ES2277441T3 - Azaftig, un proteoglicano para monitorizar la caquexia y para controlar la obesidad. - Google Patents
Azaftig, un proteoglicano para monitorizar la caquexia y para controlar la obesidad. Download PDFInfo
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Abstract
Azaftig sustancialmente puro; en donde dicho azaftig es un proteoglicano de peso molecular de aproximadamente 24 kDa, según se determina por electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato sódico-poliacrilamida; en donde dicho azaftig se obtiene de o es idéntico a un proteoglicano obtenido de la orina de pacientes caquécticos con cáncer; en donde dicho azaftig es un proteoglicano según se determina por digestión parcial con condroitinasa ABC o condroitinasa AC; en donde dicho azaftig no es digerido fácilmente por neuraminidasa; en donde dicho azaftig se une a membranas de células grasas; en donde dicho azaftig no se une a membranas de células musculares; y en donde dicho azaftig es una molécula con carga negativa, según se determina por cromatografía sobre DEAE-Sephacel a pH 7, 0.
Description
Azaftig, un proteoglicano para monitorizar la
caquexia y para controlar la obesidad.
Esta invención se refiere a la detección de la
propensión a la caquexia y al control de la obesidad.
La caquexia se define como una pérdida de peso
importante. Se produce habitualmente en pacientes con cáncer e
individuos infectados con VIH, pero también puede estar causada por
hipercatabolismo provocado por insuficiencia cardiaca
(especialmente, insuficiencia derecha o bilateral), insuficiencia
hepática, insuficiencia renal, quemaduras, inflamación (incluida
sepsis), infecciones o tuberculosis. Véase R.B. Verdery,
"Reversible and irreversible weight loss (cachexia) in the
elderly", en Textbook of Internal Medicine, 2ª edición
(V.T. DeVita et al., compiladores), capítulo 523, págs.
2424-2425 (1992); K.I. Marton, "Approach to
patient with unintentional weight loss", en Textbook of
Internal Medicine, 2ª edición (V.T. DeVita et al.,
compiladores), capítulo 444, págs. 2113-2115
(1992); R.M. Jordan et al., "Weight loss", en
Internal Medicine, 4ª edición (J.H. Stein, compilador),
capítulo 152, págs. 1260-1262 (1994); C.P. Artz
et al., "Burns: Including cold, chemical, and
electrical injuries", en Textbook of Surgery, 11ª
edición (D.C. Sabiston, Jr, compilador), capítulo 15, págs.
295-322 (1977); E. Braunwald, "Heart
Failure", en Harrison's Principles of Internal
Medicine, 13ª edición (K.J. Isselbacher, compilador), capítulo
195, págs. 998-1009 (1994); y D.W: Foster,
"Gain and loss in weight", en Harrison's Principles
of Internal Medicine, 13ª edición (K.J. Isselbacher,
compilador), capítulo 40, págs. 221-223 (1994). Más
de 50% de los pacientes con cáncer e infectado con VIH experimentan
una pérdida no intencional de peso mayor que 10% de su peso basal.
Adicionalmente, esta pérdida de peso se asocia con un incremento de
la morbididad y mortalidad. Muchos pacientes caquécticos manifiestan
múltiples problemas fisiológicos que afectan al sistema
inmunológico, sistema muscular y a la función hepática, que pueden
estar directamente relacionados con la pérdida de peso corporal o
debilitamiento. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de
la caquexia en pacientes puede conducir a un mejor tratamiento y, en
consecuencia, puede tener un impacto importante sobre la calidad de
vida y la supervivencia de muchos pacientes con cáncer y VIH/SIDA.
Véase G.O. Coodley et al., "The HIV Wasting Syndrome: A
Review", Journal of Acquired Immune Deficiency
Syndromes, vol. 7, págs. 681-694 (1994); L.M.
Hecker et al., "Malnutrition in patients with
AIDS", Nutrition Reviews, vol. 48, págs.
393-401 (1990); N.M. Graham et al.,
"Clinical factors associated with weight loss related to
infection with Human Immunodeficiency Virus Type I in the
multicenter AIDS cohort study", American Journal of
Epidemiology, vol. 137, págs. 439-46 (1993); y
K.A. Nelson et al., "The cancer anorexic cachexia
syndrome", Journal of Clinical Oncology, vol. 12,
págs. 213-25 (1994).
A pesar de la prevalencia de la pérdida de peso
en pacientes con cáncer, los mecanismos subyacentes a dicha pérdida
son desconocidos. Las explicaciones actuales de la pérdida de peso
asociada con el cáncer o el SIDA se dividen en dos categorías
generales: (1) mecanismos que reducen la ingesta de alimentos
(anorexia); y (2) mecanismos que incrementan el gasto de energía a
través de un metabolismo alterado o aumentado. Hecker et
al., 1990. Cualquier desequilibrio entre ingesta y gasto de
energía dará como resultado una variación del peso.
Muchos pacientes con cáncer o SIDA presentan una
ingesta de alimentos por vía oral disminuida y, por consiguiente,
un consumo de energía reducido. En consecuencia, a pesar de un gasto
de energía normal o, incluso, disminuido, estos pacientes pueden
perder peso. Otros pacientes experimentan anorexia debida al propio
tumor (por una obstrucción mecánica o una alteración de las
funciones de los tejidos), o a causa de la terapia usada para
tratar el tumor, por ejemplo, quimioterapia. Graham et al.,
1993; Nelson et al., 1994. Del mismo modo, numerosos
pacientes con VIH/SIDA sufren importantes pérdidas de peso
correlacionadas con el descenso del aporte calórico. Véase C.
Grunfeld et al., "Metabolic disturbance and wasting in
the acquired immunodeficiency syndrome", The New England
Journal of Medicine, vol. 327, págs. 329-337
(1992). De esta forma, la anorexia desempeña un papel importante en
la pérdida de peso para la mayoría de los pacientes tanto con cáncer
como con VIH/SIDA.
Los factores que se han identificado como
responsables de la anorexia en los pacientes incluyen infecciones
oportunistas o tumores gastrointestinales, efectos secundarios del
tratamiento, enteropatías, enfermedades del sistema nervioso
central, y trastornos psiquiátricos. Además, en la bibliografía se
mencionan numerosos mediadores fisiológicos de la anorexia, entre
los que se incluyen el factor de necrosis tumoral,
interleuquina-1, interleuquina-6,
interferón \gamma, e interferón \alpha. Coodley et al.,
1994; Nelson et al., 1994; y Grunfeld et al., 1990.
No obstante, los mecanismos mediante los que estos y otros
mediadores inducen anorexia siguen siendo desconocidos.
Otro mecanismo propuesto que contribuiría a la
pérdida de peso observada en pacientes con cáncer o SIDA es un
aumento del metabolismo o la ineficacia del mismo. Se ha informado,
y discutido, de que el gasto energético en reposo en algunos
pacientes aumenta en el curso de la enfermedad, incrementándose aún
más en las fases finales. Véase Coodley et al., 1994; Nelson
et al., 1994; y Grunfeld et al., 1990. Sin embargo,
las alteraciones del gasto energético en reposo o total no se
correlacionan con la pérdida de peso. Por lo tanto, no es probable
que el aumento de demanda de energía explique, por sí sola, la
emaciación.
Incluso con una reducción del consumo de
energía, los pacientes pueden perder peso debido a un metabolismo
ineficaz. Se plantea la hipótesis de que, durante los episodios de
pérdida de peso, se produce en los pacientes un fracaso en el
cambio de la oxidación de hidratos de carbono y proteínas a la
oxidación de ácidos grasos que tendría lugar normalmente bajo
condiciones de inanición. Este fracaso explica la observación de que
los pacientes pierden, de forma predominante, masa muscular más que
tejido graso. Asimismo, se ha señalado que el ciclo inútil del
metabolismo lipídico puede desperdiciar energía, acelerando, de esta
forma, la necesidad de degradar hidratos de carbono y proteínas a
pesar del descenso en el gasto total de energía. Véase Coodley
et al., 1994; Nelson et al., 1994; y Grunfeld et
al., 1990.
