KR100967152B1

KR100967152B1 - 신규한 펩티드 및 이의 의약적 용도

Info

Publication number: KR100967152B1
Application number: KR1020047008365A
Authority: KR
Inventors: 테루오 니시다; 이누이마코토; 나카무라마사츠구
Original assignee: 산텐 세이야꾸 가부시키가이샤; 테루오 니시다
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2010-07-05
Also published as: DK1462455T3; CA2469134C; ES2422081T3; EP1462455A4; CA2469134A1; US20110059897A1; US20050009752A1; TWI305778B; JP2008163044A; WO2003048192A1; US8183343B2; CN1599748A; EP1462455A1; SI1462455T1; AU2002354188A1; KR20100002291A; EP1462455B1; US20090005317A1; JP4310588B2; US7232881B2

Abstract

본 발명은 인슐린양 성장 인자-I의 최소 활성 발현 단위를 탐구하고, 안과 및 피부과 영역에 있어서의 의약 용도를 발견하는 것을 목적으로 한다. 인슐린양 성장 인자-I의 최소 활성 발현 단위인 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 병용은 각막의 장해 치유에 유효하며, 피부의 창상 치유를 현저히 촉진한다.

Description

신규한 펩티드 및 이의 의약적 용도{NOVEL PEPTIDES AND MEDICINAL USES THEREOF}

본 발명은 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 신규한 펩티드, 상기 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물 및 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 각막 장해 치료제 또는 피부 창상 치유 촉진제에 관한 것이다.

각막은 직경 약 1 cm, 두께 약 1 mm의 투명한 무혈관의 조직이다. 각막의 투명성은 시기능에 중요한 영향을 주고 있고, 각막에 있어서의 여러 가지의 생리 생화학적 현상은 주로 각막의 투명성의 유지를 목적으로서 기능하고 있다.

각막 궤양, 각막 상피 박리, 각막염 또는 안구건조증 등의 여러 가지의 질환에 의해 야기된 각막 상피 결손은 혼합 감염의 병발이 없으면 자연스럽게 회복한다. 그러나, 어떠한 이유로 회복이 지연하거나 또는 회복이 이루어지지 않고 상피 결손이 천연화하면 상피의 정상적인 구축에 악영향을 줄 뿐만 아니라, 실질이나 내피의 구조나 기능까지 해친다. 종래부터의 치료법의 원리는 외계의 자극으로부터 각막 표면을 보호함으로써 자연스럽게 상피가 신전(伸展)하여 결손부의 재피복을 도모한다고 하는 수동적인 것이다. 최근, 세포 생물학의 발전에 따라 세포의 분열·이동·접착·신전 등에 관여하는 인자가 해명되어 있고, 각막 상피 결손의 수복에는 각막 상피의 신전을 촉진하는 화합물이 중요한 역할을 담당하는 것이 보고되어 있다(임안, 46 , 738-743(1992), 안과 수술, 5 , 719-727(1992)).

그런데, 인슐린양 성장 인자는 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 형질 전환 성장 인자 등과 같이 정상 인간 세포의 성장을 조절하고 있는 성장 인자의 하나로서, 이것에는 인슐린양 성장 인자-I(이하, 「IGF-I」라 한다)과 인슐린양 성장 인자-II(이하, 「IGF-II」라 한다)가 있다. 최근, IGF-I가 갑상선 세포의 증식을 자극하는 것(J. Biol. Chem., 264 , 18485-18488(1989))이나, IGF-II가 근의 성장이나 분화를 조절하는 것(Hum. Mol. Genet., 3 , 1117-1121(1994)) 등도 보고되어 있다. 안과 영역에서도 IGF-I, IGF-II 및 이들의 기능적 유도체가 망막 뉴런의 생존을 촉진시킨다는 것(특허 공표 평7-500839호 공보), IGF-II가 각막 이식시의 손상을 비롯한 광범위한 모든 상처의 치료에 유효하다는 것(특허 공개 소63-233925호 공보), 상기한 성장 인자를 포함하는 용액을 이용함으로써 이식에 제공되는 각막 등의 안조직을 저온 상태에서도 신선한 조직 상태로 보존하는 것이 가능하다는 것(특허 공개 평5-25001호 공보, 특허 공개 평6-48901호 공보)이 개시되어 있다. 또한, 일반적으로 성장 인자를 포함하는 겔 배합물이 전안부를 비롯한 창상의 치유에 유효하다는 것도 개시되어 있다(특허 공개 평2-112호 공보).

