoconjugados Ghrl-KLH, Ghr2-KLH e Ghr3-KLH. Para a sintese dos peptideos, todos os haptenos e substratos foram preparados em uma escala de 1,0 mmol como amidas de termino C usando protocolos DIC/HOBt por escrito sob enco- menda para Fmoc/fBu SPPS em um sintetizador de peptideo automatizado CS Bio 136. Pa- ra os peptideos portando uma esterificagao de cadeia lateral Ser-3, 10 mmol do acido de requisito sao pre-ativados com 5 mmol de DIC em 10 mL de DCM por 20 minutos, apos ο que, 10 mL de DMF foram adicionados. A pasta resultante foi adicionada a resina de pepti- deo parcialmente protegida, seguido por 0,5 mmol de DMAP e misturada por agitagao orbital por toda a noite. As clivagens do teste TFA foram usadas para verificar a acilagao quantitati- va，para conjugates Lys (Mca) a resina-peptideo foi agitada com 0,2 eq. Pd (PPh3)4 e 10 eq. de acido A/,A/-dimetilbarbitLirico em 1:1 DMF:DCM por 12 horas. A amina Iivre nao mas- carada recente foi entao neutralizada por tratamento com DIEA/DMF a 5%, apos ο que aci- do 7-metoxicoumarinil-4-acetico foi acoplado de acordo com os protocolos DIC/HOBt. Para conjugates de acido n-butanoico, 5 mmol de acido n-butanoico foram pre-ativados com 5 mmol de DIC em 10 mL de DCM por 20 minutos, apos ο que, 10 mL de DMF foram adicio- nados. A pasta resultante foi adicionada a resina-peptideo protegida, seguido por 0,5 mmol de DMAP1 deixada reagir por 1 hora e todo ο procedimento realizado duas vezes para obter n-butanoilagao quantitativa. Apos Iavagem com DMF e DCM (cada um com Iavagem de flu- xo 2 χ 20 sec.), as resinas-peptideo completadas foram secas em vacuo por toda a noite. A desprotegao global e clivagem foram realizadas por tratamento em bateladas com 95:2.5:2.5 TFA:agua:triisopropilssilano (TIPS) por 2 horas, seguido por filtragao e remogao de TFA por evaporagao giratoria. Os peptideos foram entao triturados de 10 volumes de Et2O (pre-
resfriados a -20°C) e isolados por centrifugagao. Apos Iavagem da microesfera duas vezes mais com Et20, os peptideos foram extraidos em AcOH a 50% e purificados por RP-HPLC diretamente.
Ghrelina(1-10) Ser-3(butanoil) hapteno, Ghr1. ES卜MS: Teoria, Mw (peso molecular) =1.406,4; M1+ = 1407,4, M2+ = 704,2. Observado1 M1+ = 1.408,3, M3+ = 704,0.
Ghrelina(13-28) hapteno, Ghr2. ES卜MS: Teoria1 Mw (peso molecular) = 2.166,5;
M2+ 1.084,3, M3+ = 723,2. Observadot M2+= 1.084,5，M3+ = 723,2
Ghrelina de rato (1-28) Ser-3(butanoil) hapteno, Ghr3. ES卜MS: Teoria1 Mw (peso molecular) = 3.506,0; M2+ = 1.754,0’ M3+ = 1.169,7. Observado, M2+ = 1754.1，M3+= 1.169,7.
Exemplo 2. Individuos e protocolo de vacinacao Ratos Wistar machos, maduros (n=17, M+SEM: 413+8 g no inicio, 502+12 g na 4a
imunizagao; Charles River, Hollister, CA) foram individualmente alojados em um viveiro com ciclos de 12 horas:12 horas claro/escuro (as 6:00 horas as Iuzes eram ligadas), umidade a 〜60o/o e temperature controlada a 22°C com acesso a vontade a ragao e agua. A dite de ra^ao em microesferas (LM-485 Diet 7012; Harlan Teklad1 Madison, Wl1 USA) e um cereal extrusado, a base de milho, compreendido de carboidrato a 65%, gordura a 13%, proteina a 21%, energia metabolizavel 3,41 kcal/g. Os procedimentos se adequaram ao National Insti- tutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH nijmero da publica- gao 85-23, revisto em 1996) e os "Principles of laboratory animal care" (http://www.nap.edu/readingroom/bookslabrats) e foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of The Scripps Research Institute.
