PT1462455E

PT1462455E - Péptido ser-ser-ser-arg e suas utilizações medicinais

Info

Publication number: PT1462455E
Application number: PT2786015T
Authority: PT
Inventors: Teruo Nishida; M Nakamura; Makoto Inui
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd; Teruo Nishida
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2013-07-09
Also published as: US7795222B2; WO2003048192A1; EP2172474B1; KR20100002291A; US20050009752A1; CN1263770C; EP1462455A4; SI1462455T1; EP2172474A1; KR100967152B1; EP1462455A1; KR20050044630A; US8183343B2; JP4310588B2; ES2422081T3; AU2002354188A1; CY1114330T1; JP2008163044A; EP1462455B1; CN1599748A

Description

DESCRIÇÃO "PÉPTIDO SER-SER-SER-ARG E SUAS UTILIZAÇÕES MEDICINAIS"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um novo péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg e a um agente terapêutico de doenças da córnea ou um agente promotor da cicatrização de feridas da pele, que compreende um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg e um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2, como os ingredientes activos.

Antecedentes da Invenção A Córnea é um tecido transparente, não vascular, com um diâmetro de cerca de 1 cm e uma espessura de cerca de 1 mm. A transparência da córnea afecta a função de visão. Vários fenómenos fisiológicos e bioquímicos na córnea trabalham de modo funcional, principalmente com a finalidade de manter a transparência da córnea.

Os defeitos epiteliais da córnea, provocados por várias doenças, tais como a úlcera da córnea, erosão da córnea, queratite e olho seco, são espontaneamente reparados a menos que esteja associada uma infecção mista. Quando a reparação é 1 atrasada ou não completada, ou o defeito epitelial é prolongado por alguma razão, no entanto, não apenas a construção normal do epitélio da córnea é muito afectado, como também ainda as construções e funções do estroma da córnea e endotélio são danificados. 0 principio dos métodos terapêuticos, de acordo com a técnica convencional, é passivo. Isto é, os métodos terapêuticos incluem a protecção da superfície da córnea da estimulação externa, de modo a que a extensão espontânea do epitélio da córnea volte a emergir na área defeituosa. Seguindo o desenvolvimento da biologia celular, nos últimos anos, os factores envolvidos na proliferação, migração, adesão, extensão e semelhantes, têm sido elucidados. Foi relatado que os compostos que promovem a extensão do epitélio da córnea desempenham um papel importante na reparação de defeitos epiteliais da córnea (Japanese Journal of Clinicai Ophthalmology, 46, 738-743 (1992); Japanese Journal of Ophthalmology Surgery, 5, 719-727 (1992)).

Enquanto isso, o factor de crescimento do tipo insulina é um dos factores de crescimento que regulam o crescimento de células humanas normais, como factores de crescimento epidérmico, factores de crescimento de fibroblastos, factores de crescimento derivados de plaquetas e factores de crescimento transformantes e inclui o factor de crescimento I do tipo insulina (referido a seguir como "IGF-I") e factor de crescimento II do tipo insulina (referido a seguir como "IGF-II"). Recentemente, por exemplo, foi relatado que o IGF-I estimula a proliferação de células da tiróide (J. Biol. Chem., 264, 18485-18488 (1989)) e que o IGF-II regula o crescimento e diferenciação muscular (Hum. Mol. Genet., 3, 1117-1121 (1994)). No campo da oftalmologia, foi divulgado que o IGF-I, IGF-II e seus derivados funcionais promovem a sobrevivência dos neurónios 2 da retina (a publicação da Publicação da Patente Japonesa (Tokuhyo) 7-500839); que o IGF-II é muito eficaz para o tratamento de todos os tipos de feridas, incluindo principalmente lesões efectuadas durante a queratoplastia (a publicação do documento JP-A-63-233925); e que uma solução contendo os factores de crescimento pode ser utilizada para manter tecidos oculares, tal como a córnea, a ser utilizada para a queratoplastia no seu estado fresco, mesmo numa circunstância a uma temperatura baixa (as publicações dos documentos JP-A-5-25001 e JP-A-6-48901). Além disso, é feita outra divulgação sobre uma composição de gel contendo um factor de crescimento que a composição do gel é, geralmente, eficaz para a cicatrização de feridas de, por exemplo, o segmento anterior do olho (a publicação do documento JP-A-2-112).

