BR112017007645B1

BR112017007645B1 - Composições para tratar feridas

Info

Publication number: BR112017007645B1
Application number: BR112017007645-4A
Authority: BR
Inventors: Samuel Lynch; Leslie Wisner-Lynch
Original assignee: Samuel Lynch; Leslie Wisner-Lynch
Priority date: 2014-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2023-05-02
Also published as: JP2021106935A; US20170021054A1; EP3206670A4; AU2015332556B2; CA2962954A1; US20230372579A1; US20200164102A1; US20170014483A1; JP2017532346A; US11826486B2; EP3206670A1; AU2015332556A1; US20190125926A1; CN107106492A; CO2017004806A2; CN107106492B; JP6871855B2; WO2016061219A1; BR112017007645A2; MX2017004520A

Abstract

COMPOSIÇÕES PARA TRATAR FERIDAS. A presente invenção se refere a novas composições para tratar feridas e promover a sua cicatrização, incluindo composição contendo novas combinações de um veículo e fator de crescimento derivado de plaquetas recombinantes com menos isoformas e bioestabilidade aumentada. Também são descritos métodos de tratar feridas com nova composição terapêutica usando procedimentos de dosagens que levam a resultados eficazes com um número mínimo de aplicações de tratamentos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US n° 62/063,793, depositado em 14 de outubro de 2014, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a composições e métodos úteis para o tratamento de feridas, e em particular ao tratamento de feridas difíceis de cicatrizar, tais como úlceras de membros inferiores em um doente diabético, úlceras de estase venosas, úlceras de pressão, queimaduras graves e feridas cirúrgicas grandes tais como abdominoplastias e outros tipos de retalhos de tecido cirúrgico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O diabetes está em proporções epidêmicas em todo o mundo. Segundo se informa, cerca de 370 milhões de pessoas têm diabetes e esse número está aumentando em todos os países. Uma das complicações mais comuns e sérias resultantes da diabetes é a baixa cicatrização de feridas que se desenvolvem mais comumente em áreas de alta pressão sobre a superfície dos pés, tal como sob o hallux (dedo grande do pé), articulações metatarsofalângicas, as partes superiores e as extremidades dos pés e o calcanhar, o meio e as laterais do pé e do calcanhar. As úlceras dos pés formam-se como resultado de danos ao nervo, que resultam em uma perda da sensação sobre tais pontos de pressão sobre o pé, o que conduz ao microtrauma prolongado, à ruptura do tecido sobrejacente e à eventual ulceração. Além disso, esta perda de sensação pode permitir que pequenos arranhões ou cortes não tenham tratamento apropriado e, eventualmente, levem à formação de úlceras. Uma percentagem significativa de diabéticos irá desenvolver uma úlcera no pé durante a sua vida. Uma vez formada uma úlcera do pé diabético (DFU), o tratamento pode ser desafiador, particularmente tendo em conta o ambiente de cura comprometido devido à presença de neuropatia, doença vascular, função neutrofílica alterada, perfusão tecidual diminuída e/ou síntese de proteínas defeituosas, todas elas muitas vezes acompanham o diabetes.

[004] Existe uma grande necessidade de melhores modalidades de tratamento para estas ulcerações crônicas. DFUs são uma das principais causas de amputação. Quanto mais tempo essas feridas permanecem, maior a oportunidade para que elas aumentem de tamanho e profundidade e se tornem infectadas. Como consequência, estas complicações resultam em 80.000 amputações anualmente nos EUA apenas. Esta patologia crônica também compromete gravemente a saúde geral do paciente, levando a uma espiral descendente de saúde desses pacientes e custos adicionais para o sistema de saúde; seu tratamento dobra o custo de cuidados para pacientes diabéticos afetados.

[005] O objetivo principal da gestão de DFU é o fechamento de feridas. Sob o atual tratamento padrão, os cuidados com a ferida da DFU concentram-se no desbridamento radical e repetido, inspeção frequente e controle bacteriano, descarga de qualquer pressão sobre a ferida e equilíbrio de umidade cuidadosa para evitar a maceração. A cura efetiva da DFU, no entanto, não foi consistentemente alcançada por meio desta abordagem, e os resultados podem depender fortemente da adesão do paciente. Como resultado, tratamentos adjuvantes foram desenvolvidos para abordar DFUs. Relatórios de consenso para o tratamento de úlceras do pé diabético recomendam que, para úlceras que apresentem menos de 50% de cicatrização em 4 semanas após um bom tratamento padrão, terapias avançadas devem ser consideradas para acelerar a cicatrização e diminuir as complicações da ferida. Tais tratamentos avançados incluem terapia de ferida com pressão negativa, curativos biológicos, equivalentes de pele bioengenheirados, terapia de oxigênio hiperbárica, plasma rico em plaquetas e fatores de crescimento.

[006] Contudo, apenas um pequeno número destes produtos avançados para cuidados de feridas mostrou acelerar a cicatrização da DFU em ensaios de registo prospectivo e aleatório, e mesmo alguns desses resultados foram postos em causa por outros estudos. Entre os produtos que foram estudados em ensaios de registo prospectivo e aleatório, estão incluídos becaplermina (Regranex®, Smith e Nephew), um gel tópico contendo homodímero da cadeia B do fator de crescimento derivado de plaquetas humano recombinante (rhPDGF-BB), BioChaperone PDGF-BB Adocia, Lyon, França), um spray tópico que inclui moléculas que formam complexos com PDGF, dois equivalentes de pele viva: um substituto de pele bicamada (Apligraf®, Organogenesis, Inc., Canton, MA) e um substituto dérmico derivado de fibroblastos humanos (Dermagraft®, Shire, Plc, Dublin, Irlanda) e fechamento de feridas assistido por vácuo (V.A.C.®, KCI, San Antonio, TX). Outras modalidades de tratamento que têm dados de ensaio menos rigorosos incluem colágeno, plasma rico em plaquetas, produtos de prata, oxigênio hiperbárico e estimulação elétrica.

[007] Apesar de alguns resultados favoráveis de ensaios de registo prospectivo, randomizado para certos produtos avançados de tratamento de feridas, os seus benefícios globais têm sido decepcionantes, como evidenciado pelas elevadas e contínuas taxas de amputação. Os seguintes resultados foram relatados em uma meta-análise publicada de 35 ensaios randomizados e controlados que avaliam as terapias avançadas para úlcera do pé diabético: - Plasma rico em plaquetas não melhorou a cicatrização de úlceras diabéticas em comparação ao bom tratamento padrão para feridas. - Equivalente de pele biológica Dermagraft® em resultados agrupados de três estudos mostrou melhora não significativa em relação ao tratamento padrão, com Dermagraft favorecendo a cicatrização de úlceras (35% versus 24%). - Bicamada de equivalente de pele biológica Apligraf® foi relatado por melhorar a cicatrização em relação a um bom tratamento padrão para feridas (55% versus 34%, p = 0,001; 2 estudos). - 5, Regranex® rhPDGF-BB apresentou melhora no porcentual de úlceras cicatrizadas em relação ao placebo ou bom tratamento padrão para feridas (58% versus 37%, p = 0,04; 7 estudos). - A terapia para feridas com pressão negativa V.A.C.® melhorou a cicatrização mais do que o bom tratamento padrão para feridas (43% versus 29%, p < 0,05; 1 estudo). - Houve evidência baixa ou insuficiente para todos os estudos relacionados ao aumento do tempo para cicatrização de úlceras.

[008] Além disso, em quatro estudos a incidência de fechamento completo da ferida para Regranex foi relatada como 50% ou menos (48%, 50%, 44% e 36%).

[009] Tais terapias avançadas não resultaram em uma solução consistentemente eficaz para tratar DFUs. Tendo em conta os seus resultados clínicos mistos, juntamente com o seu maior custo do produto em relação à terapia padrão, nenhuma destas terapias avançadas foi amplamente adotada como um novo tratamento padrão para o tratamento de DFUs.

[010] Tal como referido acima, tal terapia avançada é o gel Regranex (becaplerman), que consiste em rhPDGF-BB a uma concentração de 100 μg/g em gel de carboximetilcelulose de sódio. Especificamente, o Regranex é formulado como um gel tópico à base de carboximetilcelulose de sódio (CMC) de uso múltiplo, não esterilizado, com baixa carga biológica, conservado, e é indicado para aplicação diária para melhorar a cicatrização de DFUs crônicas ao longo de vários meses. O folheto informativo da embalagem de Regranex (rótulo) indica que ele deve ser aplicado diariamente até 140 aplicações diárias durante um período de 20 semanas, e ainda mais se o médico o considerar adequado em uma dose igual a cerca de 0,006 mg/cm2 (6,25 μg) da área da superfície da ferida.

