CN102666579A

CN102666579A - 降钙素基因相关肽的衍生物

Info

Publication number: CN102666579A
Application number: CN2010800487224A
Authority: CN
Inventors: A.S.尼尔森; T.克鲁塞; J.T.科德拉; J.F.刘; J.科费德; K.劳恩; C.尼尔逊
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2012-09-12
Also published as: WO2011051312A1; EP2493919A1; US8835379B2; US20120245083A1

Abstract

带有连接基的酰化CGRP化合物作为药物具有长期作用并且是有价值的。

Description

降钙素基因相关肽的衍生物

本发明领域

本发明涉及新的CGRP衍生物和与其相关的方面。

本发明背景

代谢综合症通过肥胖症、抗胰岛素性、血脂异常和高血压症来表现。当今，利用选择性治疗模式(paradigmes)来治疗这四种表现形式。

降钙素基因相关的肽(在下文称为CGRP)是在一些物种中以两种形式(称为CGRP-α和CGRP-β(或分别为 CGRP-I和 CGRP-II))存在的肽。CGRP肽在物种内是高度保守的肽。例如，在Peptides 20(1999), 275-84的表1中提到的人和大鼠CGRP肽的氨基酸序列。CGRP是由例如感觉、运动原和肠道神经释放的。

从文献中可明显得知，CGRP引发各种药理作用，例如∶1)血管舒张，2)肌肉和肝AMP激酶(AMPK)活化和脂解和/或脂肪氧化，3)降低食物摄入，4)抑制胃排空和改变肠管功能，和5)提高糖酵解和抑制糖原合成。对所提及的作用的纯生理意义还不完全了解，并且没有出现长期接触CGRP的结果(例如，空腹胰岛素、HbA1C和持续血管舒张)。然而，在新陈代谢病中，AMPK活化、脂肪氧化和降低食物摄入是有利的，已经建议糖酵解和抑制糖原合成调解抗胰岛素性。

天然的CGRP具有小于30分钟的半衰期，并且CGRP输注之后的药理作用持续期短是明显的。由于给予CGRP的血管舒张作用，天然CGRP的体内药理学研究受到血管舒张和补偿性血管收缩继发性的效果的影响。由此，血管舒张作用是CGRP的剂量限制性作用，其妨碍了对与代谢性综合症有关的作用的完全理解。由此，CGRP的药理学应用需要产生具有长期作用的CGRP类似物，并且甚至只可以用长效类似物来获得一些效果。

US 2003/0204063中的权利要求1涉及肽，其被具有许多合适取代基的选自六个上位组的1-5个结构刚性部分取代。在其中的权利要求2中，举例说明了55个肽，例如，CGRP。但工作实施例没有涉及修饰的CGRP。按照其中的权利要求25，修饰的CGRP具有至少一个结构刚性部分。

本发明的目的

本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代性技术。

本发明的另一个方面涉及提供具有与CGRP相似的药理学性能的化合物，与CGRP所引起的作用相比较，其可以产生长效作用。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP所产生的药物动力学性能相比较，其可以导致提高的药物动力学性能。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP所产生的药效性能相比较，其可以导致提高的药效性能。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP所产生的血浆GLP-1值相比较，其可以导致更高的血浆GLP-1值。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以诱导体内GLP-1释放。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以引起GLP-1从培养的L-细胞中释放。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP导致的食物摄入相比较，其可以导致食物摄入降低。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP所引起的能量消耗(expenditure)相比较，其可以导致能量消耗增加。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP所引起的失重相比较，其可以导致失重增加。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，与CGRP导致的血压降低相比较，其可以导致血压降低。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其药理学性能在很大程度上与CGRP所具有的药理学性能相当或完全相同。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以导致血浆、肌肉和肝中的甘油三酯降低。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以导致HbA1c水平降低。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以导致空腹胰岛素水平降低。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以导致血压持续降低。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其在糖尿病前和糖尿病动物模型中可以导致胰岛素敏感性提高。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以导致哺乳动物细胞中的糖酵解提高。

本发明的另一个方面涉及提供化合物，其可以导致哺乳动物细胞中的AMPK活化提高。

定义

本文中，术语CGRP化合物包括通式I的化合物∶

X₁CX₂TX₃TCX₄TX₅RLAX₆X₇LX₈RSGGX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃FVPTX₁₄VX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈F(I)

其中X₁是Ala或Ser，X₂是Asp或Asn，X₃是Ala或Ser，X₄是Val或Ala，X₅是His或Gln，X₆是Gly或Asp，X₇是Leu或Phe，X₈是Ser、Asn或Arg，X₉是Val、Ile、Met或Leu，X₁₀是Val、Ala、Leu或Gly，X₁₁是Lys、Ser、Asn或His，X₁₂是Ser、Asn、Asp、Pro，X₁₃是Asp或Asn，X₁₄是Asp或Asn，X₁₅是Gly或Ser，X₁₆是Ala或Ser，X₁₇是Glu、Gln、Lys或Asn，X₁₈是Ala或Ser，并且C端氨基酸残基中的羧基任选被酰胺化，以及,在式I中，利用编码氨基酸的常用的一个字母来表示具体氨基酸残基。式I包括，例如，得自于下列物种的CGRP∶猪，羊，笑蛙，人，小鼠，马，狗，大鼠，两色叶蛙，日本稻鱼，日本蛤蚧，日本河豚鱼和鲑鱼；如果合适的话，所有的都是α和β型。对于一些物种，CGRP存在α和β型两种形式，本文认为两种形式都是CGRP化合物。式I化合物的一个子组是通式II的化合物∶

X₁CX₂TATCVTHRLAX₆LLX’₈RSGGX’₉X’₁₀KX’₁₂NFVPTX₁₄VGSX’₁₇AF(II)

其中X₁是Ala或Ser，X₂是Asp或Asn，X₆是Asp或Gly，X'₈是Arg或Ser，X'₉是Val或Met，X'₁₀是Val或Leu，X'₁₂是Asp、Asn或Ser，X₁₄是Asp或Asn，X'₁₇是Glu或Lys，并且C端氨基酸残基中的羧基任选被酰胺化。式II包括，例如，得自于下列物种的CGRP∶猪，小鼠，人，狗和大鼠；如果合适的话，所有的都是α和β型。具体地说，术语“CGRP化合物”包括人CGRP-α，人CGRP-β，大鼠CGRP-α和大鼠CGRP-β和人CGRP-α的类似物，人CGRP-β的类似物，大鼠CGRP-α的类似物和大鼠CGRP-β的类似物。

术语“CGRP化合物”还包括通式I或II化合物的类似物。

本文中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中一个、两个或三个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换，氨基酸残基缺失，或插入进一步的氨基酸残基。

在一个实施方案中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中一个、两个或三个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

在一个实施方案中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中一个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

在一个实施方案中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中两个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

在一个实施方案中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中三个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

在一个实施方案中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中氨基酸残基缺失。

在一个实施方案中，“通式I或II化合物的类似物”是通式I或II的化合物，其中插入进一步的氨基酸残基。

通式I或II化合物的类似物的氨基酸编号与通式I或II化合物的氨基酸编号一致。优选，插入的氨基酸残基是可以被核酸(遗传三联体)编码的氨基酸。

此外，术语“CGRP化合物”还包括具有保守性替换的上述CGRP化合物。

本文中，当描述蛋白时，“保守性替换”是指蛋白的氨基酸组成的变化，其中残基被不会显著地改变该蛋白活性的结构上类似的置换物替代。由此，具体氨基酸序列的“保守置换的变体”是指不决定蛋白活性的氨基酸的氨基酸替代，或用具有类似性能(例如，酸性，碱性，带正电荷或带负电荷，极性或非极性，等等)的另一个氨基酸替代氨基酸，这样就可以使甚至关键氨基酸的替代不会显著地改变活性。提供功能上类似的氨基酸的保守性替换表在本领域是众所周知的。下列六个组各自包含彼此保守性替换的氨基酸∶1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸，2)门冬氨酸和谷氨酸，3)天冬酰胺和谷氨酰胺，4)精氨酸和赖氨酸，5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸，和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。本领域技术人员可以理解，上面鉴定的置换不是唯一可能的保守性替换。例如，人们可以认为所有带电的氨基酸作为彼此的保守性替换，无论它们是带正电或带负电。另外，在编码的序列中，改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的单独置换、缺失或添加也可以是“保守置换的变体”。

所述CGRP化合物在两个Cys残基(通常在2和7位)之间具有常规分子内部的二硫桥。

本文中，术语“h-CGRP-α”、“h-CGRP-β”、“r-CGRP-α”和“r-CGRP-β”分别是人CGRP-α、人CGRP-β、大鼠CGRP-α和大鼠CGRP-β的缩写。

本文中，术语“h-CGRP-I”、“h-CGRP-II”、“r-CGRP-I”和“r-CGRP-II”分别是人CGRP-α、人CGRP-β、大鼠CGRP-α和大鼠CGRP-β的同义语。