Recientemente, se ha propuesto que alteraciones
del metabolismo hormonal podrían ser responsables de la pérdida de
peso relacionadas con el VIH/SIDA o el cáncer, en especial debido a
la emaciación muscular. En el curso de infecciones graves o
crónicas, los pacientes, sobre todo los que sufren VIH/SIDA,
muestran resistencia a las acciones de la hormona del crecimiento.
Dado que la hormona del crecimiento actúa conservando la masa
muscular, se ha sugerido la hipótesis de que esta resistencia da
lugar a la emaciación muscular y pérdida de peso en pacientes con
VIH/SIDA. Recientemente, algunos investigadores han demostrado que
los pacientes con VIH/SIDA y afectados del síndrome de emaciación
exhiben una respuesta disminuida a la hormona de crecimiento
exógena, en comparación con un grupo testigo. Se han estudiado
principalmente los efectos de la hormona del crecimiento sobre la
secreción del factor I de crecimiento similar a la insulina
(IGF-I, un importante mediador de la acción de la
hormona del crecimiento). Con la administración exógena de
IGF-I a pacientes con síndrome de emaciación, los
pacientes experimentaron un incremento transitorio de la retención
de nitrógeno, pero retornaron a su estado inicial después de 8 a 10
días. Véase S.A. Lieberman et al., "Anabolic effects of
recombinant insuline-like growth
factor-I in cachectic patients with the acquired
immunodeficiency syndrome", Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism, vol. 78, págs.
404-410 (1994). De esta forma, las alteraciones que
se producen en el sistema hormona del
crecimiento/IGF-I pueden jugar un papel importante
en la caquexia asociada a VIH/SIDA.
En pacientes con cáncer se ha observado
resistencia a la hormona del crecimiento, pero también otras
hormonas importantes, incluida la insulina y su antagonista
glucagón, parecen tener una producción anormal. Dado que estas
hormonas resultan esenciales para un metabolismo normal, se ha
propuesto que las anomalías en estas vías explican el síndrome de
emaciación en estos pacientes. Véase Nelson et al., 1994.
Desgraciadamente, los mecanismos por los que el cáncer o la
infección de VIH provoca estas alteraciones del metabolismo hormonal
son, en el mejor de los casos, escasamente comprendidos.
El control de la ingesta calórica y del
mantenimiento del peso corporal es muy complejo. La búsqueda,
durante décadas, de mediadores endógenos ha conducido a la
identificación de una variedad de sustancias, que van desde simples
aminoácidos hasta grandes proteínas y glicoproteínas. Sin embargo,
ha sido difícil establecer una asociación inequívoca entre la
cantidad de cualquiera de estos factores y estados patológicos
humanos tales como anorexia/caquexia y anorexia nerviosa.
Se han identificado tres glicoproteínas o
proteoglicanos que modulan el apetito o el peso corporal: satienina,
satiomem, y la proteína de ratón MAC16. Una glicoproteína es una
proteína que contiene hidratos de carbono acoplados que no son
polímeros de unidades de repetición. Por el contrario, un
proteoglicano es una proteína que contiene unidades de repetición
de glicosaminoglicanos unidos de forma covalente a una proteína
nuclear.
Satienina es una glicoproteína con un peso
molecular de 50.000 Dalton que se ha aislado de suero humano y
animal. Se sabe que la satienina suprime la ingesta de alimentos en
animales. Véanse J. Knoll, "Satienin, a
blood-borne, highly selective and potent anorectic
glycoprotein", Biomed. Biochim. Acta, vol. 44, págs.
317-328 (1985); y J. Knoll, "Satienin: a 50,000
Dalton glycoprotein in human serum with potent,
long-lasting and selective anorectic
activity", J. Neural Transmission, vol. 59, págs.
163-194 (1984).
Satiomem es un proteoglicano con un peso
molecular de 50.000 Dalton que se ha aislado de membranas de plantas
y animales, incluida la membrana eritrocitaria humana. Se ha
demostrado que satiomem suprime la ingesta de alimentos y provoca
pérdida de peso. Véanse R.K. Upreti et al., "A step
towards developing the expertise to control hunger and saciety:
Regulatory role of satiomem - a membrane proteoglycan",
Neurochemical Research, vol. 20, págs.
375-384 (1995); A.M. Kidwai et al., "A
novel plant membrane proteoglycan which causes anorexia in
animals", Molecular and Cellular Biochemistry, vol.
120, págs. 111-117 (1993); y A.M. Kidwai et
al., "Isolation of an anorexigenic protein from
membranes", Molecular and Cellular Biochemistry, vol.
91, págs. 117-122 (1989).
La proteína MAC16 es una glicoproteína sulfatada
y fosfatada de 24 kDa, identificada inicialmente en la orina de
ratones con el tumor MAC16. Utilizando un anticuerpo monoclonal
contra la proteína MAC16 de ratón, se encontró una proteína similar
en la orina de pacientes humanos caquécticos con cáncer. La proteína
de ratón MAC16 provoca pérdida de peso en roedores debido,
principalmente, a un descenso de la masa corporal magra. La
bioactividad primaria de esta proteína es aumentar la proteólisis
muscular y reducir la síntesis de proteínas. La proteína MAC16 se
une fuertemente a las membranas de las células musculares. La
proteína MAC16 provoca también una cierta actividad lipolítica y no
afecta a la ingesta de alimentos. Se ha identificado que la proteína
nuclear de la proteína de ratón MAC16 tiene al menos 18
aminoácidos, y la digestión con condroitinasa AC da como resultado
un único fragmento de 14 kDa. La proteína humana identificada con el
anticuerpo monoclonal ("MAC16 humana") contra MAC16 también
incrementa la proteólisis en las células musculares. MAC16 humana se
ha encontrado solamente en la orina de pacientes caquécticos con
cáncer y no en pacientes que sufren una pérdida extrema de peso por
otras enfermedades tales como sepsis, quemaduras o cirugía mayor.
Véanse P.T. Todorov et al., "Structural Analysis of a
Tumor-produced Sulfated Glycoprotein Capable of
Initiating Muscle Protein Degradation", The Journal of
Biological Chemistry, vol. 272, págs. 12279-88
(1997); P. Cariuk et al., "Induction of Cachexia in
Mice by a Product isolated from the urine of cachectic cancer
patients", British Journal of Cancer, vol. 76, págs.
606-613 (1997); M.J. Lorite et al.,
"Induction of muscle protein degradation by a tumour
factor", British Journal of Cancer, vol. 76, págs.
1035-1040 (1997); P. Todorov et al.,
"Characterization of a cancer cachectic factor",
Nature, vol. 379, págs. 739-742 (1996); P.T.
Todorov et al., "Induction of muscle protein
degradation and weight loss by a tumour product", Cancer
Research, vol. 56, págs. 1256-1261 (1996); T.M.
McDevitt et al., "Purification and Characterization of a
Lipid-mobilizing Factor Associated with
Cachexia-inducing Tumours in Mice and
Humans", Cancer Research, vol. 55, págs.
1458-63 (1995); J.E. Belizario et al.,
"Bioactivity of skeletal muscle
proteólisis-inducing factors in the plasma proteins
from cancer patients with weight loss", British Journal
of Cancer, vol. 63, págs. 705-710 (1991); S.A.
Beck et al., "Lipid mobilising factors specifically
associated with cancer cachexia", British Journal of
Cancer, vol. 63, págs. 846-850 (1991); P.
Groundwater et al., "Alteration of serum and urinary
lipolytic activity with weight loss in cachectic cancer
patients", British Journal of Cancer, vol. 62, págs.
816-821 (1990); y S.A. Beck et al.,
"Alterations in serum lipolytic activity of cancer patients
with response to therapy", British Journal of Cancer,
vol. 62, págs. 822-825 (1990).
