JP2009502904A - 補体C3a由来のペプチド及びその使用 - Google Patents
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Abstract
補体成分ペプチドC3aの配列の55〜64位に部分的に対応するペプチドは、アナフィラトキシン反応を回避しながら、IgE若しくはIgG媒介性誘発を抑制することにより、並びに/又はFcεRI及び/若しくはFcγR誘発性分泌反応を抑制することにより、マスト細胞及び好塩基性細胞媒介性疾患を予防及び治療することができる。粘膜型及び/若しくは漿膜型のマスト細胞並びに/又は好塩基球が、喘息、アレルギー性皮膚疾患、及び消化管アレルギーなどに関与する場合、これらのペプチドは、アレルギー性疾患の予防及び/又は治療に有用である。
Description
本発明は、補体C3aのアミノ酸配列に由来するペプチドに関し、マスト細胞又は好塩基球により媒介されるアレルギー性疾患、特に喘息などの肺アレルギーの予防及び治療におけるこれらの使用に関する。
マスト細胞及び好塩基球は、炎症性及び即時型過敏反応において中心的な役割を果たす。マスト細胞及び好塩基球の原形質膜中に存在する1型Fcεレセプター(FcεRI)のクラスター形成が、カップリングカスケードを開始し、ヒスタミン、セロトニン、プロテアーゼ、リウコトリエン及びいくつかのサイトカインを含む炎症伝達物質の分泌に至る。FcεRIクラスター形成により開始されるシグナル伝達の分子機構は、ここ数年の間に集中的に研究されてきた。srcファミリータンパク質チロシンキナーゼ(PTK)のLynは、レセプター複合体のβサブユニットと相互作用し、FcεRIのクラスター形成の結果、リン酸化と活性化を受ける。免疫レセプターのチロシンベースの活性化モティーフ(ITAM)−リン酸化したレセプターサブユニットへのLynの動員は、Syk PTKの活性化を引き起こし、これはひいてはホスホリパーゼC−γ(PLC−γ)の活性化、リン脂質イノシド−4,5−ビスホスフェート(PIP2)の加水分解及び遊離サイトゾルの[Ca2+]iの一過性の増加を引き起こす。これは次にプロテインキナーゼCの活性化を引き起こし、最終的に伝達物質の分泌に至る。
マスト細胞前駆細胞は単一系統を示し、異なる組織への遊走後に、2つの異なった表現型を生じ、漿膜空洞、皮膚及び気道に存在する、いわゆる漿膜(結合組織型)マスト細胞、並びに主として胃腸内粘膜の表面に見いだされる粘膜型マスト細胞を生じる。しかし、マスト細胞の組織依存的分化は可逆的であり、線維芽細胞由来の因子は、粘膜型のマスト細胞を漿膜型のマスト細胞に変えるが、IL−3は粘膜の表現型に有利である。組織分布の他に、これら細胞の細胞内顆粒の寿命及び伝達物質含有量も異なる。どちらの型もその細胞膜上にFcεRIを発現し、これらのクラスター形成は分泌反応を誘発する。
マスト細胞のFcεRI媒介性誘発とは対照的に、マスト細胞活性化のペプチド作動性経路は、漿膜マスト細胞でのみ生じる。漿膜マスト細胞は、ラット腹膜又はヒト皮膚マスト細胞で実験的にモデル化される。ペプチド作動性刺激は、ポリアミン又はカチオン性ペプチド、たとえばサブスタンスP、若しくは補体活性化産物C3a及びC5aに曝露させることにより誘発される(Mousliら,Immunopharmcol 27:1−11,1995)。後者の補体由来のアナフィラトキシンは、(漿膜)マスト細胞の分泌反応の最も強力なペプチド作動性活性化因子の1つである。これとは対照的に、ラットの好塩基球性白血病細胞系(RBL−2H3)などの粘膜マスト細胞は、このようなカチオン性ペプチドに反応しない。C3a及び一部のその誘導体は、RBL−2H3細胞のIgE媒介性脱顆粒を抑制するが、C5aはこの過程に影響を及ぼさないことが示された(Erdeiら.Int.Immunol.7:1433−1439,1995;Erdeiら,Immunol.Lett.68:79−82,1999)。
C3aは漿膜マスト細胞に対してアナフィラトキシンであるため、C3aは抗アレルギー剤としての使用には適さない。すなわちC3aはマスト細胞からメディエータの分泌を誘導できる。
本発明の出願人らの米国特許第6,682,740号では、粘膜マスト細胞のIgE媒介性誘発及び/又はFcεRI誘発性分泌反応を抑制できるヒト補体由来ペプチドC3aの配列の50〜77位、及びそのアナログに部分的に、又は完全に対応するペプチドを開示している。
好塩基性細胞及び漿膜型及び粘膜型双方のマスト細胞に媒介される脱顆粒を伴うアレルギー性疾患の予防又は治療に有用な、短いペプチド及びこれを含む組成物に対する必要性が存在している。
本発明によって、ヒト補体成分C3aの55〜64位におけるアミノ酸配列及びこのアナログに由来し、部分的に対応するあるペプチドは、粘膜型及び漿膜型双方のマスト細胞並びに好塩基性細胞のFcεRI誘発性分泌反応の抑制に有効であり、付随する症状の緩和に有効であるが、C3aのアナフィラトキシン作用を欠いていることが判明した。
これらのペプチドの抑制効果は、FcεRI刺激反応カップリングカスケードに近位の事象の抑制、たとえばFcεRIβサブユニット及びチロシンキナーゼLynのタンパク質リン酸化並びに遊離サイトゾルのカルシウムイオンの一過性の増加のような後期の事象の抑制をもたらすことが今回発見された。
ヒト補体成分C3aの55〜64位のアミノ酸配列及びそのアナログに部分的に対応するC3a由来ペプチドは、受動全身アナフィラキシー及び動物モデルにおける喘息症状を緩和できることが今回初めて開示された。
本発明は、細胞の分泌反応を抑制することでできる配列番号2に記載の配列:Asp−Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Glu−Leu−Argを有するヒト補体ペプチドC3aの55〜64位のアミノ酸配列、並びにこれらのアナログ、化学的誘導体、及び塩に由来し、部分的に対応するペプチドに関し、細胞は粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞であり、分泌反応は、(i)IgE若しくはIgG媒介性誘発及び/又は(ii)FcεRI若しくはFcγRクラスター形成から選択される刺激により誘発される。
1つの態様において、本発明は、一般式I:
X1−Asp−X2−Asn−Tyr−Ile−Thr−X3(配列番号3から10);
(式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Ser、D−Ala、及びD−Ala−D−Alaから選択され;
X2は、Ser−Ser及びVal−Valから選択され;
X3は、Arg、Arg−NH2、Glu−Cys−Arg、及びGlu−Cys−Arg−NH2から選択される
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩(但し、X1が水素又は低級アルカノイルであり、X3がArg又はArg−NH2である場合は、X2はVal−Valである)のアミノ酸配列を有するヒト補体C3aのアミノ酸55〜64位の配列(配列番号2)に由来するペプチドを提供する。
X1−Asp−X2−Asn−Tyr−Ile−Thr−X3(配列番号3から10);
(式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Ser、D−Ala、及びD−Ala−D−Alaから選択され;
X2は、Ser−Ser及びVal−Valから選択され;
X3は、Arg、Arg−NH2、Glu−Cys−Arg、及びGlu−Cys−Arg−NH2から選択される
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩(但し、X1が水素又は低級アルカノイルであり、X3がArg又はArg−NH2である場合は、X2はVal−Valである)のアミノ酸配列を有するヒト補体C3aのアミノ酸55〜64位の配列(配列番号2)に由来するペプチドを提供する。
本発明の新規のペプチドは、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞の分泌反応を抑制することができる。刺激により誘発される分泌反応は、(i)IgE若しくはIgG媒介性誘発及び/又は(ii)FcεRI若しくはFcγRのクラスター形成からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、
(f)(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアナログ;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の化学的誘導体;及び
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)の塩
(但し、Zは、末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
用語D−Alaは、アラニンのD−異性体立体配置を表す。
(f)(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアナログ;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の化学的誘導体;及び
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)の塩
(但し、Zは、末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
用語D−Alaは、アラニンのD−異性体立体配置を表す。
いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチドは約8から約12のアミノ酸残基を有する。特定の実施形態においては、本発明のペプチドは約8から約10のアミノ酸残基を有する。
特定の実施形態によれば、このペプチドは、Zがカルボキシ末端アミドである配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する。ある実施形態によれば、前記ペプチドはZがカルボキシ末端アミドである配列番号11に記載のアミノ酸配列を有する。
別の態様によれば、本発明は、活性剤として本発明の原理によるヒト補体C3aのアミノ酸55〜64位の配列、又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩に由来する少なくとも1つのペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物中の前記ペプチドは、配列番号3〜配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、医薬組成物中の前記ペプチドは、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。追加の実施形態においては、医薬組成物中の前記ペプチドは、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。
