CN102781458A - 多肽缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供具有多种改进的药理和药代动力学性质的多肽缀合物及其在治疗各种疾病和病况例如糖尿病和/或肥胖症中的应用。

Description

多肽缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月23日提交的美国临时专利申请号61/263,752的权益，其完整内容结合到本文中用于所有目的。
领域
本文提供具有优良药理性质的具有GLP-1受体激动剂活性和淀粉样肽(amylin)模拟物活性两者的多肽缀合物及使用它们的治疗方法。
背景
肽和蛋白质在调节生物学过程中起关键性作用。例如，肽作为激素和抑制剂起调节作用，并且参与免疫识别。肽的重要生物学作用对于理解肽与其所结合的受体的相互作用是很重要的。
肠降血糖素肽是当葡萄糖水平正常或特别当它们升高时，引起释放的胰岛素的量升高的激素和肽模拟物。胰岛素对口服葡萄糖的响应超过静脉内给予等量葡萄糖后所测量的响应，从这个观察结果发展出肠降血糖素作用的概念。除由胰岛素分泌限定的初期肠降血糖素作用外，这些肠降血糖素肽还具有其它作用。例如，它们还具有以下作用：降低胰高血糖素产生、增加饱感或减少食物摄取和延缓胃排空。另外，它们可具有改进胰岛素敏感性的作用，并且它们可增加胰岛细胞再生—形成新胰岛。
虽然许多餐后激素具有肠降血糖素样活性，但是主要的肠降血糖素肽包括葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(亦称为抑胃多肽(GIP))、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)和毒蜥外泌肽(exendin peptide) (其是非内源性肠降血糖素模拟物)。GIP和GLP-1两者属于胰高血糖素肽超家族。GLP-1由胃肠道中的特化细胞分泌，并且具有位于胰岛细胞以及其它组织上的受体。GLP-1在响应营养物摄取时从肠中分泌，这导致了胰岛素分泌提高。GLP-1的促胰岛素作用依赖于周围葡萄糖的升高。GLP-1被遍在酶二肽基肽酶IV (DPP-IV)快速灭活。毒蜥外泌肽-4与胰岛素分泌细胞上的GLP-1受体结合，在葡萄糖存在下刺激胰岛素分泌，而且该肽还阻抑胰高血糖素、延迟胃排空、增加饱感并减少食物摄取。有研究提出使用毒蜥外泌肽-4的促胰岛素活性治疗糖尿病和预防高血糖症(Eng，美国专利号5,424,286)。然而，与GLP-1不同，毒蜥外泌肽-4在人中具有相对较长的半寿期，而且在毒蜥外泌肽-4的较低浓度下还具有刺激胰岛素分泌的较强能力。
涉及代谢疾病和病症的肽激素的另一个家族是肽激素的淀粉样肽家族，例如淀粉样肽及其类似物，例如普兰林肽和davalintide。淀粉样肽分子具有两个转录后修饰：C端被酰胺化，2位和7位上的半胱氨酸交联形成N末端环。人淀粉样肽基因可读框的序列显示，在N端Lys密码子前存在Lys-Arg二碱性氨基酸蛋白水解切割信号，且在CLAIMS末端位置上的Lys-Arg蛋白水解信号之前存在Gly，这是被蛋白质酰胺化酶PAM酰胺化的一个典型序列(Cooper等, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989))。一般认为淀粉样肽延迟胃排空、阻抑胰高血糖素分泌并减少食物摄取，因此调节葡萄糖在循环中出现的速度。似乎补充胰岛素的作用，胰岛素调节葡萄糖从循环中消失及其被外周组织摄取的速度。这些作用受啮齿动物和人中的实验结论的支持，这就表明淀粉样肽通过至少3个独立机制在餐后葡萄糖控制中补充胰岛素的作用，所有这3种机制均影响葡萄糖出现的速度。在人的试验中，已表明淀粉样肽类似物普兰林肽减轻体重或减少体重增加。淀粉样肽模拟物在治疗代谢病况例如糖尿病和肥胖症中可以是有益的。淀粉样肽模拟物还可用于治疗疼痛、骨病症、胃炎；调节脂质，特别是甘油三酯或影响机体组成，例如优先损失脂肪并节省瘦组织。
代谢疾病和病症呈许多形式，包括肥胖症、糖尿病、血脂异常(dyslipidemia)、胰岛素抵抗、细胞凋亡等。肥胖症及其相关病症在美国和全世界是普遍和非常严重的公共卫生问题。上身肥胖是已知的2型糖尿病的最强风险因子，并且是心血管疾病的强风险因子。肥胖症是公认的以下疾病的风险因子：糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖障碍例如多囊性卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌及全身麻醉并发症发病率增加(参见例如Kopelman，Nature 404：635-43 (2000))。肥胖症缩短寿命并带有上述共发病以及以下病症的严重风险：例如感染、静脉曲张、黑棘皮症、湿疹、运动不耐受(exercise intolerance)、胰岛素抵抗、高血压、高胆固醇血症、胆石病、矫形损伤(orthopedic injury)和血栓栓塞性疾病(Rissanen等, Br. Med. J. 301：835-7 (1990))。肥胖症亦为称为胰岛素抵抗综合征或“X综合征”的一组病况的风险因子。肥胖症目前是难治疗的、慢性的、基本难消除的代谢障碍。可用于患有或未患糖尿病的肥胖或体重超重个人减轻体重的治疗药物，可能对健康具有深远的有益作用。
糖尿病是一种碳水化合物代谢病症，以因胰岛素产生或利用不足引起的高血糖症和糖尿为特征。糖尿病严重影响发达国家中大部分人口的生命质量。胰岛素产生不足表征为1型糖尿病，而胰岛素利用不足为2型糖尿病。然而，目前普遍公认的是，有许多远在患者被诊断患有显性糖尿病之前就已发病的独特的糖尿病相关疾病。而且，糖尿病中因葡萄糖代谢控制低于最佳水平的作用引起大范围的相关的脂质和心血管病症。体重超重和肥胖症与糖尿病是普遍的严重共发病，在一些情况下，可导致糖尿病或增加糖尿病的倾向。
血脂异常，或血浆中脂蛋白水平异常，在糖尿病患者中常见。血脂异常的特征通常是血浆甘油三酯升高、HDL (高密度脂蛋白)胆固醇低、LDL (低密度脂蛋白)胆固醇水平正常至升高和血液中小致密LDL (低密度脂蛋白)颗粒水平升高。血脂异常是糖尿病受试者中冠状动脉事件和死亡发生率升高的主要促成因素之一。流行病学研究通过表明当与非糖尿病受试者相比时，糖尿病受试者的冠状动脉性死亡增加好几倍，来证实了这一点。已对糖尿病受试者中若干脂蛋白异常情况进行了描述。
治疗与糖尿病有关的多种异常情况的尝试促使为了在不同患者中解决这些异常情况而给予若干抗糖尿病药。抗糖尿病药的实例为蛋白质例如胰岛素和胰岛素类似物及小分子例如胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌素和食欲调节化合物，其通常共同给予以解决可能的多种异常情况。
仍需要开发可用于上述代谢疾病、病况和病症的多肽。因此，本发明的一个目的是提供可用于治疗本文所述疾病和病况的多肽及用于产生和使用所述多肽的方法。
概述
总的来讲，本发明涉及新的多肽缀合物，所述多肽缀合物具有多种药理作用，可供其用作治疗和预防代谢疾病和病症的药物，所述代谢疾病和病症可通过以下方面得到缓解：控制血浆葡萄糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌和/或进一步通过增加体重减轻、减轻体重、保持体重、防止体重增加、减少食物摄取、增加饱感、降低食欲和/或通过节省瘦质量(lean-sparing)但消耗脂肪或者通过存在于本文所述多肽缀合物中的葡萄糖/胰岛素控制和体重减轻/食物摄取控制性质的组合而改善机体组成。这类病况和疾病包括高血糖症和高血糖症相关病况、糖尿病和糖尿病相关病况、肥胖症和体重超重以及其中葡萄糖/胰岛素控制相关疾病或病况和体重减轻/食物摄取相关疾病或病况两者均存在的病况。此外，这类病况和病症包括但不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖症和任何类型的糖尿病，包括1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病及其组合。本发明的多作用化合物还应用于其中常常在不存在显性糖尿病时高血糖症是主要因素，而且其中存在或可发生体重超重或肥胖症的病况，像例如类固醇诱发性糖尿病、人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病、成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、在患有先天性或HIV相关性脂肪萎缩或“脂肪重新分配综合征(Fat Redistribution Syndrome)”的受试者中的的糖尿病发展和代谢综合征(X综合征)。
现已意外地发现，与艾塞那肽即毒蜥外泌肽-4 (在美国和欧洲已获准用于治疗糖尿病的一种GLP-1受体激动剂)相比，并且与之前已知的缀合物肽构建体相比，抗糖尿病多肽缀合物可具有类似或改进的葡萄糖降低作用，而且此外还具有改进的体重减轻和/或食物摄取减少的作用。本文公开内容以这个发现为基础。本发明的多肽缀合物提供至少两种药理作用，例如本文所述的葡萄糖/胰岛素控制和体重/食物摄取控制，以提供优良的治疗益处，例如以协同方式起作用以改善多种代谢功能和异常情况或使多种代谢功能和异常情况正常化。
本文提供本文所述的包含与淀粉样肽模拟物肽缀合的GLP-1受体激动剂肽的多肽缀合物化合物1A和化合物2A。该多肽缀合物在GLP-1受体上具有毒蜥外泌肽-4的激动作用，并在C1a受体上具有davalintide (淀粉样肽模拟物)的激动作用，以与毒蜥外泌肽-4或davalintide相比提供至少所需要的葡萄糖和胰岛素控制与体重减轻和/或食物摄取的优良控制。
在一些实施方案中，本文所述的多肽缀合物优于相应的参比化合物(例如艾塞那肽或davalintide)或者相应的具有不同GLP-1受体激动剂组分和/或不同淀粉样肽模拟物组分的参比缀合物化合物，例如本文所述化合物3A和化合物7A。在这种情况下，术语“优良的”是指可在疾病或病症治疗的评价中进行衡量的各种功能性质。例如，对于最大功效，本文所述多肽缀合物可能需要较低剂量，例如为相应参比化合物剂量的1X、1/2X、1/3X、1/4X、1/5X或甚至更低。对于其它实例，本文所述多肽缀合物可具有较高的功效，例如1.5X、2X、3X、4X、5X、10X、20X、50X或甚至更高的功效。对于其它实例，本文所述多肽缀合物可具有参比化合物中未以显著程度存在的功能。
还要理解的是，本文所述多肽缀合物包括已化学衍生化的多肽缀合物。这类衍生化肽包括与一个或多个聚合物部分(例如聚乙二醇(PEG)或不同长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰等))或者通过加入聚氨基酸(例如聚his、聚arg、聚lys和聚ala)缀合。修饰还可包括小分子部分，例如短烷基和约束烷基(例如支链烷基、环状烷基、稠合烷基、金刚烷基)和芳基。聚合物部分的分子量通常可为约500-约60,000道尔顿。聚合物可以是线性的或支链的。这种衍生化可发生在N端或C端或者氨基酸残基的侧链上，例如多肽缀合物内的赖氨酸ε氨基、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸巯基。或者，衍生化可以发生在整个缀合物多肽的多个位点上。为了提供用于衍生化的一个或多个位点，可使一个或多个氨基酸用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代，或者加入赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。参见例如美国专利5824784和5824778，其通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，多肽缀合物可与1、2或3个聚合物部分缀合。将多肽缀合物聚乙二醇化可提高其水溶性、延长血浆半寿期、降低免疫原性和/或改进口服摄取。在一个实施方案中，聚乙二醇化多肽缀合物包含通过赖氨酸ε氨基与赖氨酸侧链共价连接的聚乙二醇部分，在又一个实施方案中，PEG部分的总分子量为至少约10,000道尔顿、至少约20,000道尔顿、至少约40,000道尔顿或至少约60,000道尔顿。在一个实施方案中，PEG链的分子量大于10,000且小于或等于60,000道尔顿。
多肽缀合物可用于治疗目的(例如治疗糖尿病)；用于研究目的；以及产生改进了GLP-1受体结合活性和/或改进了体内葡萄糖降低活性和/或改进了淀粉样肽模拟物活性和/或改进了体重减轻/食物摄取控制活性的GLP-1受体激动剂化合物，例如具有较长的持续作用时间、溶解度提高和/或免疫原性降低的衍生物。本公开内容提供包含治疗有效量的多肽缀合物的药物组合物。本公开内容还提供用于合成多肽缀合物的方法。
本公开内容提供在有需要的受试者中通过给予治疗有效量的本文所述多肽缀合物而用于以下方面的方法：治疗糖尿病、治疗胰岛素抵抗、治疗餐后高血糖症、降低血糖水平、降低HbA1c水平、刺激胰岛素释放、减少胃能动性、延迟胃排空、减少食物摄取、降低食欲、减轻体重、治疗体重超重和/或治疗肥胖症。本公开内容还提供在有需要的受试者中通过给予治疗有效量的本文所述多肽缀合物而用于治疗高血糖症和高血糖症相关病况、糖尿病和糖尿病相关病况、肥胖症和体重超重以及其中葡萄糖/胰岛素控制相关疾病或病况和体重减轻/食物摄取相关疾病或病况两者均存在的病况的方法。本公开内容还提供在有需要的受试者中通过给予治疗有效量的本文所述多肽缀合物而用于治疗高血压、血脂异常、心血管疾病、进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖症和任何类型的糖尿病、包括1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病及其组合的方法。本公开内容还提供在有需要的受试者中通过给予治疗有效量的本文所述多肽缀合物而用于治疗类固醇诱发性糖尿病、人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病、成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、患有先天性或HIV相关性脂肪萎缩或“脂肪重新分配综合征”的受试者中的糖尿病发展和代谢综合征(X综合征)的方法。
多肽缀合物可与另外的抗糖尿病药和/或抗肥胖症药共同给予。所谓“共同给予”意指作为单一组合物的两种或更多种活性剂给予、作为单独的溶液剂同时给予、或者可在彼此不同的时间给予，例如在彼此相隔4、8或12小时内(以避免例如由于多肽缀合物延迟胃排空作用所引起的对第二种药物摄取的干扰)。多肽缀合物与第二种药物的确切比率将是部分依赖性的，由医师和受试者的需要确定。
多肽缀合物可以适宜受试者使用的药盒提供，其中药盒装有使用多肽缀合物的说明书。
附图简述
图 1A 和 1B ：图 1A是表示以实施例中所述的显示在图1A中的量给予化合物2A或其它化合物的DIO (饮食诱导的肥胖)大鼠的体重变化的柱状图。图 1B是表示以实施例中所述的显示在图1B中的量给予化合物1A或所述化合物的DIO大鼠体重变化的柱状图。未共用上标的组彼此显著不同；p<0.05，例如图1A和1B的溶媒对照彼此无显著不同。
图 2A 和 2B ：图 2A是表示以实施例中所述的显示在图2A中的量给予化合物2A或其它化合物的DIO大鼠的总累积食物摄取的柱状图。图 2B是表示以实施例中所述的显示在图2B中的量给予化合物1A或其它化合物的DIO大鼠的总累积食物摄取的柱状图。未共用上标的组彼此显著不同；p<0.05，例如图2A和2B的溶媒对照彼此无显著不同。
图 3 ：图 3是显示以实施例中所述的显示在图3中的量给予化合物2A或其它化合物的DIO大鼠的肥胖变化的柱状图。未共用上标的组彼此显著不同；p<0.05。
图 4 ：图 4是显示以实施例中所述的显示在图4中的量给予化合物1A或其它化合物的DIO大鼠的肥胖变化的柱状图。未共用上标的组彼此显著不同；p<0.05。
图 5 ：图 5是显示以实施例中所述的显示在图5中的量给予化合物2A或其它化合物的DIO大鼠的瘦质量(lean mass)百分比变化的柱状图。
图 6 ：图 6是显示以实施例中所述的显示在图6中的量给予化合物1A或其它化合物的DIO大鼠的瘦质量百分比变化的柱状图。相对于溶媒*p<0.05。
图 7A 和 7B ：图 7A 和 7B是显示对于本文所述长期DIO大鼠研究的化合物1A、化合物2A和化合物3A，在第14天(图7A)和在第28天(图7B)所测量的血浆药物水平(PK性质)与体重减轻(PD性质)相关的曲线图。
发明详述
“GLP-1受体激动剂化合物”是指当用本领域已知方法(例如本文所述受体结合研究、cAMP产生或体内血糖和/或胰岛素分泌测定)以及按照Hargrove等，Regulatory Peptides, 141:113-119 (2007) (其公开内容通过引用结合到本文中)评价时，诱导毒蜥外泌肽参比肽(例如毒蜥外泌肽-4)或GLP-1(7-37)参比肽的生物活性的化合物。GLP-1受体激动剂化合物包括例如天然的毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、天然的GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1(7-37)和GLP-1(7-37)类似物。
术语“毒蜥外泌肽”包括大毒蜥(Gila monster)唾液分泌物中存在的天然存在的毒蜥外泌肽(或其合成形式)。毒蜥外泌肽包括酰胺化形式、酸形式、药学上可接受的盐形式和所述分子的任何其它生理活性形式。在一个实施方案中，术语毒蜥外泌肽可与术语“毒蜥外泌肽激动剂”互换使用。
“毒蜥外泌肽类似物”是指当用本领域已知方法(例如本文所述受体结合测定法或体内血糖测定法)和按照Hargrove等, Regulatory Peptides, 141:113-119 (2007)评价时，诱导类似于毒蜥外泌肽参比肽(例如毒蜥外泌肽-4)的生物活性的肽、含有氨基酸取代、插入、缺失或添加、肽模拟物和/或其它修饰和/或其它化学部分的肽。毒蜥外泌肽类似物包括酰胺化形式、酸形式、药学上可接受的盐形式和所述分子的任何其它生理活性形式。在一个实施方案中，术语毒蜥外泌肽类似物可与术语“毒蜥外泌肽激动剂类似物”互换使用。
艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4)是目前治疗2型糖尿病所需的39个氨基酸胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)受体激动剂，并且在给予DIO大鼠时还发挥体重减轻和其它代谢作用。毒蜥外泌肽-4的序列如下：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 1)，其中-NH2表明存在C端酰胺化氨基酸。毒蜥外泌肽-4呈其游离酸形式时也有活性。Hargrove等, Regulatory Peptides, 141:113-119 (2007)，报道了是全长C端酰胺化的毒蜥外泌肽-4肽类似物的毒蜥外泌肽-4肽类似物，与天然的毒蜥外泌肽-4相比，在第14位具有单个核苷酸差异，其在本文被命名为化合物4A。Hargrove报道了就其延迟胃排空、抗肥胖症性质和半寿期而言，这种毒蜥外泌肽-4类似物化合物4A明显次于毒蜥外泌肽-4。化合物4A的序列如下：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 2)。另一种毒蜥外泌肽-4肽类似物在本文命名为化合物5，其是在14和28位具有氨基酸取代的毒蜥外泌肽-4头32个氨基酸接着非哺乳动物(蛙) GLP1 C端5个氨基酸序列的嵌合体。化合物5具有以下序列：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO: 3)。
