KR20120116942A - 폴리펩티드 접합체 - Google Patents

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KR20120116942A
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therapeutically effective
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KR1020127016229A
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베로우즈 브루스 포루드
소우미트라 에스. 고쉬
제임스 엘. 트레바스키스
쳉자오 순
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아밀린 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 여러 개선된 약리학적 및 약동학적 특성이 있는 폴리펩티드 접합체, 및 다양한 질환 및 상태, 예컨대 당뇨병 및/또는 비만을 치료함에 있어서의 이의 용도를 제공한다.

Description

폴리펩티드 접합체{POLYPEPTIDE CONJUGATE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009년 11월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/263,752를 우선권으로 청구하고, 이의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 포함된다.
분야
우월한 약리학적 성질과 함께, GLP-1 수용체 효능제 및 아밀린(amylin) 모방체 활성 둘 모두를 지니는 폴리펩티드 접합체, 및 이의 사용을 위한 치료적 방법이 본원에서 제공된다.
배경
펩티드 및 단백질은 생물학적 프로세스의 조절에서 결정적인 역할을 한다. 예를 들어, 펩티드는 호르몬 및 억제제로서 조절 역할을 하고, 또한 면역학적 인식에 수반된다. 펩티드의 상당한 생물학적 역할은 펩티드가 결합하는 수용체와 펩티드의 상호작용을 이해하는 것을 중요하게 한다.
인크레틴(incretin) 펩티드는 글루코스 수준이 정상일 때 또는 특히 이러한 수준이 상승되었을 때 방출되는 인슐린의 양을 증가시키는 호르몬 및 펩티드 모방체이다. 인크레틴 효과의 개념은 경구 글루코스에 대한 인슐린 반응이 등가량의 글루코스의 정맥내 투여 후에 측정된 것을 능가하였다는 관찰로부터 나타났다. 이러한 인크레틴 펩티드는 인슐린 분비에 의해 명시되는 초기 인크레틴 작용을 넘어서는 다른 작용을 한다. 예를 들어, 이는 또한 글루카곤 생산을 감소시키고, 포만감을 증가시키거나 음식 섭취를 감소시키며, 위 배출을 지연시키는 작용을 한다. 추가적으로, 이는 인슐린 감수성을 개선하는 작용을 할 수 있고, 도세포 신생 (새로운 도세포의 형성)을 증가시킬 수 있다.
다수의 식후 호르몬이 인크레틴-유사 활성을 지니지만, 우수한 인크레틴 펩티드에는 위 억제 폴리펩티드 (GIP)로 또한 공지된 글루코스-의존적 인슐린자극(insulinotropic) 폴리펩티드, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 및 엑센딘 펩티드 (비-내인성 인크레틴 모방체임)가 포함된다. GIP 및 GLP-1은 둘 모두 글루카곤 펩티드 수퍼패밀리에 속한다. GLP-1은 위장관 내의 분화된 세포에 의해 분비되고, 도세포, 뿐만 아니라 기타 조직 상에 위치하는 수용체가 있다. GLP-1은 영양소 섭취에 반응하여 장에서 분비되고, 이는 인슐린 분비 강화를 초래한다. GLP-1의 인슐린자극 효과는 주위 글루코스의 상승에 의존적이다. GLP-1은 편재성 효소인 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의해 신속하게 불활성화된다. 엑센딘(exendin)-4는 인슐린을 분비하는 세포 상의 GLP-1 수용체에 결합하고, 글루코스의 존재 하에 인슐린 분비를 자극하며, 또한 이러한 펩티드는 글루카곤을 억제하고, 위 배출을 지연시키고, 포만감을 증가시키고, 음식 섭취를 감소시킨다. 당뇨병 치료 및 고혈당증 예방을 위해 엑센딘-4의 인슐린자극 활성을 사용하는 것이 제안되었다 (잉(Eng), 미국 특허 번호 5,424,286). 그러나, GLP-1과 달리, 엑센딘-4는 인간에서의 반감기가 비교적 길고, 추가로, 더 낮은 농도의 엑센딘-4에서 인슐린 분비를 자극하는 능력이 더 강하다.
대사 질환 및 장애에서 연루되는 또 다른 패밀리의 펩티드 호르몬은 아밀린 패밀리의 펩티드 호르몬, 예를 들어, 아밀린, 및 이의 유사체, 예를 들어, 프람린타이드(pramlintide) 및 다발린티드(davalintide)이다. 아밀린 분자는 2개의 번역후 변형이 있다: C-말단이 아미드화되고, 위치 2 및 7의 시스테인이 가교되어 N-말단 루프를 형성한다. 인간 아밀린 유전자의 오픈 리딩 프레임의 서열은 Lys에 대한 N-말단 코돈 앞의 Lys-Arg 2염기성 아미노산 단백질분해성 절단 신호, 및 CLAIMS-말단 위치에서의 Lys-Arg 단백질분해 신호 앞의 Gly (단백질 아미드화 효소 (PAM)에 의한 아미드화에 대해 전형적인 서열)을 나타낸다 (문헌 [Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)]). 아밀린은 위 배출을 지연시키고, 글루카곤 분비를 억제하며, 음식 섭취를 감소시켜, 혈행 내의 글루코스 출현 속도를 조절하는 것으로 여겨진다. 이는 순환으로부터의 글루코스 소멸 속도 및 말초 조직에 의한 글루코스 흡수를 조절하는 인슐린의 작용을 보완하는 것으로 보인다. 이러한 작용은 아밀린이 3가지 이상의 독립적인 메커니즘 (모두 글루코스 출현 속도에 영향을 미침)에 의해 식후 글루코스 제어에서 인슐린의 효과를 보완한다는 것을 가리키는, 설치류 및 인간에서의 실험적 발견에 의해 지지된다. 인간 실험에서, 아밀린 유사체인 프람린타이드가 체중 또는 체중 증가를 감소시키는 것으로 나타났다. 아밀린 모방체가 당뇨병 및 비만과 같은 대사 상태를 치료하는 것에서 이로울 수 있다. 아밀린 모방체는 통증, 골 장애, 위염을 치료하는데, 지질, 특히 트리글리세리드를 조정하는데, 또는 지방을 우선적으로 감소시키는 것 및 제지방 조직(lean tissue)의 보존과 같이 신체 조성에 영향을 미치는데 또한 사용될 수 있다.
대사 질환 및 장애는 비만, 당뇨, 이상지혈증, 인슐린 저항성, 세포성 세포자멸사 등이 포함되는 다수의 형태를 취한다. 비만 및 이와 연관된 장애는 미국에서 및 세계적으로 통상적이고 매우 심각한 공중 보건 문제이다. 상체 비만은 제2형 당뇨병에 대해 공지된 가장 강력한 위험 인자이고, 심혈관 질환에 대한 강력한 위험 인자이다. 비만은 당뇨병, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 담낭 질환, 골관절염, 수면 무호흡, 생식 장애 예컨대 다낭성 난소 증후군, 유방, 전립선 및 결장의 암, 및 일반 마취의 합병증 발생 증가에 대한 공인된 위험 인자이다 (예를 들어, 문헌 [Kopelman, Nature 404: 635-43 (2000)] 참조). 이는 수명을 감소시키고, 상기의 동반-이환, 뿐만 아니라 감염, 정맥류, 흑색 가시세포증, 습진, 운동 불내성, 인슐린 저항성, 고혈압 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 및 혈전색전성 질환과 같은 장애의 심각한 위험을 지닌다 (문헌 [Rissanen et al., Br. Med. J. 301: 835-7 (1990)]). 또한 비만은 인슐린 저항성 증후군, 또는 "X 증후군"으로 칭해지는 상태들의 군에 대한 위험 인자이다. 현재 비만은 불충분하게 치료가능하고, 만성적이며, 본질적으로 난치성인 대사 장애이다. 당뇨병에 걸린 또는 당뇨병이 아닌, 비만이거나 과체중인 사람의 체중 감소에서 유용한 치료 약물은 건강에 대한 충분히 이로운 효과가 있을 수 있다.
당뇨병은 인슐린의 불충분한 생산 또는 이용으로부터 초래되는 고혈당증 및 당뇨를 특징으로 하는 탄수화물 대사의 장애이다. 당뇨병은 선진국에서 인구의 상당 부분의 삶의 질에 심하게 영향을 미친다. 인슐린의 불충분한 생산은 제1형 당뇨병의 특징이고, 인슐린의 불충분한 이용은 제2형 당뇨병이다. 그러나, 환자가 현성 당뇨병에 걸린 것으로 진단되기 오래 전에 발병하는 다수의 별개의 당뇨병-관련 질환이 있는 것으로 현재 널리 인정된다. 또한, 당뇨병에서의 글루코스 대사의 차선적인(suboptimal) 제어로부터의 효과는 광범위한 관련된 지질 및 심혈관 장애를 일으킨다. 과체중 및 비만은 당뇨병과의 통상적인 심각한 동반-이환이고, 일부 경우에는 당뇨병에 이를 수 있거나 또는 당뇨병의 경향을 증가시킬 수 있다.
이상지혈증, 또는 혈장 내의 비정상적인 수준의 지질단백질이 당뇨병 환자에서 빈번하게 발생한다. 이상지혈증은 혈액 내의 상승된 혈장 트리글리세리드, 낮은 HDL (고밀도 지질단백질) 콜레스테롤, 정상 내지 상승된 수준의 LDL (저밀도 지질단백질) 콜레스테롤 및 증가된 수준의 작은 치밀형 LDL (저밀도 지질단백질) 입자를 전형적으로 특징으로 한다. 이상지혈증은 당뇨병 대상체에서 관상동맥 사례 및 사망 발생 증가에 대한 주요 원인 중 하나이다. 역학 연구는 비-당뇨병 대상체와 비교하여 당뇨병 대상체에서의 관상동맥 사망의 수배 증가를 제시함으로써 이를 입증하였다. 몇몇 지질단백질 이상이 당뇨병 대상체에서 기술되었다.
당뇨병과 관련된 여러 이상을 치료하기 위한 시도들이 상이한 환자들에서 이러한 이상들을 다루기 위해 몇몇 항-당뇨병 의약의 투여를 촉구하였다. 항-당뇨병 의약의 예는 인슐린 및 인슐린 유사체와 같은 단백질, 및 인슐린 감작제, 인슐린 분비촉진제 및 식욕 조절 화합물과 같은 소형 분자이고, 이들은 가능한 다중 이상을 다루기 위해 종종 공동으로 투여된다.
상기 기재된 대사 질환, 상태 및 장애에서 유용한 폴리펩티드를 개발하는 것이 여전히 요구된다. 따라서, 본원에서 기재된 질환 및 상태를 치료하는데 유용한 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 생산 및 사용하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
개요
일반적으로 본 발명은 혈장 혈당 수준, 인슐린 수준 및/또는 인슐린 분비의 제어에 의해 및/또는 추가로 체중 감소를 증가시키는 것, 체중을 감소시키는 것, 체중을 유지시키는 것, 체중 증가를 방지하는 것, 음식 섭취를 감소시키는 것, 포만감을 증가시키는 것, 식욕을 감소시키는 것 및/또는 제지방은 보존하지만 지방은 소모시킴으로써 신체 조성을 개선시키는 것에 의해, 또는 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 내에 존재하는 글루코스/인슐린 제어 및 체중 감소/음식 섭취 제어 성질의 조합에 의해 완화될 수 있는 대사 질환 및 장애의 치료 및 예방을 위한 작용제로서 사용하게 하는 다중 약리학적 작용이 있는 신규 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다. 이같은 상태 및 질환에는 고혈당증 및 고혈당증-관련 상태, 당뇨병 및 당뇨병-관련 상태, 비만 및 과체중, 및 글루코스/인슐린 제어-관련 및 체중 감소/음식 섭취-관련 질환 또는 상태 둘 모두가 존재하는 상태가 포함된다. 추가적인 이같은 상태 및 질환에는 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질환, 섭식 장애, 인슐린 저항성, 비만, 제1형, 제2형 및 임신성 당뇨병이 포함되는 임의 유형의 당뇨병, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한 본 발명의 다중-작용 화합물은 고혈당증이, 종종 현성 당뇨병의 부재 하에, 중요 인자이고, 추가로 과체중 또는 비만이 존재하거나 발생할 수 있는 상태, 예를 들어, 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및 대사 증후군 (X 증후군)에서 용도가 확인된다.
미국 및 유럽에서 당뇨병 치료용으로 승인된 GLP-1 수용체 효능제인 엑세나티드, 즉 엑센딘-4에 비교하여, 그리고 기존에 공지된 접합체 펩티드 구축물에 비교하여, 항-당뇨병 폴리펩티드 접합체가 유사한 또는 개선된 글루코스 저하 효과가 있을 수 있고, 추가로 개선된 체중 감소 및/또는 음식 섭취 감소 효과가 있을 수 있다는 것이 이제 예기치 않게 발견되었다. 본원의 개시내용은 이러한 발견을 기초로 한다. 본 발명의 폴리펩티드 접합체는 본원에 기재된 바와 같이 2가지 이상의 약리학적 작용, 예를 들어, 글루코스/인슐린 제어 및 체중/음식 섭취 제어를 제공하여, 우월한 치료 이익, 예를 들어 상승작용적 방식으로 작용하여 다중 대사 기능 및 이상을 개선 또는 정상화시키는 것을 제공한다.
아밀린 모방체 펩티드에 접합된 GLP-1 수용체 효능제 펩티드를 포함하는 본원에 기재된 화합물 1A 및 화합물 2A인 폴리펩티드 접합체가 제공된다. 이러한 폴리펩티드 접합체는 GLP-1 수용체에서 엑센딘-4의 효능작용(agonism)을 나타내고 C1a 수용체에서 다발린티드(davalintide) (아밀린 모방체)의 효능작용을 나타내어, 최소한, 엑센딘-4 또는 다발린티드와 비교하여 체중 감소 및/또는 음식 섭취의 우월한 제어와 함께 글루코스 및 인슐린의 바람직한 제어를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체는 상응하는 기준 화합물, 예를 들어 엑세나티드 또는 다발린티드, 또는 상이한 GLP-1 수용체 효능제 성분 및/또는 상이한 아밀린 모방체 성분이 있는 상응하는 기준 접합체 화합물, 예를 들어 본원에 기재된 화합물 3A 및 화합물 7A보다 우월하다. 이러한 맥락에서, 용어 "우월한"은 질환 또는 장애를 위한 치료의 평가에서 고려될 수 있는 다양한 기능적 성질을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체는 상응하는 기준 화합물보다 최대 효능을 위해 더 낮은 용량, 예를 들어, 1×, 2×, 3×, 4×, 5× 또는 이보다도 더 적은 용량을 필요로 할 수 있다. 추가적인 예로서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체는 효능이 더 높을 수 있고, 예를 들어, 효능이 1.5×, 2×, 3×, 4×, 5×, 10×, 20×, 50×, 또는 이보다도 더 높을 수 있다. 추가적인 예로서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체는 기준 화합물에서 유의한 정도로 확인되지 않는 기능이 있을 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체에 화학적으로 유도체화된 것들이 포함된다는 것이 추가로 이해된다. 이같은 유도체화 펩티드는 하나 이상의 중합체 모이어티(moiety), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 다양한 길이의 지방산 사슬 (예를 들어, 스테아릴, 팔미토일, 옥타노일 등)에 대한 접합, 또는 폴리아미노산, 예컨대 폴리-his, 폴리-arg, 폴리-lys, 및 폴리-ala의 부가를 포함한다. 변형은 소형 분자 모이어티, 예컨대 짧은 알킬 및 구속형(constrained) 알킬 (예를 들어, 분지형, 고리형, 융합형, 아다만틸) 및 방향족 기를 또한 포함할 수 있다. 중합체 모이어티는 전형적으로 분자량이 약 500 내지 약 60,000 달톤일 것이다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이같은 유도체화는 N- 또는 C-말단에서, 또는 폴리펩티드 접합체 내의 아미노산 잔기의 측쇄, 예를 들어 리신 엡실론 아미노 기, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 술프히드릴 기에서 일어날 수 있다. 별법적으로, 접합체 폴리펩티드 전반에 걸쳐 다중 부위에서 유도체화가 일어날 수 있다. 유도체화를 위한 부위(들)를 제공하기 위해, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인으로의 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인의 부가가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5824784 및 5824778을 참조한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 1개, 2개 또는 3개의 중합체 모이어티에 접합될 수 있다. 폴리펩티드 접합체의 PEG화는 이의 수용해도를 개선시킬 수 있고/있거나, 혈장 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나, 경구 흡수율을 개선시킬 수 있다. 한 실시양태에서, PEG화 폴리펩티드 접합체는 리신 측쇄를 포함하고, 여기에 리신 엡실론 아미노 기를 통해 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 공유결합으로 부착되며, 추가적인 실시양태에서, PEG 모이어티의 총 분자량은 약 10,000 달톤 이상, 약 20,000 달톤 이상, 약 40,000 달톤 이상 또는 약 60,000 달톤 이상이다. 한 실시양태에서, PEG 사슬(들)의 분자량은 10,000 달톤 초과 및 60,000 달톤 이하이다.
폴리펩티드 접합체는 치료 목적 (예를 들어, 당뇨병 치료)을 위해; 연구 목적을 위해; 그리고, 개선된 GLP-1 수용체 결합 활성 및/또는 개선된 생체내 글루코스 저하 활성 및/또는 개선된 아밀린 모방체 활성 및/또는 개선된 체중 감소/음식 섭취 제어 활성을 지니는 GLP-1 수용체 효능제 화합물, 예컨대 더 긴 작용 기간, 증가된 용해도 및/또는 감소된 면역원성을 지니는 유도체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용은 치료 유효량의 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 폴리펩티드 접합체의 합성 방법을 또한 제공한다.
본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여함으로써 당뇨병 치료; 인슐린 저항성 치료; 식후 고혈당증 치료; 혈당 수준 저하; HbA1c 수준 저하; 인슐린 방출 자극; 위 운동 감소; 위 배출 지연; 음식 섭취 감소; 식욕 감소; 체중 감소; 과체중 치료; 및/또는 비만 치료를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 치료하고/하거나; 인슐린 저항성을 치료하고/하거나; 식후 고혈당증을 치료하고/하거나; 혈당 수준을 저하시키고/시키거나; HbA1c 수준을 저하시키고/시키거나; 인슐린 방출을 자극하고/하거나; 위 운동을 감소시키고/시키거나; 위 배출을 지연시키고/시키거나; 음식 섭취를 감소시키고/시키거나; 식욕을 감소시키고/시키거나; 체중을 감소시키고/시키거나; 과체중을 치료하고/하거나; 비만을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여함으로써 고혈당증 및 고혈당증-관련 상태, 당뇨병 및 당뇨병-관련 상태, 비만 및 과체중, 및 글루코스/인슐린 제어-관련 및 체중 감소/음식 섭취-관련 질환 또는 상태 둘 모두가 존재하는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 고혈당증 및 고혈당증-관련 상태, 당뇨병 및 당뇨병-관련 상태, 비만 및 과체중, 및 글루코스/인슐린 제어-관련 및 체중 감소/음식 섭취-관련 질환 또는 상태 둘 모두가 존재하는 상태를 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여함으로써 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질환, 섭식 장애, 인슐린 저항성, 비만, 및 제1형, 제2형 및 임신성 당뇨병이 포함되는 임의 유형의 당뇨병, 및 이들의 조합의 치료를 필요로 하는 대상체에서 고혈압, 이상지혈증, 심혈관 질환, 섭식 장애, 인슐린 저항성, 비만, 및 제1형, 제2형 및 임신성 당뇨병이 포함되는 임의 유형의 당뇨병, 및 이들의 조합을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여함으로써 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및 대사 증후군 (X 증후군)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및 대사 증후군 (X 증후군)을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
폴리펩티드 접합체는 또 다른 항-당뇨병 및/또는 항-비만 작용제와 공동-투여될 수 있다. "공동-투여"는 2가지 이상의 활성제가 단일 조성물로서 투여되는 것, 별도의 용액으로서 동시에 투여되는 것을 의미하거나, 또는 서로에 대해 상이한 시점에, 예컨대 서로로부터 4시간, 8시간 또는 12시간 이내에 투여될 수 있다 (예를 들어, 폴리펩티드 접합체의 위 배출 지연 효과로 인한 제2 작용제의 흡수 방해를 피하기 위해). 폴리펩티드 접합체 대 제2 작용제의 정확한 비율은 대상체의 요구 및 의사에 의해 결정되는 바에 부분적으로 좌우될 것이다.
폴리펩티드 접합체는 폴리펩티드 접합체의 사용에 대한 설명서를 포함하는, 대상체가 사용하기에 적절한 키트 내에 제공될 수 있다.
도 1a 및 1b: 도 1a는 실시예에 기재된 바와 같이 도 1a에 제시된 양의 화합물 2A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO (식이에 의해 유도된 비만) 래트에서의 체중 변화를 도해하는 그래프이다. 도 1b는 실시예에 기재된 바와 같이 도 1b에 제시된 양의 화합물 1A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트에서의 체중 변화를 도해하는 그래프이다. 위첨자를 공유하지 않는 군들은 서로 유의하게 상이하고 (p<0.05), 예를 들어 도 1a 및 1b의 비히클 대조군은 서로 유의하게 상이하지 않다.
도 2a 및 2b: 도 2a는 실시예에 기재된 바와 같이 도 2a에 제시된 양의 화합물 2A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트에서의 총 누적 음식 섭취를 도해하는 그래프이다. 도 2b는 실시예에 기재된 바와 같이 도 2b에 제시된 양의 화합물 1A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트에서의 총 누적 음식 섭취를 도해하는 그래프이다. 위첨자를 공유하지 않는 군들은 서로 유의하게 상이하고 (p<0.05), 예를 들어 도 2a 및 2b의 비히클 대조군은 서로 유의하게 상이하지 않다.
도 3: 도 3은 실시예에 기재된 바와 같이 도 3에 제시된 양의 화합물 2A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트에서의 지방축적(adiposity) 변화를 나타내는 그래프이다. 위첨자를 공유하지 않는 군들은 서로 유의하게 상이하다 (p<0.05).
도 4: 도 4는 실시예에 기재된 바와 같이 도 4에 제시된 양의 화합물 1A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트에서의 지방축적 변화를 나타내는 그래프이다. 위첨자를 공유하지 않는 군들은 서로 유의하게 상이하다 (p<0.05).
도 5: 도 5는 실시예에 기재된 바와 같이 도 5에 제시된 양의 화합물 2A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트의 제지방 체중 % 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6: 도 6은 실시예에 기재된 바와 같이 도 6에 제시된 양의 화합물 1A 또는 기타 화합물이 투여된 DIO 래트의 제지방 체중 % 변화를 나타내는 그래프이다. *비히클에 대해 p<0.05.