さらなる態様によれば、本発明は、アレルギー性疾患の予防及び/又は治療に有用な医薬の調製のための、少なくとも1つのペプチド、又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩、及び薬学的に許容し得る担体の使用を提供し、それらのペプチド、アナログ、化学的誘導体又は塩は、配列番号3〜配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、このペプチドは、配列番号7又は配列番号11に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。いくつかの実施形態によれば、アレルギー性疾患は、好塩基性細胞並びに/又は粘膜型及び/若しくは漿膜型マスト細胞媒介性疾患である。典型的な実施形態よれば、アレルギー性疾患は喘息である。
なおさらなる態様によれば、本発明は、アレルギー性疾患の予防及び/又は治療の方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、活性剤として配列番号3〜配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、これによりアレルギー性疾患を予防又は治療する。特定の実施形態によれば、ペプチドは配列番号3から14からなる群から選択される。特定の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号7又は配列番号11に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。
いくつかの実施形態では、アレルギー性疾患は、IgE若しくはIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症及び/又はFcεRI若しくはFcγR誘発性分泌反応に起因する。他の実施形態によれば、アレルギー性疾患は、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介される。本発明の医薬組成物を用いて治療及び/又は予防できるアレルギー性疾患の例には、限定されるものではないが、季節性鼻炎及び副鼻腔炎を含むアレルギー性鼻炎;肺疾患、たとえば喘息;アレルギー性皮膚疾患、たとえばじんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、及び接触性皮膚炎;アレルギー性結膜炎;消化管アレルギー、たとえば食品又は薬剤に起因するこれらのアレルギー;痙攣;吐き気;嘔吐;下痢;過敏性腸疾患;眼のアレルギー;口唇炎;外陰炎;ブドウ膜炎;並びにアナフィラキシーが含まれる。典型的な実施形態によれば、アレルギー性疾患は喘息である。
別の態様によれば、本発明は、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型より媒介されるアレルギー性疾患を予防及び/又は治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に、活性剤として以下の配列:
[式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Asp−Cys及びArg−Arg−Cysから選択され;
X2は、水素、低級アルカノイル及びLysから選択され;
X3は、
から選択され;
X4は、Ile−Thr−R2−Leu−R3及びIle−Thr−Arg−R7から選択され;
X5は、低級アルカノイル及びLeuから選択され;
R1は、芳香族アミノ酸残基から選択され;
R2は、Glu及びLysから選択され;
R3は、正に荷電するアミノ酸残基から選択され;
R4は、Arg及びGluから選択され;
R5は、Ala及びArgから選択され;
R6は、Arg及びLysから選択され;
R7は、ヒドロキシ(OH)、Arg、Arg−NH2、及びAgm(アグマチン)から選択される]
これらのアナログ、化学的誘導体、及び薬学的に許容し得る塩からなる群から選択されるペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
[式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Asp−Cys及びArg−Arg−Cysから選択され;
X2は、水素、低級アルカノイル及びLysから選択され;
X3は、
から選択され;
X4は、Ile−Thr−R2−Leu−R3及びIle−Thr−Arg−R7から選択され;
X5は、低級アルカノイル及びLeuから選択され;
R1は、芳香族アミノ酸残基から選択され;
R2は、Glu及びLysから選択され;
R3は、正に荷電するアミノ酸残基から選択され;
R4は、Arg及びGluから選択され;
R5は、Ala及びArgから選択され;
R6は、Arg及びLysから選択され;
R7は、ヒドロキシ(OH)、Arg、Arg−NH2、及びAgm(アグマチン)から選択される]
これらのアナログ、化学的誘導体、及び薬学的に許容し得る塩からなる群から選択されるペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
追加の実施形態においては、ペプチドは、以下の配列;
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のアナログ;
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)又は(h)の化学的誘導体;及び
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)又は(i)の塩からなる群から選択される。
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のアナログ;
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)又は(h)の化学的誘導体;及び
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)又は(i)の塩からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号25〜配列番号31のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は、場合によってはカルボキシ末端アミドである。特定の実施形態においては、ペプチドは、以下の配列:
からなる群から選択される。
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、配列番号15〜31からなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物を用いて治療及び/又は予防されるアレルギー性疾患は、漿膜型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞におけるIgE若しくはIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症及び/又はFcεRI若しくはFcγR誘発性分泌反応に起因する。治療可能なアレルギー性疾患の例には、限定されるものではないが、消化管アレルギー、たとえば、食品又は薬剤により引き起こされるこれらのアレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、下痢、及び外陰炎が含まれる。米国特許第6,682,740号は、それを必要とする対象に、配列番号15から31のいずれか1つアミノ酸配列又はこれらのアナログ若しくは誘導体を有するペプチドを投与することを含む、粘膜型マスト細胞が含まれるIgE媒介性(I型)過敏症により引き起こされるアレルギー性疾患を治療する方法を開示することを理解するべきである。本発明は今回初めて、その必要性を有する対象に配列番号15から31のいずれか1つのアミノ酸配列又はこれらのアナログ若しくは誘導体を有するペプチドを投与することを含む、漿膜の型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー性疾患の治療又は予防する方法を開示する。
本発明のこれら実施形態及び他の実施形態は、以下の図、説明、実施例及び請求の範囲に関してさらに良く理解されるであろう。
本発明は、ヒト補体C3aのC末端配列、これらのアナログ、化学的誘導体、及び薬学的に許容し得る塩に基づく合成ペプチドに関する。このペプチドは、IgE若しくはIgG媒介性(I型及びIII型)過敏症及び/又はFcεRI若しくはFcγR誘発性分泌反応を抑制するのに有用であり、この反応は粘膜型及び漿膜型両方のマスト細胞並びに好塩基性細胞により媒介される。
本発明のペプチドは、以下の配列番号2:
Asp−Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Glu−Leu−Arg
に記載のヒト補体C3aの55〜64位のアミノ酸配列
並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び薬学的に許容し得る塩に由来し、部分的に対応する。本発明のペプチドC末端は、遊離カルボキシ形態であってもよく、好ましくは、ペプチドの安定性を増強するために、たとえば生体で酵素切断に対するペプチドの耐性を増強するためにアミド化されてもよい。またカルボキシ末端は、ペプチドの溶解度を増すように修飾されてもよい。
Asp−Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Glu−Leu−Arg
に記載のヒト補体C3aの55〜64位のアミノ酸配列
並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び薬学的に許容し得る塩に由来し、部分的に対応する。本発明のペプチドC末端は、遊離カルボキシ形態であってもよく、好ましくは、ペプチドの安定性を増強するために、たとえば生体で酵素切断に対するペプチドの耐性を増強するためにアミド化されてもよい。またカルボキシ末端は、ペプチドの溶解度を増すように修飾されてもよい。
本発明のペプチド
本発明は、マスト細胞及び好塩基性細胞のFcεRI又はFcγR誘発性分泌反応並びに/又はIgE又はIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症を抑制するのに有用な新規のペプチドを提供する。マスト細胞は、粘膜型及び漿膜型マスト細胞を含む。
本発明は、マスト細胞及び好塩基性細胞のFcεRI又はFcγR誘発性分泌反応並びに/又はIgE又はIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症を抑制するのに有用な新規のペプチドを提供する。マスト細胞は、粘膜型及び漿膜型マスト細胞を含む。
1つの態様において、本発明は、一般式I:
X1−Asp−X2−Asn−Tyr−Ile−Thr−X3(配列番号3から10);
(式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Ser、D−Ala、及びD−Ala−D−Alaから選択され;
X2は、Ser−Ser及びVal−Valから選択され;
X3は、Arg、Arg−NH2、Glu−Cys−Arg、及びGlu−Cys−Arg−NH2から選択される
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩
(但し、X1が水素又は低級アルカノイルであり、X3がArg又はArg−NH2である場合は、X2はVal−Valである)のアミノ酸配列からなるヒト補体C3aのアミノ酸55〜64(配列番号2)の配列に由来するペプチドを提供する。
X1−Asp−X2−Asn−Tyr−Ile−Thr−X3(配列番号3から10);
(式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Ser、D−Ala、及びD−Ala−D−Alaから選択され;
X2は、Ser−Ser及びVal−Valから選択され;
X3は、Arg、Arg−NH2、Glu−Cys−Arg、及びGlu−Cys−Arg−NH2から選択される
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩
(但し、X1が水素又は低級アルカノイルであり、X3がArg又はArg−NH2である場合は、X2はVal−Valである)のアミノ酸配列からなるヒト補体C3aのアミノ酸55〜64(配列番号2)の配列に由来するペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、
(f)(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアナログ;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の化学的誘導体;及び
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)の塩;
(但し、Zは、末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
用語D−Alaは、アラニンのD−異性体立体配置を表す。
(f)(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアナログ;
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の化学的誘導体;及び
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)の塩;
(但し、Zは、末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
用語D−Alaは、アラニンのD−異性体立体配置を表す。
1つの実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で配列番号7に記載のペプチドC3a32として同定されたペプチドで、ヒト補体ペプチドC3aの53〜62位の配列に由来する10merのペプチドあり、カルボキシ末端がカルボキシ末端アミドであり、配列:
D−Ala−D−Ala−Asp−Ser−Ser−Asn−Tyr−Ile−Thr−Arg−NH2のペプチドである。
D−Ala−D−Ala−Asp−Ser−Ser−Asn−Tyr−Ile−Thr−Arg−NH2のペプチドである。
別の実施形態においては、本発明のペプチドは、本明細書で配列番号11に記載のペプチドC3a31として同定されたペプチドで、ヒト補体ペプチドC3aの54〜62位の配列に由来する9merのペプチドであり、カルボキシ末端がカルボキシ末端アミドであり、配列:
Ser−Asp−Ser−Ser−Asn−Tyr−Ile−Thr−Arg−NH2
のペプチドである。
Ser−Asp−Ser−Ser−Asn−Tyr−Ile−Thr−Arg−NH2
のペプチドである。
さらに別の実施形態においては、本発明のペプチドは、本明細書でC3a14と表示した8merのペプチド、本明細書でC3a29と表示した9merのペプチド、及び本明細書でC3a35と表示した11merのペプチドを含み、カルボキシ末端がカルボキシ末端アミドであり、配列:
を含む。
を含む。
本発明は、本発明のペプチド、フラグメント、アナログ、及び化学的誘導体の塩を含む。本明細書中で用いられる「塩」という用語は、カルボキシル基の塩及びペプチド分子のアミノ基の酸添加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当分野で周知の手段により形成することができ、無機塩、たとえばアルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン酸、二価のマンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛その他を含む。薬学的に許容し得る有機の無毒性塩基に由来する塩には、一級、二級及び三級アミンの塩、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、たとえばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2−ジエチルアミノエタノール、2−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N−エチル−モルフォリン、N−エチルピペ、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルフォリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン、その他が含まれる。
たとえば、酸付加塩には、鉱酸との塩、たとえば酢酸、ベンゼンスルホ基、ベンゾイン、カンファースルホ基、クエン酸、エタンスルホ基、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ、マンデリン酸、メタン硫酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントチン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、p−トルエンスルホン酸、その他との塩が含まれる。
「ペプチド」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ペプチド又は非ペプチド結合により一方を他方に結合した天然、非天然及び/又は化学修飾されたアミノ酸残基を包含することを意味する。アミノ酸残基は、当技術分野で周知であるように、明細書及び請求の範囲を通して、1文字コード又は3文字コードで示される。本発明の化合物は、直鎖及び環状のペプチド並びにそれらの誘導体及びアナログを含む。
「化学的誘導体」とは、本明細書中で用いられる場合、通常はペプチド分子の一部ではない別の化学的部分、たとえば遊離カルボキシ基のエステル及びアミド、遊離アミノ基のアシル及びアルキル誘導体、遊離ヒドロキシ基のエステル及びエーテルを含むペプチドを意味する。このような修飾は、ペプチドの標的にしたアミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることによりペプチドに導入することができる。
ペプチドアナログは、天然又は非天然のアミノ酸残基によるアミノ酸の置換及び/又は添加を含む。ペプチドアナログは、ペプチドミメティックを含む。ペプチドミメティック、すなわち「疑似ペプチド」は、ペプチドの生物学的活性を模倣するが、本質的に完全にはペプチドでない分子である。完全に、又は部分的に非ペプチドであるか否かに関係なく、本発明に記載の疑似ペプチドは、疑似ペプチドの基礎になるペプチドにおける残基の三次元配置に極めて近似した化学的部分の立体配置を提供する。この類似の活性部位構造の結果、疑似ペプチドはペプチドの生物学的活性に類似する生物系に及ぼす効果を有する。
ペプチドの塩、アナログ及び化学的誘導体は、安定性、溶解度などに関する限り、このペプチドの薬学的特性の修飾に好適に利用できる。
医薬組成物
本発明はさらに、本発明のペプチド、これらのアナログ、化学的誘導体、又は薬学的に許容し得る塩を、薬学的に許容し得る担体と共に含む医薬組成物を含む。
本発明はさらに、本発明のペプチド、これらのアナログ、化学的誘導体、又は薬学的に許容し得る塩を、薬学的に許容し得る担体と共に含む医薬組成物を含む。
いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、FcεRI−βサブユニットは、FcεRIと共にFcγRのシグナル伝達又は活性化を変調又は調節することができる(たとえば、Dombrowiczら,Immunity 8:517−529,1998を参照)。したがって、当技術分野で公知の様式でFcR亜型により媒介され、FcεRI−βサブユニットで変調されたマスト細胞及び/又は好塩基性細胞の分泌反応により引き起こされるアレルギー性疾患が本発明に含まれる。
他の考察は別として、本発明の新規の活性成分が、ペプチド、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体、又はこれらの塩であるという事実は、処方物はこの型の化合物の送達に適切であるべきことを規定している。一般にペプチドは、胃酸又は腸内酵素による消化に感受性であるため経口投与には不適切であるが、本発明による組成物を経口投与できることが今初めて開示される。本発明の医薬組成物を、任意の適切な手段により、たとえば、局所的に、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、関節内に、病変内に又は非経口的に投与することができる。吸入による投与も本願発明の範囲内に包含される。
活性成分としての本発明のペプチドは、周知のように薬学的に許容し得て、活性成分と適合性の希釈剤又は賦形剤に溶解され、分散され、又は混合される。適切な担体又は賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組合せである。他の適切な担体は、当業者には周知である。さらに必要に応じて、組成物は少量の補助物質、たとえば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、安定剤、結合剤(たとえば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、崩壊剤(たとえば、デンプングリコレートナトリウム、架橋結合したポビドン、架橋結合したカルボキシルメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤、増粘剤、抗酸化剤、その他を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、当該分野で周知の工程、たとえば通常の混合、溶解、顆粒化、粉砕、微粉砕、糖剤化、微粒子状化、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥工程により製造することができる。
本発明により使用する医薬組成物は、1つ又は複数の生理学的に受容可能な担体又は製剤中に活性成分の加工を容易にし、薬学的に用い得る助剤を含む賦形剤を用いて、通常の様式で製剤化することができる。適切な処方物は、選択される投与経路に依存する。
吸入による投与では、本発明による医薬組成物は、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素の使用を含むか若しくは含まない、加圧したパック又はネブライザからのエアロゾルスプレー提示の形態で送達することができる。加圧したエアゾールの場合、ある一定量を送達するため弁を備えることにより、投与量単位を決定することがでる。吸入器又は注入器における使用のための、たとえばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジが処方でき、これはペプチドの粉末混合物及び適切な粉末基剤、たとえばラクトース又はスターチを含む。