本文中，术语例如“h-CGRP-α(2-37)”包括由h-CGRP-α中的2至37位的氨基酸残基组成的肽，并且类似地用于其它位置的表示法。

本文中，术语“氨基酸残基”包括形式上已经从羧基上除去羟基和/或形式上已经从氨基上除去氢原子的氨基酸。

本文中，术语例如“Ser1”是指氨基酸残基Ser在CGRP化合物的1位(从N端开始数起)。同样，术语例如“Cys2”是指氨基酸Cys在CGRP化合物的2位(从N端开始数起)，并且类似地用于其它位置。

可以通过核酸编码的氨基酸的例子是(在括号中具有常用的三个字母代码和一个字母代码)∶丙氨酸(Ala & A)，精氨酸(Arg & R)，天冬酰胺(Asn & N)，门冬氨酸(Asp & D)，半胱氨酸(Cys & C)，谷氨酸(Glu & E)，谷氨酰胺(Gln & Q)，甘氨酸(Gly & G)，组氨酸(His & H)，异亮氨酸(Ile & I)，亮氨酸(Leu & L)，赖氨酸(Lys & K)，甲硫氨酸(Met & M)，苯丙氨酸(Phe & F)，脯氨酸(Pro & P)，丝氨酸(Ser & S)，苏氨酸(Thr & T)，色氨酸(Trp & W)，酪氨酸(Tyr & Y)和缬氨酸(Val & V)。如果由于分类错误而与通常使用的编码不符合，使用通常使用的编码为准。

本文中，按照本发明的酰化衍生物具有“长效作用”的表述是指：其 T½比相应的非衍生化CGRP的 T½长至少为50%，优选至少100%，且更优选至少500%。 T½是利用下面章节(标题“CGRP和其类似物的药物动力学和GLP-1-释放性能”)中所描述的方法测定的半衰期。

“白蛋白结合亲合性”可以利用本领域已知的一些方法测定。在一个方法中，所测定的化合物是用例如¹²⁵I或³H放射性标记的，并且用固定白蛋白培养(Biochem.J., 312(1995), 725-31)。相对于标准来计算该化合物的结合。在另一个方法中，相关化合物是放射性标记的，并且它与固定在例如SPA微粒上的白蛋白的结合与所测定的衍生物的稀释系列竞争。竞争的EC₅₀值是衍生物亲合性的量度。在第三个方法中，在不同的白蛋白浓度下测定化合物的受体亲合性或效能，并且与白蛋白浓度有关的化合物的相对亲合性或效能的变化反映了它对白蛋白的亲合性。

本文中，术语“药物动力学性能”包括Cmax和 T½。

本文中，术语“药效性能”包括：血压降低，血浆GLP-1水平提高，食物摄入降低，失重，脂质氧化增加，糖酵解提高，血浆和组织TG水平降低，能量消耗提高，空腹胰岛素水平降低，HbA1c水平降低和胰岛素敏感性提高。

本文中，“GLP-1”是由37个氨基酸残基组成的所谓的胰高血糖素样肽1。

本文中，“全部GLP-1”是GLP-1和它的主要DDP-IV代谢物GLP-1(7-37)。

本文中，“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师所寻求研究的组织、系统、动物或人的生物或医学响应所计算得到的药剂的预定数量，例如，足以刺激、预防、阻止、延迟或逆转疾病或任何其它不合需要症状的进程、获得目标治疗效果的数量。

本文中，“可药用载体”或“可药用赋形剂”是指给药时不会引起不利的身体反应的载体，并且是治疗剂可充分地溶解于其中以便递送治疗有效量的载体。赋形剂的例子包括缓冲的水，生理盐水，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，葡萄糖溶液，Hank's溶液和惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠。

本文中，“哺乳动物”具有其常规含义，并且包括灵长类(例如，人和非人灵长类)，实验动物(例如，啮齿类，例如小鼠和大鼠)，农畜(例如牛，猪，羊和马)和家畜(例如狗和猫)。

本文中，术语哺乳动物的病症和/或疾病的“治疗”是指：(i)预防病症或疾病，也就是说，防止疾病的任何临床症状；(ii)抑制病症或疾病，也就是说，阻止临床症状的形成或进程；和/或(iii)减轻病症或疾病，也就是说，引起临床症状的衰退。

本文中，“EC₅₀值”具有其在本领域中的正常含义，并且是指可导致具体生物效应的最大提高的50%的化合物浓度，例如，生物效应是其最大值的一半时的浓度。

本发明概述

本发明涉及酰化的CGRP化合物。

附图的简要说明

在图和与其相关的文字中，“类似物α1”和“类似物β1”是分别在下面实施例1和2中具体陈述的本发明的化合物。此外，在图中，“α-CGRP”和“β-CGRP”分别是人CGRP-α和人CGRP-β。

图1. α-CGRP、类似物α1和类似物β1的药物动力学特性和对血浆GLP-1的同时效应。皮下(在下文称为s.c.)给予SD大鼠CGRP或本发明的化合物。通过ELISA方案分析血浆样品的CGRP和总的GLP-1。以平均值±SEM(n=6)的形式得到数据。空心符号代表接触数据(左侧Y轴)，实心符号代表血浆GLP-1水平(右侧Y轴)。

图2. 剂量反应曲线(cAMP在CGRP-受体表达细胞中的积聚)。CGRP和本发明化合物诱导的循环AMP在CGRP-受体表达细胞中是积聚。通过利用GraphPad Prism软件，将剂量反应曲线拟合，并计算pEC₅₀值。以平均值±SEM(n=2)的形式得到数据。

图3. CGRP诱导的GLP-1在肠管L-细胞系中的释放。在不含血清的培养基(含有0.1%牛血清白蛋白(在下文称为BSA)和0.005% tween20)中，用CGRP刺激L-细胞(50,000个细胞/孔)3小时，通过利用ELISA分析培养基得到GLP-1含量。以平均值±SEM(n=2)的形式得到数据。

图4. 本发明的化合物(类似物β1)诱导的累积食物摄入的减少。以平均值±SEM(n=5-8)的形式得到数据。对于s.c.给予本发明化合物或赋形剂的SD大鼠，在FeedWin装置中检测48小时的食物摄入。

图5. 本发明的化合物(类似物α1)诱导的累积食物摄入的减少。以平均值±SEM(n=5-8)的形式得到数据。对于腹膜内(本文称为i.p.)给予本发明化合物或赋形剂的SD大鼠，在FeedWin装置中检测48小时的食物摄入。

图6. 在SD大鼠中，s.c.注射类似物β1之后，类似物β1对平均动脉血压(MAB)的影响。以平均值±SEM(n=2-4)的形式得到数据。通过遥测技术连续地测定MAB。

图7. 在饮食诱导的肥胖(DIO)大鼠中，用类似物α1(100 nmol/kg，s.c.)或赋形剂急性治疗之后，经过24小时的氧消耗(VO₂)，用AUC(曲线下的面积)表示(n=4-8)。数据是平均值±SEM。(***p<0.001，t检验)。

图8. 在DIO大鼠中，用类似物α1(100 nmol/kg)或赋形剂急性治疗之后，经过24小时的平均呼吸交换率(RER)(n=4-8)。数据是平均值±SEM。(**p<0.01，t检验)。

图9. 在DIO大鼠中，用类似物α1(100 nmol/kg)或赋形剂s.c.治疗14天之后，从基线开始的体重变化(%)。数据是平均值±SEM。

图10. 在ob/ob小鼠中，用类似物α1(100 nmol/kg)或赋形剂治疗(s.c)14天之后的HbA1c的变化。数据是平均值±SEM(p=0.09，t检验)。

图11. 在ob/ob小鼠中，用类似物α1(100 nmol/kg)或赋形剂治疗(s.c)14天之后的空腹血浆胰岛素的变化。数据是平均值±SEM(*p<0.05，t检验)。

序列表

SEQ ID NO.1是存在于下面提到的实施例1和3所制备化合物中的人CGRP-α(8-36)序列，SEQ ID NO.2是存在于下面提到的实施例2所制备化合物中的人CGRP-β(8-36)序列。

SEQ ID NO.3是下面提到的通式I，SEQ ID NO.4是通式II。

本发明的详细说明

在一方面，本发明涉及通式X-Y-Z的化合物，其中X表示CGRP化合物，形式上已经从存在于它的氨基酸残基中的一个氨基上除去氢；Y是本文所定义的连接基；Z是酰基；其中-Y-Z部分与存在于CGRP化合物中的氨基酸残基中所存在的氨基连接。

在本发明的化合物中，酰基(以Z表示)和/或与连接基(以Y表示)连接的酰基具有足够的白蛋白结合亲合性。

连接基Y选自下式的六个基团∶

, ,

,

,

和

,

其中m是0，1，2，3，4，5或6；n是1，2或3；s是0，1，2或3；p是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或23，其中这些部分的羰基端与CGRP化合物(以X表示)连接，这些部分的氨基端与酰基(以Z表示)连接。