도 7A 및 7B: 도 7A 및 7B는 본원에 기재된 만성 DIO 래트 연구로부터의 화합물 1A, 화합물 2A 및 화합물 3A에 대한 제14일 (도 7A) 및 제28일 (도 7B)의 체중 감소 (PD 성질)와 상관된 측정된 혈장 약물 수준 (PK 성질)을 나타내는 그래프이다.
상세한 설명
"GLP-1 수용체 효능제 화합물"은 본원 및 문헌 [Hargrove et al., Regulatory Peptides, 141:113-119 (2007)] (이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 수단 예컨대 수용체 결합 연구, cAMP 생성 또는 생체내 혈당 및/또는 인슐린 분비 검정에 의해 평가했을 때 엑센딘 기준 펩티드 (예를 들어, 엑센딘-4) 또는 GLP-1(7-37) 기준 펩티드의 생물학적 활성을 유발하는 화합물을 지칭한다. GLP-1 수용체 효능제 화합물에는, 예를 들어, 천연 엑센딘, 엑센딘 유사체, 천연 GLP-1, GLP-1 유사체, GLP-1(7-37), 및 GLP-1(7-37) 유사체가 포함된다.
용어 "엑센딘"은 힐라 몬스터(Gila monster)의 타액 분비물에서 발견되는 천연 발생 엑센딘 펩티드 (또는 천연 발생 엑센딘 펩티드의 합성판)을 포함한다. 엑센딘은 이러한 분자의 아미드화 형태, 산 형태, 제약상 허용되는 염 형태, 및 임의의 기타 생리학적으로 활성인 형태를 포함한다. 한 실시양태에서, 용어 엑센딘은 용어 "엑센딘 효능제"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"엑센딘 유사체"는 본원 및 문헌 [Hargrove et al., Regulatory Peptides, 141:113-119 (2007)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 수단 예컨대 수용체 결합 검정 또는 생체내 혈당 검정에 의해 평가했을 때, 엑센딘 기준 펩티드 (예를 들어, 엑센딘-4)의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 활성을 유발하는, 펩티드, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가를 함유하는 펩티드, 펩티드 모방체, 기타 변형물, 및/또는 기타 화학적 모이어티를 지칭한다. 엑센딘 유사체는 이러한 분자의 아미드화 형태, 산 형태, 제약상 허용되는 염 형태, 및 임의의 기타 생리학적으로 활성인 형태를 포함한다. 한 실시양태에서, 용어 엑센딘 유사체는 용어 "엑센딘 효능제 유사체"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
엑세나티드 (엑센딘-4)는 현재 제2형 당뇨병의 치료에 지시되는 39개 아미노산의 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 수용체 효능제이고, DIO 래트에게 투여되었을 때 체중 감소 및 기타 대사 작용을 또한 발휘한다. 엑센딘-4의 서열은 하기와 같다: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (서열 1) [여기서, -NH2는 C-말단 아미드화 아미노산의 존재를 지시한다]. 엑센딘-4는 이의 유리 산 형태에서 또한 활성이다. 문헌 [Hargrove et al., Regulatory Peptides, 141:113-119 (2007)]에서, 천연 엑센딘-4와 비교하여 위치 14에서의 단일 뉴클레오티드 차이가 있는 전장 C-말단 아미드화 엑센딘-4 펩티드 유사체이고, 본원에서 화합물 4A로 지정된 엑센딘-4 펩티드 유사체가 보고되었다. 하그로브(Hargrove)는 위 배출 지연, 항-비만 성질 및 반감기와 관련하여 이러한 엑센딘-4 유사체 화합물 4A가 엑센딘-4보다 현저하게 열등하다는 것을 보고하였다. 화합물 4A의 서열은 하기와 같다: HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (서열 2). 또 다른 엑센딘-4 펩티드 유사체가 본원에서 화합물 5로 지정되고, 이는 위치 14 및 28에서의 아미노산 치환이 있는 엑센딘-4의 처음 32개의 아미노산에 비-포유동물 (개구리) GLP1의 C-말단으로부터의 5개 아미노산 서열이 이어지는 키메라이다. 화합물 5의 서열은 하기와 같다: HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (서열 3).
엑센딘-4의 생물학적으로 활성인 말단절단 형태인 엑센딘-4(1-28)이 당업계에 또한 공지되어 있고, 이는 본원에서 하기 서열을 지니는 화합물 10으로 지정된다: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN (서열 4); 화합물 10A로 지정된, 이의 아미드 형태의 서열은 하기와 같다: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-NH2 (서열 5).
아밀린은 영양소 섭취 후 췌장 베타-세포에 의해 인슐린과 공동-분비되는 펩티드 호르몬이고, 이의 주요 생리학적 역할은 섭식 행동 및 위 배출의 억제 및 이어지는 체중 감소를 수반한다. "AC-2307"로 또한 공지된 다발린티드는 보도에 따르면 다양한 질환 적응증의 치료에서 유용한 아밀린 효능제이다. WO 2006/083254 및 WO 2007/114838 (이들 각각은 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다)을 참조한다. 다발린티드는 아밀린 또는 칼시토닌(calcitonin) 및 이들의 유사체의 N-말단 루프 영역, 칼시토닌 또는 이의 유사체의 알파-나선형 영역의 적어도 일부분의 알파-나선형 영역 또는 아밀린 알파-나선형 영역 및 칼시토닌 알파-나선형 영역 또는 이들의 유사체의 일부분이 있는 알파-나선형 영역, 및 아밀린 또는 칼시토닌의 C-말단 꼬리 영역이 있는 키메라 펩티드이다. 다발린티드 서열의 아미노산 서열은 하기와 같고, 이는 본원에서 화합물 6A로 지정된다: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (서열 6). 식이-유도 비만 (DIO) 래트에 대해, 아밀린 및 화합물 6A 투여에 의해 유도되는 체중 감소가 지방 질량의 우선적인 상실, 제지방 체중의 보존을 특징으로 한다는 것이 보고되었다.
엑센딘 유사체 및 아밀린 모방체의 기존에 기재된 접합체에는 서열 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (서열 7) [여기서, 폴리펩티드가 C-말단에서 아미드화됨]의 화합물 3A, 및 서열 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN(베타-A)(베타-A)KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (서열 8) [여기서, 폴리펩티드가 C-말단에서 아미드화되고, 베타-알라닌, 베타알라닌 비-천연 아미노산 디펩티드 링커를 함유함]의 화합물 7A가 포함된다. 상기 화합물들은 엑센딘-4의 활성의 C-말단 말단절단된 형태인 화합물 10A 엑센딘-4(1-28) 아미드를 포함한다: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-NH2 (서열 5).
본 발명은 다발린티드 화합물 6A에 공유결합으로 연결된 특정한 엑센딘-4 펩티드 유사체를 포함하는 본원에 기재된 특정한 폴리펩티드 접합체의 우월한 효과의 놀라운 결과를 기초로 한다. 이러한 폴리펩티드 접합체는 본원에 기재된 화합물 1A 및 화합물 2A, 및 이들의 화학적 유도체, 예를 들어 PEG화 유도체이다. 폴리펩티드 접합체는 GLP-1 수용체에서 엑센딘-4의 효능작용을 나타내고 C1a 수용체에서 다발린티드 (아밀린 모방체)의 효능작용을 나타내어, 최소한, 엑센딘-4 또는 다발린티드와 비교하여 우월한 체중 감소/음식 섭취 제어와 함께 글루코스의 제어를 제공한다. 이러한 화합물들은, 공지된 접합체 및 모 펩티드와 비교하여, 우월한 글루코스 제어와 놀랄 만큼 우월한 체중 제어, 뿐만 아니라 우월한 약동학적 특성이 있다. 폴리펩티드 접합체에서 글루코스조절성(glucoregulatory)이고 체중 감소를 유도하는 GLP-1 수용체 효능작용과 지방-특이적 체중 감소를 유도하는 아밀린 모방체 활성이 조합되지만, 모 펩티드 또는 이러한 유형의 공지된 접합체보다 성질들이 우월하고, 예를 들어, 치료 효능이 더 크고, 반감기가 개선된다.
본 발명과 관련된 용어 "폴리펩티드 접합체"는 C-말단에서 아미드화된 화합물 1A 및 화합물 2A를 지칭하고, 이들의 산 형태, 이들의 제약상 허용되는 염 형태, 및 화합물 1A 또는 화합물 2A의 임의의 기타 생리학적으로 활성인 형태 (화학적으로 변형된 유도체, 예를 들어 혈장 반감기를 연장시키거나 경구 섭취를 개선하도록 PEG화 또는 지방산 아실화된 유도체 포함)를 포함한다.
본원에 기재된 화합물 1의 서열은 하기와 같다: HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (서열 9). 이의 C-말단 아미드화 형태가 본 발명의 폴리펩티드 접합체인 서열 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (서열 10)의 화합물 1A이다. 화합물 1A는 글리신-글리신-글리신 펩티드 링커를 통해 화합물 6A에 인-프레임(in-frame)으로 공유결합으로 부착된 화합물 4A의 폴리펩티드 접합체이다. 화합물 2의 서열은 하기와 같다: HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (서열 11). 이의 C-말단 아미드화 형태가 본 발명의 폴리펩티드 접합체인 서열 HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISGGGKCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2 (서열 12)의 화합물 2A이다. 화합물 2A는 글리신-글리신-글리신 펩티드 링커를 통해 화합물 6A에 인-프레임으로 공유결합으로 부착된 화합물 5의 폴리펩티드 접합체이다.
본 연구는 아밀린 모방체 다발린티드 (화합물 6A)에 공유결합으로 연결된 엑센딘-4의 유사체를 포함하는 화합물 1A 및 화합물 2A의 대사 작용 및 pK를 특성화하였다. 실시예에 개시된 바와 같이, 화합물 1A 및 화합물 2A (3, 10, 30 및 100 nmol/kg/d)를 4주 동안 계속 피하 주입하는 것의 효과를 식이-유도 비만 (DIO) 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 모 펩티드인 화합물 6A, 화합물 5 및 화합물 4A (2.8, 15 및 7.2 nmol/kg/; 체중 감소를 위한 최대 유효 용량)의 단일 및 공동-투여와 비교하였다. 간략하게, 화합물 1A 및 화합물 2A가 DIO 래트에서 모 펩티드들의 단일 투여에 비교하여 체중 감소에 대해 더 효과적이었고, 이때 화합물 1A가 화합물 2A와 비교하여 체중 감소에 있어 더 큰 효력 및 효능을 나타냈다. 화합물 1A 및 화합물 2A는 비히클 대조군과 비교하여 체중을 용량 의존적으로 감소시켰다. 화합물 1A 또는 화합물 2A에 의해 유도된 체중 감소는 유의하게 감소된 지방 체중 %와 관련되었다 (100 nmol/kg/d 용량에서, 화합물 2A는 -12.2 ± 1.3％, 화합물 1A는 -15.5 ± 2.2％; 둘 모두 비히클 대조군에 대해 p<0.05). 화합물 2A는 제지방 체중 %를 변경시키지 않았지만, 모든 용량의 화합물 1A는 비히클 대조군과 비교하여 제지방 체중 %를 증가시킴으로써 신체 조성을 개선시켰다. 최고 시험 용량에서, 단일 모 펩티드 투여와 비교하여 화합물 1A 및 화합물 2A 둘 모두에 의해 총 음식 섭취가 유의하게 감소되었다. 화합물 1A의 최고 용량에서, 모 화합물인 화합물 4A 및 화합물 6A의 공동-투여를 넘어서 음식 섭취가 억제되었다. 28일 후, 글루코스, 퍼센트 헤모글로빈 A1c (HbA1c), 인슐린, 총 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤에서의 변화가 화합물 2A 처치에서 관찰되지 않았다. 유사하게, 28일 후 총 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤 또는 HbA1c 수준에 대한 화합물 1A의 유의한 효과가 없었다. 그러나, 비히클 대조군과 비교하여 일부 용량에서 화합물 1A에 의해 혈장 인슐린 및 글루코스 수준이 유의하게 저하되었다. 처치 28일 후 비히클과 비교하여 화합물 1A 및 화합물 2A에 의해 혈장 트리글리세리드가 유의하게 감소되었다. 특이적인 면역검정에 의해 측정된 화합물 1A 및 화합물 2A의 혈장 수준은 처치 2주 후 및 4주 후 둘 모두에 처치 용량에 상응하는 증가하는 수준에서 검출되었다.
화합물 1A 및 화합물 2A 둘 모두 용량-의존적 방식으로 유의한 체중 감소를 유도하였고, 이는 더 높은 시험 용량에서, 단일 펩티드 처치로서 투여된 최대 유효 용량의 모 호르몬에 의해 유도되는 체중 감소를 초과하였다. 최고 용량의 각각의 폴리펩티드 접합체 (100 nmol/kg/d)에 의해 유발된 체중 감소는 30％ (비히클에 대해 보정됨)에 가까웠고, 모 펩티드들의 공동-주입에 의해 달성되는 체중 감소와 동일하거나 (예를 들어, 화합물 2A), 또는 이보다 컸다 (예를 들어, 화합물 1A). 기존의 기준 접합체 화합물, 예를 들어 화합물 3A 및 화합물 7A는 증가된 효능에도 불구하고 모 화합물들보다 체중을 감소시키는 것에서 유의하게 덜 효력이 있었다. 놀랍게 대조적으로, 화합물 1A 및 화합물 2A는 화합물 3A 및 화합물 7A보다 우월한 효력을 나타냈다. 100 nmol/kg/d의 화합물 3A 및 화합물 7A로 약 20％의 체중 감소만이 달성된 반면, 유사한 체중 감소가 10 nmol/kg/d의 화합물 1A 및 화합물 2A만으로 달성되었다. 또한, 화합물 6A (12％), 화합물 4A (14％) 및 화합물 5 (17％)의 체중 감소와 유사하게, 최저 용량인 3 nmol/kg/d의 화합물 1A 또는 화합물 2A 각각이 4주 기간에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 약 11-19％의 유의한 체중 감소를 유발하였다. 또한 화합물 1A는 체중 감소에 대해 화합물 2A보다 더 효과적이었다 (각각 -37％ 대 -28％).
화합물 1A 및 화합물 2A에 의해 유도된 체중 감소는 음식 섭취에서의 용량 의존적 감소와 관련되었다. 추가적으로, 화합물 1A 처치가 감소된 지방 체중 및 부수적인 제지방 체중의 보존 (신체 조성에서의 개선)과 관련되었다. 대조군 DIO 래트가 고인슐린혈증 또는 당뇨병이 아니었음에도 불구하고, 화합물 1A, 뿐만 아니라 모 펩티드 단일 또는 공동-투여로 인슐린을 감소시키는 것에 대한 소소한 효과가 관찰되었지만, 예상밖으로 글루코스 또는 HbA1c에 대해서는 그렇지 않았다.
화합물 1A 및 화합물 2A의 혈장 수준을 특이적 검정을 사용하여 실시예에서 기술된 래트 연구의 제14일 및 제28일에 측정하였다. 두 폴리펩티드 접합체 모두에서 대략적으로 용량-의존적인 증가가 관찰된 한편, 특히 28일 후 화합물 2A의 수준이 화합물 1A의 수준보다 훨씬 더 높은 것으로 보였다. 그러나, PK 프로파일을 각각의 화합물의 약리학적 (PD) 프로파일과 정렬했을 때, 화합물 2A의 PD 효과가 이의 PK 프로파일에 매칭되도록 확장되지 않았다. 달리 말하면, 연구 기간 동안 화합물 2A가 혈청 내에 축적되었을 수 있었더라도, 화합물 1A와 비교하여 이의 PD 효과가 쇠퇴하였다. 이론에 제한되기를 원치 않으면서, 이러한 불일치는 화합물 2A에 대한 항체의 조기 발달을 나타낼 수 있다. 이러한 차이가 화합물 2A PK 검정에서의 일부 방해 (혈장 Ab)에 기인하였더라도, 대조적으로 화합물 1A의 공존하는 확장된 PD 및 PK 프로파일은 화합물 2A에 비해 화합물 1A의 또 다른 중요한, 놀랍게 우월한 성질을 제공한다. 총괄적으로, 화합물 1A 및 화합물 2A는 화합물 3A보다 우월한, DIO 래트에서의 현저한 지방-특이적 체중 감소를 발휘하였고, 이때 화합물 1A가 다른 화합물들 양쪽보다 우월하였다. 매우 높은 정도의 효력 및 효능을 나타내는 화합물 1A 처치는, 기준 화합물 및 접합체와 비교하여, 트리글리세리드-저하 및 항-당뇨병 작용이 포함되는 기타 대사 파라미터에 대한 개선, 뿐만 아니라 오심 없음 또는 감소를 또한 나타냈다(실시예 참조).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체는 화학적으로 유도체화된 접합체를 포함한다. 이같은 유도체화 폴리펩티드 접합체는 하나 이상의 중합체 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 다양한 길이의 지방산 사슬 (예를 들어, 스테아릴, 팔미토일, 옥타노일 등)에 대한 접합, 또는 폴리아미노산, 예컨대 폴리-his, 폴리-arg, 폴리-lys, 및 폴리-ala의 부가를 포함한다. 변형은 소형 분자 모이어티, 예컨대 짧은 알킬 및 구속형 알킬 (예를 들어, 분지형, 고리형, 융합형, 아다만틸) 및 방향족 기를 또한 포함할 수 있다. 중합체 모이어티는 전형적으로 분자량이 약 500 내지 약 60,000 달톤일 것이다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이같은 유도체화는 N- 또는 C-말단에서, 또는 폴리펩티드 접합체 내의 아미노산 잔기의 측쇄, 예를 들어 리신 엡실론 아미노 기, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 술프히드릴 기에서 일어날 수 있다. 별법적으로, 접합체 폴리펩티드 전반에 걸쳐 다중 부위에서 유도체화가 일어날 수 있다. 유도체화를 위한 부위(들)를 제공하기 위해, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인으로의 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 리신, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인의 부가가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5824784 및 5824778을 참조한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 1개, 2개 또는 3개의 중합체 모이어티에 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물이 하나의 폴리에틸렌 글리콜에 연결된다. 폴리펩티드 접합체의 PEG화는 이의 수용해도를 개선시킬 수 있고/있거나, 혈장 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나, 경구 섭취를 개선시킬 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 분자량이 약 200 달톤 내지 약 80,000 달톤; 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤; 약 10,000 달톤 내지 약 50,000 달톤; 또는 약 15,000 달톤 내지 약 40,000 달톤일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형일 수 있다. 한 실시양태에서, PEG화 폴리펩티드 접합체가 리신 측쇄를 포함하고, 여기에 리신 엡실론 아미노 기를 통해 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 공유결합으로 부착된다. 추가적인 실시양태에서, PEG 모이어티의 총 분자량은 약 10,000 달톤 이상, 약 20,000 달톤 이상, 약 40,000 달톤 이상 또는 약 60,000 달톤 이상이다.
한 실시양태에서, 화합물이 1 또는 2개의 폴리에틸렌 글리콜에 연결되고, 이때 폴리에틸렌 글리콜이 친유성 모이어티에 추가로 연결된다. 한 실시양태에서, 이러한 경우의 폴리에틸렌 글리콜은 분자량이 약 200 내지 약 7,000 달톤 또는 약 500 내지 약 5,000 달톤일 수 있다. 친유성 모이어티는 알킬 기 (예를 들어, C1 -20 알킬 기; C1 -10 알킬 기; C1 -6 알킬 기; C1 -4 알킬 기), 지방산 (예를 들어, C4 -28 지방산 사슬; C8 -24 지방산 사슬; C10 -20 지방산 사슬), 콜레스테릴, 아다만틸 등일 수 있다. 알킬 기는 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형일 수 있다. 한 실시양태에서, 지방산은 아세틸화 지방산 또는 에스테르화 지방산이다. -(폴리에틸렌 글리콜)-(친유성 모이어티)는 C-말단 아미노산 잔기, N-말단 아미노산 잔기, 내부 아미노산 잔기 (예를 들어, 내부 Lys 아미노산 잔기), 또는 이들의 조합물 (예를 들어, 화합물이 N-말단 및 C-말단 아미노산 잔기에서 연결됨)에서 화합물에 연결될 수 있다. 이같은 실시양태에서, 유도체는 유도체화되지 않은 화합물 1A 또는 화합물 2A에 비교하여 경구 섭취 및 생체이용률이 우월하다.