本领域还已知毒蜥外泌肽-4的截短的生物活性形式毒蜥外泌肽-4(1-28)，其具有以下序列，在本文命名为化合物10：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN (SEQ ID NO: 4)；及其具有以下序列的命名为化合物10A的酰胺形式：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-NH2 (SEQ ID NO: 5)。
淀粉样肽是一种肽激素，在营养物摄取后与胰岛素一起由胰β-细胞共分泌，它的主要生理作用包括抑制摄食行为和胃排空，并随后减轻体重。Davalintide，亦称为“AC-2307”是一种淀粉样肽激动剂，据报道可用于治疗各种疾病适应症。参见WO 2006/083254和WO 2007/114838，其各通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。Davalintide是嵌合肽，具有淀粉样肽或降钙素及其类似物的N末端环区、降钙素或其类似物α-螺旋区的至少一部分的α-螺旋区或者具有淀粉样肽α-螺旋区和降钙素α-螺旋区或其类似物的一部分的α-螺旋区、以及淀粉样肽或降钙素的C端尾区。davalintide序列的氨基酸序列如下：KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 6)，其在本文命名为化合物6A。有报道指出，对于饮食诱导的肥胖(DIO)大鼠，由淀粉样肽和由给予化合物6A诱导的体重减轻的特征在于优先损失脂肪质量却保持瘦质量。
之前描述的毒蜥外泌肽类似物和淀粉样肽模拟物的缀合物包括具有以下序列的化合物3A：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 7)，其中多肽是C端酰胺化的，而化合物7A具有以下序列：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN(β-A)(β-A)KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 8)，其中多肽是C端酰胺化的，并含有β-丙氨酸,β-丙氨酸非天然氨基酸二肽接头。上述化合物包含有活性的毒蜥外泌肽-4的C端截短形式即化合物10A毒蜥外泌肽-4(1-28)酰胺：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-NH2 (SEQ ID NO: 5)。
本发明以本文所述特定多肽缀合物的优良作用的出人意料的结果为基础，所述多肽缀合物包含与davalintide化合物6A共价连接的特殊的毒蜥外泌肽-4肽类似物。多肽缀合物是本文所述化合物1A和化合物2A及其化学衍生物，例如聚乙二醇化衍生物。与毒蜥外泌肽-4或davalintide相比，该多肽缀合物在GLP-1受体上具有毒蜥外泌肽-4的激动作用并且在C1a受体上具有davalintide (淀粉样肽模拟物)的激动作用，以至少提供葡萄糖控制与优良的体重减轻/食物摄取控制。与已知的缀合物和亲本肽相比，所述化合物具有优良的葡萄糖控制与出乎意料的优良的体重控制以及优良的药代动力学性质。多肽缀合物具有诱导糖调节和体重减轻的GLP-1受体激动作用与诱导脂肪特异性体重减轻的淀粉样肽模拟物活性的组合，然而却具有优于任一亲本肽或该类型的已知缀合物的优良性质，例如较大的治疗功效、改进的半寿期。
本发明的术语“多肽缀合物”是指化合物1A和化合物2A，其是C端酰胺化的，包括其酸形式、其药学上可接受的盐形式和化合物1A或化合物2A的任何其它生理活性形式，包括化学修饰衍生物，例如聚乙二醇化或脂肪酰化衍生化以延长血浆半寿期或改进口服摄取。
本文所述化合物1具有以下序列HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 9)。其C端酰胺化形式是化合物1A，一种本发明的多肽缀合物，具有序列HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 10)。化合物1A是化合物4A与化合物6A通过甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸肽接头符合读框地共价连接的多肽缀合物。化合物2具有以下序列HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 11)。其C端酰胺化形式是化合物2A，一种本发明的多肽缀合物，具有序列HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 12)。化合物2A是化合物5与化合物6A通过甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸肽接头符合读框地共价连接的多肽缀合物。
本研究表征了化合物1A和化合物2A的代谢作用和pK，所述化合物包含与淀粉样肽模拟物davalintide (化合物6A)共价连接的毒蜥外泌肽-4的类似物。正如实施例中公开的一样，在饮食诱导的肥胖(DIO)雄性Sprague Dawley大鼠中，将4周连续皮下输注化合物1A和化合物2A (以3、10、30和100 nmol/kg/天)的作用与单独和共同给予亲本肽化合物6A、化合物5和化合物4A (以2.8、15和7.2 nmol/kg/；体重减轻的最大有效剂量)的进行比较。简单地说，在DIO大鼠中，相对于单独给予亲本肽，化合物1A和化合物2A对于体重减轻更有效，其中与化合物2A相比，化合物1A具有较大的体重减轻的效力和功效。与溶媒对照相比，化合物1A和化合物2A剂量依赖性地减轻体重。由化合物1A或化合物2A诱导的体重减轻与脂肪质量百分比显著降低有关(以100 nmol/kg/天剂量：化合物2A为-12.2 ± 1.3%，化合物1A为-15.5 ± 2.2%；两者相对于溶媒对照的p<0.05)。化合物2A不改变瘦质量百分比，然而化合物1A的所有剂量通过提高相对于溶媒对照的瘦质量百分比来改善机体组成。在受测的最高剂量下，与单独给予亲本肽相比，化合物1A和化合物2A两者显著降低总的食物摄取。在化合物1A的最高剂量下，食物摄取受阻抑，超过共同给予亲本化合物化合物4A和化合物6A所受的阻抑。28天后，用化合物2A治疗观察到葡萄糖、血红蛋白A1c (HbA1c)百分比、胰岛素、总胆固醇或HDL胆固醇无变化。同样地，在28天后，化合物1A对总胆固醇或HDL胆固醇或HbA1c水平无明显作用。然而，与溶媒对照相比，在一些剂量下，化合物1A显著降低血浆胰岛素和葡萄糖水平。治疗28天后与溶媒相比，化合物1A和化合物2A显著降低血浆甘油三酯。在2和4周治疗后，以与治疗剂量相应的递增水平，检测到通过特异性免疫测定法测量的化合物1A和化合物2A的血浆水平。
化合物1A和化合物2A两者以剂量依赖性方式诱导显著体重减轻，在所测较高剂量下，超过作为单一肽治疗给予的最大有效剂量的亲本激素诱导的体重减轻。由各种多肽缀合物的最高剂量(100 nmol/kg/天)诱导的体重减轻接近30% (溶媒校正的)，并等于(例如化合物2A)或大于(例如化合物1A)通过共同输注亲本肽所达到的体重减轻。与亲本化合物相比，现有的参比缀合物化合物(例如化合物3A和化合物7A)在减轻体重方面尽管功效增加，但效力显著较低。在出人意料的对比中，化合物1A和化合物2A显示比化合物3A和化合物7A优良的效力。虽然用100 nmol/kg/天的化合物3A和化合物7A仅实现体重减轻约20%，但仅用10 nmol/kg/天的化合物1A和化合物2A便达到类似的体重减轻。此外，与溶媒对照相比，化合物1A或化合物2A各自3 nmol/kg/天的最低剂量在4周时间内诱导显著的体重减轻为约11-19%，类似于化合物6A (12%)、化合物4A (14%)和化合物5 (17%)的体重减轻。对于体重减轻，化合物1A也比化合物2A更有效(分别为-37%与-28%)。
由化合物1A和化合物2A诱导的体重减轻与食物摄取的剂量依赖性减少有关。另外，化合物1A治疗与脂肪质量减少和瘦质量同时保存、机体组成改进有关。虽然对照DIO大鼠不是血胰岛素过多或糖尿病性的，但用化合物1A以及用单独或共同给予的亲本肽观察到对减少胰岛素、不出意料地对葡萄糖或HbA1c的适度作用。
采用特异性测定法，在实施例中描述的大鼠研究的第14天和第28天测量了化合物1A和化合物2A的血浆水平。虽然在两种多肽缀合物中观察到大致剂量依赖性增加，但是化合物2A的水平似乎比化合物1A的水平高得多，尤其28天后。然而，当将PK特征与各化合物的药理(PD)特征比对时，化合物2A的PD作用不扩展以与其PK特征相对应。换句话说，虽然化合物2A可能在研究期间在血清中蓄积，但与化合物1A相比其PD作用减小。虽然无意受理论束缚，但这种不一致可能表示针对化合物2A的抗体提早发生。即使这种差异是由于在化合物2A PK测定中的一些干扰(血浆抗体)所致，但在比较中化合物1A的PD和PK特征的同时扩展也提供了化合物1A优于化合物2A的另一个重要的出乎意料的优良性质。总之，化合物1A和化合物2A在DIO大鼠中实现优于化合物3A的明显的脂肪特异性体重减轻，其中化合物1A优于其它两种化合物。与参比化合物和缀合物相比，显示极高程度的效力和功效的化合物1A治疗还表明对其它代谢参数(包括甘油三酯降低作用和抗糖尿病作用)的改进，以及没有恶心或恶心减少(参见实施例)。
在一个实施方案中，本文所述多肽缀合物包括已化学衍生化的多肽缀合物。这类衍生化多肽缀合物包括与一个或多个聚合物部分(例如聚乙二醇(PEG)或不同长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰等))或者通过加入聚氨基酸(例如聚his、聚arg、聚lys和聚ala)缀合。修饰还可包括小分子部分，例如短烷基和约束烷基(例如支链烷基、环状烷基、稠合烷基、金刚烷基)和芳基。聚合物部分的分子量通常可为约500-约60,000道尔顿。聚合物可以是线性或支链的。这类衍生化可发生在多肽缀合物内的N端或C端或者氨基酸残基的侧链，例如赖氨酸ε氨基、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸巯基。或者，衍生化可发生在整个缀合物多肽的多个位点。为了提供用于衍生化的一个或多个位点，可将一个或多个氨基酸用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代，或者可加入赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。参见例如美国专利5824784和5824778，其通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，多肽缀合物可与1、2或3个聚合物部分缀合。在一个实施方案中，化合物与一个聚乙二醇连接。使多肽缀合物聚乙二醇化可改进其水溶性、延长血浆半寿期、降低免疫原性和/或改进口服摄取。聚乙二醇的分子量可为约200道尔顿-约80,000道尔顿、约5,000道尔顿-约60,000道尔顿、约10,000道尔顿-约50,000道尔顿或约15,000道尔顿-约40,000道尔顿。聚乙二醇可以是线性或支链的。在一个实施方案中，聚乙二醇化多肽缀合物包含通过赖氨酸ε氨基与赖氨酸侧链共价连接的聚乙二醇部分。在又一个实施方案中，PEG部分的总分子量为至少约10,000道尔顿、至少约20,000道尔顿、至少约40,000道尔顿或至少约60,000道尔顿。
在一个实施方案中，化合物与一个或两个聚乙二醇连接，其中聚乙二醇又与亲脂部分连接。在一个实施方案中，在这种情况下的聚乙二醇的分子量可为约200-约7,000道尔顿或约500-约5,000道尔顿。亲脂部分可以是烷基(例如C1-20烷基、C1-10烷基、C1-6烷基、C1-4烷基)、脂肪酸(例如C4-28脂肪酸链、C8-24脂肪酸链、C10-20脂肪酸链)、胆固醇基、金刚烷基等。烷基可以是线性或支链的，优选线性的。在一个实施方案中，脂肪酸是乙酰化脂肪酸或酯化脂肪酸。-(聚乙二醇)-(亲脂部分)可在C端氨基酸残基、N端氨基酸残基、内部氨基酸残基(例如内部Lys氨基酸残基)或其组合与化合物连接(例如化合物在N端和C端氨基酸残基上连接)。在这类实施方案中，与未衍生化化合物1A或化合物2A相比，衍生物具有优良的口服摄取和生物利用度。
在一个实施方案中，所述化合物与聚氨基酸连接。示例性聚氨基酸包括聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸等。聚氨基酸可呈D型或L型，优选为L型。聚氨基酸可包含1-12个氨基酸残基、2-10个氨基酸残基或2-6个氨基酸残基。与未衍生化化合物1A或化合物2A相比，衍生物可提供增强的持续作用时间。
在一个实施方案中，化合物与脂肪酸连接。脂肪酸可以是C4-C28脂肪酸链、C8-C24脂肪酸链或C10-C20脂肪酸链。在一个实施方案中，脂肪酸是乙酰化脂肪酸。在一个实施方案中，脂肪酸是酯化脂肪酸。与未衍生化化合物1A或化合物2A相比，衍生物可提供增强的持续作用时间。
在一个实施方案中，所述化合物与白蛋白连接。白蛋白可以是重组白蛋白、血清白蛋白或重组血清白蛋白。在另一个实施方案中，化合物与白蛋白-脂肪酸(即与脂肪酸连接的白蛋白)连接。与未衍生化化合物1A或化合物2A相比，所述衍生物可提供增强的持续作用时间。
在一个实施方案中，所述化合物与免疫球蛋白或免疫球蛋白Fc区连接。免疫球蛋白可以是IgG、IgE、IgA、IgD或IgM。在一个实施方案中，化合物与IgG Fc区或IgM Fc区连接。免疫球蛋白Fc区是(i)免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)；(ii)免疫球蛋白的重链恒定区3(CH3)或(iii)免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和3(CH3)两者。免疫球蛋白Fc区还可包含重链恒定区上的铰链区。可与毒蜥外泌肽类似物肽连接的免疫球蛋白Fc区的其它实施方案描述于WO 2008/082274，其公开内容通过引用结合到本文中。与未衍生化化合物1A或化合物2A相比，所述衍生物可提供增强的持续作用时间。
当本文所述多肽缀合物与一种或多种聚合物(例如本文所述聚合物)共价连接时，可以使用本领域已知的任何连接基团。连接基团可包含适于将肽与聚合物连接的任何化学基团。或者，可将多肽缀合物与聚合物直接连接而无需任何连接基团。示例性连接基团包括氨基酸、马来酰亚胺基、二羧酸基、琥珀酰亚胺基或者其两种或更多种的组合。用于将肽与一种或多种聚合物连接的方法是本领域已知的，描述于例如美国专利号6,329,336、美国专利号6,423,685、美国专利号6,924,264、WO 2005/077072、WO 2007/022123、WO 2007/053946、WO 2008/058461和WO 2008/082274，其公开内容通过引用结合到本文中。
所给予的多肽缀合物可呈前药形式。术语“前药”是指是药物前体的化合物，在给药后，体内通过某些化学或生理过程(例如蛋白水解切割)或者在达到特定pH环境时释放药物。
本文所述多肽缀合物可采用本领域已知的生物、化学和/或重组DNA技术制备。示例性方法描述于美国专利号6,872,700、WO 2007/139941、WO 2007/140284、WO 2008/082274、WO 2009/011544和美国公布号2007/0238669，其公开内容通过引用结合到本文中。本文给出了用于制备多肽缀合物的其它方法。
可采用标准固相肽合成技术，例如自动化或半自动化肽合成仪，制备本文所述的多肽缀合物。通常，采用这类技术，在室温下在惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷等)中，在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并-三唑等)存在下，在碱(例如二异丙基乙胺等)存在时，使α-N-氨甲酰基保护的氨基酸与连接至树脂上的延伸肽链的氨基酸偶联。使用试剂(例如三氟乙酸、哌啶等)，从所得肽-树脂上脱去α-N-氨甲酰基保护基，重复偶联反应，使下一个所需的N-保护的氨基酸加到肽链上。合适的N-保护基是本领域众所周知的，例如叔丁氧基羰基(tBoc)、芴基甲氧羰基(Fmoc)等。用于肽合成仪的溶剂、氨基酸衍生物和4-甲基二苯甲基-胺树脂可购自Applied Biosystems Inc. (Foster City，Calif.)。
对于化学合成，固相肽合成可用于所述多肽缀合物，因为固相合成一般是对于工业规模具有优良可伸缩性的直接方法，并且通常与相对长的多肽缀合物相容。可采用具有加帽反应(capping)的NMP/HOBt (选项1)系统和tBoc或Fmoc化学法(参见Applied Biosystems的ABI 430A肽合成仪用户手册，1.3B版，1988年7月1日，第6节，第49-70页，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif.)，用自动肽合成仪(430A型，Applied Biosystems Inc.，Foster City，Calif.)进行固相肽合成。Boc-肽-树脂可用HF切割(-5℃-0℃，1小时)。可用交替的水和乙酸从树脂上提取肽，将滤液冻干。可按照标准方法(例如Introduction to Cleavage Techniques，Applied Biosystems，Inc.，1990，第6-12页)切割Fmoc-肽树脂。还可采用Advanced Chem Tech合成仪(MPS 350型，Louisville，Ky.)装配肽。
可采用Waters Delta Prep 3000系统，通过RP-HPLC (制备型和分析型)纯化肽。可使用C4、C8或C18制备柱(10μ，2.2X25 cm；Vydac，Hesperia，Calif.)分离肽，并可使用C4、C8或C18分析柱(5μ，0.46X25 cm；Vydac)测定纯度。可以1.0 ml/分钟的流速将溶剂(A=0.1% TFA/水和B=0.1% TFA/CH3CN)递送至分析柱，以15 ml/分钟递送到制备柱。可在Waters Pico Tag系统中进行氨基酸分析，并应用Maxima程序处理。可通过汽相酸解(115℃，20-24小时)使肽水解。水解产物可通过标准方法衍生化并进行分析(Cohen等，The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, 第11-52页, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989))。快速原子轰击分析可通过M-Scan，Incorporated (West Chester，Pa.)进行。质量校准可使用碘化铯或碘化铯/甘油进行。可在Applied Biosystems Bio-Ion 20质谱仪上进行使用飞行检测时间的等离子体解吸电离分析。
非肽多肽缀合物可通过本领域已知方法制备。例如，含有磷酸酯的氨基酸和含有这类氨基酸的肽可采用本领域已知方法制备，例如参见Bartlett等, Biorg. Chem., 14:356-377 (1986)。