Os ratos maduros com peso e idade combinados foram imunizados usando proto- colos do nosso Iaboratorio conforme descrito em Qi e outros, A9-Tetrahydrocannabinol im- munochemical studies: Haptens, monoclonal antibodies, and a convenient synthesis of ra- diolabeled A9-Tetrahydrocannabinol, Journal of Medical Chemistry, (2005)，48:7389-7399, incorporados nesse documento como referencia. O processo de imuniza^ao envolveu cinco imuniza?5es por 12 semanas. Ratos combinados em peso e idade receberam imunizag5es (i.p. 0,4 mL) 90 minutos antes do ciclo de escuro nos dias de experimento 0，21 35’ 56 e 84. As tres primeiras imunizagdes consistiram em adjuvante em emulsao Ribi MPL-TDM (RIBI Immunochemical Research Inc.) contendo 250 pg de Ghrl-KLH, Ghr2-KLH, Ghr3- KLH ou KLH em 100 mM PBS, pH 7,4. As duas Ciltimas empregaram alume (Pierce) como ο adju- vante. O sangue da cauda foi coletado uma semana apos imunizagao, centrifugado e ο plasma analisado quanto as titulagoes de anticorpo e afinidade de Iigagao de ghrelina.
Exemplo 3. Titulacoes de anticorpo da vacina no plasma e afinidade de Iiaacao de ghrelina em ratos vacinados Os ratos foram vacinados conforme descrito no Exemplo 2. As titulagoes de anti-
corpo no plasma foram determinadas por ELISA. Placas de ELISA (96 po?os, COSAR 3590) contendo 3 ng por ροςο de Ghr3-BSA em 50 μί de 10 mM de PBS, pH 7,2 foram secas por toda a noite, seguido por fixagao de rotina de etanol e bloqueio com blotto (leite isento de gordura) em PBS. As amostras de plasma de rato foram diluidas em serie comegando com uma diluigao de 1:100 em blotto. A Iigagao do plasma foi permitida por 1 hora em uma ca- mera Limida a 37°C. Apos a lavagem，200 ng por pogo de conjugado de IgG anti-rato de ca- bra com fosfatase alcalina (Southern Biotech) em 50 μί de PBS-blotto foram adicionados e incubados por 1 hora em uma camara Cimida a 37°C. As placas foram completamente lava- das com agua, secas ao ar e desenvolvidas por adi^ao de 200 μί por pogo de 200 μΜ de p- nitrofenilfofato (Pierce) em 100 mM de acido 4-morfolinopropanossulfonico (MOPS), pH 7,4. Apos 3 horas a temperatura ambiente, a absorvencia foi medida em 405 nm em um Ieitor de microplaca (Molecular Devices). Os resultados sao mostrados na tabela 1，a seguir.