本发明的化合物可以用本身已知的方式制备。

一个策略可以是首先制备CGRP化合物。多肽(例如，GLP-1、胰岛素和生长激素)的制备方法在本领域是众所周知的。CGRP化合物可以例如通过传统的肽合成方法制备，例如，使用t-Boc或Fmoc化学或其它沿用已久的技术的固相肽合成方法，参见，例如，Greene and Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，1999。

由于本发明的化合物独特地具有长效作用，本发明化合物的适口（palate）的药理学作用是有益于治疗代谢性综合症、糖尿病、肥胖症和心血管疾病。

在一个实施方案中，本发明的化合物对CGRP受体具有足够的效能。利用下面章节中所描述方法(标题：“CGRP在CGRP受体表达细胞中诱导的cAMP积聚”)，可以测定该效能。优选，该效能应该至少为人CGRP-α效能的1%，更优选人CGRP-α效能的至少10%，甚至更加优选人CGRP-α效能的至少50%。

在一个实施方案中，本发明的化合物能够使GLP-1进行足够的体内释放。可以利用下面章节中所描述的方法(标题∶“CGRP和其类似物的药物动力学和GLP-1释放性能”)，测定体内GLP-1的释放。优选，与赋形剂相应地做比较，血浆总的GLP-1的浓度应该至少提高5%，更优选，与赋形剂相应地做比较，提高至少20%，甚至更加优选，与赋形剂相应地做比较，提高至少75%。

在一个实施方案中，本发明的化合物对食物摄入具有足够的效果。在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物引起体重减轻。可以利用下面章节中所描述的方法(标题∶“通过自动食物摄入测量来测定CGRP诱导的食物摄入的减少(FeedWin)”)，测定对食物摄入的效果。优选，对食物摄入的效果应该使食物摄入至少减少2%，更优选至少减少10%，更加优选减少至少25%。

在一个实施方案中，本发明的化合物对血压具有足够的效果。可以利用下面章节中所描述的方法(标题∶“血压的持续检测”)，测定对血压的效果。优选，对血压的效果应该至少为1%，更优选至少5%，甚至更加优选至少10%。

在一个实施方案中，经过3周治疗之后，本发明的化合物对HbA1C具有足够的效果。在本发明的另一个实施方案中，长时间接触之后，本发明的化合物引起HbA1c水平降低。可以利用下面章节中所描述的方法(标题∶“对ob/ob小鼠亚慢性给药之后的血浆胰岛素和HbA1c”)，测定对HbA1C水平的效果。优选，对HbA1c的效果应该至少为0.2%，更优选至少1%，甚至更加优选至少2%。

在一个实施方案中，经过3周治疗之后，本发明的化合物对空腹胰岛素具有足够的效果。在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物引起空腹胰岛素水平降低。可以利用下面章节中所描述的方法(标题∶“对ob/ob小鼠亚慢性给药之后的血浆胰岛素和HbA1c”)，测定对空腹胰岛素水平的效果。优选，对空腹胰岛素的效果应该至少为50 pM，更优选至少100 pM，甚至更加优选至少150 pM。

在一个实施方案中，本发明的化合物引起持续血管舒张。持续血管舒张是指血压降低持续至少12小时。

在一个实施方案中，本发明的化合物引起能量消耗提高。优选，能量消耗提高至少4%。

本发明的化合物具有独特的药理学效果。包含本发明化合物的药物制剂可以例如用于：1)血管舒张，2)肌肉和肝AMP激酶活化和脂解和/或脂肪氧化，3)食物摄入降低，4)抑制胃排空，5)提高能量消耗，6)降低T2D相关的空腹胰岛素升高，7)降低HbA1c水平，和8)降低体重。由此，使用本发明化合物的药理学治疗可以适合于治疗或预防代谢性综合症、糖尿病、肥胖症和心血管疾病，例如，高血压症。由于给予本发明化合物的血管舒张效果，使用本发明化合物的体内药理学研究通常受到血管舒张和补偿性血管收缩作用继发性效果的影响。由此，当使用本发明的化合物时，血管舒张作用可能是一种剂量限制性作用。

药物制剂

在一方面，按照本发明，给予受益于这种治疗的患者(例如，病人或动物)治疗有效量的本发明的化合物。该治疗可以例如是抗胰岛素性、II型糖尿病、高血压症、肥胖症、血脂异常、动脉粥样硬化和血栓。给予本发明化合物的剂量范围是大到足以产生预期效果的剂量范围。

在相关的方面中，本发明提供了用于给予患者的单位剂型的本发明化合物。本文使用的“单位剂型”是指单独给予的组合物，用于治疗患有疾病或医学病症的患者。每个单位剂型典型地包含每个本发明的化合物加上可药用赋形剂。单位剂型的例子是单一片剂，单一胶囊剂，散装粉剂，液态溶液剂，栓剂，乳剂或混悬剂。疾病或病症的治疗需要周期性给予单位剂型，例如∶一天给予两次或更多次的一个单位剂型，每餐给予一个单位剂型，每四个小时或其它间隔时间给予一个单位剂型，或每天只给予一个单位剂型。可以提供单位剂型的注射制剂，例如，在小瓶或多剂量容器中。

本发明的单位剂型包含治疗有效剂量的本发明的化合物。在一个实施方案中，给予单位剂型可以在哺乳动物中产生本发明化合物的合适水平。在一个实施方案中，该剂量只导致血液或血浆乳酸和葡萄糖水平或血管舒张最小限度的提高(如果有的话)。

虽然具体剂量取决于具体本发明化合物的分子结构和化学性质，但药理学领域的技术人员从本文公开内容中可以了解，可以使用常规技术来确定合适的剂量。例如，可以用各种途径来确定没有或只最低限度地在哺乳动物中引起不希望有的副作用(例如，哺乳动物的血糖、血乳酸盐或血管舒张的水平提高)的本发明化合物的剂量或制剂。本文使用的“水平提高”可以指的是预定水平的提高(例如，所指明的副作用的阈值水平)。做出这种测定的一个方法涉及通过下列方式进行的剂量-反应试验：(a)给予试验哺乳动物多个不同剂量(或制剂)的本发明的化合物；和(b)测定每个剂量或制剂的效果，测定每个剂量对副作用的效果，由此形成预期脂解效果和副作用的剂量-反应数据；和(ii)由剂量-反应数据测定能够得到目标效果但不会引起副作用的本发明化合物的制剂的剂量。

通常，本发明化合物的剂量为10^-15 M至10^-5 M的浓度(例如，在肌肉、血液、血清或血浆中的一个或多个中测定)。如上所述，在本发明化合物的情况下，导致本发明化合物的血浆或血清浓度在本发明化合物的EC50值范围内(10^-13 M至10^-10 M)的剂量是尤其有用的。

给予动物获得本发明化合物的目标水平或浓度的本发明化合物的数量取决于医师熟知的许多因素，例如，化合物半衰期(例如，血清半衰期)和给药频率和模式。为了举例说明并且没有限制性，可以每天给予20皮克(picogram)至1克范围的本发明化合物的剂量，更通常在每天3纳克和50微克之间。在各种实施方案中，单位剂量(在某些情况下为日剂量)小于大约10微克，小于大约1微克，小于大约100纳克，小于大约10纳克，小于大约1纳克，小于大约100皮克或小于大约10皮克。

基于初始剂量反应曲线及可以通过常用方法获得的其它数据，本发明化合物的其它范围对医师是显而易见的。

本发明还提供了组合物，其包含本发明的化合物与可药用赋形剂的组合。在一个实施方案中，将本发明的化合物和赋形剂进行配制。

本发明的化合物可以与其它活性剂(例如，能够降低脂质、游离脂肪酸和/或长链CoA水平的、单独或与本发明的化合物联用的药剂)一起配制或与其它活性剂共同给予。在一个实施方案中，还预期本发明的化合物不与胰岛素一起给予。

可以将本发明的化合物直接给予所治疗的宿主。任选在无菌条件下给药。然而，尽管可以单独给予本发明的化合物，但通常优选将其以药物制剂形式提供。制剂典型地包含至少一种活性组分以及一或多种其可接受的载体。从与其它组分相容、并且对患者无害的意义上来说，每个载体应该是药学和生理学可接受的。治疗制剂可以用药学领域任何众所周知的方法来制备。

本发明的化合物可以通过口服、肠胃外(例如，肌内，腹膜内，静脉内，ICV，脑池内注射或输注，皮下注射或植入物)、吸入式喷雾剂、鼻、阴道、直肠、舌下或局部给药途径给予，并且可以在含有适合于每个给药途径的常规无毒的可药用载体、佐剂和赋形剂的合适剂量单位制剂中单独配制或一起配制。通常，通过胃肠外(例如，静脉内或s.c.(皮下))给药。