한편, 물질 P는 혈관 확장, 평활근 수축, 타액선의 분비 촉진, 이뇨 작용 등 을 나타내는 11개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 물질 P에 관해서는 안과 영역에 있어서도 안장해에 있어서의 결막 배세포의 이상 분비의 개선이 개시되어 있거나(국제 특허 WO95/13087호 공개 공보), 각막염 등의 염증시에 있어서의 물질 P의 동태가 보고되어 있는(일본 안과 학회 잡지, 91 , 982∼987(1987), 일본 안과 학회 잡지, 92 , 448-452(1988)) 등 여러 가지의 연구가 이루어져 있다. 또한, 특허 공개 평10-17489호 공보에는 물질 P의 C말단측의 테트라펩티드인 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂(이하, 「FGLM」이라고 한다)와 IGF-I를 병용하면 각막 상피의 창상 치유를 촉진하고, 또한, FGLM이 이 작용을 발현하는 물질 P의 부분 펩티드의 최소 단위인 것이 기재되어 있다. 그러나, IGF-I는 70개정도의 아미노산이 결합한 폴리펩티드이며, IGF-I의 어느 아미노산 서열 부위가 효과 발현에 기여하고 있는지에 관해서는 전혀 밝혀져 있지 않다.

피부 창상은 열상, 찰과상, 외과적 절개, 피부 궤양, 화상 등의 표면 조직의 손상이다. 이러한 피부 창상의 치료는 상처 입은 부위에 응급 처치를 한 후, 생체 자신의 회복력에 의해서 자연스럽게 치유하는 것을 기다리는 것이 일반이지만, 이러한 자연 치유로서는 회복까지 장기간이 필요하고, 또한, 통증도 계속되므로 상처 입은 부위에 창상 치료제를 투여하는 등 적극적으로 창상 치유를 촉진시키는 것이 바람직하다.

창상의 치유 과정에서는 세포의 이동이나 증식에 의해 새로운 상피 조직이나 결합 조직이 형성되기 때문에 창상 치유에 관여하는 세포의 이동·분화·증식을 촉진 또는 자극하는 약제가 창상 치료제가 될 수 있다. 이러한 창상 치료제로서 염화 리조팀, 솔코세린 등이 알려져 있다.

그러나, 기존의 창상 치료제는 창상 치유의 촉진 작용이 충분하지 않고, 단기간에 창상을 완치할 수 없다고 하는 문제점이 있다. 이들 창상 치료제로는 창상의 치유 과정에서 중요한 요소가 되는 표피의 재피복, 콜라겐의 합성, 말초 순환의 개선, 육아 형성, 혈관 신생 등에의 기여가 작은 것에 원인이 있다고 생각되고 있다.

그런데, IGF-I의 최소 활성 발현 단위에 관한 보고는 없고, Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 그 자체에 관한 보고도 없다. 또, Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 병용한 각막 장해에 대한 작용이나 피부 질환에 대한 작용도 보고되어 있지 않다.

일반적으로 수많은 아미노산으로 이루어지는 펩티드는 생체내에 투여하면 대사 등에 의해 펩티드 결합이 절단되기 쉽고, 또한 의약으로서 이용하기 위해서 제제화하는 단계에서 분해 등을 일으키기 쉽다. 그래서, 펩티드쇄는 될 수 있는 한 짧게 하는 것이 바람직하나, 약리 활성은 유지되어야 하기 때문에 장쇄 펩티드의 최소 활성 발현 단위를 찾아내는 것은 의약품 개발에 있어서의 중요한 과제이다. IGF-I는 70개나 되는 아미노산으로 이루어지는 장쇄 펩티드이며, 그 IGF-I의 최소 활성 발현 단위를 찾아내는 것은 보다 유용한 의약품을 창제하는 데에 있어서 매우 중요한 과제이다. 또한, 그 최소 활성 발현 단위를 이용하여 구체적인 약리 작용, 즉 각막 장해에 대한 작용이나 피부 창상에 대한 작용에 관해서 연구하는 것은 매 우 흥미 있는 과제이다.