A especificidade da ghrelina do plasma foi determinada usando dois ensaios: um ensaio de dialise de equilibrio e um ELISA de competigao. A dialise de equilibrio foi reaIiza- da usando dilui?0es em serie de [125l]-ghrelina de rato (Ser-3-n-octanoil, Bachem, diluida in situ com ghrelina nao marcada) como Iigante e quantidades de plasma constantes (diluigao 1:1 em PBS, pH 7,4). Os pogos em uma placa de microtitulagao (12 por amostra) foram cheios com 170 de ghrelina radiomarcada em PBS, e uma segunda placa foi preparada com pogos contendo plasma de ratos (que foram imunizados com os imunoconjugados de ghrelina-KLH ou apenas com KLH) em PBS (170 pL/pogo). Todas as duas placas foram co- nectadas hermeticamente aos pogos cheios voltados um para ο outro e separados com uma membrana de dialise (corte de 14.000 Da). As placas foram anexadas verticalmente a um agitador e foram agitadas por 24 horas a temperatura ambiente, apos ο que, elas foram cui- dadosamente separadas. A membrana foi descartada e de cada pogo foram transferidos 100 μΙ_ para os tubos para contagem com y-radia^ao. A media nas diferengas em DPM (de- sintegragdes por minuto) entre pogos opostos foi determinada para cada diluigao de ghreli- na, rendendo constantes de Iigagao aparentes (K^app). Os resultados sao mostrados na ta- bela 1，a seguir.
Para ELISA de competigao, placas (96 pogos) foram revestidas por toda a noite a 4°C com conjugado de ghrelina-BSA preparado recentemente. As placas foram bloqueadas com leite desnatado a 4%, Iavadas e as amostras de sangue foram adicionadas em dilui- g5es apropriadas. As placas foram Iavadas e Ser-3 n-octanoil ghrelina foi adicionada aos pogos em uma serie de concentrates iniciando em 100 μΜ. As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C, completamente Iavadas e conjugado (Pierce) de peroxidase de raiz-forte- anticamundongo de cabra (HRP) foi adicionado. Apos um periodo de incubagao de 1 hora a temperatura ambiente, as placas foram completamente Iavadas novamente e ο substrato de HRP (kit de substratoTMB; Pierce) foi adicionado, a reagao se desenvolveu por 15 minutos e parou por adi^ao de 2 M H2SO4. A absorvencia (450 nm) foi Iida e os valores colocados em
grafico usando GraFit (Erithacus Software Ltd). A concentragao de antigeno Iivre na qual ο valor de absorvencia e de 50% da absorvencia maxima foi considerado a media Kd3pp do plasma para ghrelina. Os resultados sao mostrados na tabela 1 a seguir. Tabela 1
Titulag5es de vacina (x100) Afinidade do plasma Kaapp apos 13 semanas para π-octanoil ghrelina Des-octanoil ghrelina Taxa de seletividade Grupo de imunizagao 9 sema- nas 13 se- ma 门 as ELISA (_ Dialise de equilibrio (_ ELISA _) (KD.app-des- octanoi- la/(KD.app-n- octanoila) Ghrl- KLH(n=5) 1 ±3 34± 12 1.461 土 569 45 ±22 47.655 土 235 98 ±48 Ghr2- KLH(n=5) 23± 12 13±3 > 50.000 > 20.000 14.308 土 11.916 <0,3 ±0,2 Ghr3- KLH(n=5) 56 ±15 137 ±51 619土173 243土192 26.010 土 10.231 41 土 12 KLH (n=3) 2 土 1 2± 1 > 50.000 > 20.000 >50.000 N.D.
Os dados sao expressos como M 土 SEM. As tituIagoes e afinidade de plasma foram
transformadas com log para calcular as medias, taxas de seletividade e para analise estatis- tica. Os valores refletem transformagoes antilog.