如果需要的话(例如，为了保持特定血浆浓度)，可以以控制递送制剂形式给予患者本发明的化合物。各种合适的可控递送系统是已知的，包括适合于口服、肠胃外及其它给药途径的形式。在制备药物递送系统过程中使用的赋形剂描述在本领域技术人员已知的各种出版物中。美国药典提供了许多改进释放的口服剂型的例子。该出版物还提供了测定延时释放和延迟释放片剂和胶囊剂的药物释放能力的常规章节和具体试验。在本发明的一方面，本发明的化合物与锻炼方案结合给予，从而提高患者甘油三酯的锻炼调解的分解。

药物组合物可以是无菌注射水溶液或油脂性混悬剂形式。这种混悬剂可以使用那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂、按照已知的技术来配制。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液或悬浮液(在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中)。在可以使用的可接受的赋形剂和溶剂之中，可以使用水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。然而，应该理解，对于任何具体患者而言，具体剂量水平和给药频率可以不同，并且取决于各种因素，包括所使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间长度、年龄、体重、常规健康情况、性别、饮食、给药模式和给药时间、排泄速率、药物组合和具体症状的严重程度。在一些实施方案中，涉及每天或每周给予本发明的化合物。

附图的结论

基于图1，可以断定，与人CGRP-α相比较，已经合成了药物动力学性能(T1/2和Cmax)已被提高的类似物，并且在给予这些化合物之后，引起GLP-1血浆水平提高。

基于图2，可以断定，已经合成了与人CGRP-α等效和比人CGRP-α的效能更低的CGRP类似物。

基于图3，可以断定，CGRP和CGRP类似物刺激GLP-1从鼠的肠L-细胞系中释放。

基于图4，可以断定，在SD大鼠中，β-CGRP的类似物导致累积食物摄入的剂量依赖性降低。

基于图5，可以断定，在SD大鼠中，α-CGRP的类似物导致累积食物摄入的剂量依赖性降低。

基于图6，可以断定，在SD大鼠中，β-CGRP的类似物导致血压的剂量依赖性和持续地降低。

基于图7，可以断定，在DIO大鼠中，α-CGRP的类似物导致能量消耗提高。

基于图8，可以断定，在DIO大鼠中，α-CGRP的类似物导致脂肪氧化提高。

基于图9，可以断定，在DIO大鼠中，α-CGRP的类似物导致体重减轻。

基于图10，可以断定，在ob/ob小鼠中，α-CGRP的类似物导致HbA1c水平降低。

基于图11，可以断定，在ob/ob小鼠中，α-CGRP的类似物导致空腹胰岛素水平降低。

本发明的优选特征

为了总结和补充上面的陈述，本发明的特征如下∶

1. 通式X-Y-Z的化合物，其中X表示CGRP化合物，形式上已经从存在于它的氨基酸残基中的一个氨基上除去氢；Y是下面权利要求1所定义的连接基；Z是酰基；其中-Y-Z部分与存在于CGRP化合物中的氨基酸残基中所存在的氨基连接。

2. 按照条款1的化合物，其中存在于CGRP化合物中的所有氨基酸残基可以被遗传三联体[即，一种必需的氨基酸]编码。

3. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是CGRP-α。

4. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是CGRP-β。

5. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是CGRP-α的类似物。

6. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是CGRP-β的类似物。

7. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是式I的化合物，更优选式II的化合物，其中刚好一个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

8. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是式I的化合物，更优选式II的化合物，其中刚好两个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

9. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是式I的化合物，更优选式II的化合物，其中刚好三个氨基酸残基与另一个氨基酸残基互换。

10. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是式I的化合物，更优选式II的化合物，其中刚好一个氨基酸残基缺失。

11. 按照前述条款的任一项的化合物，其中CGRP化合物是式I的化合物，其中插入进一步的氨基酸残基。

12. 按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物中的C端氨基酸残基是Phe。

13. 按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物中的C端氨基酸残基是酰胺化的苯丙氨酸，即，C₆H₅-CH₂-CH(-CONH₂)-NH-(其中C₆H₅-是苯基)。

14. 按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物在1位具有Ala或Ser。

15. 按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物在3位具有Asn或Asp。

16. 按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物在22位具有Met或Val。按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物在25位具有Asn、Asp或Ser。

18. 按照前述条款的任一项的化合物，其中该CGRP化合物在35位具有Glu或Lys。

19. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中在该CGRP化合物的2、4-21、23、24、26-34、36和37位的氨基酸残基没有突变[即，在该条款中提到的具体位置的氨基酸残基是如同在Peptides loc cit.的表1中提到的氨基酸残基]。

20. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中在该CGRP化合物的2、4-21、23、24、26-34、36和37位的氨基酸残基没有突变(这些氨基酸残基中的一个除外)[即，在该条款中提到的具体位置的氨基酸残基是如同在Peptides loc cit.的表1中提到的氨基酸残基，其中只有一个除外]。

21. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中在该CGRP化合物的2、4-21、23、24、26-34、36和37位的氨基酸残基没有突变(这些氨基酸残基中的两个除外)[即，在该条款中提到的具体位置的氨基酸残基是如同在Peptides loc cit.的表1中提到的氨基酸残基，其中两个除外]。

22. 按照前述条款的化合物，其中连接基具有通式∶

，其中p是在1至23范围内的整数。

23. 按照只涉及连接基Y的第一个条款的化合物，其中连接基具有通式∶

，其中n是1、2或3；s是0、1、2或3。

24. 按照只涉及连接基Y的第一个条款的化合物，其中连接基具有通式∶

，其中n是1、2或3；p是在1至23范围内的整数。

25. 按照只涉及连接基Y的第一个条款的化合物，其中连接基具有通式∶

，其中m是0或是在1至6范围内的整数。

26. 按照只涉及连接基Y的第一个条款的化合物，其中连接基具有通式∶

其中m是0或1至6范围内的整数；n是1、2或3；s是0、1、2或3。

27. 按照只涉及连接基Y的第一个条款的化合物，其中连接基具有通式∶

，其中m是0或1至6范围内的整数；n是1、2或3；p是1至23范围内的整数。

28. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中在以Y表示的连接基中n是1。

29. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中在以Y表示的连接基中p是1。

30. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中连接基是存在于上面具体实施例1及以下等等提到的化合物中的任何一个具体连接基，优选-NH-CH(COOH)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-。

31. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中Z是酰基。

32. 按照前述条款的化合物，其中存在于Z中的酰基源于脂肪酸或脂肪二酸。

33. 按照前述条款的化合物，其中存在于Z中的酰基源于具有α和Ω羧基的脂肪二酸。

34. 按照前述条款的化合物，其中存在于Z中的酰基源于具有12-22个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸。

35. 按照前述条款的化合物，其中存在于Z中的酰基源于具有16个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸。

36. 按照前述条款的任一项的化合物，其中存在于Z中的酰基源于具有18个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸。

37. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中存在于Z中的酰基源于具有20个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸。

38. 按照前述条款的任一项的化合物，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在N端氨基酸残基处[即，1位]连接。

39. 按照前述条款的任一项的化合物，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在N端Ser处连接。

40. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在赖氨酸残基处连接。

41. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于3位的Lys处连接。

42. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于4位的Lys处连接。

43. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于11位的Lys处连接。

44. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在24位的Lys处连接。

45. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于25位的Lys处连接。

46. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于26位的Lys处连接。

47. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于28位的Lys处连接。

48. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于29位的Lys处连接。

49. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在存在于31位的Lys处连接。

50. 按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分与CGRP化合物在35位的Lys处连接。

51. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物，其是具体在上述说明书，例如，在具体实施例中，特别是下面/上面实施例1及以下的实施例的任一项中提到的任何一个化合物。

52. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物，其用作药物，或在药物中使用。

53. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物，其用于治疗糖尿病，抗胰岛素性，肥胖症，高血压症和心血管疾病。

54. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗糖尿病，抗胰岛素性，肥胖症，高血压症和心血管疾病。

55. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物引起GLP-1的体内释放的用途。

56. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物引起体重减轻的用途。

57. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物在长时间接触之后引起HbA1c水平降低的用途。

58. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物引起空腹胰岛素水平降低的用途。

59. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物引起持续血管舒张的用途。

60. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物引起能量消耗提高的用途。

61. 糖尿病、抗胰岛素性、肥胖症、高血压症和心血管疾病的治疗方法，该方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的按照前述产物权利要求的任一项的化合物。