한 실시양태에서, 화합물이 폴리아미노산에 연결된다. 예시적인 폴리아미노산에는 폴리-리신, 폴리-아스파르트산, 폴리-세린, 폴리-글루탐산 등이 포함된다. 폴리아미노산은 D형 또는 L형, 바람직하게는 L형일 수 있다. 폴리아미노산은 1개 내지 12개의 아미노산 잔기; 2개 내지 10개의 아미노산 잔기; 또는 2개 내지 6개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 유도체화되지 않은 화합물 1A 또는 화합물 2A에 비교하여 강화된 작용 기간을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 화합물이 지방산에 연결된다. 지방산은 C4-C28 지방산 사슬, C8-C24 지방산 사슬, 또는 C10-C20 지방산 사슬일 수 있다. 한 실시양태에서, 지방산은 아세틸화 지방산이다. 한 실시양태에서, 지방산은 에스테르화 지방산이다. 이러한 유도체는 유도체화되지 않은 화합물 1A 또는 화합물 2A에 비교하여 강화된 작용 기간을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 화합물이 알부민에 연결된다. 알부민은 재조합 알부민, 혈청 알부민, 또는 재조합 혈청 알부민일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물이 알부민-지방산 (즉, 지방산에 연결된 알부민)에 연결된다. 이러한 유도체는 유도체화되지 않은 화합물 1A 또는 화합물 2A에 비교하여 강화된 작용 기간을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 화합물이 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린 Fc 영역에 연결된다. 이뮤노글로불린은 IgG, IgE, IgA, IgD, 또는 IgM일 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물이 IgG Fc 영역 또는 IgM Fc 영역에 연결된다. 이뮤노글로불린 Fc 영역은 (i) 이뮤노글로불린의 중쇄 불변 영역 2 (CH2); (ii) 이뮤노글로불린의 중쇄 불변 영역 3 (CH3); 또는 (iii) 이뮤노글로불린의 중쇄 불변 영역 2 (CH2) 및 3 (CH3) 둘 모두이다. 이뮤노글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 엑센딘 유사체 펩티드에 연결될 수 있는 이뮤노글로불린 Fc 영역에 대한 기타 실시양태가 WO 2008/082274에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 유도체는 유도체화되지 않은 화합물 1A 또는 화합물 2A에 비교하여 강화된 작용 기간을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체가 하나 이상의 중합체, 예컨대 본원에 기재된 것들에 공유결합으로 연결되는 경우, 당업계에 공지된 임의의 연결 기를 사용할 수 있다. 연결 기는 펩티드를 중합체에 연결시키는데 적절한 임의의 화학 기(들)를 포함할 수 있다. 별법적으로, 폴리펩티드 접합체가 어떠한 연결 기도 없이 중합체에 직접적으로 부착될 수 있다. 예시적인 연결 기에는 아미노산, 말레이미도 기, 디카르복실산 기, 숙신이미드 기, 또는 이들 중 2가지 이상의 조합물이 포함된다. 펩티드를 하나 이상의 중합체에 연결시키는 방법이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,329,336; 미국 특허 번호 6,423,685; 미국 특허 번호 6,924,264; WO 2005/077072, WO 2007/022123, WO 2007/053946; WO 2008/058461; 및 WO 2008/082274에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
투여된 폴리펩티드 접합체는 전구약물의 형태일 수 있다. 용어 "전구약물"은 투여 후에, 일부 화학적 또는 생리학적 프로세스, 예를 들어, 단백질분해성 절단을 통해 또는 특정 pH 환경에 도달 시 생체 내에서 약물을 방출하는 약물 전구체인 화합물을 지칭한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 당업계에 공지된 생물학적, 화학적 및/또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 예시적인 방법이 미국 특허 번호 6,872,700; WO 2007/139941; WO 2007/140284; WO 2008/082274; WO 2009/011544; 및 미국 공개 번호 2007/0238669에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 폴리펩티드 접합체를 제조하기 위한 기타 방법이 본원에 기재된다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 표준 고체-상 펩티드 합성 기술, 예컨대 자동 또는 반자동 펩티드 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. 전형적으로, 이같은 기술을 사용하면, 알파-N-카르바모일로 보호된 아미노산 및 및 수지 상의 성장 중인 펩티드 사슬에 부착된 아미노산이 실온에서 불활성 용매 (예를 들어, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리디논, 메틸렌 클로라이드 등) 내에서 커플링제 (예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드, 1-히드록시벤조트리아졸 등)의 존재 하에 염기 (예를 들어, 디이소프로필에틸아민 등)의 존재 하에 커플링된다. 생성된 펩티드-수지로부터 시약 (예를 들어, 트리플루오로아세트산, 피페리딘 등)을 사용하여 알파-N-카르바모일 보호기를 제거하고, 펩티드 사슬에 부가될 원하는 다음 N-보호 아미노산으로 커플링 반응을 반복한다. 적절한 N-보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐 (tBoc), 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 등이 당업계에 주지되어 있다. 펩티드 합성기에서 사용되는 용매, 아미노산 유도체 및 4-메틸벤즈히드릴-아민 수지를 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc.) (캘리포니아주 포스터 시티)에서 구입할 수 있다.
화학적 합성을 위해, 고체상 펩티드 합성을 폴리펩티드 접합체에 사용할 수 있는데, 이는 일반적으로 고체상 합성이 상업적 규모로의 확장성이 우수한 수월한 접근법이고, 비교적 긴 폴리펩티드 접합체에 대해 일반적으로 상용성 있기 때문이다. 캡핑(capping)하면서 NMP/HOBt (옵션 1) 시스템 및 tBoc 또는 Fmoc 화학을 사용하여 자동 펩티드 합성기 (모델 430A, 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드, 캘리포니아주 포스터 시티)로 고체상 펩티드 합성을 수행할 수 있다 (문헌 [Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B Jul. 1, 1988, section 6, pp. 49-70, Applied Biosystems Inc., Foster city, Calif.] 참조). HF로 Boc-펩티드-수지를 절단할 수 있다 (-5℃ 내지 0℃, 1시간). 교대되는 물 및 아세트산으로 수지로부터 펩티드를 추출할 수 있고, 여과물을 동결건조시킬 수 있다. 표준 방법에 따라 Fmoc-펩티드 수지를 절단할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12]). 어드밴스드 켐 테크 합성기(Advanced Chem Tech Synthesizer) (모델 MPS 350, 켄터키주 루이빌)를 사용하여 펩티드를 또한 조립할 수 있다.
워터스 델타 프렙(Waters Delta Prep) 3000 시스템을 사용하여 RP-HPLC (정제용 및 분석용)에 의해 펩티드를 정제할 수 있다. C4, C8 또는 C18 정제용 칼럼 (10 μ, 2.2×25 cm; 비닥(Vydac), 캘리포니아주 헤스페리아)을 사용하여 펩티드를 단리할 수 있고, C4, C8 또는 C18 분석용 칼럼 (5 μ, 0.46×25 cm; 비닥)을 사용하여 순도를 결정할 수 있다. 용매 (A=0.1％ TFA/물 및 B=0.1％ TFA/CH3CN)를 분석용 칼럼에 1.0 ㎖/분의 유량으로, 정제용 칼럼에 15 ㎖/분의 유량으로 전달할 수 있다. 아미노산 분석을 워터스 피코 태그(Waters Pico Tag) 시스템에서 수행할 수 있고, 맥시마(Maxima) 프로그램을 사용하여 프로세싱할 수 있다. 펩티드를 증기상 산 가수분해 (115℃, 20-24 h)에 의해 가수분해시킬 수 있다. 가수분해물을 표준 방법에 의해 유도체화하고 분석할 수 있다 (문헌 [Cohen et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, pp. 11-52, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989)]). 고속 원자 포격 분석을 엠-스캔 인코포레이티드(M-Scan Incorporated) (펜실베이니아주 웨스터 체스터)에 의해 수행할 수 있다. 질량 검정을 아이오딘화세슘 또는 아이오딘화세슘/글리세롤을 사용하여 수행할 수 있다. 비행 시간 검출을 사용하는 플라즈마 흡착 이온화 분석을 어플라이드 바이오시스템즈의 바이오-이온(Bio-Ion) 20 질량 분광측정계에서 수행할 수 있다.
비-펩티드 폴리펩티드 접합체를 업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 포스페이트-함유 아미노산 및 이같은 아미노산을 함유하는 펩티드를 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Bartlett et al., Biorg. Chem., 14:356-377 (1986)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
별법적으로, 폴리펩티드 접합체를 당업계에 주지된 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor (1989)] 참조. 재조합 기술에 의해 생산된 폴리펩티드 접합체들은 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 이같은 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA 포함)를 코돈 용법의 축퇴성을 고려하여 야생형 cDNA, 예를 들어 엑센딘-4, 아밀린으로부터 수득할 수 있고, 지시된 치환을 혼입하도록 원하는 대로 추가로 조작할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열에 미생물 숙주에서의 mRNA의 전사 및 번역을 용이하게 하는 코돈이 혼입될 수 있다. 이같은 제작 서열은 당업계에 주지된 방법에 따라 쉽게 구축될 수 있다. 예를 들어, WO 83/04053 참조. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 임의적으로 N-말단 메티오닐 잔기를 코딩할 수 있다. 본 발명에서 유용한 비-펩티드 폴리펩티드 접합체를 업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 포스페이트-함유 아미노산 및 이같은 아미노산을 함유하는 펩티드를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Bartlett and Landen, Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986)] 참조.
폴리펩티드 접합체 코딩 서열을 함유하고 발현하도록 다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 사용할 수 있다. 여기에는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염되거나 또는 박테리아 발현 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 재조합 단백질 생산에서 유용한 포유동물 세포에는 VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, COS 세포 (예컨대 COS-7), WI 38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 및 293 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 단백질의 재조합 발현을 위한 예시적인 프로토콜이 본원에서 기재된다.
따라서, 폴리뉴클레오티드 서열이 유용한 신규 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터, 형질전환 및 형질감염된 유용한 신규 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포 (배양물에서 성장된 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 포함), 및 본 발명의 접합체 폴리펩티드의 발현이 가능한 이같은 숙주 세포의 배양 성장을 위한 유용한 신규 방법에서 유용하다. 본원에서의 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 요법에 유용할 수 있고, 이러한 경우에 폴리펩티드 접합체의 저생산이 완화되거나 또는 이의 수준 증가에 대한 요구가 충족될 것이다.
본 발명은 본 발명의 접합체 폴리펩티드의 재조합 DNA 생산 방법을 또한 제공한다. (a) 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 상기 DNA 분자의 발현을 용이하게 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 접합체 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포로부터 폴리펩티드 접합체를 생산하는 방법이 제공된다.
숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있고, 박테리아, 포유동물 세포 (예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 원숭이 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 암 세포 또는 기타 세포), 효모 세포, 및 곤충 세포를 포함한다.
재조합 단백질의 발현을 위한 포유동물 숙주 세포가 또한 당업자에게 주지되어 있다. 발현된 단백질을 프로세싱하거나, 단백질 활성을 제공하는데 유용할 특정한 번역후 변형을 일으키는 특별한 능력에 대해 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 폴리펩티드의 이같은 변형에는 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. "프리프로(prepro)" 형태의 단백질을 절단하는 번역후 프로세싱이 정확한 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능에 또한 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들, 예컨대 CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 등이 이같은 번역후 활성을 위한 특이적인 세포 장치 및 특징적인 메카니즘을 지니고, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 확실히 하도록 선택될 수 있다.
별법적으로, 효모 시스템을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 접합체를 생성시킬 수 있다. 폴리펩티드 접합체 DNA의 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭시킨다. 효모 프리-프로-알파 리더(leader) 서열을 코딩하는 DNA를 알파 짝짓기 인자 유전자의 뉴클레오티드 1-20을 함유하는 한 프라이머 및 이러한 유전자의 뉴클레오티드 255-235에 상보적인 또 다른 프라이머를 사용하여 PCR 반응에서 효모 게놈 DNA로부터 증폭시킨다 (문헌 [Kurjan and Herskowitz, Cell, 30:933-43 (1982)]). 프리-프로-알파 리더 코딩 서열 및 폴리펩티드 접합체 코딩 서열 단편을, 프로모터가 성숙형 접합체 폴리펩티드에 융합된 프리-프로-알파 인자로 구성된 융합 단백질의 발현을 지시하도록, 효모 알콜 탈수소효소 (ADH2) 프로모터를 함유하는 플라스미드 내로 결찰시킨다. 문헌 [Rose and Broach, Meth. Enz. 185:234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990)]에 교시된 바와 같이, 벡터는 클로닝 부위 하류의 ADH2 전사 종결인자, 효모 "2-마이크론" 복제 기점, 효모 leu-2d 유전자, 효모 REP1 및 REP2 유전자, 이. 콜라이(E. coli) β-락타마제 유전자, 및 이. 콜라이 복제 기점을 추가로 포함한다. β-락타마제 및 leu-2d 유전자는 각각 박테리아 및 효모에서의 선택을 제공한다. leu-2d 유전자는 효모 내에서의 플라스미드의 카피수 증가를 또한 촉진하여 더 높은 수준의 발현을 유도한다. REP1 및 REP2 유전자는 플라스미드 카피수의 조절에 수반되는 단백질을 코딩한다.
이전 단락에 기재된 DNA 구축물을 공지된 방법, 예를 들어, 리튬 아세테이트 처리를 사용하여 효모 세포 내로 형질전환시킨다 (문헌 [Steams et al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990)]). 성장 배지 내의 글루코스가 고갈되면 ADH2 프로모터가 유도된다 (문헌 [Price et al., Gene 55: 287 (1987)]). 프리-프로-알파 서열은 세포로부터의 융합 단백질의 분비를 초래한다. 부수적으로, 효모 KEX2 단백질은 성숙형 폴리펩티드 접합체로부터 프리-프로 서열을 절단한다 (문헌 [Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984)]).
또한 본 발명의 폴리펩티드 접합체를 효모, 예를 들어 피키아(Pichia)에서, 상업적으로 입수가능한 발현 시스템, 예를 들어, 피키아 발현 시스템(Pichia Expression System) (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 이러한 시스템 또한 분비를 지시하기 위해 프리-프로-알파 서열에 의존하지만, 삽입물의 전사는 메탄올에 의한 유도 시 알콜 산화효소 (AOX1) 프로모터에 의해 구동된다. 분비된 폴리펩티드 접합체를, 예를 들어, 박테리아 및 포유동물 세포 상청액으로부터 상기 폴리펩티드 접합체를 정제하기 위해 사용되는 방법에 의해, 효모 성장 배지로부터 정제한다.
별법적으로, 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 DNA를 바큘로바이러스 발현 벡터, 예를 들어 pVL1393 (파민젠(PharMingen), 캘리포니아주 샌디에고) 내로 클로닝할 수 있다. 그 후, 이러한 접합체 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 제조업자의 지시 (파민젠) 또는 공지된 기술에 따라 사용하여, sF9 단백질이 없는 배지에서 예를 들어 성장된 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 감염시키고, 재조합 단백질을 생산한다. 단백질을 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 헤파린-세파로스 칼럼 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이) 및 순차적 분자 사이징(sizing) 칼럼 (아미콘(Amicon), 매사추세츠주 비벌리)을 사용하여 배지로부터 정제하여 농축시키고, 적합한 용액, 예를 들어 PBS 내에 재현탁시킨다. SDS-PAGE 분석이, 예를 들어, 원하는 접합체 단백질의 크기가 확인되는 단일 밴드를 나타냄으로써, 단백질을 특성화하는데 사용될 수 있고, 전체 아미노산 아미노산 서열 분석, 예를 들어, 프로톤(Proton) 2090 펩티드 서열분석기 상에서의 에드만(Edman) 서열분석, 또는 이의 N-말단 서열의 확인도 마찬가지일 수 있다.
예를 들어, 예상되는 성숙형 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 DNA 서열을 원하는 프로모터 및 임의로 리더 서열을 함유하는 플라스미드 내로 클로닝할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Better et al., Science 240:1041-3 (1988)] 참조). 이러한 구축물의 서열을 자동 서열분석에 의해 확인할 수 있다. 이어서, 박테리아의 CaCl2 인큐베이션 및 열 충격 처리를 사용하는 표준 절차를 사용하여, 플라스미드를 이. 콜라이 균주 MC1061 내로 형질전환시킨다 ([Sambrook et al., 상기 문헌]). 형질전환된 박테리아를 카르베니실린이 보충된 LB 배지 내에서 성장시키고, 발현된 단백질의 생산을 적절한 배지 내에서의 성장에 의해 유도한다. 존재하는 경우, 리더 서열은 성숙형 폴리펩티드 접합체의 분비에 영향을 미칠 것이고, 분비 동안 절단될 것이다. 분비된 재조합 폴리펩티드 접합체를 박테리아 배양 배지로부터 본원에 기재된 방법에 의해 정제한다.
별법적으로, 폴리펩티드 접합체를 곤충 시스템에서 발현시킬 수 있다. 단백질 발현을 위한 곤충 시스템은 당업자에게 주지되어 있다. 한 이같은 시스템에서, 오토그래파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 다면체형성 바이러스 (AcNPV)를 벡터로 사용하여 스포롭테라 프루기페르다 세포 내에서 또는 트리코플루시아 라르바에(Trichoplusia larvae) 내에서 외래 유전자를 발현시킨다. 바이러스의 비필수 영역, 예컨대 폴리헤드린 유전자 내로 폴리펩티드 접합체 코딩 서열이 클로닝되고, 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 놓인다. 폴리펩티드 접합체의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자가 불활성이게 할 것이고, 코트 단백질 코트가 없는 재조합 바이러스가 생산될 것이다. 그 후, 재조합 바이러스를 사용하여 스포롭테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 라르바에를 감염시키고, 여기에서 본 발명의 폴리펩티드 접합체가 발현된다 (문헌 [Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983)]; [Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994)]).
또다른 예에서, 폴리펩티드 접합체를 코딩하는 DNA 서열을 PCR에 의해 증폭시키고 적합한 벡터, 예를 들어, pGEX-3X (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이) 내로 클로닝시킬 수 있다. pGEX 벡터는 벡터에 의해 코딩되는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 벡터의 클로닝 부위 내로 삽입된 DNA 단편에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생산하도록 디자인된다. PCR용 프라이머는, 예를 들어, 적합한 절단 부위를 포함하도록 생성될 수 있다. 그 후, 재조합 융합 단백질을 융합 단백질의 GST 부분으로부터 절단할 수 있다. pGEX-3X/폴리펩티드 접합체 구축물을 이. 콜라이 XL-1 블루(Blue) 세포 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라호야) 내로 형질전환시키고, 개별적인 형질전환체들을 단리하고, 600 nm 파장에서의 광학 밀도가 0.4가 될 때까지 37℃에서 LB 배지 (카르베니실린이 보충됨) 내에서 성장시킨 후, 4시간 동안 0.5 mM 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노시드 (시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Co.), 미주리주 세인트루인스)의 존재 하에 추가로 인큐베이션한다. 개별적인 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 정제하고, 자동 서열분석기를 사용하여 부분적으로 서열분석하여, 원하는 접합체 폴리펩티드-코딩 유전자 삽입물이 적절한 배향으로 존재하는 것을 확인한다.
박테리아에서 불용성 봉입체로서 생산될 것으로 예상되는 경우, 융합 단백질을 하기와 같이 정제할 수 있다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고; 0.15 M NaCl, 10 mM 트리스(Tris) (pH 8), 1 mM EDTA에서 세척하고; 0.1 ㎎/㎖ 리소자임 (시그마 케미컬 컴퍼니)으로 15분 동안 실온에서 처리한다. 용해물을 초음파처리에 의해 청정화시키고, 세포 잔해물을 10분 동안 12,000×g에서의 원심분리에 의해 펠릿화시킨다. 융합 단백질을 함유하는 펠릿을 50 mM 트리스 (pH 8) 및 10 mM EDTA에 재현탁시키고, 50％ 글리세롤 상에 층을 이루게 하고, 30분 동안 6000×g에서 원심분리한다. 펠릿을 Mg++ 및 Ca++가 없는 표준 포스페이트 완충 염수 용액 (PBS) 내에 재현탁시킨다. 재현탁된 펠릿을 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분획화시킴으로써 융합 단백질을 추가로 정제한다 ([Sambrook et al., 상기 문헌]). 겔을 0.4 M KCl에 침지시켜 단백질을 가시화시키고, 이를 절제하여 SDS가 없는 겔-러닝 완충제 내에서 전기용리시킨다. GST/폴리펩티드 접합체 융합 단백질이 박테리아에서 가용성 단백질로 생산되는 경우, GST 정제 모듈(Purification Module) (파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech))을 사용하여 이를 정제할 수 있다.
성숙형 접합체 폴리펩티드로부터 GST가 절단되도록 융합 단백질을 소화시킬 수 있다. 소화 반응물 (0.5 ㎖ PBS 내의 20-40 ㎍ 융합 단백질, 20-30 유닛 인간 트롬빈 (4000 U/㎎ (시그마))을 16-48시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 변성 SDS-PAGE 겔 상에 로딩(loading)하여, 반응 생성물을 분획화시킨다. 겔을 0.4M KCl에 침지시켜 단백질 밴드를 가시화시킨다. 폴리펩티드 접합체의 예상 분자량에 상응하는 단백질 밴드의 신원을 자동 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템즈 모델 473A, 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 부분적인 아미노산 서열 분석에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 접합체의 특정한 예시적인 재조합 발현 방법에서, pCMV 벡터 (5' CMV 프로모터, 3' HGH 폴리 A 서열) 내의 폴리펩티드 접합체 cDNA를 함유하는 플라스미드와 pSV2neo (neo 저항성 유전자 함유)로 인산칼슘 방법에 의해 293 세포를 공동-형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 형질전환 전에 벡터들을 ScaI로 선형화시켜야 한다. 유사하게, neo 유전자가 혼입된 유사한 pCMV 벡터를 사용하는 별법적인 구축물을 사용할 수 있다. 10-14일 동안 0.5 ㎎/㎖ G418 (네오마이신-유사 항생제)을 함유하는 성장 배지에서의 한계 희석에 의해 단일 세포 클론으로부터 안정한 세포주를 선택한다. 세포주를 폴리펩티드 접합체 발현에 대해 ELISA 또는 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 스크리닝하고, 고-발현 세포주를 대규모 성장을 위해 확장시킨다.
형질전환된 세포를 장기간의 고수율 단백질 생산에 사용하는 것이 바람직하고, 따라서 안정한 발현이 바람직하다. 일단 이같은 세포가 원하는 발현 카세트와 함께 선택 마커를 함유하는 벡터로 형질전환되면, 세포를 1-2일 동안 강화 배지에서 성장시킨 후, 선택 배지로 교체시킬 수 있다. 선택 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하도록 디자인되고, 마커의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 성장 및 회수되도록 한다. 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 클럼프(clump)를 세포에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
다수의 선택 시스템을 사용하여 재조합 단백질 생산을 위해 형질전환된 세포를 회수할 수 있다. 이같은 선택 시스템에는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 내의 HSV 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr; 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt; 아미노글리코시드, G418에 대한 저항성을 부여하는 neo; 클로르술푸론에 대한 저항성을 부여하는 also; 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro에 대해 항-대사산물 저항성이 선택의 기초로 사용될 수 있다. 유용할 수 있는 추가적인 선택 유전자에는 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용하도록 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD가 포함된다. 형질전환체의 확인을 위한 가시적인 지표물을 제공하는 마커에는 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질인 GUS, 및 루시페라제 및 이의 기질인 루시페린이 포함된다.
자동 펩티드 합성과 재조합 기법 둘 모두를 조합하여 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 접합체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 접합체는 결실, 치환, 삽입 및 PEG화에 의한 유도체화 (또는 기타 모이어티, 예를 들어 중합체, 지방산 사슬, C-말단 아미드화)가 포함되는 변형들의 조합을 함유할 수 있다. 이같은 폴리펩티드 접합체는 단계적으로 생산될 수 있다. 첫 번째 단계에서, 결실, 치환, 삽입 및 이들의 임의의 조합의 변형을 함유하는 중간체 폴리펩티드 접합체를 기술된 바와 같은 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 그 후, 본원에 기재된 바와 같은 임의적인 정제 단계 후에, 중간체 폴리펩티드 접합체를 적합한 PEG화 시약 (예를 들어, 넥타 트랜스포밍 쎄러퓨틱스(NeKtar Transforming Therapeutics) (캘리포니아주 샌 칼로스))로부터 입수)으로의 화학적 변형을 통해 PEG화시켜 (또는 기타 화학적 유도체화, 예를 들어 아실화 C-말단 아미드화에 적용하여), 원하는 폴리펩티드 접합체 유도체를 수득한다. 당업자는 상기 기재된 절차가 당업계에 주지되고 본 발명에 의해 고려되는 결실, 치환, 삽입, 유도체화 및 기타 변형 수단으로부터 선택된 변형들의 조합을 함유하는 폴리펩티드 접합체에 적용되도록 일반화될 수 있음을 인지할 것이다.