Conforme mostrado na Tabela 1，am bos imurioconjugados de ghrelina GhrI-KLH e Ghr3-KLH produziram boas respostas imunes (titula^des de anticorpo na vacina aumenta- das) na nona semana ou apos a quarta imuniza9§o· As respostas foram de especificidade apropriada, uma vez que os anticorpos promovidos por GhrI-KLH nao tiveram rea^ao cru- zada com Ghr2-BSA e os anticorpos promovidos por Ghr2-KHL da mesma forma tiveram baixa afinidade para GhrI-BSA (dados nao mostrados). Embora cad a grupo de imunizagao tivesse promovido uma resposta imune contra ο imunoconjugado com ο qual eles foram va- cinados, apenas os ratos dos grupos imunizados com GhrI-KLH ou Ghr3-KLH desenvolve- ram boa afinidade de Iiga^ao de plasma para ghrelina n-octanoilada, a forma de circuIagao putativamente ativa. O plasma dos ratos vacinados com GhrI-KLH ou Ghr3-KLH nao estava potencialmente Iigado pela forma des-octanoila inativa da ghrelina, que predomina na circu- Iagao (razao de pelo menos 1,8:1) (Sato e outros, Molecular forms of hypothalamic ghrelin and its regulation by fasting and 2-deoxy-d-glucose administration (2005), Endocrinology, 146:2510-6, incorporado aqui como referenda) e pode de outra forma competir para neutra- Iizagao do anticorpo, resultando em especificidade maior para acila versus des-acil ghrelina.
Exemplo 4. Ganho de peso pos-imunizacao, inqestao de alimento e eficiencia de a- Iimentacao
Os ratos foram imunizados conforme descrito no Exemplo 2. O peso corporeo e a ingestao de alimentos foram determinados diariamente (0,1 g de precisao), 2 horas antes do inicio do ciclo de escuro durante semanas apos as quarta e quinta imuniza?5es, quando as titulagoes dos anticorpos estavam maximizadas. A eftctencta de alimenta^ao foi calculada como ganho de peso corporeo por unidade de ingestao de energia (mg/kcal).
A figura 2 mostra a razao correspondente de ganho de peso corporeo, ingestao dia- ria de alimentos e eficiencia de alimentagao de ratos imunizados como uma fun^ao da vaci- na que os individuos receberam, uma vez que as titula^oes de varios ratos aumentou na faixa de 1:10.000. Os ratos que receberam os imunoconjugados GhrI-KLH e Ghr3-KLH ga- nharam menos peso por dia que os ratos imunizados com Ghr2-KLH ou KLH atraves do periodo de observagao de 7 dtas apos a 4a imuniza?ao (figura 2a). Isso ocorreu a despeito dos ratos comerem (figura 2B) e beberem (nao mostrado) normalmente, indicando uma efi- ciencia de alimentagao reduzida de individuos vacinados com GhrI-KLH e Ghr3-KLH (figura 2C). Antes disso, durante as semanas 5-8, quando as titulagoes eram modestas e ainda em elevagao, as diferengas relacioriadas a vacina no ganho de peso diario (KLH: 1,22 土 0，32 versus Ghr3-KLH: 0,92 土 0,12 e Ghrl-KLH: 1,01 ± 0,15 g/dia) e eficiencia de alimentagao (KLH: 44,4 土 5’5 versus Ghr3-KLH: 28,5 士 3,0 e Ghrl-KLH: 33,6 土 4，4 mg/kcal) estavam na mesma diregao, porem correspondentemente menores, sustentando a dependencia propos- ta na afinidade de Iiga^ao de antighrelina no plasma.