62. 本文描述的任何新的特征或特征的组合。

以举例说明的方式提供下列实施例，但没有限制性。

本文使用下列缩写∶Boc是叔丁氧羰基，DCM是二氯甲烷，Dde是1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚基)乙基，DIC是二异丙基碳二亚胺，DIPEA是二异丙基乙胺，Fmoc是9-芴甲氧羰基，h是小时，HATU是(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)，HBTU是(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)，HFIP是1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇，HOAt是1-羟基-7-氮杂苯并三唑，HOBt是1-羟基苯并三唑，HPLC是高效液相色谱，ivDde是1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚基)-3-甲基丁基，LCMS是液相色谱质谱，MeOH是甲醇，Mmt是4-甲氧基三苯甲基，Mtt是4-甲基三苯甲基，NMP是N-甲基吡咯烷酮，OEG是8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，OtBu是叔丁基酯，PBS是磷酸盐缓冲盐水，RP是反相，RP-HPLC是反相高效液相色谱，RT是室温，Rt是保留时间，SPPS是固相肽合成，TFA是三氟乙酸，TIPS是三异丙基硅烷，TIS是三异丙基硅烷，Trt是三苯甲基，UPLC是超高效液相色谱。

制备方法

一般方法

本节涉及合成树脂结合的肽的方法(SPPS方法，包括氨基酸的去保护的方法，肽从树脂上断裂的方法和其纯化方法)，以及测定和表征所得到的肽的方法(LCMS和UPLC方法)。

树脂结合的肽的合成

SPPS方法A

SPPS方法A是指保护的肽基树脂的合成，该方法在Applied Biosystems 433肽合成仪(还称为ABI433A合成仪)上使用Fmoc化学过程，规模为0.25 mmol或1.0 mmol，使用生产商的FastMoc UV方案，该方案在NMP中使用HBTU或HATU介导的结合，UV检测Fmoc保护基的去保护状况。

合成肽酰胺所使用的起始树脂是合适的Rink-酰胺树脂(对于肽酰胺)，或(对于具有羧基C端的肽)合适的王氏树脂或合适的氯三苯甲基树脂。合适的树脂可从例如Novabiochem购买。在适合于ABI433A合成仪的柱中，所使用的保护的氨基酸衍生物是标准Fmoc-氨基酸(例如，Anaspec或Novabiochem提供)。N端氨基酸是Boc保护(在α氨基处)的氨基酸。如果希望酰化N端氨基酸，则在α氨基处用Fmoc保护该N端氨基酸。用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护序列中的赖氨酸的ε氨基，这取决于白蛋白结合部分和间隔团（spacer）的连接途径。用三苯甲基保护序列中的两个半胱氨酸，当在NMP中用碘处理时，其环化为目标二硫桥接的化合物。在某些情况下，通过利用在二肽酰胺键上用能够在酸性条件下断裂的基团(例如但不局限于：2-Fmoc-氧基-4-甲氧苯甲基或2,4,6-三甲氧苯甲基)保护的二肽，可以提高肽的合成。如果丝氨酸或苏氨酸存在于肽中，假脯氨酸二肽可以用于改进该合成法(得自于，例如，Novabiochem，参见W.R. Sampson(1999)，J. Pep. Sci. 5，403)。

SPPS方法B

SPPS方法B是指在基于微波的Liberty肽合成仪(CEM Corp., North Carolina)上、通过Fmoc化学过程的肽合成。合适的树脂是预载的、低填充量的王氏树脂，得自于Novabiochem(例如，低填充量的fmoc-Lys(Mtt)-王氏树脂，0.35 mmol/g)。在NMP中，在至高达70或75℃下，用5%哌啶进行Fmoc-脱保护。偶合化学过程是DIC/HOAt(在NMP中)。将氨基酸/HOAt溶液(0.3M，在NMP中，摩尔过量3-10倍)加入到该树脂中，而后加入相同摩尔当量的DIC(0.75M，在NMP中)。例如，对于下列规模的反应，每个偶合使用如下数量的0.3M氨基酸/HOAt溶液∶规模/mL，0.10 mmol/2.5 mL，0.25 mmol/5 mL，1 mmol/15 mL。偶合时间和温度通常是5分钟、至高达70或75℃。在50℃，使组氨酸氨基酸双偶合，或如果先前的氨基酸是空间位阻的氨基酸(例如Aib)，使其四偶合。在室温下，使精氨酸氨基酸偶合25 min，然后加热到70或75℃，保持5 min。对于N端氨基酸和赖氨酸的ε氨基的保护，请参阅上面SPPC方法A。用DCM洗涤树脂，并将该树脂悬浮在纯的(未稀释的)六氟异丙醇中20分钟，而后用DCM和NMP洗涤，除去Mtt基团。通过手工合成法或在Liberty上进行一个或多个自动步骤(任选包括手工偶合)，进行赖氨酸的化学修饰。

去保护的方法

除去 ivDde 或 Dde 保护

将树脂(0.25 mmol)放在手动振荡器/过滤装置中，用2%肼/N-甲基吡咯烷酮(20 ml，2x12 min)处理，除去Dde或ivDde基团，并用N-甲基吡咯烷酮(4x20 ml)洗涤。

除去 Mtt 或 Mmt 保护

将树脂(0.25 mmol)放在手动振荡器/过滤装置中，用2% TFA和2-3% TIS/DCM处理(20 ml，5-10 min，重复6-12次)，除去Mtt或Mmt基团，并用DCM(2x20 ml)、10% MeOH和5% DIPEA/DCM(2x20ml)和N-甲基吡咯烷酮(4x20 ml)洗涤。

二硫桥的形成

将保护的树脂(0.25 mmol)放在手动振荡器/过滤装置中，用NMP洗涤，而后加入碘(635 mg，2.5 mmol)的NMP(10 mL)溶液。将该混合物搅拌30 min，而后将其排干，并用NMP(3 x 10 mL)洗涤。加入抗环血酸(441 mg，2.5 mmol)的NNP-水(9:1，10 mL)溶液，并将该混合物搅拌15 min，而后将该混合物排干，用NMP(10 x 10 mL)和DCM(10 x 10 mL)洗涤。

从树脂上断裂

合成之后，将树脂用DCM洗涤，通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5或92.5/5/2.5)处理2-3小时，而后用二乙醚沉淀，使肽从该树脂上断裂。

纯化和定量

将粗品肽溶于水和MeCN或甲基甲酰胺的合适混合物中，用反相制备HPLC(Waters Deltaprep 4000或Gilson)纯化(在包含C18-硅胶的柱上)。用包含0.1% TFA的递增梯度的MeCN/水进行洗脱。用分析HPLC或UPLC检测相关的馏分。将包含纯靶向肽的馏分混合，并减压浓缩。分析(HPLC，LCMS)所得到的溶液，并使用化学发光氮特异性HPLC检测器(Antek 8060 HPLC-CLND)或在280 nm处测定UV吸收，将产物定量。将产物分配到小玻璃管中。用微孔玻璃纤维预滤器封盖管瓶。冷冻干燥三天，得到肽三氟乙酸盐白色固体。

检测和表征方法

LCMS方法

LCMS

在由Waters Acquity UPLC系统和LCT Premier XE质谱仪(得自于Micromass)组成的装置上进行LCMS。UPLC泵连接两个洗脱储罐，其包含∶

A：0.1%甲酸/水。

B：0.1%甲酸/乙腈。

在室温下进行分析：将合适体积的样品(优选2-10µl)注射到柱上，用A和B的梯度洗脱该柱。

UPLC条件、检测器设置和质谱仪设置是：

柱∶Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7µm，2.1mm x 50mm。

梯度∶线性5%-95%乙腈，在4.0 min(或者8.0 min)期间内，0.4ml/min。

检测∶214 nm(从TUV(可调UV检测器)模拟输出)。

MS电离模式∶API-ES。

扫描∶100-2000 amu(或者500-2000 amu)，步长0.1 amu。

UPLC方法

方法 05 B5 1

UPLC(方法05_B5_1)∶使用配备双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130(C18，130Å，1.7um，2.1 mm x 150 mm柱，40℃)收集UV检测(214nm和254nm)。

UPLC系统连接两个洗脱储罐，其包括∶

A∶0.2 M Na₂SO₄，0.04 M H₃PO₄，10% CH₃CN(pH3.5)。

B∶70% CH₃CN，30% H₂O。

使用下列线性梯度∶60% A，40% B至30% A，70% B，8分钟，流速0.40 mL/min。

方法 04 A3 1

UPLC(方法04_A3_1)∶使用配备双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130(C18，130Å，1.7um，2.1 mm x 150 mm柱，40℃)收集UV检测(214nm和254nm)。

UPLC系统连接两个洗脱储罐，其包含∶

A∶90% H₂O，10% CH₃CN，0.25M碳酸氢铵。

B∶70% CH₃CN，30% H₂O。

使用下列线性梯度∶75% A，25% B至45% A，55% B，16分钟，流速0.40 mL/min。

方法 04 A4 1

UPLC(方法04_A4_1)∶使用配备双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130(C18，130Å，1.7um，2.1 mm x 150 mm柱，40℃)收集UV检测(214nm和254nm)。