[011] O Regranex continua a ser a terapia do fator de crescimento do estado da técnica para a cicatrização de feridas, como evidenciado pelo fato de ser o único produto de fator de crescimento recombinante a receber a aprovação da FDA para o tratamento de feridas crônicas, apesar de ter sido aprovado pela FDA há mais de 15 anos. Além disso, ninguém desenvolveu com sucesso outra formulação de Regranex (isto é, rhPDGF-BB) desde a sua aprovação pela FDA. Embora os dados clínicos e não clínicos apoiem seu uso clínico, acredita-se que o Regranex tem uma série de limitações, incluindo: 1) a necessidade de aplicações diárias à DFU pelo paciente, exigindo trocas diárias do curativo pelo paciente; 2) a dose baixa prescrita nas Instruções de Uso aprovadas pela FDA, cerca de 0,006 mg (6 μg) por cm2 de área de superfície da ferida; 3) dosagem frequentemente imprecisa devido à dificuldade que o paciente experimenta na visualização e aplicação do gel a partir de um tubo (semelhante a um tubo de pasta de dentes) sobre a ferida que é muitas vezes localizada na parte inferior do pé; 4) a necessidade de manter o produto refrigerado (cerca de 2-8 °C); 5) falta de esterilidade do gel Regranex; 6) a necessidade de um uso prolongado do paciente - até, e potencialmente excedendo, 140 aplicações diárias durante um período de cerca de cinco meses; e 7) o uso do gel tópico à base de carboximetilcelulose (CMC) que não tem a capacidade de proporcionar uma matriz biológica para o crescimento interno celular.

[012] Além disso, Regranex foi apenas modestamente aceito pela comunidade médica como um tratamento eficaz para DFUs. Na sequência da revisão da Agência Europeia de Medicamentos (EMA) dos dados de quatro ensaios clínicos com eficácia de Regranex, a EMA concluiu que uma formulação de 30 μg de PDGF/g era menos eficaz do que uma dose de 100 μg de PDGF/g e havia pouca diferença entre a formulação de 100 μg de PDGF/g e uma formulação de 300 μg de PDGF/g. A EMA concluiu ainda que a formulação do produto de 100 μg de PDGF/g possuía apenas eficácia “modesta”.

[013] Talvez como resultado da eficácia “modesta” de Regranex, a eficácia do ingrediente ativo em Regranex (isto é, rhPDGF-BB) no tratamento de feridas foi posta em causa. Park SA, Raghunathan VK, Shah NM, Teixeira L, Motta MJ, et al.(2014) PDGF-BB Does Not Accelerate Healing in Diabetic Mice with Splinted Skin Wounds, PLoS ONE 9(8): e104447. doi: 10.1371/journal.pone.0104447, relataram os resultados de um estudo usando um modelo de ferida excisional com fissura de espessura total controlada em camundongos db/db (modelo de rato diabético tipo 2). Foram feitas duas feridas dorsais de 8 mm de espessura total em camundongos db/db, e foram tratados topicamente uma vez por dia com 3 μg de PDGF-BB em 30 μl de veículo PEG-PBS a 5% ou um volume igual de veículo durante 10 dias. O estudo concluiu que o PDGF-BB, embora bioativo in vitro, não conseguiu acelerar a cicatrização de feridas in vivo nos camundongos db/db utilizando o modelo de feridas com fissura.

[014] Embora os especialistas no campo questionem a eficácia do ingrediente ativo Regranex, rhPDGF-BB, os requerentes acreditam que há uma série de razões para a eficácia questionável do Regranex. Em primeiro lugar, o Regranex é entregue ao local da ferida por um carreador de gel. Esta formulação permite que o rhPDGF seja removido do local em minutos a horas. Em segundo lugar, embora o carreador de gel seja biocompatível, acredita-se que não fornece substrato para crescimento interno celular e vascular e, de fato, pode ser inibidor do crescimento celular e migração na ferida, assim potencializando o processo de cicatrização e resultando em uma cicatrização abaixo do ideal. Terceiro, o Regranex é não estéril, apenas estável quando armazenado a 2-8 graus C (refrigerado) e deve ser aplicado diariamente muitas vezes a locais anatômicos difíceis de alcançar, levando a uma má adesão ao paciente; em quarto lugar, embora os dados clínicos não tenham mostrado diferença entre a formulação de 100 μg/g e a formulação de 300 μg/g, os Requerentes acreditam que o fator de crescimento em Regranex está a uma concentração demasiado baixa para o recrutamento e proliferação ideais de células. A dose de Regranex por centímetro quadrado de área de superfície da ferida é apenas 6 μg e os requerentes acreditam que é demasiado baixa para o recrutamento e proliferação ideais de células. Em quinto lugar e finalmente, apesar do seu uso comercial em pacientes nos últimos 15 anos, os requerentes acreditam que o fator de crescimento que está incluído no Regranex não é totalmente potente. O rhPDGF utilizado em Regranex é produzido de forma recombinante em um sistema de expressão de leveduras. Quando expressa em leveduras, a proteína é excretada como uma proteína homodimérica totalmente dobrada constituída por duas cadeias B antiparalelas mantidas unidas por duas ligações dissulfeto intercadeias. Contudo, durante a fermentação, pode ocorrer a proteólise interna (corte entre os resíduos Arg32 e Thr33) e o truncamento C- terminal (Arg32 e Thr109). A proteólise interna produz três formas potenciais de rhPDGF-BB: intacta (ambas as cadeias B estão intactas), cortada individualmente (uma cadeia B é cortada) e duplamente cortada (ambas as cadeias B são cortadas). O corte também cria novos sítios C- terminais para mais truncamentos C-terminais e leva a uma mistura muito complexa de isoformas. Os requerentes acreditam que as isoformas não intactas de rhPDGF-BB que estão incluídas no Regranex são muito menos eficazes no tratamento de DFUs do que a isoforma totalmente intacta.

[015] O rhPDGF-BB também foi utilizado em indicações ortopédicas e periodontais, em que os ambientes de cicatrização e os processos de cicatrização são muito diferentes das feridas dérmicas. Dois desses produtos incluem Augment Bone Graft e GEM21S, ambos incluindo rhPDGF- BB como ingrediente ativo. O GEM21S, constituído por uma solução de rhPDGF-BB e um substituto de osso sintético particulado, foi aprovado pela FDA em 2005 e é indicado por melhorar a cicatrização óssea em defeitos periodontais crônicos. Augment Bone Graft também consiste na solução de rhPDGF-BB e um substituto de osso sintético particulado. O Augment é aprovado pelo FDA, com base em um ensaio clínico fundamental com 434 paciente nos EUA e Canadá, para melhorar a fusão óssea nos pés e fusão no tornozelo após uma única implantação no defeito ósseo durante a cirurgia. No entanto, nenhum destes produtos é indicado para o tratamento de feridas dérmicas, tais como DFU’s, e ambos se concentram no uso do produto para promover o crescimento e fusão óssea, um processo celular e fisiológico muito diferente da cicatrização de feridas cutâneas, através de uma única aplicação intracirúrgica. Como o Regranex, os produtos GEM21S e Augment Bone Graft devem ser armazenados refrigerados (cerca de 2-8 °C), comprometendo a conveniência e adesão do usuário.

[016] Em resumo, baixos resultados de pacientes que conduzem a taxas de amputação elevadas, e análises científicas conflitantes demonstram que ainda existe uma necessidade de um método e uma composição terapêutica consistentemente eficazes, favoráveis para o paciente/usuário, mais previsíveis, para promover a cicatrização de feridas dérmicas, incluindo o tratamento de DFUs e outros tipos de feridas difíceis de cicatrizar.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[017] As formas de realização da invenção proporcionadas nesta Descrição da Invenção destinam-se a ser ilustrativas apenas e a proporcionar uma visão geral das formas de realização selecionadas aqui descritas. A Descrição da Invenção, sendo ilustrativa e seletiva, não limita o âmbito de qualquer reivindicação, não proporciona todo o âmbito das formas de realização inventivas aqui descritas ou contempladas e não deve ser interpretada como limitante ou restritiva do âmbito desta invenção ou qualquer forma de realização inventiva reivindicada.

[018] A presente invenção proporciona métodos e composições para tratar ou promover a cicatrização de uma ferida, tais como úlceras de extremidades inferiores em um paciente diabético, úlceras de estase venosas, úlceras de pressão, queimaduras graves, lesões traumáticas e feridas cirúrgicas de grandes dimensões tais como abdominoplastias e outros tipos de retalhos de tecido cirúrgico. Em algumas formas de realização, a ferida pode prolongar-se para dentro do tecido subcutâneo ou além, ou a ferida pode ser uma úlcera do pé diabético.

[019] É aqui proporcionada uma formulação melhorada de rhPDGF-BB que simultaneamente inclui uma combinação das seguintes melhorias e benefícios: 1) um carreador que facilita a manutenção de uma dosagem eficaz de PDGF em um local da ferida durante um período prolongado de tempo; 2) um carreador que proporciona um substrato para ligação de células e crescimento interno vascular; 3) é estéril e, portanto, mais seguro; 4) não tem que ser refrigerado e é, consequentemente, mais seguro e mais fácil para manipulação dos pacientes; 5) é aplicado com menos frequência do que as terapias atuais, de preferência cerca de uma vez cada duas semanas, o que facilita uma melhor adesão do doente e facilidade de uso; 6) tem rhPDGF presente em uma concentração mais elevada do que as formulações da técnica anterior; e 7) contém uma formulação de rhPDGF-BB mais pura e potente com menos isoformas do que certas formulações da técnica anterior. Em certas formas de realização da invenção, todas as melhorias e benefícios acima referidos são realizados simultaneamente.