배양 배지 내로 분비될 알파-인자 융합 단백질로서 예를 들어 효모 (예를 들어 피키아)에서 합성된 글리신 아미노산-C-말단 확장 전구체의 사용에 의해 C-말단 아미드화가 달성될 수 있다. 정제 후, 폴리펩티드 접합체 전구체의 C-말단 글리신이 효소성 아미드화, 예를 들어 펩티딜글리신 알파-아미드화 모노옥시게나제 (PAM)에 의해 아미드로 전환될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)] 참조한다. 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6319685를 또한 참조할 수 있고, 이는 단백질 1 ㎎ 당 약 25 mU 이상의 비활성(specific activity)을 나타내도록 알파-아미드화 효소 면에서 충분히 순수하고, 천연 공급원으로부터 정제되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 기질과 함께 사용하기에 적절하도록 단백질분해성 불순물이 충분히 없는 래트로부터의 알파-아미드화 효소가 포함되는, 효소성 아미드화를 위한 방법을 교시한다.
제제. 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체들 중 하나 이상 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 폴리펩티드 접합체는 제약 조성물 내에 치료 유효량으로 존재할 수 있고, 치료 효능을 위한 최소 혈장 수준을 제공하는 양으로 존재할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 함유하는 제약 조성물은 말초 투여, 예컨대 비경구 (예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내), 국소, 비강 또는 경구 투여용으로 제공될 수 있다. 적절한 제약상 허용되는 담체 및 이의 제형이 표준 제형에 관한 전문 서적, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Martin]; 및 [Wang et al., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988)]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체는 주사 또는 주입용 비경구 조성물에서 제공될 수 있다. 예를 들어, 이들은 물; 불활성 오일, 예컨대 식물성 오일 (예를 들어, 참깨, 땅콩, 올리브 오일 등); 또는 기타 제약상 허용되는 담체 내에 현탁될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 수성 담체, 예를 들어, pH 약 3.0 내지 8.0, 또는 약 3.0 내지 5.0의 등장성 완충제 용액 내에 현탁될 수 있다. 조성물을 통상적인 멸균 기법에 의해 멸균시킬 수 있거나, 또는 멸균 여과시킬 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하는데 필요한 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 완충제를 함유할 수 있다. 유용한 완충제에는, 예를 들어, 아세트산 완충제가 포함된다. 피하 주사, 경피 주사 또는 기타 전달 방법 후에 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 치료 유효량의 제제가 혈류 내로 전달되도록 저장소 또는 "데포(depot)" 저속 방출 제제 형태가 사용될 수 있다. 원하는 등장성은 염화나트륨 또는 기타 제약상 허용되는 작용제 예컨대 덱스트로스, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌 글리콜, 폴리올 (예컨대 만니톨 및 소르비톨), 또는 기타 무기 또는 유기 용질을 사용하여 달성할 수 있다. 나트륨 이온을 함유하는 완충제에 대해 특히 염화나트륨이 바람직하다.
폴리펩티드 접합체는 이의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, 산 부가염) 및/또는 복합체로서 또한 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 투여되는 농도에서 비-독성 염이다. 제약상 허용되는 염에는 산 부가염 예컨대 술페이트, 히드로클로라이드, 포스페이트, 술파메이트, 아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 시클로헥실술파메이트 및 퀴네이트를 함유하는 염이 포함된다. 염산, 황산, 인산, 술팜산, 아세트산, 시트르산, 락트산, 타르타르산, 말론산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 시클로헥실술팜산 및 퀸산과 같은 산으로부터 제약상 허용되는 염을 수득할 수 있다. 아세테이트, 트리플루오로아세테이트 또는 히드로클로라이드 염 형태가 본원에서 특히 사용된다. 예를 들어, 염이 불용성인 용매 또는 매질에서, 또는 추후 진공에서 또는 동결-건조에 의해 제거되는 물과 같은 용매에서 유리 산 또는 염기 형태의 생성물을 1 이상의 등가량의 적합한 염기 또는 산과 반응시킴으로써, 또는 적절한 이온 교환 수지에서 기존 염의 이온을 다른 이온으로 교환함으로써, 이같은 염들을 제조할 수 있다.
담체 또는 부형제를 또한 사용하여 폴리펩티드 접합체의 투여를 용이하게 할 수 있다. 담체 및 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 예컨대 락토스, 글루코스 또는 수크로스, 또는 전분 유형, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 생리학상 상용성인 용매가 포함된다.
원한다면, 상기 조성물의 용액을 메틸 셀룰로스와 같은 증점제로 증점시킬 수 있다. 이는 유중수 또는 수중유의 에멀젼화 형태로 제조될 수 있다. 아카시아 분말, 비-이온성 계면활성제 (예컨대 트윈(Tween), 또는 이온성 계면활성제 (예컨대 알칼리 폴리에테르 알콜 술페이트 또는 술포네이트, 예를 들어, 트리톤(Triton))이 예를 들어 포함되는 광범위한 제약상 허용되는 유화제 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
일반적으로 허용되는 절차에 따라 성분들을 혼합함으로써 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 선택된 성분들을 블렌더 또는 기타 표준 장치에서 간단하게 혼합하여 농축 혼합물을 생산할 수 있고, 그 후, 물 또는 증점제 및 가능하게는 pH를 조절하기 위한 완충제 또는 등장성을 조절하기 위한 추가적인 용질을 첨가함으로써 이를 최종 농도 및 점도로 조정할 수 있다.
본원에 기재된 질환들을 치료하기 위한 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체의 치료 유효량은 전형적으로 약 0.01 ㎍ 내지 약 5 mg; 약 0.1 ㎍ 내지 약 2.5 mg; 약 1 ㎍ 내지 약 1 mg; 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍; 또는 약 1 ㎍ 내지 약 25 ㎍일 것이다. 별법적으로, GLP-1 수용체 효능제 폴리펩티드 접합체의 치료 유효량은 70 kg 대상체의 체중을 기초로 약 0.001 ㎍ 내지 약 100 ㎍; 또는 70 kg 대상체의 체중을 기초로 약 0.01 ㎍ 내지 약 50 ㎍일 수 있다. 이러한 치료 유효 용량은 제제에 따라 1회/일, 2회/일, 3회/일, 1회/주, 격주, 또는 1회/월로 투여될 수 있다. 투여되는 정확한 용량은, 예를 들어, 제제, 예컨대 즉각 방출 제제 또는 장기 방출 제제에 의해 결정된다. 경피, 비강 또는 경구 투여 형태에 대해, 투여량이 약 5배 내지 약 10배 증가될 수 있다.
강화된 체중 감소 성질과 함께 항-고혈당증 성질이 있는 본원에 기재된 접합된 폴리펩티드, 및 이러한 접합된 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물은 고혈당증을 감소시키거나 예방하거나 치료하기 위해 혈당 수준을 제어하는 것 및/또는 과체중 또는 비만을 예방하거나 치료하거나 제어하기 위해 체중 감소 또는 음식 섭취를 제어하는 것이 이로운, 본원에 기재된 바와 같은 수많은 대사 질환 및 상태를 치료하는데 유용하다. 고혈당증을 치료 또는 예방하는 것은 당뇨병전기, 비정상적인 당불내성, 인슐린 저항성 및 당뇨병을 치료 또는 예방하는 것의 중심이 된다. 당뇨병은 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병일 수 있다. 본 발명의 접합된 폴리펩티드는 이러한 상태들, 예를 들어, 예를 들어 제II형 당뇨병 또는 제I형 당뇨병이 과다 섭식, 스트레스, 체중-증가 약물 예컨대 인슐린, 또는 유전적 이상에 의해 예를 들어 야기되는 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향, 또는 당업계의 임상의에게 공지되었을 바와 같은 본원에 기재된 기타 질환 및 상태와 관련되는 경우에 매우 유용하다. 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향이 있거나 없는 당뇨병을 치료하기 위한 방법은 대상체, 전형적으로는 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 접합된 폴리펩티드 중 하나 이상을 투여하여 대상체를 치료하는 것을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 접합체는 고혈당증이, 종종 현성 당뇨병의 부재 하에, 중요 인자이고, 추가로 과체중 또는 비만이 존재하거나 발생할 수 있는 상태, 예를 들어, 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및 대사 증후군 (X 증후군)에서 또한 용도가 확인된다.
비만 및 이의 관련 장애 (과체중 포함)은 미국에서 및 세계적으로 통상적이고 심각한 공중 보건 문제이다. 상체 비만은 제2형 당뇨병에 대해 공지된 가장 강력한 위험 인자이고, 심혈관 질환에 대한 강력한 위험 인자이다. 비만은 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 담낭 질환, 골관절염, 수면 무호흡, 생식 장애 예컨대 다낭성 난소 증후군, 유방, 전립선 및 결장의 암, 및 일반 마취의 합병증 발생 증가에 대한 공인된 위험 인자이다. 예를 들어, 문헌 [Kopelman, 2000, Nature 404:635-43] 참조.
비만은 수명을 감소시키고, 상기 열거된 동반-이환, 뿐만 아니라 감염, 정맥류, 흑색 가시세포증, 습진, 운동 불내성, 인슐린 저항성, 고혈압 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 및 혈전색전성 질환과 같은 장애의 심각한 위험을 지닌다. 예를 들어, 문헌 [Rissanen et al., 1990, Br. Med. J., 301:835-7] 참조. 또한 비만은 인슐린 저항성 증후군, 또는 "X 증후군" 및 대사 증후군으로 칭해지는 상태들의 군에 대한 위험 인자이다. 비만 및 관련 장애의 세계적인 의료 비용이 막대하다.
비만의 병인은 다인성인 것으로 여겨진다. 문제는, 비만 대상체에서, 과도한 지방 조직이 있을 때까지 영양소 이용가능성과 에너지 소비가 균형이 맞지 않는다는 것이다. 중추 신경계 (CNS)는 에너지 균형을 제어하고, 동물의 대사 상태에 적합한 다양한 행동 활성, 자율신경 활성 및 내분비 활성을 조정한다. 이러한 활성들을 제어하는 메커니즘 또는 시스템은 전뇌 (예를 들어, 시상하부), 후뇌 (예를 들어, 뇌간), 및 척수에 걸쳐 광범위하게 분포된다. 궁극적으로, 이러한 시스템들로부터의 대사 정보 (즉, 연료 이용가능성) 및 인지 정보 (즉, 학습된 선호도)가 통합되어, 식욕 (음식 추구) 및 성취 (섭취) 행동에 관여하는 결정이 켜지거나 (식사 획득 및 개시), 또는 꺼진다 (식사 종료). 시상하부가 이러한 신호들을 통합한 후 뇌간에 명령을 내리는 것을 주로 담당하는 것으로 생각된다. 뇌간 핵은 성취 모터 제어 시스템의 요소 (예를 들어, 씹기 및 삼키기를 담당하는 근육)를 제어한다. 따라서, 이러한 CNS 핵들이 섭취 행동에 대한 "최종 공통 경로"를 구성하는 것으로 실제로 언급되었다.
신경해부학적 및 약리학적 증거는 에너지 및 영양 항상성의 신호가 전뇌 핵에서 통합된다는 것과 성취 모터 제어 시스템이 뇌간 핵 내에, 가능하게는 삼차신경 모터 핵을 둘러싼 영역 내에 존재한다는 것을 지지한다. 시상하부와 뇌간 사이에는 광범위한 상호 연결이 있다. CNS에 대해 지시된 다양한 항-비만 치료제 (예를 들어, 소형 분자 및 펩티드)는 시상하부에 존재하는 전뇌 기질 및/또는 뇌간에 존재하는 후뇌 기질에 주로 초점을 맞춘다.
비만은 여전히 불완전하게 치료가능하고, 만성적이며, 본질적으로 난치성인 대사 장애이다. 따라서, 대상체에서의 체중 감소 및/또는 체중 유지에 유용한 신규 요법이 요구된다. 이같은 요법은 대상체의 건강에 대해 충분히 이로운 효과에 이를 것이다.
당뇨병 및 심혈관 질환. 당뇨병은 당뇨병 환자 중 전체 사례 치사율의 60％ 내지 70％가 심혈관 합병증의 결과인 만성 복합 질환으로 인식된다. 당뇨병은 관상동맥 심장 질환 위험 등가물로서 간주될 뿐만 아니라, 재발성 심근경색증, 울혈성 심부전, 및 심혈관 사건 후의 사망이 포함되는 유해 사례의 독립적인 예보물로서 또한 확인된다. 더 엄격한 글루코스 제어 및 심혈관 위험 인자에 대한 적극적인 치료의 채택이 당뇨병 환자에서 관상동맥 심장 질환 합병증의 위험을 감소시키고 전체적인 생존을 개선시킬 것으로 예상된다. 그러나, 당뇨병 환자는 비-당뇨병 환자보다 2배 내지 3배 더 급성 심근경색증을 경험하기 쉽고, 당뇨병 환자는 비-당뇨병 환자보다 8년 내지 13년 더 적게 산다.
당뇨병/급성 심근경색증 환자의 고위험 성질을 이해하여, 불안정 협심증 또는 비-ST-상승 심근경색증 (총괄적으로 "ACS"로 지칭됨)에 걸린 입원 환자의 관리에 대한 미국 심장학회/미국 심장 협회 ("ACC/AHA") 임상 진료 지침은 입원 당뇨병 환자가 고혈당증의 적극적인 관리를 필요로 하는 특수 집단이라는 것을 최근에 인정하였다. 구체적으로, 10 mg/dL 미만의 식전 글루코스, 180 mg/dL 미만의 최대 일일 목표 및 7％ 미만의 퇴원 후 헤모글로빈 A1c를 달성하도록 입원 당뇨병/ACS 환자에 대한 글루코스-저하 요법이 표적화되어야 한다고 지침에서 언급된다.
전국적인 노인 ACS 환자 샘플에서, 당뇨병 환자에서의 30일 사망률의 증가가 병원 입원 시 글루코스 값이 더 높은 환자에 상응하였음이 실연되었다. 문헌 ["Diabetic Coronary Artery Disease & Intervention," Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, September 20, 2002] 참조. 병원 입원 시 일시적인 글루코스 상승보다 지속적인 고혈당증이 심각한 유해 사례와 관련된다는 증거가 증가하고 있다. 환자에서의 고혈당증 및 혈관 위험에 대한 이상적인 측정법이 쉽게 알려지지는 않지만, 입원 동안의 평균 글루코스 값이 사망률에 대해 가장 예보적인 것으로 보인다. 미국 내의 40개를 초과하는 병원으로부터의 ACS 환자의 별도의 연구에서, 지속적인 고혈당증이, 병원 입원 시의 무작위 글루코스 값과 대조적으로, 병원내 사망률에 대해 더욱 예보적이었음이 발견되었다. 문헌 [Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, September 21, 2002] 참조. 입원 시의 글루코스 값과 비교하여, 전체 입원에 걸친 글루코스 제어의 로지스틱 회귀 모델이 사망률에 대해 가장 예보적이었다. 120 mg/dL을 초과하는 글루코스에서 각각의 10 mg/dL 증가에 대해 입원 동안의 사망률 위험이 거의 2배 증가하였다. 연속적인 당뇨병/ACS 환자의 더 작은 코호트에서, 병원 입원 시의 글루코스 수준이 증가하면서 1년 사망률의 단계적 증가가 있었다. 병원 환경에서, ACC/AHA 지침은 입원 동안 더 낮은 혈당을 달성하기 위한 적극적인 인슐린 요법의 개시를 제안한다.
지질 조절 질환. 당업계에 공지된 바와 같이, 지방이영양증은 신체 지방 조직의 비정상적 또는 변성 상태를 특징으로 한다. 이상지혈증은 혈액 내의 정상적인 지질 성분의 파괴이다. 인슐린 수준의 장기 상승이 이상지혈증에 이를 수 있는 것으로 여겨진다. 고지혈증은 상승되거나 비정상적인 수준의 지질 및/또는 지질 단백질이 혈액 내에 존재하는 것이다. 시상하부 무월경은 시상하부를 수반하는 문제로 인해 월경이 수개월 동안 정지된 상태이다. 시상하부 무월경 여성에서의 렙틴 대체 요법이 유해 효과를 야기하지 않으면서 생식, 갑상선 및 성장 호르몬 축 및 골 형성 마커를 개선시킨다는 것이 확인되었다. 예를 들어, 문헌 [Oral et al., N Engl J Med. 2004, 351: 959-962, 987-997] 참조. 지방간 질환, 예를 들어, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 단순한 지방간 (지방축적)에서 비알콜성 지방간염 (NASH), 간경화 (간의 비가역적인 진행 상흔)까지에 이르는 광범위한 간 질환을 지칭한다. NAFLD의 모든 단계는 간 세포 (간세포(hepatocyte)) 내의 지방 축적 (지방 침윤)이 공통적으로 있다. 렙틴이 NASH가 포함되는 다양한 만성 간 질환에서의 염증 및 섬유증 진행에 대한 주요 조절인자 중 하나인 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Ikejima et al., Hepatology Res. 33:151-154] 참조.
추가적으로, 이론에 한정되기를 원치 않으면서, 제2형 당뇨병에서의 상대적인 인슐린 결핍, 글루코스 독성, 및 간 문맥을 통한 복강내 지방 조직으로부터의 전달 상승에 의한 간의 유리 지방산 부하 증가가 지방간 장애의 가능한 원인으로서 연루되는 것으로 여겨진다. 실제로, 섭식 행동이 비만의 대사 증후군을 NASH가 포함되는 이의 다수의 필연적인 결과와 함께 구동시키는 주요 요인인 것으로 가정되었다. 따라서, 음식 섭취를 감소시키고 소식 횟수를 증가시키는 것을 목표로 하는 치료가, 이미 제2형 당뇨병에서 실연된 바와 같이, 효과적으로 NASH를 치료하고 예방할 수 있다. 인슐린 분비 및 체중 감소를 촉진하고 위 배출을 지연시키는 약물이 내당능을 개선하는데 또한 효과적이고, 따라서 지방간을 이의 부수적인 고인슐린혈증과 함께 개선할 수 있다. 따라서, 엑센딘, 엑센딘 유사체 효능제, 엑센딘 유도체 효능제, 특히 엑센딘-4의 사용이 이러한 상태에 대한 치료 양식으로서 상당히 적절할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체가 지방간 장애의 치료에 유용할 수 있다.
대사 증후군 X. 대사 증후군 X는 인슐린 저항성, 이상지혈증, 고혈압, 및 지방 조직의 내장 분포를 특징으로 하고, 제2형 당뇨병의 병리생리학적에서 중추적인 역할을 한다. 또한 이는 NASH, 섬유증, 및 간 경화와 강하게 상관되는 것으로 발견되었다. 따라서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체가 대사 증후군 X의 치료에서 유용할 수 있다.
스테로이드 유발 당뇨병. 글루코코르티코이드는 탄수화물 대사에 영향을 미치는 것으로 주지되어 있다. 외인성 글루코코르티코이드 투여에 반응하여, 간 글루코스 생산 증가, 및 인슐린 분비 및 말초 조직에서의 인슐린-자극 글루코스 흡수 감소가 관찰된다. 또한, 글루코코르티코이드 치료는 당업계에 공지된 바와 같이 프로인슐린(proinsulin) (P1)/면역반응성 인슐린 (IRI) 비율을 변경시킨다. 당뇨병이 없는 대상체에서 글루코코르티코이드에 의해 유도되는 고혈당증의 전형적인 특징에는 공복 혈당의 최소 상승, 악화된 식후 고혈당증, 외인성 인슐린에 대한 무감응, 및 메트포르민 또는 술포닐우레아 요법에 대한 무반응성이 포함된다. 따라서, 아밀린, 엑센딘 또는 다발린티드의 생물학적으로 활성인 (호르몬 도메인) 펩티드 성분, 또는 이들의 단편 또는 유사체를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체가 스테로이드 유발 당뇨병의 치료에서 유용할 수 있다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-1 프로테아제 억제제 (PI)를 일상적인 임상 용도에 도입한 직후에, PT 사용을 고혈당증의 발달과 연결시키는 보고가 나타나기 시작하였다. PI로 치료된 HIV-감염 대상체의 약 1％ 내지 6％에서 당뇨병이 발달될 한편, 상딩히 더 높은 비율에서 인슐린 저항성 및 내당능 손상이 발달될 것이다. 따라서, 아밀린, 엑센딘 또는 다발린티드의 생물학적으로 활성인 (호르몬 도메인) 펩티드 성분, 또는 이들의 단편 또는 유사체를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체가 HIV 치료-유발 당뇨병의 치료에서 유용할 수 있다.
성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA). 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA)으로 또한 공지된 진행성 자가면역성 당뇨병은 제2형 당뇨병으로 진단된 환자의 약 10％에 존재하는 것으로 생각된다. LADA 환자에는 도세포 세포질 항원 또는 더욱 빈번하게는 글루탐산 디카르복실라제에 대한 혈중 항체가 있다. 이러한 대상체들은 제1형 및 제2형 당뇨병 둘 모두에 특징적인 임상 특색을 나타낸다. 저속 진행형에서는 급속 진행형 자가면역성 당뇨병에서보다 인슐린 분비가 더 양호하게 보존되지만, LADA 환자에서 시간이 지남에 따라 인슐린 분비가 악화되는 경향이 있다. 따라서, 아밀린, 엑센딘 또는 다발린티드의 생물학적으로 활성인 (호르몬 도메인) 펩티드 성분, 또는 이들의 단편 또는 유사체를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체가 LADA의 치료에서 유용할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 인슐린 저항성을 치료하는데, 그리고 인슐린 방출을 자극하는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 인슐린 저항성을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 인슐린 저항성을 치료하는 것을 제공한다. 인슐린 방출을 자극하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 인슐린 방출을 자극하는 것을 제공한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 식후 고혈당증을 치료하는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 식후 고혈당증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 식후 고혈당증을 치료하는 것을 제공한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 혈당 수준을 저하시키는데, 그리고 HbA1c 수준을 저하시키는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 혈당 수준을 저하시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 것을 제공한다. 한 실시양태에서, 혈당 수준은 공복 혈당 수준일 수 있다. HbA1c 수준을 저하시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 HbA1c 수준을 저하시키는 것을 제공한다. HbA1c 수준은 일반적으로 대상체의 혈당 수준의 장기 척도이다.
