KR20090041416A - 비만증을 억제하는 백신 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피검체의 비만증을 치료하고 체중 증가를 지연시키는 면역접합체를 특징으로 한다. 이 면역접합체는 특정 그렐린 폴리펩타이드와 적당한 캐리어부를 포함한다.
비만증 억제 방법, 그렐린 면역접합체, 항-그렐린 면역 반응
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2006년 8월 1일에 출원된 미국 임시 특허출원 제60/821,071호(전문이 참고인용됨)에 대해 우선권을 주장한다.
비만증은 심장 질환, 암, 2형 당뇨병, 졸중, 관절염 및 주요 우울증과 같은 동반이환을 통해 전세계적으로 수백만명의 생명을 위태롭게 한다. 전세계 약 10억명이 과체중 또는 비만(각각, 체질량 지수 = 25-30 또는 ≥30kg/㎡)이고, 부유 국가의 유병률이 불균형적으로 더 높다. 예를 들어, 미국에서 국민건강 및 영양실태조사(NHANES) 결과에 따르면, 2003-2004년에 20세 이상의 모든 미국 성인 중 약 66%가 과체중 또는 비만이었다. 40-59세 성인 남성은 5명 중 거의 4명이 이와 같이 분류되었다. 6-11세 및 12-19세 사이의 아동과 청소년에서도 각각 19%와 17%가 과체중이었다. 놀랍게도 지난 20년 동안 청소년의 비만증 유병률은 3배 증가했다. 과체중 또는 비만인 사람 수의 증가는 모든 연령, 인종 및 종족 집단, 및 성별을 초월하고, 점차 세계적이다. 예를 들어, 중국의 도시 미취학 아동의 비만 유병률은 1989년-1997년 사이에 8배가 넘게 증가했고, 영국 성인의 비만율도 1980년-2002년 사이에 거의 3배 상승했다. 2000년, 미국에서 3개의 NHANES 집단의 혼동-반영된 분석에서 밝혀진 바와 같이 비만과 관련된 사망은 11만명이 넘었고, 미국에서 비만의 경제적 비용은 1170억불인 것으로 추정되었다.
현재, 약물을 포함한, 비만의 이용가능한 비외과적 치료는 일시적으로 억제하지만 치료가 유지되는 동안에만 효과적이다. 치료를 중단하면, 체중 증가가 불가피하게 일어난다. 비만증 치료를 시작하기 위해서는 에너지 섭취, 흡수, 소비 또는 저장에 영향을 미쳐야 한다. 많은 약물이 시판되고 있거나 현재 비만증 치료를 위해 연구 중이지만, 몇몇 약물은 불면증, 무력증, 변비, 고혈압, 빈맥, 판막 심장 이상 및 심지어 사망과 같은 부작용이 있다. 따라서, 몇몇 체중 감량 약물은 식약청에 의해 금지되어 있고, 그 예로는 이 증상에 대해 최초로 승인받은 데스옥시에페드린(1946), 및 최근의 d-펜플루라민/펜플루라민(1997. 9) 및 에페드린 알칼로이드(2004. 4)가 있다.
다행히, 지난 15년 동안의 연구는 체중과 지방을 항상성 방식으로 조절하는 분자 기전의 이해를 급변시켰다. 축적된 발견들은, 뇌가 보관된 에너지를 지방 조직으로서 장기간 동안 유지시키고자 한다는 에너지 항상성의 지방균형 가설을 지지한다. 따라서, 고도의 통합된 과잉 신경액 에너지 항상성 피드백 시스템은 행동 및 대사 기전을 통해 지방질량에 대한 에너지 균형 및 특히 음성 에너지 균형에 단기 변동의 충격을 최소화하는 작용을 한다. 기능상실 돌연변이가 사람 또는 설치류에서 단일유전자 비만증 증후군을 초래하거나 비만증 내성을 부여하는 유전자의 동정 은 에너지 항상성을 조절하는 상호연관된 경로의 특성을 규명하기 위한 중대한 유전학적 진입점을 제공했다. 이러한 수용체 및 리간드의 동정은 에너지 스펙트럼의 양 말단의 신호를 표적화하기 위한 연구 노력으로 이어졌지만, 아직까지 이용할 수 있는 실행가능한 백신이나 치료 양식은 없다.
발명의 개요
본 발명자들은 그렐린(ghrelin) 유래의 폴리펩타이드 면역접합체(immunoconjugate)를 이용한 능동 면역을 통해 위 내분비선 호르몬 그렐린의 생체이용률을 조정하는 것이 에너지 균형을 조절하고 제지방체중(lean mass)을 보존하면서 체중 증가를 지연시키는 수단을 제공한다는 것을 발견했다.
따라서, 하나의 관점으로서, 본 발명은 그렐린 폴리펩타이드와 캐리어부(carrier moiety)를 포함하되, 링커부(linker moiety)를 통해 그렐린 폴리펩타이드가 캐리어부에 결합되어 있는 면역접합체를 제공한다. 그렐린 폴리펩타이드 면역접합체는 다음과 같은 서열을 포함한다:
Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C
여기서, A와 B는 다음과 같이 정의된다:
A는 다음과 같은 구조를 가진 부이다:
여기서, Y1 및 Y2는 독립적으로 O, CH2 및 NH 중에서 선택되고; n은 0 또는 1이고; Z는 C, PO 또는 SO이고; R은 탄소원자가 약 3개 내지 약 10개인 포화되거나 불포화된, 분지형 또는 비분지형의 치환되거나 비치환된 탄화수소 그룹이거나, 또는 탄소원자가 약 3개 내지 약 13개인 사이클로알킬 또는 아릴 그룹이고;
B는 서열번호 2의 0개 내지 23개의 연속 아미노산 잔기의 부분서열(subsequence)을 포함하며; C는 캐리어부를 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 전술한 면역접합체의 면역원성 유효량과 생리학적으로 허용되는 비히클(vehicle)을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 전술한 면역접합체의 면역학적 유효량과 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물을 피검체에게 투여하는 것을 포함하여, 피검체의 항-그렐린 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 피검체의 비만증을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 전술한 조성물을 피검체에게 투여하는 것을 포함한다.