UPLC系统连接两个洗脱储罐，其包含∶

A∶90% H₂O，10% CH₃CN，0.25M碳酸氢铵。

B∶70% CH₃CN，30% H₂O。

使用下列线性梯度∶65% A，35% B至25% A，65% B，16分钟，流速0.40 mL/min。

方法 08 B2 1

UPLC(方法08_B2_1)∶使用配备双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130(C18，130Å，1.7um，2.1 mm x 150 mm柱，40℃)收集UV检测(214nm和254nm)。

UPLC系统连接两个洗脱储罐，其包含∶

A∶99.95%H₂O，0.05% TFA。

B∶99.95% CH₃CN，0.05% TFA。

使用下列线性梯度∶95% A，5% B至40% A，60% B，16分钟，流速0.40 mL/min。

方法 08 B4 1

UPLC(方法08_B4_1)∶使用配备双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130(C18，130Å，1.7um，2.1 mm x 150 mm柱，40℃)收集UV检测(214nm和254nm)。

UPLC系统连接两个洗脱储罐，其包括∶

A∶99.95%H₂O，0.05% TFA。

B∶99.95% CH₃CN，0.05% TFA。

使用下列线性梯度∶95% A，5% B至95% A，5% B，16分钟，流速0.40 mL/min。

使用下列线性梯度∶40% A，60% B至20% A，80% B，8分钟，流速0.40 mL/min。

实施例1

N-α-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Ser1]α-人CGRP肽

制备∶SPPS方法A：从H-PAL HMPB-ChemMatrix树脂(加载0.43 mmol/g，0.582 g，0.25 mmol)开始。使用的下列假脯氨酸得自于Novabiochem：Fmoc-Leu-Ser(ψ^Me,Mepro)-OH和Fmoc-Val-Thr(ψ^Me,Mepro)-OH。结构单元8-(9-芴基甲基氧羰基氨基)-3,6-二氧杂辛酸是可从Iris Biotech购买，十八烷二酸单叔丁基酯可如WO 2005/012347所述制备。

UPLC 08_B2_1：11.90 min。

UPLC 08_B4_1：7.88 min。

UPLC 04_A4_1：10.16 min。

LCMS：m/z= 1459.2(M+3H)³⁺，1094.5(M+4H)⁴⁺，875.6(M+5H)⁵⁺

实施例2

N-α-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Ser1]β-人 CGRP肽

制备：SPPS方法B：从ChemMatrix Rink酰胺树脂(0.25 mmol)开始。使下列氨基酸进行双偶合：甘氨酸(20位)和甘氨酸(14位)。结构单元8-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-3,6-二氧杂辛酸是可从Iris Biotech购买，十八烷二酸单叔丁基酯可如WO 2005/012347所述制备。

UPLC 08_B4_1：8.31 min。

UPLC 04_A3_1：13.52 min。

LCMS：m/z= 1461.1(M+3H)³⁺，1096.3(M+4H)⁴⁺

实施例3

N-α-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]α-人 CGRP肽

制备∶SPPS方法A：从H-PAL HMPB-ChemMatrix树脂(加载0.43 mmol/g，0.582 g，0.25 mmol)开始。使用的下列假脯氨酸得自于Novabiochem：Fmoc-Leu-Ser(ψ^Me,Mepro)-OH和Fmoc-Val-Thr(ψ^Me,Mepro)-OH。结构单元8-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-3,6-二氧杂辛酸是可从Iris Biotech购买，十八烷二酸单叔丁基酯可如WO 2005/012347所述制备。

UPLC 08_B4_1：8.21 min。

UPLC 08_B2_1：12.39 min。

UPLC 05_B5_1：5.15 min。

UPLC 04_A3_1：13.27 min。

LCMS：m/z= 1453.69(M+3H)³⁺，1090.50(M+4H)⁴⁺，872.42(M+5)⁵⁺

实施例4

在下面表1中，得到两个已知化合物(即，大鼠CGRP-α和大鼠CGRP-β)和两个本发明化合物(即，在上面实施例1和 2中具体提到的化合物)的药物动力学参数(EC₅₀值，Cmax和T1/2)和体外效能。

表1

	CGRP-α	CGRP-β	类似物α1	类似物β1
					EC₅₀，pM	5	9	90	12
C_max，nM			250	210
					T1/2，小时			>7	>7

从表1数据可明显得知，已经制备了有效的酰化CGRP类似物(Cmax大于天然肽(即CGRP)的Cmax 200倍，T1/2>7小时)。这些肽鉴定了CGRP的新的生物活性，并且测定了其许多代谢效应的净效果。

实施例5-13

背景

在体外试验(在CGRP受体表达细胞中的CGRP诱导的cAMP积聚)中，在纤维素纸上使用高通量肽合成(SPOT合成，参见J. Immunol. Methods. 2002 Sep 1;267(1):13-26. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports-principles and applications. Frank R.)，通过光可裂解的连接基(产生已可用于试验的可溶性肽)，评价某些酰化位置(是指用N-ε-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基})-L-赖氨酸置换人α CGRP中的氨基酸，或在人α CGRP中用{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}进行N端酰化)。

纤维素结合的肽的合成

在96孔板中，使用配备有AutoSpot模块的完全自动化MultiPep自动装置（rorobot）(得自于Intavis Bioanalytical Instruments(Germany))，在标准氨基-改性的酸稳定的纤维素膜(具有PEG间隔基，得自于AIMS Scientific Products GmbH(德国))上合成肽，一式两份(两个副本)。使用HOAt/DIPCDI/三甲吡啶预活化(0.4µl 1M DIC/NMP，0.2µl 1M三甲吡啶/NMP，0.3M Fmoc氨基酸/0.3M HOAt/NMP，每个SPOT 30 min)以三联形式(in triple)进行偶合。通过用20%哌啶(piperdine)/NMP(2 x 6 ml)处理每个膜10 min，进行Fmoc脱保护。通过机器人集合管用NMP(6 X 6 mL)和EtOH(6 X 6ml)洗涤膜，而后干燥。首先用Fmoc-Gly-OH/Boc-Gly-OH(1:1)衍生膜，而后用NMP/AcO2/DIPEA(94:5:1)(SPOT清晰度(definition)和膜加载调节)封盖，并洗涤。除去Fmoc、偶合Fmoc-Photo-连接基(RL-1026，得自于Iris Biotech GmbH)并洗涤之后，使用上述脱保护、偶合和洗涤的重复循环来合成肽。当在赖氨酸侧链上酰化时，用Mtt(例如Fmoc-Lys(Mtt)-OH)保护被酰化的赖氨酸的ε氨基，用Boc(例如Boc-Ala-OH)保护N端α氨基。当完成肽骨架序列时，用HFIP/DCM(75:25，3 x 20 ml)处理膜10 min，而后进行阳性溴酚蓝试验。然后使用脱保护、偶合和洗涤的重复循环来引入酰化基团。使用下列结构单元：Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu-OtBu和C18二酸单叔丁基酯。将纤维素片材干燥，放入聚丙烯盘中，用NMP洗涤，而后加入碘(635 mg，2.5 mmol)的NMP(10 mL)溶液。将该片材搅拌30 min，而后将该混合物倾析，并用NMP(3 x 10 mL)洗涤该片材。加入抗环血酸(441 mg，2.5 mmol)的NNP-水(9:1，10 mL)溶液，并将该片材搅拌15 min，而后将该混合物倾析，用DCM(5 x 20 ml)、NMP(5 x 20 ml)和EtOH(5 x 20 ml)洗涤该片材。

纤维素结合的肽的断裂

合成之后，用DCM(5 x 20 ml)洗涤纤维素膜，干燥，通过用TFA/TIPS/水(92.5/5.0/2.5)处理2小时，除去侧链保护基，而后用DCM(5 x 20 ml)、NMP(5 x 20 ml)和EtOH(5 x 20 ml)洗涤。将干燥的膜放在透射仪(在365 nm下照射)上3小时。将SPOT轧孔，并放入过滤96孔微板中。将40µl DMSO加入到每个SPOT中，并将板摇动30 min。收集每个孔的滤液，并将160 µl HBSS(1x，含有20 mM Hepes，0.1%卵清蛋白，0.005% Tween20)加入到每个孔中，在溶液中得到粗品肽，准备用于检验CGRP在CGRP受体表达细胞中CGRP-诱导的cAMP积聚。

表2给出了所获得的试验结果。

表2

*=天然的人α-CGRP

表2中的数据表明了用人α-CGRP的N-ε-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基})-L-赖氨酸(在用光可裂解的连接基功能化的纤维素片材上以一式两份形式制备的单独的SPOT，用UV光(365 nm)从纤维素上断裂的，溶解在DMSO中，并在CGRP-1-luc细胞系受体试验中检验)的酰化扫描(acylation scan)。

下表说明了表2中被试验过的化合物。标题栏指出了与侧链相连接的CGRP化合物中的位置。

No 肽

用二硫键将 Cys2 和 Cys7 环化

CGRP A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

3 A-C-X-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

4 A-C-D-X-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

11 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-X-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