或者，多肽缀合物可通过本领域众所周知的重组技术制备。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor (1989)。通过重组技术产生的这些多肽缀合物可由多核苷酸表达。本领域技术人员应了解的是，编码这类多肽缀合物的多核苷酸(包括DNA和RNA)可获自野生型cDNA，例如毒蜥外泌肽-4、淀粉样肽，要考虑密码子使用的简并性，并且可按所需进一步改造以掺入规定的取代。这些多核苷酸序列可掺入有利于mRNA在微生物宿主中转录和翻译的密码子。可按照本领域众所周知的方法容易地构建这类制备序列。参见例如WO 83/04053。上述多核苷酸还可任选编码N端甲硫氨酰残基。可用于本发明的非肽多肽缀合物可通过本领域已知方法制备。例如，含有磷酸酯的氨基酸和含有这类氨基酸的肽可采用本领域已知方法制备。参见例如Bartlett和Landen, Bioorg. Chem. 14：356-77 (1986)。
可利用各种表达载体/宿主系统含有并表达多肽缀合物编码序列。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。可用于重组蛋白质生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。本文描述了用于蛋白质的重组表达的示例性方案。
因此，多核苷酸序列可用于产生新的和有用的病毒和质粒DNA载体、新的和有用的转化和转染的原核和真核宿主细胞(包括生长在培养物中的细菌、酵母和哺乳动物细胞)以及用于能够表达本发明缀合物多肽的这类宿主细胞的培养生长的新的和有用的方法。在其中多肽缀合物产生不足可被减缓或者对所述多肽缀合物的水平提高的要求可被满足的情况下，本文编码多肽缀合物的多核苷酸序列可用于基因疗法。
本发明还提供用于本发明缀合物多肽的重组DNA生产的方法。本发明提供用于自含有编码所述多肽缀合物的核酸的宿主细胞产生多肽缀合物的方法，所述方法包括：(a)将含有编码所述多肽缀合物的多核苷酸的所述宿主细胞在有利于所述DNA分子表达的条件下培养；和(b)获得所述缀合物多肽。
宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括细菌细胞、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞或其它细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
用于重组蛋白质表达的哺乳动物宿主系统也为本领域技术人员所熟知。可针对加工已表达的蛋白质或产生可用于提供蛋白质活性的某些翻译后修饰的特定能力选择宿主细胞品系。多肽的这种修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白质的“前原(prepro)”形式的翻译后加工，对于正确的插入、折叠和/或功能也可能是重要的。不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，具有针对这种翻译后活性的特殊细胞机器和特有机制，并可选择以确保正确修饰和加工所引入的外源蛋白质。
或者，可使用酵母系统以产生本发明的多肽缀合物。多肽缀合物DNA的编码区通过PCR扩增。使用含有α交配因子基因的核苷酸1-20的一种引物和与该基因的核苷酸255-235互补的另一种引物，在PCR反应中自酵母基因组DNA扩增编码酵母pre-pro-α前导序列的DNA (Kurjan和Herskowitz，Cell，30：933-43 (1982))。将pre-pro-α前导序列编码序列和多肽缀合物编码序列片段连接至含有酵母醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，使得该启动子指导由与成熟缀合物多肽融合的pre-pro-α因子组成的融合蛋白的表达。如Rose和Broach, Meth. Enz. 185：234-79，Goeddel主编，Academic Press，Inc.，San Diego，California (1990)的教导一样，载体还包括克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2-micron”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌(E. coli) β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别供在细菌和酵母中选择。leu-2d基因还有利于在酵母中增加质粒的拷贝数以诱导较高的表达水平。REP1和REP2基因编码参与调节质粒拷贝数的蛋白质。
采用已知方法，例如乙酸锂处理(Steams等, Meth. Enz. 185：280-97 (1990))，将在前段中描述的DNA构建体转化至酵母细胞中。在生长培养基中在葡萄糖耗尽时诱导ADH2启动子(Price等, Gene 55：287 (1987))。pre-pro-α序列实现融合蛋白自细胞中分泌。同时，酵母KEX2蛋白从成熟多肽缀合物切割pre-pro序列(Bitter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：5330-4 (1984))。
还可使用市售可获得的表达系统(例如毕赤酵母表达系统(Pichia Expression System) (Invitrogen，San Diego，California))，按照生产商的说明书，在酵母(例如毕赤酵母)中重组表达本发明的多肽缀合物。该系统也依赖pre-pro-α序列指导分泌，但在受甲醇诱导时，插入序列的转录受醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。通过例如用于自细菌和哺乳动物细胞上清液纯化所述多肽缀合物的方法，从酵母生长培养基中纯化分泌的多肽缀合物。
或者，可将编码多肽缀合物的DNA克隆至杆状病毒表达载体，例如pVL1393 (PharMingen，San Diego，California)中。然后，按照生产商的说明书(PharMingen)或已知技术，使用该缀合物-多肽编码载体感染例如在sF9无蛋白培养基中生长的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞并产生重组蛋白质。采用本领域已知方法，例如肝素-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)和序贯分子大小柱(sequential molecular sizing column) (Amicon，Beverly，Massachusetts)，将蛋白质从培养基中纯化出来后浓缩，并重新悬浮于合适的溶液(例如PBS)中。SDS-PAGE分析可用于例如通过显示证实所需缀合物蛋白质大小的单条带，来表征蛋白质，正如可进行完整氨基酸序列分析一样，例如在Proton 2090 Peptide Sequencer上进行Edman测序，或证实其N端序列。
例如，可将编码预测的成熟多肽缀合物的DNA序列克隆至含有所需启动子和任选前导序列的质粒中(参见例如Better等，Science 240：1041-3 (1988))。该构建体的序列可通过自动化测序证实。然后采用使用细菌的CaCl2孵育和热激处理的标准方法，将质粒转化至大肠杆菌MC1061菌株中(Sambrook等，同上)。使转化的细菌在补充了羧苄西林的LB培养基中生长，并通过在合适的培养基中生长诱导表达蛋白质的产生。如存在的话，前导序列将影响成熟多肽缀合物的分泌，并在分泌期间被切割。通过本文所述方法，从细菌培养基中纯化出分泌的重组多肽缀合物。
或者，多肽缀合物可在昆虫系统中表达。用于蛋白质表达的昆虫系统为本领域技术人员所熟知。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作在草地贪夜蛾细胞或在尺蠖(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。将多肽缀合物编码序列克隆至病毒的非必需区中，例如多角体蛋白基因中，并置于多角体蛋白启动子的控制下。多肽缀合物的成功插入可使多角体蛋白基因失活，并且产生没有外壳蛋白外壳的重组病毒。然后使用重组病毒感染草地贪夜蛾细胞或尺蠖幼虫，在其中表达本发明的多肽缀合物(Smith等, J. Virol. 46：584 (1983)；Engelhard等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：3224-7 (1994))。
在另一个实例中，编码多肽缀合物的DNA序列可通过PCR扩增并克隆至合适的载体中，例如，pGEX-3X (Pharmacia，Piscataway，New Jersey)。设计pGEX载体以产生融合蛋白，所述融合蛋白包含由该载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入该载体的克隆位点中的DNA片段编码的蛋白质。可产生用于PCR的引物以包括例如合适的切割位点。然后，可从融合蛋白的GST部分切割重组融合蛋白。将pGEX-3X/多肽缀合物构建体转化至大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，California)中，分离个体转化子，在37℃下培养在LB培养基(补充了羧苄西林)中至在波长600 nm下的光密度为0.4，接着在0.5 mM异丙基β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri)存在下进一步孵育4小时。来自各转化子的质粒DNA经纯化后，利用自动序列分析仪部分测序以证实所需缀合物多肽编码基因插入序列以正确方向存在。
融合蛋白当预期作为不溶性包含体在细菌中产生时，可如下纯化。细胞通过离心收获；在0.15 M NaCl、10 mM Tris、pH 8、1 mM EDTA中洗涤；并用0.1 mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)在室温下处理15分钟。裂解物通过超声处理澄清，通过在12,000xg下离心10分钟使细胞碎片沉淀。将含有融合蛋白的沉淀物重新悬浮于50 mM Tris (pH 8)和10 mM EDTA中，经50%甘油分层，于6000xg离心30分钟。将沉淀物重新悬浮于不含Mg++和Ca++的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中对重新悬浮的沉淀物进行分级分离，进一步纯化融合蛋白(Sambrook等，同上)。将凝胶浸入0.4 M KCl以观测蛋白质，将所述蛋白质切离并在没有SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果GST/多肽缀合物融合蛋白在细菌中作为可溶性蛋白质产生，则其可利用GST Purification Module (GST Purification Module) (Pharmacia Biotech)纯化。
可对融合蛋白进行消化以从成熟缀合物多肽上切割GST。将消化反应物(20-40 µg融合蛋白，20-30单位人凝血酶(4000 U/mg (Sigma)/0.5 mL PBS)在室温下孵育16-48小时，加载到变性SDS-PAGE凝胶上以分级分离反应产物。将凝胶浸泡在0.4 M KCl中以观测蛋白质条带。可采用自动序列分析仪(Applied Biosystems 473A型，Foster City，California)，通过部分氨基酸序列分析，确认与多肽缀合物的预期分子量对应的蛋白质条带的特性。
在本发明的多肽缀合物的重组表达的一个具体示例性方法中，可通过磷酸钙方法，用在pCMV载体(5’ CMV启动子，3’ HGH聚A序列)中含有多肽缀合物cDNA和pSV2neo (含有neo抗性基因)的质粒共转染293细胞。在一个实施方案中，在转染前，载体应用ScaI线性化。同样地，可以使用备选构建体，其使用类似的具有掺入的neo基因的pCMV载体。在含有0.5 mg/mL G418 (新霉素样抗生素)的生长培养基中有限稀释10-14天，从单个细胞克隆中选出稳定的细胞系。通过ELISA或蛋白质印迹法，针对多肽缀合物表达筛选细胞系，使高表达的细胞系扩繁用于大规模生长。
优选转化细胞用于长期、高产量的蛋白质生产，因此需要稳定表达。一旦这类细胞用含有选择标记以及所需表达盒的载体转化，则可使细胞在滋养培养基中生长1-2天后，将其转移到选择培养基中。设计选择标记以赋予对选择的抗性，且选择标记的存在可供成功表达所引入的序列的细胞生长和回收。可采用适于细胞的组织培养技术，使稳定转化的细胞的抗性块(clump)增殖。
可采用多种选择系统回收已被转化的用于重组蛋白质产生的细胞。这类选择系统包括但不限于分别位于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。同样地，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性；gpt，其赋予麦考酚酸抗性；neo，其赋予氨基糖苷抗性；还有G418，其赋予氯磺隆(chlorsulfuron)抗性；以及hygro，其赋予潮霉素抗性。可以是有用的其它选择基因包括可供细胞利用吲哚替换色氨酸的trpB或者可供细胞利用组氨醇(histinol)替换组氨酸的hisD。给出用于鉴定转化子的目测指示的标志物包括花色素苷、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS和萤光素酶及其底物萤光素。
可采用自动肽合成和重组技术两者的组合产生本发明的多肽缀合物。例如，本发明的多肽缀合物可含有修饰的组合，所述修饰包括缺失、取代、插入和通过聚乙二醇化(或其它部分，例如聚合物、脂肪酰基链、C端酰胺化)的衍生化。这类多肽缀合物可在各阶段产生。在第一阶段，可通过所述重组技术产生含有缺失、取代、插入及其任何组合的修饰的中间多肽缀合物。然后在任选的本文所述纯化步骤后，通过用合适的聚乙二醇化试剂(例如得自NeKtar Transforming Therapeutics，San Carlos，California)进行化学修饰，使中间多肽缀合物聚乙二醇化(或进行其它化学衍生化，例如酰化、C端酰胺化)，以得到所需要的多肽缀合物衍生物。本领域技术人员应了解的是，可推广上述方法以适于含有选自以下的修饰的组合的多肽缀合物：缺失、取代、插入、衍化和本领域众所周知和本发明预期的其它修饰方法。
可通过使用甘氨酸氨基酸-C端延伸的前体实现C端酰胺化，所述前体例如在酵母(例如毕赤酵母)中作为可分泌到培养基中的α-因子融合蛋白合成。在纯化后，可通过酶促酰胺化，例如肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)，将多肽缀合物前体的C端甘氨酸转化成酰胺。参见例如Cooper等, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)。另参见美国专利6319685，该专利通过引用结合到本文中，其教导了用于酶促酰胺化的方法，包括大鼠的α-酰胺化酶，其是足够纯的比活为至少约25 mU/mg蛋白质的α-酰胺化酶，并且充分不含蛋白水解杂质而适于与由天然来源纯化的或通过重组DNA技术产生的底物一起使用。
制剂。本公开内容还提供包含至少一种本文所述多肽缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。多肽缀合物可以治疗有效量的药物组合物存在，并可以提供用于治疗功效的最小血浆水平的量存在。
可提供含有本文所述多肽缀合物的药物组合物用于外周给予，例如胃肠外(例如皮下、静脉内、肌内)、局部、经鼻或口服给予。合适的药学上可接受的载体及其制剂描述于标准制剂专著，例如Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences；以及Wang等, Journal of Parenteral Science and Technology, 第10期技术报告，增刊42:2S (1988)。
本文所述多肽缀合物可以用于注射或输注的胃肠外组合物提供。例如，可将它们悬浮于水；惰性油，例如植物油(例如芝麻油、花生油、橄榄油等)或其它药学上可接受的载体中。在一个实施方案中，将多肽缀合物悬浮于水性载体中，例如悬浮于pH为约3.0-8.0或约3.0-5.0的等渗缓冲溶液中。组合物可通过常规灭菌技术灭菌，或者可无菌过滤。组合物可含有大致生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，例如pH缓冲剂。有用的缓冲液包括例如乙酸缓冲液。可以使用贮存库或“贮库”缓释制剂的形式，使得在皮下注射、透皮注射或其它递送方法后，在多个小时或多天内将治疗有效量的制剂递送至血流中。可使用氯化钠或其它药学上可接受的物质例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨糖醇)或者其它无机或有机溶质，实现所需等渗性。对于含有钠离子的缓冲液，氯化钠是特别优选的。
还可将多肽缀合物配制成药学上可接受的盐(例如酸加成盐)和/或其复合物。药学上可接受的盐在其给药浓度下是无毒盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐的酸加成盐。药学上可接受的盐可获自酸，例如盐酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸和奎尼酸。乙酸盐、三氟乙酸盐或盐酸盐盐形式特别用于本文。可通过在例如盐在其中不溶解的溶剂或介质中，或者在随后真空或通过冷冻干燥除去的溶剂(例如水)中，使产物的游离酸或碱形式与一当量或多当量的合适碱或酸反应，或者通过将现有盐的离子与合适的离子交换树脂中的另一离子交换，来制备这类盐。
还可使用载体或赋形剂以利于多肽缀合物的给予。载体和赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)或各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理上相容的溶剂。
如有需要，上述组合物的溶液可用增稠剂(例如甲基纤维素)增稠。它们可以乳化形式(油包水或水包油)制备。可采用多种药学上可接受的乳化剂的任一种，包括例如阿拉伯树胶粉、非离子型表面活性剂(例如Tween)或离子型表面活性剂(例如聚醚醇硫酸碱金属盐(alkali polyether alcohol sulfate)或聚醚醇磺酸碱金属盐，例如Triton)。
可按照广为接受的方法，通过将各成分混合来制备组合物。例如，可简单地将所选的组分在混合器或其它标准装置中混合以产生浓缩的混合物，然后通过加入水或增稠剂将其调整至最终浓度和粘度，以及或许加入缓冲液以控制pH或其它溶质以控制张度。
治疗本文所述疾病的本文所述多肽缀合物的治疗有效量通常可为约0.01 μg-约5 mg、约0.1 μg-约2.5 mg、约1 μg-约1 mg、约1 μg-约50 μg或约1 μg-约25 μg。或者，GLP-1受体激动剂多肽缀合物的治疗有效量可以70 kg受试者体重计为约0.001 μg-约100 μg或者以70 kg受试者体重计为约0.01 μg-约50 μg。这些治疗有效剂量可根据剂型一次/天、两次/天、三次/天、一次/周、每两周一次或一次/月给予。通过例如剂型(例如即释剂型或延释剂型)确定待给予的确切剂量。对于透皮、经鼻或口服剂型，剂量可增加约5倍-约10倍。