약 12시간 이상, 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 1개월 이상, 약 3개월 이상, 또는 약 6개월 이상의 기간 동안 약 50 pg/㎖ 이상의 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 순환 혈장 수준을 달성하는데 충분한 폴리펩티드 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병, 예를 들어, 제I형, 제II형 또는 임신성 당뇨병을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리펩티드 접합체 약 25 pg/㎖ 이상, 약 50 pg/㎖ 이상, 약 65 pg/㎖ 이상, 약 75 pg/㎖ 이상, 약 100 pg/㎖ 이상, 약 150 pg/㎖ 이상, 약 170 pg/㎖ 이상, 약 175 pg/㎖ 이상, 약 200 pg/㎖ 이상, 약 225 pg/㎖ 이상, 약 250 pg/㎖ 이상, 약 350 pg/㎖ 이상, 약 400 pg/㎖ 이상, 약 450 pg/㎖ 이상, 약 500 pg/㎖ 이상, 약 550 pg/㎖ 이상 또는 약 600 pg/㎖ 이상의 평균 또는 최소 순환 혈장 농도를 달성하는데 충분한 폴리펩티드 접합체의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 농도는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 600 pg/㎖ 또는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 350 pg/㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과, 50 pmoles/ℓ 초과, 60 pmoles/ℓ 초과, 70 pmoles/ℓ 초과, 80 pmoles/ℓ 초과, 90 pmoles/ℓ 초과, 100 pmoles/ℓ 초과, 110 pmoles/ℓ 초과, 120 pmoles/ℓ 초과, 130 pmoles/ℓ 초과, 140 pmoles/ℓ 초과, 또는 150 pmoles/ℓ 초과이다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 150 pmoles/ℓ 미만, 또는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 80 pmoles/ℓ 미만이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 화합물 1A 또는 화합물 2A, 또는 화합물 1A, 또는 이의 유도체이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 농도는 주어진 농도의 엑센딘-4, 화합물 4A, 다발린티드, 또는 엑센딘 + 다발린티드의 조합물로 관찰되는 것과 등가인 생물학적 또는 치료적 효과, 예를 들어 공복 글루코스를 저하시키는 것, 식후 글루코스 폭주를 감소시키는 것, HbA1c를 감소시키는 것 등을 초래하는 폴리펩티드 접합체의 농도이다. 추가적인 실시양태에서, 대상체는 체중 감소를 필요로 하거나 원한다. 추가적인 실시양태에서, 대상체는 또한 체중/음식 섭취 제어를 필요로 하고, 예컨대 체중 감소, 식욕을 감소시키는 것, 포만감을 증가시키는 것, 음식 섭취를 감소시키는 것, 위 배출을 느리게 하는 것, 트리글리세리드를 저하시키는 것, 신체 조성을 개선시키는 것 또는 이들의 임의의 조합을, 추가로 임의적으로는 오심의 발생률 및/또는 중증도의 감소와 함께 필요로 한다.
추가적인 실시양태는, 예를 들어 HbA1c, 일일 평균 혈당, 또는 공복 글루코스의 감소를 필요로 하는 대상체에게, 약 12시간 이상, 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 1개월 이상, 약 3개월 이상, 또는 약 6개월 이상의 기간 동안 약 50 pg/㎖ 이상의 엑센딘, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 순환 혈장 수준을 달성하는데 충분한 양의 폴리펩티드 접합체를 투여하는 것에 의한 HbA1c, 전체적인 일일 평균 혈당 농도, 공복 혈당 및/또는 식후 혈당의 감소 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리펩티드 접합체 약 25 pg/㎖ 이상, 약 65 pg/㎖ 이상, 약 75 pg/㎖ 이상, 약 100 pg/㎖ 이상, 약 150 pg/㎖ 이상, 약 170 pg/㎖ 이상, 약 175 pg/㎖ 이상, 약 200 pg/㎖ 이상, 약 225 pg/㎖ 이상, 약 250 pg/㎖ 이상, 약 350 pg/㎖ 이상, 약 400 pg/㎖ 이상, 약 450 pg/㎖ 이상, 약 500 pg/㎖ 이상, 약 550 pg/㎖ 이상 또는 약 600 pg/㎖ 이상의 평균 또는 최소 순환 혈장 농도를 달성하는데 충분한 폴리펩티드 접합체의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 농도는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 600 pg/㎖ 또는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 350 pg/㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과, 50 pmoles/ℓ 초과, 60 pmoles/ℓ 초과, 70 pmoles/ℓ 초과, 80 pmoles/ℓ 초과, 90 pmoles/ℓ 초과, 100 pmoles/ℓ 초과, 110 pmoles/ℓ 초과, 120 pmoles/ℓ 초과, 130 pmoles/ℓ 초과, 140 pmoles/ℓ 초과, 또는 150 pmoles/ℓ 초과이다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 150 pmoles/ℓ 미만, 또는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 80 pmoles/ℓ 미만이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 화합물 1A 또는 화합물 2A, 또는 화합물 1A 또는 이의 유도체이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 농도는 주어진 농도의 엑센딘-4, 화합물 4A, 다발린티드, 또는 엑센딘 + 다발린티드의 조합물로 관찰되는 것과 등가인 생물학적 또는 치료적 효과, 예를 들어 HbA1c를 저하시키는 것을 초래하는 폴리펩티드 접합체의 농도이다. 한 실시양태에서, 평균 또는 최소 순환 혈장 농도가 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일의 기간 동안 달성된다. 추가적인 실시양태에서, 평균 또는 최소 혈장 농도가 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 약 13주, 약 14주, 약 15주 또는 약 16주의 기간 동안 달성된다. 추가적인 실시양태에서, 평균 또는 최소 혈장 농도가 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 12개월의 기간 동안 달성된다. 엑센딘 또는 엑센딘 효능제 또는 다발린티드의 순환 혈액 농도를 결정하는 임의의 방법을 청구된 방법과 함께 사용할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 대상체는 체중 감소를 필요로 하거나 원한다. 추가적인 실시양태에서, 대상체는 또한 체중/음식 섭취 제어를 필요로 하고, 예컨대 체중 감소, 식욕을 감소시키는 것, 포만감을 증가시키는 것, 음식 섭취를 감소시키는 것, 위 배출을 느리게 하는 것, 트리글리세리드를 저하시키는 것, 신체 조성을 개선시키는 것 또는 이들의 임의의 조합을, 추가로 임의적으로는 오심의 발생률 및/또는 중증도의 감소와 함께 필요로 한다.
식사 전후의 혈당 농도 차이가 감소되도록 식전 혈당 농도와 비교하여 식후 혈당 농도의 증가를 감소시키는 방법이 추가적으로 제공된다. 이는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 7점 자가 모니터링 혈당에 의해 결정되는 바와 같은 하루 동안의 혈당 농도 변동을 작게 한다. 이러한 방법은 약 12시간 이상, 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 1개월 이상, 약 3개월 이상, 또는 약 6개월 이상의 기간 동안 약 50 pg/㎖ 이상의 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 순환 혈장 수준을 달성하는데 충분한 양의 폴리펩티드 접합체를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리펩티드 접합체 약 25 pg/㎖ 이상, 약 65 pg/㎖ 이상, 약 75 pg/㎖ 이상, 약 100 pg/㎖ 이상, 약 150 pg/㎖ 이상, 약 170 pg/㎖ 이상, 약 175 pg/㎖ 이상, 약 200 pg/㎖ 이상, 약 225 pg/㎖ 이상, 약 250 pg/㎖ 이상, 약 350 pg/㎖ 이상, 약 400 pg/㎖ 이상, 약 450 pg/㎖ 이상, 약 500 pg/㎖ 이상, 약 550 pg/㎖ 이상 또는 약 600 pg/㎖ 이상의 평균 또는 최소 순환 혈장 농도를 달성하는데 충분한 폴리펩티드 접합체의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 농도는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 600 pg/㎖ 또는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 350 pg/㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과, 50 pmoles/ℓ 초과, 60 pmoles/ℓ 초과, 70 pmoles/ℓ 초과, 80 pmoles/ℓ 초과, 90 pmoles/ℓ 초과, 100 pmoles/ℓ 초과, 110 pmoles/ℓ 초과, 120 pmoles/ℓ 초과, 130 pmoles/ℓ 초과, 140 pmoles/ℓ 초과, 또는 150 pmoles/ℓ 초과이다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 또는 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 150 pmoles/ℓ 미만, 또는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 80 pmoles/ℓ 미만이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 화합물 1A 또는 화합물 2A, 또는 화합물 1A, 또는 이의 유도체이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 농도는 주어진 농도의 엑센딘-4, 화합물 4A, 다발린티드, 또는 엑센딘 + 다발린티드의 조합물로 관찰되는 것과 등가인 생물학적 또는 치료적 효과, 예를 들어 식후 혈당 폭주, 평균 일일 혈당 등을 감소시키는 것을 초래하는 폴리펩티드 접합체의 농도이다. 한 실시양태에서, 평균 또는 최소 순환 혈장 농도가 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일의 기간 동안 달성된다. 추가적인 실시양태에서, 평균 또는 최소 혈장 농도가 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 약 13주, 약 14주, 약 15주 또는 약 16주의 기간 동안 달성된다. 추가적인 실시양태에서, 평균 또는 최소 혈장 농도가 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 12개월의 기간 동안 달성된다. 엑센딘 또는 엑센딘 효능제 또는 다발린티드의 순환 혈액 농도를 결정하는 임의의 방법을 청구된 방법과 함께 사용할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 대상체는 체중 감소를 필요로 하거나 원한다. 추가적인 실시양태에서, 대상체는 또한 체중/음식 섭취 제어를 필요로 하고, 예컨대 체중 감소, 식욕을 감소시키는 것, 포만감을 증가시키는 것, 음식 섭취를 감소시키는 것, 위 배출을 느리게 하는 것, 트리글리세리드를 저하시키는 것, 신체 조성을 개선시키는 것 또는 이들의 임의의 조합을, 추가로 임의적으로는 오심의 발생률 및/또는 중증도의 감소와 함께 필요로 한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 위 운동을 감소시키는데, 그리고 위 배출을 지연시키는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 위 운동을 감소시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 위 운동을 감소시키는 것을 제공한다. 위 배출을 지연시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 위 배출을 지연시키는 것을 제공한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 음식 섭취를 감소시키는데, 식욕을 감소시키는데, 포만감을 증가시키는데, 그리고 체중을 감소시키는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 고혈당증, 예를 들어 당뇨병, 또는 고혈당증 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 음식 섭취를 감소시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 것을 제공한다. 식욕을 감소시키거나 포만감을 증가시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 식욕을 감소시키는 것을 제공한다. 체중을 감소시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 체중을 감소시키는 것을 제공한다. 본원에 기재된 방법들에서, 대상체는 음식 섭취 감소, 식욕 감소 또는 체중 감소를 필요로 할 수 있다. 본원에 기재된 다른 방법들에서, 대상체는 음식 섭취가 감소되거나, 식욕이 감소되거나 또는 체중이 감소되는 것을 원할 수 있다. 대상체는 임의의 체중일 수 있거나, 또는 과체중 또는 비만일 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 과체중 및 비만을 치료하는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 고혈당증, 예를 들어 당뇨병, 또는 고혈당증 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 과체중을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 과체중을 치료하는 것을 제공한다. 비만을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 비만을 치료하는 것을 제공한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은, 전형적으로는 체중을 감소시키는 것과 함께, 예를 들어, 제지방 근육 대 체지방 비율을 개선시키면서, 신체 조성을 개선시키는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 고혈당증, 예를 들어 당뇨병, 또는 고혈당증 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 신체 조성을 개선시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 신체 조성을 개선하고, 임의적으로는 체중을 감소시키는 것을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 출원은 대상체에서 체중 감소를 야기하는데 효과적인 양의 폴리펩티드 접합체의 투여를 포함하는, 체중 감소를 원하거나 필요로 하는 대상체에서 체중을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에게 체중 감소를 야기하는데 효과적인 폴리펩티드 접합체의 만성 또는 지속 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 체중 감소는 제지방 체중 또는 근육 체중에서의 상응하는 감소 없이 체지방 또는 지방 조직의 감소로 인한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 체지방 감소로 인한 체중 감소가 제지방 체중 또는 근육 체중의 감소로 인한 체중 감소보다 크다. 한 실시양태에서는 제지방 조직 또는 근육과 비교했을 때의 체지방 감소가 절대 체중 기준을 기초로 하는 한편, 또 다른 실시양태에서는 감소된 체중 백분율 기준을 기초로 한다. 한 실시양태에서, 내장 지방의 감소가 비-내장 지방의 감소보다 더 크다. 또 다른 실시양태에서, 비-내장 지방의 감소가 내장 지방의 감소보다 더 크다. 또 다른 실시양태에서, 본 출원은 개체에서, 예를 들어, 지방 대 제지방 조직의 비율을 감소시킴으로써, 체지방 %를 감소시킴으로써, 또는 제지방 조직 %를 증가시킴으로써 신체 조성을 변경시키는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 경우에, "체중 감소"는 대상체의 체중이 줄어드는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 체중이 줄어드는 것은 대상체의 체지방이 우선적으로 줄어드는 것의 결과이다. 한 실시양태에서, 내장 지방의 감소가 비-내장 지방의 감소보다 더 크다. 또 다른 실시양태에서, 비-내장 지방의 감소가 내장 지방의 감소보다 더 크다. 본 발명이 대상체의 체중의 어떠한 특정한 감소에도 좌우되지 않는 한편, 본원에 기재된 방법들은, 다양한 실시양태에서, 대상체의 체중을 본원에 개시된 방법들을 개시하기 전의 대상체의 체중과 비교하여 약 1％ 이상, 약 2％ 이상, 약 3％ 이상, 약 4％ 이상, 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 또는 약 70％ 이상만큼 감소시킬 것이다. 다양한 실시양태에서, 체중 감소가 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 1년 또는 이를 초과하는 기간에 걸쳐 발생한다. 다른 실시양태에서, 약 5 파운드, 약 6 파운드, 약 7 파운드, 약 8 파운드, 약 9 파운드, 약 10 파운드, 약 15 파운드, 약 20 파운드, 약 25 파운드, 약 30 파운드, 약 35 파운드, 약 40 파운드, 약 45 파운드, 약 50 파운드, 약 100 파운드, 약 125 파운드, 약 150 파운드, 약 175 파운드, 약 200 파운드 또는 이를 초과하는 파운드가 대상체에서 감소될 수 있다. 임의의 재현가능한 측정 수단을 사용하여 체중 감소를 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체의 체질량 지수를 계산하고, 대상체의 BMI를 일정 기간에 걸쳐 비교함으로써, 체중 감소를 측정할 수 있다. 이용가능한 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 노모그램(nomogram) 또는 유사한 장치를 사용함으로써, 체질량 지수를 계산할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 이상지혈증을 치료하는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 고혈당증, 예를 들어 당뇨병, 또는 고혈당증 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 이상지혈증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 이상지혈증을 치료하는 것을 제공한다. 이상지혈증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 이상지혈증을 치료하는 것을 제공한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 고트리글리세리드혈증을 치료하는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 고혈당증, 예를 들어 당뇨병, 또는 고혈당증 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 고트리글리세리드혈증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 고트리글리세리드혈증을 치료하는 것을 제공한다. 고트리글리세리드혈증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 고트리글리세리드혈증을 치료하는 것을 제공한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 및 이러한 폴리펩티드 접합체를 포함하는 제약 조성물은 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및/또는 대사 증후군 (X 증후군)을 치료하는데 유용하다. 폴리펩티드 접합체는 이같은 상태들이 고혈당증, 예를 들어 당뇨병, 또는 고혈당증 성향, 또는 과체중 또는 비만 또는 과체중 또는 비만 성향과 추가로 관련되는 경우에 특히 유용하다. 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및/또는 대사 증후군 (X 증후군)을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 질환/상태를 치료하는 것을 제공한다. 스테로이드 유발 당뇨병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 치료-유발 당뇨병, 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 선천적 또는 HIV-관련 지방위축증 또는 "지방 재분포 증후군"에 걸린 대상체에서의 당뇨병 발달, 및/또는 대사 증후군 (X 증후군)을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 투여하여 대상체에서 질환/상태를 치료하는 것을 제공한다.
본원에 기재된 방법들에서, 대상체는 언급된 치료 효과를 필요로 할 수 있고/있거나 언급된 치료 효과를 얻는 것을 원할 수 있다. 대상체는 임의의 체중일 수 있거나, 또는 과체중 또는 비만일 수 있다.
본원에서의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 원하는 결과에 영향을 미치기 위해 유효량의 폴리펩티드 접합체를 대상체에게 만성적으로 또는 지속적으로 투여하는 것을 고려한다.
본원에 개시된 방법들은 임의의, 이같은 방법을 필요로 하는 개별 대상체 또는 방법의 실행이 요망되는 개별 대상체에 대해 사용될 수 있다. 이러한 개체는 인간, 개, 말, 소, 돼지, 및 기타 상업적으로 유용한 동물 또는 반려 동물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유동물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 만성 투여에 의해 폴리펩티드 접합체가 제공된다. 본원에서 사용되는 경우에, "만성 투여"는 장기간 동안 원하는 치료 효과 (활성)을 수득하는데 필요한 혈장 농도를 유지하도록, 급성 방식과 대조적으로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하는 것을 지칭한다. 한 측면에서, "만성 투여"는 혈장 농도를 치료적으로 효과적이거나 원하는 양 또는 이러한 양보다 높은 양으로 유지하도록, 연속적인 방식으로 폴리펩티드 접합체를 투여하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 이같은 만성 투여는 장기간 동안 약 25 pg/㎖ 이상, 약 50 pg/㎖ 이상, 약 65 pg/㎖ 이상, 약 75 pg/㎖ 이상, 약 85 pg/㎖ 이상, 약 100 pg/㎖ 이상, 약 150 pg/㎖ 이상, 약 170 pg/㎖ 이상, 약 175 pg/㎖ 이상, 약 200 pg/㎖ 이상, 약 225 pg/㎖ 이상, 약 250 pg/㎖ 이상, 약 300 pg/㎖ 이상, 약 350 pg/㎖ 이상, 약 400 pg/㎖ 이상, 약 450 pg/㎖ 이상, 약 500 pg/㎖ 이상, 약 550 pg/㎖ 이상 또는 약 600 pg/㎖ 이상의 평균 혈장 폴리펩티드 접합체 농도를 유지시킨다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 농도는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 600 pg/㎖ 또는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 350 pg/㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과, 50 pmoles/ℓ 초과, 60 pmoles/ℓ 초과, 70 pmoles/ℓ 초과, 80 pmoles/ℓ 초과, 90 pmoles/ℓ 초과, 100 pmoles/ℓ 초과, 110 pmoles/ℓ 초과, 120 pmoles/ℓ 초과, 130 pmoles/ℓ 초과, 140 pmoles/ℓ 초과, 또는 150 pmoles/ℓ 초과이다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 150 pmoles/ℓ 미만, 또는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 80 pmoles/ℓ 미만이다. 한 실시양태에서 폴리펩티드 접합체가 화합물 1A 또는 화합물 2A이거나, 또는 다른 실시양태에서는 화합물 1A, 또는 이의 유도체이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 농도는 주어진 농도의 엑센딘-4, 화합물 4A, 다발린티드, 또는 엑센딘 + 다발린티드의 조합물로 관찰되는 것과 등가인 생물학적 또는 치료적 효과, 예를 들어 체중 감소, 글루코스 저하, 신체 조성 변경 등을 초래하는 폴리펩티드 접합체의 농도이다.
또 다른 실시양태에서, 만성 투여는 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도 (평균 또는 최소 혈장 농도)를 약 12시간 이상, 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 4일 이상, 약 5일 이상, 약 6일 이상, 또는 약 7일 이상의 기간 동안 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 만성 투여는 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도를 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 또는 약 4주 이상 또는 약 1개월 이상, 약 2개월 이상, 또는 약 3개월 이상 동안 유지시킨다. 다른 실시양태에서, 연속 방식에 의해 폴리펩티드 접합체가 투여된다. 본원에서 사용되는 경우에, "연속 방식"은 폴리펩티드 접합체를 신체, 예를 들어, 순환 내로 도입하는 것을 지칭하고, 투여 수단을 지칭하지 않는다. 따라서, 연속 방식에 의한 만성 투여가 연속 주입 (정맥내 또는 피하 주입); 연속 또는 간헐적 전달을 위한 펌프 또는 계량 시스템 (이식형 또는 외용형)의 사용; 또는 장기 방출, 저속 방출, 지속 방출 또는 장기 작용 제형 (예를 들어 매일 1회, 일주일에 2번, 매주, 1개월에 2번, 매달, 2개월마다 또는 3개월마다 투여됨)의 사용으로부터 초래될 수 있다. 제제 투여 시 즉각적으로 평균 또는 최소 혈장 수준에 도달할 필요가 없고, 도달하는데 수시간 내지 수일, 수주의 임의의 시간이 걸릴 수 있음을 인지하여야 한다. 일단 도달되면, 평균 또는 최소 혈장 농도가 이의 치료 효과가 있도록 원하는 기간 동안 유지된다.
체중 감소 또는 신체 조성을 변경시키는 것의 맥락에서 본원에서 사용된 경우, "이를 필요로 하는 대상체"는 과체중 또는 비만인 대상체이다. 체중 감소 또는 신체 조성을 변경시키는 것의 맥락에서 본원에서 사용된 경우, "원하는" 대상체는, 예를 들어, 지방 대 제지방 조직의 비율을 줄임으로써, 체중을 감소하거나 신체 조성을 변경시키는 것을 바라는 대상체이다. 한 실시양태에서, 대상체는 비만 또는 과체중 대상체이다. 예시적인 실시양태에서, "과체중 대상체"는 체질량 지수 (BMI)가 25 초과이거나, 또는 BMI가 25 내지 30인 대상체를 지칭한다. 그러나, 과체중의 의미가 BMI가 25를 초과하는 개체에 한정되지 않고, 체중 감소를 원하거나 의학적 또는 미용적 이유로 체중 감소가 필요한 경우의 임의의 대상체를 지칭한다는 것을 인지하여야 한다. 일반적으로 "비만"은 30을 초과하는 체질량 지수로 정의되지만, 본 개시내용의 목적을 위해, 체중 감소를 필요로 하거나 바라는 임의의 대상체가 "비만"의 범주 내에 포함된다. 한 실시양태에서, 인슐린 저항성이거나, 당불내성이거나, 임의 형태의 당뇨병 (예를 들어, 제1형, 제2형 또는 임신성 당뇨병)에 걸린 대상체에게 이러한 방법이 이로울 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 비만이다. 그러나, 본원에 기재된 방법이 내당능 손상, 인슐린 저항성 또는 당뇨병이 없고/없거나 내당능 손상, 인슐린 저항성 또는 당뇨병으로 진단되지 않은 대상체에게 적용될 수 있음을 주지하여야 한다.
