KR20210062649A - 펩티드 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩티드, 상기 펩티드를 포함하는 조성물 및 혈관신생 및/또는 신혈관신생의 억제제로서 이의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 부적절한 혈관신생 및/또는 신혈관신생과 관련된 병리를 치료하기 위한 상기 펩티드 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 특히, 이러한 맥락에서 VEGFR1과 관련된 혈관신생 및/또는 신혈관신생을 언급한다.

Description

펩티드 및 이의 의학적 용도

본 발명은 펩티드, 상기 펩티드를 포함하는 조성물 및 혈관신생 및/또는 신혈관신생의 억제제로서 이의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 부적절한 혈관신생 및/또는 신혈관신생과 관련된 병리의 치료를 위한 상기 펩티드 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 특히, 이러한 맥락에서 VEGFR1과 관련된 혈관신생 및/또는 신혈관신생을 언급한다.

VEGFR-1 활성화의 억제가 적용될 수 있는 상당한 심각성 및 광범위한 병리를 고려하면, VEGFR-1에 결합할 수 있고, VEGF-A, PlGF, VEGF-B 리간드 및 VEGF-A/PlGF 이종이량체와 VEGFR-1 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 합성 화합물에 대한 강력한 요구가 있을 것으로 생각할 수 있다. 실제로, 유리하게는, 합성 화합물은 본질적으로 생물학적 기원의 오염 물질이 없고, 재조합 기원의 생물치료제보다 상당히 낮은 비용으로 생산될 수 있다.

리간드 중화를 목적으로하는 많은 치료 접근법은 단일 클론 항체가 높은 특이성 및 친화성을 특징으로 하는 분자이므로, 단일 클론 항체를 사용한다. 그러나, 합성 분자 역시 생산하기 더 쉽고 저렴하며 더 안정적으로 쉽게 전달할 수 있으므로, 이점을 갖는다.

이와 관련하여, 최근 2008년, [Ponticelli et al.]은 펩티드 라이브러리로부터 선택된 사량체 트리펩티드를 기술하였는데, 여기서 화학식 (R-Glu)-(S-Cys(Bzl))-(S-Cha)의 펩티드 사슬은 3개 리신의 "코어(core)"에서 사량체화되었다 [(Tam, J. P. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409 -5413)].

사량체 펩티드는 다음의 구조를 갖는다:

화학식 (I)

[Ponticelli et al.]에 의해 보고된 과학적 증거는 위에서 언급된 사량체 펩티드가 VEGFR1에 결합할 수 있고, PlGF, VEGF-A 및 VEGF-B와 약 10 μM의 IC50의 상호작용을 인비트로(in vitro)에서 억제할 수 있음을 입증한다. 뿐만 아니라, 펩티드는 VEGFR-2에 결합할 수 없고, VEGF-A에 의한 활성화를 방해하지 않는다.

마지막으로, 펩티드는:

1) PlGF 및 VEGF-A의 전-혈관형성 활성을 방해하는 인비트로(in vitro) 항-혈관형성 활성을 나타내고;

2) 각막에서 VEGF-A-sFlt1 결합을 대체할 수 있어- 생리적 조건하에 혈관화되지 않음 - 결과적으로 VEGF-A가 자유롭게되고 신혈관신생을 촉진시킬 수 있으며;

3) 복강내 투여시, 종양 성장, 혈관신생 및 동맥신생과 전이를 감소시키고; 및

4) 유리체내 투여시, 맥락막 신혈관화를 감소시킨다 [(Cicatiello et al. 2015)].

펩티드의 항-혈관형성 활성은 새로운 혈관 형성의 억제 및 신혈관신생의 부위에서 염증 세포, 바람직하게는 단핵구-대식세포의 동원을 억제하는 능력에 기인한다.

항-동맥신생 활성은 신혈관신생의 부위에서 평활근 세포의 동원을 억제하는 능력에 기초한다.

이러한 맥락에서, 본 발명의 발명자들은 펩티드의 C-말단에, 화학적 그룹, 특히 티올 또는 티올에테르기와 유사한 입체장애를 갖는 측쇄를 특징으로 하는 아미노산을 삽입함으로써, 분자의 활성을 상당히 향상시킨다는 것을 놀랍게도 발견하였다.

실제로, 위에서 언급된 변형은 VEGFR1과의 선택적 결합 및 VEGFR1과의 결합에서 용량-의존성 방식으로 VEGF-A 및/또는 PlGF와 경쟁하는 능력을 손상시키지 않는다. 반대로, 이러한 변형은 1000 nM 미만의 농도에서 PlGF 또는 VEGF와 VEGFR1 사이의 상호작용을 50% 억제 (IC50)할 수 있다; VEGFR1에 대한 [Ponticelli et al.]에 보고된 펩티드의 친화성이 10000 nM 이상 (IC50으로 표현)임을 고려할 때, 이는 전혀 예상치 못한 결과이다. 즉, 본 발명의 펩티드는 [Ponticelli et al.]에 보고된 펩티드의 것보다 약 10배 더 큰 억제 능력을 갖는다.

뿐만 아니라, 본 발명의 발명자들은, 경구로 또는 위관 영양으로 투여할 때, [Ponticelli et al.]에 기술된 펩티드 및 본 발명의 펩티드 모두 맥락막 신혈관화를 억제하는 상당한 능력을 입증하였다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 그러므로, 이러한 분자는 혈관신생, 바람직하게는 VEGFR1-의존성 혈관신생의 변경과 관련되거나 이에 의해 야기되는 어떤 경우에서도 병리를 치료, 바람직하게는 경구 투여에 의해 치료하는데 치료적으로 효과적이다.

이하의 도면 및 정의를 참조하는 비제한적인 예시적 실시예와 함께 본 발명의 상세한 설명이 이어진다.