具有抗高血糖症性质与提高体重减轻性质的本文所述缀合多肽和包含所述缀合多肽的药物组合物可用于治疗本文所述的大量代谢疾病和病况，其中控制血糖水平以减轻、预防或治疗高血糖症和/或在控制体重减轻或食物摄取以预防、治疗或控制体重超重或肥胖症是有益的。治疗或预防高血糖症对于治疗或预防前驱糖尿病、葡萄糖耐量异常、胰岛素抵抗和糖尿病十分重要。糖尿病可以是I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。当这些病况(例如II型糖尿病或I型糖尿病)与例如由过食、应激、增重药物(例如胰岛素)或遗传异常或者本文所述的应为本领域临床医生所知的其它疾病和病况引起的体重超重或肥胖症或有体重超重或肥胖症倾向有关时，本发明的缀合多肽是非常有用的。在体重超重或肥胖症或者其倾向存在或不存在的情况下，用于治疗糖尿病的方法供将治疗有效量的一种或多种本文所述缀合多肽给予受试者(通常为有需要的受试者)以治疗受试者。本发明的多肽缀合物还应用于以下病况：其中高血糖症通常在不存在显性糖尿病的情况下是重要因素的病况，还有其中存在或可能发生体重超重或肥胖症的病况，例如类固醇诱发性糖尿病、人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病、成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、患有先天性或HIV相关性脂肪萎缩或“脂肪重新分配综合征”的受试者中的糖尿病发展以及代谢综合征(X综合征)。
肥胖症及其相关病症(包括体重超重)是美国和全世界普遍和严重的共同卫生问题。上身肥胖是已知的2型糖尿病的最强风险因子，并且是心血管疾病的强风险因子。肥胖症是公认的高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖障碍例如多囊性卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌以及全身麻醉并发症发生率增加的风险因子。参见例如Kopelman，2000，Nature 404:635-43。
肥胖症减少寿命，并且携带上文列举的共发病以及以下病症的严重风险：例如感染、静脉曲张、黑棘皮症、湿疹、运动不耐受、胰岛素抵抗、高血压、高胆固醇血症、胆石病、矫形损伤和血栓栓塞性疾病。参见例如Rissanen等，1990, Br. Med. J., 301:835-7。肥胖症还是称为胰岛素抵抗综合征或“X综合征”和代谢综合征的一类病况的风险因子。世界范围的肥胖症和相关病症的医疗费用巨大。
一般认为肥胖症的发病机制是多因素的。一个问题是在肥胖受试者中，直到有过量的脂肪组织，营养物可利用性和能量消耗才达到平衡。中枢神经系统(CNS)控制能量平衡，并协调与动物代谢状态相称的各种行为活动、自主活动和内分泌活动。控制这些活动的机制或系统遍及前脑(例如下丘脑)、后脑(例如脑干)和脊髓广泛分布。最后，来自这些系统的代谢信息(即养料可利用性)和认知信息(即经验偏好)被整合，参与食欲(食物寻求)和饮食(摄入)行为的决定被打开(膳食获取和开始)或关掉(膳食终止)。下丘脑被认为主要负责整合这些信号，然后向脑干发出命令。脑干核控制饮食运动控制系统的组分(例如负责咀嚼和吞咽的肌肉)。因此，这些CNS核在字面上被称为构成摄食行为的“最终共同路径”。
神经解剖学和药理证据证实，能量和营养稳态信号在前脑核整合以及饮食运动控制系统存在于脑干核中(可能存在于三叉神经运动核周围区域)。在下丘脑和脑干之间有广泛的相互连接。各种CNS定向的抗肥胖症治疗药(例如小分子和肽)主要集中在存在于下丘脑的前脑基质和/或存在于脑干的后脑基质。
肥胖症依旧是难治疗的、慢性的、基本上难消除的代谢障碍。因此，存在可在受试者中用于减轻体重和/或保持体重的新疗法的需要。这类疗法可对受试者的健康产生深远的有益作用。
糖尿病和心血管疾病。糖尿病被公认为复杂的慢性疾病，其中糖尿病患者总死亡病例的60%-70%是心血管并发症的结果。糖尿病不仅被视为冠心病风险等同因子，而且还被鉴定为不良事件的独立预测因子，所述不良事件包括复发性心肌梗死、充血性心力衰竭和心血管意外之后的死亡。可预期采用较严的葡萄糖控制和心血管风险因子的积极治疗降低冠心病并发症的风险，并改善糖尿病患者的总体生存率。但是，糖尿病患者遭受急性心肌梗死的可能性是非糖尿病患者的2-3倍，糖尿病患者比非糖尿病患者少活8-13年。
了解糖尿病/急性心肌梗死患者的高风险性质后，用于患有不稳定心绞痛或非ST升高心肌梗死(统称“ACS”)住院患者管理的美国心脏病学会/美国心脏协会(American College of Cardiology/American Heart Association，“ACC/AHA”)临床实践准则最近认识到住院糖尿病患者是需要积极管理高血糖症的特殊人群。准确地讲，准则声明应瞄准住院糖尿病/ACS患者的葡萄糖降低疗法以实现餐前葡萄糖小于10 mg/dL，最大每日指标小于180 mg/dL，且出院后血红蛋白A1c小于7%。
在全国范围的年长ACS患者的样品中，已经表明，糖尿病患者中30天死亡率的增加与在入院时具有较高葡萄糖值的患者相应。参见“Diabetic Coronary Artery Disease & Intervention,” Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, 2002年9月20日。有越来越多的证据表明，持续高血糖症而非入院时葡萄糖短暂升高与严重不良事件有关。虽然不易了解患者中高血糖症和血管风险的理想度量，但似乎住院期间的平均葡萄糖值最能预测死亡率。在一项遍及美国40家医院的ACS患者的独立研究中，发现与在入院时随机葡萄糖值相比，持续高血糖症更能预测住院死亡率。参见Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, 2002年9月21日。与入院时的葡萄糖值相比，对整个住院期内的葡萄糖控制的逻辑斯谛回归模型最能预测死亡率。在120 mg/dL范围内葡萄糖每增加10 mg/dL，住院期间死亡风险便增加几乎2倍。在持续糖尿病/ACS患者的一个较小组群中，随着入院后葡萄糖水平的增加，在一年中的死亡率分级增加。在医院环境中，ACC/AHA准则建议开始积极的胰岛素疗法以实现在住院期间降低血糖。
脂质调节疾病。正如本领域所知，脂肪营养不良的特征在于机体脂肪组织的异常或变性情况。血脂异常是血液中正常脂质组分的破坏。一般认为胰岛素水平长期升高可导致血脂异常。高脂血症是血液中存在脂质和/或脂蛋白水平升高或异常。下丘脑性闭经是其中因涉及下丘脑的问题所致月经停止几个月的病况。已经发现在患有下丘脑性闭经的女性中瘦蛋白替代疗法改善生殖、甲状腺和生长激素轴和骨形成标志物而又不引起不良作用。参见例如Oral等, N Engl J Med. 2004，351：959-962，987-997。脂肪肝病，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指从单纯的脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化(肝脏不可逆性晚期斑痕)的各种肝脏疾病。NAFLD的全部病期在肝脏细胞(肝细胞)中均具有共同的脂肪积累(脂肪浸润)。一般认为瘦蛋白是各种慢性肝脏疾病(包括NASH)中炎症和纤维变性进程的关键调节剂之一。参见例如Ikejima等, Hepatology Res. 33:151-154。
另外，虽不希望受任何理论的束缚，但是一般认为2型糖尿病中的相对胰岛素缺乏、葡萄糖毒性和通过从腹内脂肪组织经由门静脉的递送增加而增加的肝游离脂肪酸负荷意味着脂肪肝病症的可能原因。实际上，据假设进食行为是驱动肥胖代谢综合征及其许多必然结果(包括NASH)的关键因素。因此，治疗旨在减少食物摄取并增加少量膳食次数，因为在2型糖尿病中已经证实，可有效治疗和预防NASH。促进胰岛素分泌和体重减轻及延迟胃排空的药物还有效改善葡萄糖耐量，因此可改善脂肪肝及伴发的高胰岛素血症。因此，毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物激动剂、毒蜥外泌肽衍生物激动剂、特别是毒蜥外泌肽-4的使用可很好的适于作为这种病况的治疗方式。因此，本文所述多肽缀合物可用于治疗脂肪肝病症。
代谢X综合征。代谢X综合征的特征在于胰岛素抵抗、血脂异常、高血压和脂肪组织的内脏分布，并且在2型糖尿病的病理生理学中起关键作用。另发现它与NASH、纤维变性和肝硬化极相关。因此，本文所述多肽缀合物可用于治疗代谢X综合征。
类固醇诱发性糖尿病。众所周知糖皮质激素影响碳水化合物代谢。在响应外源糖皮质激素给予时，观察到外周组织中肝葡萄糖产生增加及胰岛素分泌和胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低。此外，正如本领域所知，糖皮质激素治疗改变胰岛素原(P1)/免疫反应性胰岛素(IRI)比率。在未患糖尿病的受试者中糖皮质激素诱导的高血糖症的典型特征包括空腹血糖升高最小、餐后高血糖症过大、对外源胰岛素不敏感和对二甲双胍或磺酰脲治疗无响应。因此，包括淀粉样肽、毒蜥外泌肽或davalintide生物活性(激素结构域(hormone domain))肽组分或其片段或类似物的本文所述多肽缀合物可用于治疗类固醇诱发性糖尿病。
人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病。在将人免疫缺陷病毒(HIV)-1蛋白酶抑制剂(PI)引入常规临床应用后不久，开始出现将PT应用与高血糖症的发生相关联的报告。虽然用PI治疗的HIV感染的受试者的约1%-6%将发生糖尿病，但相当较大的比例将发生胰岛素抵抗和葡萄糖耐量减低。因此，包括淀粉样肽、毒蜥外泌肽或davalintide生物活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物的本文所述多肽缀合物可用于治疗HIV治疗诱发的糖尿病。
成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)。一般认为约10%诊断为2型糖尿病的患者存在进行性自身免疫性糖尿病，亦称为成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)。LADA患者具有抗胰岛细胞胞质抗原的循环抗体，更通常具有抗谷氨酸脱羧酶的抗体。这些受试者具有1型和2型糖尿病两者特有的临床特征。虽然比起在自身免疫性糖尿病的急进性形式中，在慢进性形式中胰岛素分泌更好地保持，但是在LADA受试者中，胰岛素分泌趋于随时间恶化。因此，包括淀粉样肽、毒蜥外泌肽或davalintide生物活性(激素结构域)肽组分或其片段或类似物的本文所述多肽缀合物可用于治疗LADA。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于治疗胰岛素抵抗和刺激胰岛素释放。当这类病况还与体重超重或肥胖症或者体重超重或肥胖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于治疗胰岛素抵抗的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的胰岛素抵抗。用于治疗刺激胰岛素释放的方法可供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以刺激受试者的胰岛素释放。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于治疗餐后高血糖症。当这类病况还与体重超重或肥胖症或者体重超重或肥胖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于治疗餐后高血糖症的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的餐后高血糖症。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于降低血糖水平和降低HbA1c水平。当这类病况还与体重超重或肥胖症或者体重超重或肥胖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。当这类病症还与体重超重或肥胖症或者体重超重或肥胖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于降低血糖水平的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以降低受试者的血糖水平。在一个实施方案中，血糖水平可以是空腹血糖水平。用于降低HbA1c水平的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以降低受试者的HbA1c水平。HbA1c水平一般是受试者血糖水平的长期衡量。
本文还提供用于治疗例如I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病等糖尿病的方法，所述方法包括给予足以达到至少约50 pg/ml多肽缀合物的平均循环血浆水平或最小循环血浆水平持续以下一段时间的多肽缀合物：至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约3个月或至少约6个月。在一个实施方案中，所述方法包括给予足以达到以下平均循环血浆浓度或最小循环血浆浓度的多肽缀合物：至少约25 pg/ml、至少约50 pg/ml、至少约65 pg/ml、至少约75 pg/ml、至少约100 pg/ml、至少约150 pg/ml、至少约170 pg/ml、至少约175 pg/ml、至少约200 pg/ml、至少约225 pg/ml、至少约250 pg/ml、至少约350 pg/ml、至少约400 pg/ml、至少约450 pg/ml、至少约500 pg/ml、至少约550 pg/ml或至少约600 pg/ml多肽缀合物。在其它实施方案中，多肽缀合物的平均浓度或最小浓度介于至少约170 pg/ml和600 pg/ml之间或介于至少约170 pg/ml和350 pg/ml之间。在又一些实施方案中，多肽缀合物的平均血浆浓度或最小血浆浓度大于40 pmol/升、大于50 pmol/升、大于60 pmol/升、大于70 pmol/升、大于80 pmol/升、大于90 pmol/升、大于100 pmol/升、大于110 pmol/升、大于120 pmol/升、大于130 pmol/升、大于140 pmol/升或大于150 pmol/升。在更多的实施方案中，多肽缀合物的平均血浆浓度或最小血浆浓度大于40 pmol/升但小于150 pmol/升或大于40 pmol/升但小于80 pmol/升。在一个实施方案中，所述多肽缀合物是化合物1A或化合物2A、或化合物1A、或其衍生物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的浓度是产生的生物作用或治疗作用等同于用规定浓度的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、davalintide或毒蜥外泌肽加davalintide的组合观察到的生物作用或治疗作用的多肽缀合物的浓度，所述作用例如降低空腹葡萄糖、降低餐后葡萄糖波动(glucose excursion)、降低HbA1c等。在其它实施方案中，受试者需要或渴望减轻体重。在又一个实施方案中，受试者还需要控制体重/食物摄取，例如需要减轻体重、降低食欲、增加饱感、减少食物摄取、延缓胃排空、降低甘油三酯、改善机体组成或其任何组合、还任选减少恶心的发生率和/或严重程度。
其它实施方案提供降低HbA1c、总体日平均血糖浓度、空腹血糖和/或餐后血糖的方法，所述方法通过将量足以达到至少约50 pg/ml毒蜥外泌肽、多肽缀合物的平均循环血浆水平或最小循环血浆水平持续以下一段时间的多肽缀合物给予例如需要降低HbA1c、日平均血糖或空腹葡萄糖的受试者：至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约3个月或至少约6个月。在一个实施方案中，所述方法包括给予足以达到以下平均循环血浆浓度或最小循环血浆浓度的多肽缀合物：至少约25 pg/ml、至少约65 pg/ml、至少约75 pg/ml、至少约100 pg/ml、至少约150 pg/ml、至少约170 pg/ml、至少约175 pg/ml、至少约200 pg/ml、至少约225 pg/ml、至少约250 pg/ml、至少约350 pg/ml、至少约400 pg/ml、至少约450 pg/ml、至少约500 pg/ml、至少约550 pg/ml或至少约600 pg/ml的多肽缀合物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的平均浓度或最小浓度介于至少约170 pg/ml和600 pg/ml之间或介于至少约170 pg/ml和350 pg/ml之间。在又一些实施方案中，所述多肽缀合物的平均血浆浓度或最小血浆浓度大于40 pmol/升、大于50 pmol/升、大于60 pmol/升、大于70 pmol/升、大于80 pmol/升、大于90 pmol/升、大于100 pmol/升、大于110 pmol/升、大于120 pmol/升、大于130 pmol/升、大于140 pmol/升或大于150 pmol/升。在更多的实施方案中，所述多肽缀合物的平均血浆浓度或最小血浆浓度大于40 pmol/升但小于150 pmol/升或大于40 pmol/升但小于80 pmol/升。在一个实施方案中，所述多肽缀合物是化合物1A或化合物2A、或化合物1A或其衍生物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的浓度是产生的生物作用或治疗作用(例如降低HbA1c)等同于用规定浓度的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、davalintide或毒蜥外泌肽加davalintide的组合观察到的生物作用或治疗作用的多肽缀合物的浓度。在一个实施方案中，达到平均循环血浆浓度或最小循环血浆浓度持续约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在又一实施方案中，到达平均血浆浓度或最小血浆浓度持续约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周或约16周。在又一个实施方案中，达到平均血浆浓度或最小血浆浓度持续约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月。用于测定毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽激动剂或davalintide的循环血液浓度的任何方法可与所要求保护的方法一起使用。在其它实施方案中，受试者需要或渴望减轻体重。在又一个实施方案中，受试者还需要控制体重/食物摄取，例如需要减轻体重、降低食欲、增加饱感、减少食物摄取、延缓胃排空、降低甘油三酯、改善机体组成或其任何组合、还任选减少恶心的发生率和/或严重程度。