발명의 개시

본 발명자들은 IGF-I의 여러 가지의 부분 펩티드를 합성하고, 그 부분 펩티드와 물질 P 또는 FGLM을 병용한 각막 상피 신전에 관한 약리 시험을 실시함으로써 IGF-I의 최소 활성 발현 단위가 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열(이하, 「SSSR」이라 한다)인 것을 발견했다. 또한, SSSR로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 펩티드와 물질 P 또는 FGLM을 병용하면 각막의 장해 치유 및 피부의 창상 치유를 촉진하는 것을 발견했다. 즉, (1) Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류와 (2) Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류를 함유하는 조성물은 여러 가지의 요인에 의해 각막이 손상을 받은 상태에 있는 각막 궤양, 각막 상피 박리, 각막염 또는 안구건조증 등의 각막 장해의 치료제 또는 열상, 찰과상, 외과적 절개, 피부 궤양, 화상 등의 피부 창상이나 그것에 기인하는 괴저 등의 질환에 대한 치료제로서 유용한 것이 발견되었다. 또. 본 발명의 각막 장해 치료제 및 피부 창상 치유 촉진제에는 이미 창상 치유 효과가 확인되어 있는 아스코르빈산, 아스코르빈산에스테르, 아스크로빈산의 염, 판토텐산, 판토텐산의 염 등을 배합하여 사용할 수 있다.

IGF-I는 A, B, C 및 D의 각 도메인으로 구성되나, A 도메인 및 B 도메인은 인슐린이나 IGF-II와 유사한 구조를 갖기 때문에 본 발명자들은 IGF-I의 C 도메인 및 D 도메인에 주목하여 각막 상피 신전 작용을 검토했다. 그리고, C 도메인을 구성하는 펩티드 또는 D 도메인을 구성하는 펩티드와 물질 P를 병용하여 각막 상피 신전 시험을 실시한 바, C 도메인을 구성하는 펩티드인 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(이하, 「GYGSSSRRAPQT」라고 한다)에 활성이 확인되었다. 다음에, GYGSSSRRAPQT의 양말단에서 2아미노산을 제거하더라도 활성이 유지되었기 때문에 알라닌 스캐닝 수법을 이용하여 Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro(이하, 「GSSSRRAP」라고 한다)의 아미노산을 순차 알라닌으로 변환한 것을 합성하여 물질 P 또는 FGLM과의 공존하에서 각막 상피 신전 시험을 실시한 바, SSSR로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 펩티드는 전부 활성을 발현했기 때문에 SSSR가 각막 상피 신전 작용을 발현하는 데 필수적이고 최소의 IGF-I의 부분 펩티드인 것이 판명되었다.

본 발명자들은 주로 하기의 4개의 발명을 완성하였다.

제1 발명은 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 신규 펩티드 또는 이의 유도체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류에 관한 발명이다.

이 제1 발명의 특징은 IGF-I의 최소 활성 발현 단위인 신규 펩티드, 즉 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 신규 펩티드를 발견한 것에 있다. 따라서, Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유도체(이하, 해당 펩티드와 그 유도체를 「SSSR 유도체」라고 총칭한다)란 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 신규인 펩티드이면 특별히 제한되는 것은 아니다. 해당 펩티드의 유도체란 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 펩티드에 활성 발현에 영향을 주지 않는 1개 또는 복수의 아미노산이 결합한 것, N 말단이 아실기 등의 펩티드에 범용되는 보호기로 보호되어 있는 것, C 말단이 에스테르, 아미드 등의 펩티드에 범용되는 보호기로 보호되어 있는 것 등을 의미하고, 또한, Ser 잔기의 히드록시기가 범용되는 보호기로 보호된 것이나, Arg 잔기의 아미노기가 범용되는 보호기로 보호된 것도 포함한다. 보다 구체적으로 나타내면 SSSR 유도체로서는 예컨대 SSSR, GSSSRRAP을 비롯하여, Ser-Ser-Ser-Arg-Arg(이하, 「SSSRR」이라고 약기한다), Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(이하, 「GSSSR」이라고 약기한다), Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg(이하, 「GSSSRR」이라고 약기한다), Ala-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro(이하, 「ASSSRRAP」라고 약기한다), Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Ala-Ala-Pro(이하, 「GSSSRAAP」라고 약기한다), Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Ala-Ala-Ala-Pro(이하, 「GSSSRAAAP」라고 약기한다). 등을 들 수 있다. 이들 펩티드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하지만, 이들은 전부 본 발명에 포함된다. 약리 시험의 항으로 구체적으로 표시되고 있는 바와 같이 펩티드쇄 중에 SSSR로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 있는 SSSR 유도체는 전부 물질 P 또는 FGLM과의 병용에 의해 각막 상피 신전 효과 및 피부 창상 치유 촉진 효과를 발현한다.