経口投与可能な医薬組成物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル及びゼラチン製のソフトな、密封されたカプセル並びに可塑剤、たとえばグリセロール又はソルビトールを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、スターチのような結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤及び必要に応じて安定化剤と混合した活性成分を含むことができる。ソフトカプセル中では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、若しくは液体ポリエチレングリコールのような適切な液体の中に溶解又は懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方物は、選択した投与経路に適切な投与量でなければならない。口腔内投与のためには、組成物は通常の様式で処方された錠剤又は舐剤形態をとり得る。
糖衣錠の核には、適切なコーティングが施される。この目的のためには、濃縮された糖溶液が使用され、これは必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤又は混合溶媒を含むこともできる。染料又は色素が、識別のために又は活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるために、錠剤又は糖剤コーティングに添加される場合もある。
注射用として、本発明の化合物は水溶液で、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、たとえばハンクの溶液、リンゲル液、又は生理緩衝食塩水に入れて処方することができる。経粘膜投与用には、浸透する障壁に対して適切な浸透剤が処方物で使用される。浸透剤には、たとえばポリエチレングリコールが当該分野で一般に知られている。
非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性成分の水溶液を含む。さらにこの活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製することができる。適切な天然又は合成の担体は、当分野において良く知られている(Pillaiら,Curr.Opin.Chem.Biol.5,447,2001)。必要に応じて、またこの懸濁液は、活性成分の溶解度を増大させて非常に濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤を含むことができる。或いは使用前に適切なビヒクル、たとえば無菌で発熱性物質を含まない水により再構成するために、活性成分は粉末の形態であることができる。
本発明の医薬組成物はまた、たとえば従来の座薬基剤(たとえばカカオバター又は他のグリセリド)を使用する坐剤又は滞留浣腸のような直腸用の組成物に処方することもできる。
本発明のコンテキストにおける使用に適する医薬組成物は、活性成分を意図した目的を達成するために有効な量で含む組成物を含む。より詳細には、「治療有効量」とは、治療する対象のアレルギー疾患の症状を予防、遅延、緩和又は改善するために有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
本明細書に記載されているペプチド及びこれらのアナログ、誘導体、又は塩の毒性と治療有効性は、細胞培養又は実験動物で、標準的な製薬学的手順により、たとえば、対象ペプチドに関するIC50(50%抑制を与える濃度)を測定することにより決定することができる。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用される投与量の範囲を処方する際に使用することができる。投与量は、使用された剤形及び利用された投与経路により変化し得る。正確な処方物、投与経路及び投与量は、患者の症状を考慮して個々の医師により選択され得る(たとえばFinglら、1975、「治療薬の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)」,Ch.1 p.1)。
治療する症状の重篤度に応じて、投薬はまた、徐放性組成物の1回の投与であり得、治療経過は数日から数週間まで、又は治癒が達成されるまで、又は疾病状態の軽減が得られるまで持続する。投与される組成物の量は、むろん、治療されている対象の免疫状態及び健康状態、疾病又は症状の重篤度、投与の様式、並びに他の関連する要素に依存する。
処方物及び投与方法は、例示を意図したもので制限を意図したものではない。本明細書で提供される開示を用いて、他の適切な処方物及び投与の様式を容易に考案できることが理解されるであろう。
発明のいくつかの実施形態によれば、C3a由来のペプチド又はアナログの治療的有効量は、約0.02mg/kgから約10mg/kgの範囲の投与量である。好ましくは、本発明によるペプチド、誘導体又はアナログの投与量は、約0.05mg/kgから約2mg/kgの範囲であり、より好ましくはペプチド、誘導体又はアナログの投与量は、約0.1mg/kgから約1mg/kgの範囲である。投与量は、漸増する投与量であり得、したがって最初は低い投与量であり得て、適切な反応が達成されるまで、その後より高い投与量で投与され得ることは理解されるであろう。また、この組成物の投与量を、それぞれの投与で投与量の一部が投与される、治療期間の過程おける複数回投与で対象に投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のペプチド並びにこれらの誘導体及びアナログは、修飾されたペプチドとして細胞に送達される。1つの実施形態では、本発明のペプチドは、細胞貫通ペプチド(CPP)に結合される。1つの好ましい実施形態では、CPPは、ショウジョウバエアンテナペデイア(ANTP)ドメイン又はそれらのフラグメントを含むアミノ酸配列である。
治療用途
本発明のペプチド、並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び塩を、哺乳動物でアレルギー疾患の予防又は療法的処置のための医薬組成物又は薬剤の製造に用いることができる。
本発明のペプチド、並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び塩を、哺乳動物でアレルギー疾患の予防又は療法的処置のための医薬組成物又は薬剤の製造に用いることができる。
本発明は、アナフィラトキシン作用を誘発することなく、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介されるアレルギー性疾患の予防及び/又は治療の方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、活性剤として配列番号3から配列番号8からなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この疾患は、IgE若しくはIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症及び/又はFcεRI若しくはFcγR誘発性分泌反応に起因するアレルギー性疾患である。
本発明の医薬組成物により治療可能なアレルギー疾患の例には、限定されるものではないが、季節性鼻炎及び副鼻腔炎を含むアレルギー性鼻炎;肺疾患、たとえば気管支喘息;アレルギー性皮膚疾患、たとえばじんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、及び接触性皮膚炎;アレルギー性結膜炎;消化管アレルギー、たとえば食品又は薬剤に起因するこれらのアレルギー;痙攣;吐き気;嘔吐;下痢;過敏性腸疾患;及び眼のアレルギー、たとえばブドウ膜炎;口唇炎;外陰炎;並びにアナフィラキシーが含まれる。本発明はまた、ハチ毒その他を含むトキシンに曝されることにより誘発された症状を緩和又は治療するのに有用である。特定の実施形態においては、アレルギー性疾患は喘息である。
配列番号15〜配列番号31に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、粘膜マスト細胞が含まれるIgE媒介性(I型)過敏症の抑制に有用であるとして、本発明の出願人らにより米国特許第6,682,740号(その内容は、上述のごとく本明細書中に完全に参照として含まれる)に開示されている。これらのペプチドは、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞のIgE若しくはIgG及び/又はFcεR1若しくはFcγR誘発性分泌反応の抑制に有効であるであることが現在示されている。
したがって本発明はさらに、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型によって媒介されるアレルギー性疾患を治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に、配列番号15〜配列番号31からなる群から選択される少なくとも1つのペプチドの治療的有効量を含む医薬組成物を投与することを含む。
1つの実施形態では、漿膜マスト細胞及び/又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー性疾患を治療する方法で使用されるペプチドは、ヒト補体ペプチドC3aの56〜64の配列由来の9merのペプチドで、配列番号25に記載の本明細書でC3a7と表示した、配列:
Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Glu−Leu−Arg
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Glu−Leu−Arg
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
なおさらなる実施形態では、漿膜型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー性疾患を治療する方法で使用される本発明のペプチドは、ヒト補体ペプチドC3aの55〜62の配列由来の8merのペプチドで、配列番号26に記載の本明細書でC3a9と表示した、配列:
Asp−Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Arg
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
Asp−Cys−Cys−Asn−Tyr−Ile−Thr−Arg
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
別の実施形態においては、漿膜型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー疾患を治療する方法で使用される本発明のペプチドは、ヒト補体ペプチドC3aの55〜61の配列由来の7merのアナログで、配列番号27に記載の本明細書でC3a11と表示した、配列:
Asp−Ser−Ser−Asn−Tyr−Ile−Arg
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
Asp−Ser−Ser−Asn−Tyr−Ile−Arg
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
いっそうさらなる実施形態においては、漿膜型マスト細胞及び/又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー疾患を治療する方法で使用される本発明のペプチドは、14merのC3a4、20merのC3a5、15merのC3a6、10merのC3a10であり、配列:
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
いくつかの好ましい実施形態では、配列番号25から配列番号31のいずれか1つに記載のペプチドのカルボキシ末端は、カルボキシ末端アミドである。
たとえば花粉症の治療のための、スプレー又はエアゾールの形態の医薬組成物は、花粉の飛散する季節にアレルギーの発症を予防するために、必要とする対象に投与するのに適切であり得る。さらに気管支粘膜表面は吸入されたアレルゲンに対する最初の接触部位であり、したがってスプレーで投与された本発明の抑制ペプチドに対するマスト細胞の反応には、非常に有効であり得ることはよく知られている。
漿膜マスト細胞の活性化を伴うアレルギー性疾患は、限定されるものではないがI型又はIII型の即時型過敏反応、たとえば消化管アレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、及び下痢が含まれる。
本発明のペプチドは、単剤治療のような医薬組成物として又は他の治療薬、たとえば他の抗炎症剤との組合せにより投与することができる。併用療法は、同時に又は異なる時間に投与される単回用剤形又は複数回用剤形としての薬剤の投与を含むことができる。
ここで、本発明を以下の実施例で説明するが、これらによって制限されるものではない。
材料及び方法
試薬及び細胞培養培地。組織培養培地及び補充物は、Invitrogen Life Technologies又はGibco(Grand Island,NY)から購入した。TritonX−100、p−ニトロフェニル−N−アセチル−β−D−グルコサミン及び抗ホスホチロシンAb PT−66は、Sigma(Sigma−Aldrich Kft.,Hungary)から購入した。2,4−ジニトロベンゼンスルホン酸結合ウシ血清アルブミン(DNP11−BSA)、DNPコーティングビーズ及びマウスDNP特異的モノクローナルA2 IgEは、Arieh Licht氏(Rehovot,Israel)の好意により供与を受けた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)結合抗マウスIgG及びHRP標識抗ウサギIgGは、Sigma−Aldrichから購入し、抗Lyn AbはBD Transduction Laboratoriesから購入した。増強された化学ルミネッセンス試薬(ECL)は、Amersham Biosciences(UK)から購入し、SDS−ゲル電気泳動に用いる材料は、Bio−Rad(CA,USA)から入手した。Fluo−3 AM色素は、Calbiochemから入手した。C3a及びC5aは、(Erdeiら,Int.Immunol.7:1433−1439,1995を参照)に記載のように単離した。
試薬及び細胞培養培地。組織培養培地及び補充物は、Invitrogen Life Technologies又はGibco(Grand Island,NY)から購入した。TritonX−100、p−ニトロフェニル−N−アセチル−β−D−グルコサミン及び抗ホスホチロシンAb PT−66は、Sigma(Sigma−Aldrich Kft.,Hungary)から購入した。2,4−ジニトロベンゼンスルホン酸結合ウシ血清アルブミン(DNP11−BSA)、DNPコーティングビーズ及びマウスDNP特異的モノクローナルA2 IgEは、Arieh Licht氏(Rehovot,Israel)の好意により供与を受けた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)結合抗マウスIgG及びHRP標識抗ウサギIgGは、Sigma−Aldrichから購入し、抗Lyn AbはBD Transduction Laboratoriesから購入した。増強された化学ルミネッセンス試薬(ECL)は、Amersham Biosciences(UK)から購入し、SDS−ゲル電気泳動に用いる材料は、Bio−Rad(CA,USA)から入手した。Fluo−3 AM色素は、Calbiochemから入手した。C3a及びC5aは、(Erdeiら,Int.Immunol.7:1433−1439,1995を参照)に記載のように単離した。
合成ペプチド及びタンパク質の標識化。ペプチド合成は、MBHA樹脂上で「Boc化学」(Merifieldら,Biochem.14:1385−1390,1964)を利用する固相法により実施した。逆相HPLC及び質量分析によりペプチドを精製し、特性を決定した。Amersham−Pharmacia(NJ,USA)により提供される使用説明書(0.1M炭酸水素ナトリウムに関する標識プロトコル)によって与えられるように、ペプチドC3a9はCy5を用いて、A2IgEはCy3を用いて標識した。
細胞。骨髄由来マスト細胞(BMMC)は、Nagaoらにより記載されたように(Science 212:333−335,1981)、Balb/cマウスから調製した。3週間後に、ほぼ95%純粋なマスト細胞集団が得られ、フローサイトメトリーで測定して、FcεRI及び幹細胞因子レセプター(c−キット)の高い発現が示された。
Reuben Siraganian博士(NIH,Bethesda MD)から入手したRBL−2H3細胞系を、5%FCS、2mMグルタミン及び抗生物質を補充したダルベッコの改変必須培地(DMEM)中で、37℃、5%CO2の加湿雰囲気下で維持した。実験のために、細胞をDMEM中10mM EDTAと共に15分のインキュベーションによる剥離後に収集した。
ラット腹腔マスト細胞(RPMC)を、前述したように単離した(Kimら,J.Immunol.162:4960−4965,1981)。マスト細胞標本は、FcεRI表面発現のフローサイトメトリーモニタリングによる評価で、ほぼ95%純粋であった。漿膜型マスト細胞の特異的活性化因子であるコンパウンド48/80が、単離したラット腹腔マスト細胞の総βヘキソサミニダーゼ含量の約50%の放出を誘発した。
マスト細胞の分泌反応。FcεRIクラスター形成による刺激作用に反応したマスト細胞による媒介物質の分泌を、記述したように分泌された顆粒性酵素βヘキソサミニダーゼの活性を測定することによりモニターした(Erdeiら,Int.Immunol.7:1433−1439,1995を参照)。抗原誘発性反応に及ぼすC3a及びその誘導体の効果を調べるために、DNPに特異的なA2 IgEの飽和濃度で感作したマスト細胞を、最適下限の抗原濃度(5ng/ml)に曝す前に、さまざまなペプチドの濃度範囲で、室温で5分間プレインキュベートした。
ELISAによるTNF−αの測定。このペプチドの非存在或いは存在下で、RBL−2H3によるFcεRIクラスター形成に反応するTNF−αの分泌を、ラットTNF−α ELISAキット(R&D systems,UK)を用いて測定した。
免疫沈降及びウエスタンブロット。マスト細胞を、10cmのペトリ皿に播種(7×106細胞/皿)し、一夜、37℃でDMEM中でA2IgEを用いて飽和した。細胞を洗浄後、5分間ペプチドで処理し、37℃で2分間、5ng/mlのDNP11−BSAと共にインキュベートしてFcεRIをクラスター形成させた。反応を、ペトリ皿当たり500μlの細胞溶解緩衝液(1% Triton X−100、50mM HEPES、100mM NaF、10mM EDTA、2mM オルトバナジウム酸ナトリウム、10% グリセロール、10mM ピロリン酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル1:200、pH 7.4)により停止した。細胞を擦り取り、ポスト核上清のタンパク含量を、PT−66ホスホチロシン特異的抗体でコーティングしたビーズ(試料当たり10μlビーズ)による沈殿の前に、ブラッドフォードアッセイを用いて等しい値に調整した。タンパク質を、2−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液により溶出し、SDS−PAGEで分離し、ニトロセルロース膜上へエレクトロトランスファーして、表示した抗体を用いて発現し、ECLにより検出した。
遊離サイトゾルCa2+イオン濃度のモニタリング。0.5mlのRPMI−1640培地中で、合計5×106のIgE感作細胞に、5μM Fluo−3/AM指示薬及び30μg/mlプルロニック(Pluronic)F−127を37℃で30分間ロードした。洗浄後、細胞(5×105細胞/ml)を、200μMのC3a7又はC3a9ペプチドと共に37℃で5分間インキュベートした。フローサイトメトリー記録開始後20秒で、5ng/mlの抗原(DNP11−BSA)を細胞に添加し、遊離カルシウムイオン濃度の変化を、Becton−Dickinson FACSCalibur flow cytometerの時間分解モードで追跡調査した。データ収集及び解析は、CELLQuestソフトウェア(Becton−Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)を用いて実施した。
走査レーザー共焦点顕微鏡。RBL−2H3細胞を収集し、4℃で25分間、5μMのCy3結合IgEと共にインキュベートするか又は、同時に200μMのCy5結合C3a9ペプチドと共にもインキュベートした。洗浄後、細胞を氷上で20分間、2%のパラホルムアルデヒドで固定し、次いで、0.1%のポリ−L−リシンでプレコートしたカバーガラスにマウントした。Cy3標識IgE及びCy5ペプチドからの蛍光シグナルを、緑色(543nmヘリウムネオンレーザーによる励起)及び赤色(632nmヘリウムネオンレーザーによる励起)Zeiss LSM5走査レーザー共焦点顕微鏡の光学チャネルで分析した。細胞を、0.5μm厚の512×512ピクセルセクションに光学的にスライスした。共局在性の指標として、蛍光強度間の相互相関係数の評価を、前述したように実施した(Verebら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6013−6018,2000)。
フローサイトメトリー蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)測定。双方ともRBL−2H3細胞の表面に結合したFITC標識C3a9ペプチド(ドナー)及びCy3標識IgE(アクセプター)間のFRETを測定し、Becton Dickinson FACSStar Plus flow cytometerを用いて評価した。RBL−2H3細胞は、Cy3−IgEの飽和濃度を用いて標識したが、FITC−C3a9ペプチドは150μM、すなわち、機能的研究で用いたこのペプチドと同程度の量であった。