[020] É aqui proposto um método de tratamento de feridas que compreende aplicar de uma composição terapêutica à superfície da ferida, monitorar a cicatrização da ferida e reaplicar periodicamente a composição terapêutica à superfície da ferida, se for considerado necessário, para alcançar a cicatrização. Em algumas formas de realização, o método inclui ainda o desbridamento da ferida para remover o tecido necrótico ou infectado antes de aplicar a composição terapêutica e cobrir a ferida com um curativo após a aplicação da composição terapêutica. Em certas formas de realização, um curativo oclusivo ou semioclusivo, e o curativo podem ser periodicamente alterados, tal como a alteração do curativo com cada reaplicação da composição terapêutica. O método da presente invenção também pode incluir a etapa de limpeza da ferida em uma mudança de curativo com solução salina ou um agente de limpeza de feridas antisséptico apropriado e/ou agente químico de desbridamento. Os métodos aqui proporcionados podem também incluir tratar o paciente com uma forma de controle de infecção ou terapia para feridas com pressão negativa.

[021] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda formar a composição terapêutica combinando PDGF estéril e uma matriz biocompatível estéril. O PDGF estéril pode ser uma solução de PDGF estéril pré-formulada ou pode ser formado como parte do processo de tratamento por reconstituição de um pó estéril liofilizado contendo PDGF com água estéril ou solução tampão. Em algumas formas de realização, a matriz biocompatível é uma matriz porosa estéril e pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em polímeros naturais tais como colágeno, gelatina, fibrina, alginato, celulose ou fibronectina. Alternativamente, a matriz biocompatível é uma matriz porosa estéril selecionada a partir do grupo de polímeros sintéticos tais como poli(DL- lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA), poli(DL-lactídeo) (PDLA), poli(L-lactídeo)(PLLA), poli(e-caprolactona)(PCL), poliuretano ou outros. Em algumas formas de realização, a matriz biocompatível é uma esponja de colágeno ou uma mistura de polímeros naturais e sintéticos.

[022] Em algumas formas de realização, a composição terapêutica é formada diretamente sobre a superfície da ferida aplicando primeiramente uma matriz, tal como uma esponja de colágeno, à superfície da ferida e, depois, aplicando uma solução de PDGF à esponja de colágeno, ou alternativamente aplicando primeiro uma solução de PDGF à superfície da ferida, e depois, aplicando uma matriz, tal como uma esponja de colágeno, à superfície da ferida. Em algumas formas de realização, a composição terapêutica é formada primeiro por formação de uma solução estéril de PDGF por reconstituição de um pó estéril liofilizado contendo PDGF com água estéril ou solução tampão e, depois, adicionando assepticamente a solução estéril de PDGF a uma matriz biocompatível porosa estéril, tal como uma esponja de colágeno, de tal modo que a matriz é umedecida com a solução de PDGF.

[023] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é aqui proporcionado um método de tratamento de uma ferida dérmica compreendendo: desbridar a ferida; aplicar uma composição terapêutica contendo fator de crescimento derivado de plaquetas recombinante BB (rhPDGF-BB) à ferida cerca de uma vez a cada 3 a 42 dias durante um período de tratamento de cerca de 2 a cerca de 20 semanas, e em que a referida primeira dose compreende pelo menos cerca de 10 μg de RhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida; e cobrir a ferida com um curativo após cada aplicação da composição terapêutica. Em alguma forma de realização, o método pode compreender ainda aconselhar o referido paciente a evitar a aplicação de pressão sobre a ferida à medida que cicatriza. Em algumas formas de realização, a quantidade total cumulativa de rhPDGF-BB aplicada à ferida durante o período de tratamento é inferior a cerca de 25 mg ou cerca de 10 mg ou cerca de 5 mg ou cerca de 4 mg ou cerca de 3 mg ou cerca de 2 mg ou cerca de 1 mg de RhPDGF-BB. Em algumas formas de realização, o método compreende aplicar a composição terapêutica à ferida uma vez a cada 7 a 28 dias ou uma vez a cada 7 a 21 dias ou uma vez a cada 10 a 15 dias ou uma vez a cada 12 a 14 dias. Em algumas formas de realização, cada tratamento inclui a aplicação de pelo menos cerca de 10 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou entre cerca de 10 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida e cerca de 5000 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida.

[024] A presente invenção também proporciona uma composição terapêutica compreendendo PDGF estéril e uma matriz biocompatível que pode ser estéril e/ou porosa. Em algumas formas de realização, o PDGF estéril compreende uma solução de PDGF estéril pré-formulada e, em outras formas de realização, o PDGF estéril compreende pó estéril liofilizado contendo PDGF reconstituído com água estéril ou solução tampão.

[025] Em certas formas de realização, o PDGF estéril incluído na composição terapêutica da presente invenção compreende uma solução de rhPDGF-BB contendo entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml de rhPDGF-BB. A solução de rhPDGF-BB pode ser formada por combinação de um pó estéril contendo rhPDGF-BB liofilizado e água estéril ou solução salina, assim reconstituindo o rhPDGF-BB liofilizado em solução. Em certas formas de realização, o rhPDGF-BB pode ser produzido através de um sistema de expressão de E. coli, em que pelo menos cerca de 80% do referido rhPDGF-BB em uma base ponderal é rhPDGF-BB não cortado, o qual pode ser subsequentemente liofilizado. Em certas formas de realização, o rhPDGF-BB liofilizado é capaz de ser armazenado entre cerca de 20 °C e cerca de 26 °C e ainda manter a bioatividade de pelo menos 80% do referido rhPDGF-BB durante pelo menos cerca de seis meses ou pelo menos cerca de um ano, ou entre cerca de 16 °C e cerca de 32 °C e ainda manter a bioatividade de pelo menos 80% do referido rhPDGF-BB durante pelo menos cerca de seis meses ou pelo menos cerca de um ano.

[026] Em certas formas de realização, a matriz incluída na composição terapêutica da presente invenção pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em colágeno, gelatina, fibrina, alginato, celulose, quitano ou fibronectina. A matriz pode proporcionar um suporte celular reabsorvível e pode compreender uma esponja de colágeno. Em certas formas de realização, a matriz que tem uma distribuição de tamanho de poro entre cerca de 10 mícrons a cerca de 2000 mícrons, e/ou um tamanho médio de poro entre cerca de 50 mícrons a cerca de 500 mícrons. Em certas formas de realização, alguns dos poros são interligados ou a maioria dos poros é interligada.

[027] É também aqui proporcionada uma composição terapêutica compreendendo uma solução de rhPDGF-BB e um carreador, tal como uma matriz, em que a razão da solução de rhPDGF-BB para a matriz está entre cerca de 4 μl/cm3 a cerca de 40 ml/cm3 ou a razão de rhPDGF-BB para a matriz está entre cerca de 1,2 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 12 mg de PDGF/cm3 do carreador. As soluções de rhPDGF-BB aqui descritas podem compreender entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml ou entre cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1 mg/ml ou entre cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 0,4 mg/ml de rhPDGF- BB. As soluções de rhPDGF-BB aqui descritas podem compreender cerca de 0,3 mg/ml ou cerca de 0,5 mg/ml ou cerca de 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. Em certas formas de realização, pelo menos cerca de 80% ou cerca de 85% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou cerca de 97% do rhPDGF-BB incluído na solução de PDGF ou a composição terapêutica em uma base ponderal é rhPDGF-BB não cortado.

[028] Em certos aspectos, é proporcionada uma composição terapêutica compreendendo uma solução de rhPDGF -BB e uma matriz em que pelo menos cerca de 20% do rhPDGF-BB está aprisionado dentro dos poros da matriz, de modo que quando a referida composição é aplicada a uma ferida em um paciente, o rhPDGF-BB é liberado ao longo do tempo à medida que a matriz é absorvida pelo corpo do paciente. Em certas formas de realização, a composição terapêutica proporciona a entrega sustentada de rhPDGF-BB no local da ferida, à medida que a matriz é reabsorvida e fornece simultaneamente uma matriz para novas células e crescimento interno de tecido.

[029] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comumente entendido por um perito na arte a que pertence esta descrição. Métodos e materiais são aqui descritos para uso na presente descrição; outros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica também podem ser utilizados. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, sequências, entradas de bases de dados e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, irá predominar.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[030] A Figura 1 ilustra graficamente as alterações na área média da ferida ao longo do tempo em três grupos de animais incluídos em um estudo calculado por medições de calibrador digital.

[031] A Figura 2 mostra graficamente as alterações na área média da ferida ao longo do tempo em três grupos de animais incluídos em um estudo calculado utilizando o software ImageJ.

[032] A Figura 3 ilustra graficamente a área da ferida calculada utilizando o software ImageJ para cada animal de teste no dia 0 de um estudo.