본 발명의 SSSR 유도체는 펩티드 자동 합성기를 이용하여 공지된 방법으로 제조할 수 있고, 그 상세한 것은 실시예에서 기술한다.

제2 발명은 아미노산 서열이 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 신규 펩티드 또는 이의 유도체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류를 유효 성분으로서 함유하고, 의약으로서 허용되는 첨가물을 배합하여 이루어지는 의약 조성물에 관한 발명이다.

제3 발명은,

(1) Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류 및

(2) Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류를 유효 성분으로서 함유하는 각막 장해 치료제에 관한 발명이다.

제4 발명은 상기 성분(1)과 상기 성분(2)을 유효 성분으로서 함유하는 피부 창상 치유 촉진제에 관한 발명이다.

제3 및 제4 발명의 특징은 최소 활성 발현 단위가 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 펩티드와, 최소 활성 발현 단위가 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 펩티드를 병용함으로써 우수한 각막 상피 신전 효과 및 피부 창상 치유 촉진 효과가 발현하는 것을 발견한 것에 있다.

제3 및 제4 발명에 있어서, Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유사체(이하, 해당 펩티드와 그 유사체를 「SSSR 유사체」라고 총칭한다)란 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이면 특별히 제한되는 것은 아니다. 해당 펩티드의 유사체란 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 펩티드에 그 활성 발현에 영향을 미치지 않는 1개 또는 복수의 아미노산이 결합한 것, N 말단이 아실기 등의 펩티드에 범용되는 보호기로 보호되어 있는 것, C 말단이 에스테르, 아미드 등의 펩티드에 범용되는 보호기로 보호되어 있는 것 등을 의미하고, 또한, Ser 잔기의 히드록시기가 범용되는 보호기로 보호된 것이나, Arg 잔기의 아미노기가 범용되는 보호기로 보호된 것도 포함한다. 보다 구체적으로 나타내면 SSSR 유사체로서, 예컨대 전술한 SSSR 유도체 외, GYGSSSRRAPQT 등을 들 수 있다. SSSR 유사체의 펩티드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하지만, 이들은 전부 본 발명에 포함된다. 보다 바람직한 형태는 전부 L-체의 아미노산으로 이루어지는 펩티드이다.

또한, Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 유사체(이하, 해당 펩티드와 그 유사체를 「FGLM 유사체」라 총칭한다)란 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이면 특별히 제한되는 것은 아니다. 해당 펩티드의 유사체와 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂로 표시되는 펩티드에 그 활성 발현에 영향을 미치지 않는 1개 또는 복수의 아미노산이 결합한 것이나, N 말단이 아실기 등의 펩티드에 범용되는 보호기로 보호되어 있는 것을 의미한다. 보다 구체적으로 나타내면 FGLM 유사체로서는, 예컨대 물질 P, FGLM을 비롯하여 미국 특허 3862114호에 구체적으로 개시되어 있는 4∼12개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드인 Tyr-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂, Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂, Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂, Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂, Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂, Tyr-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂, Gly-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ 등을 들 수 있다. 보다 바람직한 예로서는 물질 P, FGLM이 있다. 이들을 구성하는 아미노산에도 L-체, D-체, DL-체가 존재하지만, 이들은 전부 본 발명에 포함된다. 본 발명에 있어서의 보다 바람직한 형태는 전부 L-체의 아미노산으로 이루어지는 펩티드이다.

본 발명에 있어서 의약으로서 허용되는 염류로서는, 예컨대 염산염, 황산염, 인산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 SSSR 유사체와 FGLM 유사체의 병용은 각막 상피의 신전 및 피부의 창상 치유를 촉진하는 작용을 발현한다. 이들의 작용을 발현하는 SSSR 유사체의 종류 및 FGLM 유사체의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 보다 바람직한 실시의 형태로서는 IGF-I의 최소 활성 발현 단위인 SSSR와 물질 P의 최소 활성 발현 단위인 FGLM 을 조합시켜 사용하는 것을 들 수 있다.

본 발명의 각막 장해 치료제 및 피부 창상 치유 촉진제는 범용되어 있는 기술을 이용하여 조제할 수 있고, SSSR 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류와, FGLM 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류를 각각의 단독 제제로서 또는 배합 제제로서, 비경구 투여 또는 경구 투여할 수 있으나 비경구 투여가 보다 바람직하다.