En la actualidad, no existe ninguna terapia
racional para la caquexia, es decir, un tratamiento basado en la
etiología de la enfermedad. Dado que los síntomas comunes del
síndrome de anorexia/caquexia incluyen pérdidas de apetito, de los
depósitos de grasa y de masa muscular, todas las terapias existentes
contra la caquexia comprenden productos conocidos por aumentar el
apetito (por ejemplo, ciproheptadina (PERIACTIN®), facilitar el
almacenamiento de energía (por ejemplo, acetato de megestrol
(MEGACE®)), o aumentar la masa muscular (productos androgénicos).
Aunque estos tratamientos funcionan en algunos pacientes, en otros
muchos nada funciona. Puesto que el factor tiempo es muy importante
en estos pacientes, hasta que se pueda encontrar una terapia
racional, existe la necesidad de predecir qué pacientes podrían
responder a cuál de las múltiples terapias disponibles.
La obesidad juega un papel importante en la
etiología de muchas enfermedades crónicas, incluidas las
enfermedades cardiovasculares, cáncer y diabetes. Por lo tanto, un
objetivo de alcance nacional ha sido reducir la prevalencia de la
obesidad en la población de EE.UU. a no más de 20%.
Desgraciadamente, se ha comprobado un incremento sustancial de la
obesidad en los EE.UU. durante la última década.
Por lo general, la obesidad se clasifica en dos
grupos, basados en el sitio de depósito de la grasa: visceral y no
visceral, también conocidos como obesidad de la parte superior del
cuerpo, o androide (en forma de manzana), y obesidad de la parte
inferior del cuerpo, o feminoide (en forma de pera),
respectivamente. Está bien establecido que el tejido adiposo
visceral se asocia con una mayor morbididad y mortalidad, en
especial hipertensión, hiperlipidemia, y resistencia a la insulina.
Los datos demuestran igualmente que la pérdida de peso mediante
dietas, ejercicio o farmacoterapia produce un descenso del tejido
adiposo visceral y mejoría de la hipertensión, hiperlipidemia, y
resistencia a la insulina. Véanse F.X. Pi-Sunyer,
"Medical Hazards of Obesity"; Annals of Internal
Medicine, vol. 119, págs. 655-660 (1993); y G.A.
Bray, "Pathophysiology of Obesity", American Journal
of Clinical Nutrition, vol. 55, págs. 488S-494S
(1992).
Un tratamiento farmacológico para reducir la
grasa corporal, en particular la grasa visceral, sería de gran
importancia para la salud. En la actualidad, no se dispone de
ninguna farmacoterapia capaz de facilitar una reducción de los
depósitos de grasa. Preparados tales como REDUX® y Fen/phen han
tenido éxito en el tratamiento de la obesidad; sin embargo, han
sido retirados del mercado debido a sus graves efectos
secundarios.
Los presentes inventores han descubierto un
proteoglicano ("azaftig"), con un peso molecular de
aproximadamente 24.000 Dalton, que ha sido aislado y caracterizado
a partir de la orina de pacientes caquécticos con y sin cáncer. Se
ha demostrado que azaftig se une a los receptores en las membranas
de las células grasas y provoca lipólisis. Azaftig no se une a las
membranas de las células musculares ni produce proteólisis. La
detección de azaftig en orina permitirá la identificación precoz de
pacientes en los que la pérdida de peso puede convertirse en un
problema. Azaftig también puede contribuir a la pérdida de grasa de
humanos en los que la obesidad representa una amenaza para la
salud.
Figura 1 ilustra el perfil de elución en
DEAE-Sephacel de
^{125}I-azaftig.
Figura 2 ilustra la reducción del peso corporal
de una rata debido a inyecciones de azaftig.
Figura 3 ilustra la reducción del peso corporal
de ratones debido a inyecciones de azaftig.
Figura 4 ilustra la evolución en el tiempo de la
pérdida de peso de ratones registrada en la Figura 3.
Figura 5 ilustra la evolución en el tiempo del
aumento de peso en ratones tras interrumpir las inyecciones de
azaftig.
Figura 6 ilustra la reducción porcentual de
grasa intraperitoneal en ratones tratados con azaftig, medida una
semana después de la última inyección de azaftig.
Figura 7 ilustra la ingesta de alimentos a las 3
h y 24 h en ratones testigo y tratados con azaftig.
Figura 8 ilustra el perfil de elución en
Sephadex-G-25 de
^{125}I-azaftig.
Figura 9A ilustra la unión específica de
^{125}I-azaftig a preparaciones de membrana de
células grasas.
Figura 9B ilustra el efecto del pH sobre la
unión específica de ^{125}I-azaftig a
preparaciones de membrana de células grasas.
Figura 9C ilustra la dependencia del tiempo de
la unión específica de ^{125}I-azaftig a
preparaciones de membranas de células grasas.
Figura 10A ilustra el efecto de la concentración
de ^{125}I-azaftig sobre la unión específica a
preparaciones de membranas de células grasas.
Figura 10B ilustra el análisis de Scatchard de
los datos de fijación de la Figura 10A.
Figura 11 ilustra el efecto de azaftig sobre la
proteólisis in vitro de células musculares.
Figura 12 ilustra la velocidad de eliminación de
la sangre en ratones de ^{125}I-azaftig.
Figura 13 ilustra el perfil de elución en
DEAE-Sephacel de azaftig.
Figura 14 ilustra el perfil de elución en
Q-Sefarosa de azaftig.
Figura 15 ilustra el patrón de unión del núcleo
peptídico sintético de MAC16 y de MAC16 de la orina de pacientes
con SIDA.
Los presentes inventores han aislado un
proteoglicano con un peso molecular de aproximadamente 24.000 Dalton
de la orina de pacientes caquécticos con y sin cáncer. Los
inventores han denominado este proteoglicano "azaftig". Se ha
demostrado que azaftig provoca pérdida de peso en mamíferos.
Asimismo, se ha demostrado que incrementa la lipólisis y que se une
a preparaciones de membranas de células grasas. No obstante, y a
diferencia de la glicoproteína MAC16, azaftig no aumenta la
proteólisis en el tejido muscular, ni se fija a preparaciones de
membranas de células musculares.
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Ejemplo
1
Se recogió orina de 24 h de un paciente con un
diagnóstico de adenocarcinoma metastático de origen primario
desconocido, que había experimentado una pérdida de 22,7 kg de peso
durante varios meses antes del diagnóstico. La orina se trató con
sulfato de amonio (saturación al 80%), y se incubó durante la noche
a 7ºC. La solución se centrifugó a 6.000 x g durante 1 h, y se
separó el sobrenadante. El precipitado de sulfato de amonio se
disolvió en 50 ml de agua y se centrifugó nuevamente. Se conservó el
sobrenadante, y el granulado se suspendió nuevamente en
dodecil-sulfato sódico("SDS") al 5%. Tanto el
sobrenadante como el precipitado disuelto en SDS se separaron
subsiguientemente por electroforesis sobre gel de
SDS-poliacrilamida. El sobrenadante exhibió varias
bandas de proteínas, con dos bandas predominantes a 24
kilo-daltons y 70 kilo-daltons. Las
proteínas con un peso molecular de 24 kilo-daltons,
o las que posteriormente se determinó que eran sus múltiplos (70
kilo-daltons), se denominaron azaftig.
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Ejemplo
2
Azaftig de 24 kilo-daltons se
aisló de la forma anteriormente descrita. La proteína purificada se
marcó radiactivamente con ^{125}I, usando el método de
cloramina-T descrito por F.C. Greenwood et
al., "The preparation of ^{131}I-labeled
growth hormone of high specific activity", Biochemical
Journal, vol. 89, págs. 114-123 (1963).