Por outro lado, a substância P é um polipéptido que consiste em 11 aminoácidos e tem acções, tal como vasodilatação, contracção do músculo liso, promoção da secreção da glândula salivar e diurese. No campo da oftalmologia, divulga-se que a substância P pode melhorar a secreção anómala de células caliciformes da conjuntiva (a publicação da Publicação Internacional WO95/13087), ao passo que a cinética da substância P, no caso de inflamação, tal como a queratite, também é relatada (Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 91, 982-987 (1987); Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 92, 448-452 (1988); e semelhantes) . Como descrito acima, têm sido realizados vários estudos. Além disso, a publicação do documento JP-A-10-17489 descreve que o tetrapéptido Fen-Gly-Leu-Met-NH2 (referido a seguir como "FGLM") no terminal C da substância P, quando utilizado em combinação com IGF-I, pode promover a cicatrização da ferida do epitélio da córnea e que a FGLM é a unidade mínima entre os péptidos parciais com tal acção da substância P. No 3 entanto, ainda nunca foi identificado que local na sequência de aminoácidos de IGF-1 é responsável pela expressão do efeito, embora o IGF-1 seja um polipéptido que consiste em tantos aminoácidos como 70.

As feridas da pele são as dos tecidos de superfície, incluindo uma ruptura, uma abrasão, uma incisão cirúrgica, uma úlcera na pele ou uma queimadura. Tais feridas na pele são tratadas através da aplicação de um tratamento de emergência a um local ferido e esperar que as feridas cicatrizem espontaneamente através do poder de recuperação biológico próprio. Tal cicatrização espontânea exige um longo tempo até à recuperação e a dor continua durante esse tempo. Portanto, é preferido que a cicatrização da ferida seja promovida activamente, através da administração de um agente para a cicatrização de feridas para locais feridos.

Como os novos tecidos epiteliais e tecidos conjuntivos são formados através da migração celular e crescimento no decurso da cicatrização de feridas, um promotor de agente farmacêutico ou estimulação da migração de células, diferenciação e participação do crescimento na cicatrização de feridas é, possivelmente, um agente para a cicatrização de feridas. Como tal agente para a cicatrização de feridas, por exemplo, o cloreto de lisozima e solcoseril têm sido conhecidos.

Contudo, os agentes existentes para a cicatrização de feridas não tem acções suficientes para promover a cicatrização de feridas porque são problemáticos na medida em que não podem cicatrizar completamente feridas num curto período de tempo.

Considera-se que a causa é devido à baixa contribuição desses agentes para a cicatrização de feridas, por exemplo, o 4 re-surgimento de epiderme, síntese de colagénio, a melhoria da circulação periférica, granulação e angiogénese, que são elementos importantes no curso da cicatrização das feridas. Não há relatos sobre a unidade mínima para exibir a actividade em IGF-I e não existe nenhum relato sobre o péptido per se da sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg. Além disso, não existe qualquer relato sobre a acção de uma administração conjunta de um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg e um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2 para distúrbios da córnea ou a sua acção para as doenças de pele.

Geralmente, os péptidos consistindo em vários aminoácidos, quando administrados em organismos biológicos, estão aptos a serem cortados, devido ao metabolismo e semelhantes. Além disso, numa fase da sua formulação para utilização como agentes farmacêuticos, os péptidos são capazes de ser decompostos. É desejado que um péptido deva ter uma cadeia tão curta quanto possível. Porque a sua actividade farmacológica deve ser mantida, no entanto, é um assunto importante para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos encontrar a unidade mínima para a exibição da actividade de um péptido de cadeia longa. 0 IGF-I é um péptido de cadeia longa consistindo em tantos amino ácidos como 70. É um assunto muito importante para a preparação de um produto farmacêutico mais útil para encontrar a unidade mínima para a exibição da atividade de IGF-I. Ainda além disso, é um assunto muito interessante para fazer estudos sobre acções farmacológicas específicas, nomeadamente a acção sobre as doenças da córnea e a acção em feridas de pele, utilizando a unidade mínima para a exibição da atividade. 5