另外提供降低餐后血糖浓度相比于餐前血糖浓度的升高的方法，使得进餐前后血糖浓度之间的差异降低。这就导致了通过例如本文所述7点自我监测血糖测定的一日内的血糖浓度的变化减少。该方法包括给予多肽缀合物，其量足以达到多肽缀合物的平均循环血浆水平或最小循环血浆水平为至少约50 pg/ml持续至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约3个月或至少约6个月。在一个实施方案中，所述方法包括给予多肽缀合物，其足以达到以下平均循环血浆浓度或最小循环血浆浓度：至少约25 pg/ml、至少约65 pg/ml、至少约75 pg/ml、至少约100 pg/ml、至少约150 pg/ml、至少约170 pg/ml、至少约175 pg/ml、至少约200 pg/ml、至少约225 pg/ml、至少约250 pg/ml、至少约350 pg/ml、至少约400 pg/ml、至少约450 pg/ml、至少约500 pg/ml、至少约550 pg/ml或至少约600 pg/ml多肽缀合物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的平均浓度或最小浓度介于至少约170 pg/ml和600 pg/ml之间或介于至少约170 pg/ml和350 pg/ml之间。在又一些实施方案中，所述多肽缀合物的平均血浆浓度或最小血浆浓度大于40 pmol/升、大于50 pmol/升、大于60 pmol/升、大于70 pmol/升、大于80 pmol/升、大于90 pmol/升、大于100 pmol/升、大于110 pmol/升、大于120 pmol/升、大于130 pmol/升、大于140 pmol/升或大于150 pmol/升。在更多的实施方案中，所述多肽缀合物的平均血浆浓度或最小血浆浓度大于40 pmol/升但小于150 pmol/升或大于40 pmol/升但小于80 pmol/升。在一个实施方案中，所述多肽缀合物是化合物1A或化合物2A、或化合物1A、或其衍生物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的浓度是产生的生物作用或治疗作用等同于用规定浓度的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、davalintide或毒蜥外泌肽加davalintide的组合观察到的生物作用或治疗作用的多肽缀合物的浓度，所述作用例如降低餐后血糖波动、日平均血糖等。在一个实施方案中，达到平均循环血浆浓度或最小循环血浆浓度持续约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在又一实施方案中，达到平均血浆浓度或最小血浆浓度持续约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周或约16周。在又一个实施方案中，达到平均血浆浓度或最小血浆浓度持续约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月。用于测定毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽激动剂或davalintide的循环血液浓度的任何方法可与所要求保护的方法一起使用。在其它实施方案中，受试者需要或渴望减轻体重。在又一个实施方案中，受试者还需要控制体重/食物摄取，例如需要减轻体重、降低食欲、增加饱感、减少食物摄取、延缓胃排空、降低甘油三酯、改善机体组成或其任何组合，还任选减少恶心的发生率和/或严重程度。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于减少胃能动性和延迟胃排空。当这类病况还与体重超重或肥胖症或者体重超重或肥胖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于减少胃能动性的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以减少受试者的胃能动性。用于延迟胃排空的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以延迟受试者的胃排空。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于减少食物摄取、降低食欲、增加饱感和减轻体重。当这类病况还与高血糖症(例如糖尿病)或高血糖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于减少食物摄取的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以减少受试者的食物摄取。用于降低食欲或增加饱感的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以降低受试者的食欲。用于治疗减轻体重的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以减轻受试者的体重。在本文所述方法中，受试者可能需要减少食物摄取、降低食欲或减轻体重。在本文所述其它方法中，受试者可能渴望减少食物摄取、降低食欲或减轻体重。受试者可以是任何体重，并且可以是体重超重或肥胖。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于治疗体重超重和肥胖症。当这类病况还与高血糖症(例如糖尿病)或高血糖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于治疗体重超重的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的体重超重。用于治疗肥胖症的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的肥胖症。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于改善机体组成，例如瘦肌肉与体脂肪比率得到改进，通常连同减轻体重。当这类病况还与高血糖症(例如糖尿病)或高血糖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于改善机体组成的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以改善受试者的机体组成并任选减轻体重。
在一个实施方案中，本申请提供用于减轻渴望或有需要的受试者的体重的方法，其中所述方法包括给予有效引起受试者的体重减轻的多肽缀合物的量。在另一个实施方案中，所述方法包括长期或持续给予有效引起受试者体重减轻的多肽缀合物。在再一个实施方案中，体重减轻是在无相应的瘦体质量或肌肉质量减少的情况下由体脂肪或脂肪组织减少所致。在再一个实施方案中，由体脂肪丢失所致体重减轻大于由瘦体质量或肌肉质量丢失所致的体重减轻。在一个实施方案中，与瘦组织或肌肉相比，体脂肪的减少基于绝对体重基础(absolute weight basis)，而在另一个实施方案中，它基于体重减轻基础(weight lost basis)的百分比。在一个实施方案中，内脏脂肪的丢失大于非内脏脂肪的丢失。在另一个实施方案中，非内脏脂肪的丢失大于内脏脂肪的丢失。在再一个实施方案中，本申请提供例如通过在个体中降低脂肪与瘦组织的比率、降低体脂肪百分比或提高瘦组织百分比而改变机体组成的方法。
本文所用“体重减轻”是指受试者的体重减轻。在一个实施方案中，体重减轻是受试者的体脂肪优先减少的结果。在一个实施方案中，内脏脂肪的丢失大于非内脏脂肪的丢失。在另一个实施方案中，非内脏脂肪的丢失大于内脏脂肪的丢失。虽然本发明不取决于受试者体重的任何具体减轻，但在各个实施方案中，与在开始本文公开的方法之前的受试者体重相比，本文所述方法可减少受试者体重达至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约10%、至少约15、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%或至少约70%。在各个实施方案中，在以下时间内发生体重减轻：约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年或更长。在其它实施方案中，受试者可减轻以下磅数：约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约100、约125、约150、约175、约200磅或更长。可采用任何可再现的测量方法测量体重的减轻。在一个实施方案中，可通过计算受试者的体重指数，并在一段时间内比较该受试者的BMI，来测量体重减轻。可采用任何可获得的方法(例如通过使用列线图装置或类似装置)计算体重指数。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于治疗血脂异常。当这类病况还与高血糖症(例如糖尿病)或高血糖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于治疗血脂异常的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的血脂异常。用于治疗血脂异常的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的血脂异常。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于治疗高甘油三酯血症。当这类病况还与高血糖症(例如糖尿病)或高血糖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于治疗高甘油三酯血症的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的高甘油三酯血症。用于治疗高甘油三酯血症的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的高甘油三酯血症。
本文所述多肽缀合物和包含所述多肽缀合物的药物组合物可用于治疗类固醇诱发性糖尿病、人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病、成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、患有先天性或HIV相关性脂肪萎缩或“脂肪重新分配综合征”的受试者的糖尿病发展和/或代谢综合征(X综合征)。当这类病况还与高血糖症(例如糖尿病)或高血糖症倾向或者体重超重或肥胖症或者体重超重或肥胖症倾向有关时，所述多肽缀合物特别有用。用于治疗类固醇诱发性糖尿病、人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病、成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、患有先天性或HIV相关性脂肪萎缩或“脂肪重新分配综合征”的受试者的糖尿病发展和/或代谢综合征(X综合征)的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的疾病/病况。用于治疗类固醇诱发性糖尿病、人免疫缺陷病毒(HIV)治疗诱发的糖尿病、成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、患有先天性或HIV相关性脂肪萎缩或“脂肪重新分配综合征”的受试者的糖尿病发展和/或代谢综合征(X综合征)的方法供将治疗有效量的本文所述多肽缀合物给予有需要的受试者以治疗受试者的疾病/病况。
在本文所述方法中，受试者可能需要所述治疗作用和/或可能渴望具有所述治疗作用。受试者可以是任何体重，并可以是体重超重或肥胖。
本文的方法预期将有效量的多肽缀合物长期或持续地给予受试者以实现本文所述的所需结果。
所公开的方法可用在任何需要这类方法的个体受试者或需要对其实施所述方法的个体受试者。这些个体可以是任何哺乳动物，包括但不限于人、狗、马、牛、猪和其它有商业价值的动物或伴侣动物。
在一些实施方案中，通过长期给药给予所述多肽缀合物。本文所用“长期给药”是指与急性方式不同以连续方式给予一种或多种药剂，使得维持所需的血浆浓度，以获得所需治疗作用(活性)持续长的一段时间。在一个方面，“长期给药”是指以连续方式给予所述多肽缀合物，使得维持血浆浓度处于或高于治疗有效量或所需量。在一个实施方案中，这类长期给药保持以下平均血浆多肽缀合物浓度持续一段长的时间：至少约25 pg/ml、至少约50 pg/ml、至少约65 pg/ml、至少约75 pg/ml、至少约85 pg/ml、至少约100 pg/ml、至少约150 pg/ml、至少约170 pg/ml、至少约175 pg/ml、至少约200 pg/ml、至少约225 pg/ml、至少约250 pg/ml、至少约300 pg/ml、至少约350 pg/ml、至少约400 pg/ml、至少约450 pg/ml、至少约500 pg/ml、至少约550 pg/ml或至少约600 pg/ml。在其它实施方案中，平均多肽缀合物的浓度介于至少约170 pg/ml和600 pg/ml之间或介于至少约170 pg/ml和350 pg/ml之间。在又一些实施方案中，多肽缀合物的平均血浆浓度大于40 pmol/升、大于50 pmol/升、大于60 pmol/升、大于70 pmol/升、大于80 pmol/升、大于90 pmol/升、大于100 pmol/升、大于110 pmol/升、大于120 pmol/升、大于130 pmol/升、大于140 pmol/升或大于150 pmol/升。在更多的实施方案中，多肽缀合物的平均血浆浓度大于40 pmol/升但小于150 pmol/升或大于40 pmol/升但小于80 pmol/升。在一个实施方案中，所述多肽缀合物是化合物1A或化合物2A、或者在其它实施方案中是化合物1A或其衍生物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的浓度是产生的生物作用或治疗作用等同于用规定浓度的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、davalintide或毒蜥外泌肽加davalintide的组合观察到的生物作用或治疗作用的多肽缀合物的浓度，所述作用例如减轻体重、降低葡萄糖、改变机体组成等。
在再一个实施方案中，长期给药保持多肽缀合物的平均血浆浓度或最低血浆浓度持续以下一段时间：至少约12小时或至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天或至少约7天。在另一个实施方案中，长期给药保持多肽缀合物的血浆浓度持续至少1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周或至少约1个月、至少约2个月或至少约3个月。在其它实施方案中，通过连续方式给予所述多肽缀合物。本文所用“连续方式”是指将多肽缀合物引入机体(例如循环)，而不是给药方法。因此通过连续方式的长期给药可产生于静脉内或皮下连续输注；使用植入或外部泵或计量系统用于连续或间歇性递送；或者通过使用例如每日一次、每周两次、一周一次、一月两次、每月一次、每两月或每三月一次给予的持续释放制剂、缓慢释放制剂、缓释或长效制剂。应当认识到，不必在给予制剂后立即达到平均血浆水平或最小血浆水平，而是可花费几小时到几天到几周的任一时间达到。一旦达到，然后便保持平均血浆浓度或最小血浆浓度持续所需时间以实现其治疗作用。
本文在减轻体重或改变机体组成的情况下使用的“有需要的受试者”是体重超重或肥胖的受试者。本文在减轻体重或改变机体组成情况下使用的“渴望的”受试者是希望例如通过降低其脂肪与瘦组织的比率而减轻其体重或改变其机体组成的受试者。在一个实施方案中，受试者是肥胖或体重超重受试者。在示例性的实施方案中，“体重超重受试者”是指体重指数(BMI)大于25或BMI介于25和30之间的受试者。然而，应当认识到，体重超重的含义不限于BMI大于25的个体，而是指其中体重减轻是出于医学或美容原因期需或需要的任何受试者。虽然对本公开内容的目的而言“肥胖症”一般定义为体重指数超过30，但需要或希望减轻体重的任何受试者也包括在“肥胖”的范围内。在一个实施方案中，患有胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受或患有任何形式的糖尿病(例如1型、2型或妊娠糖尿病)的受试者可获益于该方法。在另一个实施方案中，有需要的受试者是肥胖的。然而，应当注意的是，本文所述方法可应用于未患有和/或没有诊断为葡萄糖耐量减低、胰岛素抵抗或糖尿病的受试者。
如本文在治疗糖尿病、降低HbA1c、控制餐后血糖、降低空腹葡萄糖和降低总体日血糖浓度的情况下使用的一样，有需要的受试者可包括患有糖尿病、葡萄糖耐量减低、胰岛素抵抗的受试者或不能够自我调节血糖的受试者。
本领域通常使用的HbA1c或A1c或糖化血红蛋白或糖血红蛋白是指糖基化血红蛋白。
在一个实施方案中，提供用于减轻体重、降低脂肪与瘦组织的比率或降低BMI的方法，其中所述方法包括长期给予有需要或渴望的受试者多肽缀合物。在一个实施方案中，体重减轻归因于脂肪或脂肪组织的丢失大于由瘦组织所致的体重减轻。在另一个实施方案中，由瘦体质量丢失所致体重减轻占总体体重减轻的百分比小于约40%、小于约30%、小于约20%、小于约10%、小于约5%、小于约2%、小于约1%或0%。在一个实施方案中，以持续释放制剂、缓慢释放制剂、缓释制剂或长效制剂给予所述多肽缀合物。在一个实施方案中，以基于聚合物的缓释制剂给予所述多肽缀合物。这类基于聚合物的缓释制剂描述于例如2001年8月31日提交的美国专利申请顺序号09/942,631 (现时的美国专利号6,824,822)和2005年12月21日提交的相关申请顺序号11/312,371；2002年10月17日提交的美国临时申请号60/419,388和2003年10月17日提交的相关美国专利申请顺序号10/688,786和10/688,059；2006年1月9日提交的美国临时申请号60/757,258；2004年4月15日提交的美国临时申请顺序号60/563,245和2005年4月13日提交的相关美国专利申请顺序号11/104,877；以及2005年4月15日提交的美国专利申请顺序号11/107,550，其整体通过引用结合到本文中。
在本文公开的实施方案或方法的任一个中，循环血浆多肽缀合物浓度可保持在规定的平均血浆浓度下或在规定的平均血浆浓度的约10%、约15%、约20%或约25%内。在其它实施方案中，循环血浆浓度保持在规定的平均浓度下或规定的平均浓度的约98%、约97%、约96%、约95%、约90%、约80%、约70%或约60%下。多肽缀合物的血浆浓度可采用技术人员可获得的任何方法测量。
在本文所述实施方案或方法的任一个中，给予的多肽缀合物有效保持至少约50 pg/ml的最小循环血浆多肽缀合物浓度持续至少约12小时、约24小时或约48小时。在其它实施方案中，所述方法包括给予足以保持以下多肽缀合物的最小循环血浆浓度的多肽缀合物：至少约25 pg/ml、至少约65 pg/ml、至少约75 pg/ml、至少约100 pg/ml、至少约150 pg/ml、至少约170 pg/ml、至少约175 pg/ml、至少约200 pg/ml、至少约225 pg/ml、至少约250 pg/ml、至少约350 pg/ml、至少约400 pg/ml、至少约450 pg/ml、至少约500 pg/ml、至少约550 pg/ml或至少约600 pg/ml。在其它实施方案中，多肽缀合物的最小浓度介于至少约170 pg/ml和600 pg/ml之间或介于至少约170 pg/ml和350 pg/ml之间。在又一些实施方案中，多肽缀合物的最小血浆浓度大于40 pmol/升、大于50 pmol/升、大于60 pmol/升、大于70 pmol/升、大于80 pmol/升、大于90 pmol/升、大于100 pmol/升、大于110 pmol/升、大于120 pmol/升、大于130 pmol/升、大于140 pmol/升或大于150 pmol/升。在更多的实施方案中，多肽缀合物的最小血浆浓度大于40 pmol/升但小于150 pmol/升或大于40 pmol/升但小于80 pmol/升。在一个实施方案中，所述多肽缀合物是化合物1A或化合物2A、或化合物1A、或其衍生物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的浓度是产生的生物作用或治疗作用等同于用规定浓度的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、davalintide或毒蜥外泌肽加davalintide的组合观察到的生物作用或治疗作用的多肽缀合物的浓度，所述作用例如减轻体重、降低葡萄糖、改变机体组成等。在某些实施方案中，多肽缀合物的最小浓度保持持续以下一段时间：至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天或至少约7天。在各个实施方案中，最小循环血浆浓度保持至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约9周、至少约10周、至少约11周、至少约12周、至少约13周、至少约14周、至少约15周或至少约16周。在其它实施方案中，最小循环血浆水平保持至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月。多肽缀合物的血浆浓度可采用技术人员可获得的任何方法测量。