- 도 1은 VEGFR-1의 PlGF-유도 인산화와 관련하여 iVR1 및 iVR1-Cys및 항-PlGF 단일 클론 항체의 억제 활성을 보여준다. 20 ng/ml의 PlGF로 유도된 VEGFR-1 인산화의 분석은 웨스턴 블롯팅으로 293-VEGFR-1 세포에서 수행되었다. iVR1-Cys 및 iVR1은 5 μM의 농도로 동시에 첨가되었다. 인간 항-PlGF 중화 단일 클론 항체는 억제 대조군으로서 3.3 nM의 농도로 사용되었다. PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다.
- 도 2는 유리체내 투여된 iVRI-Cys가 용량-의존성 방식으로 레이저-유도 맥락막 신혈관화를 억제하는 것을 보여준다. 단일(single) 10 또는 50 μg의 iVRI-Cys의 유리체내 주사는 비히클 (DMSO) 주사에 비해 48.9% 및 75.9%에 해당하는 맥락막 신혈관화의 용량-의존성 감소를 일으킨다. 동일 양의 iVR1은 37.8% 및 73.9%에 해당하는 CNV의 억제를 일으킨다. 대조군 펩티드 (PC)는 억제 능력을 나타내지 않는다. 신혈관화의 부피 정량화는 iVR1 10μg 및 50μg의 경우 n = 12 및 15 지점; iVR1-Cys 10μg 및 50μg의 경우 n = 10 및 8 지점; PC의 경우 n = 15 지점 및 DMSO의 경우 n = 14 지점에서 수행되었다. 데이터는 대조군에 대한 평균 ± SEM으로 표시된다. #p<0.05; *p > 0.0002; ¶p<0.02; §p > 0.002; 대 PC 및 DMSO. 하단에 CNV를 대표하는 이미지가 있다. 막대는 100 μm를 나타낸다.
- 도 3는 경구로 투여된 iVRI-Cys가 레이저-유도 맥락막 신혈관화를 억제하는 것을 보여준다. 7일 동안 50 mg/Kg으로 iVR1-Cys의 하루 2번 경구 투여는 비히클에 비해 맥락막 신혈관화의45.9 % 감소를 일으킨다. 동일 양의 iVR1은 CNV의 유사한 (49.7 %) 억제를 일으킨다. 신혈관화의 부피 정량화는 iVRI-Cys의 경우 n = 18 지점, iVRI의 경우 n = 20 지점, 및 비히클에 대해 n = 10 지점에서 수행되었다. 데이터는 대조군에 대한 평균 ± SEM으로 표시된다. *p = 0.001 및 §p = 0.007 대 DMSO. 하단에 CNV를 대표하는 이미지가 있다. 막대는 100 μm를 나타낸다.
정의
이러한 맥락에서, 용어 "VEGF"는 혈관 내피 성장 인자를 의미한다. 인간에게는 5개의 상이한 유전자로 암호화된, 5개의 상이한 혈관 내피 성장 인자, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PlGF이 존재한다. 모두 글리코실화된 이량체 단백질이다.
이러한 맥락에서, 용어 "VEGF-A"는 이전에 VPF (혈관 투과 인자)로도 알려진, 혈관 내피 성장 인자 -A를 의미한다. 이는 생리적 및 병리적 혈관신생에서 결정적 역할을 하는, VEGF 패밀리의 가장 강력한 인자이다. 인간에서 대체 스플라이싱에 의해 수득된 적어도 6개의 상이한 이소폼이 설명되었다. 모두 VEGFR-1 및 VEGFR-2라고 하는 2개의 수용체와 상호작용을 할 수 있다.
이러한 맥락에서, 용어 "PlGF"는 병리적 상태와 관련된 혈관신생의 조건에 국한된 역할을 하는 태반 성장 인자를 의미한다. 인간에서 4개의 상이한 이소폼이 설명되었다. 모두 VEGFR-1에 특이적으로 결합할 수 있다. VEGF-A 및 PlGF 모두 VEGFR-1와 상호작용하기 때문에, 그리고 각각의 두 유전자가 동일 세포에서 발현될 때, VEGFR-1과 상호작용할 수 있거나 VEGFR-1/VEGFR-2 이종이량체화를 유도할 수 있는 VEGF-A/PlGF 이종이량체화 이종이량체를 생성할 수 있기 때문에, VEGF-A 및 PlGF는 병리적 조건에서 강력한 상승 작용을 한다.
이러한 맥락에서, 용어 "VEGFR-1"은 Flt-1으로도 알려진 VEGF 수용체 1를 의미한다. VEGFR-1은 세포내 티로신-키나아제 도메인을 갖는 반면, 세포외 부분은 7개의 IgG-유사 도메인으로 이루어진다. VEGF-A, VEGF-B, 또는 PlGF는 티로신-키나아제 도메인의 자가인산화에 의해 결과적인 활성화와 함께 수용체의 이량체화를 일으킨다. VEGFR-1은 내피 세포에서 발현되는 것 외에도, 평활근 세포, 단핵구-대식세포, 섬유아세포 및 내피 전구체를 포함한 많은 다른 유형의 세포에서 발현된다. 이는 혈관신생에 기여하는 상이한 유형의 세포를 모집하는데 근본적인 역할을 한다. 이러한 맥락에서, 용어 "수용성 VEGFR-1" (sVEGFR-1)은 sFlt-1으로도 알려진 VEGF 수용체 1의 수용성 형태를 의미한다. 이는 처음 6개의 VEGFR-1의 IgG-유사 세포외 도메인과 꼬리로 이루어지며, 대체 스플라이싱에 의해 VEGFR-1 유전자로부터 생성된다. 이는 수용성 형태가 우선적으로 발현되는, 각막을 제외하고, VEGFR-1의 전장(full-length) 형태가 발현되는 동일 세포에서 일반적으로 발현되어, 각막을 무혈관 상태로 유지하는데 결정적이다. 전장 및 수용성 인간 VEGFR1의 메신저 서열은 각각 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 및 2인 반면, 전장 인간 VEGFR1의 단백질 서열은 각각 SEQ ID NO: 3 및 4이다. 본원에 기술된 서열에 대한 80-99.9% 범위의 동일성을 특징으로 하는 서열은 본 설명의 일부로 간주되어야한다.
이러한 맥락에서, 용어 "VEGFR-2"는 인간의 KDR 및 마우스의 Flk-1으로도 알려진 VEGF 수용체 2를 의미한다. VEGFR-2는 VEGF-A에 의해 특이적으로 결합되고, 도메인에 조직이 있고 VEGFR-1에 대해 설명된 것과 유사한 활성화 메커니즘을 갖는다. 수용체 1과 달리, 본질적으로 내피 세포에서 발현된다. 이는 내피 세포의 증식, 이동 및 분화를 자극하는 근본적인 역할을 한다.
이러한 맥락에서, 용어 "혈관신생"은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 의미한다; 이러한 맥락에서 혈관신생은 다양한 유형의 병리적 조건과 관련된 새로운 혈관의 형성 과정으로 지칭되며, 바람직하게는 다음으로부터 선택된다:
- 신혈관 안구 질환으로서, 바람직하게는 황반 부종, 습성 형태의 노인 황반 변성, 당뇨망막병증, 미숙아 망막증, 중심성 망막 정맥 폐쇄 망막증, 초자체 출혈 및 망막 박리 및 이의 조합으로부터 선택되는 신혈관 안구 질환; 및/또는;
- 고형 종양 및/또는 종양 전이로서, 바람직하게는 백혈병 및 림프종, 바람직하게는 급성 림프구 백혈병, 급성 비-림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 호지킨 질환, 영아 또는 성인 고형 종양, 뇌 종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 윌름 종양, 골육종 및 연골육종, 폐 종양, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 비뇨계 암, 방광암, 구강 종양, 이자 종양, 흑색종 및 피부 종양, 위 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 후두 종양, 간 종양, 고환 종양으로부터 선택되는 상기 종양; 및/또는
- 골 또는 관절의 질환으로서, 바람직하게는 류마티스 관절염, 윤활막염, 연골 및/또는 골 파괴, 골수염, 윤활 조직의 비대 및/또는 과형성, 골증식, 신생물 및/또는 전이의 형성 및 이의 조합으로부터 선택되는 골 또는 관절의 질환; 및/또는
- 혈관 병리로서, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 혈관종, 혈관내피종 및 이의 조합으로부터 선택되는 혈관 병리; 및/또는
- 피부 질환으로서, 바람직하게는 건선, 사마귀, 화농육아종, 모발 성장, 카포시 육종, 상처의 켈로이드, 알러지성 부종, 신생물 및 이의 조합으로부터 선택되는 피부 질환; 및/또는
- 지방 조직의 병리, 바람직하게는 비만에서 관찰되는 혈관 신생; 및/또는
- 당뇨 및/또는 이의 합병증으로서, 바람직하게는 망막증 및/또는 당뇨병성 족부병변; 및/또는
- 조혈 질환으로서, 바람직하게는 AIDS 및/또는 카포시 육종.
이러한 맥락에서, 용어 "신혈관신생"은 이전에 존재하지 않았던 조직에서 새로운 혈관의 형성 및/또는 이미 혈관화된 조직에서 혈관의 수 증가와 관련하여 새로운 혈관신생을 의미한다; 이러한 맥락에서, 신-혈관신생은 바람직하게는 VEGFR-1의 활성에 의존성이다.
이러한 맥락에서, 용어 "혈관화"는 혈관신생을 의미하고, 즉 동의어로 사용된다.
이러한 맥락에서, 용어 "신혈관화"는 신혈관신생을 의미하고, 바람직하게는 VEGFR-1의 활성에 의존성이다.
이러한 맥락에서, 용어 "동맥신생"은 혈관을 평활근 세포로 덮음으로써 새로운 혈관이 안정화되는 과정을 의미한다.
이러한 맥락에서, "억제제"는 수용체 자체 및/또는 이의 수용성 리간드를 결합하여, 상호작용을 방지함으로써 수용체의 활성을 길항할 수 있는 화학적 및/또는 생물학적 실체를 의미한다.
이러한 맥락에서, 용어 "유효 용량"은 본 발명에 기술된 활성 물질의 투여가 원하는 생물학적 효과를 결정할 수 있는 투여 간격을 의미한다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 이는 건강 상태, 치료를 필요로하는 개인의 신체 상태, 연령, 활성 물질의 제형, 환자를 돌보는 의사의 평가에 따라 달라질 수 있다. 단일 개인의 시스템이 효과적으로 반응할 수 있는 능력, 원하는 반응 정도, 분류학적 그룹 (예컨대, 인간, 비-인간 영장류, 영장류 등) 및 기타 관련 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 기술된 활성 물질의 유효 용량은 일상적인 시험으로 결정하기에 충분히 넓은 간격 내에 있을 것으로 예상된다. 일반적으로, [Ragan-Shaw et al. (FASEB J. 2008 Mar;22(3):659-61)]에 의해 보고된 바와 같이, 그리고 따라서 이러한 맥락에서도, 투여된 유효 용량은 바람직하게는 전신적으로, 바람직하게는 경장 경로에 의해 전신적으로, 더욱 바람직하게는 경구로, 설하로 또는 직장으로 투여되는 경우, 바람직하게는 10 내지 2000 mg/용량 범위이다. 대안으로, 투여된 유효 용량은 바람직하게는 유리체내 투여되는 경우 1 내지 100 mg/용량 범위이다. 대안으로, 투여된 유효 용량은 바람직하게는 체중의 0.16 내지 33.3 mg/kg 범위이다. 치료 프로그램은 단일 용량 또는 다중 용량을 제공한다.

본 발명의 제1 양태는 다음의 일반 화학식 (II)에 의해 분리되고 특징으로 하는 펩티드, 바람직하게는 다량체 펩티드에 관한 것이다:

{{{[Y1 - Glu - Cys(Bzl) - Cha]2 - Z1}i - Z2 }j - Z3 }z - Y2 - Y3 (화학식 II)

여기서

- Y1은 펩티드의 아미노 말단 관능기 (NH₂) 또는 바람직하게는 표 I에서 선택된 적어도 하나의 화학적 그룹이다. 목록은 또한 화학적 그룹, 바람직하게는 입체장애 및/또는 화학적 특성을 갖는 아미노산을 포함하는 것으로 이해되며, 특히 아미노산의 경우 측쇄를 가지고, 표 I에 열거된 화학적 그룹, 바람직하게는 아미노산을 모방하고/하거나, 당업자에게 알려진 방법, 예컨대, [Woong-Hee Shin et al., Molecules 2015, 20, 12841-12862]에 기술된 방법이지만 배제하는 것은 아닌 방법으로 측정되는 유사성, 바람직하게는 적어도 70% 유사성을 특징으로 한다.

이러한 맥락에서 본 설명의 기(group)에 존재하는 카이랄 중심의 절대 배열을 정의하는데 적합한 D/L 표시는, 당업자에게 알려진 바와 같이, 문헌에 보고된 규칙에 따른 R/S 표시와 상호 교환될 수 있음을 명확히 해야한다.

번호	3-문자 코드	약어
1	D-알라닌	D-Ala
2	D-아스파르트산	D-Asp
3	D-발린	D-Val
4	D-글루탐산	D-Glu
5	L-시클로헥실알라닌	L-Cha
6	D-페닐알라닌	D-Phe
7	D-트레오닌	D-Thr
8	D-메티오닌	D-Met
9	D-리신	D-Lys
10	D-시스테인(S-아세트아미도메틸)	D-Cys(Acm)
11	D-티로신	D-Tyr
12	D-프롤린	D-Pro
13	D-류신	D-Leu
14	D-아르기닌	D-Arg
15	D-아스파라긴	D-Asn
16	D-이소류신	D-Ile
17	D-아르기닌(NΓ-토실)	D-Arg(Tos)
18	D-세린	D-Ser
19	L-시스테인(S-벤질)	L-Cys(Bzl)
20	L-시스테인(S-아세트아미도메틸)	L-Cys(Acm)
21	D-히스티딘	D-His
22	D-글루타민	D-Gln
23	D-트립토판	D-Trp
24	L-글루탐산-(β-알릴)	L-Glu(β-OAll)
25	β-알라닌	β-Ala
26	L-시스테인(S-p-메틸-벤질)	L-Cys(p-MeBzl)
27	L-시스테인(S-tert-부틸)	L-Cys(tBu)
28	L-메티오닌-설폰	L-Met(O)2
29	L-메티오닌-설폭사이드	L-Met(O)
30	글리신	Gly

- Glu는 글루탐산, 바람직하게는 아미노산 (R-Glu)의 Cα에서 절대 배열 R을 나타낸다.

- Cys(Bzl)은 벤질 시스테인, 바람직하게는 아미노산 (S-벤질-시스테인 / S-Cys (Bzl) 측쇄의 황-결합 벤질기를 포함하는 아미노산의 Cα에서 절대 배열 S를 나타낸다.

- Cha는 시클로헥실알라닌, 바람직하게는 아미노산 (S-시클로헥실알라닌/ S-Cha)의 Cα에서 절대 배열 S를 나타낸다.

- Y2는 바람직하게는 다음으로부터 선택된다:

1. 트리펩티드 R-Glu - S-Cys(Bzl) - S-Cha, 및

· α-아미노산, 바람직하게는 글리신 또는 적어도 하나의 티올 또는 티올에테르기를 특징으로 하는 것으로 부터 선택된 α-아미노산, 바람직하게는 표 II에서 보여지는 것들 및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 티올 또는 티올에테르기를 특징으로 하는 상기 α-아미노산.

목록은 또한 화학적 그룹, 바람직하게는 입체장애 및/또는 화학적 특성을 갖는 아미노산을 포함하는 것으로 이해되며, 아미노산의 경우 측쇄를 가지고, 표 II에 열거된 화학적 그룹, 바람직하게는 아미노산을 모방하고/하거나, 당업자에게 알려진 방법, 예컨대 [Woong-Hee Shin et al., Molecules 2015, 20, 12841-12862]에 기술된 방법이지만 배제하는 것은 아닌 방법으로 측정되는 유사성, 바람직하게는 적어도 70% 유사성을 특징으로 한다.