각막 장해 치료제의 바람직한 투여 제형으로서는 점안제, 안연고 등을 들 수 있다. 이들은 범용되어 있는 기술을 이용하여 조제할 수 있다. 예컨대, 점안제는 염화나트륨 등의 등장화제, 인산나트륨 등의 완충화제, 염화벤잘코늄 등의 방부제 등을 이용하여 조제할 수 있다. pH는 안과 제제에 허용되는 범위내에 있으면 좋지 만, 4∼8의 범위가 바람직하다.

각막 장해 치료제로서의 투여량은 증상, 연령, 제형 등에 의해서 적절하게 선택할 수 있지만, 점안제이면 SSSR 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류의 량은 0.001∼10%(w/v), 바람직하게는 0.01∼1%(w/v)의 것을 1일 1∼수회 점안하면 좋다. 또한, FGLM 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류의 량은 0.00001∼0.1%(w/v), 바람직하게는 0.0001∼0.01%(W/v)의 것을 하루 1∼수회 점안하면 좋다.

물론, 상기한 양성분을 동시에 배합하여 점안제 등의 제제로 할 수 있다. 또한, 피부 창상 치유 촉진제의 바람직한 제제 형태로서는 연고제, 젤리제, 팹(pap)제, 첩부제, 로션제, 크림제, 스프레이제, 에어졸제, 경고제, 현탁제, 유제 등을 예시할 수 있고, 또한, 적당한 용제를 선정하여 액제를 조제할 수도 있다. 또한, 피부 창상 치유 촉진제를 조제하기 위해서 그 제형태에 따라서 충전제, 부형제, 기제, 증량제, pH 조정제, 가용화제, 현탁화제, 완충제, 안정화제, 보존제, 계면활성제, 항산화제, 분산제, 유화제, 용해제, 용해보조제 등을 첨가할 수 있다.

상기 제제용의 담체로서는 예컨대, 백색바셀린, 유동파라핀, 겔화탄화수소, 세틸알코올, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콘스타치, 알긴산나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 친수성 플라스티베이스, 젤라틴, 덱스트린, 세틸알코올, 스테아릴알콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 메톡시에틸렌-무수말레산공중합체, 폴리비닐에테르, 비닐피롤리돈을 구성 성분으로 하는 중합체·공중합체, 스테아린산나트륨, 스테아린산마그네슘, 염화벤잘코늄, 올리 브오일, 동백유, 콩유 등의 유지류, 젖당, 물 등을 들 수 있다.

본 발명의 피부 창상 치유 촉진제는 창상 부위나 창상의 정도에 따라서 각종의 형태로 투여할 수 있다. 예컨대 외용제로서 사용하는 경우는 본제를 피부 등의 소요 부위(환부)에 직접 도포, 분무 또는 첨부하는 것이 바람직하다.

본 발명의 피부 창상 치유 촉진제의 투여량은 증상, 연령, 제형 등을 고려하고 적절하게 선택할 수 있다. SSSR 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류의 투여량은 통상 하루당 0.001∼1000 mg, 바람직하게는 0.01∼500 mg으로, 1회 또는 수회에 나눠 투여한다. 또한, FGLM 유사체 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류의 투여량은 통상 하루당 0.01∼5000 mg, 바람직하게는 O.1∼1000 mg으로, 1회 또는 수회에 나눠 투여한다.

물론, 상기한 양성분을 동시에 배합하여 연고 등의 제제로 할 수 있다.

이하에, 제조예, 제제예 및 약리 시험의 결과를 나타내지만, 이들의 예는 본 발명을 보다 잘 이해하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

[제조예]

본 발명에 이용되는 SSSR 유사체의 대표적인 제조예를 이하에 나타낸다.