在本文所述实施方案或方法的任一个中，给予的多肽缀合物有效保持至少约50 pg/ml的平均血浆多肽缀合物浓度持续至少约12小时、至少约24小时或至少约48小时。在其它实施方案中，所述方法包括给予足以保持以下的多肽缀合物平均循环血浆浓度的多肽缀合物：至少约25 pg/ml、至少约65 pg/ml、至少约75 pg/ml、至少约100 pg/ml、至少约150 pg/ml、至少约170 pg/ml、至少约175 pg/ml、至少约200 pg/ml、至少约225 pg/ml、至少约250 pg/ml、至少约350 pg/ml、至少约400 pg/ml、至少约450 pg/ml、至少约500 pg/ml、至少约550 pg/ml或至少约600 pg/ml。在其它实施方案中，多肽缀合物的平均浓度介于至少约170 pg/ml和600 pg/ml之间或介于至少约170 pg/ml和350 pg/ml之间。在又一些实施方案中，多肽缀合物的平均血浆浓度大于40 pmol/升、大于50 pmol/升、大于60 pmol/升、大于70 pmol/升、大于80 pmol/升、大于90 pmol/升、大于100 pmol/升、大于110 pmol/升、大于120 pmol/升、大于130 pmol/升、大于140 pmol/升或大于150 pmol/升。在更多的实施方案中，多肽缀合物的平均血浆浓度大于40 pmol/升但小于150 pmol/升或大于40 pmol/升但小于80 pmol/升。在一个实施方案中，所述多肽缀合物是化合物1A或化合物2A、或化合物1A、或其衍生物。在其它实施方案中，所述多肽缀合物的浓度是产生的生物作用或治疗作用等同于用规定浓度的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、davalintide或毒蜥外泌肽加davalintide的组合观察到的生物作用或治疗作用的多肽缀合物的浓度，所述作用例如减轻体重、降低葡萄糖、改变机体组成等。在某些实施方案中，多肽缀合物的平均浓度保持以下的一段时间：至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天或至少约7天。在各个实施方案中，平均循环血浆浓度保持至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约9周、至少约10周、至少约11周、至少约12周、至少约13周、至少约14周、至少约15周或至少约16周。在其它实施方案中，平均循环血浆水平保持至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月。多肽缀合物的血浆浓度可采用技术人员可获得的任何方法测量。
可通过可获得的任何方法给予所述多肽缀合物。在一个实施方案中，皮下给予所述多肽缀合物。在另一个实施方案中，口服或通过泵或植入物给予所述多肽缀合物。在一个实施方案中，连续给予所述多肽缀合物。在另一个实施方案中，以缓慢释放制剂、持续释放制剂、缓释或长效制剂给予所述多肽缀合物。在前述实施方案的任一个中，可每天一次、每隔一天、每周三次、每周二次、每周一次、每月两次、每月一次、每隔一月或每三个月给予所述多肽缀合物。另外，给予所述多肽缀合物的总时间长度可通过所需体重减轻的量来确定。因此，可按照本文公开的方法给予所述多肽缀合物足以充分实现规定的目标体重、BMI或机体组成的一段时间，之后终止给药。或者在实现目标体重、BMI或机体组成后，可降低所述多肽缀合物的剂量至保持所需目标的水平。另外，如果在达到目标体重后受试者重新增加体重，则可增加所述多肽缀合物的量，或者如果之前已终止，则可重新开始给药。
同样在糖血控制领域，可按照本文公开的方法给予所述多肽缀合物足以达到目标HbA1c、目标空腹葡萄糖水平、目标总体日血糖浓度等的一段时间。之后可降低多肽缀合物的血浆浓度至维持水平或终止。如果终止，则随后如有需要，便可恢复给药。在一个实施方案中，按照本文公开的方法给予所述多肽缀合物足以降低或稳定空腹葡萄糖水平、降低或清除高的或高于所需的空腹葡萄糖水平的一段时间。
在一些实施方案中，本文公开的方法还提供与一种或多种其它抗糖尿病药和/或抗肥胖症药/食欲抑制药共同给予的多肽缀合物。所谓“共同给予”意指两种或更多种活性剂作为单一组合物给予、作为单独的溶液剂同时给予、或者备选地可在彼此不同的时间内给予。这类抗糖尿病药包括但不限于二甲双胍、磺酰脲(SU)、噻唑烷二酮(TZD)或其任何组合。示例性药物包括吡格列酮、罗格列酮、格列本脲、格列齐特、格列美脲、格列吡嗪、格列喹酮、氯磺丙脲和甲苯磺丁脲。其它药物包括二肽基肽酶-4 (DPP-IV)抑制剂，例如维格列汀或西格列汀。所述多肽缀合物还可与胰岛素一起给予。共同给予可通过任何合适的方法或给药方案实现。本领域已知的或正在研究中的抗肥胖症药包括食欲抑制药，包括苯乙胺型兴奋剂、芬特明(任选与芬氟拉明或右芬氟拉明一起)、安非拉酮、苯甲曲秦、苄非他明、西布曲明；利莫纳班、其它大麻素受体拮抗剂；泌酸调节肽；盐酸氟西汀；Qnexa (托吡酯和芬特明)、安非他酮和唑尼沙胺或安非他酮和纳曲酮；或脂肪酶抑制剂，类似于赛尼可或西替司他或GT 389-255。
在一个实施方案中，提供用于降低与给予多肽缀合物相关的胃肠道作用的频率和/或严重程度(包括恶心或恶心事件的数目和/或严重程度)的方法，包括通过本文所述的任何方法长期给予多肽缀合物。有时始于低剂量或较低剂量的长期给药可诱导对所给予的多肽缀合物的耐受性，使得可将通常引起不能接受的胃肠道作用的频率和/或严重程度的高剂量给予胃肠道作用降低或缺乏的受试者。因此，预期长期给药可始于低于最佳剂量的多肽缀合物，例如采用在一段时间内释放所给予的多肽缀合物的制剂，其中一周一次给予制剂。在数周时间内，所述多肽缀合物的血浆水平可提高并最终达到平稳期浓度。在一些实施方案中，如果以单剂量或起始剂量给予，则该平稳期处于因不良胃肠道作用所引起的无法耐受的浓度。可以采用任何合适的延时释放制剂和给药方案以达到平顶效应。
因此，在一个实施方案中，提供多次缓释剂量，使得各连续剂量在受试者中提高一种或多种药物的浓度，其中在受试者中达到一种或多种药物的治疗有效浓度。在又一个实施方案中，给予各个连续的缓释剂量，使得其持续期与先前剂量的持续期重叠。
本公开内容还提供具有至少一种治疗有效剂量的本文所述多肽缀合物或含有本文所述多肽缀合物的药物组合物的药物递送装置。药物递送装置可以是一次用小瓶或多次用小瓶、一次用药笔(pen)或多次用药笔、一次用药筒(cartridge)或多次用药筒等。在一个实施方案中，药物递送装置装有本文所述多肽缀合物或药物组合物，其量能够为受试者提供约7-约40次剂量或者持续约1周或约1个月的足够剂量。
本公开内容还提供装有容器的药盒，该容器装有本文所述多肽缀合物，任选用于受试者使用所述多肽缀合物的说明书。容器可以是本文所述的一次用或多次用的小瓶、药筒、药笔或其它递送装置。
还特别预期多肽缀合物在制备用于上述任何治疗方法的药物中的用途。
其它实施方案包括下列实施方案：
1. 一种多肽缀合物，其包含化合物1A或化合物2A。
2. 实施方案1的多肽缀合物，其包含化合物1A。
3. 实施方案1的多肽缀合物，其包含化合物2A。
4. 实施方案1-3中任一个的多肽缀合物，其中化合物1A或化合物2A与至少一个聚乙二醇部分共价连接。
5. 实施方案4的多肽缀合物，其中所述聚乙二醇与亲脂部分连接。
6. 实施方案5的多肽缀合物，其中所述亲脂部分是烷基、脂肪酸、胆固醇基或金刚烷基。
7. 实施方案1-3中任一个的多肽缀合物化合物，其中化合物1A或化合物2A与至少一个脂肪酸共价连接。
8. 实施方案1-3中任一个的多肽缀合物化合物，其中化合物1A或化合物2A与白蛋白共价连接。
9. 实施方案8的多肽缀合物，其中白蛋白与脂肪酸连接。
10. 实施方案1-3中任一个的多肽缀合物化合物，其中化合物1A或化合物2A与聚氨基酸共价连接。
11. 实施方案1-10中任一个的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于1微摩尔。
12. 实施方案11的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于100纳摩尔。
13. 实施方案12的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于10纳摩尔。
14. 实施方案13的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于1纳摩尔。
15. 实施方案1-14中任一个的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于1微摩尔。
16. 实施方案15的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于100纳摩尔。
17. 实施方案16的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于10纳摩尔。
18. 实施方案17的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于5纳摩尔。
19. 实施方案1-18中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4、化合物4A或davalintide更有效力地减轻体重。
20. 实施方案1-19中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4或davalintide两者更有效力地减轻体重。
21. 实施方案1-20中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4更有效地减轻体重。
22. 实施方案1-20中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比davalintide更有效地减轻体重。
23. 实施方案1-22中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4和davalintide两者更有效地减轻体重。
24. 实施方案1-20中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比共同给予最高有效剂量的毒蜥外泌肽-4和davalintide更有效地减轻体重。
25. 实施方案1-24中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4更有效力且更有效地减轻体重。
26. 实施方案1-24中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比化合物3A更有效力和/或更有效地减轻体重。
27. 实施方案1-26中任一个的多肽缀合物，其中体重的减轻发生在4周时间内。
28. 实施方案1-27中任一个的多肽缀合物，其中体重的减轻发生在6个月时间内。
29. 实施方案1-28中任一个的多肽缀合物，其中体重的减轻发生在1年时间内。
30. 实施方案1-29中任一个的多肽缀合物，其中与毒蜥外泌肽-4相比，所述多肽缀合物减少大鼠的高岭土摄取。
31. 实施方案1-30中任一个的多肽缀合物，其中与davalintide相比，所述多肽缀合物减少大鼠的高岭土摄取。
32. 实施方案1-31中任一个的多肽缀合物，其中与化合物7A相比，所述多肽缀合物减少大鼠的高岭土摄取。
33. 实施方案1-32中任一个的多肽缀合物，其中与毒蜥外泌肽-4相比，所述多肽缀合物减少恶心。
34. 实施方案1-33中任一个的多肽缀合物，其中与davalintide相比，所述多肽缀合物减少恶心。
35. 实施方案1-34中任一个的多肽缀合物，其中与化合物7A相比，所述多肽缀合物减少恶心。
36. 实施方案1-35中任一个的多肽缀合物，其中所述恶心减少是恶心的严重程度较低或每年恶心的不良事件的次数较不频繁或者两者，其中所述恶心事件可以是轻微的、中度的或重度的或是合并的恶心事件总数。
37. 实施方案1-36中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物降低空腹血浆葡萄糖。
38. 实施方案1-37中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物提高对口服葡萄糖负荷的耐受性。
39. 实施方案1-38中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物增加葡萄糖诱导的胰岛素分泌。
40. 实施方案1-39中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物延迟胃排空达至少2小时、至少4小时或至少8小时。
41. 实施方案1-40中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物在相同剂量下比化合物3A延迟胃排空至较大程度。
42. 实施方案1-41中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物在相同剂量下比毒蜥外泌肽-4、davalintide或化合物3A降低血浆甘油三酯至较大程度。
43. 实施方案1-42中任一个的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物在相同剂量下比化合物2A降低血浆甘油三酯至较大程度。
44. 权利要求1-43中任一项的化合物，其呈药学上可接受的盐的形式。
45. 一种药物组合物，其包含实施方案1-44中任一个的多肽缀合物和药学上可接受的载体。
46. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的实施方案1-45中任一个的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的糖尿病。
47. 权利要求46的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
48. 权利要求46的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
49. 权利要求46的方法，其中所述糖尿病是妊娠糖尿病。
50. 实施方案46-49中任一个的方法，其中所述受试者体重超重、肥胖或具有体重超重或肥胖的倾向。
51. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗胰岛素抵抗的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的胰岛素抵抗。
52. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗餐后高血糖症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的餐后高血糖症。
53. 一种用于在有需要或渴望的受试者中降低血糖水平的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以降低受试者的血糖水平。
54. 一种用于在有需要的受试者中降低HbA1c水平的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以降低受试者的HbA1c水平。
55. 一种用于在有需要的受试者中刺激胰岛素释放的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以刺激受试者的胰岛素释放。
56. 一种用于在有需要的受试者中减少胃能动性的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减少受试者的胃能动性。
57. 一种用于在有需要的受试者中延迟胃排空的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以延迟受试者的胃排空。
58. 一种用于在有需要或渴望的受试者中减少食物摄取的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减少受试者的食物摄取。
59. 一种用于在有需要或渴望的受试者中减少食欲的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减少受试者的食欲。
60. 一种用于在有需要或渴望的受试者中减轻体重的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减轻受试者的体重。
61. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗体重超重的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的体重超重。
62. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗肥胖症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的肥胖症。
63. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约0.1 μg-约5 mg。
64. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约2.5 mg。
65. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约1 mg。
66. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约50 μg。
67. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约25 μg。
68. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量以70 kg受试者的体重为基础为约0.01 μg-约100 μg。
69. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量以70 kg受试者的体重为基础为约0.01 μg-约50 μg。
70. 一种药物递送装置，其包含至少一次治疗有效剂量的权利要求1-45中任一项的化合物或药物组合物。
71. 权利要求70的药物递送装置，其中所述药物递送装置是小瓶、药笔或药筒。