N.	Y
1	D-시스테인
2	L-시스테인
3	L-호모시스테인
4	D-호모시스테인
5	D-시스테인-S-메틸
6	L-시스테인-S-메틸
7	D-시스테인-S-에틸
8	L-시스테인-S-에틸
9	L-메티오닌
10	D-메티오닌
11	D-시스테인-S-벤질
12	L-시스테인-S-벤질
13	L-메티오닌 설폭사이드
14	D-메티오닌 설폭사이드
15	L-메티오닌 설폰
16	D-메티오닌 설폰
17	D-세린
18	L-세린
19	D- 세린 -O-메틸
20	L- 세린 -O-메틸
21	D- 세린 -O-에틸
22	L- 세린 -O-에틸
23	D- 세린 -O-벤질
24	L- 세린 -O-벤질
25	D-트레오닌
26	L- 트레오닌
27	D- 트레오닌 -O-메틸
28	L- 트레오닌 -O-메틸
29	D 트레오닌 -O-에틸
30	L- 트레오닌 -O-에틸
31	D- 트레오닌 -O-벤질
32	L- 트레오닌 -O-벤질

- Y3는 바람직하게는 카르복실기, 카르복시아미드기, N-메틸-치환카르복시아미드 또는 이치환 N, N-디메틸기, 히드록시기 및 수소로부터 선택된다.

- Z1, Z2 및 Z3는 바람직하게는 삼관능기를 나타내며, 바람직하게는 다음의 화학식 (III)을 특징으로 한다:

(III)

여기서 k는 정수로서, 바람직하게는 1 내지 4가 포함된 정수이며, B는 바람직하게는 아미노기 또는 히드록시기이다. 상기 삼관능성 분자는 바람직하게는 R 또는 S 절대 배열이다.

바람직하게는, Z1, Z2 및 Z3는 분지형 구조를 얻기 위해 사용된다. 실제로, 이러한 유형의 구조는 이러한 목적을 위해 알려진 방법에 따라 펩티드를 다중화하는데 일반적으로 사용되고, 예컨대 B가 아미노기인 경우, [Tam et al.]에 의해 기술된 방법이 사용될 수 있다 [(Tam J.P., 1988, PNAS, 85, 5409-5413)].

Z1, Z2 및 Z3는 바람직하게는 1, 3 또는 7개의 삼관능성 분자를 포함하는 다중 그룹 Z1, Z2 및 Z3을 갖는 화학식 (II)의 구조를 얻는 방식으로 조립될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Z1 및/또는 Z2 및/또는 Z3는 바람직하게는 분지형 구조를 형성하는 방식으로 아미드 결합에 의해 서로 결합된다. 대안으로, 예컨대 B가 바람직하게는 히드록시기인 경우, 에스테르 결합에 의해 서로 결합될 수 있다.

- i는 바람직하게는 4, 2 또는 1이다.

- j는 바람직하게는 2, 1 또는 0이다.

- z는 바람직하게는 1 또는 0이다.

바람직한 구현예에 따르면, i=4인 경우, j=2 및 z=1이다. 바람직한 추가 구현예에 따르면, i=2인 경우, j=1 및 z=0이다.

바람직한 추가 구현예에 따르면, i=1인 경우, j=z=0이다.

j=0이면 Z2기가 생략되고, z=0이면 Z3기가 생략된다.

본 발명의 목적을 위해, 특히 바람직한 구현예는 i가 2와 같고, j는 1과 같으며, Z2는 0 또는 생략되는 것을 예상한다 (즉, Z3는 존재하지 않는다, 즉 부재한다).

본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, Z1, Z2 및 Z3는 R- 또는 S-리신 (k = 4)이고, i는 바람직하게는 2와 같다.

본 발명의 다량체 펩티드의 바람직한 화학식은 아래의 화학식으로 표시된다 (도 IIa):

(도 IIa)

본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 펩티드는 화학식 (IIb)를 특징으로 하는 사량체 펩티드이다:

(화학식 IIb)

여기서:

- Y1는 수소 원자이고;

- Y2는 D-시스테인이며;

- Y3는 비치환 1차 아마이드기이고

- Z1, Z2 및 Z3는 위에서 정의된 바와 같으며;

- i는 2와 같고;

- j는 1과 같으며; 및

- z는 0과 같다, 즉 부재한다.

편의상, 화학식 IIb를 특징으로 하는 펩티드의 특히 바람직한 구현예는 이 순간부터 iVR1-Cys로 명명될 것이다.

전술한 펩티드는 비제한적인 예시 목적을 갖는 실험 결과에서 - 이러한 맥락에서- 아래에 보고되고 논의된 바와 같이 [Ponticelli et al.]에 의해 기술된 펩티드의 것과 비교하여 개선된, 생물학적 활성, 바람직하게는 조절 활성, 더욱 바람직하게는 혈관신생 및/또는 신혈관신생을 억제하는 활성을 보인다. 앞에서 정의된 바와 같이, 이러한 맥락에서 언급되는 혈관신생 및/또는 신혈관신생은 바람직하게는 VEGFR1-의존성이다.

[Ponticelli et al.]에서 기술된 펩티드는 또한 화학식 (IIc)을 특징으로 하는 사량체 펩티드이다:

(화학식 IIc)

여기서:

- Y1는 수소 원자이고;

- Y2는 글리신이며;

- Y3는 비치환 1차 아마이드기이고

- Z1, Z2 및 Z3는 위에서 정의된 바와 같으며;

- i는 2와 같고;

j는 1과 같으며; 및

- z는 0과 같다.

편의상, 화학식 IIc를 특징으로 하는 펩티드의 특히 바람직한 구현예는 이 순간부터 iVR1로 명명될 것이다.

놀랍게도 본 발명의 발명자들은, 특히 말단 카르복실에서, IVR1를 변형함으로써, 바람직하게는 R-Glu - S-Cys(Bzl) - S-Cha기 또는 α-아미노산, 바람직하게는 적어도 하나의 티올 또는 티올에테르기를 특징으로 하는 α-아미노산으로부터 선택된 α-아미노산, 바람직하게는 표 II에서 보여지는 것들 및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 티올 또는 티올에테르기를 특징으로 하는 상기 α-아미노산을 삽입함으로써, 개선된 생물학적 활성, 바람직하게는 개선된 조절 능력을 특징으로 하는 펩티드를 바람직하게는 위에서 정의된 바와 같이 혈관신생 및/또는 신혈관신생을 억제함으로써 얻는다는 것을 발견하였다.

실제로, 실시예에서 더 자세히 보여지고 논의되는 바와 같이, iVR1-Cys가 용량-의존성 방식으로 PlGF 및 VEGF-A 둘 모두와 VEGFR-1의 상호작용을 억제하는 능력을 입증하였으며, 이는 iVR1에 비해 개선된 능력이다. 특히, iVR1-Cys가 PlGF와 VEGFR-1의 상호작용을 50% 억제할 수 있는 농도 (IC50)는 1000 nM미만인 반면, VEGF-A/VEGFR-1 억제에 대한 IC50은 1000 nM에 가깝거나 그 이상이다. 반면에 iVR1은 10000 nM에 가까운 농도에서 PlGF와 VEGFR-1의 상호작용을 50% (IC50) 억제할 수 있다. 유사하게, iVR1에 의한 VEGF-A/VEGFR-1 억제에 대한 IC50은 10000 nM에 가깝거나 그 이상이다.

그러므로, iVR1-Cys는 iVR1에 대해 보고된 것보다 10배 큰 억제 능력을 보여준다.

뿐만 아니라, 발명자들은 인비보(in vivo) 분석으로 iVR1이 비히클 및 PC에 비해 맥락막 신혈관화의 37.8% 및 39.3% 억제를 일으킨 반면 (p<0.05), iVR1-Cys 이 비히클 및 PC에 비해 48.9% 및 51.0% 억제를 일으킨다는 것 (p<0.02)을 입증하였다. 그러므로, iVR1-Cys는 펩티드 iVR1보다 더 큰 억제 효과를 보여주며, 이는 신혈관화를 19.3% 더 감소시킨다.

마지막으로, 경구로 또는 위관 영양으로 투여되는 경우, 예시로 테스트된 두 펩티드는 비히클에 비해 신혈관화의 상당한 억제를 유도할 수 있다.

[Ponticelli et al.] 및 [Cicatiello et al. 2015]가 유리체내 주사에 의해 맥락막 혈관신생 및 신혈관화를 억제하는 iVR1의 능력을 이미 입증하였지만, 상이한 경로, 특히 위관 영양으로 펩티드를 투여하는 것이, 무엇보다도 안구와 같은 매우 복잡한 기관에서 그리고 조절되지 않는, 바람직하게는 증가된 혈관신생/신혈관신생에 의해 유발되거나 이와 관련된 임의의 경우의 병리에서 치료 효과를 유지하거나 심지어 개선할 수 있다는 것이 절대적으로 예상되지 않았기 때문에 후자의 사실은 특히 관련이 있다. 특히, 언급되는 안구의 신혈관 질환은 바람직하게는 황반 부종, 습성 형태의 노인 황반 변성, 당뇨망막병증, 미숙아 망막증, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 초자체 출혈 및 망막 박리 및 이의 조합으로부터 선택된다.

이러한 증거에 비추어 볼 때, 경구 경로를 통해, 또는 위관 영양에 의한 본 발명의 펩티드 투여는, 예컨대 혈관신생/신혈관신생과 일반적으로 관련된 암과 같은 병리를 치료하는데도 또한 치료적으로 효과적임이 명백하다. 언급되는 혈관신생 또는 신혈관신생은 바람직하게는 VEGFR1-의존성이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 펩티드는 전달을 촉진하거나 개선하기 위해, 바람직하게는 페길레이션(PEGylation), 또는 컨테이너/셔틀/담체 시스템, 바람직하게는 리포좀, 미셀, 캡슐, 에멀젼, 매트릭스, 겔 등을 이용함으로써 변형될 수 있다.

본 발명의 추가 양태는 상세히 기술된 펩티드 및 적어도 하나의 추가적인 약학적으로 허용되는 성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

조성물은 바람직하게는 화학식 IIa를 특징으로 하는 적어도 하나의 펩티드, 더욱 바람직하게는 화학식 IIb를 특징으로 하는 펩티드, 즉, iVR1-Cys를 포함한다.

이러한 맥락에서, 약학적으로 허용되는 성분은 부형제, 희석제, 담체, 보조제, 방부제, 항생제, 항-염증제, 오일, 비타민, 항산화제, 킬레이트제, 가용화제, 점도제, 불활성화 가스, 계면활성제, 유화제, 완충 물질, 면역 억제제, 항-종양제 및 이의 조합으로부터 선택되는 화합물을 의미한다

예를 들면, 구현예에 따르면, 조성물은 적어도 하나의 항-혈관형성/항-신혈관형성 분자, PlGF의 작용을 중화하는 항체, 적어도 하나의 항-VEGFR-1, 항-VEGFR-2, 항-VEGFR-3 항체, 적어도 하나의 항-VEGF-A, 항-VEGF-B, 항-VEGF-C, 항-VEGF-D, 항-VEGF-E 항체 및 이의 조합과 조합된 본 발명의 펩티드를 포함한다.

본 발명의 추가 양태는 약제로서 사용하기 위한, 바람직하게는 화학식 IIa를 특징으로 하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 화학식 IIb를 특징으로 하는 펩티드, 즉 iVR1-Cys에 관한 것이다.