[033] A Figura 4 ilustra graficamente a área da ferida calculada utilizando o software ImageJ para cada animal de teste no dia 7 de um estudo.

[034] A Figura 5 ilustra graficamente a área da ferida calculada utilizando o software ImageJ para cada animal de teste no dia 14 de um estudo.

[035] A Figura 6 ilustra graficamente a área da ferida como calculada utilizando o software ImageJ para cada animal de teste no dia 21 de um estudo.

[036] A Figura 7A ilustra graficamente a quantidade de cicatrização de feridas (mm2) utilizando o software ImageJ pelo número de doses cumulativas para cada ponto de tempo para o Grupo Regranex 1 e o Grupo rhPDGF/colágeno 3.

[037] A Figura 7B ilustra graficamente a percentagem média de fechamento da ferida para cada grupo ao longo do período de tratamento.

[038] A Figura 8 inclui uma série de imagens de feridas que mostram o grau de cicatrização ao longo do tempo para animais incluídos em uma composição de teste do estudo de acordo com a invenção.

[039] A Figura 9 inclui uma série de fotomicrografias de uma seção transversal do sítio da ferida no dia 21 a partir de três animais de estudo.

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[040] A presente invenção proporciona um novo método de tratamento de feridas dérmicas, tais como úlceras do pé diabético (DFU), úlceras de estase venosas, úlceras de pressão, queimaduras, lesões traumáticas e feridas cirúrgicas de grandes dimensões. A presente invenção proporciona adicionalmente novas composições terapêuticas bioativas para uso no tratamento de tais feridas, novos métodos de preparação de curativos bioativos úteis para o tratamento de feridas e novos regimes de tratamento para melhorar a adesão do paciente e a cicatrização de feridas.

[041] Os novos métodos e composições terapêuticas de acordo com a presente invenção irão permitir uma eficácia equivalente ou superior em comparação com produtos da técnica anterior no tratamento de feridas dérmicas, e proporcionar um melhor perfil de segurança e uma melhor adesão e conveniência do paciente. As novas composições terapêuticas aqui proporcionadas proporcionam: 1) entrega prolongada do PDGF sobre a ferida a partir de cada aplicação, obviando assim a necessidade de aplicações muito mais frequentes pelo paciente (por exemplo, aplicações diárias ou a cada dois dias com produtos da técnica anterior); 2) um material físico tal como uma esponja de colágeno que pode ser aplicada como um Band-Aid sobre a ferida uma vez a cada vários dias, assim melhorando a adesão do doente; 3) estabilidade à temperatura ambiente, eliminando a necessidade de manter o produto refrigerado; 4) um produto estéril que melhora a segurança em relação aos produtos da técnica anterior; 5) uma dose inicial mais elevada de PDGF em comparação com os produtos da técnica anterior que melhor inicia o processo de cicatrização, assim reduzindo a necessidade de um uso prolongado pelo paciente; 6) o uso de um carreador melhorado que não apenas sustenta a entrega do PDGF, mas simultaneamente proporciona um suporte biológico e/ou matriz porosa aberta que facilita o crescimento interno de células, vasos sanguíneos e novo tecido, levando a uma cicatrização melhorada em comparação com produtos da técnica anterior que não têm a capacidade de fornecer uma matriz biológica para crescimento interno celular; e 7) contém uma formulação de rhPDGF-BB mais pura e potente com menos isoformas do que as formulações da técnica anterior. Os novos métodos aqui descritos proporcionam: 1) uma dose inicial mais elevada de PDGF em comparação com os produtos da técnica anterior para melhor iniciar o processo de cicatrização, assim reduzindo a necessidade de um uso prolongado pelo doente; e 2) um protocolo de tratamento que facilitará melhor adesão e conveniência do paciente, exigindo menos aplicações periódicas da composição terapêutica, talvez apenas 1 a 6 aplicações em comparação com as 140 aplicações requeridas pelos produtos da técnica anterior.

I. Definições/Nomenclatura

[042] Tal como aqui utilizado, a menos que indicado de outro modo, os termos em aberto tais como “contêm”, “contendo”, “incluem”, “incluindo”, e semelhantes significam compreendendo.

[043] Algumas formas de realização aqui contemplam intervalos numéricos. Quando um intervalo numérico é fornecido, o intervalo inclui os pontos de extremidade do intervalo, a menos que indicado de outra forma. Salvo indicação em contrário, os intervalos numéricos incluem todos os valores e subintervalos neles contidos como se explicitamente escritos.

[044] Alguns dos valores aqui descritos são modificados pelo termo “cerca de”. Em alguns casos, o termo “cerca de” em relação a um valor numérico de referência pode incluir um intervalo de valores mais ou menos 10% desse valor. Por exemplo, a quantidade “cerca de 10” pode incluir quantidades de 9 a 11. Em outras formas de realização, o termo “cerca de” em relação a um valor numérico de referência pode incluir um intervalo de valores mais ou menos 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2 % ou 1% desse valor.

[045] Tal como aqui utilizado, o artigo “um, uma” significa um ou mais, a menos que explicitamente indicado em contrário.

[046] Quando os métodos e etapas aqui descritos indicam determinados eventos que ocorrem em determinada ordem, os especialistas na técnica reconhecerão que a ordenação de certas etapas pode ser modificada e que tais modificações estão de acordo com as variações da invenção. Adicionalmente, certas etapas podem ser realizadas simultaneamente em um processo paralelo quando possível, assim como executadas sequencialmente.

[047] O significado das abreviaturas é o seguinte: “C” significa Celsius ou graus Celsius, como é evidente a partir de seu uso, “μL” ou “uL” ou “ul” significa microlitro(s), “mL” significa mililitro(s), “L” significa litro(s), “mm” significa significa milímetro(s), “nm” significa nanômetros, “mM” significa milimolar, “μM” ou “uM” significa micromolar, “M” significa molar, “mmol” significa milimol(s), “μmol” ou “uMol” significa micromol(s)”, “g” significa grama(s), “μg” ou “ug” significa micrograma(s) e “ng” significa nanograma(s), “% p/v” significa percentual em peso/volume, “% v/v” significa percentual em volume/volume, “HPLC” significa cromatografia líquida de alta eficiência, “UPLC” significa cromatografia líquida de ultraeficiência e “GC” significa cromatografia gasosa.

[048] O termo “homologia” se refere ao alinhamento ideal de sequências (ou nucleotídeos ou aminoácidos), que pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos. A “homologia”, no que diz respeito a polinucleotídeos, por exemplo, pode ser determinada por análise com BLASTN versão 2.0 utilizando os parâmetros padrão. “Homologia”, com respeito a polipeptídeos (ou seja, aminoácidos), pode ser determinada utilizando um programa, tal como BLASTP versão 2.2.2 com os parâmetros padrão, que alinha o polipeptídeo ou fragmentos (e também pode alinhar fragmentos nucleotídicos) a ser comparados e determina a extensão da identidade de aminoácidos ou semelhança entre eles.

[049] As descrições e métodos acima para homologia de sequência pretendem ser exemplificativos e é reconhecido que este conceito é bem compreendido na técnica. Além disso, é apreciado que as sequências de ácido nucleico podem ser variadas e ainda proporcionam uma enzima funcional, e tais variações estão dentro do âmbito da presente invenção. O termo “homólogo de enzima” pode também significar uma variante funcional.

[050] Tal como aqui utilizado, o termo “carreador” pretende referir-se amplamente a qualquer substância biologicamente compatível que possa servir como veículo de entrega para PDGF, ao passo que os termos “matriz” e “suporte” são utilizados de forma intermutável para se referirem a um suporte que atua como um substrato para a fixação de células e/ou crescimento interno vascular à medida que a ferida cicatriza, e/ou proporciona um meio para aprisionar o PDGF dentro da sua estrutura (tal como, por exemplo, através de poros interligados), permitindo assim uma entrega contínua ou retardada ou prolongada de PDGF à medida que a ferida cicatriza.

II. Novo método de Tratamento de Feridas

[051] A presente invenção proporciona novos métodos de tratamento de feridas. Em uma forma de realização, um método de tratamento de uma ferida compreende fornecer uma composição terapêutica compreendendo uma solução de PDGF incorporada em um suporte, matriz ou carreador biocompatível e aplicar a composição terapêutica a uma ferida. Uma composição terapêutica compreendendo uma solução de PDGF incorporada em um suporte, matriz ou carreador biocompatível, por exemplo, pode ser aplicada topicamente à ferida. Em algumas formas de realização, um método de tratamento de uma ferida compreende múltiplas aplicações periódicas de uma composição terapêutica a uma ferida durante um período de semanas.

[052] De acordo com um aspecto da presente invenção, o novo método de tratamento para tratar feridas inclui as seguintes etapas: (1) desbridar a ferida conforme necessário para remover tecido necrótico ou infectado; (2) formar uma composição terapêutica compreendendo rhPDGF-BB estéril e um carreador biocompatível poroso estéril; (3) aplicar a composição terapêutica contendo PDGF à superfície da ferida, em que o carreador proporciona um substrato para ligação de células e crescimento interno vascular à medida que a ferida cicatriza; (4) cobrir a ferida com um curativo; e (5) monitorar a cicatrização da ferida durante um período de tratamento e repetir as etapas (1) - (4) em intervalos de tratamento de 3 ou mais dias.