Divulgação da Invenção

As presentes requerentes verificaram que a unidade minima para a exibição da actividade de IGF-I foi a sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg (referida a seguir como "SSSR"), através da síntese de vários péptidos parciais de IGF-I e a realização de um teste farmacológico sobre a extensão do epitélio da córnea, a administração da substância P ou FGLM em combinação com os péptidos parciais. As requerentes também verificaram que a administração conjunta de um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por SSSR e substância P ou FGLM, poderia promover a cura de doenças da córnea e cicatrização de feridas da pele. Especificamente, as requerentes verificaram que uma composição contendo (1) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e (2) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, era útil como um agente terapêutico para distúrbios da córnea, tais como úlcera da córnea, erosão da córnea, queratite ou olho seco, quando a córnea está num estado danificado devido a vários factores, como um agente de cicatrização de feridas da pele, tais como a ruptura, uma abrasão, uma incisão cirúrgica, uma úlcera da pele ou uma queimadura e gangrena causada por estas. Aqui, o agente terapêutico para distúrbios da córnea e o agente promotor da cicatrização de feridas da pele, de acordo com a invenção, pode ser utilizado em mistura com ácido ascórbico, ésteres de ácido ascórbico, sais de ácido ascórbico, ácido pantoténico e seus sais de ácido pantoténico e semelhantes, com a sua acção de cicatrização de feridas já conhecida. 6 0 IGF-I é composto de domínios individuais, A, B, C e D. Os domínios A e B têm uma estrutura semelhante às da insulina e do IGF-II. Com a atenção focada nos domínios C e D de IGF-I, portanto, as requerentes avaliaram a acção da extensão do epitélio da córnea. Em seguida, as requerentes realizaram um ensaio de extensão do epitélio da córnea, utilizando o péptido compondo o domínio C ou o péptido compondo o domínio D, em combinação com a substância P. As requerentes verificaram que o péptido compondo o domínio C, nomeadamente o Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (referido a seguir como "GYGSSSRRAPQT"), tinha actividade. Mesmo depois de dois aminoácidos terem sido removidos das duas extremidades de GYGSSSRRAPQT, respectivamente, a actividade manteve-se. Assim, os aminoácidos de Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro (aqui referidos adiante como "GSSSRRAP"), foram sequencialmente substituídos com alanina, utilizando a abordagem de varrimento de alanina, para sintetizar sequências de aminoácidos substituídas com alanina. Na presença da substância P ou FGLM com as sequências de aminoácidos substituídas com alanina, foi depois efectuado um teste de extensão do epitélio da córnea. Porque todos os péptidos contendo a sequência de aminoácidos representada por SSSR exibiram actividade, verificou-se que o SSSR era o péptido parcial mínimo essencial de IGF-I, para a exibição da acção de extensão do epitélio da córnea.

As requerentes conseguiram principalmente as seguintes três invenções.

Uma primeira invenção refere-se a um novo péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 7 A característica da primeira invenção baseia-se na verificação do novo péptido como a unidade mínima para a exibição de actividade de IGF-I, nomeadamente o novo péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg. Os aminoácidos que compõem este péptido estão nas formas L, formas D e formas DL, que estão também englobadas no âmbito da invenção. Como especificamente descrito na secção do teste farmacológico, SSSR, quando utilizado em combinação com a substância P ou FGLM, pode exibir o efeito da extenção do epitélio da córnea e o efeito de promoção da cicatrização de feridas da pele. 0 SSSR da invenção pode ser preparado por métodos conhecidos, utilizando um sintetizador de péptidos automático e os detalhes são descritos nos Exemplos.

Uma segunda invenção refere-se a um agente para utilização no tratamento de um distúrbio da córnea, o agente que contém (1) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e (2) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como substâncias activas.

Uma terceira invenção refere-se a um agente para utilização na promoção da cicatrização de feridas da pele, o agente que contém o péptido (1) e o péptido (2), como os ingredientes activos. A característica da segunda e terceira invenções é a constatação de que a administração conjunta do péptido em que a unidade mínima para a exibição da actividade é representada por

Ser-Ser-Ser-Arg e o péptido em que a unidade mínima para a exibição da actividade é representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2, podem exibir um excelente efeito de extensão do epitélio da córnea e também um excelente efeito de promoção da cicatrização de feridas da pele.

Os aminoácidos que compõem o péptido de SSSR estão nas formas L, formas D e formas DL, que estão todas englobadas no âmbito da invenção. Um modo mais preferido é um péptido composto por aminoácidos todos na forma L.

Os aminoácidos que compõem a substância P e F6LM estão nas formas L, formas D e formas DL. Eles estão todos englobados no âmbito da invenção. Um modo mais preferido é um péptido composto por aminoácidos todos na forma L.

De acordo com a invenção, os seus sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sal de cloridrato, sal de sulfato, sal de fosfato, sal de lactato, sal de maleato, sal de fumarato, sal de oxalato, sal de metanossulf onato e sal de p-toluenossulfonato.