당뇨병을 치료하는 것, HbA1c를 감소시키는 것, 식후 혈당을 제어하는 것, 공복 글루코스를 저하시키는 것 및 전체적인 일일 혈당 농도를 감소시키는 것의 맥락에서 본원에서 사용되는 경우, 이를 필요로 하는 대상체는 당뇨병, 내당능 손상, 인슐린 저항성이 있는 대상체, 또는 혈당을 자동조절할 수 없는 대상체를 포함할 수 있다.
당업계에서 통상적으로 사용되는 바와 같은 HbA1c 또는 A1c 또는 당화(glycated) 헤모글로빈 또는 글리코헤모글로빈은 글리코실화 헤모글로빈을 지칭한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체를 체중 감소, 지방 대 제지방 조직 비율 감소 또는 BMI 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에게 만성적으로 투여하는 것을 포함하는, 체중을 감소시키거나, 지방 대 제지방 조직 비율을 감소시키거나, BMI를 감소시키는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 지방 또는 지방 조직의 감소에 기인하는 체중 감소가 제지방 조직으로 인한 체중 감소보다 크다. 또 다른 실시양태에서, 제지방 체중 감소로 인한 체중 감소의 백분율이 전체 체중 감소의 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만, 약 10％ 미만, 약 5％ 미만, 약 2％ 미만, 약 1％ 미만, 또는 0％이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 장기 방출, 저속 방출, 지속 방출 또는 장기 작용 제제로 투여된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 중합체-기반 지속 방출 제제로 투여된다. 이같은 중합체-기반 지속 방출 제제는, 예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 09/942,631 (2001년 8월 31일 출원) (현재 미국 특허 번호 6,824,822) 및 이와 관련된 출원 일련 번호 11/312,371 (2005년 12월 21일 출원); 미국 가출원 번호 60/419,388 (2002년 10월 17일 출원) 및 이와 관련된 미국 특허 출원 일련 번호 10/688,786 및 10/688,059 (2003년 10월 17일 출원); 미국 가출원 번호 60/757,258 (2006년 1월 9일 출원); 미국 가출원 일련 번호 60/563,245 (2004년 4월 15일 출원) 및 이와 관련된 미국 특허 출원 일련 번호 11/104,877 (2005년 4월 13일 출원); 및 미국 특허 출원 일련 번호 11/107,550 (2005년 4월 15일 출원)에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시된 실시양태 또는 방법 중 임의의 것에서, 순환 혈장 폴리펩티드 접합체 농도는 주어진 평균 혈장 농도에서, 또는 주어진 평균 혈장 농도의 약 10％, 약 15％, 약 20％ 또는 약 25％ 이내에서 유지될 수 있다. 다른 실시양태에서, 순환 혈장 농도가 주어진 평균 농도에서, 또는 주어진 평균 농도의 약 98％, 약 97％, 약 96％, 약 95％, 약 90％, 약 80％, 약 70％ 또는 약 60％에서 유지된다. 당업자가 이용가능한 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도를 측정할 수 있다.
본원에 기재된 실시양태 또는 방법 중 임의의 것에서, 폴리펩티드 접합체의 투여는 적어도 약 12시간, 약 24시간 또는 약 48시간 동안 약 50 pg/㎖ 이상의 최소 순환 혈장 폴리펩티드 접합체 농도를 지속시키는데 효과적이다. 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리펩티드 접합체 약 25 pg/㎖ 이상, 약 65 pg/㎖ 이상, 약 75 pg/㎖ 이상, 약 100 pg/㎖ 이상, 약 150 pg/㎖ 이상, 약 170 pg/㎖ 이상, 약 175 pg/㎖ 이상, 약 200 pg/㎖ 이상, 약 225 pg/㎖ 이상, 약 250 pg/㎖ 이상, 약 350 pg/㎖ 이상, 약 400 pg/㎖ 이상, 약 450 pg/㎖ 이상, 약 500 pg/㎖ 이상, 약 550 pg/㎖ 이상 또는 약 600 pg/㎖ 이상의 최소 순환 혈장 농도를 지속시키는데 충분한 폴리펩티드 접합체의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 최소 농도는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 600 pg/㎖ 또는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 350 pg/㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과, 50 pmoles/ℓ 초과, 60 pmoles/ℓ 초과, 70 pmoles/ℓ 초과, 80 pmoles/ℓ 초과, 90 pmoles/ℓ 초과, 100 pmoles/ℓ 초과, 110 pmoles/ℓ 초과, 120 pmoles/ℓ 초과, 130 pmoles/ℓ 초과, 140 pmoles/ℓ 초과, 또는 150 pmoles/ℓ 초과이다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 최소 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 150 pmoles/ℓ 미만, 또는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 80 pmoles/ℓ 미만이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 화합물 1A 또는 화합물 2A, 또는 화합물 1A, 또는 이의 유도체이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 농도는 주어진 농도의 엑센딘-4, 화합물 4A, 다발린티드, 또는 엑센딘 + 다발린티드의 조합물로 관찰되는 것과 등가인 생물학적 또는 치료적 효과, 예를 들어 체중 감소, 글루코스 저하, 신체 조성 변경 등을 초래하는 폴리펩티드 접합체의 농도이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 최소 농도가 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 4일 이상, 약 5일 이상, 약 6일 이상, 또는 약 7일 이상의 기간 동안 지속된다. 다양한 실시양태에서, 최소 순환 혈장 농도가 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 약 7주 이상, 약 8주 이상, 약 9주 이상, 약 10주 이상, 약 11주 이상, 약 12주 이상, 약 13주 이상, 약 14주 이상, 약 15주 이상 또는 약 16주 이상 동안 지속된다. 추가적인 실시양태에서, 최소 순환 혈장 수준이 약 5개월 이상, 약 6개월 이상, 약 7개월 이상, 약 8개월 이상, 약 9개월 이상, 약 10개월 이상, 약 11개월 이상, 또는 약 12개월 이상 동안 지속된다. 당업자가 이용가능한 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도를 측정할 수 있다.
본원에 기재된 실시양태 또는 방법 중 임의의 것에서, 폴리펩티드 접합체의 투여는 약 12시간 이상, 약 24시간 이상 또는 약 48시간 이상 동안 약 50 pg/㎖ 이상의 평균 혈장 폴리펩티드 접합체 농도를 유지시키는데 효과적이다. 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리펩티드 접합체 약 25 pg/㎖ 이상, 약 65 pg/㎖ 이상, 약 75 pg/㎖ 이상, 약 100 pg/㎖ 이상, 약 150 pg/㎖ 이상, 약 170 pg/㎖ 이상, 약 175 pg/㎖ 이상, 약 200 pg/㎖ 이상, 약 225 pg/㎖ 이상, 약 250 pg/㎖ 이상, 약 350 pg/㎖ 이상, 약 400 pg/㎖ 이상, 약 450 pg/㎖ 이상, 약 500 pg/㎖ 이상, 약 550 pg/㎖ 이상 또는 약 600 pg/㎖ 이상의 평균 순환 혈장 농도를 지속시키는데 충분한 폴리펩티드 접합체의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 농도는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 600 pg/㎖ 또는 약 170 pg/㎖ 이상 내지 350 pg/㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과, 50 pmoles/ℓ 초과, 60 pmoles/ℓ 초과, 70 pmoles/ℓ 초과, 80 pmoles/ℓ 초과, 90 pmoles/ℓ 초과, 100 pmoles/ℓ 초과, 110 pmoles/ℓ 초과, 120 pmoles/ℓ 초과, 130 pmoles/ℓ 초과, 140 pmoles/ℓ 초과, 또는 150 pmoles/ℓ 초과이다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 혈장 농도는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 150 pmoles/ℓ 미만, 또는 40 pmoles/ℓ 초과 내지 80 pmoles/ℓ 미만이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 화합물 1A 또는 화합물 2A, 또는 화합물 1A, 또는 이의 유도체이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 농도는 주어진 농도의 엑센딘-4, 화합물 4A, 다발린티드, 또는 엑센딘 + 다발린티드의 조합물로 관찰되는 것과 등가인 생물학적 또는 치료적 효과, 예를 들어 체중 감소, 글루코스 저하, 신체 조성 변경 등을 초래하는 폴리펩티드 접합체의 농도이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 평균 농도가 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 4일 이상, 약 5일 이상, 약 6일 이상, 또는 약 7일 이상의 기간 동안 지속된다. 다양한 실시양태에서, 평균 순환 혈장 농도가 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 약 7주 이상, 약 8주 이상, 약 9주 이상, 약 10주 이상, 약 11주 이상, 약 12주 이상, 약 13주 이상, 약 14주 이상, 약 15주 이상 또는 약 16주 이상 동안 지속된다. 추가적인 실시양태에서, 평균 순환 혈장 수준이 약 5개월 이상, 약 6개월 이상, 약 7개월 이상, 약 8개월 이상, 약 9개월 이상, 약 10개월 이상, 약 11개월 이상, 또는 약 12개월 이상 동안 지속된다. 당업자가 이용가능한 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도를 측정할 수 있다.
폴리펩티드 접합체를 임의의 이용가능한 방법에 의해 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 피하 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 경구 투여되거나, 또는 펌프 또는 이식물을 통해 투여된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 연속적으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 저속 방출, 장기 방출, 지속 방출 또는 장기 작용 제제로 투여된다. 임의의 상기 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체가 하루에 1번, 2일마다, 1주일에 3번, 1주일에 2번, 1주일에 1번, 1개월에 2번, 매달, 2개월마다 또는 3개월마다 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 접합체의 총 투여 시간의 길이는 원하는 체중 감소량에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 소정의 목표 체중, BMI 또는 신체 조성을 달성하는데 충분한 기간 동안 본원에 개시된 방법에 따라 폴리펩티드 접합체를 투여할 수 있고, 달성 후 투여를 종결할 수 있다. 별법적으로, 목표 체중, BMI 또는 신체 조성의 달성 후에, 원하는 목표를 유지하는 수준으로 폴리펩티드 접합체의 용량을 감소시킬 수 있다. 또한, 목표 체중이 달성된 후에 대상체의 체중이 다시 증가하면, 폴리펩티드 접합체의 양을 증가시킬 수 있거나, 이전에 종결된 경우에는 투여를 다시 시작할 수 있다.
혈당 제어 분야에서와 같이, 목표로 하는 HbA1c, 목표로 하는 공복 글루코스 수준, 목표로 하는 전체적인 일일 혈당 농도 등을 달성하는데 충분한 기간 동안 본원에 개시된 방법에 따라 폴리펩티드 접합체를 투여할 수 있고, 달성 후 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도를 유지 수준으로 감소시키거나 이를 중단할 수 있다. 중단되는 경우, 필요하다면 추후에 투여를 다시 시작할 수 있다. 한 실시양태에서, 공복 글루코스 수준을 저하시키거나 안정화시키는데 충분한 기간 동안 본원에 개시된 방법에 따라 폴리펩티드 접합체가 투여되어, 높은 공복 글루코스 수준 또는 원하는 것보다 높은 공복 글루코스 수준을 감소시키거나 제거한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 폴리펩티드 접합체가 하나 이상의 다른 항-당뇨병 및/또는 항-비만/식욕 억제 작용제와 공동-투여되는 것을 추가로 제공한다. "공동-투여"는 2가지 이상의 활성제가 단일 조성물로서 투여되는 것, 별도의 조성물들로서 동시에 투여되는 것을 의미하거나, 또는 별법적으로는 서로에 대해 상이한 시점에 투여될 수 있다. 이같은 항-당뇨병 작용제에는 메트포르민, 술포닐우레아 (SU), 티아졸리딘디온 (TZD) 또는 이들의 임의의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 작용제에는 피오글리타존, 로지글리타존, 글리벤클라미드, 글리글라지드, 글리메피리드, 글리피지드, 글리퀴돈, 클로르프로파미드 및 톨부타미드가 포함된다. 추가적인 작용제에는 디펩티딜 펩티다제-4 (DPP-IV) 억제제 예컨대 빌다글립틴 또는 시타글립틴이 포함된다. 폴리펩티드 접합체는 인슐린과 또한 공동-투여될 수 있다. 공동-투여는 임의의 적절한 수단 또는 투약 요법에 의해 달성될 수 있다. 당업계에 공지되어 있거나 연구 중인 항-비만 작용제에는 페네틸아민 유형 자극제, 펜터민 (임의적으로는 펜플루라민 또는 덱스펜플루라민과 함께 사용됨), 디에틸프로피온, 펜디메트라진, 벤즈페타민, 시부트라민이 포함되는 식욕 억제제; 리모나반트, 기타 카나비노이드 수용체 길항제; 옥신토모듈린; 플루옥세틴 히드로클로라이드; 큐넥사(Qnexa) (토피라메이트 & 펜터민), 부프로피온 & 조니사마이드 또는 부프로피온 & 날트렉손; 또는 제니칼 또는 세티리스타트(Cetilistat) 또는 GT 389-255와 유사한 리파제 억제제가 포함된다.
한 실시양태에서, 임의의 본원에 기재된 방법에 의해 폴리펩티드 접합체를 만성적으로 투여하는 것을 포함하는 폴리펩티드 접합체 투여와 관련되는 위장 효과의 빈도 및/또는 중증도 (오심, 또는 오심 사례의 횟수 및/또는 중증도 포함)를 감소시키기 위한 방법이 제공된다. 때때로, 낮은 용량 또는 더 낮은 용량으로 시작하는 만성 투여가 투여된 폴리펩티드 접합체에 대한 내성을 유도할 수 있어, 허용될 수 없는 빈도 및/또는 중증도의 위장 효과를 전형적으로 유발하는 높은 용량이 위장 효과가 감소되면서 또는 위장 효과 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 투여된 폴리펩티드 접합체를 일정 기간에 걸쳐 방출하고, 이때 제형이 매주 투여되는 제형을 예를 들어 사용하여, 최적 용량 미만의 폴리펩티드 접합체로 만성 투여를 시작할 수 있는 것이 고려된다. 여러 주에 걸쳐, 폴리펩티드 접합체의 혈장 농도가 증가할 것이고, 결국에는 정체기(plateau) 농도를 달성할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 정체기는 단일 또는 개시 용량으로 투여되면 유해한 위장 효과로 인해 허용될 수 없는 농도이다. 임의의 적절한 장기 방출 제형 및 투여 요법을 정체기 효과를 달성하는데 사용할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 각각의 연속적인 용량이 대상체 내의 작용제 또는 작용제들의 농도를 증가시키도록 다중 지속 방출 용량이 제공되고, 이때 작용제 또는 작용제들의 치료 유효 용량이 대상체에서 달성된다. 한 추가적인 실시양태에서, 각각의 연속적인 지속 방출 용량이 이의 지속 단계가 이전 용량의 지속 단계와 중첩되도록 투여된다.
본 개시내용은 1회분 이상의 치료 유효 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 또는 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 함유하는 제약 조성물을 갖는 약물 전달 장치를 또한 제공한다. 약물 전달 장치는 일회용 또는 다회용 바이알, 일회용 또는 다회용 제약 펜, 일회용 또는 다회용 카트리지 등일 수 있다. 한 실시양태에서, 약물 전달 장치는 대상체에게 약 7회 내지 약 40회 용량 또는 약 1주일 또는 약 1개월 분에 충분한 용량을 제공할 수 있는 양으로 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 함유한다.
본 개시내용은 대상체가 폴리펩티드 접합체를 사용하는 것에 대한 설명서를 임의적으로 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 접합체를 포함하는 용기를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 용기는 본원에 기재된 바와 같은 일회용 또는 다회용의 바이알, 카트리지, 펜, 또는 기타 전달 장치일 수 있다.
임의의 본원에 기재된 치료 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 폴리펩티드 접합체의 용도가 또한 명확하게 고려된다.
추가적인 실시양태에는 하기의 실시양태들이 포함된다:
1. 화합물 1A 또는 화합물 2A를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
2. 실시양태 1에 있어서, 화합물 1A를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
3. 실시양태 1에 있어서, 화합물 2A를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
5. 실시양태 4에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 친유성 모이어티에 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
6. 실시양태 5에 있어서, 친유성 모이어티가 알킬 기, 지방산, 콜레스테릴, 또는 아다만틸인 폴리펩티드 접합체.
7. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 하나 이상의 지방산에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
8. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 알부민에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
9. 실시양태 8에 있어서, 알부민이 지방산에 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
10. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 폴리아미노산에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 1 μM 미만인 폴리펩티드 접합체.
12. 실시양태 11에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 100 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
13. 실시양태 12에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 10 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
14. 실시양태 13에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 1 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 1 μM 미만인 폴리펩티드 접합체.
16. 실시양태 15에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 100 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
17. 실시양태 16에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 10 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
18. 실시양태 17에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 5 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4, 화합물 4A 또는 다발린티드보다 더욱 효력적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4 및 다발린티드 둘 모두보다 더욱 효력적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
21. 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
22. 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 다발린티드보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4 및 다발린티드 둘 모두보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
24. 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 공동-투여된 최대로 효과적인 용량의 엑센딘-4 및 다발린티드보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
25. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4보다 더욱 효력적으로 및 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
26. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 화합물 3A보다 더욱 효력적으로 및/또는 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 체중 감소가 4주 기간에 걸쳐 발생하는 것인 폴리펩티드 접합체.
28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 체중 감소가 6개월 기간에 걸쳐 발생하는 것인 폴리펩티드 접합체.
29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 체중 감소가 1년 기간에 걸쳐 발생하는 것인 폴리펩티드 접합체.
30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4와 비교하여 래트에서 카올린 섭취를 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 다발린티드와 비교하여 래트에서 카올린 섭취를 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 화합물 7A와 비교하여 래트에서 카올린 섭취를 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 엑센딘-4와 비교하여 오심을 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
34. 실시양태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 다발린티드와 비교하여 오심을 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
35. 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 화합물 7A와 비교하여 오심을 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
36. 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 감소된 오심이 중증도가 덜한 오심 또는 1년 당 유해 사례의 횟수가 덜 빈번한 오심 또는 둘 모두이고, 이때 오심 사례가 경도, 중등도 또는 중증, 또는 오심 사례들의 합쳐진 총 횟수일 수 있는 것인 폴리펩티드 접합체.
37. 실시양태 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 공복 혈장 혈당을 저하시키는 폴리펩티드 접합체.
38. 실시양태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 경구 당 부하에 대한 내성을 증가시키는 폴리펩티드 접합체.
39. 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 글루코스-유도 인슐린 분비를 증가시키는 폴리펩티드 접합체.
40. 실시양태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 2시간 이상, 4시간 이상 또는 8시간 이상 동안 위 배출을 지연시키는 폴리펩티드 접합체.
41. 실시양태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 동일한 용량에서 화합물 3A보다 더 큰 정도로 위 배출을 지연시키는 폴리펩티드 접합체.
42. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 동일한 용량에서 엑센딘-4, 다발린티드 또는 화합물 3A보다 더 큰 정도로 혈장 트리글리세리드를 저하시키는 폴리펩티드 접합체.
43. 실시양태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 동일한 용량에서 화합물 2A보다 더 큰 정도로 혈장 트리글리세리드를 저하시키는 폴리펩티드 접합체.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 염 형태의 화합물.
45. 실시양태 1 내지 44 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
46. 치료 유효량의 실시양태 1 내지 45 중 어느 하나의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 당뇨병 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법.
47. 제46항에 있어서, 당뇨병이 제1형 당뇨병인 방법.
48. 제46항에 있어서, 당뇨병이 제2형 당뇨병인 방법.
49. 제46항에 있어서, 당뇨병이 임신성 당뇨병인 방법.
50. 실시양태 46 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 과체중이거나, 비만이거나, 또는 과체중 또는 비만 성향이 있는 대상체인 방법.
51. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 인슐린 저항성 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 인슐린 저항성을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린 저항성을 치료하는 방법.
52. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 식후 고혈당증 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 식후 고혈당증을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 식후 고혈당증을 치료하는 방법.
53. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 혈당 수준 저하를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 방법.
54. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 HbA1c 수준의 저하를 필요로 하는 대상체에서 HbA1c 수준을 저하시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 HbA1c 수준을 저하시키는 방법.
55. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 인슐린 방출 자극을 필요로 하는 대상체에서 인슐린 방출을 자극하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린 방출을 자극하는 방법.
56. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 위 운동의 감소를 필요로 하는 대상체에서 위 운동을 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 위 운동을 감소시키는 방법.
57. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 위 배출 지연을 필요로 하는 대상체에서 위 배출을 지연시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 위 배출을 지연시키는 방법.
58. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 음식 섭취의 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 방법.
59. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 식욕 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 식욕을 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 식욕을 감소시키는 방법.
60. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 체중 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 체중을 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 체중을 감소시키는 방법.
61. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 과체중의 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 과체중을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 과체중을 치료하는 방법.
62. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 비만의 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 비만을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비만을 치료하는 방법.
63. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 mg인 방법.
64. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 2.5 mg인 방법.
65. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 1 mg인 방법.
66. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍인 방법.
67. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 25 ㎍인 방법.
68. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 70 ㎏ 대상체의 체중을 기초로 약 0.01 ㎍ 내지 약 100 ㎍인 방법.
69. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 70 ㎏ 대상체의 체중을 기초로 약 0.01 ㎍ 내지 약 50 ㎍인 방법.
70. 1회분 이상의 치료 유효 용량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제약 조성물을 포함하는 약물 전달 장치.
71. 제70항에 있어서, 바이알, 제약 펜 또는 카트리지인 약물 전달 장치.
72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 치료 유효 용량의 약 1개월 공급분을 포함하는 약물 전달 장치.
73. 실시양태 1 내지 45 중 어느 하나의 화합물을 제조하는 방법.
74. 실시양태 73에 있어서, 재조합 공정을 포함하는 방법.
75. 대상체에 의한 폴리펩티드 접합체 또는 조성물의 사용에 대한 설명서를 임의적으로 갖는, 실시양태 1 내지 45 중 어느 하나의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 포함하는 키트.
76. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 접합체의 투여가 화합물 6A에 비하여 개선된 환자 순응, 화합물 6A에 비하여 개선된 중증 홍조 감소, 및/또는 화합물 6A에 비하여 감소된 오심을 초래하는 것인 방법.
