TWI754324B

TWI754324B - 促進血管增生之短鏈胜肽組合物及其於糖尿病傷口癒合之用途

Info

Publication number: TWI754324B
Application number: TW109124127A
Authority: TW
Inventors: 侯建維; 李英中; 賈銅安; 戴瑞凡
Original assignee: 三凡生技研發股份有限公司
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2022-02-01
Also published as: TW202204374A

Abstract

本發明係關於一種短鏈胜肽組合物及其於糖尿病傷口癒合之應用。本發明之短鏈胜肽組合物具有使血管內皮生長因子增加，導致血管增生，進而促進傷口(尤其是糖尿病患難癒的傷口)之修復癒合的功效。

Description

促進血管增生之短鏈胜肽組合物及其於糖尿病傷口癒合之用途

本案係關於一種用於傷口癒合之短鏈胜肽組合物。更特別地是，本發明係關於一種包含一由5~10個胺基酸組成之短鏈胜肽的組合物，具有誘發血管增生，並進而促進糖尿病傷口修復、癒合的功效。

傷口的癒合過程可分三個階段：第一個階段是凝血與止血；第二個階段是白血球聚集在傷口，用以抵抗感染；而在最後的增生階段，必須要有新的血管和神經形成，並因此生長出新的肉芽組織。一般傷口瘙癢是發生在增生階段，此時新的血管和神經等都在積極修復傷口，這些組織因密集增生而擠在一起，由於新生的末梢神經非常敏感，特別容易受到刺激，因此病人會產生瘙癢的感覺。

一般人皆有糖尿病患者的傷口不容易癒合這種概念，主要是因糖尿病導致患者自身免疫力下降所造成的，因此一旦糖尿病患者出現了傷口癒合的周期很長，而不進行及時的處理，就可能造成感染等情況的發生。此外，糖尿病患者當血糖濃度過高時，因細胞外液滲透壓升高，導致水從細胞內滲出；而葡萄糖從尿中排出，形成滲透性利尿，通過尿液排出過多的水分和電解質。這樣細胞內、外都可能發生脫水，影響傷口處皮膚癒合。

若糖尿病患者的血糖控制不好，除了其身體消滅細菌的能力降低之外，由於高血糖會降低細胞運輸氧到組織的能力，也影響傷口癒合。此乃因為糖尿病患者血糖水平升高時，促使葡萄糖氧化物沉積在組織膠原內，出現異常的膠原蛋白，導致血管喪失彈性，微循環變差，體肢末端的代謝廢物無法完全清除，容易導致組織壞死。

糖尿病血糖升高易引起微血管病變，損害血管和神經。糖尿病傷口難以癒合的另一個主要原因是，下肢中小動脈的血管壁增厚、血管腔狹窄引起的遠端血管阻塞、缺血及血循環不暢，致使新鮮的肉芽無法順利長出；而且因為血循環不暢，導致藥物也難以到達傷口幫助消炎。再加上糖尿病患者富於糖份的傷口，也容易滋生細菌的感染。這樣傷口就會越來越大，感染越來越重，最後發生壞疽(即發黑)。

糖尿病患者是足部潰瘍的高風險群，而癒合不佳的糖尿病足部潰瘍更可能會導致糖尿病患部份或全部的足部、甚至是下肢的截肢。抗微生物製劑(抗菌劑或抗生素)能抑制細菌的生長，所以有時候會用來治療糖尿病患足部的潰瘍傷口。目前一般常用的傷口敷料，有抗生素藥膏、銀離子抗菌纖維敷料，吸收性泡棉敷料等，視傷口的狀況來選擇，其目的是維持傷口的保濕、保溫與抗菌、制菌來達到傷口癒合。

於是，本發明提供一種具有能有效誘發血管增生，並進而促進傷口(尤其是糖尿病傷口)修復、癒合的短鏈胜肽及其組合物。

於一方面，本發明係關於一種具有促進血管增生之短鏈胜肽組合物，其特徵在於包含一由5~10個胺基酸組成之短鏈胜肽，且所述之短鏈胜肽具有分子量為550~1100Da。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽係包含一由Xxx-Asn-Pro-Yyy-Thr(SEQ ID No.1)組成之胺基酸序列，及1~3個視需要的任意胺基酸，其中Xxx及Yyy各代表一任意胺基酸。較佳地，Xxx代表一鹼性胺基酸，Yyy代表一任意胺基酸；最佳地，Xxx代表一鹼性胺基酸，Yyy代表一酸性胺基酸。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽用於促進糖尿病傷口之血管增生。