Subsiguientemente, se analizó la carga de la proteína usando
cromatografía de intercambio aniónico sobre
DEAE-Sephacel. ^{125}I-azaftig se
dializó durante la noche a 4ºC contra una solución de urea 8 M, Tris
0,1 M, Triton X-100 al 0,3%, y NaCl 0,15 M (pH 7,0)
que contuvo inhibidores de proteasa. La muestra dializada se aplicó
a una columna de DEAE-Sephacel (volumen de lecho 4
ml), que había sido equilibrada en el mismo tampón que la solución
de diálisis. La columna se lavó con 20 ml del mismo tampón, con una
velocidad de flujo de 10 ml/h. A continuación, la columna se eluyó
con un gradiente continuo de NaCl (desde 0,15 hasta 1,0 M) en el
tampón de urea. Se recogieron fracciones de 1,0 ml, y se contaron
las partes alícuotas en un contador gamma para determinar la
radiactividad de ^{125}I. El patrón de elución con NaCl 0,18 M
demostró que azaftig es una molécula de carga negativa, siendo
probablemente un proteoglicano, es decir, moléculas conocidas por
tener grupos sulfato cargados negativamente (Figura 1). En
consonancia con esta conclusión, la digestión con condroitinasa ABC,
según la descripción de H. Saito et al., "Enzymatic
methods of the determination of small quantities of isomeric
chondroitin sulfate", J. Biol. Chem., vol. 243, págs.
1536-1542 (1968), de azaftig dio como resultado un
descenso de la banda de azaftig en SDS-PAGE. Debido
a que la condroitinasa ABC es una enzima que escinde de forma
específica el sulfato de condroitina o los grupos de sulfato de
dermatano en los proteoglicanos, esta pérdida de azaftig indica que
la molécula es un proteoglicano que contiene sulfato de
condroitina.
condroitina.
Azaftig marcado radiactivamente se separó por
SDS-PAGE. La autorradiografía puso de manifiesto
tres a cuatro bandas evidentes, generadas por azaftig purificado,
que indican que azaftig tiene tendencia a la agregación. Para
reducir la agregación de la muestra, se trató azaftig purificado con
Triton X-100 al 1% y, subsiguientemente, se
cromatografió sobre una columna de Sephadex G-50.
Adicionalmente, se llevaron a cabo experimentos en presencia de
guanidina-HCl 4 M para minimizar la agregación.
Ambos tratamientos tuvieron como consecuencia una disminución de la
agregación, tal como se deduce de una única banda por
SDS-PAGE, que demuestra que azaftig forma agregados
in vitro. Estudios subsiguientes con anticuerpos
anti-azaftig han demostrado también un patrón
similar de agregación, tal como se describe en el siguiente Ejemplo
3.
^{125}I-azaftig se digirió en
experimentos separados, utilizando sendas 50 unidades de
neuraminidasa, condroitinasa ABC, o condroitinasa AC. Se analizó
cada producto de digestión por electroforesis
SDS-PAGE. La neuraminidasa no degradó el
proteoglicano, en tanto que las condroitinasas ABC y AC provocaron
digestión parcial. Condroitinasa AC produjo fragmentos con pesos
moleculares por debajo de 10 kDa. Estos datos confirman que azaftig
es un proteoglicano, porque tanto condroitinasa ABC como AC
escinden específicamente el sulfato de condroitina o el sulfato de
dermatano presente en proteoglicanos.
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Ejemplo
3
En conejos Blancos de Nueva Zelanda se
inyectaron 5 \mug de azaftig purificado,
electro-eluido de geles de
SDS-PAGE, utilizando adyuvante completo de Freund
(Difco Laboratories, MI). Se llevaron a cabo subsiguientes
inmunizaciones usando la misma cantidad de azaftig en adyuvante
incompleto de Freund cada dos semanas, durante un total de cuatro
inyecciones. Después de cuatro inmunizaciones, los conejos fueron
desangrados y se analizaron los antisueros, con sus anticuerpos
policlonales, frente a azaftig purificado y las muestras de orina
originales del paciente. Tal como se demuestra por Transferencia de
Western, el antisuero fijó azaftig a una dilución de 1:1.000. Este
antisuero se utilizó, a continuación, para la detección de azaftig
en pacientes con VIH/SIDA con pérdida de
peso.
peso.
Del mismo modo, una persona experimentada en la
técnica puede sintetizar anticuerpos policlonales y monoclonales
adicionales contra la molécula de azaftig, empleando métodos bien
conocidos en este campo.
Se separaron proteínas de la orina no
concentrada de un paciente mediante SDS-PAGE al 14%,
y se transfirieron a nitrocelulosa por el método de H. Towbin et
al., "Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some
applications", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 76,
págs. 4350-54 (1979). A continuación, las proteínas
transferidas se analizaron con el anticuerpo
anti-azaftig. Tras el revelado con una
inmunoglobulina anti-conejo de cabra conjugada con
fosfatasa alcalina, se llevó a cabo una evaluación semicuantitativa
de la intensidad de las bandas presentes en la transferencia.
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Ejemplo
4
Se seleccionaron de forma aleatoria 42 pacientes
VIH-positivos para proporcionar muestras de orina y
cumplimentar un cuestionario relativo a pérdida de peso,
infecciones oportunistas, y otros parámetros de actividad del VIH.
Los 42 pacientes se sometieron a rastreo por el método de
transferencia de Western anteriormente señalado. De los 42
pacientes, 17 demostraron no tener azaftig. 10 tuvieron grandes
cantidades de azaftig en orina, en tanto que los 15 restantes
mostraron cantidades modestas de azaftig. 24 pacientes (13 con
azaftig y 11 sin él) cumplimentaron cuestionarios en los que se
solicitó información sobre el peso. La Tabla 1 muestra los datos
relativos a la presencia de azaftig y pérdida de peso en estos
pacientes.
| Presencia | Ausencia | Total | ||||
| Pérdida de peso | 9 | 4 | 13 | |||
| Sin pérdida de peso | 4 | 7 | 11 | |||
| Total | 13 | 11 | 24 |
De esta forma, de los 24 pacientes, 13
experimentaron pérdida de peso y 9 de estos 13 (69,2%) mostraron
azaftig en su orina. De los 11 pacientes que no experimentaron
pérdida de peso, sólo 4 (36,4%) tuvieron azaftig en su orina. Por
lo tanto, en esta población de muestra, los pacientes con azaftig
tuvieron prácticamente el doble de probabilidad de experimentar
pérdida de peso que los que carecen de azaftig. De la misma forma,
los pacientes con pérdida de peso tuvieron prácticamente el doble
de probabilidad de expresar azaftig que los que no perdieron peso.
Sin embargo, el tamaño de la muestra no fue suficientemente grande
para mostrar significado estadístico (p=0,10).
Una explicación del reducido número de pacientes
que exhibieron cantidades mensurables de azaftig, pero que no
experimentaron pérdida de peso, puede radicar en diferencias
estructurales del azaftig producido por los diferentes
individuos.
Ejemplo
5
Se seleccionaron de forma aleatoria 23 pacientes
con cáncer hospitalizados, 7 pacientes sin cáncer, y 10 adultos
sanos. Los pacientes sin cáncer tuvieron diagnósticos de diabetes,
enfisema, anemia, hipertensión, e insuficiencia cardiaca coronaria.
Se pidió a los participantes que cumplimentaran cuestionarios en los
que se detallaban sus hábitos alimentarios y cualquier patrón de
pérdida o aumento de peso. De los 23 pacientes con cáncer, 7
comunicaron pérdida de peso, 3 ausencia de pérdida de peso, y 13 no
respondieron el cuestionario. De los 7 pacientes sin cáncer, sólo 2
pacientes con insuficiencia cardiaca coronaria comunicaron pérdida
de peso. El cuestionario no determinó el grado de pérdida de peso.
Se recogió el volumen total de orina producido por cada paciente
durante 24 h, y una parte se analizó por SDS-PAGE.