Exemplo 5. Relacao das taxas de capacidade de Iigacao de antiqhrelina no plasma para homeostasia de energia corporea integral, adiposidade e qhrelina no cerebro/plasma
De modo a determinar se a capacidade de IigagSo de antighrelina na circula^ao es- ta relacionada a atenuagao de ganho de peso corporeo, os individuos vacinados conforme descrito no Exemplo 2 foram divididos naqueles que desenvolveram titula^des de anticorpo alta ou baixa ao Ghr3-BSA (figura 3，painel A) e comparados nas semanas apos a 4a e 5a imunizagdes. Conforme mostrado na figura 3，painel B, cada individuo com titula^es altas de Ghr3-BSA tambem exibiu boa afinidade de plasma para π-octanoil ghrelina por competi- gao. Analise ELISA (KD.app<650 nM), superiores a uma ordem de grandeza na media em relagao aqueles com titulagoes Ghr3«BSA mais baixas. Aqueles ratos com capacidade de Iigagao de ghrelina no plasma maior ganharam ~0,5 g menos peso por dia em rela^ao aos com afinidade de plasma inferior para ghrelina (mostrado na figura 3，painel C), a despeito da ingestao normal de alimentos (figura 3，painel D), novamente indicando eficiencia de ali- mentagao diminuida (figura 3，painel E), com ο mesmo perfil de resultados observados apos cada imunizagao. Mesmo os ratos com capacidade de Iiga^ao de ghrelina no plasma mais baixa, porem mensuravel, exibiram eficiencia de alimentagao reduzida em com para ς§ο aos
controles KLH (figura 3，painel E). Os tratos gastrintestinais foram removidos de carcagas congeladas (25。C). As car- cagas foram entao secas (70°C) para massa constante de modo a determinar ο teor de agua e entao extraidas com eter petroleo em um aparelho Soxhlet para determinar a massa seca isenta de gordura compreendida de ambas proteina e cinzas, em com para ς§ο a massa de gordura (Dobush e outros, (1985), Canadian Journal of Zoolology, 63:1917-1920, incorpora- do nesse documento como referenda). Conforme mostrado na figura 3, painel F e Tabela 2， a seguir, a analise das carcagas mostrou que os ratos com respostas antighrelina fortes ga- nharam massa seca isenta de gordura preferivelmente em relagao a massa de gordura, quando comparados aqueles com respostas imunes antighrelina mais fracas, e nao diferem em teor de agua.
Tabela 2
Grupo Massa seca isenta de gordura (%) Massa de gordura (%) Agua (%) Proteina Cinza Total Titulagdes 22,9 ± 0,2* 2,9 ±0,1 25,8 ± 0,2* 13,6 ± 1,6* 60,6 ± 1,4 altas de Ghr3-BSA (n=5) 22,0 ±0,4 2,8 ±0,1 24,8 ± 0,4 17,1 土 1,3 58,2 ± 1,0 Titulagdes baixas de Ghr3-BSA (A7=9)
Os dados sao expressos como M 土 SEM, *p<0,05, *p=0,06 versus grupo de titula-
gao batxa de Ghr3-BSA, teste-t corrigido de Welch.
Concentrag5es totals de ghrelina (octanoila e des-octanoila combinadas) em amos- tras de plasma e de cerebro de ratos foram determinadas com ο emprego de um kit de imu- noensaio de enzima de ghrelina (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA). Os extratos de tecido foram obtidos usando os seguintes metodos descritos em Shibata e outros; (48) >95% de recuperagao da ghrelina foram reportados). Em resumo, os cerebros integrals fo- ram congelados em pedagos em 2-metilbutano resfriados em gelo seco e armazenados a - 80°C antes do uso. O tecido cerebral foi fatiado em 10-15 pedagos e fervido por 7 minutos em agua (10 mL) e acido acetico (580 μΙ_, 100%) foi adicionado apos resfriamento, para render 1 M de AcOH. A suspensao foi homogeneizada com um Tekmar Tissumizer e centri- fugada a 10.000 rpm por 10miutos. O sobrenadante foi liofilizado, redissolvido em tampao EIA (Phoenix Pharmaceuticals) e analisado seguindo-se as instru?5es do fabricante. Consis- tente com a diminuigao relativa na gordura, os niveis de plasma terminal do hormonio de
adipocito, Ieptinaf foram reduzidos nos ratos com afinidade de plasma forte para ghrelina (figura 3, painel G). Os niveis de insulina na circulagao nao diferem confiavelmente como uma fungao da afinidade de Iigagao de ghrelina no plasma obtida (M+SEM: Alta: 0,8 土 0,2 versus Baixa: 1,3 土 0,2 ng/mL). Possivelmente consistente com uma passagem reduzida da circulagao de ghrelina para ο compartimento central, a razao dos niveis da ghrelina total no cerebro/plasma foi reduzida nos ratos em relagao a sua capacidade de Iiga^ao antighrelina no plasma (figura 3, painel H).