본 발명의 추가 양태는 전술된 바와 같은 상기 펩티드, 바람직하게는 화학식 IIa를 특징으로 하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 화학식 IIb를 특징으로 하는 펩티드, 즉 iVR1-Cys, 또는 부적절한 혈관신생/신-혈관신생과 관련되거나 이에 의해 야기되는 병리적 상태, 즉 혈관신생/신혈관신생이 조절되지 않는; 바람직하게는 증가되었으므로, 억제될 필요가 있는 병리의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기 병리의 치료에 유용한 것 이외에도, 전술된 바와 같은 펩티드, 바람직하게는 화학식 IIa를 특징으로 하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 화학식 IIb를 특징으로 하는 펩티드, 즉, iVR1-Cys, 또는 전술된 바와 같은 상기 펩티드를 포함하는 조성물은 또한 상기 병리에 대한 추가적인 대체 치료적 치료의 후속 조치에 사용될 수 있다.

이전에 이미 언급한 바와 같이, 혈관신생/신혈관신생은, 앞서 정의한 바와 같이, 바람직하게는 VEGFR1 또는 VEGFR1 경로에 의해 의존/ 유도/ 조절된다.

상기 병리/ 상태는 바람직하게는 다음으로부터 선택된다:

- 신혈관 안구 질환으로서, 바람직하게는 황반 부종, 습성 형태의 노인 황반 변성, 당뇨망막병증, 미숙아 망막증, 중심성 망막 정맥 폐쇄 망막증, 초자체 출혈 및 망막 박리 및 이의 조합으로부터 선택되는 신혈관 안구 질환; 및/또는

- 고형 또는 액상 종양 및/또는 종양 전이로서, 바람직하게는 백혈병 및 림프종, 바람직하게는 급성 림프구 백혈병, 급성 비-림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 호지킨 질환, 영아 또는 성인 고형 종양, 뇌 종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 윌름 종양, 골육종 및 연골육종, 폐 종양, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 비뇨계 암, 방광암, 구강 종양, 이자 종양, 흑색종 및 피부 종양, 위 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 후두 종양, 간 종양, 고환 종양으로부터 선택되는 상기 종양; 및/또는

- 바람직하게는 류마티스 관절염, 윤활막염, 연골 및/또는 골 파괴, 골수염, 윤활 조직의 비대 및/또는 과형성, 골증식, 신생물 및/또는 전이의 형성 및 이의 조합으로부터 선택되는 골 또는 관절의 질환; 및/또는

- 혈관 병리로서, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 혈관종, 혈관내피종 및 이의 조합으로부터 선택되는 혈관 병리; 및/또는

- 피부 질환으로서, 바람직하게는 건선, 사마귀, 화농육아종, 모발 성장, 카포시 육종, 상처의 켈로이드, 알러지성 부종, 신생물 및 이의 조합으로부터 선택되는 피부 질환; 및/또는

- 지방 조직의 병리, 바람직하게는 비만에서 관찰되는 혈관 신생; 및/또는

- 당뇨 및/또는 이의 합병증으로서, 바람직하게는 망막증 및/또는 당뇨병성 족부병변; 및/또는

- 조혈 질환, 바람직하게는 AIDS 및/또는 카포시 육종.

전술한 의학적 목적을 위해, 본 발명의 펩티드 및 조성물은 임의로 조합되거나 또한 상기 병리를 치료하기 위해 사용되는 이미 알려진 약물 이전 또는 이후에 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드 및 조성물은 상기 병리를 치료하는데 사용되는 외과적, 방사선 치료 또는 화학 치료 유형의 이미 알려진 치료와 관련될 수 있다.

본 발명의 펩티드 또는 전술된 바와 같은 상기 펩티드를 포함하는 조성물은 임의의 경로를 통해 투여되도록 제형화될 수 있다. 투여 경로는 바람직하게는 전신 경로, 바람직하게는 경구 경로, 위관 영양, 설하 또는 직장 경로, 국소, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내 및 표피내 경로로부터 선택된다.

본 발명의 펩티드 및 조성물은 고체, 예를 들어, 알약, 정제, 과립, 수용성 과립, 펠릿, 비드, 로렌지 등으로 제형화될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 펩티드 또는 조성물은 예를 들어 주사, 흡입제 또는 분무제로 투여될 수 있으며, 액체 용액 또는 드롭제 또는 스프레이로 제형화될 수 있다.

본 발명의 펩티드 또는 전술된 바와 같은 상기 펩티드를 포함하는 조성물은 볼루스로서 투여될 수 있다.

본 발명의 펩티드 또는 전술된 바와 같은 상기 펩티드를 포함하는 조성물은 의료 장치에 의해, 예를 들면 스텐트, 펌프 또는 패치에 의해 투여될 수 있다.

투여는 바람직하게는 안약 전달을 위한 장치를 사용하여 제어 방출 또는 일정 방출에 의해 바람직하게는 연속적일 수 있다.

경구 경로 또는 위관 영양에 의한 투여가 특히 바람직하다. 실제로, 이전에 기술된 바와 같이, iVR1이 포함된 본 발명의 펩티드를 또한 위관 영양으로 투여할 때, 혈관신생/신혈관신생을 억제하는데 효과적임을 보여주었다. 그들은 또한 눈의 혈관신생/신혈관신생을 억제하는데 효과적임을 보여주었다; 즉, iVR1이 포함된 본 발명의 펩티드를 위관 영양으로 투여했을 때, 안구의 혈관신생/신혈관신생 억제가 놀랍게도 관찰되었다. 언급되는 혈관신생/신혈관신생은 바람직하게는 VEGFR1-의존성이다.

이러한 과학적 증거에 비추어 볼 때, 본 발명의 추가 양태는 본 발명의 펩티드, 바람직하게는 도 IIa를 특징으로 하는 적어도 하나의 펩티드, 더욱 바람직하게는 화학식 IIb를 특징으로 하는 펩티드, 즉 iVR1-Cys, 및/또는 화학식 IIc를 특징으로 하는 펩티드, 즉 iVR1, 또는 부적절한, 바람직하게는 증가된, 혈관신생/신혈관신생, 바람직하게는 VEGFR1-의존성에 의해 유발되거나 이와 관련된 임의의 경우의 병리를 치료하는데 사용하기 위한 경구로 또는 위관 영양에 의해 투여되는 상기 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기 병리/ 상태는 바람직하게는 다음으로부터 선택된다:

- 신혈관 안구 질환으로서, 바람직하게는 황반 부종, 습성 형태의 노인 황반 변성, 당뇨망막병증, 미숙아 망막증, 중심성 망막 정맥 폐쇄 망막증, 초자체 출혈 및 망막 박리 및 이의 조합으로부터 선택되는 신혈관 안구 질환; 및/또는

- 고형 종양 및/또는 종양 전이, 바람직하게는 백혈병 및 림프종, 바람직하게는 급성 림프구 백혈병, 급성 비-림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 호지킨 질환, 영아 또는 성인 고형 종양, 뇌 종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 윌름(Wilms) 종양, 골육종 및 연골육종, 폐 종양, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 비뇨계 암, 방광암, 구강 종양, 이자 종양, 흑색종 및 피부 종양, 위 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 후두 종양, 간 종양, 고환 종양으로부터 선택되는 상기 종양; 및/또는

- 골 또는 관절의 질환으로서, 바람직하게는 류마티스 관절염, 윤활막염, 연골 및/또는 골 파괴, 골수염, 윤활 조직의 비대 및/또는 과형성, 골증식, 신생물 및/또는 전이의 형성 및 이의 조합으로부터 선택되는 골 또는 관절의 질환; 및/또는

- 혈관 병리로서, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 혈관종, 혈관내피종 및 이의 조합으로부터 선택되는 혈관 병리; 및/또는

- 피부 질환으로서, 바람직하게는 건선, 사마귀, 화농육아종, 모발 성장, 카포시 육종, 상처의 켈로이드, 알러지성 부종, 신생물 및 이의 조합으로부터 선택되는 피부 질환; 및/또는

- 지방 조직의 병리, 바람직하게는 비만에서 관찰되는 혈관 신생; 및/또는

- 당뇨 및/또는 이의 합병증으로서, 바람직하게는 망막증 및/또는 당뇨병성 족부병변; 및/또는

- 조혈 질환으로서, 바람직하게는 AIDS 및/또는 카포시 육종.

본 발명의 펩티드 또는 조성물은 이를 필요로 하는 임의의 동물, 바람직하게는 VEGFR-1-의존성 신혈관신생을 억제할 필요가 있는 동물에게 투여된다.

상기 동물은 바람직하게는 포유류이고, 더욱 바람직하게는 인간이다.

전술한 바와 같은 펩티드 또는 조성물의 투여되는 유효 용량은 바람직하게는 다음의 범위이다:

- 바람직하게는 전신적으로, 바람직하게는 전신 경장 경로로, 더욱 바람직하게는 경구로, 설하로 또는 직장으로 투여되는 경우, 10 내지 2000 mg/용량; 또는

- 바람직하게는 유리체내 투여되는 경우, 1 내지 100 mg/용량.

대안으로, 투여되는 유효 용량은 바람직하게는 체중의 0.16 내지 33.3 mg/kg 범위이다.

치료 프로그램은 바람직하게는 단일 용량 또는 다중 용량으로 제공된다.

본 발명의 서열은 국제 표준 WIPO ST.25에 따라 주석이 달렸고, 이의 설명은 Patent-In 3.5 프로그램으로 개발되었다. 서열의 설명이 본원에 첨부된다.

본 발명에서, 표 III에서 확인된 서열 및 80 내지 99.9% 범위의 동일성을 갖는 서열이 기술된 것으로 간주되어야 한다.