BMMCに対するC3aの共有結合性の架橋。BMMCを洗浄し、C3a(50μg/ml(PBS中で15〜20×106細胞/試料当たり))と共に、室温で10分間インキュベートした。5mMの架橋結合試薬のビス−(スルホサクシンイミドイル)−スベラート(BS3,PIERCE,IL,USA)と共にさらに室温で20分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、溶解した。C3a特異的ポリクローナルウサギ抗体(Behringwerke AG,Germany)を、免疫沈降に用いた。ウェスタンブロッティングを、Jean Pierre Kinet(Harvard University,Boston,USA)の好意により供与を受けたFcεeRIβ鎖特異的抗体により実施した。二次抗体として、HRPO結合ヤギ抗マウスIgG(DAKO,Frank Diagnosztika Kft,Hungary)を用いた。検出はECLにより実施した。
表面プラスモン共鳴(SPR)測定。SPR測定は、BIACORE instrument Model 2000(Pharmacia,Sweden)を用いて実施した。下記の配列を有するペプチドを合成して使用した:(1)ラット及びヒトFcεRIβ鎖の第1の細胞外ループ:それぞれSTLQTSDFDDEVLLLYRAGYPF(配列番号39)及びSVLDISHIEGDIFSSFKAGY(配列番号40);並びに(2)ラット及びヒトFcεRIβ鎖の第2の細胞外ループ:それぞれNNSAYMNYCKDITEDDGCFVTS(配列番号41)及びKSLAYIHIHSCQKFFETKCFMAS(配列番号42)。
全てのペプチドを、そのN末端アミノ基でビオチン標識し、30及び60共鳴ユニット(RU)の範囲にわたる低密度で、ストレプトアビジンでコートしたセンサチップ(BIACORE,Sweden)に結合した。蒸留水中で10.5nMから656nMの範囲にわたる5つの異なる濃度のC3a及びC5a溶液を、20μl/minの流量で注入した。チップ表面は、測定間で0.1MHClにより再生した。データは、BIAEVALUATION 3.0ソフトウェアを用いて解析した。観察された結合速度定数(kobs)を、C3a濃度の関数としてプロットし、各プロットの勾配を結合の比速度定数(kon)と見なすのに対し、y切片を解離速度定数(koff)と見なして、次いでKdをkoff/konとして算出した。
受動全身アナフィラキシー。マウス(Balb/c)を300〜400μlのアベルチン(avertin)を用いて麻酔し、眼窩後(又は尾静脈)注射により、200μlのPBS中のIgEクラスのDNP特異的モノクローナル抗体(SPE−7,Sigma)を3μg注射した。24時間後にマウスを300〜400μlのアベルチンで麻酔し、鼻孔上へ置いたPBS中の約100μlの表示したペプチド(抑制性、配列番号11、対照の配列番号35の逆転させたペプチド又は配列番号36のペプチドGAKDGNEYI−COOH)溶液に曝した。これに続いて、眼窩後(又は尾静脈)注射で、抗原(200μlのPBS中、100μgのDNP誘導体化ヒト血清アルブミン、HSA)又はPBSのみを注射した。1.5分後に頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、心臓穿刺を実施した。ここではヘパリンリンスの注射器を吸引に用いた。血液試料を、卓上遠心器で4℃で10分間、8000rpmで遠心した。競合的なALPアッセイ用のImmunotechプロトコルにより、ヒスタミンをアッセイした。
ペプチドの肺機能に及ぼす抑制効果。マウス(Balb/c、雌、8週齢)を、最初に抗原(Ag)卵白アルブミンのip注射により感作した。その後、1週間隔で約20分間の、プレキシグラスチャンバ中でネビュライザーにより拡散した同じ抗原のエアゾールの吸入で、マウスを4回チャレンジした。28日目に、マウスを0.1M NaHCO3に溶解し、上記のように拡散した試験するペプチドエアゾールで、最初に処置した。この結果エアゾールは、約10から20分間、動物に吸入された。吸入後、動物を20分間、感作抗原(5%OVA、PBS中)(上記のように)の吸入により直ちにチャレンジした。この処置の終了後、マウスを直ちにプレチスモグラフィーを用いて、意識的、自由運動状態における肺機能について試験した。
気管支絞窄の程度を、マウスにおける増強されたポーズ及び気道抵抗に対するその関連、インピーダンス及び胸内圧によりモニターした。気管支肺胞洗浄(BAL)試料を、0.8mlの氷冷生理的食塩水(×2)を注入する気管カニューレ処置後、BAL液体を吸引することにより、これらのマウスから得た。これらの試験後に、ブレビタル(1mg/ml)の全身麻酔を用いてマウスを屠殺した。マウスの胸壁を開いて血液を回収し、肺を冷PBSで灌流して細胞学及び組織学に関して検査した。
(実施例1)
ヒトC3a由来のペプチド
下記に示す表1は、合成したペプチド、そのアミノ酸配列、質量分析データ及びネームコードのリストを提供する。ペプチドC3a1、C3a3、C3a55、及びGAKペプチド(配列番号33から配列番号36)を対照ペプチドとして使用した。表1にリストしたペプチドは、本明細書中に開示のように「Boc化学」を用いて合成した。そのほかに、全てのペプチドを、さらに別のアミド化されたペプチドとして調製した。ペプチド合成の方法は、限定することを意図したものではないことに留意すべきである。
ヒトC3a由来のペプチド
下記に示す表1は、合成したペプチド、そのアミノ酸配列、質量分析データ及びネームコードのリストを提供する。ペプチドC3a1、C3a3、C3a55、及びGAKペプチド(配列番号33から配列番号36)を対照ペプチドとして使用した。表1にリストしたペプチドは、本明細書中に開示のように「Boc化学」を用いて合成した。そのほかに、全てのペプチドを、さらに別のアミド化されたペプチドとして調製した。ペプチド合成の方法は、限定することを意図したものではないことに留意すべきである。
(実施例2)
粘膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすペプチドの抑制能力
以前の実験で、本出願の発明者らは、RBL−2H3細胞のIgE媒介性刺激作用の抑制に関与するC3a配列のモティーフを同定した(Erdeiら,Immunol Lett.68:79−82,1999)。この結果は、補体−ペプチドのアナフィラトキシン及び走化活性を生じる上で極めて重要であることが知られているC3aのC末端配列(残基65〜77)は、この抑制に含まれないことを明らかに示していた。しかし、残基56〜64(C3a7と命名したCCNYITELR)を含む上流の配列が含まれている。この配列のいくつかのアナログが現在合成され、このアナログのうちオクタペプチド、すなわちC3a9と命名したDCCNYITRは、RBL−2H3系の粘膜型マスト細胞のFcεRI媒介性分泌を抑制する上で有効であることが示されている(図1)。IgE感作細胞を、最適下限の(5ng/ml)抗原量を用いて刺激する前に5分間ペプチドと共にインキュベートし、次いで分泌された顆粒性酵素のβヘキソサミニダーゼ活性を測定した。図1Aに、これらの細胞の反応に及ぼす、これらのペプチドにより生じた用量依存的抑制を示す。
粘膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすペプチドの抑制能力
以前の実験で、本出願の発明者らは、RBL−2H3細胞のIgE媒介性刺激作用の抑制に関与するC3a配列のモティーフを同定した(Erdeiら,Immunol Lett.68:79−82,1999)。この結果は、補体−ペプチドのアナフィラトキシン及び走化活性を生じる上で極めて重要であることが知られているC3aのC末端配列(残基65〜77)は、この抑制に含まれないことを明らかに示していた。しかし、残基56〜64(C3a7と命名したCCNYITELR)を含む上流の配列が含まれている。この配列のいくつかのアナログが現在合成され、このアナログのうちオクタペプチド、すなわちC3a9と命名したDCCNYITRは、RBL−2H3系の粘膜型マスト細胞のFcεRI媒介性分泌を抑制する上で有効であることが示されている(図1)。IgE感作細胞を、最適下限の(5ng/ml)抗原量を用いて刺激する前に5分間ペプチドと共にインキュベートし、次いで分泌された顆粒性酵素のβヘキソサミニダーゼ活性を測定した。図1Aに、これらの細胞の反応に及ぼす、これらのペプチドにより生じた用量依存的抑制を示す。
粘膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすC3a31、C3a32、及びC3a35と命名したペプチドの効果を図1Bに示す。図IBで示すように、ペプチドC3a31及びC3a32は、RBL−2H3からのIgE媒介性βヘキソサミニダーゼの分泌を抑制することが認められた。ペプチドC3a11及びC3a13を試験して、RBL−2H3細胞のIgE依存性脱顆粒を抑制することが示された。
骨髄由来マスト細胞(BMMC)を用いる同様の実験を実施した。C3aは、同様にこれらの粘膜型マスト細胞のIgE媒介性分泌反応も抑制することが認められたが(表2)、C5aは効果を示さなかった。表2で示すように、BMMCの分泌反応に及ぼすペプチドC3a7及びC3a9の抑制効果はRBL−2H3細胞に及ぼす抑制効果に匹敵する。配列DVSNYITRの対照標準ペプチドは、どちらの系にも効果を示さなかった。
表2.RBL−2H3、BMMC及びラット腹腔マスト細胞(RPMC)のIgE媒介性脱顆粒に及ぼす、C3a及びC3a由来のペプチドの抑制効果(IC50、μM)。
脱顆粒アッセイに関して、最適下限の抗原量を用いた。
* C3は非感作細胞に添加された場合、粘膜型RBL−2H3及びBMM細胞ではなく漿膜型RPMCのみを刺激した。
脱顆粒アッセイに関して、最適下限の抗原量を用いた。
* C3は非感作細胞に添加された場合、粘膜型RBL−2H3及びBMM細胞ではなく漿膜型RPMCのみを刺激した。
(実施例3)
漿膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすペプチドの抑制能力
粘膜型マスト細胞はペプチド作動性刺激に非反応性であるが、漿膜型細胞はカチオン性分泌促進物質により刺激されることがずっと以前から知られていた。アナフィラトキシンペプチドC3a及びC5aは、漿膜型マスト細胞により発現されたそのそれぞれのレセプターに結合することにより、細胞の分泌反応を開始する。このマスト細胞型に及ぼすペプチドの効果を調べるために、RPMCを使用した。予想通り、やはりこれらの細胞はC5a及びC3aに反応した(表2)。しかし、ペプチドC3a7又はC3a9をIgEで感作したRPMCに添加し、5分後に最適下限の抗原量を用いて刺激した場合には、脱顆粒は抑制された(表2)。
漿膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすペプチドの抑制能力
粘膜型マスト細胞はペプチド作動性刺激に非反応性であるが、漿膜型細胞はカチオン性分泌促進物質により刺激されることがずっと以前から知られていた。アナフィラトキシンペプチドC3a及びC5aは、漿膜型マスト細胞により発現されたそのそれぞれのレセプターに結合することにより、細胞の分泌反応を開始する。このマスト細胞型に及ぼすペプチドの効果を調べるために、RPMCを使用した。予想通り、やはりこれらの細胞はC5a及びC3aに反応した(表2)。しかし、ペプチドC3a7又はC3a9をIgEで感作したRPMCに添加し、5分後に最適下限の抗原量を用いて刺激した場合には、脱顆粒は抑制された(表2)。