Exemplo 6. Niveis de mediadores inflamatorios no plasma em ratos vacinados De modo a examinar a possibilidade de que os efeitos de vacinagao possam resul- ts r de uma resposta imune sistemica nao especifica, mediadores pro-inflamatorios, incluindo interleucina-1y?, interleucina-6, fator-σ de necrose de tumor, proteina-1 quimioatraente de monocito e inibidor de ativador de plasminogenio total tipo 1 foram medidos em ratos vaci- nados, conforme descrito no Exemplo 2.
Os ratos foram sacrificados por decapitagao no dia de experiment。92’ 1-4 horas no ciclo de escuro e ο sangue foi coletado em tubos de polipropileno resfriado contendo um coquetel de 0,5 M de EDTA (-1/10 v/v) e inibidor de protease (-1/100 v/v) (Sigma, St. Louis, MO). O plasma foi obtido por centrifugagao (3.000 rpm, 4°C, 20 minutos) e armazenado a - 80°C, ate analise por um painel de adipocina de rato multiplexo (Linco, St. Charles, MO), um imunoensaio com base em tecnologia xMAP™ usando instrumentagao Luminex®. O Iimite da sensibilidade para TNF-σ, MCP-1 e IL-IyS foi de 4,9 pg/mL e para leptina, IL-6, insu- Iina e PAI-1 total foi de 12,2 pg/mL. O coeficiente de variagao intra-ensaio tipico foi < 4%.
Conforme mostrado na Tabela 3 a seguir, os niveis de plasma eram baixos na base absolute atraves dos grupos de tratamento e nao relacionado a especificidade do plasma para ghrelina acilada.
Tabela 3
Grupo IL-IyS PAI-1 total IL-6 TNF-σ MCP-1 Pg/mL Pg/mL Detec tavel Pg/mL Detec tavel Pg/mL Detect avel Pg/mL Titulag5es altas de G- hr3-BSA (n=5) 18±8 452 土 315 2/5 101 土 70 0/5 <4,9 3/5 177 土 158 Titula?5es baixas de Ghr3-BSA (n=9) 38 ±8 220 土 88 3/9 157 土 90 1/9 7±2 4/9 79 土 32 KLH (n=3) 27 土 266 + 2/3 221 土 0/3 <4,9 1/3 30 ±25 11 210 123
Os dados sao expressos como M 土 SEM ou como a freqiiencia dos niveis detecta-
veis.
Exemplo 7. Estatisticas
Analises de varia^ao (ANOVA) foram empregadas para identificar as diferengas do grupo. Testes LSD protegidos de Fisher foram usados para comparagdes posthoc. Testes t de Welch, corrigidos para mCiltiplas compara?5es, foram usados para comparar os grupos com variagao desigual. De modo a reduzir a heterogeneidade da varia^ao e obter uma dis- tribuigao mais normal, os dados para IL-6, TNF-σ, PAI-1 total ’ MCP-1，titulagoes de anticor- po no plasma, constantes de afinidade de Iigagao de ghrelina aparentes do plasma e razoes de ghrelina total no cerebro/plasma foram primeiro transformadas com log para analise esta- tistica，incluindo calculo das raz5es de seletividade de titulagao. Os valores correspondentes apreseritados nas Tabelas ou figuras representam transforma?5es antilog. Analise dos qua- drados φίο\ usada para testar se os individuos diferiram na freqQencia dos niveis de citocina na circulagao detectaveis. O pacote de software era ο Systat 11.0 (SPSS, Chicago, 111., USA). listagem de sequencia <110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE <120> vacinas e metodos para controle da adiposidade <130> 017968-9004-w000 <140> PCT/US2007/074976 <141> 08-01-2007 <150> US 60/821.071 <151> 08-01-2006 <160> 31
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERiSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posigao 3 e uma serina modificada da formula (I). <400> 1
Gly Ser Xaa Phe Leu 1 5
<210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERiSTICAS DIVERSAS <222> (6)..(6)
<223> Xaa na posigao 6 e tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERiSTICAS DIVERSAS <222> (7)..(7)
<223> Xaa na posigao 7 e tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 2
Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro 10 15
Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20
<210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERiSTICAS DIVERSAS <222> 0)..(3)
<223> Xaa na posigao 3 e uma serina modificada da formula (I) <400> 3
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser
1 5
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<221 > CARACTERiSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posigao 3 e uma serina modificada da formula (I) <400> 4
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro 1 5
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<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERiSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posigao 3 e uma serina modificada da formula (I), <400> 5
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu 1 5
<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220>
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<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 6
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His
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<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 7
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln 1 5 10
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<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
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<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <400> 8
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa
1 5 10
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<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS, <222> (3)..(3) <223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
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Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa 1 5 10
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<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 10
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln 1 5 10
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<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
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<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 11