Se cuantificó la intensidad de la banda de azaftig en cada muestra,
utilizando el software NIH Image (V. 1.59). Se analizaron de la
misma manera concentraciones conocidas de albúmina sérica bovina
(BSA, en sus siglas en inglés) purificada para generar una curva
estándar. La concentración de azaftig en las muestras de pacientes
se determinó comparando las densidades integradas para las muestras
de pacientes con las densidades de banda de las concentraciones
conocidas de BSA. La concentración media de azaftig en los
pacientes con cáncer fue 8,37 \pm 12,51 mg/l, con un intervalo de
0,00 a 39,25 mg/l. Estos datos pusieron de manifiesto una alta
variabilidad en los niveles de azaftig en los pacientes con cáncer.
Los pacientes sin cáncer y los adultos sanos tuvieron niveles de
azaftig de 0,00 mg/l. Fue interesante comprobar que los únicos
pacientes sin cáncer que comunicaron pérdida de peso fueron los
diagnosticados de insuficiencia cardiaca, una enfermedad asociada
con caquexia. Los presentes inventores, sin pretender limitarse a
esta teoría, establecen que es posible que estos 2 pacientes
mostraran signos incipientes de caquexia, pero sin que azaftig
hubiera alcanzado todavía niveles mensurables.
Ejemplo
6
En 2 ratas Sprague-Dawley se
insertaron cánulas en la arteria carótida, y se dejó que su peso se
estabilizara después de la operación. Al cabo de 5 días, una rata
recibió 3 dosis (a intervalos de 5 h) de azaftig purificado de 1
\mug/gramo de peso corporal, administradas en solución salina
tamponada con fosfato. Azaftig se había aislado de un paciente
humano con cáncer. La otra rata recibió solamente la solución salina
tamponada. Tal como se ve en la Figura 2, la rata testigo aumentó
de peso durante 24 h, en tanto que la rata tratada con azaftig
perdió 10% de su peso en el mismo espacio de tiempo. Este
experimento preliminar demostró que azaftig provoca pérdida de peso
en otra especie de mamífero.
Estudios similares se llevaron a cabo en 4
ratones NMRI criados en el centro (Charles River, Willmington, MA),
y cuatro ratones NIH Swiss criados fuera del centro (Hilltop
Laboratories, Scottsdale, PA). Inicialmente, los ratones recibieron
inyecciones intraperitoneales de un tampón de elución de SDS al 0,1%
en acetato de amonio 50 mM durante 5 días, hasta que su peso se
estabilizó. Tras la estabilización del peso, los ratones recibieron
inyecciones diarias de 0,1 mg/kg de azaftig purificado sobre gel
durante 5 días. Se registraron diariamente el peso corporal y la
ingesta de alimentos. Tal como se muestra en la Figura 3, los ocho
ratones perdieron peso a un promedio de 12,0% (\pm 7%) del peso
corporal máximo medido. Esta reducción es significativa en un
ensayo t apareado (p=0,001), utilizando el peso previo a la
administración de azaftig de cada animal como control del peso
posterior al tratamiento.
En la Figura 4 aparecen representados los datos
para mostrar la evolución en el tiempo de la pérdida de peso con la
administración de azaftig. Dado que los ratones tuvieron pesos
iniciales diferentes, los datos se expresan como porcentajes del
peso máximo observado en cada animal (media \pm DE) durante el
experimento. Estos datos demuestran que la administración de
azaftig causa una pérdida sustancial y sostenida de peso.
Para determinar si el efecto de azaftig es
reversible, se permitió que 4 de los 8 ratones originales se
recuperaran tras interrumpir las inyecciones de azaftig. Tal como
se ve en la Figura 5, estos animales se recuperaron lentamente de
la pérdida de peso, pero sin volver a los valores iniciales. Estos 4
ratones se sometieron a una autopsia. Se observó que estos animales
tuvieron escasa o nula grasa intra-abdominal. Este
hecho indica que, a pesar de haber recuperado peso, los incrementos
de peso no se debieron a un aumento de masa lipídica.
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Ejemplo
7
Para confirmar adicionalmente la observación
anterior de que el aumento de peso no obedece a la grasa, 5 ratones
recibieron diariamente 0,1 mg/kg de azaftig por vía intraperitoneal
durante 5 días. Una semana después de la última administración de
azaftig, los ratones fueron pesados y sacrificados. Se retiró
quirúrgicamente la grasa intraperitoneal, que se pesó. Se calculó
el porcentaje de grasa intraperitoneal con respecto al peso
corporal total, y los resultados se muestran en la Figura 6.
Animales no tratados con inyecciones actuaron como testigos. Los
animales tratados con azaftig mostraron una reducción significativa
(60%) del porcentaje de grasa intraperitoneal comparados con los
testigos. El porcentaje medio de grasa intraperitoneal (\pm
desviación estándar [DE]) para los animales tratados con azaftig fue
5,75 \pm 1,83; para los animales testigos, 14,7 \pm 2,44 (p =
0,002).
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Ejemplo
8
Al objeto de establecer el efecto de azaftig
sobre el apetito, se efectuaron experimentos con ratones en ayunas.
18 ratones NIH Swiss hembras se dividieron en 2 grupos, un grupo
testigo y un grupo de tratamiento de 9 ratones cada uno. Durante 5
días consecutivos, los ratones se mantuvieron sin comida, pero con
agua, durante 21 h y, seguidamente, se alimentaron durante 3 h. Al
sexto día, 30 min antes de la hora programada de alimentación, los
ratones fueron tratados por vía intraperitoneal con vehículo (0,1
ml/ratón) o con azaftig (0,1 mg/kg en 0,1 ml de vehículo). 30 min
más tarde, se les ofreció comida. Se midió la ingesta de alimentos
de cada ratón a las 3 h y a las 24 h. Los datos que se muestran en
la Figura 7 ponen de manifiesto que azaftig no afectó de manera
significativa a la ingesta de alimentos a las 3 h ni a las 24 h.
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Ejemplo
9
Azaftig se marcó mediante el uso de un kit de
marcado con ^{125}I de lactoperoxidasa, adquirido en ICN
Radiochemicals. En pocas palabras, se agregaron 1,5 mCi de
^{125}I exento de vehículo neutralizado (10 \mul) a un tubo que
contuvo 30 \mug de azaftig (100 \mul), y se mezcló por completo.
A la mezcla anterior se agregaron 10 \mul de solución de
lactoperoxidasa (1 \mug/\mul) en agua. La reacción se inició
mediante la adición de 5 \mul de H_{2}O_{2} al 3% recién
preparado. La adición de H_{2}O_{2} se repitió tres veces a
intervalos de 10 min hasta completar una adición total de 40 \mul
de H_{2}O_{2}. 10 min después de la última adición, la reacción
se finalizó por dilución con 500 \mul de tampón de fosfato de
potasio 500 mM a pH 7,5. La mezcla total se cargó en una columna
Sephadex G-25 con un volumen de lecho de 9 ml. La
columna se eluyó con el tampón fosfato mencionado, y se recogieron
14 fracciones de 1 ml. El pico de radiactividad apareció entre las
fracciones 4 y 7, y se combinó. Esta muestra combinada se mezcló con
una décima parte del volumen de albúmina sérica bovina al 5%, y se
almacenó a -20ºC en partes alícuotas de 1,2 ml.
^{125}I-azaftig se purificó
adicionalmente antes de la unión al receptor cargando una muestra de
1,2 ml con 164.000 CPM en una columna Sephadex G25 (58 x 0,75 cm,
volumen de lecho de 25,6 ml). La columna se eluyó con
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contuvo NaCl 0,15 M, y
se recogieron 148 fracciones (0,25 ml/fracción) en las que se contó
la radiactividad. Los datos que se presentan en la Figura 8 muestran
3 picos de radiactividad, siendo el Pico 3 ^{125}I libre. Tras
SDS-PAGE, el Pico 1 migró con azaftig conocido, en
tanto que el Pico 2 pareció ser un producto de degradación. En los
subsiguientes ensayos de unión al receptor se utilizó solamente el
producto del Pico 1, en las fracciones 18 a 36.