77. 실시양태 63에 있어서, 용량이 약 0.1 내지 1.0 ㎎/일인 방법.
78. 실시양태 67에 있어서, 용량이 약 0.3 내지 0.6 ㎎/일인 방법.
79. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 용량이 하루에 2번 (BID)으로 분할되거나, 또는 하루에 1번 (QD) 제공되는 방법.
실시예
하기의 실시예들은 오직 설명의 목적을 위한 것이고, 청구항의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.　
실시예 1: DIO 래트에서의 생체내 연구 방법
본 연구는 화합물 1A 및 화합물 2A의 대사 작용을 특성화하였다. 실시예에 개시된 바와 같이, 화합물 1A 및 화합물 2A (3, 10, 30 및 100 nmol/kg/d)를 4주 동안 계속 피하 주입하는 것의 효과를 식이-유도 비만 (DIO) 수컷 스프라그 돌리 래트에서 모 펩티드인 화합물 6A, 화합물 5 및 화합물 4A (2.8, 15 및 7.2 nmol/kg/; 체중 감소를 위한 최대 유효 용량)의 단일 및 공동-투여와 비교하였다. 다양한 대사 및 PK 파라미터를 평가하였다.
동물. 연구 이전의 약 8주 동안, 수컷 스프라그 돌리 래트 (CRL:CD 래트, 찰스 리버 래버러토리즈 (매사추세츠주 윌밍턴))를 개별적으로 거주시켰고, 고지방 식이 (지방으로부터의 32％ kcal; D12266B 리서치 다이어츠(Research Diets) (뉴저지주 브런즈윅))를 유지시켰다. 시험을 시작할 때 (제0일), 래트의 평균 체중은 545 ± 3.8 g이었다.
화합물. 실시예에서 사용된 화합물에는 하기의 것들이 포함되었다:
화합물 4A: 천연 엑센딘-4와 비교하여 위치 14에서의 단일 뉴클레오티드 차이가 있는 전장 C-말단 아미드화 엑센딘-4 펩티드 유사체;
화합물 5: 위치 14 및 28에서의 아미노산 치환이 있는 엑센딘-4의 처음 32개의 아미노산에 비-포유동물 (개구리) GLP1의 C-말단으로부터의 5개의 아미노산 서열이 이어지는 키메라;
화합물 6A: C-말단 아미드화 아밀린 모방체인 다발린티드;
화합물 2A: 글리신-글리신-글리신 펩티드 링커를 통해 화합물 6A에 인-프레임으로 공유결합으로 부착된 화합물 5의 폴리펩티드 접합체; 및
화합물 1A: 글리신-글리신-글리신 펩티드 링커를 통해 화합물 6A에 인-프레임으로 공유결합으로 부착된 화합물 4A의 폴리펩티드 접합체.
연구 디자인. 폴리펩티드 접합체를 비히클 (멸균수 내의 50％ DMSO) 및 단독 모 화합물 및 조합된 모 화합물과 비교하여 시험하였다 (표 1 참조). 화합물 5, 화합물 4A 및 화합물 6A의 용량은 이러한 모델에서 체중 감소에 대해 최대로 효과적이었다 (데이터는 제시되지 않음). 제1일에, 비히클, 화합물 2A, 화합물 1A, 화합물 5, 화합물 4A 또는 화합물 6A를 4주 동안 일정한 속도로 (1일당 래트 1 kg당 나노몰수) 전달하는 2개의 삼투 미니-펌프 (알젯(Alzet), 듀렉트 코포레이션(Durect Corporation) (캘리포니아주 쿠퍼티노))를 래트에게 수술로 이식하였다. 표 1 참조.
Figure pct00001
음식 섭취 및 체중을 매주 측정하였다. 신체 조성을 제-1일 및 제28일에 NMR 기기 (에코 메디컬 시스템즈(Echo Medical Systems), 텍사스주 휴스턴)를 사용하여 평가하였다. 지방축적 (지방 체중 %)은 체중에 비교된 지방 체중의 양으로서 정의되었다 (지방 체중/체중 × 100). 꼬리 정맥을 통해 제14일에 혈액을 수집하였다. 제28일에, 경정맥을 통해 혈액 샘플을 뽑고, 이소플루란 과다투여로 동물을 안락사시켰다. 미니-펌프를 즉각적으로 제거하고, 동물을 간단한 NMR 스캔에 적용하고, 추후의 조직학적 검사 및 예비 독성학적 평가를 위해 조직을 수집하였다.
통계 분석. 일원 분산 분석 (ANOVA)을 뉴만-쿨스(Newman-Keuls) 사후 비교와 함께 사용하여 데이터를 분석하였다. p<0.05에 대해 유의성이 가정되었다. 그래프는 윈도우용 프리즘(Prism) 4 (그래프패드 소프트웨어(Graphpad Software), 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 생성되었다. 모든 데이터 포인트는 평균 ± SEM으로 표현된다. 화합물 1A 및 화합물 2A의 최고 용량에 대해, 몇몇 동물에서 음식 섭취가 최소였고, 이러한 데이터가 분석에 포함되었다.
호르몬 및 대사산물 분석. 연구 약물의 혈장 수준을 제14일 및 종료일에 ELISA에 의해 측정하였다. 제14일 및 종료일의 전혈 헤모글로빈 A1c ％ (％HbA1c), 혈장 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 혈장 혈당을 올림푸스 바이오애널라이저(Olympus bioanalyzer) (올림푸스 아메리카 다이아그노스틱스(Olympus America Diagnostics))를 사용하여 측정하였다. 제14일 및 종료일의 혈장 인슐린 수준을 ELISA 키트 (래트/마우스 인슐린(Rat/Mouse Insulin) ELISA, 링코 다이아그노스틱스(Linco Diagnostics))에 의해 분석하였다.
실시예 2: 화합물 1A는 우월한 체중 감소를 제공한다
실시예 1의 방법에 따라, 각각의 폴리펩티드 접합체 (화합물 1A 및 화합물 2A)가 28일 처치에 걸쳐 3, 10, 30 및 100 nmol/kg/d에서 용량-의존적으로 체중을 유의하게 감소시켰다 (비히클에 대해 p<0.05) (도 1a 및 1b 참조). 모 화합물의 공동-투여 (화합물 5 + 화합물 6A 및 화합물 4A + 화합물 6A)가 비히클 대조군에 비하여 및 화합물 6A 단독에 비하여 체중을 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 도 1a 및 1b 참조.
도 1a에 지시된 바와 같이, 비히클에 대해 보정된 4주 체중 감소는 100 nmol/kg/d의 화합물 2A의 경우 -31.5 ± 2.7％, 화합물 5의 경우 -16.6 ± 3.6％, 화합물 6A의 경우 -12.3 ± 1.3％, 화합물 5 + 화합물 6A의 경우 -24.3 ± 1.3％였고, 화합물 2A 대 화합물 6A에 대해 p<0.05였지만, 화합물 5 또는 화합물 5 + 화합물 6A의 공동-투여와는 상이하지 않았다. 화합물 2A의 경우, 10 nmol/kg/d 초과에서 용량-효과가 없었다; 30 또는 100 nmol/kg/d의 용량에 의해서는 추가적인 체중 감소가 관찰되지 않았다. 100 nmol/kg/d 군에서 -27.8 ± 5.3％의 최대 체중 감소가 달성되었다. 도 1a 참조. 또한 화합물 2A가 화합물 3A보다 지속 주입을 통해 체중을 감소시키는 것에서 여러 배 더 효력이 있었다.
도 1b에 지시된 바와 같이, 비히클에 대해 보정된 4주 체중 감소는 100 nmol/kg/d의 화합물 1A의 경우 -37.3 ± 4.8％, 화합물 4A의 경우 -13.5 ± 1.5％, 및 화합물 4A + 화합물 6A의 경우 -25.8 ± 1.5％였고; 화합물 1A 대 단독 모 펩티드 및 조합된 모 펩티드 둘 모두에 대해 p<0.05였다. 화합물 1A의 경우, 최고 시험 용량까지 용량-의존적 체중 감소가 관찰되었다 [-37.3 ± 4.8％의 100 nmol/kg/d 군]. 또한 100 nmol/kg/d의 화합물 1A에 의한 체중 감소가 최대로 효과적인 용량의 모 화합물들의 공동-투여로 관찰되는 체중 감소보다 유의하게 더 컸다. 도 2a 참조. 두 폴리펩티드 접합체 모두가 28일 처치 기간에 걸쳐 충분한 체중 감소를 도출하였지만, 화합물 1A의 경우, 심지어 최저 시험 용량에서도 체중 감소가 어느 한쪽 모 펩티드의 단일 투여를 통한 것보다 유의하게 더 컸다. 또한 화합물 1A는 화합물 2A보다 현저하게 더 효력이 있고, 더 효과적이었다. 또한 화합물 1A는 화합물 3A보다 지속 주입을 통해 체중을 감소시키는 것에서 약 10배 더 효력이 있었다.
실시예 3: 화합물 1A는 우월한 음식 섭취 감소를 제공한다
실시예 1의 방법에 따라, 체중에서와 같이, 각각의 폴리펩티드 접합체는 28일 처치 기간에 걸쳐 비히클 대조군에 비해 각각의 시험 용량에서 음식 섭취를 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 도 2a 및 2b 참조. 최고 시험 용량에서, 총 음식 섭취가 단일 모 펩티드 투여에 비해 화합물 1A 및 화합물 2A에 의해 유의하게 감소되었고, 화합물 1A의 최고 용량에서, 음식 섭취가 화합물 4A + 화합물 6A의 공동-투여의 음식 섭취를 넘어서 억제되었다.
3 nmol/kg/d의 화합물 2A의 경우 누적 음식 섭취가 다른 용량들보다 유의하게 더 높았다 (p<0.05). 모 화합물 단독요법과 비교했을 때, 10 및 100 nmol/kg/일 용량이 양쪽 모 화합물보다 유의하게 더 낮았지만, 30 nmol/kg/d 용량은 화합물 6A 모 화합물과만 유의하게 상이하였다. 공동-투여된 화합물 5 + 화합물 6A 처치는 어떠한 폴리펩티드 접합체 용량과도 유의하게 상이하지 않았다. 도 2a 참조. 화합물 2A는 화합물 3A보다 급성으로 음식 섭취를 감소시키는 것에서 더 효력이 있었다.
모든 용량의 화합물 1A가 비히클 및 단독으로 투여된 양쪽 모 화합물과 비교했을 때 음식 섭취를 유의하게 감소시켰다. 도 2b 참조. 화합물 1A의 최고 용량이 2가지 모 화합물인 화합물 4A 및 화합물 6A의 조합 요법 (공동-투여)과 유의하게 상이한 유일한 용량이었다. 도 2b 참조. 따라서, 화합물 1A가 우월한 음식 섭취 감소를 제공하였다. 또한 화합물 1A는 화합물 3A보다 급성으로 음식 섭취를 감소시키는 것에서 더 효력이 있었다. 전체적으로, 화합물 1A 및 화합물 2A가 DIO 래트에서 모 펩티드들의 단일 투여에 비교하여 체중 감소에 대해 더 효과적이었고, 이때 화합물 1A가 화합물 2A와 비교하여 체중 감소에 대해 더 큰 효력 및 효능을 나타냈다.
실시예 4: 화합물 1A는 신체 조성 개선을 제공한다
실시예 1의 방법에 따라, 연구를 시작할 때, 미처리 중량 또는 지방 체중 % (지방축적)로 표현되는 기준선 지방 체중, 또는 기준선 제지방 체중에서의 유의한 차이가 시험 대상체들 사이에서 관찰되지 않았다 (표 2 및 표 3 참조). 종료일에, 증가되는 용량의 폴리펩티드 접합체가 지방 체중 감소를 초래하였음이 관찰되었다. 폴리펩티드 접합체-유도 체중 감소가 유의하게 감소된 지방 체중 %와 관련되었다 (100 nmol/kg/d 용량에서, 화합물 2A의 경우 -12.2 ± 1.3％ 및 화합물 1A의 경우 -15.5 ± 2.2％; 둘 모두 비히클 대조군에 대해 p<0.05). 화합물 2A는 제지방 체중 %를 변경시키지 않았지만, 모든 용량의 화합물 1A는 비히클 대조군에 비교하여 제지방 체중 %를 증가시켰다. 100 nmol/kg/d의 화합물 1A 및 화합물 2A가 비히클 및 양쪽 모 화합물 군의 투여에 비교하여 지방 체중을 유의하게 감소시켰다 (표 2 및 표 3 참조). 10 및 100 nmol/kg/d의 화합물 2A 및 화합물 5 + 화합물 6A 공동-투여 처치가 비히클과 비교하여 최종 제지방 체중을 유의하게 감소시켰다 (표 2 참조). 10, 30 및 100 nmol/kg/d의 화합물 1A 처치, 및 화합물 4A + 화합물 6A 처치가 비히클 대조군과 비교하여 제지방 체중을 유의하게 저하시켰다 (표 3).
Figure pct00002
Figure pct00003
체중 감소에 대해 보정하기 위해, 지방 및 제지방 체중 감소를 최종 체중에 대해 조정하여 지방축적 (지방 체중 %)에서의 변화 및 제지방 체중 %에서의 변화를 계산하였다. 모든 용량의 화합물 2A, 뿐만 아니라 단독 모 화합물 및 조합된 모 화합물에 의해 지방축적이 유의하게 감소되었다 (도 3 참조). 100 nmol/kg/d의 화합물 2A가 가장 큰 지방축적 감소를 일으켰다 (-12.2 ± 1.3％; 도 3).
지방축적 감소가 화합물 1A에 의해 관찰되었다: 모든 처치 용량이 비히클 대조군과 비교하여 지방축적을 유의하게 감소시켰으며, 화합물 4A 및 화합물 6A 투여도 그러하였다. 도 4 참조. 최고 용량의 화합물 1A가 가장 큰 감소를 일으켰고 (-15.5 ± 2.2％), 이는 다른 모든 용량들보다 유의하게 더 낮았지만, 모 화합물들의 공동-투여와 유사하였고 (도 4 참조), 화합물 2A보다 우월하였다.
전체적인 제지방 (또는 무지방) 체중이 높은 용량의 폴리펩티드 접합체 처치에 의해 감소된 한편, 체중의 백분율로서 표현되는 경우의 제지방 체중에서의 변화는 비히클 대조군과 임의의 용량의 화합물 2A, 화합물 5, 화합물 6A 또는 화합물 5 + 화합물 6A 조합물 군 간에 유의하게 상이하지 않았다 (도 5 참조). 놀랍게 대조적으로, 각각의 용량의 화합물 1A로의 처치가 비히클 대조군과 비교하여 제지방 체중 %를 유의하게 증가시켰다 (도 6 참조). 화합물 1A는 신체 조성을 개선시키는 것, 예를 들어, 제지방-보존, 지방 소모에서 우월하다.
28일 노출에서, 화합물 1A 및 2A가 ob/ob 마우스 (비만 및 당뇨병)에서 공복 혈당-저하 (mg/dL), HbA1c 감소 및 체중 감소 (지방-소모, 제지방-보존)를 제공하였다. ob/ob 마우스에서, 화합물 1A가 엑센딘-4와 비교하여 유사한 공복 혈당-저하를 제공하였지만, 우월한 체중 감소 (지방-소모, 제지방-보존)를 제공하였다. HbA1c를 감소시키고 공복 혈당을 저하시키는 것에 대한 이러한 이로운 효과들은 이러한 시스템에서 다발린티드 단독으로 관찰된 HbA1c 증가 및 공복 혈당 증가의 관점에서 더욱 놀라웠다. 화합물 1A의 이러한 우월한 효과는 엑센딘-4 및 다발린티드의 조합물로 처치된 ob/ob 마우스에서 관찰된 제28일의 혈장 혈당 수준 증가와 비교하여 더욱 더 놀라웠다 (데이터는 제시되지 않음).　　　
실시예 6: 화합물 1A는 우월한 대사 파라미터를 제공한다
혈장 파라미터. 하기의 혈장 파라미터들에 대한 모 화합물 및 폴리펩티드 접합체 화합물의 효과를 결정하였다: 제14일 및 제28일의, 헤모글로빈 A1c (HbA1c) %, 급식 상태 혈장 인슐린, 및 혈장 내의 폴리펩티드 접합체의 농도.
28일 후, 화합물 2A 처치에 의해서는 글루코스, 헤모글로빈 A1c (HbA1c) %, 인슐린, 총 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤에서의 변화가 관찰되지 않았다. 유사하게, 28일 후 총 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤 또는 HbA1c 수준에 대한 화합물 1A의 유의한 효과가 없었다. 혈장 인슐린 및 혈당 수준이 비히클 대조군에 비하여 일부 용량에서 화합물 1A에 의해 유의하게 저하되었다. 혈장 트리글리세리드가 처치 28일 후 비히클에 비교하여 모든 펩티드 처치에 의해 유의하게 감소되었다. 특이적 면역검정에 의해 측정된 화합물 1A 및 화합물 2A의 혈장 수준이 처치 2주 및 4주 후 둘 모두에서 처치 용량에 상응하는 증가되는 수준에서 검출되었다.
처치 14일 후, HbA1c 수준이 비히클 및 화합물 6A 군 둘 모두에 비하여 화합물 5 + 화합물 6A, 화합물 5 및 10 nmol/kg/d의 화합물 2A로 약간이지만 유의하게 상승되었다 (표 4 참조). 28일 후에는 이러한 군들 간에 HbA1c에서의 차이가 명확하지 않았다. 모든 처치 군이 비히클 대조군에 비해 14일 후 유의하게 감소된 인슐린 수준을 나타냈지만, 28일 후에는 차이가 관찰되지 않았다. 화합물 2A의 혈장 수준은 제14일 및 제28일에 용량 의존적 방식으로 혈장 내에서 유의하게 증가되었다 (표 4 참조).
Figure pct00004
대조적으로, 3 및 10 nmol/kg/d의 화합물 1A 처치가 14일 후 비히클 및 화합물 6A 군에 비해 HbA1c 수준을 증가시켰고, 이때 제28일에는 차이가 관찰되지 않았다(표 5 참조). 화합물 2A 처치와 유사하게, 모든 용량의 화합물 1A, 및 화합물 4A + 화합물 6A 조합물이 제14일에 비히클에 비교하여 혈장 인슐린을 유의하게 감소시켰지만, 28일 후에 비히클에 비하여 화합물 1A 10 및 30 nmol/kg/d 처치 및 화합물 4A + 화합물 6A 공동-투여 처치에 의해 여전히 추가로 감소되었다 (표 5 참조). 제14일에, 100 nmol/kg/d의 화합물 1A가 비히클 및 3 및 10 nmol/kg/d의 화합물 1A에 비교하여 유의하게 더 높은 혈장 농도를 나타냈지만, 30 nmol/kg/d에 대해서는 그렇지 않았다. 제14일 값과 제28일 값 간에 차이가 없었다.
Figure pct00005
이러한 연구는 28일 후의 글루코스 및 지질 (트리글리세리드, 총 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤)의 혈장 수준을 또한 평가하였다. 모든 용량의 화합물 2A 및 개별적으로 또는 함께 투여된 모 펩티드들은 글루코스, 또는 총 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤을 변경시키지 않았다. 비히클과 비교하여 모든 군에 의해 트리글리세리드가 유의하게 감소되었다 (표 6 참조).
Figure pct00006
화합물 2A가 포함되는 다른 모든 화합물과 달리, 화합물 1A는, 예를 들어 화합물 6A와 비교하여, 10 및 30 nmol/kg/d에서 HDL 콜레스테롤을 감소시켰다. 화합물 1A는 총 콜레스테롤을 변경시키지 않았다. 표 7 참조. 모든 용량의 화합물 1A, 및 모 펩티드가 비히클에 비하여 트리글리세리드를 감소시켰고, 10 및 30 nmol/kg/d에서 글루코스를 저하시켰으며, 화합물 4A + 화합물 6A도 그러하였다 (표 7 참조)
Figure pct00007
실시예 7: 폴리펩티드 접합체는 원하는 이중-수용체 효능작용을 유지한다
폴리펩티드 접합체인 화합물 1A, 화합물 2A, 화합물 3A 및 모 화합물을 GLP-1 수용체 (예를 들어 엑센딘-4 유사 활성) 또는 칼시토닌 수용체 (예를 들어 다발린티드/아밀린 모방체 유사 활성)에 결합하여 이를 작동시키는 능력에 대해 세포-기반 검정에서 시험하였다.
GLP-1 수용체 기능 검정은 내인성으로 발현되는 GLP-1 수용체의 펩티드-유도 활성화를 통한 6-23 (클론 6) 세포주에서의 cAMP 증가를 측정한다 (문헌 [Zeytinoglu et al., "Establishment of a calcitonin-producing rat medullary thyroid carcinoma cell line: I. Morphological studies of the tumor and cells in culture", Endocrinology 107:509-515 (1980)]; [Crespel et al., "Effects of glucagon and glucagon-like peptide-(7-36) amide on C cells from rat thyroid and medullary thyroid carcinoma CA-77 cell line", Endocrinology 137:3674-3680 (1996)]). 384-웰 양식의 HTRF (시스바이오(CisBio), 미국 매사추세츠주 베드포드) 세포-기반 cAMP 검정 키트를 사용하여 30분 펩티드 처리 후에 cAMP의 축적을 측정하였다. HTRF (균질 시간 분해 형광)는 FRET 화학과 방출 반감기가 긴 형광단 사용의 조합인 TR-FRET (시간 분해 형광 및 형광 공명 에너지 전이)를 기초로 하는 기술이다. 10 μM 포스콜린 (cAMP 생성을 초래하는 아데닐레이트 시클라제의 구성적 활성화제)로의 세포 처리와 비교하여 시험 화합물의 효능을 결정하고, 4-파라미터 모델에 핏팅(fitting)된 비-선형 회귀 분석을 사용하여 농도-반응 곡선의 분석에 의해 시험 화합물의 효력 (EC50)을 결정하였다. 농도-반응 곡선은 1 μM에서 0.1 pM까지의 시험 화합물 농도 범위였다 (농도 당 N = 4개의 복제본). 시험 화합물을 8점 용량 반응에 대해 단계적으로 1:10 희석하였다. 세포를 500 μM IBMX 및 HTRF 용액을 함유하는 완충제에 2.5×10-6개의 세포/㎖로 현탁시켰다. 5 ㎕의 시험 화합물을 5 ㎕의 현탁된 세포에 첨가하고, 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 검출 시약/용해 완충제의 첨가에 의해 활성화를 중지시켰다. 축적된 cAMP를 키트 설명서에 따라 결정하였다.