De acordo com a invenção, a administração conjunta do SSSR e FGLM, exibe acções de extensão do epitélio da córnea e promoção da cicatrização de feridas da pele. Qualquer tipo de SSSR e FGLM exibindo essas acções são satisfatórios, sem qualquer limitação específica. A administração conjunta de SSSR como a unidade mínima de exibição da actividade de IGF-I e FGLM, como a unidade mínima da exibição da actividade da substância P, é aplicável para a realização da invenção. 9 0 agente para utilização no tratamento de doenças da córnea e o agente para a promoção da cicatrização de feridas da pele, de acordo com a invenção, podem ser preparados utilizando técnicas comuns. 0 SSSR ou seus sais f armaceut icamente aceitáveis e FGLM, ou seus sais farmaceuticamente aceitávis, são formulados individualmente em formulações simples ou formulados em formulações mistas, que podem ser administradas por via parentérica ou por via oral. A sua administração parentérica é a mais preferida.

As formas de dosagem preferidas do agente para o tratamento de distúrbios da córnea incluem, por exemplo, gotas oculares e pomadas oculares. Estas podem ser preparadas utilizando técnicas comuns. Por exemplo, as gotas oculares podem ser preparadas, utilizando agentes isotónicos, tal como cloreto de sódio, tampões, tal como fosfato de sódio e conservantes, tal como cloreto de benzalcónio. 0 pH é satisfatório se estiver dentro de uma gama oftalmologicamente aceitável. 0 PH preferido está entre 4 a 8. A dose do agente para o tratamento de distúrbios da córnea é adequadamente seleccionada, dependendo dos sintomas, idade dos doentes, forma de dosagem e semelhantes. Para gotas oculares, a concentração de SSSR ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, é de 0,001 a 10% em p/v, de um modo preferido, 0,01 a 1% em p/v, para administração nos olhos, uma vez ou várias vezes por dia. A concentração de FGLM ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, é de 0,00001 a 0,1% em p/v, de um modo preferido, 0,0001 a 0,01% em p/v, para administração nos olhos, uma vez ou várias vezes por dia. 10 É desnecessário dizer que ambos os ingredientes activos são misturados para preparar formulações, tal como gotas oculares.

As formas preferidas de formulação do agente promotor da cicatrização de feridas incluem, por exemplo, uma pomada, uma gelatina, um cataplasma, um penso, uma loção, um creme, um vaporizador, um aerossol, amplasto, uma suspensão e uma emulsão. Além disso, um liquido pode ser preparado através da selecção de um solvente apropriado. De modo a preparar o agente para promover a cicatrização de feridas da pele , podem ser adicionados os seguintes agentes, dependendo da forma de dosagem: enchimentos, excipientes, bases ou veículos, extensores, ajustadores de pH, solubilizantes, agentes de suspensão, tampões, estabilizadores, conservantes, tensioactivos, antioxidantes, dispersantes, agentes emulsionantes, agentes de dissolução e agentes auxiliares para a dissolução. 0 transportador para a formulação inclui, por exemplo, Vaselina branca, parafina fluida, hidrocarboneto gelificado, álcool cetilico, polietilenoglicol, gelatina, amido de milho, alginato de sódio, metilcelulose, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, plastibase hidrófila, gelatina, dextrina, álcool cetilico, álcool estearilico, polietilenoglicol, álcool polivinilico, copolimero anidro de metoxietileno-maleico, éter polivinilico e polímeros e copolímeros com um componente constitucional de vinilpirrolidona, estearato de sódio, estearato de magnésio, cloreto de benzalcónio, gorduras e óleos, tais como azeite, óleo de camélia e óleo de soja, lactose e água. 11 0 agente para a promoção da cicatrização de feridas da pele, de acordo com a invenção, pode ser administrado de várias formas, dependendo do local da ferida e o nível da lesão. No caso em que o agente é para ser utilizado como uma preparação para uso externo, o agente é, de um modo preferido, revestido directamente, pulverizado ou ligado num local necessário (lesão), tal como a pele. A dose do agente para a promoção da cicatrização de feridas da pele, de acordo com a invenção, pode ser seleccionada de forma adequada, em termos dos sintomas, idade dos doentes, forma de dosagem e semelhantes. A dose de SSSR ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis é, geralmente, 0,001 a 1000 mg, de um modo preferido, 0,01 a 500 mg por dia, numa porção ou em várias porções. Além disso, a dose de FGLM ou seu sal farmaceuticamente aceitável é, geralmente, 0,01 a 5000 mg, de um modo preferido, 0,1 a 1000 mg por dia, numa porção ou em várias porções. É desnecessário dizer que ambos os ingredientes activos são misturados para preparar formulações, tal como pomadas.