Ratones NIH Swiss adultos hembras fueron
sacrificados por dislocación cervical, y se recogió la grasa
visceral de la cavidad abdominal. La grasa (200-300
mg) se suspendió en 10 ml de Tris-HCl 50 mM helado,
a pH 7,4, y se trituró con tijeras hasta lograr una buena
suspensión de células. La suspensión se mantuvo fría durante la
homogeneización con un dispositivo Virtis Polytron durante 20 seg en
posición 2,5. El homogeneizado se centrifugó a 3.000 x g durante 10
min a 4ºC. El sobrenadante se centrifugó nuevamente a 49.000 x g
durante 15 min a 4ºC, y se recogió el granulado. Seguidamente, el
granulado se resuspendió en el tampón de homogeneización a 20 mg de
tejido original/ml, y se mezcló con el Polytron durante 5 seg. Se
utilizó esta muestra, entonces, para la unión al receptor.
Para el ensayo de unión, se incubaron sobre
hielo durante 15 min 300 \mul de preparación de membrana, 10
\mul de tampón (Tris-HCl 50 mM, a pH 7,4) (con o
sin azaftig radiactivo), y 10 \mul de
^{125}I-azaftig (300-500 pmol).
La reacción se interrumpió por la adición de 5 ml de tampón helado.
El ^{125}I-azaftig fijado a membrana se recogió
de inmediato por succión a través de un filtro de microfibra de
vidrio con un tamaño de poro de 1 micrómetro (Whatman Co.), seguido
de dos lavados con 5 ml de tampón. Todo el proceso de filtración y
lavado duró alrededor de 15 seg. Los filtros se transfirieron a un
vial de escintilación, y se contó la radiactividad en un contador
gamma. La fijación específica de ^{125}I-azaftig
se calculó restando la radiactividad no específicamente unida de la
radiactividad unida total no desplazada por azaftig 1,0 \muM.
La unión específica de
^{125}I-azaftig a las preparaciones de membrana de
células grasas dependió de la concentración de proteínas de la
membrana, del pH, y de la duración de la incubación (Figuras 9A, 9B
y 9C). A una temperatura de 0 a 4ºC y un pH 7,4, la unión de
^{125}I-azaftig fue proporcional a la
concentración de proteínas de membrana, que varió desde 0,5 hasta
5,0 mg de tejido por tubo (Figura 9A). La unión específica fue
máxima a pH neutro (Figura 9B). A 4ºC y pH 7,4, la unión específica
de ^{125}I-azaftig aumentó de manera lineal con
el tiempo, alcanzando un valor máximo a los 15 min (Figura 9C).
La adición de cantidades crecientes de
^{125}I-azaftig a una cantidad fija de preparación
de receptores dio como resultado la saturación de la unión
específica (Figura 10A). El análisis de Scatchard de estos datos de
unión (Figura 10B) indicó la presencia de una única población de
sitios de unión, con un valor de constante de disociación (KD)
aparente de 82,5 nM y una capacidad máxima de unión (B_{max}) de
67,25 fmol/mg de tejido graso.
Ejemplo
10
El tejido muscular incubado in vitro
sufre proteólisis que tiene como consecuencia la pérdida de tejido
muscular y liberación de aminoácidos. Esta proteólisis puede
aumentar por la adición de la glicoproteína MAC16, que incrementa
también la lipólisis. Utilizando métodos como los descritos por P.
Todorov et al., "Structural analysis of a
tumor-produced sulfated glycoprotein capable of
initiating muscle protein degradation", J. Biol.
Chem., vol. 272, págs. 12279-12288 (1997),
azaftig, por el contrario, no incrementa la degradación de
músculo.
Se disecó el músculo del diafragma de dos
ratones, se eliminó el tejido extraño, y se determinaron sus pesos:
67,2 y 66,3 mg. Cada músculo de diafragma se transfirió a un pequeño
vial que contuvo 1 ml de tampón bicarbonato de
Krebs-Ringer, de pH 7,4, con glucosa al 0,1%. El
vial se gaseó con aire que contuvo dióxido de carbono al 5%, y se
incubó durante 30 min a 37ºC. A continuación, se retiró el tejido
muscular, se sometió a transferencia, y se transfirió a un vial
limpio que contuvo 1 ml de tampón de Krebs-Ringer
(testigo) o 1 ml de tampón de Krebs-Ringer que
contuvo 150 \mug de azaftig (experimental). Seguidamente, los
viales se gasearon como antes, y se les incubó durante 2 h a 37ºC.
Al final de la incubación, se retiró el músculo, se lavó 3 veces con
solución salina tamponada con fosfato, y se transfirió a un vial
limpio que contuvo 3 ml de tampón de Krebs-Ringer.
Se retiró de inmediato una parte alícuota de 0,5 ml de la solución
para la determinación de tiempo cero de los aminoácidos liberados
por la proteólisis. Entonces, se incubó el músculo a 37ºC y se
extrajeron partes alícuotas similares a 1 h, 3 h y 4 h. Los
aminoácidos se analizaron por el método de ninhidrina descrito por
S. Moore, "Amino acid analysis: Aqueous dimethyl sulfoxide as
solvent for the ninhydrin reaction", J. Biol.. Chem.,
vol. 243, págs. 6281-6283 (1968). Tal como se
muestra en la Figura 11, el músculo tratado con azaftig liberó
aminoácidos al mismo ritmo que la preparación de testigo. Azaftig no
incrementó la tasa proteolítica normal.
Se incubó ^{125}I-azaftig
marcado radiactivamente con preparaciones de membrana de una
variedad de tejidos, incluidas células de corazón, músculo,
suprarrenales, riñón, hígado y grasa. Solamente las células grasas
mostraron fijación, lo que indica la presencia de un receptor de
alta afinidad. Las células musculares no fijaron
^{125}I-azaftig y se utilizaron como controles en
posteriores ensayos de receptor.
Ejemplo
11
Ratones NIH Swiss se trataron dos veces al día
con azaftig (0,5 mg/kg, inyección intraperitoneal) durante 5 días
consecutivos. Se midieron diariamente la ingesta de alimentos y las
variaciones del peso corporal. La aparición de pérdida de peso tras
la administración de azaftig se retrasó en 1-2 días.
No obstante, la pérdida de peso continuó durante varios días
después de finalizar el tratamiento con azaftig. La pérdida de los
depósitos de grasa visceral en los ratones fue claramente visible
durante varios días después de haber finalizado el tratamiento.
Para comprender el mecanismo subyacente a la pérdida de peso y
reducción de los depósitos de grasa, mediadas por azaftig, se midió
la semivida de ^{125}I-azaftig en ratones Swiss
Webster.
5 ratones NIH Swiss adultos, hembras, de Hilltop
Farm, recibieron inyecciones intraperitoneales de 0,1 ml de
^{125}I-azaftig (5 x 10^{6} CPM, 5 \mug de
azaftig). En diversas ocasiones se extrajeron 10 \mul de sangre
de la cola y se determinó la radiactividad presente en la muestra de
sangre con un contador gamma. Los datos que aparecen en la Figura
12 muestran un perfil de radiactividad en un ratón típico. La
radiactividad en sangre alcanzó un valor máximo de aproximadamente
1.300 CPM/10 \mul en aproximadamente 20 min y permaneció elevada
durante aproximadamente 30 min. A continuación, el nivel de
radiactividad en sangre disminuyó lentamente, con una semivida de
aproximadamente 4 a 5 h, lo que revela una baja velocidad de
eliminación para azaftig. Este lento aclaramiento indica la
resistencia de azaftig a la degradación metabólica y hace de azaftig
un potente agente caquéctico.
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Ejemplo
12
Se utilizó azaftig purificado en un intento
inicial de secuenciar el núcleo proteico del proteoglicano.
Desgraciadamente, se encontró que el extremo amino estaba
bloqueado. Por el contrario, el extremo amino de la proteína MAC16
no exhibe un bloqueo similar. Véase Cariuk et al., 1997.