24 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-X-N-N-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

25 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-X-N-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

26 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-X-F-V-P-T-N-V-G-S-K-A-F

28 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-X-P-T-N-V-G-S-K-A-F

29 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-V-X-T-N-V-G-S-K-A-F

31 A-C-D-T-A-T-C-V-T-H-R-L-A-G-L-L-S-R-S-G-G-V-V-K-N-N-F-V-P-T-X-V-G-S-K-A-F

X=N-ε-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基})-L-赖氨酸

生物学评价的方法

在 CGRP- 受体表达细胞中 CGRP 诱导的 cAMP 积聚

用降钙素受体类受体(CRLR)、受体活性调节蛋白-1(RAMP1)和CRE荧光素酶(cAMP响应成份，用于荧光素酶基因表达对照)稳定地转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。荧光素酶是报告胞内cAMP积聚的指示基因。

将细胞在F12培养基中培养，该培养基补充有GlutaMAX^TM(Gibco cat no 31765-027)、FBS(10%，Gibco 16140-071)、青霉素-链霉素(1%，Lonza DE-17-602E)、G418(400µg/ml，Gibco 10131-027)、灭瘟素(Blasticidine)(10µg/ml，Corning cat no 15205)、潮霉素(400µg/ml， Calbiochem cat no400052)。

在实验之前的当天，在100µl培养基中，将细胞播种在96孔板(Packard #6005180)中，20000个细胞/孔。实验的当天，用试验培养基(Dulbecco's培养基w/o酚红(Gibco cat no 11880-028)，补充有10% FBS(10%，Gibco 16140-071)，Hepes(10 mM，Gibco cat no 15630)，GlutaMAX^TM(2mM，Gibco cat no 35050))替代培养基，50µl/孔。

将肽在试验培养基中稀释，而后加入到细胞中，进行刺激，50µl/孔。

将细胞在5% CO₂中、在37℃下培养4小时。

用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco cat no 14040-091)替代试验培养基和肽，100µl/孔，并加入LucLite^tm(PerkinElmer，cat no 6076759)，100µl/孔。将板密封，而后在室温(21℃)下培养30 min。测定荧光素酶活性(发光，7 s/孔)(TopCount^®，NXT，Packard)。

通过利用GraphPad Prism软件，将剂量反应曲线拟合，并计算pEC₅₀值。以平均值±SEM(n=2)的形式得到数据，每个类似物试验两次。

在肠管 L- 细胞系中 CGRP- 诱导的 GLP-1 的释放

使鼠的肠L-细胞系GLUTag生长在DMEM(Gibco cat no 21885-010)中，其中补充有FCS(10%，Gibco)和青霉素-链霉素(1%，Gibco cat no 15140-114)。

在200μl培养基中，将细胞播种在96孔板(Biological Industries，cat no E-TCMT-F)中，50,000个细胞/孔，并培养过夜。在37℃，在包含DMEM(Gibco 21885-010)的试验培养基(补充有BSA(0.1%，Sigma cat no A4503)、Tween20(0.005%，Merck，cat no 822184)和valpyr(200μM))中，用CGRP、类似物或对照物刺激细胞3小时。收集培养基，立即储存在-20℃下，直到按照下述(测定血浆和培养基中的总的GLP-1)分析GLP-1含量为止。使用GraphPad Prism分析数据，以平均值±SEM的形式得到结果。一式两份试验所有的类似物(n=2)。

通过自动食物摄入测定法 (FeedWin) 来测定 CGRP 诱导的食物摄入的减少

一旦雄性Spraque Dawley(SD)大鼠到达，每个笼中放两个大鼠，在它们之间具有分隔墙。将它们在相反的昼夜节律下放置，并使环境丰富。使大鼠适应相反的昼夜节律至少1周，而后转入实验系统笼(单独放置)中。使它们额外适应实验系统笼5-6天，而后开始实验。在驯化期间，使大鼠不限量地接触食物(Altromin 1324)和水。

开始研究之前的当天，基于体重(250-300 g)将大鼠分成三或四个组(n=5-8)。

开始研究之前16小时，使大鼠禁食。与给药结合恢复供给食物。使大鼠接受单一皮下注射(s.c.，1 ml/kg)赋形剂或CGRP类似物。在第一个实验中，腹膜内给予(i.p.，1 ml/kg)α1类似物。

在“FeedWIN”系统(Ellegaard Systems A/S，Faaborg，Denmark)中检验类似物对食物和水消耗的效果。该系统包括32个工作站。在每个工作站，记录单个大鼠的持续的水和食物消耗。

一个工作站由带有金属盖的笼和放置在笼的每个面上的两个天平组成。天平记录从食物和水容器中减少的重量，由此记录个体分别消耗的食物和水的重量。将32个工作站与两个PC连接，PC通过特别设计的软件(FeedWIN)收集和处理数据。每15分钟收集数据，直至48小时，并表示为累积食物摄入(平均值±SEM)。

CGRP 和其类似物的药物动力学和 GLP-1 释放性能

重量大约250 g的雄性Spraque Dawley大鼠(n=24)用于合并的药物动力学(T1/2，Cmax等等)和药效(GLP-1释放)研究。将大鼠分成4个组，每个组n=6个大鼠。用单一皮下注射(1 ml/kg)赋形剂、α-CGRP(138 nmol/kg)、类似物β1(231 nmol/kg)或类似物α1(151 nmol/kg)来处理大鼠。在给药前和给药后0.5、1、3、7和24小时，从未麻醉大鼠的舌下静脉取出血液(200µl)样品。将血液收集在含有EDTA的管中。将样品在冰上保持，并离心。将血浆在-20℃下保持，直到分析CGRP类似物和总的GLP-1为止。

商业获得的试剂盒(人CGRP ELISA，cat.#A05481，SPIbio)用于监测CGRP-类似物的血浆水平。简要地说，该试验是使用两个抗人CGRP的抗体的两位点酶联免疫吸收试验(ELISA)。将单克隆抗体固定到微板孔的表面。将五微升血浆样品或校准物加到合适的孔中，并与100µL缓冲剂和100µL AChE-共轭的Fab'片段一起培养2小时。然后将孔排空，洗涤，并将Ellman's试剂加入到每个孔中，在黑暗中额外培养30-90分钟。利用分光光度计(在405 nm)测定颜色强度。信号水平与血浆样品中CGRP-类似物的浓度成正比。将CGRP-类似物在血浆(Bioreclamation，UK)中稀释，并用作校准物。在0至30000 pM范围内制作校准物的线。将校准物在-18℃下保存在Micronic管中。改进的CGRP试验的定量下限是大约750 pM，不精确性(%CV)<10%。

测定血浆和培养基中的总的 GLP-1

使用发光氧通道免疫测定(LOCI)，分析血浆或细胞培养基样品的总的GLP-1水平。将两微升校准物、对照物和未知的血浆样品吸到灰色384孔微滴度板(Perkin Elmer)的孔中，而后加入用mAbF5(Pridal L，Ingwersen SH，Larsen FS，Holst JJ，Adelhorst K，Kirk O. Comparison Of Sandwich-Linked Immunoabsorbent Assay Radioimmunoassay For Determination Of Exogenous Glucagon-Like Peptide-1(7-36)Amide In Plasma. J Pharm Biomed. Anal. 1995,13:841-50)涂渍的受体微粒(0.5μg/孔)和生物素化的HYP147-12(AntibodyShop，DK)(4 nmol/L)的15μL混合物。将该板在18-22℃下培养1小时。然后，将30μL链亲和素涂渍的供体微粒(2μg/孔)(Perkin Elmer)加入到每个孔中，并在21-22℃下培养30分钟。用680 nm激光激发之后，在Envision板读数器(Perkin Elmer)中(在21-22℃，具有520-645 nm谱带宽度的滤光片)对该板进行读数。每个孔的总的测定时间是210 ms，包括70 ms激发时间。将人GLP-1(Novo Nordisk)在HEPES缓冲的溶液中稀释，并用作校准物。在0至2000 pmol/L范围内制作校准物的线。将校准物在-18℃下保存在Micronic管中。检测限(定义为：相当于零校准物的21个测定的平均值以上3 SD的浓度)是1.0 pmol/L，并通过在12个连续分析操作中测定三个样品和在相同分析操作中三个样品中每一个的21个测定来评价不精确性(CV)；总的CV<10%。