(実施例4)
ペプチドC3a7又はC3a9は、FcεRI−クラスター形成で誘発されるTNF−αの分泌を抑制する
TNF−α分泌を測定することにより、マスト細胞の遅延相反応に及ぼすペプチドの効果を測定した。この目的のために、C3a7又はC3a9の不在下又は存在下で、RBL−2H3細胞を刺激した24時間後に上清を取り、分泌されたサイトカイン濃度をELISAにより測定した。図1Cに示すように、どちらのペプチドもこの炎症性サイトカインの放出を用量依存的に抑制した。単独で添加した場合、ペプチドは効果を示さなかった。
ペプチドC3a7又はC3a9は、FcεRI−クラスター形成で誘発されるTNF−αの分泌を抑制する
TNF−α分泌を測定することにより、マスト細胞の遅延相反応に及ぼすペプチドの効果を測定した。この目的のために、C3a7又はC3a9の不在下又は存在下で、RBL−2H3細胞を刺激した24時間後に上清を取り、分泌されたサイトカイン濃度をELISAにより測定した。図1Cに示すように、どちらのペプチドもこの炎症性サイトカインの放出を用量依存的に抑制した。単独で添加した場合、ペプチドは効果を示さなかった。
(実施例5)
Lyn、PI−3K及びFcεRIのβサブユニットのチロシンリン酸化は、抑制ペプチドにより抑制される
図2Aは、FcεRIクラスター形成が誘発するいくつかの細胞内タンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の増加が、RBL−2H3細胞を抗原刺激前に200μMのC3a7(レーン3)又はC3a9(レーン4)に曝露した時、著しく減少することを示す。この結果及び以前の結果に基づき(図1)、FcεRI近位の事象を検討した。これらの事象は、FcεRIβ及びγサブユニットのITAMのsrcファミリーPTK Lynによるリン酸化を含むことが知られている。図2Bで示すように、C3a7又はC3a9の存在下で細胞が抗原により刺激されたとき、Lynのリン酸化は大幅に減少したが、対照ペプチドは効果を示さなかった。またFcεRIβ鎖のリン酸化も調べ、対照ペプチドで処理した細胞のリン酸化と比べて減少することが認められた(図2B)。ホスファチジルイノシドのリン酸化レベルを調節する酵素であり、したがって主要なカップリング要素であるPI−3Kのチロシンリン酸化もまた、ペプチドC3a7及びC3a9に曝露後に減少することが認められた(図2B)。RBL−2H3細胞のチロシンリン酸化タンパク質のパターンにおいて、これらのペプチドは単独ではいかなる変化を引き起こさなかった。
Lyn、PI−3K及びFcεRIのβサブユニットのチロシンリン酸化は、抑制ペプチドにより抑制される
図2Aは、FcεRIクラスター形成が誘発するいくつかの細胞内タンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の増加が、RBL−2H3細胞を抗原刺激前に200μMのC3a7(レーン3)又はC3a9(レーン4)に曝露した時、著しく減少することを示す。この結果及び以前の結果に基づき(図1)、FcεRI近位の事象を検討した。これらの事象は、FcεRIβ及びγサブユニットのITAMのsrcファミリーPTK Lynによるリン酸化を含むことが知られている。図2Bで示すように、C3a7又はC3a9の存在下で細胞が抗原により刺激されたとき、Lynのリン酸化は大幅に減少したが、対照ペプチドは効果を示さなかった。またFcεRIβ鎖のリン酸化も調べ、対照ペプチドで処理した細胞のリン酸化と比べて減少することが認められた(図2B)。ホスファチジルイノシドのリン酸化レベルを調節する酵素であり、したがって主要なカップリング要素であるPI−3Kのチロシンリン酸化もまた、ペプチドC3a7及びC3a9に曝露後に減少することが認められた(図2B)。RBL−2H3細胞のチロシンリン酸化タンパク質のパターンにおいて、これらのペプチドは単独ではいかなる変化を引き起こさなかった。
またFcεRIカップリングカスケードに及ぼすペプチドC3a31の抑制作用も、ラット粘膜型のRBL−2H3系を用いて検討した。これらの実験の結果は、ペプチドC3a31は、タンパク質チロシンキナーゼLyn及びFcεRIβ鎖のリン酸化を抑制することを示した。Lynのリン酸化の抑制が1分後に認められ、PAGのリン酸化(PAGは、srcファミリーキナーゼの調節に重要な役割を持つ)の抑制が3分後に認められた。しかし、またC3a31が3分後にLynのリン酸化を増強することが示された。さらに、C3a31は5分後にDok−1リン酸化を抑制したが、8分後には効果を示さなかった。またC3a31は、PLCγ−2のリン酸化を抑制した。
(実施例6)
このペプチドは、抗原誘発性の[Ca2+]iの一過性上昇を抑制する。
[Ca2+]iの一過性上昇は、抗原で活性化された細胞で誘発される最も初期の事象の1つであるので、RBL−2H3細胞中でこの過程に及ぼすC3a7及びC3a9の効果を検討した。図3に示すように、抗原のチャレンジの5分前にペプチドC3a7又はC3a9を細胞に添加したとき、この過程は著しく抑制された。細胞外の培養液からのイオン流入に帰せられる[Ca2+]iの初期の急速な増加及び引き続く上昇したレベルの両方が抑制された。ペプチドが単独で添加された対照では、効果は決定され得ない。
このペプチドは、抗原誘発性の[Ca2+]iの一過性上昇を抑制する。
[Ca2+]iの一過性上昇は、抗原で活性化された細胞で誘発される最も初期の事象の1つであるので、RBL−2H3細胞中でこの過程に及ぼすC3a7及びC3a9の効果を検討した。図3に示すように、抗原のチャレンジの5分前にペプチドC3a7又はC3a9を細胞に添加したとき、この過程は著しく抑制された。細胞外の培養液からのイオン流入に帰せられる[Ca2+]iの初期の急速な増加及び引き続く上昇したレベルの両方が抑制された。ペプチドが単独で添加された対照では、効果は決定され得ない。
(実施例7)
C3aはFcεRIβ鎖に結合する
BMMCに対するC3aの共有結合性の架橋。C3aレセプターが粘膜型マスト細胞上で検出されなかったので、このペプチドは別の細胞膜成分との相互作用を介して、おそらくは1型Fcεレセプターを介するペプチドの抑制効果を及ぼす可能性を検討した。以前の実験で、本発明者らは、IgEとFcεRI間の相互作用のC3aによる干渉を認めなかったので、C3aは四量体FcεRI複合体のα鎖と相互作用しないと見なされた。β鎖を有するITAMが、FcεRI反応の増幅因子として作用することが以前に報告されていたので、BMMC上のこの膜タンパク質とC3aの相互作用を測定した。細胞をC3aと共にインキュベート後、共有結合性の架橋剤、BS3−試薬を添加した。これに続いて細胞溶解し、ポリクローナルC3a特異的抗体を用いて免疫沈降した。タンパク質試料をSDS−PAGEにより分離し、FcεRIβ鎖特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングにより解析した。図4Aに示すように、ただ1つのタンパク質が認められたが(レーン1)、対照試料では何も分離されなかった(レーン2)。各成分に対して共有結合的に架橋結合した、すなわち一方ではC3aに対して、及び他方ではβ鎖に対して架橋結合した複合体の特定の反応のために、約45kDaの質量を有するレーン1に現れるただ1つのバンドは、C3a(9kDa)及びβ鎖(36kDa)の共有結合複合体である。これらの結果は、RBL−2H3細胞を用いて得られたわれわれの以前の結果と完全に一致するものである(Erdeiら,1999、前掲書)。
C3aはFcεRIβ鎖に結合する
BMMCに対するC3aの共有結合性の架橋。C3aレセプターが粘膜型マスト細胞上で検出されなかったので、このペプチドは別の細胞膜成分との相互作用を介して、おそらくは1型Fcεレセプターを介するペプチドの抑制効果を及ぼす可能性を検討した。以前の実験で、本発明者らは、IgEとFcεRI間の相互作用のC3aによる干渉を認めなかったので、C3aは四量体FcεRI複合体のα鎖と相互作用しないと見なされた。β鎖を有するITAMが、FcεRI反応の増幅因子として作用することが以前に報告されていたので、BMMC上のこの膜タンパク質とC3aの相互作用を測定した。細胞をC3aと共にインキュベート後、共有結合性の架橋剤、BS3−試薬を添加した。これに続いて細胞溶解し、ポリクローナルC3a特異的抗体を用いて免疫沈降した。タンパク質試料をSDS−PAGEにより分離し、FcεRIβ鎖特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングにより解析した。図4Aに示すように、ただ1つのタンパク質が認められたが(レーン1)、対照試料では何も分離されなかった(レーン2)。各成分に対して共有結合的に架橋結合した、すなわち一方ではC3aに対して、及び他方ではβ鎖に対して架橋結合した複合体の特定の反応のために、約45kDaの質量を有するレーン1に現れるただ1つのバンドは、C3a(9kDa)及びβ鎖(36kDa)の共有結合複合体である。これらの結果は、RBL−2H3細胞を用いて得られたわれわれの以前の結果と完全に一致するものである(Erdeiら,1999、前掲書)。
C3a及びFcεRIβ鎖間の相互作用の表面プラスモン共鳴(SPR)測定。C3aとFcεRIのβ鎖との相互作用をさらに調べるために、ヒト及びラットの4回膜貫通型分子双方の第1及び第2細胞外ループの配列を有する固定化したオリゴペプチドを用いて、SPR測定を実施した。ヒトC3a及び対照のC5aを分析物として用いた。図4B及びCに示すように、C3aは、それぞれ250nM及び520nMのKd値を有するヒト及びラットのタンパク質双方の第1の細胞外ループに結合した。C3aと細胞膜蛋白の第2の細胞外ループ間には相互作用は検出されなかった。C5aは、いずれの試験したFcεRIβ鎖の配列とも反応しなかった。
(実施例8)
C3a9は、無傷のRBL−2H3細胞上でFcεRIに結合したIgEと共存している。
C3a9は、無傷のRBL−2H3細胞上でFcεRIに結合したIgEと共存している。
無傷の細胞上でのC3a由来のペプチドとFcεRIに結合したIgE間の空間的な関係の詳細を可視化するために、共焦点レーザー走査顕微鏡測定をRBL−2H3細胞上のCy3結合IgE及びCy5結合C3a9ペプチドを使用して実施した。Cy3とCy5放出シグナル間のピクセルごと相互相関の解析(相互相関係数:≧0.54)では、この細胞に結合したペプチドは、FcεRIαサブユニットに結合したIgEと共存していることを強く示している。これは全ての他の結果と一致し、このペプチドの相互作用部位が、マスト細胞の多サブユニットFcεRIレセプター複合体中に存在することを強く支持している(図4D)。さらに、またβ鎖を欠くヒト単球も共焦点蛍光顕微鏡で調べたが、検出可能なペプチドの結合は見いだされなかった。
上記の結果は、ナノメートルのスケールでの接近を示すFRET測定の結果によりさらに裏づけられた。24%の平均FRET効率を示すフローサイトメトリー共鳴エネルギー転移(FCET)効率のヒストグラム(図4E)は、FITC−C3a9ペプチドとRBL−2H3細胞の表面に結合したCy3−IgE間の分子的接近を明確に示した。
(実施例9)