도 1은 실시예에서 기술된 그렐린 특이적 면역 반응을 발생시키는데 사용된 그렐린-합텐 면역접합체 Ghr1, Ghr2 및 Ghr3을 도시한 것이다.
도 2는 1일 체중 증가(패널 A), 1일 음식 섭취량(패널 B) 및 급식 효율(패널 C)의 함수로서, 전신 에너지 항상성에 미치는 그렐린-합텐 면역접합체 백신접종의 효과를 그래프로 도시한 것이다.
도 3은 혈장 친화성(패널 B), 1일 체중 증가(패널 C), 1일 음식 섭취량(패널 D), 급식 효율(패널 E), 상대적 무지방 건조 질량(패널 F), 혈장 렙틴 수준(패널 G) 및 뇌/혈장 총 그렐린 비(패널 H)에 의거하여, 고 혈장역가 피검체와 저 혈장역가 피검체의 비교(패널 A)를 통해 입증한, 전신 에너지 항상성, 비만증 및 뇌/혈장 그렐린 비에 대한 혈장 항-그렐린 결합능의 관계를 그래피로 도시한 것이다.
본 발명은 면역접합체의 그렐린 폴리펩타이드 부분이 본 명세서에 기술된 바와 같이 제3 아미노산 위치에 변형된 세린 잔기를 포함하는 그렐린 폴리펩타이드 면역접합체를 제공한다. 이 면역접합체는 다음과 같은 서열로 적절하게 표현된다:
Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C
여기서, A와 B는 다음과 같이 정의된다:
A는 다음과 같은 구조를 가진 부이다:
여기서, Y1 및 Y2는 독립적으로 O, CH2 및 NH 중에서 선택되고; n은 0 또는 1이고; Z는 C, PO 또는 SO이고; R은 탄소원자가 약 3개 내지 약 10개인 포화되거나 불포화된, 분지형 또는 비분지형의 치환되거나 비치환된 탄화수소 그룹이거나, 또는 탄소원자가 약 3개 내지 약 13개인 사이클로알킬 또는 아릴 그룹이고;
B는 서열번호 2의 0개 내지 23개의 연속 아미노산 잔기의 부분서열을 포함하며;
C는 캐리어부를 포함한다.
면역접합체는 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 백신 조성물에 적절하게 포함된다. 또한, 본 발명은 항-그렐린 면역 반응을 피검체에서 유도하여 피검체의 비만증을 억제하는 방법을 제공한다.
그렐린
폴리펩타이드
본 명세서와 당업계에 사용되는 것처럼, "폴리펩타이드"란 용어는 2개 이상의 아미노산 잔기가 아미드 결합에 의해 결합되어 있는 것을 의미하며, 펩타이드와 단백질을 포함한다. 본 발명의 그렐린 폴리펩타이드는 정제물이거나 합성물일 수 있다. "정제물"은 자연 상태에서 보통 동반되는 성분이 적어도 부분적으로 분리된 물질을 의미한다. 당업자라면 알고 있듯이, 폴리펩타이드의 순도는 일반적으로 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 기술을 사용하여 측정한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "합성물"은 당업계에 공지된 바와 같이 재조합 생산된 것 및 고체상 기술을 통해 제조된 것을 모두 의미한다.
본 발명의 그렐린 폴리펩타이드는 최소한 Gly Ser Xaa Phe Leu(서열번호 1)을 포함하는 서열을 보유하고, 여기서, A는 화학식 I의 구조를 가진 변형된 세린 잔기를 나타낸다:
상기 화학식 I과 관련하여, Y1 및 Y2는 독립적으로 O, CH2 및 NH 중에서 선택되고; n은 0 또는 1이다. 또한, 화학식 I에서, Z는 C, PO 또는 SO 중에서 적당히 선택된다. R은 탄소원자가 약 3개 내지 약 10개인 포화되거나 불포화된, 분지형 또는 비분지형의 치환되거나 비치환된 탄화수소 그룹이거나, 또는 탄소원자가 약 3개 내지 약 13개인 사이클로알킬 또는 아릴 그룹이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "탄화수소 그룹"은 쇄에 특정 수의 탄소 원자를 보유하는 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 이 탄화수소 그룹은 예컨대, 알킬 그룹, 알케닐 그룹 또는 알키닐 그룹을 포함할 수 있다. 특히 적당한 양태에서, Y1은 O이고, Z는 C이고, n은 0이고, R은 -CH2CH2CH3이다. 이하에 기술되는 서열 목록에서 A는 Xaa로 표시된다.
그렐린 폴리펩타이드는 또한 B를 포함할 수 있고, 이 B는 전장(full length) 그렐린 폴리펩타이드의 카르복시 말단 부분서열이다. 부분서열은 서열번호 2의 임의의 서열 또는 서열번호 2의 전체서열을 포함한다. 환언하면, 그렐린 폴리펩타이드는 서열번호 1, 및 서열번호 2의 서열 또는 부분서열을 포함한다. 예를 들어, 전체 그렐린 폴리펩타이드 서열은 다음 서열 중 임의의 서열을 포함할 수 있다:
Gly Ser Xaa Phe Leu (서열번호 1);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser (서열번호 3);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro (서열번호 4);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu (서열번호 5);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His (서열번호 6);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln (서열번호 7);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg (서열번호 8);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val (서열번호 9);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln (서열번호 10);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln (서열번호 11);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg (서열번호 12);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys (서열번호 13);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu (서열번호 14);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser (서열번호 15);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys (서열번호 16);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys (서열번호 17);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro (서열번호 18);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro (서열번호 19);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala (서열번호 20);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys (서열번호 21);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu (서열번호 22);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln (서열번호 23);
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro (서열번호 24); 또는
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys/Arg Ala/Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg (서열번호 25).
여기서, Xaa는 전술한 바와 같은 변형된 세린인 A이다. 또한, 특별히 고찰되어야 하는 것은, 상기 열거된 아미노산 중 임의의 아미노산은 예컨대 본 발명에 참고인용된 문헌[Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, ed. B. Weinstein (1983)]에 기술된 바와 같이 적당한 비-천연 아미노산으로 대체될 수 있다는 것이다.