[053] O novo método de tratamento pode ainda incluir a preparação da nova composição terapêutica antes da sua aplicação à superfície da ferida, em que a composição compreende PDGF e uma matriz biológica. O método de preparação da composição pode incluir: (2a) reconstituir um pó de PDGF estéril liofilizado (seco por congelamento) com água estéril, solução salina, um tampão, ou uma solução fisiológica para proporcionar uma concentração segura e terapêutica específica de PDGF; e (1b) retirar a solução de PDGF estéril de um frasco (recipiente) e adicioná-lo assepticamente a uma matriz ou penso estéril hidrofílico seco, de tal modo que a matriz ou o penso seja umedecido com a solução de PDGF.

[054] Em algumas formas de realização, o curativo é um curativo oclusivo ou semioclusivo. Em algumas formas de realização, a repetição das etapas (1) a (3) também pode compreender as etapas de: (A) remover o curativo e limpar a ferida com solução salina ou um agente de limpeza de feridas antisséptico apropriado antes de aplicar a composição terapêutica ao curativo, e (B) cobrir a ferida com um novo curativo após aplicação da composição terapêutica. Em algumas formas de realização, novas composições terapêuticas bioativas aqui descritas podem ser utilizadas em combinação com outros aspectos do tratamento de feridas, incluindo, por exemplo, controle de infecção, terapia de feridas com pressão negativa e/ou instrução do doente para evitar colocar pressão sobre o local da ferida.

[055] De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um cronograma para retratar a ferida periodicamente, isto é, repetir as etapas (2) - (4) ou reaplicar periodicamente a composição terapêutica à ferida. O número real de retratamentos e a frequência de retratamento (ou seja, o intervalo de tratamento) devem ser determinados com base em um número de fatores, incluindo a gravidade da ferida (por exemplo, o seu grau, tamanho e profundidade), a extensão à qual está comprometido o ambiente de cicatrização natural da ferida (por exemplo, o suprimento vascular no local, o estado metabólico do paciente, a capacidade de descarregar a pressão sobre o local, a presença de infecção, o estágio do diabetes para uma DFU, o grau de queimadura para uma queimadura), idade do paciente, duração da ferida e outras comorbidades tais como tabagismo, obesidade, níveis de glicose descontrolados, adesão do paciente e outros. O número de retratamentos e a frequência de retratamento devem ser aumentados para feridas mais graves ou para feridas com ambientes de cicatrização mais comprometidos. Além disso, o número prescrito de tratamentos e/ou a frequência de retratamentos podem ser ajustados durante o período de tratamento com base na taxa de cicatrização da ferida, isto é, aumentar o número de retratamentos e/ou a frequência de retratamento para feridas de cicatrização mais lenta ou diminuir o número de retratamentos e/ou a frequência de retratamentos para feridas de cicatrização mais rápida.

[056] De acordo com um aspecto da invenção, a frequência de retratamento é pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 6 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias ou pelo menos cerca de 15 dias e assim sucessivamente até pelo menos cerca de uma vez a cada seis semanas, ou suas combinações. De acordo com outro aspecto da invenção, a frequência de retratamento é de uma vez a cada 2 a 42 dias, ou uma vez a cada 3 a 42 dias, ou uma vez a cada 2 a 28 dias, ou uma vez a cada 3 a 28 dias, ou uma vez a cada 2 a 7 dias, ou uma vez a cada 3 a 7 dias, ou uma vez a cada 4 a 21 dias, uma vez a cada 7 a 28 dias, ou uma vez a cada 7 a 21 dias, ou uma vez a cada 7 a 14 dias, ou uma vez a cada 10 a 15 dias, ou uma vez a cada 12 a 14 dias. De acordo com outro aspecto da invenção, a frequência de retratamento é uma vez a cada 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 12 dias, 14 dias, 15 dias, 21 dias, 28 dias, 30 dias, 35 dias, 42 dias, ou combinações destes.

[057] De acordo com outro aspecto da invenção, a frequência de retratamento é substancialmente a mesma durante o período de tratamento, e a frequência de retratamento é uma vez pelo menos aproximadamente a cada 2 dias, pelo menos aproximadamente a cada 3 dias, pelo menos aproximadamente a cada 4 dias, pelo menos aproximadamente a cada 5 dias, pelo menos aproximadamente a cada 6 dias, pelo menos aproximadamente a cada 7 dias, pelo menos aproximadamente a cada 8 dias, pelo menos aproximadamente a cada 9 dias, pelo menos aproximadamente a cada 10 dias, pelo menos aproximadamente a cada 11 dias, pelo menos aproximadamente a cada 12 dias, pelo menos aproximadamente a cada 13 dias, pelo menos aproximadamente a cada 14 dias ou pelo menos aproximadamente a cada 15 dias e assim por diante, até pelo menos aproximadamente uma vez a cada seis semanas.

[058] De acordo com um aspecto da invenção, a ferida é retratada pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes durante o período de tratamento. De acordo com outro aspecto da invenção, a ferida é retratada entre 0 e 6 vezes, entre 0 e 7 vezes, ou entre 0 e 8 vezes ao longo do período de tratamento. De acordo com outro aspecto da invenção, a ferida é tratada entre 1 a 8 vezes, ou entre 2 a 7 vezes, ou entre 3 a 6 vezes ao longo do período de tratamento. De acordo com outro aspecto da invenção, a ferida é retratada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou 20 vezes ao longo do período de tratamento. De acordo com outro aspecto da invenção, a ferida é retratada entre 0 e 46 vezes, ou entre 1 e 46 vezes, ou entre 0 e 20 vezes, ou entre 1 e 20 vezes, ou entre 0 e 27 vezes, ou entre 1 e 27 vezes.

[059] De acordo com um aspecto da invenção, a quantidade total cumulativa de rhPDGF-BB aplicado à ferida durante o período de tratamento é preferencialmente superior a 0 mg, porém inferior a cerca de 50 mg, ou inferior a cerca de 25 mg, ou inferior a cerca de 20 mg ou inferior a cerca de 15 mg ou inferior a cerca de 10 mg ou inferior a cerca de 5 mg ou inferior a cerca de 4 mg ou inferior a cerca de 3 mg ou inferior a cerca de 2 mg ou inferior a cerca de 1 mg de rhPDGF-BB. Em certas formas de realização, a quantidade total cumulativa de rhPDGF-BB aplicada à ferida durante o período de tratamento é preferencialmente entre cerca de 0,1 mg a cerca de 50 mg; ou cerca de 0,5 mg a cerca de 25 mg; ou cerca de 1 mg a cerca de 10 mg; ou cerca de 2,5 mg a cerca de 8 mg; ou cerca de 3 mg a cerca de 7 mg; cerca de 4 mg a cerca de 6 mg.

[060] Os vários retratamentos podem envolver a mesma ou diferentes dosagens de rhPDGF-BB, ou em termos da quantidade exata de rhPDGF-BB que é aplicada à ferida (isto é, “dosagem absoluta”) ou em termos da quantidade de RhPDGF-BB que é aplicada por centímetro quadrado (cm2) da área da ferida (isto é, “dose de área”). De acordo com um aspecto da invenção, cada tratamento aplica uma dosagem absoluta entre cerca de 10 μg e cerca de 50 mg, ou entre cerca de 10 μg e cerca de 25 mg, ou entre cerca de 10 μg e cerca de 20 mg, ou entre cerca de 10 μg e cerca de 15 mg, ou entre cerca de 10 μg e cerca de 10 mg, ou entre cerca de 10 μg e cerca de 5 mg de RhPDGF-BB ou entre cerca de 10 ug e cerca de 1 mg de rhPDGF-BB. De acordo com outro aspecto da invenção, cada tratamento aplica uma dosagem de área entre cerca de 10 μg de PDGF/cm2 e cerca de 1,0 mg de PDGF/cm2, ou entre cerca de 10 μg de PDGF/cm2 e cerca de 0,5 mg de PDGF/cm2, ou entre cerca de 10 μg de PDGF/cm2 e cerca de 0,25 mg de PDGF/cm2, ou entre cerca de 10 μg de PDGF/cm2 e 0,1 mg de PDGF/cm2, ou entre cerca de 10 μg de PDGF/cm2 e cerca de 0,05 mg de PDGF/cm2. Em certas formas de realização, cada tratamento com rhPDGF-BB é preferencialmente entre cerca de 10 μg a 1000 μg de PDGF/cm2; ou cerca de 0,01 mg a cerca de 50 mg de PDGF/cm2; ou cerca de 0,05 mg a cerca de 25 mg de PDGF/cm2; ou cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg de PDGF/cm2; ou cerca de 0,2 mg a cerca de 2 mg de PDGF/cm2. Em certas formas de realização, cada tratamento aplica uma dosagem de área que é pelo menos cerca de 10 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos cerca de 25 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida ou pelo menos cerca de 50 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida ou pelo menos cerca de 100 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos cerca de 250 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos cerca de 500 μg de rhPDGF/cm2 da área da superfície da ferida. Em certas formas de realização, cada tratamento aplica uma dosagem de área que está entre cerca de 10 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida e cerca de 500 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou entre cerca de 10 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida e cerca de 100 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou entre cerca de 15 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida e cerca de 375 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida ou entre cerca de 30 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida e cerca de 190 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou entre cerca de 30 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida e cerca de 300 μg de rhPDGF/cm2 de área de superfície da ferida.