於另一方面，本發明係關於一種包含一由5~10個胺基酸組成之短鏈胜肽用於製備糖尿病傷口修復組成物之用途，所述之短鏈胜肽具有分子量為550~1100Da。

於本發明之一具體實施態樣，所述之短鏈胜肽係包含一由Xxx-Asn-Pro-Yyy-Thr(SEQ ID No.1)組成之胺基酸序列，及1~3個視需要的任意胺基酸，其中Xxx代表一鹼性胺基酸，Yyy代表一任意胺基酸；或者，Xxx代表一鹼性胺基酸，Yyy代表一酸性胺基酸。

於本發明之具體實施態樣，所述之短鏈胜肽係用於促進糖尿病傷口之血管生成。所述之傷口，包括(但不限定於)創傷傷口及燙傷傷口。

胜肽是兩個以上的胺基酸通過脫水縮合而成的聚合物，由第一個胺基酸分子的羧基與第二個胺基酸分子的胺基縮合，而形成具有兩個胺基酸的短鏈就稱為二胜肽；由三個胺基酸縮合而成的肽鏈稱為三胜肽，依此類推。通常，具有小於10個胺基酸的胜肽鏈稱為短鏈胜肽。

於本發明使用之短鏈胜肽是由5~10個胺基酸組成，分子量為550~1100Da，較佳地，本發明之短鏈胜肽包含一由Xxx-Asn-Pro-Yyy-Thr(SEQ ID No.1)組成之胺基酸序列，其中Xxx及Yyy各代表一任意的胺基酸，及1~3個視需要的其他任意胺基酸。

於本發明，“視需要的任意胺基酸”係指可依需要，添加於本發明Xxx-Asn-Pro-Yyy-Thr(SEQ ID No.1)胺基酸序列之N-端或C-端，而不會影響該五肽序列之促進血管增生活性的任意胺基酸。

於本發明，“任意胺基酸”係指由胺基(-NH₂)和羧基(-COOH)的官能團，以及連到每一個胺基酸的側鏈所組成的有機化合物。構成天然蛋白質之胺基酸包括：甘胺酸(Glycine)、丙胺酸(Alanine)、纈胺酸(Valine)、亮胺酸(Leucine)、異亮胺酸(Isoleucine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)、色胺酸(Tryptophan)、酪胺酸(Tyrosine)、天冬胺酸(Aspartate)、組織胺酸(Histidine)、天冬醯胺(Asparagine)、谷胺酸(Glutamate)、賴胺酸(Lysine)、谷胺醯胺(Glutamine)、甲硫胺酸(Methionine)、精胺酸(Arginine)、絲胺酸(Serine)、蘇胺酸(Threonine)、半胱胺酸(Cysteine)、脯胺酸(Proline)等。

於本發明，一些較佳之短鏈胜肽包含一鹼性胺基酸，其在正常生理環境下帶正電，實例包括(但不限定於)賴氨酸(Lysine)、精胺酸(Arginine)、組胺酸(Histidine)等。本發明另一些較佳之短鏈胜肽包含一酸性胺基酸，即側鏈帶有酸性基團的胺基酸殘基，實例包括(但不限定於)谷胺酸(Glutamate)、天冬胺酸(Aspartate)、γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)等。

脯胺酸(Proline)對於維持關節及肌腱的正常功能有舉足輕重的地位，還可以強化心肌的功能。蘇胺酸(Threonine)是人體膠原蛋白及牙齒紶瑯質之重要成份，可以防止肝臟脂肪堆積，及促進胃腸道功能更平順。

用於本發明之實施例，係將短鏈胜肽Met-Lys-Asn-Pro-Glu-Thr-Cys(SEQ ID No.2)溶於生理食鹽水，製得濃度為250μg/ml之短鏈胜肽溶液，再用過濾膜無菌處理後備用，施予(於傷口塗抹)該短鏈胜肽溶液之實驗組，以下稱為短鏈胜肽處理組。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例一、短鏈胜肽組合物促進糖尿病傷口癒合

本實例係使用Sprague-Dawley大鼠(10週齡，350-400g)，以鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)誘導成糖尿病，以水浴槽維持水溫98±2℃造成部分深度的燙傷，佔全身表面積的20%背部(20% TBSA)區域燙傷，再塗抹短鏈胜肽後進行傷口癒合分析評估。