또한, 그렐린 펩타이드 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같이 위치 3번에 변형된 세린을 보유하고 면역화될 종에 특이적인 그렐린 서열에 상응하는 것일 수 있다는 것도 고려되어야 한다. 또한, 종간 서열이 보존적이고 약간의 변이만이 있으므로 펩타이드 및 종 사이의 교차반응성이 고려된다는 것도 생각되어야 한다.
캐리어부
본 발명의 면역접합체는 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 캐리어부 C에 공유 또는 비공유 접합된 전술한 그렐린 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "캐리어부"는 폴리펩타이드의 면역원성을 증강시킬 수 있는 접합 파트너를 의미한다. 예를 들어, 덱스트란, 만노스 또는 만난 등의 탄수화물과 같은 폴리머가 사용될 수 있다. 또한, 이.콜라이(E. coli) 및 다른 세균 유래의 내재성 막 단백질도 유용한 접합 파트너이다. 또한, 통상의 캐리어 분자, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 및 소혈청 알부민(BSA)도 적합하다.
결합부
당업계에 공지된 바와 같이, 폴리펩타이드를 캐리어부에 결합시키는데 이용할 수 있는 다양한 방법이 있고, 이 방법 모두 본 발명에 적당히 개조되어 사용될 수 있다. 대부분의 전략은 폴리펩타이드와 캐리어 상의 반응성 그룹 사이의 공유 결합의 형성을 통해 캐리어부 상의 유도체화된 분자에 폴리펩타이드를 접합시키는 것을 포함한다. 적당하게는, 그렐린 폴리펩타이드 서열에 혼입된 반응성 그룹을 보유하는 하나 이상의 아미노산이, 폴리펩타이드를 캐리어부에 결합시키는데 사용된다. 적합한 결합부는 아미노 그룹, 카르복시 그룹 또는 설프하이드릴 그룹을 보유하는 것이다. 자명한 것으로서, 그렐린 폴리펩타이드의 서열에 있는 아미노산의 관 능 그룹은 폴리펩타이드를 캐리어에 연결시키는 결합부로서 사용될 수 있다. 이러한 아미노산에는 리신, 아르기닌, 시스테인, 아스파테이트, 글루타메이트, 티로신 및/또는 히스티딘이 포함될 수 있다. 그렐린 폴리펩타이드의 항체 결합 도메인의 외측에 있는 시스테인 잔기를 이용한 디설파이드 커플링은 특히 적합한 커플링 전략 중 하나이며, 여기서 시스테인은 표준 재조합 기술을 이용하여 도입시키는 것이 적당하다. 하나의 양태에서, 시스테인 잔기는 그렐린 폴리펩타이드의 말단, 예컨대 카르복시 말단 또는 아미노 말단에 위치한다.
폴리펩타이드 부를 캐리어에 결합시키는 또 다른 적합한 수단은 당업계에 공지되어 있고 본 발명에 사용될 수 있다.
면역원성 조성물
전술한 바와 같은 그렐린 면역접합체는 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 조성물에 면역원성 유효량으로 포함되는 것이 적당하다. 당업계 및 본 명세서에 사용된 "면역원성 유효량"은 면역원, 즉 천연의 내인성 그렐린과 면역학적 특징을 공유하는 제제(agent)를 유의적으로 체결시키는 면역반응을 유도할 수 있는 면역접합체의 양이다. "생리학적으로 허용되는" 비히클은 생체내 투여(예: 경구, 경피 또는 비경구 투여)에 적합하거나 시험관내 사용, 즉 세포 배양물에 적합한 임의의 비히클이다.
본 발명의 그렐린 면역접합체를 포함하는 조성물은 생체내 용도, 즉 피검체에의 치료적 또는 예방적 투여를 위해 제형화되는 것이 적당하다. 특정 양태에서, 조성물은 백신 조성물로서 제형화된다. 본 명세서에 사용된 "백신"은 격리 항체의 생성을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 면역 반응을 피검체에 유도할 수 있는 조성물이다.
활성 성분으로서 폴리펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제법은 당업계에 널리 알려져 있고, 그 예는 미국 특허 제4,608,251호; 제4,601,903호; 제4,599,231호; 제4,599,230호; 제4,596,792호 및 제4,578,770호에 예시되어 있으며, 이 문헌들은 모두 참고인용되었다. 통상적으로, 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조되고, 주사전에 용액이나 현탁액으로 제형화하기에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 이 제조물은 유화될 수 있다. 그렐린 면역접합체는 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합될 수 있다. 적당한 부형제는 예컨대 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물이다. 또한, 경우에 따라, 백신은 이하에 기술되는 바와 같이 백신의 효과를 증강시키는 애주번트, pH 완충제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조 물질을 소량으로 포함할 수 있다.
백신은 통상적으로 주사에 의해, 예컨대 피하, 피부내, 피부하 또는 근육 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 투여 방식에 적합한 또 다른 제형에는 좌제가 있고, 일부 경우에는 구강, 협측, 설하, 복강내, 질내, 항문, 경막외, 척수 및 수조내 제형이 포함된다. 좌제인 경우에, 통상의 결합제 및 캐리어로는 예컨대 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있고, 이러한 좌제는 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위로 함유하는 혼합물로부터 제 조될 수 있다. 경구 제형은 일반적으로 이용되는 부형제, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 이러한 조성물은 용액제, 현탁액제, 정제, 환제, 캡슐제, 지속 방출 제형 또는 산제의 형태를 취하고, 10 내지 95%의 활성 성분, 바람직하게는 25 내지 70%의 활성 성분을 포함한다.
잘 알고 있듯이, 백신은 투여 제형에 적합한 방식으로, 예방적 또는 치료학적으로 유효하고 면역원성인 양으로 투여된다. 투여되는 양은 치료받는 피검체, 예컨대 면역 반응을 일으키는 개체의 면역계의 능력, 및 원하는 보호 정도에 따라 달라진다. 적당한 투여량 범위는 약 0.1㎍/체중kg 내지 약 10mg/체중kg의 범위이고, 예컨대 약 500㎍/체중kg 내지 약 1000㎍/체중kg의 범위이다. 또한, 초회 투여 및 추가 용량에 적합한 방법도 고려되어야 하며, 초회 투여 후, 후속 접종 또는 다른 투여가 일반적이다.