[061] De acordo com um aspecto da invenção, o tratamento inicial com composições de acordo com a presente invenção pode ser o tratamento mais importante. PDGF facilita o processo de cicatrização de feridas através do seu efeito sobre a proliferação celular (mitogênese) e o movimento celular dirigido (quimiotaxia), bem como a revascularização (geração de novos vasos sanguíneos). Demonstrou-se que muitas células possuem receptores (locais de ligação) para PDGF, incluindo tecidos conjuntivos (pele, osso, cartilagem, tendão e ligamentos), células de vasos sanguíneos e células do sistema nervoso. As células que possuem receptores para PDGF respondem migrando para o local da ferida (onde o PDGF está presente em níveis elevados como resultado da aplicação de composições terapêuticas de acordo com a presente invenção) e, subsequentemente, proliferando após a ligação ao PDGF. Uma vez que o receptor de PDGF é degradado rapidamente após a ativação, a proliferação celular é controlada e limitada pela presença de PDGF localmente disponível, bem como pela interação célula-célula que leva as células a prosseguir da fase proliferativa da cicatrização de feridas para a da deposição de matriz que, em última instância, resulta em cura completa. Como resultado, um bolo crítico de rhPDGF-BB deve ser aplicado durante o tratamento inicial para assegurar que o processo de cicatrização natural do paciente seja apropriadamente ativado. Por conseguinte, de acordo com a invenção, o tratamento inicial compreende a aplicação de uma composição terapêutica contendo uma dose de área que é pelo menos 10 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, até 5000 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 20 μg de PDGF/cm2 até 1000 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 30 μg de PDGF/cm2 até 600 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 40 μg de PDGF/cm2 até 400 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 50 μg de PDGF/cm2 até 350 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 60 μg de PDGF/cm2 até 300 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 200 μg de PDGF/cm2 até 2000 μg de PDGF/cm2 da área da superfície da ferida. De acordo com outro aspecto da invenção, o tratamento inicial compreende aplicar uma composição terapêutica contendo uma dose de área que é pelo menos 10 μg de PDGF/cm2 de área de superfície de ferida ou pelo menos 20 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida ou pelo menos 25 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 30 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 40 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 50 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 60 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 70 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 80 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida ou pelo menos 90 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 100 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 250 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida, ou pelo menos 500 μg de PDGF/cm2 de área de superfície da ferida.

[062] De acordo com outro aspecto da invenção, cada tratamento aplica-se entre cerca de 4 μl de solução de PDGF/cm3 de carreador (que pode ser uma matriz tal como uma esponja de colágeno) até cerca de 40 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,1 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 30 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,2 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 20 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,1 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 10 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,25 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,25 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 2,5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,1 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 1 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 0,5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 1,5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador. Em certas formas de realização, a solução de PDGF contém cerca de 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB.

[063] De acordo com outro aspecto da invenção, cada tratamento aplica-se entre cerca de 1,2 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 12 mg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 30 μg PDGF/cm3 de carreador a cerca de 9 mg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 60 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 6 mg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 3 mg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 1,5 mg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 750 μg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 120 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 600 μg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 150 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 450 μg de PDGF/cm3 de carreador; ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 225 μg de PDGF/cm3 de carreador.

[064] De acordo com um aspecto da invenção, a dosagem absoluta do tratamento com PDGF inicial pode ser maior do que as dosagens de retratamento subsequentes. A dosagem absoluta do tratamento com PDGF inicial pode ser cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, ou cerca de 50% mais elevada, ou até cerca de 300% mais elevada do que cada uma das dosagens de PDGF do retratamento subsequente.

[065] De acordo com um aspecto da invenção, o método inclui o armazenamento do PDGF à temperatura ambiente, geralmente entre 16 e 32 graus C. Antes da utilização, ele pode ser reconstituído com água estéril, solução salina, um tampão ou outra solução fisiológica para formar uma solução com a concentração desejada de PDGF. A solução é, então, adicionada a um carreador, de preferência uma matriz celular (por exemplo, uma esponja de colágeno) tendo a porosidade desejada no volume desejado para molhar a matriz. A matriz embebida em rhPDGF é, então, aplicada à superfície da ferida. Se a ferida for uma ferida externa, ela é então coberta com um curativo para feridas. Este processo pode então ser repetido de acordo com os parâmetros de frequência e duração descritos acima, até a ferida ser substancialmente cicatrizada.

III. Novas Composições Terapêuticas para o Tratamento de Feridas

[066] A presente invenção também proporciona novas composições terapêuticas para o tratamento de feridas, que compreendem PDGF estéril incorporado em um carreador, matriz ou suporte estéril biocompatível. Por exemplo, a composição terapêutica pode ser aplicada topicamente a uma ferida para facilitar a cicatrização da ferida.

[067] De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionada uma composição terapêutica que compreende uma solução de rhPDGF-BB e um carreador que é preferencialmente um suporte celular biocompatível, em que a solução de rhPDGF- BB é disposta ou incorporada ao suporte celular. Em algumas formas de realização, a solução de rhPDGF-BB compreende entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml de rhPDGF-BB; ou entre cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1 mg/ml de rhPDGF-BB; ou entre cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 0,4 mg/ml de rhPDGF-BB. De acordo com um aspecto da invenção, a solução de rhPDGF-BB contém rhPDGF-BB a uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml; ou cerca de 0,1 mg/ml; ou cerca de 0,2 mg/ml; ou cerca de 0,25 mg/ml; ou cerca de 0,3 mg/ml; ou cerca de 0,35 mg/ml; ou cerca de 0,4 mg/ml; ou cerca de 0,5 mg/ml; ou cerca de 0,6 mg/ml; ou cerca de 0,7 mg/ml; ou cerca de 0,8 mg/ml; ou cerca de 0,9 mg/ml; ou cerca de 1 mg/ml; ou cerca de 2 mg/ml; ou cerca de 3 mg/ml; ou cerca de 4 mg/ml; ou cerca de 5 mg/ml.

[068] Em algumas formas de realização, a solução de rhPDGF-BB é uma solução asséptica pré-formulada de PDGF compreendendo os elementos aqui descritos (por exemplo, concentração de PDGF, composição de solução estéril, etc.). Em outras formas de realização, a solução de rhPDGF-BB é formada no momento da utilização, preferencialmente combinando uma solução estéril (por exemplo, água estéril, solução salina, uma solução tampão ou uma solução fisiológica) com um pó estéril compreendendo ou consistindo essencialmente em rhPDGF-BB liofilizado. A solução estéril é utilizada para reconstituir o rhPDGF-BB liofilizado. O rhPDGF-BB liofilizado é formado por liofilização de rhPDGF- BB líquido produzido utilizando um sistema de expressão recombinante como descrito mais adiante aqui em condições assépticas.

[069] Em outro aspecto da invenção, o rhPDGF pode ser incorporado ao carreador, de preferência um suporte celular absorvível biocompatível, estéril, e o carreador saturado de PDGF é então liofilizado para formar um dispositivo seco, estéril, que incorpora rhPDGF. Qualquer técnica conhecida para liofilizar proteínas recombinantes pode ser utilizada para liofilizar rhPDGF-BB, desde que proporcione um pó estéril. O pó de rhPDGF-BB liofilizado resultante é capaz de ser armazenado à temperatura ambiente e ainda manter pelo menos cerca de 80% de sua bioatividade durante pelo menos cerca de 6 meses, ou pelo menos cerca de 1 ano, ou pelo menos cerca de 2 anos, ou pelo menos Cerca de 3 anos. O dispositivo liofilizado estéril pode então ser aplicado diretamente a um local da ferida ou umedecido por sangue ou outra solução estéril antes da colocação na ferida.