서열	이름	SEQ ID
atcgaggtcc gcgggaggct cggagcgcgc caggcggaca ctcctctcgg ctcctccccg gcagcggcgg cggctcggag cgggctccgg ggctcgggtg cagcggccag cgggcgcctg gcggcgagga ttacccgggg aagtggttgt ctcctggctg gagccgcgag acgggcgctc agggcgcggg gccggcggcg gcgaacgaga ggacggactc tggcggccgg gtcgttggcc gcggggagcg cgggcaccgg gcgagcaggc cgcgtcgcgc tcaccatggt cagctactgg gacaccgggg tcctgctgtg cgcgctgctc agctgtctgc ttctcacagg atctagttca ggttcaaaat taaaagatcc tgaactgagt ttaaaaggca cccagcacat catgcaagca ggccagacac tgcatctcca atgcaggggg gaagcagccc ataaatggtc tttgcctgaa atggtgagta aggaaagcga aaggctgagc ataactaaat ctgcctgtgg aagaaatggc aaacaattct gcagtacttt aaccttgaac acagctcaag caaaccacac tggcttctac agctgcaaat atctagctgt acctacttca aagaagaagg aaacagaatc tgcaatctat atatttatta gtgatacagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg acctgtgaag 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mvsywdtgvl lcallsclll tgsssgsklk dpelslkgtq himqagqtlh lqcrgeaahk wslpemvske serlsitksa cgrngkqfcs tltlntaqan htgfysckyl avptskkketesaiyifisd tgrpfvemys eipeiihmte grelvipcrv tspnitvtlk kfpldtlipd gkriiwdsrk gfiisnatyk eiglltceat vnghlyktny lthrqtntii dvqistprpv kllrghtlvl nctattplnt rvqmtwsypd eknkrasvrr ridqsnshan ifysvltidk mqnkdkglyt crvrsgpsfk svntsvhiyd kafitvkhrk qqvletvagk rsyrlsmkvk afpspevvwl kdglpateks aryltrgysl iikdvteeda gnytillsik qsnvfknlta tlivnvkpqi yekavssfpd palyplgsrq iltctaygip qptikwfwhp cnhnhsearc dfcsnneesf ildadsnmgn riesitqrma iiegknkmas tlvvadsris giyiciasnk vgtvgrnisf yitdvpngfh vnlekmpteg edlklsctvn kflyrdvtwi llrtvnnrtm hysiskqkma itkehsitln ltimnvslqd sgtyacrarn vytgeeilqk keitirdqea pyllrnlsdh tvaisssttl dchangvpep qitwfknnhk iqqepgiilg pgsstlfier vteedegvyh ckatnqkgsv essayltvqg tsdksnleli tltctcvaat lfwllltlfi rkmkrsssei ktdylsiimd pdevpldeqc erlpydaskw efarerlklg kslgrgafgk vvqasafgik ksptcrtvav kmlkegatas eykalmtelk ilthighhln vvnllgactk qggplmvive yckygnlsny lkskrdlffl nkdaalhmep kkekmepgle qgkkprldsv tssesfassg fqedkslsdv eeeedsdgfy kepitmedli sysfqvargm eflssrkcih rdlaarnill sennvvkicd fglardiykn pdyvrkgdtr lplkwmapes ifdkiystks dvwsygvllw eifslggspy pgvqmdedfc srlregmrmr apeystpeiy qimldcwhrd pkerprfael veklgdllqa nvqqdgkdyi pinailtgns gftystpafs edffkesisa pkfnsgssdd vryvnafkfm sleriktfee llpnatsmfd dyqgdsstll aspmlkrftw tdskpkaslk idlrvtsksk esglsdvsrp sfchsscghv segkrrftyd haelerkiac cspppdynsv vlystppi	전장 인간 VEGFR1 단백질	SEQ ID NO: 2
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctcacaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc actctaattg tcaatgtgaa accccagatt tacgaaaagg ccgtgtcatc gtttccagac ccggctctct acccactggg cagcagacaa atcctgactt gtaccgcata tggtatccct caacctacaa tcaagtggtt ctggcacccc tgtaaccata atcattccga agcaaggtgt gacttttgtt ccaataatga agagtccttt atcctggatg ctgacagcaa catgggaaac agaattgaga gcatcactca gcgcatggca ataatagaag gaaagaataa gcttccacca gctaacagtt ctttcatgtt gccacctaca agcttctctt ccaactactt ccatttcctt ccgtga	수용성 인간 VEGFR1 mRNA	SEQ ID NO: 3
mvsywdtgvl lcallsclll tgsssgsklk dpelslkgtq himqagqtlh lqcrgeaahkwslpemvske serlsitksa cgrngkqfcs tltlntaqan htgfysckyl avptskkket esaiyifisd tgrpfvemys eipeiihmte grelvipcrv tspnitvtlk kfpldtlipd gkriiwdsrk gfiisnatyk eiglltceat vnghlyktny lthrqtntii dvqistprpv kllrghtlvl nctattplnt rvqmtwsypd eknkrasvrr ridqsnshan ifysvltidk mqnkdkglyt crvrsgpsfk svntsvhiyd kafitvkhrk qqvletvagk rsyrlsmkvk afpspevvwl kdglpateks aryltrgysl iikdvteeda gnytillsik qsnvfknlta tlivnvkpqi yekavssfpd palyplgsrq iltctaygip qptikwfwhp cnhnhsearc dfcsnneesf ildadsnmgn riesitqrma iiegknklpp anssfmlppt sfssnyfhflp	수용성 인간 VEGFR1 단백질	SEQ ID NO: 4

실시예

VEGF-A/VEGFR1및 PlGF/VEGFR-1 상호작용의 용량-의존성 억제.

PlGF 또는 VEGF-A와 VEGFR-1 수용체의 결합을 시험하는 분석은 ELISA 방법 [Ponticelli et al., JBC. 2008 Dec 5;283(49):34250-9]을 기반으로 하며, R&D 시스템에서 획득한 시약을 사용하여 수행하였다.

인간 재조합 수용체 VEGFR-1, 특히 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 (R&D 시스템, cat No. 321-FL) 수용체의 7개의 세포외 도메인으로 이루어진 형태는, PBS pH 7.5 (100 μl/well)에서 16시간 동안 실온 (RT)에서 0.5 μg/ml의 농도 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 부착되도록 만들어졌다.

PBET (PBS pH 7.5, BSA 0.1%, EDTA 5mM, Tween 0.004%)에서 3% BSA, 5 ng/ml의 재조합 PlGF (R&D 시스템, cat No. 264-PG), 또는 인간 기원의 5 ng/ml의 재조합 VEGF-A (R&D 시스템, cat No. 293-VE)을 포함하는 PBS pH 7.5로 이루어진 완충 용액을 사용하여 비-특이적 결합 부위를 웰에서 차단한 후, 수용체가 부착된 웰에 첨가하였다.

리간드, 즉 PlGF 또는 VEGF-A와 동시에, 점진적 용량의 iVR1, iVR1-Cys 또는 대조군 펩티드 (PC - [(S-Ser)-(S-Ala)-(S-Cha) iVR1 펩티드의 구조와 동일한 사량체 구조를 갖는 트리펩티드])를 780 내지 50000 nM의 농도로 첨가하였다. 결합 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행한 후, 실온에서 1시간 동안 수행하였다.

결합 및/또는 경쟁 단계의 마지막에, 항-인간-PlGF 비오틴화된 다클론 항체 (R&D 시스템, cat No. BAF264) 또는 항-인간-VEGF-A (R&D 시스템, cat No. BAF293)를 PBET에서 300 ng/ml의 농도로 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 배양에 이어서, 실온에서 1시간 후, HRP-접합 아비딘-스트렙트아비딘 시스템 (Vectastain elite ABC kit)과 HRP용 기질(o-페닐렌디아민 - Sigma, cat No. P1526)을 웰에 첨가하였다. 490 nM에서 흡광도를 측정하여 정량화를 수행하였다.

펩티드의 모든 억제 활성은 사량체 펩티드의 존재하에 수용체에 대한 PlGF 또는 VEGF-A의 결합에 대해 얻은 데이터를 동일하지 않은 경우와 비교하여 잔류 결합의 %로 표현하였다. iVR1은 PlGF/VEGFR-1 또는 VEGF-A/VEGFR-1 상호작용의 억제에 대한 양성 조절을 나타내었다.

결과는 표 IV 및 표 V에 제공되며, iVR1-Cys가 용량-의존성 방식으로 PlGF 및 VEGF-A 둘 모두와 VEGFR-1의 상호작용을 억제하는 능력을 입증하였다는 것을 보여준다.

iVR1-Cys가 PlGF와 VEGFR-1의 상호작용을 50% 억제할 수 있는 농도 (IC ₅₀ )는 1000 nM 미만인 반면, VEGF-A/VEGFR-1에 대한 IC50는 1000 nM에 가깝거나 그 이상이다.

그러므로, iVR1-Cys는 iVR1의 것보다 10배 큰 억제 능력을 갖고, 따라서 혈관신생/신혈관신생 억제와 관련된 동일한 인비트로 및 인비보 실험 프로토콜에서 iVR1로 얻은 것과 동일한 효과를 얻기 위해 10배 적은 용량이 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

PC는 억제하지 않는다.

- PlGF/VEGFR-1 상호작용의 용량-의존성 억제

	결합 %
펩티드 [nM]	iVR1-Cys	iVR1	PC
780	83.82	99.36	98.88
1560	35.50	101.32	102.35
3125	25.54	96.10	99.53
6250	14.09	68.49	93.82
12500	12.59	44.57	87.21
25000	10.27	36.02	88.55
50000	9.18	26.26	90.16

- VEGF-A/VEGFR-1 상호작용의 용량-의존성 억제

	결합 %
펩티드 [nM]	iVR1-Cys	iVR1	PC
780	92.32	98.36	100.09
1560	43.71	96.21	102.59
3125	21.70	93.93	95.20
6250	12.50	66.00	91.37
12500	9.81	37.02	100.04
25000	7.99	21.45	93.44
50000	6.50	8.60	87.93

VEGF-A/VEGFR-1 결합을 억제하는 화학식 (II)을 갖지만, Y2가 D-시스테인과 상이한, 사량체 펩티드의 능력을 전술한 결합 분석으로 평가하였다. 펩티드의 Y2 및 VEGF-A/VEGFR-1 상호작용의 억제에 대한 각각의 IC₅₀는 표 VI에 표시되어 있다.

- 상호작용 VEGF-A/VEGFR-1의 억제 IC₅₀

Y2	IC 50 , μM
L-시스테인	2.03 ± 0.2
L-메티오닌	2.15 ± 1.0
D-메티오닌	2.89 ± 1.2
L-메티오닌 설폭사이드	15.7 ± 2.1
L-메티오닌 설폰	4.62 ± 1.4
D-세린	2.43 ± 03
L-세린	2.90 ± 0.5
D-트레오닌	2.60 ± 0.6
L-트레오닌	1.29 ± 0.5

VEGFR-1의 PlGF-유도 인산화의 억제.

펩티드 iVR1-Cys의 억제 능력을 평가하고 그 활성을 iVR1의 활성과 비교하기 위해 수용체 VEGFR-1의 PlGF-유도 인산화 분석을 수행하였다.

VEGFR-1의 활성화를 위해, HEK-293 세포로부터 안정적인 형질 감염을 통해 293-VEGFR-1라는 수용체를 과발현하는 세포주를 사용하였다 [(Errico, M. et al. 2004 JBC, 279: 43929-43939)].

이러한 목적을 위해, 293-VEGFR-1 세포를 하위융합(subconfluence)에 도달할 때까지 배양한 후, 혈청이 없는 배양 배지에서 적어도 16시간 동안 보관/배양하여 세포를 '굶겼다.'.

굶주림 단계의 마지막에, 배양 배지를 제거하고 세포 단층을 Na₃VO₄ 100 μM과 함께 5분 동안 배양하여 내인성 포스파타제의 활성을 억제하였다.

그 다음, 세포를 37℃에서 10분 동안 굶주림에 사용된 배지에서 (1) 20 ng/ml로 PlGF 단독으로 자극하고, (2) 5 μM 농도의 펩티드 존재하에 자극하였다.

억제 대조군으로서, 3.3 nM의 농도로 항-인간-PlGF 중화 단일 클론 항체 (Thrombogenics)를 사용하였다. 음성 대조군로서 PBS를 사용하였다.

배양 마지막에, 세포를 차가운 Na₃VO₄ 100 μM로 세척한 다음, Tris-HCl 20 mM pH 8, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton-X100, 10% 글리세롤, 아연 아세테이트 10 mM, Na₃VO₄ 100 μM 및 프로테아제 억제제의 혼합물로 구성된 완충액에서 용해시키고, 부드럽게 교반하면서 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막에, 세포 용해물을 12000xg에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. Bio-Rad 시약을 사용하여 추출물의 정량화를 Bradford 방법으로 수행하였다. 100 μg의 모든 단백질 추출물 SDS-PAGE에 로딩하여 8.5%로 줄인 후, 웨스턴 블롯팅으로 단백질 분석 표준 방법을 수행하였다.