血压的持续检测

使七个雌性Sprague Dawley(SD)大鼠(大约9个月大交接(at delivery))(Taconic M & B)与配偶大鼠配对居住在营养物质超丰富的笼中，并包括在该研究中。在研究开始的时候，大鼠的重量范围为301-424克。在研究之前，在畜舍中驯化至少2至3周之后，用异氟烷(Baxter A/S，Allerød，Denmark)使大鼠麻醉，并腹膜内植入TL11M2-C50-PXT遥测发射机(Data Sciences International(DSI)，St.Paul，US)，将动脉插管放在股动脉中，并通中主动脉中，用于动脉血压测定。使它们优先（Pre-emptively）接受0.05-0.1 mg/kg丁丙诺啡(buprenorphin)(Temgesic，Schering-Ploug A/S，Farum，Denmark)和5 mg/kg Rimadyl Vet.(Orion Pharma，Nivå，Denmark)(作为镇痛药)加上0.05 ml/100 g Streptocillin Vet. 2,000,000 IE(Boehringer Ingelheim，København Ø，Denmark)(作为预防性抗生素治疗)。对于随后两天，使它们接受5 mg/kg Rimadyl Vet.(OrionPharma，Nivå，Denmark)作为手术后的镇痛药。手术后，使所有大鼠恢复至少四周时间，并且在参加研究之前，必须通过常规健康检查。数据采集程序Notocord-HEM v. 3.5(Notocord，Croissy Sur Seine，France)用于获得和显示通过遥测技术所获得的血液动力学信号。对所有大鼠的血压和心率检测至多24小时。

用给药前(t=0)和给药(只是高剂量)之后直至24小时的平均值来评价平均动脉血压(还检测收缩和舒张压)。

氧消耗 (VO₂) 和呼吸交换率 (RER) 的测定

八只雄性Spraque Dawley肥胖倾向大鼠(Charles River)用于该研究。使它们在正常昼夜节律下群居，并且不限量地接触多脂饮食(60 kcal%来源于油脂，R12492)和水。当检验能量消耗时，已经用多脂饮食喂养大鼠11周。

在Oxymax System 2(Columbus Instrument-开放式Circuit量热形式2.30)中，通过间接量热，由呼吸气体交换测定所试验化合物对能量消耗的效果。将动物称重，并单独放置在恒定供氧的呼吸舱中。以恒速(1.8 l/min)引入空气，流出是0.8 l/min。以9分钟的取样间隔来测定动物的O₂消耗和CO₂产生。

驯化两个小时之后，s.c.给予大鼠类似物α1(100 nmol/kg)或赋形剂(交叉设计)。收集数据22小时，并且转化为VO₂和呼吸交换率(RER)。

获得的结果示于图7和图8中。

亚慢性给药之后 DIO 大鼠的食物摄入和体重

十八只Spraque Dawley大鼠用于该研究。当开始研究时，大鼠大约1岁，并且已经喂食了10个月的多脂饮食(Research Diet，D12451 45%)。在研究开始之前14天，使它们单独居住，并且不限量地接触食物和水。每天用类似物α1(100 nmol/kg，s.c.)或赋形剂处理它们一次，处理14天。

每天测量一次体重。

获得的结果示于图9中。

亚慢性给药之后 ob/ob 小鼠的血糖、血浆胰岛素和 HbA1c

20只雄性UMEÅ ob/ob小鼠(Taconic，Denmark)用于该研究。将小鼠在常规昼夜节律下放置，并且不限量地接触常规食物和水。开始研究时，它们8周大。在开始研究之前，获得HbA1c的血样。过夜半空腹之后，获得基础血样，用于测定空腹胰岛素。每天s.c.给予小鼠一次100 nmol/kg类似物α1或赋形剂。研究进行14天。在研究的最后，再次获得空腹血浆胰岛素和HbA1c的血样。用大鼠胰岛素放射免疫测定(RIA)(Crystalchem，IL)来分析胰岛素。将用于HbA1c测定的血液(10µl)转入含有1 ml溶血剂(Roche A/S Diagnostics，Mannheim，Germany)的管中，在干冰上冷冻，并在-80℃下储存，直到按照生产商的说明书在Hitachi 912分析仪(Roche A/S Diagnostics，Mannheim，Germany)上分析为止。

获得的结果示于图10和图11中。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，是以引证的方式将它们以整体引入本文中，并且引用的程度好象每个参考文献被单独地引入，并且具体地表明是以引证的方式结合的，且以其全部在这里列出(至法规容许的极限程度)那样。

本文使用的所有标题和副标题只是为了方便起见，无论如何不应该将其看作是对本发明的限制。

本文提供的任何和所有实施例或示范性语言(例如，“例如”)的用途，仅仅想要更好地阐明本发明，不会引起对本发明范围的限制，除非另外要求。说明书中的文辞都不应该被看作是将任何未提出要求的要素指定为本发明实践所必需的、。

本文引用和引入的专利文献只是为了方便起见，并不反映这种专利文献的有效性、专利性和/或强制性的任何观点。本文提到的参考文献不是对它们构成现有技术的承认。

本文中，词语“包含”应该广泛地解释为“包括”、“含有”或“由...组成”(参阅，EPO指南C，III，4.13)。

本发明包括适用法律所允许的附加权利要求和条款中所列举主题的所有变体和等效内容。

Claims

1.通式X-Y-Z的化合物，其中X表示CGRP化合物，从其中已经形式上从存在于氨基酸残基中的一个氨基上除去氢；Y是选自下式六个基团的连接基∶

, ,

,

,

和

,

其中m是0，1，2，3，4，5或6；n是1，2或3；s是0，1，2或3；p是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或23，其中这些部分的羰基端与CGRP化合物(以X表示)连接，这些部分的氨基端与酰基(以Z表示)连接；Z是酰基，优选，该酰基源于具有12-22个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸；其中-Y-Z部分与存在于CGRP化合物中的氨基酸残基中所存在的氨基连接。

2.按照前述权利要求的化合物，其中存在于Z中的酰基源于具有12-22个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸。

3.按照前述权利要求的化合物，其中存在于Z中的酰基源于具有12-22个碳原子的脂肪二酸。

4.按照前述权利要求的任一项的化合物，其中CGRP化合物具有通式I∶ X₁CX₂TX₃TCX₄TX₅RLAX₆X₇LX₈RSGGX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃FVPTX₁₄VX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈F，其中X₁是Ala或Ser，X₂是Asp或Asn，X₃是Ala或Ser，X₄是Val或Ala，X₅是His或Gln，X₆是Gly或Asp，X₇是Leu或Phe，X₈是Ser、Asn或Arg，X₉是Val、Ile、Met或Leu，X₁₀是Val、Ala、Leu或Gly，X₁₁是Lys、Ser、Asn或His，X₁₂是Ser、Asn、Asp、Pro，X₁₃是Asp或Asn，X₁₄是Asp或Asn，X₁₅是Gly或Ser，X₁₆是Ala或Ser，X₁₇是Glu、Gln、Lys或Asn，X₁₈是Ala或Ser，并且C端氨基酸残基中的羧基任选被酰胺化，以及,在式I中，利用编码氨基酸的常用的一个字母来表示具体氨基酸残基；和所述CGRP化合物在两个Cys残基(通常在2和7位)之间具有常规分子内部的二硫桥。

5.按照前述权利要求的任一项的化合物，其中CGRP化合物具有通式II∶ X₁CX₂TATCVTHRLAX₆LLX’₈RSGGX’₉X’₁₀KX’₁₂NFVPTX₁₄VGSX’₁₇AF，其中X₁是Ala或Ser，X₂是Asp或Asn，X₆是Asp或Gly，X'₈是Arg或Ser，X'₉是Val或Met，X'₁₀是Val或Leu，X'₁₂是Asp、Asn或Ser，X₁₄是Asp或Asn，X'₁₇是Glu或Lys，并且C端氨基酸残基中的羧基任选被酰胺化。

6.按照前述条款的任一项的化合物，其中式-Y-Z的部分在N端氨基酸残基处[即，1位]与CGRP化合物连接，例如，与Ser连接。

7.按照前述条款的任一项的化合物，在可能的范围内，其中式-Y-Z的部分在赖氨酸残基处与CGRP化合物连接，例如，在24位或35位。

8.按照前述权利要求的任一项本文所描述的新产物，例如，在上述条款的任一项中所描述的新产物。

9.本文所描述的新的用途，例如，在上述条款的任一项中所描述的新的用途。

10.本文所描述的新的治疗法，例如，在上述条款的任一项中所描述的新的治疗法。

11.在上述实施例的任一项中所描述的产物，例如，在实施例1-3中所描述的产物。

12.按照前述权利要求的任一项的产物，其导致GLP-1的体内释放；导致体重减轻；长期接触之后导致HbA1c水平降低；导致空腹胰岛素水平降低；导致持续的血管舒张；和/或导致能量消耗提高。

13.按照前述权利要求的任一项的产物，其对CGRP受体具有效果，导致GLP-1的体内释放；对CGRP受体具有效果，导致体重减轻；对CGRP受体具有效果，在长期接触之后导致HbA1c水平降低；对CGRP受体具有效果，导致空腹胰岛素水平降低；对CGRP受体具有效果，导致持续血管舒张；和/或对CGRP受体具有效果，导致能量消耗提高。

14.本文描述的任何新的特征或特征的组合。