[070] Devido ao fato de o PDGF ter uma tendência para aderir às superfícies de um recipiente, tal como um frasco, (particularmente a pH’s mais elevados) alcançar a reconstituição de 100% do PDGF liofilizado em um frasco pode ser desafiador. Deste modo, em determinadas formas de realização, aditivos podem ser incluídos na solução de PDGF para baixar o seu pH abaixo de cerca de 7, ou abaixo de cerca de 6, ou abaixo de cerca de 5 ou abaixo de cerca de 4 ou abaixo de cerca de 3. Os aditivos que podem facilitar a reconstituição do PDGF liofilizado incluem sais, proteínas carreadoras tais como albumina ou soluções de pH baixo tais como ácido acético diluído ou ácido clorídrico. Se a solução de PDGF for muito ácida, no entanto, poderia impactar negativamente o suporte biocompatível. Por conseguinte, em certas formas de realização, o PDGF liofilizado é reconstituído em uma solução com um pH abaixo de cerca de 5 e, uma vez que o PDGF é substancialmente reconstituído completamente, é adicionada uma solução de base para aumentar o pH da solução de PDGF a entre cerca de 6 a cerca de 8, ou para o aumentar a cerca de 7 antes de ser combinado com o suporte biocompatível. Tal etapa de ajuste do pH é particularmente útil quando o suporte biocompatível é uma esponja de colágeno.

[071] A solução tampão utilizada para reconstituir o rhPDGF-BB liofilizado pode compreender, mas não está limitada a, água, solução salina, carbonatos, fosfatos (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), histidina, acetatos (por exemplo, acetato de sódio), tampões ácidos tais como ácido acético e HCl, e tampões orgânicos tais como lisina, tampões Tris (por exemplo, tris(hidroximetil) aminoetano), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2- etanossulfônico (HEPES) e ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS). De preferência, a solução tampão é estéril. Os tampões podem ser selecionados com base na biocompatibilidade com PDGF e a capacidade do tampão de impedir a modificação indesejável da proteína. Os tampões podem ser adicionalmente selecionados com base na compatibilidade com tecidos de feridas. Em uma forma de realização, utiliza-se tampão de acetato de sódio. Os tampões podem ser empregues a diferentes molaridades, por exemplo, cerca de 0,1 mM a cerca de 100 mM, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM, ou cerca de 15 mM a cerca de 25 mM, ou qualquer molaridade dentro destes intervalos. Em algumas formas de realização, utiliza-se um tampão de acetato a uma molaridade de cerca de 20 mM.

[072] Conforme mencionado acima, a solução de rhPDGF-BB é combinada com um carreador para formar uma composição terapêutica. O carreador pode ser uma matriz ou suporte que atue como um substrato para ligação de células e/ou crescimento interno vascular à medida que a ferida cicatriza, e/ou proporciona um meio para capturar o PDGF dentro da sua estrutura (tal como, por exemplo, através de poros interligados), assim permitindo uma entrega contínua ou retardada ou prolongada de PDGF à medida que a ferida cicatriza e a matriz ou suporte é reabsorvido pelo corpo. Em algumas formas de realização, o carreador ou matriz é um suporte celular biocompatível, reabsorvível. O carreador ou matriz pode compreender polímeros naturais tais como colágeno, gelatina, fibrina, alginato, celulose, quitosano ou fibronectina. O carreador ou matriz pode também compreender polímeros sintéticos biocompatíveis selecionados a partir do grupo de polímeros sintéticos tais como poli(DL- lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA), poli(DL-lactídeo)(PDLA), poli(L-lactídeo)PLLA), poli(e-caprolactona)(PCL), poliuretano ou outros. O carreador ou matriz pode também ser uma mistura de tais polímeros naturais e sintéticos. Em algumas formas de realização, a matriz compreende uma esponja de colágeno ou gelatina, a qual pode ser uma esponja de colágeno Tipo 1. Uma esponja de colágeno mantém o rhPDGF no local da ferida e simultaneamente proporciona um suporte para o crescimento celular, resultando em uma maior facilidade para o usuário e uma cicatrização mais rápida e completa. Em um aspecto da invenção, o carreador ou matriz, que pode ser uma esponja de colágeno, tem uma porosidade entre cerca de 10 mícrons a cerca de 2 mm, ou cerca de 50 mícrons a cerca de 1000 mícrons, ou cerca de 100 mícrons a cerca de 500 mícrons. O tamanho médio dos poros pode estar entre cerca de 50 mícrons a cerca de 500 mícrons e em que a maioria dos poros está interligada.

[073] Em algumas formas de realização, os materiais de carreador ou matriz são biorreabsorvíveis. Um material de carreador ou matriz, em uma forma de realização, pode ser pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 90% ou 100% reabsorvido dentro de um mês subsequente à sua aplicação à ferida. A capacidade de biorreabsorção dependerá: (1) da natureza do material (isto é, sua composição química, estrutura física e tamanho); (2) a localização dentro do corpo no qual o material é colocado; (3) a quantidade de material que é usado; (4) o estado metabólico do paciente (diabético/não diabético, fumante, idade avançada, etc.); e (5) a extensão e/ou tipo de ferida tratada.

[074] Em um aspecto da invenção, a solução de rhPDGF-BB e o carreador devem ser combinados em uma razão apropriada, de modo a formar uma composição terapêutica que tenha uma eficácia óptima na cicatrização de feridas. Em algumas formas de realização, a solução de rhPDGF-BB e o carreador são combinados em uma razão que está entre cerca de 4 μl de solução de PDGF/cm3 de carreador (que pode ser uma matriz tal como uma esponja de colágeno) até cerca de 40 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,1 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 30 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,2 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 20 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,1 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 10 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,25 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 5 mL de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,25 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 2,5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,1 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 1 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 0,5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 1,5 ml de solução de PDGF/cm3 de carreador.

[075] Em algumas formas de realização, o rhPDGF-BB e o carreador são combinados em uma razão que está entre cerca de 1,2 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 12 mg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 30 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 9 mg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 6 0 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 6 mg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 3 mg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 1,5 mg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 750 μg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 120 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 600 μg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 150 μg de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 450 μg de PDGF/cm3 de carreador, ou entre cerca de 75 μg de PDGF/cm3 de PDGF/cm3 de carreador a cerca de 225 μg de PDGF/cm3 de carreador.

[076] Em um aspecto da invenção, o carreador é um suporte e a razão rhPDGF-BB/suporte é tal que, quando a solução de rhPDGF-BB e o suporte são combinados, o suporte é capaz de aprisionar pelo menos cerca de 20%, 30%, 40% ou 50% até pelo menos cerca de 100% do rhPDGF-BB dentro dos poros do suporte, de tal modo que o rhPDGF-BB é liberado ao longo do tempo à medida que o suporte é absorvido pelo corpo do paciente, assim proporcionando entrega controlada de rhPDGF-BB no local da ferida durante um período prolongado de tempo e simultaneamente proporcionando uma matriz para novas células e crescimento interno de tecido. Em algumas formas de realização, o suporte é capaz de aprisionar entre cerca de 20% a cerca de 100%, ou entre cerca de 25% a cerca de 95%, ou entre 30% a cerca de 90% do rhPDGF-BB dentro dos poros do suporte. Os percentuais de aprisionamento de PDGF acima descritos são também aplicáveis ao aprisionamento de PDGF- BB liofilizado reconstituído.

[077] Podem ser utilizadas várias quantidades de rhPDGF- BB nas composições terapêuticas da presente invenção. De acordo com um aspecto da invenção, a quantidade total de rhPDGF-BB incluída na composição terapêutica é inferior a 50 mg; ou inferior a 25 mg; ou inferior a 10 mg; ou inferior a 5 mg; ou inferior a 2,5 mg ou inferior a 1 mg. De acordo com outro aspecto da invenção, a quantidade total de rhPDGF-BB incluída na composição terapêutica é de cerca de 50 mg; ou cerca de 25 mg; ou cerca de 10 mg; ou cerca de 1,0 mg; ou cerca de 0,5 mg; ou cerca de 0,1 mg.

[078] A concentração de PDGF em formas de realização da presente invenção pode ser determinada utilizando um imunoensaio ligado à enzima, como descrito nas Patentes US nos 6.221.625, 5.747.273 e 5.290.708, aqui incorporadas por referência, ou qualquer outro ensaio conhecido na arte para a determinação da concentração de PDGF. A concentração de PDGF nas formas de realização da presente invenção é inferior a cerca de 10 mg/g; ou inferior a cerca de 5 mg/g; ou inferior a cerca de 1 mg/g; ou inferior a cerca de 0,5 mg/g; ou inferior a cerca de 0,1 mg/g; ou inferior a cerca de 0,05 mg/ml. Em outro aspecto da invenção, a concentração de PDGF nas formas de realização da presente invenção situa-se entre cerca de 0,05 mg/g a cerca de 5 mg/g; ou entre cerca de 0,1 mg/g a cerca de 1 mg/g ou entre cerca de 0,25 mg/g e cerca de 0,5 mg/g.

[079] O PDGF-BB usado na composição terapêutica da presente invenção pode ser derivado de qualquer fonte, tal como fonte natural, fonte sintética ou fonte recombinante. De acordo com um aspecto da invenção, o PDGF é produzido por técnicas de DNA recombinante. Quando o PDGF é produzido por técnicas de DNA recombinante, uma sequência de DNA que codifica um único monômero (por exemplo, cadeia B de PDGF) é inserida em células cultivadas para expressão do monômero da cadeia B. O monómero é então extraído e isolado a partir da cultura celular e redobrado para formar o homodímero biologicamente ativo (por exemplo, PDGF-BB), que pode ser posteriormente processado para purificação adicional. De acordo com um aspecto da invenção, as células cultivadas são células procarióticas ou são células de E. coli. O rhPDGF- BB produzido através destas técnicas recombinantes pode ser purificado de acordo com as técnicas descritas no documento PCT n° WO 2005/077973, que é aqui incorporado.