Sprague-Dawley大鼠(10周，350-400g)隨機分為四組，其中兩組以1%濃度的鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)，以50mg/Kg之劑量注入大鼠腹腔，共施予2針，1週1針。鏈脲佐菌素是一種由鏈球菌產生的天然化合物，對於哺乳動物胰臟中產生胰島素的胰島B細胞具有特異的毒性，會破壞生成胰島素的細胞，引發第I型糖尿病。STZ-誘導糖尿病組，偵測空腹血糖濃度超過250(mg/dL)確認誘導完成(300mg/dL)，並維持高血糖2週(肛門上切尾滴血-血糖機測量)。於第16天，先以0.4ml/正常鼠或0.2ml/糖尿病鼠的麻醉藥舒泰50(Zoletil®舒泰，動物藥入字第05392-05393號)注射後，再進行燙傷處理：以水浴槽維持水溫100℃造成部分深度的燙傷(8秒)，佔全身表面積的20%背部(20% TBSA)區域燙傷。再緊接進行切割採樣表皮，固定1x1cm²面積大小之全皮層進行觀察：切割採樣表皮保留，進一步由台中榮總整形外科，進行切片染色，評估生理變化之機制。

將生理食鹽水(無投藥對照組)及短鏈胜肽溶液，分別塗抹於燙傷傷口表面：正常大鼠與糖尿病大鼠，各別區分無投藥對照組(塗抹生理食鹽水)，及短鏈胜肽處理組(塗抹短鏈胜肽溶液，250ug/ml)，皆於燙傷後第1、5、8、13天進行患部觀察與採樣切片。

結果：

第1天(實驗代號A)

正常SD鼠對照組：(與糖尿病組比較)皮層組織較厚、(截尾)血液顏色鮮紅易採血；糖尿病SD鼠組：(與正常組比較)皮層組織較薄、(截尾)血液顏色暗紅且採血不易，明顯具糖尿病組織與血管併發症。進行切割採樣表皮A-1、A-2、A-3、A-4之1x1cm²面積大小之全皮層時，顯示全部的SD鼠之傷口都有滲血，參見下表1。

第5天(實驗代號B)

正常SD鼠對照組：表皮較乾硬且色深，切皮時亦明顯厚硬，且無出血現象；正常SD鼠塗抹短鏈胜肽溶液處理組：表皮較軟且色稍淺，切皮時表皮亦較軟，且真皮層易有輕微出血。

沒有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之正常SD鼠(對照組)，進行切割採樣表皮(B-1)其傷口沒有滲血反應。有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之正常SD鼠(正常SD鼠+短鏈胜肽溶液處理組)，進行切割採樣表皮(B-2)時，傷口有輕微滲血反應。糖尿病SD鼠(糖尿病SD鼠對照組)，與正常SD鼠對照組比較，其傷口表皮明顯較薄，且表皮與真皮容易剝離；而其與有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠(糖尿病SD鼠+短鏈胜肽溶液處理組)比較時，顯示其表皮層較硬且色深，切皮時亦明顯較硬，且無出血現象。糖尿病SD鼠有塗抹短鏈胜肽溶液之處理組，與糖尿病SD鼠對照組比較時，其表皮層較軟且色稍淺，切皮時亦明顯較軟，且真皮層易有輕微出血。

沒有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠進行切割採樣表皮(B-3)，顯示傷口沒有滲血反應，表示已發生血管阻塞、缺血。而傷口經塗抹本發明短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠進行切割採樣表皮(B-4)，與塗抹短鏈胜肽溶液之正常SD鼠比較，其於第5天的傷口有比較慢的滲血反應，有出血現象表示有血管增生：參見下表2。上述之結果顯示，有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠，於第5天已呈現傷口處有血管增生現象，而此修復作用在沒有塗抹短鏈胜肽溶液之SD鼠對照組中皆無發生。

第8天(實驗代號C)

正常SD鼠對照組：表皮較乾硬且色深，切皮時亦明顯厚硬，且真皮層與結締組織明顯分離，較無出血現象。正常SD 鼠+短鏈胜肽溶液處理組：表皮較軟且色更淺，切皮時表皮亦較軟，且真皮層與結締組織明顯沾黏，且出血明顯。由表3之切割傷口出血現象觀測結果顯示，沒有塗抹短鏈胜肽溶液之正常SD鼠，進行切割採樣表皮(C-1)傷口沒有滲血反應，表示其傷口處尚未有血管增生。而有塗抹短鏈胜肽溶液之正常SD鼠，進行切割採樣表皮(C-2)傷口有滲血反應，表示本發明之短鏈胜肽已誘發該處之血管增生。