래트 칼시토닌 C1a 수용체에서의 시험 화합물의 기능적 활성은 384-웰 양식의 HTRF-기반 cAMP 검정 키트 (시스바이오, 미국 매사추세츠주 베드포드)를 사용하여, 시험 화합물에 30분 노출시킨 후, 래트 C1a 칼시토닌 수용체를 과발현하는 C1a-HEK 세포주에서의 cAMP 축적에 의해 결정하였다. cAMP의 축적은 증가되는 시험 펩티드의 농도에 상응하여 측정되었고, 상기 펩티드의 효능은 10 μM 포스콜린 (아데닐레이트 시클라제의 구성적 활성화제)으로의 세포 처리와 비교하여 결정되었다. 알파스크린 전체 세포 cAMP 기능 검정(AlphaScreen Whole Cell cAMP Functional Assay) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주)을 사용하여 시험 화합물의 기능적 활성을 또한 측정할 수 있었다. 계산된 EC50 값은 1 μM 내지 0.1 pM 농도의 펩티드 용량으로의 4-파라미터 농도-반응 곡선을 기초로 하였다 (농도 당 N = 4개의 복제본). 세포를 500 μM IBMX 및 HTRF 용액을 함유하는 완충제에 2.0×10-6개의 세포/㎖로 현탁시켰다. 5 ㎕의 시험 화합물을 5 ㎕의 현탁된 세포에 첨가하고, 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 검출 시약/용해 완충제의 첨가에 의해 활성화를 중지시켰다. 축적된 cAMP를 키트 설명서에 따라 결정하였다.
표 8은 수용체 활성의 시험관내 지표인, cAMP에 대한 EC50 측정치를 제공한다. 예상대로, 엑센딘-4, 화합물 4A, 화합물 5 및 화합물 10A (모두 GLP-1 수용체 효능제)가 GLP-1 수용체 기능 검정에서 활성이었지만, C1a 칼시토닌 수용체 기능 검정에서는 그렇지 않았다. 엑센딘-4는 다른 어떤 모 화합물보다도 더 활성이었다. 예상대로, 아밀린 모방체 다발린티드인 화합물 6A가 C1a 칼시토닌 수용체 기능 검정에서 활성이었지만, GLP-1 수용체 기능 검정에서는 그렇지 않았다.
Figure pct00008
또한, 엑센딘 효능제가 아니라 아밀린 효능제의 성질인 혈액 칼슘을 저하시키는 효과를 각각의 화합물이 나타낸 것을 기초로 할 때 생체내 화합물 1A 및 2A는 활성 아밀린모방체 서열이 있었다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, 화합물 1A, 화합물 2A 및 화합물 3A (기존에 공지된 접합체)인 모든 접합체 화합물이 GLP-1 및 아밀린 수용체 둘 모두에서 기능성이었다.
실시예 8: 폴리펩티드 접합체는 기저 글루코스 저하에서 활성이다
폴리펩티드 접합체 및 모 화합물을 생체내 기저 글루코스 저하 검정에서 분석하였다. 이러한 검정은 경구 투여된 글루코스 챌린지(challenge)의 인슐린-매개 글루코스 클리어런스를 강화하는 접합체 폴리펩티드의 능력을 반영한다 (경구 내당능 시험; OGTT). 8시간 이상의 금식 후에 대상체의 혈장 혈당 수준을 측정하는 더 간단한 공복 혈장 혈당 시험이 선호되지만, 당뇨병을 진단하는데 OGTT가 사용된다. 하기의 절차를 사용하였다: 다양한 농도의 시험 화합물을 4시간 금식시킨 NIH/스위스(Swiss) 암컷 마우스에게 t = -5분에 복강내 (IP) 주사하였다. 글루코스 위관영양 (1.5 g/kg)을 t = 0에 제공하였다. 원터치(OneTouch)® 울트라(Ultra)® (라이프스캔 인코포레이티드(LifeScan, Inc.), 캘리포니아주 밀피타스)를 사용하여 꼬리 혈당으로서 t = 30분에 샘플을 채취하였다. ANOVA에 의해 유의한 효과를 확인하였고 (p<0.05), 그래프패드 프리즘 버전 4.00 (그래프패드 소프트웨어, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하는 던넷 사후 검정이 이어졌다.
결과가 표 9에서 제시된다. 예상대로, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 펩티드 유사체인 화합물 4A, 화합물 5 및 화합물 10A가 글루코스 저하에서 효과적이었다. 놀랍게도 화합물 2A가 기존에 공지된 폴리펩티드 접합체인 화합물 3A 및 화합물 7A보다 더 효력이 있었다. 놀랍게도 화합물 1A가 화합물 3A 및 화합물 7A뿐만 아니라 화합물 2A보다 더 효력이 있었다.
Figure pct00009
실시예 9: 폴리펩티드 접합체인 화합물 1A 및 화합물 2A는 오심이 더 적으면서 음식 섭취를 감소시킨다
접합체 폴리펩티드의 가능한 오심 효과를 연구하기 위해, 급성 카올린 섭취를 래트에서 측정하였다. 이식증 행동 (먼지/점토 섭취)은 감소된 음식 섭취 및 체중 감소와 전형적으로 관련되는, 설치류에서의 오심 마커이다. 합성 점토 카올린 섭취량을 측정함으로써 이식증을 평가할 수 있다. 장에서 구토를 일으키도록 작용할 수 있는 화학요법 약물인 시스플라틴을 사용하여, 양성 대조군으로서 오심-관련 연하저하(hypophagia)를 유도하였다. 래트를 통상적인 먹이와 혼합된 카올린 점토로서 3일 동안 카올린에 적응시켰다. 그 후, 4시간 및 24시간 기준선 카올린 및 먹이 섭취를 측정하였다. 이어서, 래트를 약 16시간 동안 금식시킨 후, 시험 화합물을 하기에 지시된 용량으로 주사하였다. 주사 24시간 후에, 먹이 및 카올린 소비를 측정하였다. 표 10은 카올린 섭취, 및 (먹이) 음식 섭취 억제에 대한 상관관계를 나타낸다.
Figure pct00010
음식 섭취를 억제한 용량에서, 기존에 공지된 접합체인 화합물 7A는 래트에서의 오심의 징후인, 양성 대조군과 유사한 유의한 카올린 섭취를 유도하였다. 시스플라틴 주사와 유사하게 급성으로 음식 섭취를 억제한 용량의 화합물 3A는 카올린 소비에 대한 효과가 (존재하더라도) 약간일 뿐이었다. 양성 대조군, 화합물 3A 또는 7A보다 더 큰 음식 섭취 감소를 일으킨 용량의 화합물 1A 및 화합물 2A는 카올린 소비에서의 유의한 증가를 유도하지 않았다. 놀랍게도, 엑센딘-4 및 다발린티드와 관련된 오심에도 불구하고, 화합물 1A 및 화합물 2A는 이러한 연구에서 유의한 카올린 섭취를 나타내지 않았다.
언급된 바와 같이, 화합물 1A는 GLP-1 수용체 및 아밀린 및 칼시토닌 수용체 둘 모두에 대해 높은 효력을 나타내는데, 이는 엑센딘-유사 및 다발린티드 모이어티가 이들의 생물학적 활성을 유지하는 것을 입증한다. 이러한 표적 수용체들에 대한 활성은 모 화합물과 비교하여 보통 정도로만 약화된다. 흥미롭게, CGRP 수용체에 비교하여 아밀린 수용체 (각각 >600배 대 >100배) 및 칼시토닌 수용체 (>1600배 대 >280배)에 대한 화합물 3A보다 더 양호한 선택성, 및 CGRP 수용체에 비교하여 칼시토닌 및 아밀린 수용체에 결합하는 것에 대한 다발린티드 (화합물 6A)보다 더욱 더 양호한 선택성을 나타내어, 화합물 1A는 매우 낮은 친화도로 CGRP 수용체에 결합한다. 다발린티드가 강력한 아드레노메둘린 수용체 길항제 (IC50 = 18 nM)임에도 불구하고, 화합물 1A는 10 uM 이하의 농도에서 아드레노메둘린 수용체의 기능적 활성화 또는 길항작용을 나타내지 않았다. 따라서, 화합물 1A는 아밀린 및 아밀린모방체를 인식하는 세포 수용체에 관하여 다발린티드와 비교하여 놀랍게도 상이한 약리학적 프로파일을 나타낸다. 화합물 1A는 모 펩티드보다 표적을 벗어나는 활성이 더 적다. 화합물 1A에 대한 이러한 개선된 약리학적 프로파일은, 모 펩티드 화합물 6A와 비교하여, 특히 인간 대상체에서, 감소된 부작용, 예컨대 감소된 중증 홍조, 오심 및/또는 구토를 초래할 것으로 예상된다. 예를 들어, CGRP 및 CGRP 효능제는 인간 대상체에서 중증 홍조 및 심지어 오심 및 구토를 유도하는 것으로 보고되었고, 이는 부분적으로 CGRP 수용체의 활성화에 기인하는 것으로 여겨지고, CGRP 길항제에 의해 경감된다.
기존의 화합물과 비교하여, 예를 들어 화합물 6A와 비교하여, 화합물 1A 및 화합물 2A, 특히 화합물 1A가 환자 순응의 증가를 나타내고/내거나 필요한 경우의 투약 증가를 허용하여, 개선된 상업적 성공을 초래할 것으로 예상된다.
실시예 10: 폴리펩티드 접합체는 위 배출을 지연시킨다
폴리펩티드 접합체 및 모 화합물을 래트에서 위 배출을 지연시키는 능력에 대해 분석하였다. 위 배출 억제는 GLP-1 수용체 효능작용, 뿐만 아니라 아밀린 수용체 효능작용의 생리학적 효과이고, 글루코스 제어에서의 엑센딘-4 및 화합물 6A의 주요 약리학적 효과이다. 금식시킨 수컷 스프라그 돌리 래트 (약 250 g, n = 5마리/군)에게 염수, 화합물 6A 또는 시험 화합물의 단일 피하 주사를 t = 0에 제공하였다 (1 nmol/kg). 그 후, 33 mg 아세트아미노펜/1 ㎖ 오라블렌드(Orablend) (패드독 래버러토리즈 인코포레이티드(Paddock Laboratories, Inc.), 미국 미네소타주)의 경구 위관영양을 래트에게 주사 후 t = 3.5시간, 5.5시간 또는 7.5시간에 제공하였다. 피하 주사하고 나서 4시간, 6시간 또는 8시간 후에 아세트아미노펜 측정을 위해 혈액을 수집하였다. 경구 위관영양 30분 후의 혈장 내의 아세트아미노펜의 출현에 의해 위 배출을 평가하였다.
표 11은 위 배출의 억제 %를 나타낸다. 화합물 1A 및 화합물 2A가 단일 주사 후 6시간까지 위 배출 억제에서 화합물 6A만큼 효과적이었다. 화합물 3A 및 화합물 7A는 시험된 시점 및 용량에서 위 배출을 유의하게 억제하지 않았다. 놀랍게도, 화합물 1A가 화합물 2A와 비교하여 더 긴 작용 기간을 제공하였다.
Figure pct00011
모 화합물인 화합물 4A를 포함하는 폴리펩티드 접합체인 화합물 1A의 본원에서 제공된 검정들에서의 효과가 놀랍다. 문헌 [Hargrove et al., 2007]에서, 엑센딘-4 펩티드 유사체 Leu14 엑센딘-4인 화합물 4A가 엑센딘-4에 비교하여 현저하게 덜 효력이 있는 위 배출 지연 (4배 덜함), 현저하게 덜 효력이 있는 음식 섭취 억제 (8배 덜 강력함), 더 짧은 반감기, 및 더 짧은 작용 기간을 나타낸다는 것이 교시되었다. 폴리펩티드 접합체 화합물 1A 내의 Leu14 엑센딘-4 펩티드 유사체 서열의 존재에도 불구하고, 화합물 1A는 화합물 2A 및 기존에 공지된 접합체들에 비교하여 놀랄 만큼 우월한 약리학적 성질, 예컨대 강건하고 더 길게 작용하는 위 배출 활성 억제, 뿐만 아니라 놀랄 만큼 강건하고 더 길게 작용하는 음식 섭취 감소 및 체중 감소를 나타냈다. 놀랍게도, 화합물 1A 및 화합물 2A가 엑센딘-4, 화합물 4A 및 화합물 6A에 비하여 5시간 인큐베이션 기간에 걸쳐 인간 혈장에서 및 인간 신장 솔가장자리막 매트릭스로의 시험관내 대사 프로파일이 더 안정적이었다 (2배 이상) (데이터는 제시되지 않음). 이러한 기간 동안 화합물 1A 또는 화합물 2A에 대한 대사산물이 검출되지 않았고, 이는 임의의 미확인 대사산물이 10％ 미만의 수준으로 존재하였을 것임을 가리킨다.
놀랍게도, 화합물 1A 및 화합물 2A가 엑센딘-4, 화합물 4A 또는 화합물 6A에 비하여 생체이용률은 유사하면서 반감기가 더 길었다 (래트에서의 피하 주사) (데이터는 제시되지 않음). 엑센딘-4의 20분 및 다발린티드의 약 30분에 비교하여, 피하 제공된 화합물 1A의 반감기는 72분이었고 (수컷 스프라그-돌리 래트에서), 이때 절대 생체이용률은 유사하였다.
우수한 PK 프로파일 및 기타 유리한 약물 성질 예컨대 표적을 벗어나는 활성이 더 적은 것 및 감소된 오심과 커플링되어, 이러한 우월한 약리학적 성질들은 글루코스 제어와 체중 및 신체 조성 제어에서의 추가적인 개선이 이로운 질환 및 상태를 가진, 이같은 치료를 필요로 하는 대상체에서 글루코스 제어와 체중 및 신체 조성 제어에서의 추가적인 개선을 위한 놀랄 만큼 유용한 폴리펩티드 접합체 (화합물 2A 및 더욱더 그러한 화합물 1A)를 제공한다. 이같은 상태에는 당뇨병전기, 당뇨병, 당뇨병 + 과체중 또는 비만, 과체중 또는 비만인 대상체가 포함되고, 이때 이같은 대상체는 혈당을 제어하는 것 (예를 들어, 항-고혈당증) 및/또는 체중 감소, 체중 유지, 체중 증가 방지 및/또는 제지방 근육 대 체지방 비율 개선을 위한 체중 및 신체 조성의 개선된 효과 또는 제어를 갖는 것을 필요로 하고 이를 원하는 대상체이다.
모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 간행물 및 특허 출원이 본원에 완전하게 기재된 것처럼 참고로 포함되는 것으로 명확하게 및 개별적으로 지시되는 바와 동일한 정도로 참고로 본원에 포함된다. 이해를 명쾌하게 하기 위해 상기에서 상세하게 기술되었지만, 본 개시내용 또는 첨부된 청구항의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Amylin Pharmaceuticals, Inc. <120> POLYPEPTIDE CONJUGATE <130> 0703WO1 <140> PCT/US2010/057890 <141> 2010-11-23 <150> 61/263,752 <151> 2009-11-23 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> amidated optionally <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> amidated optionally <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> amidated optionally <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Glu Ile Ile Ser 35 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> amidated optionally <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> AMIDATION <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn 20 25 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> AMIDATION <400> 6 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu 1 5 10 15 His Arg Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 20 25 30 <210> 7 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> AMIDATION <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Gly Lys 20 25 30 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu His 35 40 45 Arg Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 50 55 60 <210> 8 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is beta-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is beta-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> AMIDATION <400> 8 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Xaa Xaa Lys Cys 20 25 30 Asn Thr Ala Thr Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu His Arg 35 40 45 Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 50 55 60 <210> 9 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Lys Cys Asn Thr Ala Thr 35 40 45 Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu His Arg Leu Gln Thr Tyr 50 55 60 Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 65 70 <210> 10 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (74)..(74) <223> AMIDATION <400> 10 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Lys Cys Asn Thr Ala Thr 35 40 45 Cys Val Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu His Arg Leu Gln Thr Tyr 50 55 60 Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 65 70 <210> 11 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 11 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Glu Ile Ile Ser Gly Gly Gly Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val 35 40 45 Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu His Arg Leu Gln Thr Tyr Pro Arg 50 55 60 Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 65 70 <210> 12 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> AMIDATION <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Glu Ile Ile Ser Gly Gly Gly Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val 35 40 45 Leu Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu His Arg Leu Gln Thr Tyr Pro Arg 50 55 60 Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 65 70

Claims (79)

  1. 화합물 1A 또는 화합물 2A를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 화합물 1A를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 화합물 2A를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(moiety)에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 친유성 모이어티에 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 친유성 모이어티가 알킬 기, 지방산, 콜레스테릴, 또는 아다만틸인 폴리펩티드 접합체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 하나 이상의 지방산에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 알부민에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 알부민이 지방산에 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1A 또는 화합물 2A가 폴리아미노산에 공유결합으로 연결된 것인 폴리펩티드 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 1 μM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  12. 제11항에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 100 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  13. 제12항에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 10 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  14. 제13항에 있어서, GLP-1 수용체 기능 검정에서 EC50이 1 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 1 μM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 100 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 10 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 칼시토닌 C1a 수용체 기능 검정에서 EC50이 5 nM 미만인 폴리펩티드 접합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘(exendin)-4, 화합물 4A 또는 다발린티드(davalintide)보다 더욱 효력적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘-4 및 다발린티드 둘 모두보다 더욱 효력적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘-4보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 다발린티드보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘-4 및 다발린티드 둘 모두보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-투여된 최대로 효과적인 용량의 엑센딘-4 및 다발린티드보다 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘-4보다 더욱 효력적으로 및 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 3A보다 더욱 효력적으로 및/또는 더욱 효과적으로 체중을 감소시키는 폴리펩티드 접합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 체중 감소가 4주 기간에 걸쳐 발생하는 것인 폴리펩티드 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 체중 감소가 6개월 기간에 걸쳐 발생하는 것인 폴리펩티드 접합체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 체중 감소가 1년 기간에 걸쳐 발생하는 것인 폴리펩티드 접합체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘-4와 비교하여 래트에서 카올린 섭취를 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다발린티드와 비교하여 래트에서 카올린 섭취를 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 7A와 비교하여 래트에서 카올린 섭취를 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 엑센딘-4와 비교하여 오심을 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 다발린티드와 비교하여 오심을 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 7A와 비교하여 오심을 감소시킨 폴리펩티드 접합체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 오심이 중증도가 덜한 오심 또는 1년 당 유해 사례의 횟수가 덜 빈번한 오심 또는 둘 모두이고, 이때 오심 사례가 경도, 중등도 또는 중증, 또는 오심 사례들의 합쳐진 총 횟수일 수 있는 것인 폴리펩티드 접합체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 공복 혈장 혈당을 저하시키는 폴리펩티드 접합체.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 당 부하에 대한 내성을 증가시키는 폴리펩티드 접합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스-유도 인슐린 분비를 증가시키는 폴리펩티드 접합체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 2시간 이상, 4시간 이상 또는 8시간 이상 동안 위 배출을 지연시키는 폴리펩티드 접합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 용량에서 화합물 3A보다 더 큰 정도로 위 배출을 지연시키는 폴리펩티드 접합체.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 용량에서 엑센딘-4, 다발린티드 또는 화합물 3A보다 더 큰 정도로 혈장 트리글리세리드를 저하시키는 폴리펩티드 접합체.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 용량에서 화합물 2A보다 더 큰 정도로 혈장 트리글리세리드를 저하시키는 폴리펩티드 접합체.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 염 형태의 화합물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  46. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 당뇨병 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 당뇨병이 제1형 당뇨병인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 당뇨병이 제2형 당뇨병인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 당뇨병이 임신성 당뇨병인 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 과체중이거나, 비만이거나, 또는 과체중 또는 비만 성향이 있는 대상체인 방법.
  51. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 인슐린 저항성 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 인슐린 저항성을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린 저항성을 치료하는 방법.
  52. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 식후 고혈당증 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 식후 고혈당증을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 식후 고혈당증을 치료하는 방법.
  53. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 혈당 수준의 저하를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 방법.
  54. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 HbA1c 수준의 저하를 필요로 하는 대상체에서 HbA1c 수준을 저하시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 HbA1c 수준을 저하시키는 방법.
  55. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 인슐린 방출 자극을 필요로 하는 대상체에서 인슐린 방출을 자극하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린 방출을 자극하는 방법.
  56. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 위 운동의 감소를 필요로 하는 대상체에서 위 운동을 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 위 운동을 감소시키는 방법.
  57. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 위 배출 지연을 필요로 하는 대상체에서 위 배출을 지연시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 위 배출을 지연시키는 방법.
  58. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 음식 섭취의 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 방법.
  59. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 식욕 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 식욕을 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 식욕을 감소시키는 방법.
  60. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 체중 감소를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 체중을 감소시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 체중을 감소시키는 방법.
  61. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 과체중의 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 과체중을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 과체중을 치료하는 방법.
  62. 치료 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 투여하여 비만의 치료를 필요로 하거나 원하는 대상체에서 비만을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비만을 치료하는 방법.
  63. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 mg인 방법.
  64. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 2.5 mg인 방법.
  65. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 1 mg인 방법.
  66. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍인 방법.
  67. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 약 1 ㎍ 내지 약 25 ㎍인 방법.
  68. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 70 ㎏ 대상체의 체중을 기초로 약 0.01 ㎍ 내지 약 100 ㎍인 방법.
  69. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 치료 유효량이 70 ㎏ 대상체의 체중을 기초로 약 0.01 ㎍ 내지 약 50 ㎍인 방법.
  70. 1회분 이상의 치료 유효 용량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제약 조성물을 포함하는 약물 전달 장치.
  71. 제70항에 있어서, 바이알, 제약 펜 또는 카트리지인 약물 전달 장치.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 치료 유효 용량의 약 1개월 공급분을 포함하는 약물 전달 장치.
  73. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 화합물을 제조하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 재조합 공정을 포함하는 방법.
  75. 대상체에 의한 폴리펩티드 접합체 또는 조성물의 사용에 대한 설명서를 임의적으로 갖는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 접합체 또는 제약 조성물을 포함하는 키트.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 접합체의 투여가 화합물 6A에 비하여 개선된 환자 순응, 화합물 6A에 비하여 개선된 중증 홍조 감소, 및/또는 화합물 6A에 비하여 감소된 오심을 초래하는 것인 방법.
  77. 제63항에 있어서, 용량이 약 0.1 내지 1.0 ㎎/일인 방법.
  78. 제67항에 있어서, 용량이 약 0.3 내지 0.6 ㎎/일인 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 하루에 1번 (QD) 제공되거나, 또는 하루에 2번 (BID)으로 분할 제공되는 것인 방법.
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