본 발명의 그렐린 면역접합체 백신의 일부 양태는 충분히 면역원성이지만, 다른 일부 양태에서는 백신이 추가로 애주번트 물질을 포함한다면 면역 반응이 증강될 것이다. 애주번트 및 이의 용도는 당업계에 익히 공지되어 있다. 본 명세서에서, "애주번트"란 용어는 1) 그 자체가 백신의 면역접합체에 대하여 면역 반응을 유발시킬 수 없지만, 2) 그럼에도 불구하고 면역접합체에 대한 면역반응을 증강시킬 수 있는 물질을 의미한다. 애주번트 효과를 달성하는 다양한 방법은 공지되어 있다. 일반적인 원리와 방법은 본 발명에 참고인용된 문헌["The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, 및 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9]에 상세히 설명되어 있다. 본 발명에 사용하기에 특히 적합한 애주번트는 보통 완충된 식염수에 0.05 내지 0.1% 용액으로서 사용되는, 알루미늄 하이드록사이드 또는 포스페이트(명반)이다.
항-
그렐린
면역 반응을 유도하는 방법
본 발명의 일부 양태는 피검체에서 항-그렐린 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. "피검체"는 척추동물, 적당하게는 포유동물, 더욱 적당하게는 사람이다. 적당한 피검체로는 또한 가축, 예컨대 고양이, 개 및 말이 포함될 수 있다. 잘 알고 있듯이, 연구 목적인 경우에 피검체는 동물 모델, 예컨대 마우스 또는 래트가 적당하다. 다른 종, 예컨대 개, 고양이, 말 또는 마우스의 경우, 면역접합체의 그렐린 폴리펩타이드 부는 종에 따라 선택될 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 본 명세서에 사용된 "항-그렐린 면역 반응"은 구체적으로 피검체의 면역계에 의해 매개되는 치료적 또는 예방적 그렐린 격리 효과를 유도하는 것을 의미한다. 이러한 면역 반응은 체중증가의 예방 또는 지연, 제지방체중(lean body mass)의 보존, 급식 효율 저하 및 상대적 비만증 저하와 같은 전신적 효과가 피검체에서 관찰되도록, 피검체의 내인성 그렐린의 제거 또는 면역 조절을 적당히 촉진한다.
항-그렐린 면역 반응의 평가는 이하 실시예에 기술되는 분석법으로 평가하는 것이 적당하다. 본 발명에 따른 피검체의 항-그렐린 면역 반응의 유도는 전술한 면 역접합체 조성물을 피검체에게 투여함으로써 달성할 수 있다.
비만증을 억제하는 방법
본 발명의 일부 양태는 피검체의 비만증을 억제하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "비만증을 억제하는"이란 어구는 피검체의 체중 증가의 예방 또는 지연, 제지방체중의 보존, 급식 효율 저하 및 상대적 비만증 저하를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 피검체의 비만증 발생을 예방한다.
본 발명에 따른 그렐린 면역접합체 조성물의 피검체에의 투여는 용량 의존적 방식으로 유익한 효과를 나타낼 것으로 보인다. 즉, 광범위한 한도 내에서, 그렐린 면역접합체 조성물을 다량으로 투여할수록, 소량 투여 시보다 더 큰 정도로 비만증을 억제할 것으로 예상된다. 또한, 효능은 독성이 나타나는 수준 이하의 투여량에서 고려한다. 또한, 실제로는 비만증의 치료학적 치료가 목적인 경우에는 일반적으로 더 높은 용량으로 사용하고, 체중 증가를 지연시키거나 예방적 목적인 경우에는 일반적으로 더 낮은 용량을 사용한다.
임의의 주어진 경우에 투여되는 특정 투여량은 당업자라면 잘 알고 있는 바와 같이 피검체의 상태 및 그렐린 면역접합체의 활성 또는 피검체의 반응을 변경시킬 수 있는 다른 관련 의학적 요인에 따라 조정될 것이라는 것은 자명한 것이다. 예를 들어, 특정 환자의 특정 용량은 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 식이, 투여 시간 및 방식, 배출 속도 및 함께 사용된 약제에 따라 달라진다. 주어진 환자에 대 한 투여량은 적당한 통상적인 약리학적 또는 예방학적 프로토콜의 이용 등과 같은 통상적인 고려 사항을 이용하여 결정할 수 있다.
피검체의 최대 투여량은 바람직하지 않거나 견딜 수 없는 부작용을 일으키지 않는 최고 투여량이다. 각각의 예방학적 또는 치료학적 방법과 관련된 변수의 수는 많아서, 용량의 상당한 범위가 예상된다. 약 0.1㎍/체중kg 내지 약 10mg/체중kg 범위의 면역접합체의 투여량이 고려될 것으로 예상되며, 예컨대 약 500㎍/체중kg 내지 약 1000㎍/체중kg 범위의 면역접합체의 투여량은 치료전 증상에 비해 50% 이상 증상을 감소시키거나 예방할 것이다. 특히, 본 발명의 백신 제조물 및 조성물은 치유 없이 체중 증가를 일시적으로 억제하거나 경감시킬 수 있고, 또는 일부 양태에서 비만증을 치유 또는 예방하는데 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
특히, 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물의 임의의 양태는 본 발명의 다른 임의의 방법 또는 조성물과 함께 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 명세서에 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 단수적 표현은 문맥상 다른 분명한 언급이 없는 한 복수의 대상도 포함한다. 즉, 예컨대 "폴리펩타이드"를 함유하는 조성물에 대한 언급은 2개 이상의 폴리펩타이드의 혼합물을 포함한다. 또한, "또는"이란 용어는 다른 분명한 언급이 없는 한, "및/또는"을 포함하는 의미로 일반적으로 이용되고 있다는 것을 유념해야 한다.
특히, 본 명세서에 언급된 임의의 수치 값은 하한값부터 상한값까지의 모든 값을 포함하며, 즉 열거된 최저값과 최고값 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합이 본 명세서에서 분명하게 언급된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 범위가 1% 내지 50%로 언급되어 있다면, 2% 내지 40%, 10% 내지 30% 또는 1% 내지 3% 등과 같은 값도 본 명세서에서 분명하게 열거된 것으로 간주한다.