72. 权利要求70或71的药物递送装置，其包含治疗有效剂量的约1个月的供应量。
73. 一种用于制备实施方案1-45中任一个的化合物的方法。
74. 实施方案73的方法，其包括重组方法。
75. 一种药盒，其包括实施方案1-45中任一个的多肽缀合物或药物组合物，任选具有用于受试者使用所述多肽缀合物或组合物的说明书。
76. 上述实施方案中任一个的方法，其中给予所述多肽缀合物导致与化合物6A相比患者顺应性得到改进、与化合物6A相比严重潮红得到改善和/或与化合物6A相比恶心减少。
77. 实施方案63的方法，其中所述剂量为约0.1-1.0 mg/天。
78. 实施方案67的方法，其中所述剂量为约0.3-0.6 mg/天。
79. 上述实施方案中任一个的方法，其中所述剂量分为一天两次(BID)或一天一次(QD)给予。
实施例
下列实施例仅用于说明的目的，并无意限制权利要求书的范围。
实施例 1 ： DIO 大鼠中体内研究的方法
本研究表征了化合物1A和化合物2A的代谢作用。正如实施例中公开的一样，在饮食诱导的肥胖(DIO)雄性Sprague Dawley大鼠中，将4周连续皮下输注化合物1A和化合物2A (以3、10、30和100 nmol/kg/天)的作用与单独和共同给予亲本肽、化合物6A、化合物5和化合物4A (以2.8、15和7.2 nmol/kg/；体重减轻的最大有效剂量)的作用进行了比较。对各项代谢和PK参数进行了评价。
动物。在研究前约8周，将雄性Sprague Dawley大鼠(CRL:CD大鼠，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)分别关养，以高脂肪饮食(32% kcal来自脂肪；D12266B Research Diets，Brunswick，NJ)维持。在开始测试(第0天)时，大鼠平均体重为545 ± 3.8 g。
化合物。用于实施例的化合物包括下列化合物：
化合物4A，全长C端酰胺化毒蜥外泌肽-4肽类似物，其与天然的毒蜥外泌肽-4相比，在第14位有单个核苷酸差异。
化合物5，在第14和28位具有氨基酸取代的毒蜥外泌肽-4的头32个氨基酸接着来自非哺乳动物(蛙) GLP1 C端的5个氨基酸序列的嵌合体；
化合物6A、davalintide、C端酰胺化淀粉样肽模拟物；
化合物2A，化合物5通过甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸肽接头与化合物6A符合读框地共价连接的多肽缀合物；和
化合物1A，化合物4A通过甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸肽接头与化合物6A符合读框地共价连接的多肽缀合物。
研究设计。相对于溶媒(50% DMSO/无菌水)及单独和组合的亲本化合物，测定了多肽缀合物(参见表1)。在该模型中，化合物5、化合物4A和化合物6A的剂量对于体重减轻是最有效的(数据未显示)。在第1天，对大鼠经手术植入两个渗透小型泵(Alzet，Durect Corporation，Cupertino，CA)，该泵以恒速(纳摩尔/千克大鼠/天)递送溶媒、化合物2A、化合物1A、化合物5、化合物4A或化合物6A持续4周。参见表1
表 1 ：组别分配和治疗
Figure 2010800621149100002DEST_PATH_IMAGE001
。
一周一次测量食物摄取和体重。在第-1天和第28天，采用NMR仪器(Echo Medical Systems，Houston，TX)，对机体组成进行了评价。肥胖(脂肪质量百分比)定义为脂肪质量相对于体重的量(脂肪质量/体重x 100)。在第14天通过尾静脉采集血液。在第28天，通过颈静脉抽取血样后，通过异氟烷过量将动物麻醉。立即取出小型泵，对动物进行简单的NMR扫描，收集组织用于未来的组织学检查和初步的毒理评价。
统计学分析。应用单向方差分析(ANOVA)与Newman-Keuls事后比较分析数据。假设显著性p<0.05。应用适于Windows的Prism 4 (Graphpad Software，San Diego，CA)作图。所有数据点表示为平均值± SEM。对于最高剂量的化合物1A和化合物2A，若干动物具有最少的食物摄取，该数据包括在分析中。
激素和代谢物分析。在第14天和结束时通过ELISA测量研究药物的血浆水平。在第14天和在结束时，采用Olympus生物分析仪(Olympus America Diagnostics)，测量全血血红蛋白A1c百分比(%HbA1c)、血浆甘油三酯、总胆固醇、HDL胆固醇和血浆葡萄糖。在第14天和在结束时，通过ELISA试剂盒(大鼠/小鼠胰岛素ELISA，Linco Diagnostics)，分析血浆胰岛素水平。
实施例 2 ：化合物 1A 提供优良的体重减轻
按照实施例1的方法，在28天治疗期间，3、10、30和100 nmol/kg/天的各种多肽缀合物(化合物1A和化合物2A)剂量依赖性地显著减轻体重(相对于溶媒的p<0.05) (参见图1A和1B)。与溶媒对照相比，以及与仅化合物6A相比，共同给予亲本化合物(化合物5+化合物6A和化合物4A+化合物6A)显著减轻体重(p<0.05)。参见图1A和1B。
如图1A中所示，4周溶媒校正的体重减轻：对于100 nmol/kg/天的化合物2A为-31.5 ± 2.7%、对于化合物5为-16.6 ± 3.6%、对于化合物6A为-12.3 ± 1.3%、对于化合物5+化合物6A为-24.3 ± 1.3%，化合物2A相对于化合物6A的p<0.05，但与化合物5或共同给予的化合物5+化合物6A无不同。对于化合物2A，超过10 nmol/kg/天没有剂量效应；用30或100 nmol/kg/天的剂量未观察到更多的体重减轻。在100 nmol/kg/天组中达到最大体重减轻，为-27.8 ± 5.3%。参见图1A。在通过持续输注的体重减轻方面，化合物2A的效力亦为化合物3A的几倍。
如图1B中所示，4周溶媒校正的体重减轻：对于100 nmol/kg/天的化合物1A为-37.3 ± 4.8%、对于化合物4A为-13.5 ± 1.5%，而对于化合物4A+化合物6A为-25.8 ± 1.5%；化合物1A相对于单独和组合的亲本肽两者的p<0.05。对于化合物1A，观察到剂量依赖性的体重减轻直到所测的最高剂量[100 nmol/kg/天组，为-37.3 ± 4.8%]。用100 nmol/kg/天的化合物1A的体重减轻也显著大于用共同给予最大有效剂量的亲本化合物所观察到的体重减轻。参见图2A。虽然两种多肽缀合物在28天治疗期内引起显著的体重减轻，但对于化合物1A，甚至在所测最低剂量下的体重减轻也显著大于通过单独给予任一种亲本肽的体重减轻。与化合物2A相比，化合物1A还明显效力更大且更有效。在通过持续输注减轻体重方面，化合物1A的效力还是化合物3A的约10倍。
实施例 3 ：化合物 1A 提供优良的食物摄取减少
按照实施例1的方法，与对于体重一样，在28天治疗期内，在测试的各个剂量下，各种多肽缀合物相对于溶媒对照显著减少食物摄取(p<0.05)。参见图2A和2B。在所测最高剂量下，与单独给予亲本肽相比，化合物1A和化合物2A显著减少总食物摄取，并且在化合物1A的最高剂量下，食物摄取所受阻抑超过共同给予化合物4A+化合物6A的阻抑。
对于3 nmol/kg/天的化合物2A，累积食物摄取显著高于其它剂量(p<0.05)。当与亲本化合物单一疗法相比时，10和100 nmol/kg/天剂量显著低于任一亲本，然而30 nmol/kg/天剂量仅显著不同于亲本化合物化合物6A。共同给予化合物5+化合物6A治疗不显著不同于任何的多肽缀合物剂量。参见图2A。在减少食物摄取方面，化合物2A比化合物3A有效力得多。
当与溶媒和与任何单独给予的亲本化合物相比时，化合物1A的所有剂量均显著减少食物摄取。参见图2B。化合物1A的最高剂量是唯一显著不同于两种亲本化合物化合物4A和化合物6A组合疗法(共同给予)的剂量。参见图2B。因此，化合物1A提供优良的食物摄取减少。在减少食物摄取方面，化合物1A也比化合物3A极更有效力。总的来说，在DIO大鼠中，与单独给予亲本肽相比，化合物1A和化合物2A对体重减轻更有效，其中与化合物2A相比，化合物1A对于体重减轻具有更大的效力和功效。
实施例 4 ：化合物 1A 提供机体组成改进
按照实施例1的方法，在开始研究时，在测试的受试者中观察到在基线脂肪质量方面(表示为毛重或脂肪质量百分比(肥胖))或在基线瘦质量方面无显著差异(参见表2和表3)。在结束时，观察到多肽缀合物的递增剂量引起脂肪质量减少。多肽缀合物诱导的体重减轻与脂肪质量百分比显著降低相关(在100 nmol/kg/天剂量下：对于化合物2A为-12.2 ± 1.3%，对于化合物1A为-15.5 ± 2.2%；两者相对于溶媒对照的p<0.05)。化合物2A不改变瘦质量百分比，然而与溶媒对照相比，化合物1A的所有剂量均提高瘦质量百分比。与溶媒和与给予任何亲本化合物组相比，100 nmol/kg/天的化合物1A和化合物2A显著减少脂肪质量(参见表2和表3)。与溶媒相比，10 nmol/kg/天和100 nmol/kg/天的化合物2A和化合物5+化合物6A共同给予治疗显著减少终末瘦质量(参见表2)。与溶媒对照相比，10、30和100 nmol/kg/天的化合物1A治疗和化合物4A+化合物6A治疗显著降低瘦质量(表3)。
表 2 ：化合物 2A 基线机体组成和终末机体组成
Figure 383312DEST_PATH_IMAGE002
1. 未共用上标的组彼此显著不同(p<0.05)。
表 3 ：化合物 1A 基线机体组成和终末机体组成
Figure 2010800621149100002DEST_PATH_IMAGE003
1. 未共用上标的组彼此显著不同(p<0.05)。
为了校正体重减轻，针对终末体重调整脂肪和瘦质量的减轻以计算肥胖的改变(脂肪质量百分比)和瘦质量百分比的改变。所有剂量的化合物2A以及单独和组合的亲本化合物显著减轻肥胖(参见图3)。100 nmol/kg/天的化合物2A产生肥胖的最大减轻(-12.2 ± 1.3%；图3)。
用化合物1A观察到肥胖减轻：与溶媒对照相比，所有治疗剂量显著减轻肥胖，与给予化合物4A和化合物6A一样。参见图4。化合物1A的最高剂量产生最大的减轻(-15.5 ± 2.2%)，显著低于所有其它剂量，但与共同给予亲本化合物类似(参见图4)，并优于化合物2A。
虽然高剂量的多肽缀合物治疗减少总体瘦(或无脂肪)质量，但瘦质量的改变(当表示为体重的百分比时)在溶媒对照和任何剂量的化合物2A、化合物5、化合物6A或化合物5+化合物6A组合组之间无显著不同(参见图5)。在意想不到的对比之下，与溶媒对照相比，用各种剂量的化合物1A治疗显著增加瘦质量百分比(参见图6)。化合物1A在改善机体组成(例如节省瘦质量、消耗脂肪)方面是优良的。
在ob/ob小鼠(肥胖和糖尿病)中，在暴露28天时，化合物1A和2A提供禁食血糖降低(mg/dL)、HbA1c降低和体重减轻(消耗脂肪、保留瘦质量)。在ob/ob小鼠中，与毒蜥外泌肽-4相比，化合物1A提供类似的禁食血糖降低损失，但提供优良的体重减轻(消耗脂肪、节省瘦质量)。鉴于在该系统中仅用davalintide观察到的HbA1c增加和空腹血糖增加，对降低HbA1c和降低空腹血糖的这些有益作用也是出乎意料的。与在用毒蜥外泌肽-4和davalintide组合治疗的ob/ob小鼠中观察到的在第28天血浆葡萄糖水平增加 (数据未显示) 相比，化合物1A的这种优良作用甚至更出乎意料。
实施例 6 ：化合物 1A 提供优良的代谢参数
血浆参数。在第14和28天，测定了亲本和多肽缀合物化合物对下列血浆参数的作用：血红蛋白A1c (HbA1c)百分比、饱食状态血浆胰岛素和血浆的多肽缀合物浓度。
28天后，用化合物2A治疗未观察到葡萄糖、血红蛋白A1c (HbA1c)百分比、胰岛素、总胆固醇或HDL胆固醇的改变。同样地，28天后化合物1A对总胆固醇或HDL胆固醇或HbA1c水平无显著作用。与溶媒对照相比，一些剂量的化合物1A显著降低血浆胰岛素和葡萄糖水平。治疗28天后，与溶媒相比，所有肽治疗显著降低血浆甘油三酯。在2周和4周两种治疗后，以与治疗剂量相应的递增水平检测到化合物1A和化合物2A的血浆水平(通过特异性免疫测定法测定)。
在治疗14天后，与溶媒和化合物6A组两者相比，用10 nmol/kg/天的化合物5+化合物6A、化合物5和化合物2A两者稍微(但显著地)提高HbA1c水平(参见表4)。28天后任何这些组间的HbA1c的差异不明显。14天后，与溶媒对照相比，所有治疗组的胰岛素水平显著降低，然而28天后未观察到差异。在第14和28天，血浆中的化合物2A血浆水平以剂量依赖性方式显著提高(参见表4)。
表 4 ： HbA1c 、胰岛素和化合物 2A 血浆药物水平
Figure 980079DEST_PATH_IMAGE004
1. 未共用上标的组彼此显著不同。
相比之下，14天后，相对于溶媒和化合物6A组，3和10 nmol/kg/天的化合物1A治疗提高HbA1c水平，其中在28天时未观察到差异(参见表5)。与化合物2A治疗类似，14天时，与溶媒相比，所有剂量的化合物1A和化合物4A+化合物6A组合显著降低血浆胰岛素，但是28天后，与溶媒相比，10和30 nmol/kg/天的化合物1A治疗以及化合物4A+化合物6A共同给予治疗仍进一步降低(参见表5)。14天时，与溶媒及3和10 nmol/kg/天而非30 nmol/kg/天的化合物1A相比，100 nmol/kg/天的化合物1A显示显著较高的血浆浓度。在14天和28天数值之间无差异。
表 5 ： HbA1c 、胰岛素和化合物 1A 血浆药物水平
Figure 2010800621149100002DEST_PATH_IMAGE005
1. 未共用上标的组彼此显著不同。
该项研究还评价了28天后葡萄糖和脂质(甘油三酯、总胆固醇和HDL胆固醇)的血浆水平。所有剂量的化合物2A和单独或一起给予的亲本肽不改变葡萄糖、或总胆固醇或HDL胆固醇。与溶媒相比，所有组均显著降低甘油三酯(参见表6)
表 6 ：血浆葡萄糖和脂质：化合物 2A
Figure 697500DEST_PATH_IMAGE006
。
与包括化合物2A在内的所有其它化合物不同，10和30 nmol/kg/天的化合物1A降低HDL胆固醇，例如与化合物6A相比时。化合物1A不改变总胆固醇。参见表7。与溶媒相比，所有剂量的化合物1A和亲本肽降低甘油三酯，10和30 nmol/kg/天的化合物1A降低葡萄糖，正如化合物4A+化合物6A一样(参见表7)
表 7 ：血浆葡萄糖和脂质：化合物 1A
Figure 2010800621149100002DEST_PATH_IMAGE007
。
实施例 7 ：多肽缀合物保持所需的双重受体激动作用
针对其结合和激动GLP-1受体(例如毒蜥外泌肽-4样活性)或降钙素受体(例如davalintide/淀粉样肽模拟物样活性)的能力，在基于细胞的测定中对多肽缀合化合物1A、化合物2A、化合物3A和亲本化合物进行了测试。
通过肽诱导的内源表达的GLP-1受体的活化，GLP-1受体功能测定法测量了6-23 (克隆6)细胞系中cAMP的增加(Zeytinoglu等,“Establishment of a calcitonin-producing rat medullary thyroid carcinoma cell line: I. Morphological studies of the tumor and cells in culture (产生降钙素的大鼠甲状腺髓样癌细胞系的建立：I. 培养物中肿瘤和细胞的形态学研究),” Endocrinology 107:509-515 (1980)；Crespel等，“Effects of glucagon and glucagon-like peptide-1-(7-36) amide on C cells from rat thyroid and medullary thyroid carcinoma CA-77 cell line (胰高血糖素和胰高血糖素样肽-1-(7-36)酰胺对大鼠甲状腺癌和甲状腺髓样癌CA-77细胞系的C细胞的作用),” Endocrinology 137:3674-3680 (1996))。在30分钟肽处理后，采用HTRF (CisBio，Bedford，MA USA)基于细胞的cAMP测定试剂盒，在384孔板中测量了cAMP的蓄积。HTRF (均相时间分辨荧光)是基于TR-FRET (时间分辨荧光和荧光共振能量转移)这种FRET化学和使用具有长的发射半寿期的荧光团的组合的技术。相对于用10微摩尔毛喉素(引起cAMP产生的腺苷酸环化酶的组成型激活剂)处理的细胞，测定了试验化合物的功效，并应用与4-参数模型拟合的非线性回归分析，通过浓度反应曲线分析，测定了试验化合物的效力(EC50)。浓度反应曲线的范围为1微摩尔-0.1皮摩尔试验化合物浓度(N=4个重复/浓度)。将试验化合物1:10连续稀释用于8点剂量反应。将细胞以2.5 x 10-6个细胞/ml悬浮于含有500微摩尔IBMX和HTRF溶液的缓冲液中。将5微升的试验化合物加入5微升悬浮的细胞中，并在室温下避光孵育30分钟。通过加入检测试剂/裂解缓冲液终止活化。按照试剂盒说明书测定蓄积的cAMP。
在384孔板中，使用基于HTRF的cAMP测定试剂盒(CisBio，Bedford，MA USA)，在暴露于试验化合物30分钟后，通过过量表达大鼠C1a降钙素受体的C1a-HEK细胞系中的cAMP蓄积，测定了大鼠降钙素C1a受体上试验化合物的功能活性。测量响应递增浓度的试验肽的CAMP的蓄积，并测定了所述肽相对于用10微摩尔毛喉素(腺苷酸环化酶的组成型激活剂)处理的细胞的功效。还采用AlphaScreen全细胞cAMP功能测定法(Whole Cell cAMP Functional Assay) (Perkin Elmer，MA USA)，测量了试验化合物的功能活性。EC50计算值以具有1微摩尔-0.1皮摩尔浓度的肽剂量的4-参数浓度反应曲线(N=4个重复/浓度)为基础。将细胞以2.0 x 10-6细胞/ml悬浮于含有500微摩尔IBMX和HTRF溶液的缓冲液中。将5微升的试验化合物加入5微升的悬浮细胞中，并在室温下避光孵育30分钟。通过加入检测试剂/裂解缓冲液终止活化。按照试剂盒说明书测定蓄积的cAMP。
表8提供cAMP的EC50测量值，cAMP是一种受体活性的体外指示物。如预期一样，均为GLP-1受体激动剂的毒蜥外泌肽-4、化合物4A、化合物5和化合物10A，在GLP-1受体功能测定中有活性，但在C1a降钙素受体功能测定中没有活性。与任何其它亲本化合物相比，毒蜥外泌肽-4的活性更大。如预期一样，化合物6A(淀粉样肽模拟物davalintide)在C1a降钙素受体功能测定中有活性，但在GLP-1受体功能测定中无活性
表 8 ：受体激动作用
。
此外，根据已证实的各种化合物降低血钙的影响(一种淀粉样肽激动剂而非毒蜥外泌肽激动剂的性质)，化合物1A和2A体内具有活性淀粉样肽模拟物序列(数据未显示)。因此，所有缀合物化合物化合物1A、化合物2A和化合物3A (之前已知的缀合物)对GLP-1和淀粉样肽受体两者皆具有功能。
实施例 8 ：多肽缀合物在基础葡萄糖降低中具有活性
在体内基础葡萄糖降低测定中，对多肽缀合物和亲本化合物进行了分析。该测定反映了缀合物多肽提高口服给予葡萄糖攻击(口服葡萄糖耐量试验；OGTT)的胰岛素介导的葡萄糖清除的能力。利用OGTT诊断糖尿病，但是优选较简单的空腹血浆葡萄糖试验，其测量空腹至少8小时后受试者的血浆葡萄糖水平。采用以下步骤：在t = -5分钟至4小时内，给禁食NIH/Swiss雌性小鼠腹膜内(IP)注射不同浓度的试验化合物。在t = 0时给予葡萄糖管饲法(1.5 g/kg)。使用OneTouch® Ultra® (LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)，在t = 30分钟时取样品作为尾血糖。应用用于Windows的GraphPad Prism 4.00版(GraphPad Software，San Diego CA)，通过ANOVA (p<0.05)接着Dunnett事后检验鉴定出作用显著。