受動全身アナフィラキシーの抑制
マウスにおけるC3a由来のペプチドの受動全身アナフィラキシーに及ぼす効果を検討した。図5で示すように、マウス血液中のヒスタミン濃度をアッセイでモニターしたとき、C3a31アミドは、受動全身アナフィラキシーの症状を緩和することが認められた。C3a55アミドと表示した逆転したペプチドは効果がなかった(図5)。対照群を、抗原DNP−HSAの注射前に配列番号36のアミノ酸配列GAKDGNEYI−COOHを有する関連の無いペプチドで処置した。
受動全身アナフィラキシーの抑制
マウスにおけるC3a由来のペプチドの受動全身アナフィラキシーに及ぼす効果を検討した。図5で示すように、マウス血液中のヒスタミン濃度をアッセイでモニターしたとき、C3a31アミドは、受動全身アナフィラキシーの症状を緩和することが認められた。C3a55アミドと表示した逆転したペプチドは効果がなかった(図5)。対照群を、抗原DNP−HSAの注射前に配列番号36のアミノ酸配列GAKDGNEYI−COOHを有する関連の無いペプチドで処置した。
(実施例10)
喘息モデルにおける、C3a由来のペプチドの抑制能力
肺機能を、最初の抗原(卵白アルブミン)注射による感作に曝露後、この抗原のエアゾール曝露に4回チャレンジした(又は曝されない、すなわち未処置の)マウスで、実験セクションに記載のようにアッセイした。動物を、抗原による最後の(通常は5回の)チャレンジの前に、緩衝液単独、ペプチドC3a31を含む緩衝液又はC3a55と表示した逆転したペプチドを含む緩衝液のいずれかのエアゾールに最終的に曝露した。図6A〜Dは、ペプチドC3a31の防御能力を示す。図6Aは、未処置マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し;図6Bは、喘息にかかったマウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し;図6Cは、抗原(卵白アルブミン)エアゾールのチャレンジ前に、ペプチドC3a31により処置した「喘息にかかった」マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し;図6Dは、抗原チャレンジの前に、ペプチドC3a55で処置した「喘息にかかった」マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示す。図6Eは、図6A〜Dに示した結果の平均値及び標準偏差を示す。これらの結果は、C3a31ペプチドは、喘息の動物モデルで抗原誘発性症状の緩和に有効であることを明解に示している。
喘息モデルにおける、C3a由来のペプチドの抑制能力
肺機能を、最初の抗原(卵白アルブミン)注射による感作に曝露後、この抗原のエアゾール曝露に4回チャレンジした(又は曝されない、すなわち未処置の)マウスで、実験セクションに記載のようにアッセイした。動物を、抗原による最後の(通常は5回の)チャレンジの前に、緩衝液単独、ペプチドC3a31を含む緩衝液又はC3a55と表示した逆転したペプチドを含む緩衝液のいずれかのエアゾールに最終的に曝露した。図6A〜Dは、ペプチドC3a31の防御能力を示す。図6Aは、未処置マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し;図6Bは、喘息にかかったマウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し;図6Cは、抗原(卵白アルブミン)エアゾールのチャレンジ前に、ペプチドC3a31により処置した「喘息にかかった」マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し;図6Dは、抗原チャレンジの前に、ペプチドC3a55で処置した「喘息にかかった」マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示す。図6Eは、図6A〜Dに示した結果の平均値及び標準偏差を示す。これらの結果は、C3a31ペプチドは、喘息の動物モデルで抗原誘発性症状の緩和に有効であることを明解に示している。
表3は、肺機能の分析に供されたマウスと同じプロトコルにより処置したマウスの気管支肺胞洗浄(BAL)中に存在する細胞の分析結果を提供する。表3に示したように、ペプチドC3a31による処置は、BALで検出される細胞型に著しい影響を及ぼし、主として好中球の数を減少させた。
これらの結果は、アレルギー関連症状の抑制に及ぼすC3a由来のペプチドの顕著な能力を明確に確立した。これは粘膜型及び漿膜型マスト細胞双方を調べる細胞培養、並びに喘息様の症状の同様な顕著な抑制を示すin vivoモデルの動物で認められた。
本明細書で上述して示したことがらに限定されるものではないことは当業者には理解されるであろう。本発明の範囲は、むしろ請求項により規定される。
Claims (24)
- 一般式I:
X1−Asp−X2−Asn−Tyr−Ile−Thr−X3(配列番号3から10)
(式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Ser、D−Ala及びD−Ala−D−Alaからなる群から選択され;
X2は、Ser−Ser及びVal−Va1からなる群から選択され;
X3は、Arg、Arg−NH2、Glu−Cys−Arg、及びGlu−Cys−Arg−NH2からなる群から選択される);
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩
(但し、X1が水素又は低級アルカノイルであり、X3がArg又はArg−NH2である場合は、X2はVal−Valである)のアミノ酸配列を有するヒト補体C3aのアミノ酸55〜64位の配列(配列番号2)に由来する、ペプチド。 - 分泌反応が、(i)IgE又はIgG媒介性誘発、及び(ii)FcεRI又はFcγRのクラスター形成からなる群から選択される刺激により誘発される、請求項1に記載のペプチド。
- Zがカルボキシ末端アミドである、請求項1から3までのいずれか一項に記載のペプチド。
- Zがカルボキシ末端アミドである、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する、請求項4に記載のペプチド。
- Zがカルボキシ末端アミドである、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有する、請求項4に記載のペプチド。
- 活性剤として請求項1から6までのいずれか一項に記載のペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号3〜配列番号14、並びにこれらのアナログ及び化学的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項8に記載の医薬組成物。
- アレルギー性疾患を予防及び/又は治療するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項1から6までのいずれか一項に記載のペプチドの治療有効量、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、これにより前記アレルギー性疾患を予防又は治療する、上記方法。
- 前記ペプチドが、配列番号3〜配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項11に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項12に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項12に記載の方法。
- 前記アレルギー性疾患が、IgE若しくはIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症及び/又はFcεRI若しくはFcγR誘発性分泌反応に起因する、請求項11に記載の方法。
- 前記アレルギー性疾患が、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介される、請求項11に記載の方法。
- 前記アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、肺疾患、アレルギー性皮膚疾患、アレルギー結膜炎、消化管アレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、下痢、過敏性腸疾患、眼のアレルギー、口唇炎、外陰炎、及びアナフィラキシーからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記肺疾患が喘息である、請求項17に記載の方法。
- 漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介されるアレルギー性疾患を予防及び/又は治療するための方法であって、それを必要とする対象に、ペプチドの治療有効量及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記ペプチドが、
(式中、
X1は、水素、低級アルカノイル、Cys、Asp−Cys及びArg−Arg−Cysから選択され;
X2は、水素、低級アルカノイル及びLysから選択され;
X3は、
から選択され;
X4は、(i)Ile−Thr−R2−Leu−R3;及び(ii)Ile−Thr−Arg−R7から選択され;
X5又は配列は、低級アルカノイル及びLeuから選択され;
R1は、芳香族アミノ酸残基から選択され;
R2は、Glu及びLysから選択され;
R3は、正に荷電するアミノ酸残基から選択され;
R4は、Arg及びGluから選択され;
R5は、Ala及びArgから選択され;
R6は、Arg及びLysから選択され;
R7は、ヒドロキシ(OH)、Arg、Arg−NH2、及びAgm(アグマチン)から選択される)、
並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び薬学的に許容し得る塩からなる群から選択される、上記方法。 - 前記ペプチドが、配列番号25に記載のアミノ酸配列からなり、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項19及び20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号26に記載のアミノ酸配列からなり、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項19及び20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレルギー性疾患が、IgE若しくはIgG媒介性(I型若しくはIII型)過敏症及び/又はFcεRI若しくはFcγR誘発性分泌反応に起因する、請求項19に記載の方法。
- 前記アレルギー性疾患が、消化管アレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、下痢、過敏性腸疾患からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
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