1. SSSR의 제조

펩티드 자동 합성기 430 A(Applied Biosystems 제조)를 이용하여, 기설 소프트에 따라 제3부틸옥시카르보닐(BOC)법에 의해 보호 펩티드 수지를 합성했다. 출발 원료로서 4-(옥시메틸)페닐아세트아미드메틸[Boc-Arg(Tos)PAM 수지 담체(0.5 mmol 스케일)을 사용했다. 본 합성법에서는 Na-아미노 보호기인 Boc기의 제거에는 30% 트리플루오로초산(TFA)/디클로로메탄, 70% TFA/디클로로메탄을 사용하고, 그 세정에는 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)/디클로로메탄을 이용했다. 축합제인 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)과 N-보호 아미노산의 Boc-Ser(OBzl) 유도체는 각각 아미노기에 대하여 4당량 이용하고, 반응 용매로서 디메틸설폭시드(DMSO)-NMP(8:2)를 사용했다. 축합 반응 종료후, 잔존하는 아미노기를 완전히 막는 조작으로서 무수 아세트산/N,N-디이스프로필에틸아민(DIEA)으로 결함 펩티드의 생성을 막았다. Boc기의 제거와, Boc-Ser(OBzl)의 축합을 반복하여 최종 보호 펩티드의 구축을 행했다. 얻어진 보호 펩티드 수지로부터의 펩티드의 추출과 모든 보호기의 이탈은 무수불화수소(HF) 처리(HF:p-크레졸, 8:2(V/V), -2∼-5℃, 60분)에 의해서 행했다. 반응후, HF를 유거하고, 0.1% 트리플루오로아세트산수로 펩티드를 추출하여, 조생성물을 동결 건조 분말로서 얻은 후, 분취 정제에 제공했다. 분취 정제는 시마즈 제작소 제조 HPLC LC8A(컬럼:YMC 제조 ODS 30 X 240 mm)를 사용하고, 아세토니트릴/수계(O.1% TFA 함유)로 0.5-2%의 그레디언트(gradient)(80분)로 행했다. 얻어진 목적물의 고순도 화분을 모아 아세토니트릴 유거후, 동결 건조하여 표적 화합물의 TFA염 70 mg(수율32%)을 얻었다.

아미노산 분석(가수분해 조건: 6N HCl, 110℃, 22시간)

Ser(3) 2.74, Arg(1) 1.00

HPLC 분석[칼럼: YMC Pak ODS-A(4.6 mml. D.×150 mm), 용리제:1-60% CH₃CN/5 mM CF₃CF₂COOH(25 분), 온도: 25℃, 유속: 1.0 ml/분, 검출기: 220 nm]

순도(HPLC): 98.5%

질량분석(ESI-MS)

MH⁺=436.2(Theor.=436.2, mono isotopic)

2. SSSR 유사체의 제조

SSSR와 같은 조작을 하여, GSSSR, SSSRR, GSSSRR, GSSSRRAP, ASSSRRAP, GSSSRAAP, GSSSRAAAP를 제조했다. 이하에 대표적인 펩티드에 관한 물질을 나타낸다.

(1) GSSSR

아미노산 분석(가수분해 조건: 6N HCl, 110℃, 22시간)

Ser(3) 2.76, Gly(1) 1.00, Arg(1) 1.00

HPLC 분석[칼럼:YHC Pak ODS-A(4.61 mml. D.×150 mm), 용리제: 1-60% CH₃CN/5 mM CF₃CF₂COOH(25 분), 온도: 25℃, 유속: 1.0 ml/분, 검출기: 220 nm]

순도(HPLC): 98.5%

질량분석(ESI-MS)

MW=492.3(Theor.=492.5)

(2) SSSRR

아미노산 분석(가수분해 조건: 6N HCl, 110℃, 22시간)

Ser(3) 2.76, Arg(2) 2.00

HPLC 분석[칼럼:YHC Pak ODS-A(4.0 mml. D.×150 mm), 용리제: 1-60% CH₃CN/0.1% CF₃COOH(25 분), 온도: 2℃, 유속: 1.0 ml/분, 검출기: 220 nm]

순도(HPLC): 99.7%

질량분석(ESI-MS)

MW=591.5(Theor.=591.0)

(3) GSSSRR

아미노산 분석(가수분해 조건: 6N HCl, 110℃, 22시간)

Ser(3) 2.73, Gly(1) 0.98, Arg(2) 2.00

HPLC 분석[칼럼:YHC Pak ODS-A(4.6 mml. D.×150 mm), 용리제: 1-60% CH₃CN/0.1% CF₃COOH(25 분), 온도: 25℃, 유속: 1.0 ml/mim, 검출기: 220 nm]

순도(HPLC): 99.3%

질량분석(ESI-MS)

MW=648.5(Theor.=648.7)

(4) GSSSRRAP

아미노산 분석(가수분해 조건: 6N HCl, 110℃, 22시간)

Ser(3) 2.68, Gly(1) 0.99, Ala(1) 1.01, Arg(2) 2.00

HPLC 분석[칼럼:YMC Pak ODS-A(4.6 mnl.D.×150 mm), 용리제: 1-60% CH₃CN/0.1% CF₃COOH(25 분), 온도: 25℃, 유속: 1.0 ml/분, 검출기: 220 nm]

순도(HPLC):98.6%

질량분석(ESI-MS)

MW=816.7(Theor.=816.9)

[제제예]

본 발명에 이용되는 대표적인 제제예를 이하에 나타낸다.