1:500으로 희석된 항-p-VEGFR-1 항체 (R&D 시스템, cat. No. AF4170)를 사용하여 인산화된 VEGFR-1을 검출하고, 1:500으로 희석된 항-VEGFR-1 항체 (Sigma-Aldrich, cat. No. V4262)를 사용하여 인산화되지 않은 형태의 수용체를 검출해서 정규화를 수행하였다.

도 1에서 보이는 바와 같이, 결합 분석 (실시예 1 참조)에서 측정된 IC₅₀ 보다 약 5배 높은 농도 (5000 nM)로 사용된 펩티드 iVR1-Cys는, 중화 항체로 얻은 것과 유사하고 동일 농도를 사용하여 iVR1로 얻은 것보다 확실히 더 큰 수용체의 인산화 억제를 강력하게 일으킨다.

iVR1 및 iVR1-Cys의 유리체내 및 경구 (위관 영양) 투여에 의한 맥락막 신혈관화의 억제.

레이저-유도 맥락막 신혈관화의 실험 모델은 Bruch 막에 손상을 일으켜 망막의 색소 상피 (RPE)에서 맥락막을 분리한다. 이 손상은 레이저-유도 화상에 의해 유발되어, Bruch 막의 천공을 일으켜, 맥락막에서 시작하여 위에 있는 망막 조직을 침범하는 새로운 혈관의 성장인 맥락막 혈관화를 활성화한다. 이 마우스 모델은 인간 노인 황반 변성 (AMD)의 삼출성 형태의 주요 특징을 요약하며, 실제로 흔히 AMD의 전임상 모델로 사용된다. 관심 분자의 항-혈관형성 활성을 평가할 수 있다.

마우스의 안저를 시각화하고 레이저 손상을 유도하기 위해, 아래 기술된 실험 절차에 따라 Micron IV 통합 시스템을 사용하였다.

우선, 0.5% Tropicamide 안구 드롭제를 도포하여 동물의 동공 확장을 유도하였다. 케타민 및 자일라진 용액 (각각 80 mg/Kg 및 10 mg/Kg)을 복강내 주사하여 동물을 마취하였다. 진정되면, 동물을 스탠드에 놓고, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 2.5% 수용액을 양쪽 눈에 도포하였다. Micron IV의 카메라 렌즈를 용액과 접촉시켜 (액침 대물렌즈가 있는 현미경에서 사용하는 것과 유사한 절차), 각막의 탈수를 방지하고 안저의 가시성을 향상시키는 이중 기능을 가지고 있다.

레이저로 손상을 유도하기 위해, 우선, 레이저 포인터를 활성화하고 초점을 맞춰 RPE 레이어를 기준으로 사용하여 레이저 빔을 적용한다. 레이저 빔이 적용되는 영역은 출혈 가능성을 방지하기 위해 망막의 주요 혈관에서 멀리 떨어져 있어야 한다. Bruch 막 수준에서의 화상 효율은 레이저 빔의 적용 직후에 기포의 형성으로 확인된다. 레이저 빔의 적용 조건은 100 msec 동안 200mW의 출력이었다.

[Lambert et al. (Nature Protocols, 2013, 8:2197)]의 기사에 잘 요약된, 문헌에 제시된 데이터로부터, 이 실험 모델에서 최대 신-혈관화는 손상 7일 후에 얻어지는 것으로 알려져있다.

C57Bl6/J 마우스를 사용하였고, 그룹당 n = 5이었다. 레이저 손상 유도 절차 마지막에, 유리체내 주사를 즉시 수행하고, 10 및 50 μg의 iVR1-Cys 또는 iVR1, 및 1 μL의 DMSO 중 50 μg의 PC를 32g 바늘이 있는 Hamilton 주사기를 이용하여 투여하였다. 대조군으로서 DMSO를 자체적으로 주입하였다.

7일 후 동물을 희생시키고 안구를 적출하여 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그 후, 입체 현미경하에 각막, 홍채 및 수정체로 이루어진 안구의 앞부분을 제거하였다. 공막, 맥락막, RPE 및 망막으로 이루어진, '안구-컵(eye-cups)' 또는 후안부로 정의되는 나머지 부분을 0.7% FITC-Griffonia simplicifolia Isolectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)의 존재하에 16시간 동안 배양하였다. 일련의 세척 후, 망막을 제거하고, 형광 현미경하에 관찰하기 위해 슬라이드에 장착할 수 있는, RPE/맥락막에 4개의 컷을 만든다. 맥락막 신혈관화의 정량화를 부피 측면에서 수행한다. 모든 지점의 부피를 평가하기 위해, RPE 세포 수준에서 상부 표면에 가장 깊은 초점면까지 1 μm의 두께의 일련의 이미지를 각각 얻는다 (Z-Satcks, 약 20-25개의 이미지). 형광의 부피는 ImageJ 프로그램 (NIH, Bethesda, MD)을 사용하여 측정되고, 모든 단일 평면의 형광 영역을 취합한다.

CNV의 정량화를 iVR1 10μg 및 50μg의 경우 n = 12 및 15 지점; iVR1-Cys 10μg 및 50μg의 경우 n = 10 및 8 지점; PC의 경우 n = 15 지점 및 DMSO의 경우 n = 14 지점에서 수행하였다. 도 2에서 주어진 결과는 두 펩티드가 용량-의존성으로 신혈관화의 억제를 일으킬 수 있음을 보여준다. 더 높은 용량 (50μg)으로, 강력하고, 상당하며, 비교할 만한 신혈관화 억제 능력을 얻었다: iVR1-Cys -75.9% 및 -74.6 % 대 비히클 및 PC (p > 0.002); iVR1 -73.9% 및 -76.5 % 대 비히클 및 PC (p > 0.0002).

10 μg의 투여에서, iVR1는 비히클 및 PC에 비해 신혈관화의 37.8% 및 39.3% 억제를 일으킨 반면 (p<0.05), iVR1-Cys는 비히클 및 PC에 비해 48.9% 및 51.0% 억제를 일으킨다 (p<0.02). 그러므로, 낮은 농도에서, 펩티드 iVR1-Cys는 펩티드 iVR1보다 더 큰 억제 효과를 입증하였으며, 이는 신혈관화를 19.3% 더 감소시킨다. 따라서, 펩티드의 억제 능력의 최대 임계는 사용된 더 높은 투여량에서 도달했을 가능성이 있다.

경구 투여 (위관 영양)에 대한 실험의 경우, 전술한 실험 절차에 따라, 그룹당 n = 5의 C57Bl6/J 마우스에서 맥락막 신혈관화를 유도하였다. 손상 유도 직후, 동물 마취에서 회복되자마자 실험 프로토콜에 의해 제공된 7일 동안 하루에 2번, 펩티드 iVR1 및 iVR1-Cys 및 비히클의 투여를 시작하였다. 복강내 투여된 펩티드 iVR1에 대해 이전에 얻은 데이터를 기반으로, 펩티드를 50 mg/Kg으로 투여하였다 [(Cicatiello et al. 2015, Oncotarget, 6, 10563-10576)].

경구 투여를 가능하게하기 위해, 펩티드를 DMSO에 용해시킨 다음, Nutilis 식품 증정제와 혼합하여, 9부 Nutilis 및 1부 DMSO로 이루어진 최종 혼합물을 얻었다.

DMSO 혼합물에서 200μl의 9:1 Nutilis/물질을 매 1회 투여할 때마다 사용할 수 있도록 하는 농도로 물질을 제조하였고, 20 게이지 구멍이 있는 위관 영양에 적합한 바늘을 사용하여 동물 위장에 직접 투여하였다. 대조군에서, 200 μl의 9:1 Nutilis/DMSO 혼합물을 투여하였다.

실험 마지막에, 동물을 희생시키고, 안구를 제거하고 해부하여, RPE-맥락막을 분리하고, 후술하는 바와 같이, 면역형광분석에 의해 CNV의 부피를 측정하였다.

CNV의 정량화를 iVR1-Cys의 경우 n = 18 지점, iVR1의 경우 n = 20 지점 및 비히클의 경우 n = 10 지점에서 수행하였다.

결과는 도 3에서 제시되며, 펩티드 iVR1-Cys가 iVR1 (-49.7%, p = 0.001)에 대해 관찰된 것과 유사한 수준에서, 비히클 (-45.9%, p = 0.007)에 비해 신혈관화의 상당한 억제를 유도할 수 있음을 입증한다.

iVR1-Cys 의 혈청 프로테아제 안정성.

[Ponticelli et al.]에서 기술된 바와 같이, [Ponticelli et al., J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34250-9]에 기술된 RP-HPLC 크로마토그래피에 기반한 방법에 따라, 10% 혈청(송아지 태아 혈청, FCS에서 50 mM 인산염 완충 용액, pH 7.3, 168시간에 펩티드 iVR1-Cysd의 안정성을 측정하였다.

완전한 용해를 위해 0.1 μmol/L 내지 1000 μmol/L 사이의 농도를 증가시키면서 DMSO에 화합물을 용해시켜 기준 곡선을 구성하였다. 10 μmol/L의 초기 농도에서 10% FCS와 접촉한 상태로 둔 분자의 농도는 t = 0에서 3개의 분취량을 회수한 다음, 매 시간 처음 12시간 그리고 그 다음, 24, 72, 120 및 168시간에 측정하였다다. 분취량을 0.1 M 아세트산으로 1:1 희석하여 알부민에 결합된 펩티드를 분리하고, 원심분리하여 임의의 침전물을 제거하며, [Ponticelli et al]에서 보고된 조건하에 RP-HPLC로 분석하였다. 초기 양에 대한 백분율로 표현되는 분취량에서 검출된 잔류 펩티드의 양을 시간 함수로서 표시하였다. 결과는 표 VII에서 3개의 측정값 ± 표준 편차 (SD)의 평균으로서 표시된다.