糖尿病SD鼠對照組：與正常對照組比較時明顯較薄，且表皮與真皮容易剝離；而其與有塗抹短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠比較，表皮層較硬且色深，切皮時亦明顯較硬，真皮層與結締組織沒有沾黏，且無出血現象。糖尿病SD鼠+短鏈胜肽溶液處理組：與糖尿病SD鼠對照組比較時，其傷口表皮層較軟且色稍淺，切皮時亦明顯較軟，且真皮層易有輕微出血，表示有血管增生。沒有塗抹短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠，進行切割採樣表皮(C-3)的傷口沒有滲血反應；而塗抹短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠，進行切割採樣表皮(C-4)的傷口有明顯的滲血反應。參見下表3。上述之結果顯示，有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠，於處理後第8天，本發明短鏈胜肽促進傷口處血管增生的效果，已相當明顯。

第13天(實驗代號D)

正常SD鼠對照組：與第5日之正常SD鼠對照組(未塗抹短鏈胜肽溶液)組比，表皮已軟且色稍淺，但切皮時與實驗上藥組比仍明顯較厚硬，且真皮層與結締組織明顯分離，但已稍有出血現象，表示正常SD鼠在燙傷13天後已出現血管增生現象。正常SD鼠+短鏈胜肽溶液處理組：表皮更軟且色更淺，切皮時表皮亦更軟，且真皮層與結締組織明顯沾黏，且出血更為明顯，傷口已需要加壓止血。沒有塗抹短鏈胜肽溶液之正常SD鼠，進行切割採樣表皮(D-1)傷口有滲血反應。有塗抹短鏈胜肽溶液之正常SD鼠，進行切割採樣表皮(D-2)傷口有明顯的滲血反應。

糖尿病SD鼠對照組：與正常對照組比較時明顯較薄，且表皮與真皮更易剝離；而與有塗抹短鏈胜肽溶液之糖尿病 SD鼠比較時，其表皮層較硬且色深，切皮時亦明顯較硬厚，真皮層比結締組織沒有沾黏，但也已稍有出血現象，表示有些微的血管增生。糖尿病SD鼠+短鏈胜肽溶液處理組：與糖尿病SD鼠對照組比較時，表皮與真皮易剝離，表皮更軟且色更淺，但真皮層與結締組織明顯沾黏，且出血更為明顯。沒有塗抹短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠，進行切割採樣表皮(D-3)之傷口有輕微的滲血反應；而塗抹短鏈胜肽溶液之糖尿病SD鼠，進行切割採樣表皮(D-4)之傷口，有很明顯的滲血反應。參見下表4。上述之結果顯示，沒有塗抹本發明短鏈胜肽溶液之SD鼠在燙傷13天後，其傷口才出現血管增生現象；而有塗抹短鏈胜肽溶液之SD鼠，其傷口處的血管增生的現象，相較於未塗抹短鏈胜肽溶液之對照組已相當明顯，在正常SD鼠之促進血管增生作用尤其顯著。

傷口癒合天數

下表5係總和記錄，各組SD鼠之傷口所需癒合的天數。結果顯示，經過本發明短鏈胜肽處理之正常SD鼠傷口，相較於未經塗抹短鏈胜肽之正常SD鼠傷口，其癒合天數從30天縮短至12~18天，表示短鏈胜肽促進傷口癒合的效率可達50%；而對於糖尿病傷口，其癒合天數縮短了15天，顯示本發明之短鏈胜肽促進糖尿病傷口癒合的效率亦可達25%。

<110> 三凡生技研發股份有限公司

<120> 短鏈胜肽組合物及其於糖尿病傷口癒合之用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Claims

一種具有促進血管增生之短鏈胜肽組合物，其特徵在於包含一由Met-Lys-Asn-Pro-Glu-Thr-Cys(SEQ ID No.2)之胺基酸序列組成之短鏈胜肽。
如請求項1所述之短鏈胜肽組合物，其中該短鏈胜肽用於促進糖尿病傷口之血管增生。
一種包含一由7個胺基酸組成之短鏈胜肽用於製備糖尿病傷口修復組成物之用途，其中該短鏈胜肽係由一Met-Lys-Asn-Pro-Glu-Thr-Cys(SEQ ID No.2)之胺基酸序列所組成。
如請求項3所述之用途，其中該短鏈胜肽係用於促進傷口之血管生成。
如請求項3所述之用途，其中該傷口為燙傷傷口。
如請求項3所述之用途，其中該傷口為創傷傷口。