Cuando se purifican 10 \mug de azaftig como se
describe a continuación, en el Ejemplo 13, se secuenciará el núcleo
proteico de azaftig escindiendo, en primer lugar, la molécula y
secuenciando, seguidamente, los segmentos no bloqueados por métodos
conocidos en la técnica.
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Ejemplo
13
Se ha desarrollado un método de 3 etapas para la
purificación adicional de azaftig.
Etapa
1
Se hicieron pasar 200 mililitros de orina de un
paciente caquéctico con cáncer a través de una columna
DEAE-Sephadex (4,0 ml volumen de lecho), a una
velocidad de flujo de 10 ml/h. La columna se lavó con 20 ml de un
tampón de acetato sódico 0,05 M, a pH 6,0, que contuvo Triton
X-100 al 0,5% y urea 8 M, y a continuación se eluyó
con un gradiente continuo de NaCl desde 0 hasta 0,3 M en el mismo
tampón. Se recogieron fracciones de 1 ml, y se llevaron a cabo
ensayos de proteínas en partes alícuotas mediante la absorbancia a
280 nm. Las fracciones con proteínas se sometieron a
SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa, y se sondaron con el anticuerpo contra azaftig. Como
se muestra en la Figura 13, las fracciones 27-70
exhibieron inmuno-reactividad positiva. La
inmuno-reactividad máxima se detectó entre las
fracciones 33 a 41. Las fracciones 33, 37 y 41 se combinaron para
una purificación adicional.
Etapa
2
Las fracciones combinadas de la Etapa 1 se
dializaron contra Tris-HCl 0,01 M, a pH 8,0, durante
24 h a 4ºC y, seguidamente, se aplicaron a una columna de
Q-Sefarosa (8,0 ml de volumen de lecho). La columna
se lavó con 20 ml de tampón de Tris-HCl 0,01 M, a
pH 8,0, y a continuación, se eluyó con un gradiente de NaCl 0 a 0,3
M en el mismo tampón, a una velocidad de flujo de 10 ml/h. Se
recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron las proteínas
midiendo la absorbancia a 280 nm. Las fracciones con proteínas se
sometieron a análisis por transferencia de Western usando el
anticuerpo contra azaftig de la forma anteriormente descrita. Tal
como se muestra en la Figura 14, las fracciones
38-48 mostraron inmuno-reactividad
positiva, registrándose la máxima actividad en las Fracciones 41 y
42. Se combinaron las Fracciones 41 y 42 para una purificación
adicional.
Etapa
3
La muestra combinada de fracciones 41 y 42 de la
Etapa 2 se inyectó en una columna de HPLC
(Novo-pack C^{18} 60 A 4 \mum, 3,9 x 300 mm,
40ºC). La columna se eluyó a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min,
usando un gradiente lineal de acetonitrilo al 0,1% hasta 35% en
ácido trifluoroacético al 0,1% y trietilamina al 0,05%. Se registró
la absorbancia de cada fracción a 214 nm y se ensayó su
inmuno-reactividad frente al anticuerpo contra
azaftig. Azaftig eluyó de la columna a aproximadamente 6 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Se desarrollará un sistema de detección para
azaftig al objeto de identificar los pacientes en riesgo de sufrir
caquexia debida al cáncer, infección de VIH u otras afecciones tales
como, por ejemplo, quemaduras, sepsis o tuberculosis. En muchos
casos, la aparición de caquexia (un trastorno secundario) dificulta
la continuación de la terapia adecuada de la enfermedad primaria
(cáncer, VIH/SIDA, etc.). El hecho de conocer el riesgo inminente
de caquexia permitiría al médico instituir medidas precoces para
combatir el trastorno y conservar el peso corporal, permitiendo, de
esta forma, continuar la terapia para la enfermedad primaria.
Resulta fácil desarrollar diversos sistemas de detección, por
ejemplo, ELISA, RIA y "tiras reactivas" impregnadas con
anticuerpo. Muestras biológicas adecuadas para una detección de
este tipo incluyen suero, saliva y orina. Los anticuerpos utilizados
en los ensayos pueden ser policlonales o monoclonales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
De acuerdo con un protocolo aprobado, se
administrará azaftig por vías periféricas para normalizar el peso
corporal y reducir los depósitos de grasa en pacientes obesos con
riesgo de hipertensión, enfermedades cardiovasculares, diabetes y
otras afecciones asociadas con la obesidad. Este método de reducción
de los depósitos de grasa ("liposucción química") es muy
preferible a la eliminación quirúrgica de grasa que no sólo es caro,
sino que supone también un riesgo importante de infecciones y
derivados de la anestesia quirúrgica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 16 -
18
Al objeto de analizar adicionalmente las
diferencias entre azaftig y MAC16, se generó un anticuerpo
policlonal contra la secuencia octadecapeptídica del núcleo
proteico de la glicoproteína MAC16. Este anticuerpo se utilizó
entonces en un ensayo de inmunosorción unido a enzima (ELISA) para
analizar la presencia de MAC16 en la orina de pacientes
caquécticos, según se describe en D. Shiuan et al.,
"Competitive enzyme-linked immunosorbent assay
for protein", Methods in Enzymology, vol. 279, págs.
321-326 (1997).
En Alpha Diagnostics, San Antonio, Tejas, se
sintetizó un péptido equiparable a la secuencia establecida del
núcleo peptídico de MAC16:
NH_{2}-Tyr-Asp-Pro-Glu-Ala-Ala-Ser-Ala-Pro-Gly-Ser-Gly-Asp-Pro-Ser-His-Glu-Ala-Cys-COOH,
tal como se describe en P. Todorov et al.,
"Characterization of a cancer cachectic factor",
Nature, vol. 379, págs. 739-742 (1996). La
pureza de los péptidos sintetizados se determinó por espectroscopia
de masa, cromatografía líquida de alta presión, análisis de
aminoácidos, y análisis de secuencia de aminoácidos. En Alpha
Diagnostic International, Inc., San Antonio TX, EE.UU. se
adquirieron anticuerpo G contra la inmunoglobulina
anti-conejo de cabra (el segundo anticuerpo),
sustrato y todos los restantes reactivos para ELISA.
El péptido sintetizado se acopló con hemocianina
de lapa (keyhole limpet hemocyanin) (KLH), utilizando éster
de
m-maleimido-benzoil-N-hidroxi-succinimida
(MBH) como agente bifuncional. Dos conejos Nueva Zelanda adultos
recibieron una inyección primaria del conjugado
péptido-KLH (0,3-0,4 mg/conejo),
emulsionado en adyuvante completo de Freund. Todas las inyecciones
se administraron en múltiples sitios por vías subcutánea e
intramuscular. Cada 2 semanas, se administraron múltiples
inyecciones de recuerdo del conjugado de péptido-KLH
(0,3-0,4 mg/conejo), emulsionado en adyuvante
incompleto de Freund. La primera muestra de sangre se extrajo 1
semana después de la 5ª inyección, y se midió el título de
anticuerpo de la forma que se describe a continuación. Seguidamente,
los animales recibieron inyecciones de recuerdo cada 2 semanas,
extrayendo sangre una semana después de cada inyección.
El péptido sintetizado (0,5 mg/ml) se diluyó a
1,0 \mug/ml en tampón de revestimiento consistente en fosfato
sódico 50 mM, NaCl 145 mM, a pH 7,4, y un estabilizador antigénico.
Los pocillos de placas de microtitulación de alta fijación se
recubrieron con 0,1 ml de péptido (1,0 \mug/ml) por medio de
incubación durante la noche a 4ºC. Todas las restantes operaciones
se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-23ºC).