Exemplos de preparação, exemplos de formulação e os resultados de um teste farmacológico são apresentados abaixo. Estes são para uma melhor compreensão da invenção. 12

Melhor Modo para a Realização da Invenção <Exemplo de Preparação> É apresentado abaixo um exemplo de preparação representativo de SSSR para utilização na invenção.

1. Preparação de SSSR

Utilizando um sintetizador de péptidos automático 430A (fabricado pela Applied Biosystems) e de acordo com um software existente, foi sintetizada uma resina de péptido protector pelo método do butiloxicarbonilo terciário (BOC). Como uma matéria-prima de partida, foi utilizado um transportador de resina 4-(oximetil)fenilacetoamida de metilo [Boc-Arg(Tos)APAM] (escala de 0,5 mmol). Neste método sintético, foram utilizados 30% de ácido trifluoroacético (TFA)/diclorometano e 70% de TFA/diclorometano para a remoção do grupo Boc, como grupo de protecção Na-amino. Para enxaguar, foi utilizado N-metil-2-pirrolidona (NMP)/diclorometano. A N,N-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) e 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) como agentes de condensação e o derivado de Boc-Ser (OBzl) como um aminoácido N-protegido, são utilizados em 4 equivalentes por grupo amino, respectivamente, enquanto o dimetilsulfóxido (DMSO)-NMP (8:2) foi utilizado como um solvente da reacção. Depois de se completar a condensação, a geração de péptidos defeituosos foi impedida com anidrido acético/N,N-diisopropiletilamina (DIEA) para bloguear completamente os restantes grupos amino. A remoção do grupo Boc e a condensação de Boc-Ser (OBzl), foram repetidos para construir o péptido final protegido. A remoção do péptido, a partir da resina de péptido protegida resultante e a 13 eliminação de todos os grupos de protecção, foram efectuados por um processo com fluoreto de hidrogénio anidro (HF)(HF:p-cresol = 8:2 (v/v) ; -2 a -5 °C; 60 minutos). Depois da reacção, o HF foi removido por destilação e o péptido foi extraído com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%. Um produto em bruto foi obtido na forma de um pó liofilizado, para a separação e purificação preparativa. A separação e purificação preparativa foi efectuada num gradiente de 0,5 a 2% de um sistema de acetonitrilo/água (contendo 0,1% de TFA) , utilizando HPLC LC 8A (fabricado por Shimadzu Corporation) (coluna: ODS, 30x240 mm, fabricada por YMC) (80 minutos) . Após a recolha de fracções de elevada pureza do material em causa resultante e removendo o acetonitrilo por destilação do material, o material resultante foi liofilizado para se obter o sal de TFA do composto alvo (70 mg; rendimento de 32%) . A análise de aminoácidos (condições para a hidrólise: HC1 6 N, a 110 °C, 22 horas)

Ser (3) 2,74, Arg (1) 1,00

Análise por HPLC [Coluna: YMC-Pak ODS-A (4,6 mm I.D. χ 150 mm);

Eluente: 1-60% de CH3NC/CF3CF2COOH 5 mM (25 min) ; Temp.: 25 °C, Caudal: 1,0 mL/min: Detector: 220 nm].

Pureza (HPLC): 98,5%

Análise de massa (ESI-MS) MH+= 436,2 (teor. = 436,2, mono isotópica) 14 <Exemplo de preparaçao de Referência>

2. Preparação do análogo de SSSR

Foram repetidos os mesmos procedimentos que para SSSR para preparar GSSSR, SSSRR, GSSSRR, GSSSRRAP, ASSSRRAP, GSSSRAAP e GSSSRAAAP. As propriedades físicas dos péptidos representativos são apresentadas abaixo.

(1) GSSSR

Análise de aminoácidos (condições para a hidrólise: HC1 6 N, 110 °C, 22 horas)

Ser (3) 2,76, Gly (1) 1,00, Arg (1) 1,00

Análise por HPLC [Coluna: YMC Pak ODS-A (4,6 mm χ 150 mm);

Eluente: 1-60% de CH3NC/CF3CF2COOH 5 mM (25 min) ;

Temp.: 25 °C, Caudal: 1,0 mL/min: Detector: 220 nm].