表9中给出结果。如预期一样，毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-4肽类似物化合物4A、化合物5和化合物10A在降低葡萄糖中具有活性。化合物2A出乎意料地比之前已知的多肽缀合物化合物3A和化合物7A具有更大效力。化合物1A出乎意料地比化合物2A以及化合物3A和化合物7A具有更大效力
表 9 ： OGTT
Figure 2010800621149100002DEST_PATH_IMAGE009
。
实施例 9 ：多肽缀合物化合物 1A 和化合物 2A 降低食物摄取伴以较少恶心
为了研究缀合物多肽的可能的恶心作用，在大鼠中测量了急性高岭土摄取。异食癖行为(摄入泥土/粘土)是啮齿动物中通常与食物摄取减少和体重减轻有关的恶心的标志。可通过测量合成粘土高岭土的摄取，来评价异食癖。顺铂，一种可在肠中起作用以产生呕吐的化疗药物，被用来诱导恶心相关性hypophagia作为阳性对照。使大鼠适应高岭土(作为与正常颗粒饲料(chow)混合的高岭土粘土) 3天。然后，测量4小时和24小时基线高岭土和颗粒饲料摄取。随后，使大鼠禁食约16小时，此后以下述剂量注射试验化合物。注射后24小时，测量颗粒饲料和高岭土消耗。表10表示高岭土摄取的结果和与(颗粒饲料)食物摄取抑制的相关性
表 10 ：恶心
Figure 31715DEST_PATH_IMAGE010
。
在抑制食物摄取的剂量下，化合物7A (一种之前已知的缀合物)诱导类似于阳性对照的显著的高岭土摄取(一种大鼠的恶心征兆)。在极类似于顺铂注射的阻抑食物摄取的剂量下，化合物3A对高岭土消耗仅有适度作用(如有的话)。在诱导食物摄取减少甚至大于阳性对照化合物3A或7A的剂量下，化合物1A和化合物2A不引起高岭土消耗显著增加。出乎意料的是，在该研究中，尽管恶心与毒蜥外泌肽-4和davalintide有关，但是化合物1A和化合物2A未显示显著的高岭土摄取。
正如所注意到的一样，化合物1A对于GLP-1受体及淀粉样肽和降钙素受体两者具有高效力，这就表明了其毒蜥外泌肽样部分和davalintide部分保持它们的生物活性。与亲本化合物相比，对这些靶受体的活性只是适度减弱。令人感兴趣的是，化合物1A以非常低的亲和力与CGRP受体结合，显示比化合物3A对于淀粉样肽受体(分别为> 600倍与> 100倍)和降钙素受体(> 1600倍与> 280倍)针对CGRP受体更好的选择性，甚至比davalintide (化合物6A)针对CGRP受体与降钙素和淀粉样肽受体结合的选择性更好。尽管davalintide是有效力的肾上腺髓质素受体拮抗剂(IC50 = 18 nM)，但是在高达10 uM的浓度下，化合物1A不显示肾上腺髓质素受体的功能性活化作用或拮抗作用。因此，就识别淀粉样肽和淀粉样肽模拟物(amylinomimetics)的细胞受体而言，与davalintide相比，化合物1A显示出乎意料的不同药理特征。化合物1A具有比亲本肽少的脱靶活性。预期与亲本肽化合物6A相比，化合物1A的这种改进的药理特征导致副作用减少，例如特别是人受试者的严重潮红、恶心和/或呕吐减轻。例如，据报道，CGRP和CGRP激动剂在人受试者中引起严重潮红，甚至恶心和呕吐，这被认为是部分由CGRP受体活化所引起的，并且被CGRP拮抗剂缓解。
预期与之前的化合物相比(例如与化合物6A相比)，化合物1A和化合物2A，特别是化合物1A，可提高患者顺应性和/或可允许按所需提高剂量，这导致了商业成功提高。
实施例 10 ：多肽缀合物延迟胃排空
针对其在大鼠中延迟胃排空的能力，对多肽缀合物和亲本化合物进行了分析。胃排空的抑制是GLP-1受体激动作用和淀粉样肽受体激动作用的生理效应，并且是毒蜥外泌肽-4和化合物6A在葡萄糖控制中的关键药理效应。在t = 0时，禁食雄性Sprague Dawley大鼠(约250克，n=5只/组)接受盐水、化合物6A或试验化合物的单次皮下注射(1 nmol/kg)。然后在注射后t=3.5小时、5.5小时或7.5小时时，大鼠接受经口管饲的33 mg对乙酰氨基酚/1ml Orablend (Paddock Laboratories，Inc.，MN USA)。在SC注射后4小时、6小时或8小时时，采血以测量对乙酰氨基酚。通过经口管饲后30分钟血浆中对乙酰氨基酚的出现，对胃排空进行评价。
表11表示胃排空的抑制百分比。在单次注射后长达6小时，在抑制胃排空方面，化合物1A和化合物2A与化合物6A一样有效。在受测时间点和剂量，化合物3A和化合物7A不显著抑制胃排空。出乎意料的是，与化合物2A相比，化合物1A提供较长的持续作用时间
表 11 ：胃排空延迟
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
在本文提供的测定法中，化合物1A (包含亲本化合物化合物4A的多肽缀合物)的作用是出人意料的。Hargrove等人(2007)教导了与毒蜥外泌肽-4相比，化合物4A (毒蜥外泌肽-4肽类似物Leu14毒蜥外泌肽-4)，具有显著较低效力的胃排空延迟(1/4倍)、显著较低效力的食物摄取抑制(1/8倍)、较短的半寿期和较短的持续作用时间。尽管在多肽缀合物化合物1A中存在Leu14毒蜥外泌肽-4肽类似物序列，但是与化合物2A和之前已知的缀合物相比，化合物1A表现出出乎意料的优良的药理性质(例如稳固和更长作用的胃排空抑制活性)以及出乎意料的稳固和长效的食物摄取减少和体重减轻。出乎意料的是，与毒蜥外泌肽-4、化合物4A和化合物6A相比，在人血浆中和与人肾刷状缘膜基质一起在5小时孵育时间内，化合物1A和化合物2A具有体外更稳定的(至少2倍)代谢特征(数据未显示)。在该期间内，未检测到化合物1A或化合物2A的代谢物，这就表明任何未鉴定的代谢物可以低于10%的水平存在。
出乎意料的是，与毒蜥外泌肽-4、化合物4A或化合物6A相比，化合物1A和化合物2A具有较长的半寿期，其生物利用度相似(大鼠中皮下注射) (数据未显示)。与毒蜥外泌肽-4为20分钟和davalintide为约30分钟相比，皮下给予时，化合物1A的半寿期为72分钟(在雄性Sprague-Dawley大鼠中)，其绝对生物利用度类似。
这些优良的药理性质、结合优良的PK特征和其它有利的药物性质(例如较少的脱靶活性和恶心减少)，提供出人意料的有用的多肽缀合物(化合物2A和甚至更是如此的化合物1A)，用于在需要这类治疗的受试者中控制葡萄糖与控制体重和机体组成的进一步改进，所述受试者患有其中这种治疗是有益的疾病和病况。这类病况包括患有前驱糖尿病、糖尿病、糖尿病伴发体重超重或肥胖症、体重超重或肥胖症的受试者，其中这类受试者需要和渴望控制血糖(例如抗高血糖症)和/或具有体重和机体组成的改进的作用或控制以减轻体重、保持体重、防止体重增加和/或改进瘦肌肉与体脂肪比率。
所有出版物和专利申请通过引用结合到本文中，其程度与每个参考文献具体而单独指明通过引用结合一样，并且就像全部在本文中提供一样。虽然前文进行了详细描述用于清楚理解的目的，但是对本领域普通技术人员而言显而易见的是，可在不偏离本公开内容或随附权利要求书的精神或范围的情况下进行变动和修改。

Claims (79)

1. 一种多肽缀合物，其包含化合物1A或化合物2A。
2. 权利要求1的多肽缀合物，其包含化合物1A。
3. 权利要求1的多肽缀合物，其包含化合物2A。
4. 权利要求1-3中任一项的多肽缀合物，其中化合物1A或化合物2A与至少一个聚乙二醇部分共价连接。
5. 权利要求4的多肽缀合物，其中所述聚乙二醇与亲脂部分连接。
6. 权利要求5的多肽缀合物，所述亲脂部分是烷基、脂肪酸、胆固醇基或金刚烷基。
7. 权利要求1-3中任一项的多肽缀合物化合物，其中化合物1A或化合物2A与至少一个脂肪酸共价连接。
8. 权利要求1-3中任一项的多肽缀合物化合物，其中化合物1A或化合物2A与白蛋白共价连接。
9. 权利要求8的多肽缀合物，其中白蛋白与脂肪酸连接。
10. 权利要求1-3中任一项的多肽缀合物化合物，其中化合物1A或化合物2A与聚氨基酸共价连接。
11. 权利要求1-10中任一项的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于1微摩尔。
12. 权利要求11的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于100纳摩尔。
13. 权利要求12的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于10纳摩尔。
14. 权利要求13的多肽缀合物，其在GLP-1受体功能测定中的EC50小于1纳摩尔。
15. 权利要求1-14中任一项的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于1微摩尔。
16. 权利要求15的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于100纳摩尔。
17. 权利要求16的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于10纳摩尔。
18. 权利要求17的多肽缀合物，其中在降钙素C1a受体功能测定中，所述多肽缀合物的EC50小于5纳摩尔。
19. 权利要求1-18中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4、化合物4A或davalintide更有效力地减轻体重。
20. 权利要求1-19中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4或davalintide两者更有效力地减轻体重。
21. 权利要求1-20中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4更有效地减轻体重。
22. 权利要求1-20中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比davalintide更有效地减轻体重。
23. 权利要求1-22中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4和davalintide两者更有效地减轻体重。
24. 权利要求1-20中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比共同给予最高有效剂量的毒蜥外泌肽-4和davalintide更有效地减轻体重。
25. 权利要求1-24中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比毒蜥外泌肽-4更有效力且更有效地减轻体重。
26. 权利要求1-24中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物比化合物3A更有效力和/或更有效地减轻体重。
27. 权利要求1-26中任一项的多肽缀合物，其中体重的减轻发生在4周时间内。
28. 权利要求1-27中任一项的多肽缀合物，其中体重的减轻发生在6个月时间内。
29. 权利要求1-28中任一项的多肽缀合物，其中体重的减轻发生在1年时间内。
30. 权利要求1-29中任一项的多肽缀合物，其中与毒蜥外泌肽-4相比，所述多肽缀合物减少大鼠的高岭土摄取。
31. 权利要求1-30中任一项的多肽缀合物，其中与davalintide相比，所述多肽缀合物减少大鼠的高岭土摄取。
32. 权利要求1-31中任一项的多肽缀合物，其中与化合物7A相比，所述多肽缀合物减少大鼠的高岭土摄取。
33. 权利要求1-32中任一项的多肽缀合物，其中与毒蜥外泌肽-4相比，所述多肽缀合物减少恶心。
34. 权利要求1-33中任一项的多肽缀合物，其中与davalintide相比，所述多肽缀合物减少恶心。
35. 权利要求1-34中任一项的多肽缀合物，其中与化合物7A相比，所述多肽缀合物减少恶心。
36. 权利要求1-35中任一项的多肽缀合物，其中所述恶心减少是恶心的严重程度较低或每年恶心的不良事件的次数较不频繁或者两者，其中所述恶心事件可以是轻微的、中度的或重度的或是合并的恶心事件总数。
37. 权利要求1-36中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物降低空腹血浆葡萄糖。
38. 权利要求1-37中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物提高对口服葡萄糖负荷的耐受性。
39. 权利要求1-38中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物增加葡萄糖诱导的胰岛素分泌。
40. 权利要求1-39中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物延迟胃排空达至少2小时、至少4小时或至少8小时。
41. 权利要求1-40中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物在相同剂量下比化合物3A延迟胃排空至较大程度。
42. 权利要求1-41中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物在相同剂量下比毒蜥外泌肽-4、davalintide或化合物3A降低血浆甘油三酯至较大程度。
43. 权利要求1-42中任一项的多肽缀合物，其中所述多肽缀合物在相同剂量下比化合物2A降低血浆甘油三酯至较大程度。
44. 权利要求1-43中任一项的化合物，其呈药学上可接受的盐的形式。
45. 一种药物组合物，其包含权利要求1-44中任一项的多肽缀合物和药学上可接受的载体。
46. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的糖尿病。
47. 权利要求46的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
48. 权利要求46的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
49. 权利要求46的方法，其中所述糖尿病是妊娠糖尿病。
50. 权利要求46-49中任一项的方法，其中所述受试者体重超重、肥胖或具有体重超重或肥胖的倾向。
51. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗胰岛素抵抗的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的胰岛素抵抗。
52. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗餐后高血糖症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的餐后高血糖症。
53. 一种用于在有需要或渴望的受试者中降低血糖水平的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以降低受试者的血糖水平。
54. 一种用于在有需要的受试者中降低HbA1c水平的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以降低受试者的HbA1c水平。
55. 一种用于在有需要的受试者中刺激胰岛素释放的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以刺激受试者的胰岛素释放。
56. 一种用于在有需要的受试者中减少胃能动性的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减少受试者的胃能动性。
57. 一种用于在有需要的受试者中延迟胃排空的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以延迟受试者的胃排空。
58. 一种用于在有需要或渴望的受试者中减少食物摄取的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减少受试者的食物摄取。
59. 一种用于在有需要或渴望的受试者中减少食欲的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减少受试者的食欲。
60. 一种用于在有需要或渴望的受试者中减轻体重的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以减轻受试者的体重。
61. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗体重超重的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的体重超重。
62. 一种用于在有需要或渴望的受试者中治疗肥胖症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物以治疗受试者的肥胖症。
63. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约0.1 μg-约5 mg。
64. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约2.5 mg。
65. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约1 mg。
66. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约50 μg。
67. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量为约1 μg-约25 μg。
68. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量以70 kg受试者的体重为基础为约0.01 μg-约100 μg。
69. 权利要求46-62中任一项的方法，其中所述化合物的治疗有效量以70 kg受试者的体重为基础为约0.01 μg-约50 μg。
70. 一种药物递送装置，其包含至少一次治疗有效剂量的权利要求1-45中任一项的化合物或药物组合物。
71. 权利要求70的药物递送装置，其中所述药物递送装置是小瓶、药笔或药筒。
72. 权利要求70或71的药物递送装置，其包含治疗有效剂量的约1个月的供应量。
73. 一种制备权利要求1-45中任一项的化合物的方法。
74. 权利要求73的方法，其包括重组方法。
75. 一种药盒，其包含权利要求1-45中任一项的多肽缀合物或药物组合物，任选具有用于受试者使用所述多肽缀合物或组合物的说明书。
76. 上述权利要求中任一项的方法，其中给予所述多肽缀合物导致与化合物6A相比患者顺应性得到改进、与化合物6A相比严重潮红的减少得到改进和/或与化合物6A相比恶心减少。
77. 权利要求63的方法，其中所述剂量为约0.1-1.0 mg/天。
78. 权利要求67的方法，其中所述剂量为约0.3-0.6 mg/天。
79. 上述权利要求中任一项的方法，其中一天一次(QD)或分成一天两次(BID)给予所述剂量。
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