다음 실시예는 본 발명의 더 상세한 이해를 돕기 위한 것이다. 사용된 특정 물질과 조건은 본 발명을 더 상세히 예시하기 위한 것이며, 첨부된 청구의 범위의 적당한 범위를 한정하려는 것이 아니다.
실시예
1.
그렐린
합텐
면역접합체 합성
Ghr1-Ghr3을 합성하여 캐리어 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 커플링시켜, 면역접합체 Ghr1-KLH, Ghr2-KLH 및 Ghr3-KLH를 생산했다. 펩타이드 합성 시에, 모든 합텐과 기질은 CS Bio 136 자동화 펩타이드 합성기에서 Fmoc/tBu SPPS를 위한 통상적인 DIC/HOBt 프로토콜을 이용하여 C-말단 아미드로서 1.0mmol 규모에서 제조했다. Ser-3 측쇄 에스테르화를 보유하는 펩타이드의 경우에는, 필요한 산 10mmol을 DCM 10ml 중의 5mol DIC로 20분 동안 예비활성화시키고, 그 후 DMF 10ml를 첨가했다. 수득되는 슬러리를 부분 보호된 펩타이드-수지에 첨가한 뒤, 0.5mmol DMAP를 첨가하고, 궤도형 진탕기에서 하룻밤 동안 혼합했다. 정량적 아실화를 확인하기 위해 시험용 TFA 절단을 사용했다. Lys(Mca) 접합을 위해, 펩타이드-수지를 1:1 DMF:DCM 중의 0.2당량의 Pd(PPh3)4 및 10당량의 N,N'-디메틸바르비투르산과 함께 12시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 차폐되지 않은 새로운 유리 아민을 5% DIEA/DMF 처 리로 중화시키고, 그 후 표준 DIC/HOBt 프로토콜에 따라 7-메톡시쿠마리닐-4-아세트산을 커플링시켰다. n-부탄산 접합을 위해, 5mmol의 n-부탄산을 10ml DMC 중의 5mmol DIC로 20분 동안 예비활성화시키고, 그 후 10ml DMF를 첨가했다. 수득되는 슬러리는 상기 보호된 펩타이드-수지에 첨가하고, 그 후 0.5mmol DMAP를 첨가한 다음 1시간 동안 반응시키고, 정량적 n-부타노일화를 위하여 전체 공정을 2회 반복했다. DMF 및 DCM(각각 2 x 20초 흐름 세척)으로 세척한 후, 완성된 펩타이드-수지를 진공하에 하룻밤 동안 건조시켰다. 전체적인 탈보호 및 절단은 95:2.5:2.5 TFA:물:트리이소프로필실란(TIPS)으로 2시간 동안 배치식(batch-wise) 처리한 후, 여과하고 회전 증발에 의해 TFA를 제거하여 달성했다. 그 다음, 펩타이드를 10용적의 Et2O(-20℃에서 예냉됨)로 분쇄하고 원심분리로 분리했다. 이와 유사하게 펠릿을 Et2O로 추가 2회 세척한 후, 펩타이드를 50% AcOH로 추출하고 RP-HPLC로 직접 정제했다.
그렐린 (1-10) Ser - 3(부타노일)합텐 , Ghr1 . ESI-MS: 이론값, MW = 1406.4; M1+ =1407.4, M2 +=704.2. 실측값, M1 +=1408.3, M3 +=704.0.
그렐린 (13-28) 합텐 , Ghr2 . ESI-MS: 이론값, MW = 2166.5; M2 + 1084.3, M3+=723.2. 실측값, M2 +=1084.5, M3 +=723.2.
래트 그렐린 (1-28) Ser -3( 부타노일 ) 합텐 , Ghr3 . ESI-MS: 이론값, MW = 3506.0; M2 + =1754.0, M3 +=1169.7. 실측값, M2 +=1754.1, M3 +=1169.7.
실시예
2. 피검체 및 백신접종 프로토콜
성숙한 수컷 위스타(Wistar) 래트(n=17, M+SEM: 시작시 413+8g, 4차 면역화 후 502+12g; Charles River, Hollister, CA)를, 12h:12h 일광(0600h 점등), 습도(60%) 및 온도 조절(22℃)된 사육장에서 먹이와 물을 연속 제공하면서 개별적으로 사육했다. 펠릿화된 고형 사료(LM-485 Diet 7012; Harlan Teklad, Madison, WI, USA)는 탄수화물 65%, 지방 13%, 단백질 21%, 대사성 에너지 3.41kcal/g으로 이루어진 옥수수계 압출 시리얼이다. 절차는 국립보건원(NIH)의 실험 동물의 관리와 사용에 관한 지침(NIH Publication number 85-23, 1996 개정) 및 "실험동물관리 원칙"(http://www.nap.edu/readingroom/booksalabrats)을 고수했고, 스크립스 연구소의 동물 관리 사용 협회의 승인을 받았다.
연령 및 체중이 매치하는 성숙한 래트를 문헌[Qi et al., △9-Tetrahydrocannabinol immunochemical studies: Haptens, monoclonal antibodies, and a convenient synthesis of radiolabeled △9-Tetrahydrocannabinol, Journal of Medical Chemistry(2005), 48: 7389-7399, 본 발명에 참고인용됨]에 기술된 바와 같이 본 실험실의 프로토콜을 이용하여 면역화했다. 면역화는 12주에 걸쳐 5회 면역화를 포함했다. 연령 및 체중이 매치하는 래트에게 실험 0일, 21일, 35일, 56일 및 84일에 암 주기(dark cycle) 90분 전에 면역화(복강내, 0.4ml)를 실시했다. 처음 3회 면역화에는 Ghr1-KLH, Ghr2-KLH, Ghr3-KLH 또는 KLH 250㎍을 100mM PBS, pH 7.4에 함유하는 Ribi MPL-TDM 에멀젼 애주번트(RIBI Immunochemical Research Inc.)를 사용했다. 마지막 2회 면역화에는 애주번트로서 명반(Pierce)을 사용했다. 면역화 1주 후에 꼬리 혈액을 수집하여 원심분리하고 혈장을 항체 역가 및 그렐린 결합 친화성에 대해 분석했다.