Pureza (HPLC): 98,5%

Análise de massa (ESI-MS) PM = 492,3 (teórica = 492,5) 15

(2) SSSRR

Análise de aminoácidos (condições para a hidrólis 6 N, 110 °C, 22 horas) Ser (3) 2,76, Arg (2) 2,00 Análise por HPLC [Coluna: YMC-Pak ODS-A (4,6 mm 150 mm); Eluente: 1-60% de CH3CN/CF3COOH a 0,1% (25 Temp.: 25 °C, Caudal: 1,0 mL/min: Detector: 220 nm] Pureza (HPLC): 99,7% Análise de massa (ESI-MS) PM = 591,5 (teórica = 591,6) (3) GSSSRR A análise de aminoácidos (condições para a hidrólis 6 N, 110 °C, 22 horas) Ser (3) 2,73, Gly (1) 0,98, Arg (2) 2,00 Análise por HPLC [Coluna: YMC Pak ODS-A (4,6 mm 150 mm); Eluente: 1-60% de CH3CN/CF3COOH a 0,1% (25 Temp.: 25 °C, caudal: 1,0 mL/min: Detector: 220 nm] : HC1 .D. x min) ; : HC1 .D. x min) ; 16

Pureza (HPLC): 99,3%

Análise de massa (ESI-MS) PM = 648,5 (teórica = 648,7)

(4) GSSSRRAP

Ser (3) 2,68, Gly (1) 0,99, Ala (1) 1,01, Arg (2) 2,00

Análise por HPLC [Coluna: YMC Pak ODS-A (4,6 mm I.D. χ 150 mm);

Eluente: 1-60% de CH3CN/CF3COOH a 0,1% (25 min) ;

Temp.: 25 °C, Caudal: 1,0 mL/min: Detector: 220 nm].

Pureza (HPLC): 98,6%

Análise de massa (ESI-MS) PM = 816,7 (teórica = 816,9) 17 <Exemplos de Formulaçao>

Sao apresentadas abaixo exemplos de formulações representativas para utilização. 1. Gotas oculares

Foram preparadas gotas oculares com a seguinte formulação, por um método vasto.

Exemplo de Formulação 1 SSSR

Cloreto de sódio Hidróxido de sódio Ácido clorídrico Água purificada esté Em 100 mL 1 mg 9 0 0 mg quantum suficiente quantum suficiente il quantum suficiente

Do mesmo modo como para o Exemplo de Formulação 1, podem ser preparadas gotas oculares contendo SSSR de 0,01 mg, 0,05 mg, 0,1 mg, 0,5 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg e 100 mg em 100 mL. 18 2. Exemplo de Formulação Ref. 2

GSSSR

FGLM

Cloreto de sódio Hidróxido de sódio Ácido clorídrico Água purificada estéril Em 100 mL

Do mesmo modo como para o pode ser preparadas gotas oculare 10 mg, 50 mg, 500 mg e 1000 mg em 1 mg 100 mg 900 mg quantum suficiente quantum suficiente quantum suficiente

Exemplo de Formulação Ref. 2, s contendo FGLM de 1 mg, 5 mg, 100 mL. modo como para o Exemplo gotas oculares contendo SSSR de 0,5 mg, 10 mg, 50 mg e 100 mg e FGLM 50 mg, 500 mg e 1000 mg em combinações

Exemplo de Formulação 3

SSSR

FGLM

Do mesmo ser preparadas 0,1 mg, 10 mg, 1 mg 10 0 mg 9 0 0 mg quantum suficiente quantum suficiente quantum suficiente de Formulação 3, podem 0,01 mg, 0,05 mg, de 1 mg, 5 mg, facultativas. 19 2. Pomada

Exemplo de Formulação 4

SSSR

FGLM

Parafina líquida Vaselina branca Em 100 g 10 mg 100 mg 10 g quantum suficiente

Ao modificar adequadamente a quantidade de SSSR a ser adicionada e a quantidade de FGLM a ser adicionada, podem ser preparadas várias concentrações de pomadas.

Exemplo de Formulação de Ref. 5

GSSSR

Substância P Parafina líquida Vaselina branca Em 100 g 1 mg 100 mg 10 g quantum suficiente

Ao modificar adequadamente a quantidade de GSSSR a ser adicionada e a quantidade de substância P a ser adicionada do mesmo modo como para o Exemplo de Formulação de Ref. 5, podem ser preparadas várias concentrações de pomadas. 20

Exemplo de Formulação de Ref. 6 modificar adequadamente a e a quantidade de FGLM a ser várias concentrações de pomadas.