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln 1 5 10
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<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
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<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
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Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220>
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<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
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<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
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Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
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<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
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<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
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<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 17
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys 20 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 18
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro 20
<210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 19
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 20
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala 20 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 21
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys 20 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 22
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu
25
<210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 23
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 24
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro
25
<210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Homo sapiens ou Rattus Norvegicus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (11)..(11)
<223> Xaa na posição 11 é tanto Lys (K) quanto Arg (R). <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (12)..(12)
<223> Xaa na posição 12 é tanto Ala (A) quanto Val (V). <400> 25
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 25 <210> 26 <211> 27 <212> PRT <213> Feliscatus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 26
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Arg Lys Glu 10 15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
25
<210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Sus scrofa <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 27
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys
10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
25
<210> 28 <211> 28 <212> PRT
<213> CanisLupusFamiIiaris <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 28
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
25
<210> 29 <211> 28 <212> PRT <213> MacacaMuIatta <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 29
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Ala Gln Gln Arg Lys
10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
25
<210> 30 <211> 28 <212> PRT <213> gallusgallus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 30
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
10 15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His Arg Arg
25
<210> 31 <211> 28 <212> PRT <213> Equuscaballus <220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS <222> (3)..(3)
<223> Xaa na posição 3 é uma serina modificada da fórmula (I). <400> 31
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg 25
Claims (11)
1. Imunoconjugado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) um polipeptídeo de ghrelina compreendendo Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C1 onde: <formula>formula see original document page 33</formula> onde: Y1 e Y2 são selecionados independentemente de O1 CH2 e NH; cada η é independentemente selecionado de O ou 1; Z é C, PO ou SO; e R é um grupo hidrocarboneto saturado ou insaturado, ramificado ou linear, substitu- ído ou não substituído tendo cerca de 3 a cerca de 10 átomos de carbono, ou é um grupo cicloalquila ou arila tendo cerca de 3 a cerca de 13 átomos de carbono; B compreende uma subseqüência de O a 23 resíduos de aminoácido consecutivos da SEQ ID NO: 2; e b) C compreende a fração veículo, onde o polipeptídeo de ghrelina é ligado à fração veículo por uma fração ligante.
2. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que A compreende
3. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que B compreende resíduos de aminoácido 1 a 5 da SEQ ID NO: 2.
4. Imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a fração ligante é um resíduo de cisteína.
5. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de cisteína é posicionado em um término do polipeptídeo de ghrelina. <formula>formula see original document page 33</formula>
6. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o término é o término carbóxi.
7. Imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o veículo é KLH ou BSA.
8. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz do imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7 e um veículo fisiologicamente aceitável.
9. Método de indução de uma resposta imune antighrelina em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administração ao indivíduo da composição de acordo com a reivindicação 8.
10. Método de controle de adiposidade em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administração ao indivíduo da composição de acordo com a reivin- dicação 8.
11. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que Y,éO,ZéC,néOeRé CH2CH2CH3.
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