실시예
3.
백신접종된
래트에서의
혈장 백신 항체
역가
및
그렐린
결합 친화성
래트의 백신접종은 실시예 2에 기술된 바와 같이 실시했다. 혈장 항체 역가는 ELISA로 측정했다. 웰당 3ng의 Ghr3-BSA를 10mM PBS, pH7.2, 50㎕에 함유하는 ELISA 플레이트(96웰, COSTAR 3590)를, 하룻밤 동안 건조시킨 뒤, 통상의 에탄올 고정과 PBS 중의 블랏토(blotto)(탈지분유) 차단을 수행했다. 래트 혈장 샘플을 블랏토에 1:100 희석률로 시작해서 연속 희석했다. 37℃의 가습실에서 1시간 동안 혈장 결합이 일어나게 했다. 세척 후, 50㎕ PBS-블랏토 중의 알칼리성 포스파타제(Southern Biotech)와 접합된 염소 항-래트 IgG를 웰당 200ng씩 첨가하고, 37℃의 가습실에서 1시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 물로 충분히 세척하고, 공기 건조시킨 뒤, 100mM 4-모르폴린프로판설폰산(MOPS)(pH7.4) 중의 200μM p-니트로페닐포스페이트(Pierce)를 웰당 200㎕씩 첨가하여 발색시켰다. 실온에서 3시간 후, 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 405nm에서 측정했다. 결과는 이하 표 1에 제시했다.
혈장의 그렐린 특이성은 2가지 분석법, 즉 평형 투석 분석 및 경쟁 ELISA로 측정했다. 평형 투석은 리간드로서 일련의 [125I]-래트 그렐린 희석물(Ser-3-n-옥타노일, Bachem, 비표지된 그렐린으로 동일계에서 희석한 것)과 일정량의 혈장(pH7.4인 PBS 중의 1:1 희석물)을 사용하여 수행했다. 하나의 미세역가 플레이트 내의 웰(샘플 당 12개)에, PBS 중의 방사능표지된 그렐린 170㎕를 주입하고, 또 다른 플레이트에는 PBS(170㎕/웰) 중의 래트(그렐린-KLH 면역접합체로 면역화되거나 KLH만으로 면역화됨)의 혈장을 주입했다. 두 플레이트를 충전된 웰을 서로 대향시키고 투석막(컷오프 14,000Da)으로 분리시켜 단단히 연결했다. 플레이트를 수직으로 진탕기에 부착한 뒤, 실온에서 24시간 동안 진탕시킨 다음, 조심스럽게 분리했다. 막을 떼어내고, 각 웰로부터 100㎕를 튜브에 담아 γ-방사선 계수를 수행했다. 대향 웰 간의 DPM(분당 붕괴율)의 차이의 평균값을 각 그렐린 희석물마다 측정하여 겉보기 결합 상수(K d - app )를 얻었다. 결과는 이하 표 1에 제시했다.
경쟁 ELISA를 위해, 플레이트(96웰)를 새로 제조한 그렐린-BSA 접합체로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅했다. 플레이트를 4% 탈지분유로 차단시키고, 세척한 뒤, 적당한 희석률의 혈장 샘플을 첨가했다. 플레이트를 세척하고, Ser-3 n-옥타노일 그렐린을 100μM부터 시작해서 일련의 농도로 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 충분히 세척하고, 염소 항-마우스-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합체(Pierce)를 첨가했다. 실온에서 1시간 항온처리한 후, 플레이트를 다시 충분히 세척하고 HRP 기질(TMB 기질 키트; Pierce)을 첨가하고, 15분 동안 발색시키고 2M H2SO4를 첨가하여 반응 정지시켰다. 흡광도(450nm)를 판독하고, 그 값 을 GraFit(Erithacus Software Ltd.)을 이용하여 플롯팅했다. 흡광도 값이 최대 흡광도의 50%일 때의 유리 항원 농도를 그렐린에 대한 혈장의 평균 K d - app 로 간주했다. 결과는 이하 표 1에 제시했다.
데이터는 M±SEM으로 나타냈다. 역가와 혈장 친화성을 log 변형시켜 평균, 선택성 비를 계산하고 통계 분석에 사용했다. 이 값은 안티로그 변환을 반영한다.
표 1에 제시된 바와 같이, Ghr1-KLH 및 Ghr3-KLH 그렐린 면역접합체는 9주까지 또는 4차 면역화 후에 우수한 면역 반응(백신 항체 역가의 증가)을 나타냈다. Ghr1-KLH에 의해 유인된 항체는 Ghr2-BSA와 교차 반응하지 않았고, 이와 마찬가지로 Ghr2-KLH에 의해 유인된 항체는 Ghr1-BSA에 대해 낮은 친화성을 나타냈는 바(데이터 미제시), 적당한 특이성이 있는 반응이었다. 각 면역화 그룹은 백신접종된 면역접합체에 대하여 면역반응을 유발시켰지만, Ghr1-KLH 또는 Ghr3-KLH로 면역화된 그룹의 래트에서만 추정상의 활성 순환 형태인 n-옥타노일화된 그렐린에 대하여 우수한 혈장 결합 친화성이 발생되었다. Ghr1-KLH 또는 Ghr3-KLH로 백신접종된 래트 유래의 혈장은 순환에 주로 존재하는(적어도 1.8:1 비)(참조: Sato et al., Molecular forms of hypothalamic ghrelin and its regulation by fasting and 2-deoxy-d-glucose administration(2005), Endocrinology, 146:2510-6, 참고인용됨) 그렐린의 불활성 데스-옥타노일 형태에 의해 강하게 결합되지 않았고, 중화 항체에 대해 경쟁할 수도 있어, 데스-아실 그렐린보다 아실 그렐린에 대해 더 큰 특이성을 나타낸다.
실시예
4.
면역화후
체중 증가, 음식 섭취량 및 급식 효율
실시예 2에 기술된 바와 같이 래트를 면역화시켰다. 체중과 음식 섭취량은, 항체 역가가 최대가 되었을 때까지 4차 및 5차 면역화 후의 주 동안 암 주기 개시 2시간 전에 매일 측정했다(정확도 0.1g). 급식 효율은 단위 에너지 섭취 당 증가된 체중(mg/kcal)으로서 계산했다.