SSSRR

FGLM

Parafina líquida Vaselina branca Em 100 g

Ao adicionada preparadas 5 mg 100 mg 10 g quantum suficiente quantidade de SSSRR a ser adicionada, podem ser

Exemplo de Formulação de Ref. 7 50 mg 10 mg 3 mg 10 g quantum suficiente

GSSSRR

Substância P Ácido ascórbico Parafina líquida Plastibase hidrofílica Em 100 g

Ao modificar adequadamente a quantidade de GSSSRR a ser adicionada e a quantidade de substância P a ser adicionada, podem ser preparadas várias concentrações de pomadas. 21 <Teste Farmacológico (1) Acçao para a extensão do epitélio da córnea (in vitro)

Utilizando a córnea de um coelho Branco japonês macho e de acordo com o método do Nishida et al. (J. Cell Biol., 97, 1653-1657 (1983)), o comprimento da extensão do epitélio da córnea da secção da córnea num sistema de cultura de tecido, foi utilizada como um marcador para avaliar a influência sobre a extensão do epitélio da córnea. (Método experimental)

Os blocos de córnea cortados a partir da secção da córnea de coelho (6 blocos por grupo), foram cultivados em meio de cultura (TC—199) contendo um composto de teste sob condições de CO2 a 5%, a 37 °C, durante 24 horas. Após a cultura, os blocos da córnea foram fixos numa solução mista de etanol-ácido acético glacial (razão de volume: 95:5) e, em seguida, embebidas em parafina para preparar as secções. Depois da parafina ser removida das secções, as secções resultantes foram coradas com hematoxilina-eosina para avaliar o comprimento da extensão da camada de células epiteliais de córnea com um microscópio. Como controlo, foram utilizados blocos cultivados do mesmo modo nos meios de cultura, sem nenhum composto de ensaio. (Compostos de teste)

Os exemplos representativos dos péptidos utilizados na experiência são apresentados na Tabela 1. 22 (Resultados)

Os resultados experimentais são apresentados na Tabela 1. Aqui, a razão de extensão na tabela representa a média de seis secções por grupo, como calculado quando o comprimento alongado do grupo de controlo foi definido como a linha de base (100%).

Tabela 1 Fármacos de teste Relação de extensão (%) Controlo 100 SSSR (1 nM) 101 GSSSR (1 nM) 101 SSSRR (1 nM) 98 GSSSRR (1 nM) 94 GSSSRRAP (1 nM) 97 GSSSRAAAP (1 nM) 100 GYGSSSRRAPQT (1 nM) 104 Substância P (20 μΜ) 94 FGLM (20 pm) 99 SSSR (1 nM) + substância P (20 μΜ) 138 GSSSR (1 nM) + substância P (20 μΜ) 135 SSSRR (1 nM) + substância P (20 μΜ) 136 GSSSRR (1 nM) + substância P (20 μΜ) 142 GSSSRRAP (1 nM) + substância P (20 μΜ) 140 ASSSRRAP (1 nM) + substância P (20 μΜ) 134 GSSSRAAP (1 nM) + substância P (20 μΜ) 150 GSSSRAAAP (1 nM) + substância P (20 μΜ) 139 GYGSSSRRAPQT (1 nM) + substância P (20 μΜ) 134 SSSR (1 nM) + FGLM (20 μΜ) 145 23

Como apresentado na Tabela 1, os análogos de SSSR sozinhos, a substância P sozinha e FGLM sozinho, não foram observados ter qualquer influência sobre a extensão do epitélio da córnea; no entanto, observou-se que a extensão do epitélio da córnea, foi promovido de forma significativa, quando o epitélio da córnea foi cultivado em meio de cultura contendo o análogo SSSR e a substância P (ou FGLM). (2) Acção de cicatrizaçao de feridas da pele A acção de cicatrização de feridas da pele pode ser testada pelo método seguinte. 0 rato é anestesiado sob inalação de éter dietílico; em seguida, o cabelo dorsal é eliminado com tesoura de cabelo e, em seguida, removido com um creme depilatório. 24 horas mais tarde, são feitos cinco locais de feridas ao longo de todas as camadas da epiderme e da derme, com um intervalo igual, na pele dorsal, utilizando uma trefina com um diâmetro de 5 mm para biopsia cutânea. Após ter sido confirmada a hemostasia, uma pomada contendo SSSR, uma pomada contendo FGLM e uma pomada contendo SSSR e FGLM são aplicadas individualmente, uma vez por dia.