Para lavar los pocillos de la placa de microtitulación o para
separar su contenido, la placa se invirtió rápidamente y su
contenido se hizo caer a la fuerza sobre una bandeja. Cada pocillo
se lavó 3 veces con 0,3 ml de tampón de lavado (fosfato sódico 50
mM, NaCl 145 mM, Tween al 0,05%, NaN_{3} al 0,1%, a pH 7,4, con un
estabilizador antigénico), se bloqueó durante 3 h con 0,2 ml de
tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina al 10%, fosfato sódico 50
mM, NaCl 145 mM, a pH 7,4, y con un estabilizador antigénico) y, a
continuación, se retiró el tampón. A cada pocillo se agregó una
muestra desconocida o una muestra testigo de cantidades crecientes
de péptido, en un volumen total de 50 \mul, 50 \mul del
péptido-anticuerpo diluido (1:400 a 1:6.400) en
tampón ELISA (albúmina sérica bovina al 1,5%, suero bovino
fetal/cabra, NaN_{3} al 0,1%, y un estabilizador antigénico), y
150 \mul de tampón ELISA. Esta solución se incubó durante 3 h. Al
final de la incubación, las placas se lavaron 3 veces con tampón de
lavado, y se agregó 0,1 ml de IgG anti-conejo de
cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluido 1:2000 en
tampón ELISA), continuando la incubación durante 30 min adicionales.
Las placas se lavaron 5 veces con tampón de lavado. La reacción
enzimática se inició por la adición de 0,1 ml de solución de
sustrato TMB (tetrametilbenzidina 50 mM, dimetilsulfóxido del 1%,
peróxido de hidrógeno al 0,01%, y un estabilizador antigénico). La
reacción se finalizó 15 min más tarde por la adición de 0,1 ml de
solución de detención (ácido sulfúrico 0,2 M en agua). La
absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de placa ELISA.
La fiabilidad de la medición del nivel endógeno
de la glicoproteína MAC16 mediante ELISA en la orina u otros
fluidos corporales depende de la especificidad del anticuerpo
utilizado. Cuando utilizan anticuerpo anti-péptido,
los presentes inventores han demostrado una estrecha inmunoidentidad
entre la glicoproteína MAC16 y el péptido sintético. La adición de
péptido sintético al pocillo de ensayo dio lugar a una disminución
dependiente de la dosis de la unión
péptido-anticuerpo al péptido fijado al pocillo y,
por lo tanto, a un descenso de A_{450 \ nm}. (Figura 15, círculos
macizos). Bajo las condiciones descritas anteriormente, el límite de
detección fue aproximadamente de 50 ng/ml ó 1,0 ng por pocillo. Sin
embargo, el intervalo útil de la curva estándar se extendió hasta
1.000 ng/ml.
Las muestras de orina se diluyeron dos veces al
mismo tiempo (1:1 a 1:8), y se utilizaron 50 \mul para ELISA. Se
comparó la capacidad del péptido sintético y MAC16 en orina para
inhibir la reacción antígeno-anticuerpo en ELISA.
La adición de orina de un paciente caquéctico con SIDA al pocillo de
ensayo redujo la A_{450 \ nm} en relación con su contenido en
glicoproteína MAC16 de forma paralela al péptido sintético (Figura
15, círculos en blanco). Estos datos indican una inmunoidentidad
entre la inmuno-reactividad semejante a la de la
glicoproteína MAC16 urinaria y la
inmuno-reactividad del péptido sintético.
En esta ocasión, se analizó la presencia de
MAC16 mediante ELISA en muestras de orina de 17 de los pacientes
VIH-positivos, en los que se había analizado
previamente la presencia de azaftig por un ensayo de transferencia
de Western (Ejemplo 4 anterior). La orina de 12 de los pacientes
mostró niveles detectables de la proteína MAC16 (>20 ng/ml) en
orina. Sin embargo, no hubo correlación (r=0,24, p=0,35) entre la
cantidad de glicoproteína MAC16 en orina y la pérdida de peso.
Azaftig sí mostró correlación con la pérdida de peso. La orina de 6
pacientes tuvo niveles detectables de MAC16 (>20 ng/ml) sin
azaftig detectable, y 3 pacientes sin glicoproteína MAC16
exhibieron presencia de azaftig.
Azaftig, combinado con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, se puede administrar a mamíferos,
incluidos humanos, por vía intravenosa, subcutánea, percutánea,
intramuscular o intranasal para controlar la pérdida de peso.
La dosificación variará en función del objetivo
específico para el que se administra azaftig; los expertos en la
técnica pueden determinar fácilmente las dosificaciones apropiadas,
siendo la "cantidad eficaz" aquella dosificación que
incremente (azaftig) la pérdida de peso en un grado estadísticamente
significativo.
Claims (7)
1. Azaftig sustancialmente puro; en donde dicho
azaftig es un proteoglicano de peso molecular de aproximadamente 24
kDa, según se determina por electroforesis sobre gel de
dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida; en donde dicho azaftig se
obtiene de o es idéntico a un proteoglicano obtenido de la orina de
pacientes caquécticos con cáncer; en donde dicho azaftig es un
proteoglicano según se determina por digestión parcial con
condroitinasa ABC o condroitinasa AC; en donde dicho azaftig no es
digerido fácilmente por neuraminidasa; en donde dicho azaftig se
une a membranas de células grasas; en donde dicho azaftig no se une
a membranas de células musculares; y en donde dicho azaftig es una
molécula con carga negativa, según se determina por cromatografía
sobre DEAE-Sephacel a pH 7,0.
2. Método de detección de la propensión a la
caquexia en humanos, que comprende analizar en los fluidos
corporales de dicho humano cantidades detectables de azaftig; en
donde azaftig es un proteoglicano de peso molecular de
aproximadamente 24 kDa, según se determina por electroforesis sobre
gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida; en donde azaftig se obtiene
de o es idéntico a un proteoglicano obtenido de la orina de
pacientes caquécticos con cáncer; en donde azaftig es un
proteoglicano según se determina por digestión parcial con
condroitinasa ABC o condroitinasa AC; en donde azaftig no es
digerido fácilmente por neuraminidasa; en donde dicho azaftig se
une a membranas de células grasas; en donde azaftig no se une a
membranas de células musculares; y en donde azaftig es una molécula
con carga negativa, según se determina por cromatografía sobre
DEAE-Sephacel a pH 7,0.
3. Método según la reivindicación 2, en donde la
caquexia está causada por cáncer, infección de VIH, quemaduras,
insuficiencia cardiaca, inflamación, tuberculosis, insuficiencia
renal, insuficiencia hepática, infección o por sepsis.
4. Método según la reivindicación 2, en donde el
fluido corporal es suero, sangre, plasma, orina o saliva.
5. Azaftig para la inducción de pérdida de peso
en un mamífero, en donde azaftig es un proteoglicano de peso
molecular de aproximadamente 24 kDa, según se determina por
electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida; en donde azaftig se obtiene
de o es idéntico a un proteoglicano obtenido de la orina de
pacientes caquécticos con cáncer; en donde azaftig es un
proteoglicano según se determina por digestión parcial con
condroitinasa ABC o condroitinasa AC; en donde azaftig no es
digerido fácilmente por neuraminidasa; en donde dicho azaftig se
une a membranas de células grasas; en donde azaftig no se une a
membranas de células musculares; y en donde azaftig es una molécula
con carga negativa, según se determina por cromatografía sobre
DEAE-Sephacel a pH 7,0.
6. Uso de azaftig para la fabricación de un
medicamento para inducir pérdida de peso en un mamífero, en donde
azaftig es un proteoglicano de peso molecular de aproximadamente 24
kDa, según se determina por electroforesis sobre gel de
dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida; en donde azaftig se obtiene
de o es idéntico a un proteoglicano obtenido de la orina de
pacientes caquécticos con cáncer; en donde azaftig es un
proteoglicano según se determina por digestión parcial con
condroitinasa ABC o condroitinasa AC; en donde azaftig no es
digerido fácilmente por neuraminidasa; en donde dicho azaftig se
une a membranas de células grasas; en donde azaftig no se une a
membranas de células musculares; y en donde azaftig es una molécula
con carga negativa, según se determina por cromatografía sobre
DEAE-Sephacel a pH 7,0.
7. Azaftig según la reivindicación 5, en donde
el mamífero es un humano.
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