도 2는 여러 래트의 역가가 1:10,000 범위로 증가했을때, 면역화된 래트의 상응하는 체중 증가율, 1일 음식 섭취량 및 급식 효율을 피검체에 투여된 백신의 함수로서 도시한 것이다. Ghr1-KLH 및 Ghr3-KLH 면역접합체를 투여받은 래트는 4차 면역화 후 7일간의 관찰 기간 동안 Ghr2-KLH 또는 KLH로 면역화된 래트보다 1일 체중 증가가 적었다(도 2A). 이것은 래트가 정상적으로 식사하고(도 2B) 정상적으로 물을 마심(미제시)에도 불구하고 나타난 결과로서, Ghr1-KLH 및 Ghr3-KLH 백신접종된 피검체의 감소된 급식 효율을 시사한다(도 2C). 이 시기 전에, 역가가 중간이고 상승 중인 5 내지 8주 동안에는 1일 체중 증가(KLH: 1.22±0.32 대 Ghr3-KLH: 0.92±0.12 및 Ghr1-KLH: 1.01±0.15g/일) 및 급식 효율(KLH: 44.4±5.5 대 Ghr3-KLH: 28.5±3.0 및 Ghr1-KLH: 33.6±4.4 mg/kcal)의 백신-관련 차이는 동일한 방향이었지만, 상응하게 더 작어서, 항-그렐린 혈장 결합 친화성에 대한 제안된 의존성을 지지한다.
실시예
5. 전신 에너지 항상성, 비만증 및 뇌/혈장
그렐린
비에 대한 혈장 항-
그렐린
결합능의
관계
순환 항-그렐린 결합능이 체중 증가의 감쇠와 관련이 있는지를 측정하기 위해, 실시예 2에 기술된 바와 같이 백신접종된 피검체를 Ghr3-BSA에 대한 높은 또는 낮은 항체 역가를 발생시키는 피검체로 나누어(도 3, 패널 A) 4차 및 5차 면역화 후의 주 동안 비교했다. 도 3, 패널 B에 명시된 바와 같이, 높은 Ghr3-BSA 역가를 보유하는 각 피검체는 경쟁 ELISA 분석당 n-옥타노일 그렐린에 대한 우수한 혈장 친화성을 나타내어(K D - app <650nM), 낮은 Ghr3-BSA 역가를 보유하는 피검체보다 평균 1등급 이상 더 높았다. 혈장 그렐린 결합능이 높은 래트는 정상적인 음식 섭취에도 불구하고(도 3, 패널 D), 그렐린에 대한 혈장 친화성이 낮은 래트(도 3, 패널 C에 제시)보다 1일당 약 0.5g 적은 체중 증가를 나타내어, 이 역시 급식 효율의 감소를 나타냈고(도 3, 패널 E), 각 면역화 후마다 동일한 프로필의 결과가 관찰되었다. 그렐린 결합능이 낮지만 측정가능한 래트도 KLH 대조군에 비해 감소된 급식 효율을 나타냈다(도 3, 패널 E).
해동된(25℃) 사체에서 위장관을 떼어냈다. 이어서, 이 사체를 일정 질량까지 건조(70℃)시켜 수분 함량을 측정한 뒤, 속슬렛(Soxhlet) 장치에서 석유 에테르로 추출하여, 단백질과 회분으로 구성된 무지방 건조 질량을 지방 질량과 비교하여 측정했다(참조: Dobush et al., (1985), Canadian Journal of Zoolology, 63: 1917-1920, 참고인용됨). 도 3, 패널 F 및 이하 표 2에 제시된 바와 같이, 사체 분석은 항-그렐린 반응이 강한 래트가 항-그렐린 면역 반응이 약한 래트와 비교했을 때 지방 질량보다 무지방 건조 질량을 우선적으로 증가시켰고, 수분 함량에는 차이가 없었음을 보여주었다.
데이터는 M±SEM으로 나타냈다. *p<0.05, #p=0.06 (저 Ghr3-BSA 역가 그룹 대비), 웰치(Welch) 보정된 t-검정.
래트의 혈장 및 뇌 샘플에 존재하는 총 그렐린(옥타노일 및 데스-옥타노일 합계) 농도는 그렐린 효소 면역검정 키트(Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA)를 사용하여 측정했다. 조직 추출물은 시바타(Shibata) 등(48)에 기술된 방법에 따라 수득했고, >95% 그렐린 회수율이 기록되었다. 간략히 설명하면, 전뇌를 드라이아이스 냉각된 2-메틸부탄에서 순간 동결시키고, 사용 전까지 -80℃에서 보관했다. 뇌 조직은 10 내지 15개의 조각으로 주사위꼴로 잘라서, 물(10ml)에서 7분 동안 비등시키고, 냉각시킨 후 아세트산(580㎕, 100%)을 첨가하여 1M AcOH을 수득했다. 이 현탁액을 테크마 조직분쇄기(Tekmar Tissumizer)로 균질화하고, 10,000rpm으로 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 동결건조하고, EIA 완충액(Phoenix Pharmaceuticals)에 재용해한 후, 제조업자의 지시에 따라 분석했다. 지방질의 상대적 감소와 일관되게, 지방세포 호르몬 렙틴의 최종 혈장 수준은 그렐린에 대해 강한 혈장 친화성이 있는 래트에서 감소했다(도 3, 패널 G). 순환 인슐린 수준은 달성된 혈장 그렐린 결합 친화성의 함수로서 신뢰할만한 차이가 없었다(M±SEM: 고: 0.8±0.2 대 저: 1.3±0.2 ng/ml). 총 그렐린의 뇌/혈장 수준의 비는, 아마도 중심 구획으로 통과하는 순환 그렐린의 감소와 일관되게, 혈장 항-그렐린 결합능과 관련하여 래트에서 감소되었다(도 3, 패널 H).
실시예
6.