Antes da aplicação das pomadas individuais, as feridas dorsais do rato são fotografadas e medidas as suas áreas. As áreas das feridas individuais, depois de aplicadas as pomadadas contendo SSSR, a pomada contendo FGLM e a pomada contendo SSSR e FGLM, são comparadas umas com as outras, para avaliar o efeito de cicatrização de feridas da pele. 24

Aplicabilidade industrial

Com base nos resultados do teste farmacológico, uma administração conjunta de SSSR consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg, como a unidade minima para a exibição da actividade de IGF-I e FGLM consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2, promove significativamente a extensão do epitélio da córnea e cicatrizaçao das feridas. Assim, o SSSR e FGLM, quando administrados em combinação agem sinergicamente para exibirem efeitos como agentes terapêuticos de distúrbios da córnea, tais como úlcera da córnea, erosão da córnea, queratite e olho seco ou efeitos como agentes de cicatrização de feridas da pele, tais como uma ruptura, uma abrasão, uma incisão de cirurgia, uma úlcera de pele e uma queimadura e doenças devido a estas, tais como gangrena.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> SANTEN PHARMACEUTICAL CO., LTD. NISHIDA, Teruo

<120> NOVO PÉPTIDO E UTILIZAÇÃO FERMACÊUTICA DO MESMO <130> 19-153- tM/hg <140> PCT/JP02/12632 <141> 2002-12-03 <150> JP 2001-368103 <151> 2001-12-01 25 <16 0> 17 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Humano <400> 1

Ser Ser Ser Arg <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Humano <40 0>2

Phe Gly Lett Met 1 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Humano <400> 3

Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr 15 10 26 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Humano <400>4 GTy Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <40 0> 5

Ser Ser Ser Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <40 0> 6

Gly Ser Ser Ser Arg 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Humano 27 <4Ο0> 7

Gly Ser Ser Ser Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Humano <40 0> 8

Ala Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Humano <40 0> 9

Gly Ser Ser Ser Arg Ala Ala Pro 1 . 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Humano <40 0> 10

Gly Ser Ser Ser Arg Ala Ala Ala Pro 1 5

<210> 11 <211> 12 <212> PRT 28 <213> Humano <400> 11 Tyr Arg 1 Pro Lys Pro Gin 5 Gin Phe Phe Gly Leu Met 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Humano <400> 12 Pro Gin 1 Gin Phe Phe Gly 5 Leu Met <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <40 0> 13 Gin Gin 1 Phe Phe Gly Leu 5 Met <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Humano <400> 14 Gin Phe 1 Phe Gly Leu Met 5 29 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <400> 15 Phe Phe Gly Leu Met 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <40 0> 16 Tyr Phe Gly Leu Met 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <40 0> 17

Gly Phe Gly Leu Met 1 5

Lisboa, 28 de Junho de 2013 30

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
2. Agente para utilização no tratamento de um distúrbio da córnea, o agente compreendendo os seguintes componentes: (1) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e (2) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2 ou substância P, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
3. Agente para utilização no tratamento de um distúrbio da córnea, de acordo com a reivindicação 2, em que o distúrbio da córnea é úlcera da córnea, erosão da córnea, queratite ou olho seco.
4. Agente para utilização no tratamento de um distúrbio da córnea, de acordo com a reivindicação 3, em que a sua forma de dosagem é uma gota ocular.
5. Agente para utilização na promoção da cicatrização de feridas da pele, o agente contendo os seguintes componentes: (1) um péptido consistindo na sequência de aminoácidos representada por Ser-Ser-Ser-Arg ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; e (2) um péptido 1 consistindo na sequência de aminoácidos representada por Phe-Gly-Leu-Met-NH2 ou substância P, ou de seus sais farmaceuticamente aceitáveis,
6. Agente para utilização na promoção da cicatrização de feridas da pele, de acordo com a reivindicação 5, em que a ferida é uma ruptura, uma abrasão, uma incisão cirúrgica, uma úlcera da pele ou uma queimadura.
7. Agente para utilização na promoção da cicatrização de feridas da pele, de acordo com a reivindicação 6, em que a sua forma de dosagem é uma pomada ou um penso. Lisboa, 28 de Junho de 2013 2