시간 (시)	% 잔류 펩티드 ± SD
0	101 ± 4
1	100 ± 11
2	99 ± 7
3	98 ± 5
4	97 ± 4
5	96 ± 5
6	99 ± 6
7	95 ± 8
8	96 ± 5
9	95 ± 6
10	94 ± 10
11	94 ± 8
12	93 ± 4
24	93 ± 6
72	92 ± 7
120	91 ± 5
168	92 ± 8

SEQUENCE LISTING <110> Anbition srl <120> Peptidi ed usi medici correlati <130> 21.A0615.12.WO.1 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR1 umano intero <400> 1 atcgaggtcc gcgggaggct cggagcgcgc caggcggaca ctcctctcgg ctcctccccg 60 gcagcggcgg cggctcggag cgggctccgg ggctcgggtg cagcggccag cgggcgcctg 120 gcggcgagga ttacccgggg aagtggttgt ctcctggctg gagccgcgag acgggcgctc 180 agggcgcggg gccggcggcg gcgaacgaga ggacggactc tggcggccgg gtcgttggcc 240 gcggggagcg cgggcaccgg gcgagcaggc cgcgtcgcgc tcaccatggt cagctactgg 300 gacaccgggg tcctgctgtg cgcgctgctc agctgtctgc ttctcacagg atctagttca 360 ggttcaaaat taaaagatcc tgaactgagt ttaaaaggca cccagcacat catgcaagca 420 ggccagacac tgcatctcca atgcaggggg gaagcagccc ataaatggtc tttgcctgaa 480 atggtgagta aggaaagcga aaggctgagc ataactaaat ctgcctgtgg aagaaatggc 540 aaacaattct gcagtacttt aaccttgaac acagctcaag caaaccacac tggcttctac 600 agctgcaaat atctagctgt acctacttca aagaagaagg aaacagaatc tgcaatctat 660 atatttatta gtgatacagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 720 atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 780 actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 840 tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 900 acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 960 accaatacaa tcatagatgt ccaaataagc acaccacgcc cagtcaaatt acttagaggc 1020 catactcttg tcctcaattg tactgctacc actcccttga acacgagagt tcaaatgacc 1080 tggagttacc ctgatgaaaa aaataagaga gcttccgtaa ggcgacgaat tgaccaaagc 1140 aattcccatg ccaacatatt ctacagtgtt cttactattg acaaaatgca gaacaaagac 1200 aaaggacttt atacttgtcg tgtaaggagt ggaccatcat tcaaatctgt taacacctca 1260 gtgcatatat atgataaagc attcatcact gtgaaacatc gaaaacagca ggtgcttgaa 1320 accgtagctg gcaagcggtc ttaccggctc tctatgaaag tgaaggcatt tccctcgccg 1380 gaagttgtat ggttaaaaga tgggttacct gcgactgaga aatctgctcg ctatttgact 1440 cgtggctact cgttaattat caaggacgta actgaagagg atgcagggaa ttatacaatc 1500 ttgctgagca taaaacagtc aaatgtgttt aaaaacctca ctgccactct aattgtcaat 1560 gtgaaacccc agatttacga aaaggccgtg tcatcgtttc cagacccggc tctctaccca 1620 ctgggcagca gacaaatcct gacttgtacc gcatatggta tccctcaacc tacaatcaag 1680 tggttctggc acccctgtaa ccataatcat tccgaagcaa ggtgtgactt ttgttccaat 1740 aatgaagagt cctttatcct ggatgctgac agcaacatgg gaaacagaat tgagagcatc 1800 actcagcgca tggcaataat agaaggaaag aataagatgg ctagcacctt ggttgtggct 1860 gactctagaa tttctggaat ctacatttgc atagcttcca ataaagttgg gactgtggga 1920 agaaacataa gcttttatat cacagatgtg ccaaatgggt ttcatgttaa cttggaaaaa 1980 atgccgacgg aaggagagga cctgaaactg tcttgcacag ttaacaagtt cttatacaga 2040 gacgttactt ggattttact gcggacagtt aataacagaa caatgcacta cagtattagc 2100 aagcaaaaaa tggccatcac taaggagcac tccatcactc ttaatcttac catcatgaat 2160 gtttccctgc aagattcagg cacctatgcc tgcagagcca ggaatgtata cacaggggaa 2220 gaaatcctcc agaagaaaga aattacaatc agagatcagg aagcaccata cctcctgcga 2280 aacctcagtg atcacacagt ggccatcagc agttccacca ctttagactg tcatgctaat 2340 ggtgtccccg agcctcagat cacttggttt aaaaacaacc acaaaataca acaagagcct 2400 ggaattattt taggaccagg aagcagcacg ctgtttattg aaagagtcac agaagaggat 2460 gaaggtgtct atcactgcaa agccaccaac cagaagggct ctgtggaaag ttcagcatac 2520 ctcactgttc aaggaacctc ggacaagtct aatctggagc tgatcactct aacatgcacc 2580 tgtgtggctg cgactctctt ctggctccta ttaaccctct ttatccgaaa aatgaaaagg 2640 tcttcttctg aaataaagac tgactaccta tcaattataa tggacccaga tgaagttcct 2700 ttggatgagc agtgtgagcg gctcccttat gatgccagca agtgggagtt tgcccgggag 2760 agacttaaac tgggcaaatc acttggaaga ggggcttttg gaaaagtggt tcaagcatca 2820 gcatttggca ttaagaaatc acctacgtgc cggactgtgg ctgtgaaaat gctgaaagag 2880 ggggccacgg ccagcgagta caaagctctg atgactgagc taaaaatctt gacccacatt 2940 ggccaccatc tgaacgtggt taacctgctg ggagcctgca ccaagcaagg agggcctctg 3000 atggtgattg ttgaatactg caaatatgga aatctctcca actacctcaa gagcaaacgt 3060 gacttatttt ttctcaacaa ggatgcagca ctacacatgg agcctaagaa agaaaaaatg 3120 gagccaggcc tggaacaagg caagaaacca agactagata gcgtcaccag cagcgaaagc 3180 tttgcgagct ccggctttca ggaagataaa agtctgagtg atgttgagga agaggaggat 3240 tctgacggtt tctacaagga gcccatcact atggaagatc tgatttctta cagttttcaa 3300 gtggccagag gcatggagtt cctgtcttcc agaaagtgca ttcatcggga cctggcagcg 3360 agaaacattc ttttatctga gaacaacgtg gtgaagattt gtgattttgg ccttgcccgg 3420 gatatttata agaaccccga ttatgtgaga aaaggagata ctcgacttcc tctgaaatgg 3480 atggctcctg aatctatctt tgacaaaatc tacagcacca agagcgacgt gtggtcttac 3540 ggagtattgc tgtgggaaat cttctcctta ggtgggtctc catacccagg agtacaaatg 3600 gatgaggact tttgcagtcg cctgagggaa ggcatgagga tgagagctcc tgagtactct 3660 actcctgaaa tctatcagat catgctggac tgctggcaca gagacccaaa agaaaggcca 3720 agatttgcag aacttgtgga aaaactaggt gatttgcttc aagcaaatgt acaacaggat 3780 ggtaaagact acatcccaat caatgccata ctgacaggaa atagtgggtt tacatactca 3840 actcctgcct tctctgagga cttcttcaag gaaagtattt cagctccgaa gtttaattca 3900 ggaagctctg atgatgtcag atacgtaaat gctttcaagt tcatgagcct ggaaagaatc 3960 aaaacctttg aagaactttt accgaatgcc acctccatgt ttgatgacta ccagggcgac 4020 agcagcactc tgttggcctc tcccatgctg aagcgcttca cctggactga cagcaaaccc 4080 aaggcctcgc tcaagattga cttgagagta accagtaaaa gtaaggagtc ggggctgtct 4140 gatgtcagca ggcccagttt ctgccattcc agctgtgggc acgtcagcga aggcaagcgc 4200 aggttcacct acgaccacgc tgagctggaa aggaaaatcg cgtgctgctc cccgccccca 4260 gactacaact cggtggtcct gtactccacc ccacccatct agagtttgac acgaagcctt 4320 atttctagaa gcacatgtgt atttataccc ccaggaaact agcttttgcc agtattatgc 4380 atatataagt ttacaccttt atctttccat gggagccagc tgctttttgt gattttttta 4440 atagtgcttt tttttttttg actaacaaga atgtaactcc agatagagaa atagtgacaa 4500 gtgaagaaca ctactgctaa atcctcatgt tactcagtgt tagagaaatc cttcctaaac 4560 ccaatgactt ccctgctcca acccccgcca cctcagggca cgcaggacca gtttgattga 4620 ggagctgcac tgatcaccca atgcatcacg taccccactg ggccagccct gcagcccaaa 4680 acccagggca acaagcccgt tagccccagg gatcactggc tggcctgagc aacatctcgg 4740 gagtcctcta gcaggcctaa gacatgtgag gaggaaaagg aaaaaaagca aaaagcaagg 4800 gagaaaagag aaaccgggag aaggcatgag aaagaatttg agacgcacca tgtgggcacg 4860 gagggggacg gggctcagca atgccatttc agtggcttcc cagctctgac ccttctacat 4920 ttgagggccc agccaggagc agatggacag cgatgagggg acattttctg gattctggga 4980 ggcaagaaaa ggacaaatat cttttttgga actaaagcaa attttagaac tttacctatg 5040 gaagtggttc tatgtccatt ctcattcgtg gcatgttttg atttgtagca ctgagggtgg 5100 cactcaactc tgagcccata cttttggctc ctctagtaag atgcactgaa aacttagcca 5160 gagttaggtt gtctccaggc catgatggcc ttacactgaa aatgtcacat tctattttgg 5220 gtattaatat atagtccaga cacttaactc aatttcttgg tattattctg ttttgcacag 5280 ttagttgtga aagaaagctg agaagaatga aaatgcagtc ctgaggagag gagttttctc 5340 catatcaaaa cgagggctga tggaggaaaa aggtcaataa ggtcaaggga aaaccccgtc 5400 tctataccaa ccaaaccaat tcaccaacac agttgggacc caaaacacag gaagtcagtc 5460 acgtttcctt ttcatttaat ggggattcca ctatctcaca ctaatctgaa aggatgtgga 5520 agagcattag ctggcgcata ttaagcactt taagctcctt gagtaaaaag gtggtatgta 5580 atttatgcaa ggtatttctc cagttgggac tcaggatatt agttaatgag ccatcactag 5640 aagaaaagcc cattttcaac tgctttgaaa cttgcctggg gtctgagcat gatgggaata 5700 gggagacagg gtaggaaagg gcgcctactc ttcagggtct aaagatcaag tgggccttgg 5760 atcgctaagc tggctctgtt tgatgctatt tatgcaagtt agggtctatg tatttatgat 5820 gtctgcacct tctgcagcca gtcagaagct ggagaggcaa cagtggattg ctgcttcttg 5880 gggagaagag tatgcttcct tttatccatg taatttaact gtagaacctg agctctaagt 5940 aaccgaagaa tgtatgcctc tgttcttatg tgccacatcc ttgtttaaag gctctctgta 6000 tgaagagatg ggaccgtcat cagcacattc cctagtgagc ctactggctc ctggcagcgg 6060 cttttgtgga agactcacta gccagaagag aggagtggga cagtcctctc caccaagatc 6120 taaatccaaa caaaagcagg ctagagccag aagagaggac aaatctttgt tcttcctctt 6180 ctttacatac gcaaaccacc tgtgacagct ggcaatttta taaatcaggt aactggaagg 6240 aggttaaaca cagaaaaaag aagacctcag tcaattctct actttttttt ttttttccaa 6300 atcagataat agcccagcaa atagtgataa caaataaaac cttagctatt catgtcttga 6360 tttcaataat taattcttaa tcattaagag accataataa atactccttt tcaagagaaa 6420 agcaaaacca ttagaattgt tactcagctc cttcaaactc aggtttgtag catacatgag 6480 tccatccatc agtcaaagaa tggttccatc tggagtctta atgtagaaag aaaaatggag 6540 acttgtaata atgagctagt tacaaagtgc ttgttcatta aaatagcact gaaaattgaa 6600 acatgaatta actgataata ttccaatcat ttgccattta tgacaaaaat ggttggcact 6660 aacaaagaac gagcacttcc tttcagagtt tctgagataa tgtacgtgga acagtctggg 6720 tggaatgggg ctgaaaccat gtgcaagtct gtgtcttgtc agtccaagaa gtgacaccga 6780 gatgttaatt ttagggaccc gtgccttgtt tcctagccca caagaatgca aacatcaaac 6840 agatactcgc tagcctcatt taaattgatt aaaggaggag tgcatctttg gccgacagtg 6900 gtgtaactgt atgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgggt gtatgtgtgt 6960 tttgtgcata actatttaag gaaactggaa ttttaaagtt acttttatac aaaccaagaa 7020 tatatgctac agatataaga cagacatggt ttggtcctat atttctagtc atgatgaatg 7080 tattttgtat accatcttca tataataaac ttccaaaaac aca 7123 <210> 2 <211> 1338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR1 umano intero <400> 2 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr 35 40 45 Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val 355 360 365 Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380 Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400 Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys 405 410 415 Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu 420 425 430 Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile 450 455 460 Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys 465 470 475 480 Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495 Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile 500 505 510 Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg 515 520 525 Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val 530 535 540 Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His 545 550 555 560 Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser 565 570 575 Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu 580 585 590 Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys 595 600 605 Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met 610 615 620 Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn 625 630 635 640 Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg 645 650 655 Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val 660 665 670 Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro 675 680 685 Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu 690 695 700 Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg 705 710 715 720 Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln 725 730 735 Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser 740 745 750 Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala 755 760 765 Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Phe Ile Arg Lys Met Lys 770 775 780 Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg 995 1000 1005 Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile 1025 1030 1035 Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr 1040 1045 1050 Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1055 1060 1065 Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp 1070 1075 1080 Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser 1085 1090 1095 Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu 1100 1105 1110 Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu 1115 1120 1125 Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu 1130 1135 1140 Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu 1145 1150 1155 Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala 1175 1180 1185 Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe 1190 1195 1200 Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys 1205 1210 1215 Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro 1220 1225 1230 Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser 1250 1255 1260 Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys 1265 1270 1275 Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys 1280 1285 1290 His Ser Ser Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr 1295 1300 1305 Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro 1310 1315 1320 Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1325 1330 1335 <210> 3 <211> 1626 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR1 umano solubile <400> 3 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120 cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180 tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240 tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300 cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360 gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420 gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480 acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540 ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600 gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660 ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720 aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780 agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840 cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900 atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960 tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa 1020 cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag 1080 gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct 1140 gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca 1200 gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc 1260 actctaattg tcaatgtgaa accccagatt tacgaaaagg ccgtgtcatc gtttccagac 1320 ccggctctct acccactggg cagcagacaa atcctgactt gtaccgcata tggtatccct 1380 caacctacaa tcaagtggtt ctggcacccc tgtaaccata atcattccga agcaaggtgt 1440 gacttttgtt ccaataatga agagtccttt atcctggatg ctgacagcaa catgggaaac 1500 agaattgaga gcatcactca gcgcatggca ataatagaag gaaagaataa gcttccacca 1560 gctaacagtt ctttcatgtt gccacctaca agcttctctt ccaactactt ccatttcctt 1620 ccgtga 1626 <210> 4 <211> 541 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR1 umano solubile <400> 4 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr 35 40 45 Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val 355 360 365 Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380 Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400 Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys 405 410 415 Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu 420 425 430 Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile 450 455 460 Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys 465 470 475 480 Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495 Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile 500 505 510 Glu Gly Lys Asn Lys Leu Pro Pro Ala Asn Ser Ser Phe Met Leu Pro 515 520 525 Pro Thr Ser Phe Ser Ser Asn Tyr Phe His Phe Leu Pro 530 535 540