1. 점안제

이하 처방의 점안제를 범용되는 방법을 이용하여 조제했다.

처방예 1

100 ml 중

SSSR 1 mg

염화나트륨 900 mg

수산화나트륨 적당량

염산 적당량

멸균 정제수 적당량

처방예 1과 같이 하여 SSSR를 100 ml 중에 0.01 mg, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.5 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg 함유하는 점안액을 조제할 수 있다.

처방예 2

100 ml 중

GSSSR 1 mg

FGLM 100 mg

염화나트륨 900 mg

수산화나트륨 적당량

염산 적당량

멸균 정제수 적당량

처방예 2와 같이 하여 FGLM을 100 ml 중에 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50mg, 500 mg, 1000 mg 함유하는 점안액을 조제할 수 있다.

처방예 3

100 ml 중

SSSR 1 mg

FGLM 100 mg

염화나트륨 900 mg

수산화나트륨 적당량

염산 적당량

멸균 정제수 적당량

처방예 3과 같이 하여 SSSR를 0.01 mg, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 및 FGLM을 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 500 mg, 1000 mg 임의로 조합한 점안액을 조제할 수 있다.

2. 연고제

처방예 4

100 g 중

SSSR 10 mg

FGLM 100 mg

유동파라핀 10 g

백색바셀린 적당량

SSSR의 첨가량 및 FGLM의 첨가량을 적절하게 바꾸는 것에 의해 여러 가지 농도의 연고를 조제할 수 있다,

처방예 5

100 g 중

GSSSR 1 mg

물질 P 100 mg

유동파라핀 10 g

백색바셀린 적당량

처방예 5와 같이 하여 GSSSR의 첨가량 및 물질 P의 첨가량을 적절하게 바꾸는 것에 의해 여러 가지 농도의 연고를 조제할 수 있다.

처방예 6

100 g 중

SSSRR 5 mg

FGLM 100 mg

유동파라핀 10 g

백색바셀린 적당량

SSSRR의 첨가량 및 FGLM의 첨가량을 적절하게 바꾸는 것에 의해 여러 가지 농도의 연고를 조제할 수 있다.

처방예 7

100 g 중

GSSSRR 50 mg

물질 P 10 mg

아스코르빈산 3 mg

유동파라핀 10 g

친수성 플라스티베이스 적당량

GSSSRR의 첨가량 및 물질 P의 첨가량을 적절하게 바꾸는 것에 의해 여러 가지 농도의 연고를 조제할 수 있다.

[약리 시험]

(1) 각막 상피 신전에 대한 작용(시험관내)

웅성 일본 백색 토끼의 각막을 이용하여 Nishida 연구진의 방법(J. Cell Biol.. 97 , 165-1657(1983))에 준하여, 각막편의 조직 배양계에서의 각막 상피 신전 길이를 지표로 하여 각복 상피 신전에 대한 영향을 검토했다.

(실험 방법)

토끼 각막편으로부터 추출한 각막 블록(1군 6개)을 피험 화합물을 포함하는 배양액(TC-199) 중, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 24시간 배양했다. 배양후, 각막 블록을 에탄올-빙초산(용적비 95:5) 혼합액속에서 고정하고, 파라핀으로 포매하여 세그먼트를 제작했다. 세그먼트를 탈파라핀한 후, 헤마토크실린-에오신 염색하여, 현미경하에서 상피 세포층의 신전 길이를 측정했다.

대조군으로서는 피험 화합물을 포함하지 않는 배양액으로 마찬가지로 배양한 것을 이용했다.

(피험 화합물)

실험에 이용한 펩티드의 대표예를 표 1에 나타낸다.

(결과)

실험 결과를 표 1에 나타낸다. 또, 표 중의 신전율은 대조군의 신전 길이를 기준(100 %)으로 하여 산출한 각 6예의 평균값이다.