백신접종된
래트에서의
염증성
매개인자의
혈장 수준
백신접종 효과가 비특이적 전신 면역 반응으로부터 생길 수 있는 가능성을 조사하기 위해, 염증촉진성 매개인자, 예컨대 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 종양 괴사 인자-α, 단핵구 화학유인물질 단백질-1, 및 총 플라스미노겐 활성인자 억제제 1형을 실시예 2에 기술된 바와 같이 백신접종된 래트에서 측정했다.
래트를 실험 92일째에 암 주기가 된 지 1 내지 4시간에 단두에 의해 희생시키고, 동맥 혈액을 0.5M EDTA(약 1/10v/v)와 프로테아제 억제제 칵테일(약 1/100v/v)(Sigma, St.Louis, MO)을 함유하는 냉각된 폴리프로필렌 관에 모았다. 혈장을 원심분리(3000rpm, 4℃, 20분)로 수득하고, Luminex® 장치를 이용하여 xMAP™ 기술-기반 면역검정법인 다중 래트 아디포카인 패널(Linco, St.Charles, MO) 분석시까지 -80℃에서 보관했다. TNF-α, MCP-1 및 IL-1β의 감도 한계는 4.9pg/ml였고, 렙틴, IL-6, 인슐린 및 총 PAI-1의 감도 한계는 12.2pg/ml였다. 통상적인 분석내 변동 계수는 <4%이었다.
이하 표 3에 명시한 바와 같이, 혈장 수준은 치료 그룹마다 절대적 기준으로 낮았고, 아실화된 그렐린에 대한 혈장 특이성과 관련이 없었다.
데이터는 M±SEM으로서 또는 검출가능한 수준의 빈도로서 나타냈다.
실시예
7. 통계
그룹간의 차이를 확인하기 위해 분산 분석(ANOVA)을 사용했다. 피셔(Fisher)의 보호된 LSD 검정을 사후 비교에 사용했다. 다중 비교를 위해 보정된 웰치 t-검정을 사용하여, 비대칭 분산을 보유한 그룹을 비교했다. 분산의 불균일성을 감소시키고 더욱 정상적인 분포를 달성하기 위해, IL-6, TNF-α, 총 PAI-1, MCP-1, 혈장 항체 역가, 혈장의 겉보기 그렐린 결합 친화성 상수, 및 뇌/혈장 총 그렐린 비에 관한 데이터를, 역가 선택성 비의 계산을 비롯한 통계 분석을 위해 먼저 로그 변환시켰다. 표 또는 도면에 제시된 해당 값은 안티로그 변환값을 나타낸다. 카이제곱 분석은 피검체가 순환 사이토카인 수준을 검출할 수 있는 빈도가 다른 피검체인지 검사하는데 사용했다. 소프트웨어 패키지는 Systat 11.0(SPSS, Chicago, III., USA)이었다.
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<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa at position 11 is either Lys (K) or Arg (R).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa at position 12 is either Ala (A) or Val (V).
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Glu Ser
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<213> Artificial
<220>
<223> Homo sapiens or Rattus Norvegicus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa at position 11 is either Lys (K) or Arg (R).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa at position 12 is either Ala (A) or Val (V).
<400> 16
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys
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<213> Artificial
<220>
<223> Homo sapiens or Rattus Norvegicus
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<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa at position 12 is either Ala (A) or Val (V).
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1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys
20
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<213> Artificial
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<223> Homo sapiens or Rattus Norvegicus
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<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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20
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<213> Artificial
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<223> Homo sapiens or Rattus Norvegicus
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<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
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<222> (11)..(11)
<223> Xaa at position 11 is either Lys (K) or Arg (R).
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<221> MISC_FEATURE
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
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<222> (11)..(11)
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<222> (12)..(12)
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<220>
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Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Xaa Xaa Gln Gln Arg Lys
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Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
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<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<400> 26
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Arg Lys Glu
1 5 10 15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
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<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<400> 27
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
20 25
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> Canis Lupus Familiaris
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<400> 28
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
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Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
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<212> PRT
<213> Macaca Mulatta
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<400> 29
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Ala Gln Gln Arg Lys
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Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210> 30
<211> 28
<212> PRT
<213> gallus gallus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<400> 30
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1 5 10 15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His Arg Arg
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<212> PRT
<213> Equus caballus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is a modified serine of formula (I).
<400> 31
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg
20 25
Claims (11)
- Gly-Ser-A-Phe-Leu-B-C를 포함하는 그렐린(ghrelin) 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체로서,여기서, A는
를 포함하고 (여기서,Y1 및 Y2는 독립적으로 O, CH2 및 NH 중에서 선택되고;각각의 n은 독립적으로 0 또는 1 중에서 선택되며;Z는 C, PO 또는 SO이고;R은 탄소원자가 약 3개 내지 약 10개인 포화되거나 불포화된, 분지형 또는 비분지형의 치환되거나 비치환된 탄화수소 그룹이거나, 또는 탄소원자가 약 3개 내지 약 13개인 사이클로알킬 또는 아릴 그룹이다),B는 서열번호 2의 0개 내지 23개의 연속 아미노산 잔기의 부분서열(subsequence)을 포함하며,C는 캐리어부(carrier moiety)를 포함하고,상기 그렐린 폴리펩타이드가 링커부(linker moiety)에 의해 상기 캐리어부에 연결되는, 면역접합체. - 제1항에 있어서, A가
를 포함하는, 면역접합체. - 제1항 또는 제2항에 있어서, B가 서열번호 2의 아미노산 잔기 1번 내지 5번을 포함하는 면역접합체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커부가 시스테인 잔기인 면역접합체.
- 제4항에 있어서, 시스테인 잔기가 그렐린 폴리펩타이드의 말단에 위치하는 면역접합체.
- 제5항에 있어서, 말단이 카르복시 말단인 면역접합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어가 KLH 또는 BSA인 면역접합체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체의 면역학적 유효량과 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물.
- 제8항에 따른 조성물을 피검체에게 투여함을 포함하는, 피검체에서 항-그렐린 면역 반응을 유도하는 방법.
- 제8항에 따른 조성물을 피검체에게 투여함을 포함하는, 피검체에서 비만증을 억제하는 방법.
- 제1항에 있어서, Y1이 O이고, Z가 C이고, n이 0이고, R이 -CH2CH2CH3인 면역접합체.
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