Claims (9)

1. 다음의 화학식 (II)을 특징으로 하는 분리된 펩티드로서,
   {{{[Y1 - Glu - Cys(Bzl) - Cha]2 - Z1}i - Z2 }j - Z3 }z - Y2 - Y3
   (화학식 II)
   여기서
   - Y1은 아미노 말단 펩티드 관능기(NH₂) 또는 D-알라닌, D-아스파르트산, D-발린, D-글루탐산, L-시클로헥실-알라닌, D-페닐알라닌, D-트레오닌, D-메티오닌, D-리신, D-시스테인(S-아세트아미도메틸), D-티로신, D-프롤린, D-류신, D-아르기닌, D-아스파라긴, D-이소류신, D-아르기닌(N^Γ-토실), D-세린, L-시스테인(S-벤질), L-시스테인(S-아세트아미도메틸), D-히스티딘, D-글루타민, D-트립토판, L-글루탐산(β-알릴), β-알라닌, L-시스테인(S-p-메틸-벤질), L-시스테인(S-tert-부틸), L-메티오닌-설폰, L-메티오닌-설폭사이드, 글리신, 및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 화학적 그룹이며;
   - Glu는 글루탐산으로서, 바람직하게는 아미노산 (R-Glu)의 Cα에서 절대배열 R을 나타내는 글루탐산;
   - Cys(Bzl)은 벤질 시스테인으로서, 바람직하게는 아미노산 (S-벤질-시스테인 / S-Cys (Bzl) 측쇄의 황-결합 벤질기를 포함하는 아미노산 Cα에서 절대 배열 S를 나타내는 벤질 시스테인;
   - Cha는 시클로헥실알라닌으로서, 바람직하게는 아미노산 (S-시클로헥실알라닌/ S-Cha)의 Cα에서 절대 배열 S를 나타내는 시클로헥실알라닌;
   - Y2는 다음으로부터 선택되며:
   · 적어도 하나의 티올 또는 티올에테르기 바람직하게는 D-시스테인. L-시스테인, L-호모시스테인, D-호모시스테인, D-시스테인-S-메틸, L-시스테인-S-메틸, D-시스테인-S-에틸, L-시스테인-S-에틸, L-메티오닌, D-메티오닌, D-시스테인-S-벤질, L-시스테인-S-벤질, L-메티오닌 설폭사이드, D-메티오닌 설폭사이드, L-메티오닌 설폰, D-메티오닌 설폰, D-세린, L-세린, D-세린-O-메틸, L-세린-O-메틸, D-세린-O-에틸, L-세린-O-에틸, D-세린-O-벤질, L-세린-O-벤질, D-트레오닌, L-트레오닌, D-트레오닌-O-메틸, L-트레오닌-O-메틸, D-트레오닌-O-에틸, L-트레오닌-O-에틸, D-트레오닌-O-벤질, L-트레오닌-O-벤질, 및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 티올 또는 티올에테르기를 특징으로 하는 α-아미노산; 및
   · R-Glu - S-Cys(Bzl)- S-Chaα 트리펩티드;
   - Y3는 카르복실기, 카르복시아미드기, N-메틸-치환카르복시아미드 또는 이치환 N, N-디메틸기, 히드록시기 및 수소로부터 선택되고;
   - Z1, Z2 및 Z3는 삼관능성 분자를 나타내며,
   - i는 4, 2 또는 1이고; 및/또는
   - j는 2, 1 또는 0이며; 및/또는
   - z는 1 또는 0이고,
   단, i=4인 경우, j=2 및 z=1이며; i=2인 경우, j=1 및 z=0이고; i=1인 경우, j=z=0이며; j=0인 경우, Z2기는 생략되고, z=0인 경우, Z3기는 생략되는 것인 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 삼관능성 분자는 다음의 화학식 (III)을 특징으로 하는 펩티드로서
   

   

   (III)
   
   여기서 k는 정수로서, 바람직하게는 1 내지 4가 포함된 정수이며, B는 바람직하게는 아미노기, 바람직하게는 S- 또는 R-리신, 또는 히드록시기인 것인 펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Z1 및/또는 Z2 및/또는 Z3는 분지형 구조를 형성하기 위해 아미드 결합 또는 에스테르 결합에 의해 함께 결합되는 것인 펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학식 (IIb)을 특징으로 하는 펩티드로서, 여기서
   

   

   
   (화학식 IIb)
   - Y1는 수소 원자이고;
   - Y2는 D-시스테인이며;
   - Y3는 비치환 1차 아마이드기이고
   - Z1, Z2 및 Z3는 위에서 정의된 바와 같으며;
   - i는 2와 같고;
   - j는 1과 같으며; 및
   - z는 0과 같거나 부재하는 것인 펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 및 추가로 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 성분을 포함하는 것인 조성물.
6. 약제로 사용하기 위한 것인, 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 펩티드 또는 제5항의 조성물.
7. 조절되지 않는 혈관신생/신-혈관신생으로서, 바람직하게는 혈관신생/신-혈관신생, 바람직하게는 상기 혈관신생/신-혈관신생은 VEGFR1-의존성인 것인 것과 관련되거나 이에 의해 야기되는 병리적 상태의 치료에 사용하기 위한 것으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 펩티드 또는 제5항의 조성물.
8. 제7항에 따라 사용하기 위한 펩티드 또는 조성물로서, 상기 병리적 상태는 다음으로부터 선택되는 것인 펩티드 또는 조성물:
   - 신혈관 안구 질환으로서, 바람직하게는 황반 부종, 습성 형태의 노인 황반 변성, 당뇨망막병증, 미숙아 망막증, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 초자체 출혈 및 망막 박리 및 이의 조합으로부터 선택되는 신혈관 안구 질환; 및/또는
   - 고형 종양 및/또는 종양 전이로서, 바람직하게는 백혈병 및 림프종, 바람직하게는 급성 림프구 백혈병, 급성 비-림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 호지킨 질환, 영아 또는 성인 고형 종양, 뇌 종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 윌름 종양, 골육종 및 연골육종, 폐 종양, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 비뇨계 암, 방광암, 구강 종양, 이자 종양, 흑색종 및 피부 종양, 위 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 후두 종양, 간 종양, 고환 종양으로부터 선택되는 상기 종양; 및/또는
   - 골 또는 관절의 질환으로서, 바람직하게는 류마티스 관절염, 윤활막염, 연골 및/또는 골 파괴, 골수염, 윤활 조직의 비대 및/또는 과형성, 골증식, 신생물 및/또는 전이의 형성 및 이의 조합으로부터 선택되는 골 또는 관절의 질환; 및/또는
   - 혈관 병리로서, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 혈관종, 혈관내피종 및 이의 조합으로부터 선택되는 혈관 병리; 및/또는
   - 피부 질환으로서, 바람직하게는 건선, 사마귀, 화농육아종, 모발 성장, 카포시 육종, 상처의 켈로이드, 알러지성 부종, 신생물 및 이의 조합으로부터 선택되는 피부 질환; 및/또는
   - 지방 조직의 병리, 바람직하게는 비만에서 관찰되는 혈관 신생; 및/또는
   - 당뇨 및/또는 이의 합병증으로서, 바람직하게는 망막증 및/또는 당뇨병성 족부병변; 및/또는
   - 조혈 질환으로서, 바람직하게는 AIDS 및/또는 카포시 육종.
9. VEGFR1, 바람직하게는 이의 활성화의 억제제로서 사용하기 위한 것인, 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 펩티드 또는 제5항에 따른 조성물.

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