피험 약물	신전율(%)
대조군	100
SSSR (1nM) GSSSR (1nM) SSSRR (1nM) GSSSRR (1nM) GSSSRRAP (1nM) GSSSRAAAP (1nM) GYGSSSRRAPQT (1nM) 물질 P (20 μM) FGLM (20 μM)	101 101 98 94 97 100 104 94 99
SSSR (1 nM) + 물질 P (20 μM) GSSSR (1nM) + 물질 P (20 μM) SSSRR (1nM) + 물질 P (20 μM) GSSSRR (1nM) + 물질 P (20 μM) GSSSRRAP (1nM) + 물질 P (20 μM) ASSSRRAP (1nM) + 물질 P (20 μM) GSSSRAAP (1nM) + 물질 P (20 μM) GSSSRAAAP (1nM) + 물질 P (20 μM) GYGSSSRRAPQT (1nM) + 물질 P (20 μM) SSSR (1nM) + FGLM (20 μM)	138 135 136 142 140 134 150 139 134 145

표 1에 나타낸 바와 같이, SSSR 유사체 단독, 물질 P 단독 및 FGLM 단독으로는 각막 상피의 신전에 대한 영향은 확인되지 않았지만, SSSR 유사체와 물질 P(또 는 FGLM)의 양방을 포함하는 배양액으로 배양을 하면 각막 상피의 현저한 신전 촉진이 확인되었다.

(2) 피부 창상 치유에 대한 작용

피부 창상 치유 효과는 이하에 나타내는 방법으로 시험할 수 있다.

래트를 디에틸에테르 흡입으로 마취시켜 배부의 체모를 이발기로 체모하고, 탈모용 크림으로 제모한다. 24시간 후에 5 mm지름의 피부 생검용 트레반을 이용하여 배부 피부에 표피·진피의 전층성의 창상을 등간격으로 5개소 작성하고, 지혈의 확인후에 SSSR를 함유하는 연고, FGLM을 함유하는 연고 및 SSSR와 FGLM을 함유하는 연고를 각각 1일 1회 도포한다. 각 연고 도포전에 래트의 배부 창상을 사진 촬영하여 그 면적을 측정한다. SSSR를 함유하는 연고, FGLM을 함유하는 연고 및 SSSR와 FGLM을 함유하는 연고를 도포한 후의 각 창상 면적을 비교함으로써 피부 창상 치유 효과를 검토할 수 있다.

약리 시험의 결과로부터 IGF-I의 최소 활성 발현 단위인 Ser-Ser-Ser-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 SSSR 유사체와 Phe-Gly-Leu-Het-NH₂로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 FGLM 유사체를 병용하면 각막 상피의 신전 및 피부의 창상 치유를 현저히 촉진한다. 따라서, SSSR 유사체와 FGLM 유사체를 조합하여 투여하면 이들 약제가 상승적으로 작용하여 각막 궤양, 각막 상피 박리, 각막염, 안구건조증 등의 각막 장해의 치료제 또는 열상, 찰과상, 외과적 절개, 피부 궤양, 화상 등의 피부 창상이나 그것에 기인하는 괴저 등의 질환의 치유제로서의 효과를 발 휘한다.

Claims

아미노산 배열이 Ser-Ser-Ser-Arg인 펩티드 또는 이의 의약으로서 허용되는 염류.
아미노산 배열이 Ser-Ser-Ser-Arg인 펩티드 또는 이의 의약으로서 허용되는 염류를 필수 성분으로서 포함하고, 의약으로서 허용되는 첨가물을 배합하여 이루어지는 각막 장해 치료제 또는 피부 창상 치유 촉진제.
1) 아미노산 배열이 Ser-Ser-Ser-Arg인 펩티드 또는 이의 의약으로서 허용되는 염류, 및

2) 아미노산 배열이 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂인 펩티드 또는 물질 P 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류

를 포함하는 각막 장해 치료제.
제2항 또는 제3항에 있어서, 각막 장해가 각막 궤양, 각막 상피 박리, 각막염 또는 안구건조증인 각막 장해 치료제.
제4항에 있어서, 제형이 점안제인 각막 장해 치료제.
1) 아미노산 배열이 Ser-Ser-Ser-Arg인 펩티드 또는 이의 의약으로서 허용되는 염류, 및

2) 아미노산 배열이 Phe-Gly-Leu-Met-NH₂인 펩티드 또는 물질 P 또는 이들의 의약으로서 허용되는 염류

를 포함하는 피부 창상 치유 촉진제.
제6항에 있어서, 피부 창상이 열상, 찰과상, 외과적 절개, 피부 궤양 또는 화상인 피부 창상 치유 촉진제.
제7항에 있어서, 제형이 연고제 또는 첩부제인 피부 창상 치유 촉진제.
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