[080] Como observado acima, os métodos de produção de DNA recombinante da técnica anterior resultaram em misturas de fragmentos de rhPDGF-BB. De acordo com um aspecto da invenção, substancialmente todo o rhPDGF-BB incluído nas composições terapêuticas aqui descritas são cadeias não cortadas intactas. De acordo com um aspecto da invenção, o sistema de expressão bacteriana é um sistema de expressão de E. coli, e a proteína resultante é purificada utilizando cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, filtração em gel ou cromatografia de troca iônica, ou alguma combinação destes, em que o RhPDGF-BB resultante contido na composição de proteína purificada é pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97% de rhPDGF-BB não cortado em uma base ponderal.

[081] Em algumas formas de realização, o rhPDGF-BB incluído nas composições terapêuticas da presente invenção é um rhPDGF-BB que compreende ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% de homologia com a SEQ ID NO. 1, que é fornecida abaixo:

[082] De acordo com outro aspecto da invenção, o rhPDGF- BB incluído nas composições terapêuticas da presente invenção compreende ou consiste essencialmente em pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97% de rhPDGF-BB não cortado em uma base ponderal. De acordo com outro aspecto da invenção, o rhPDGF-BB incluído nas composições terapêuticas da presente invenção compreende ou consiste essencialmente em pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97% de rhPDGF-BB que compreende ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% de homologia com a SEQ ID NO. 1.

[083] Em algumas formas de realização, os componentes que compreendem as novas composições da presente invenção são fornecidos em um kit. Um kit pode compreender três componentes: a) frasco de pó liofilizado de rhPDGF-BB estéril, b) frasco de água estéril, um tampão, solução salina ou uma solução fisiológica, e c) um carreador.

[084] O kit pode ser armazenado em temperatura ambiente por até 3 anos. Em algumas formas de realização, o armazenamento está entre 16 e 32 graus C. Em algumas formas de realização, o pó incluído no kit compreende uma quantidade predeterminada de PDGF. Em algumas formas de realização, a quantidade de PDGF é consistente com os valores aqui proporcionados. Em algumas formas de realização, o carreador está incluído em uma embalagem blister compreendendo uma quantidade predeterminada de carreador. Em algumas formas de realização, a quantidade de carreador é consistente com os valores aqui proporcionados, e o tipo de carreador é consistente com os materiais aqui descritos.

[085] No momento do uso, o rhPDGF-BB no kit será reconstituído com água estéril, solução salina, tampão ou solução fisiológica e o carreador será moldado ao tamanho da ferida. Depois de cortar o carreador para ajustar à ferida, ele será embebido com a solução de rhPDGF de tal modo que a solução satura completamente os poros internos do carreador. O carreador saturado com rhPDGF será então aplicado à ferida desbridada e coberto com um curativo para feridas. Este processo é repetido de acordo com os cronogramas de tempo acima descritos.

IV. Métodos de Tratamento de Vários Tipos de Feridas

[086] Os métodos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de uma variedade de feridas, incluindo úlceras diabéticas, úlceras por pressão, úlceras neuropáticas, úlceras vasculares, queimaduras, feridas agudas acidentais e feridas cirúrgicas. Existem vários sistemas de classificação de feridas e podem ser utilizados para identificar feridas que os métodos e composições da presente invenção são particularmente úteis no tratamento. Dois desses sistemas de classificação de úlceras incluem o sistema de classificação de Wagner (veja Wagner (1987) Orthopedics 10:163-72) e o sistema de classificação da Universidade de Texas (veja Lavery (1996) J Foot Ankle Surg 35: 528-31). O sistema de Wagner classifica a ferida pela profundidade da ferida e a presença de infecção. Ele tem cinco graus numéricos: Grau 1: Úlcera Diabética Superficial Grau 2: Extensão da Úlcera Envolve ligamento, tendão, cápsula articular ou fáscia Sem abscesso ou Osteomielite Grau 3: úlcera profunda com abscesso ou osteomielite Grau 4: Gangrena à parte do antepé Grau 5: Extensa gangrena do pé

[087] A classificação da Universidade do Texas tem quatro graus numéricos baseados na profundidade da ferida. Além disso, existem quatro graus de letra, A a D, relacionados à infecção e isquemia. O sistema de classificação da Universidade do Texas inclui: Estágios Estágio A: Sem infecção ou isquemia Estágio B: Infecção presente Estágio C: Isquemia presente Estágio D: Infecção e isquemia presentes Avaliação Grau 0: ferida epitelial Grau 1: ferida superficial Grau 2: a ferida penetra no tendão ou na cápsula Grau 3: a ferida penetra no osso ou na articulação

[088] Uma ferida com um grau numérico de 3 e grau de letra de D, por exemplo, seria uma ferida que penetra no osso ou articulação e está infectada e isquêmica. De acordo com um aspecto da presente invenção, os métodos e composições da presente invenção são utilizados para tratar uma ferida que é uma ferida de grau 2, grau 3 ou grau 4, de acordo com o sistema de classificação de Wagner, ou um grau 1, 2 ou 3 (estágios A, B, C ou D) no sistema de classificação da Universidade do Texas.

[089] Em algumas formas de realização, os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para tratar feridas tais como úlceras de extremidades inferiores e, em particular, úlceras de pé em pacientes diabéticos. Os métodos e composições da presente invenção são particularmente úteis no tratamento de úlceras diabéticas de extremidades inferiores não cicatrizantes que não conseguiram cicatrizar em cerca de 50% após cerca de 4 semanas de terapias convencionais sob o tratamento padrão atual, como descrito acima na sessão Antecedentes.

[090] Em algumas formas de realização, as composições da presente invenção são utilizadas para tratar queimaduras em combinação com um enxerto de pele de espessura dividida em malha de 1:1,5 ou 1:1,3 (a malha permite que o enxerto cubra uma área mais larga, mas deixe pequenas aberturas necessárias para cicatrização), abdominoplastias (assim chamadas “tummy tucks”), cicatrização após outros tipos de cirurgias plásticas e reconstrutivas, ou feridas pós-amputação.

V. Elementos Terapêuticos Adicionais

[091] As composições terapêuticas da presente invenção podem incluir elementos terapêuticos adicionais para facilitar ainda mais a cicatrização de uma ferida. Em algumas formas de realização, as soluções compreendendo PDGF podem ainda compreender componentes adicionais, tais como outros agentes biologicamente ativos. Em outras formas de realização, as soluções compreendendo PDGF podem ainda compreender meios de cultura de células, outras proteínas estabilizadoras tais como albumina, agentes antibacterianos, inibidores de protease [por exemplo, ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), ácido etileno glicol- bis(beta-aminoetileter)-N,N,N’,N’-tetra-acético (EGTA), aprotinina, ácido ε-aminocaproico (EACA), etc.] e/ou outros fatores de crescimento tais como fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), fatores de crescimento transformadores TGFs), fatores de crescimento de queratinócitos (KGFs), fatores de crescimento semelhantes a insulina (IGFs) ou outros PDGFs incluindo composições de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC e/ou PDGF-DD. Além disso, agentes biologicamente ativos que podem ser incorporados nas composições da presente invenção, em adição ao PDGF, podem compreender moléculas orgânicas, materiais inorgânicos, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos (por exemplo, genes, fragmentos de genes, ácidos ribonucleicos de pequenas inserções [si-RNAs], sequências reguladoras de genes, fatores de transcrição nucleares e moléculas antissentido), nucleoproteínas, polissacarídeos (por exemplo, heparina), glicoproteínas e lipoproteínas. Exemplos adicionais não limitativos de compostos biologicamente ativos que podem ser incorporados nas composições da presente invenção, incluindo, por exemplo, agentes anticâncer, antibióticos, analgésicos, agentes anti- inflamatórios, imunossupressores, inibidores enzimáticos, anti-histamínicos, hormônios, relaxantes musculares, prostaglandinas, fatores tróficos, fatores de crescimento e vacinas, são descritos no pedido de patente US n° de série 11/159.533 (Publicação n°: 20060084602).

[092] São conhecidos na técnica protocolos e regimes padronizados para a entrega de agentes biologicamente ativos adicionais. Agentes biologicamente ativos adicionais podem ser introduzidos em composições da presente invenção em quantidades que permitem a entrega de uma dosagem apropriada do agente ao local da ferida. Na maioria dos casos, as dosagens são determinadas utilizando diretrizes conhecidas dos médicos e aplicáveis ao agente particular em questão. A quantidade de um agente biologicamente ativo adicional a ser incluído em uma composição da presente invenção pode depender de variáveis tais como o tipo e a extensão da condição, o estado geral de saúde do paciente particular, a formulação do agente biologicamente ativo, a cinética de liberação e a capacidade de biorreabsorção do suporte biocompatível. Podem ser utilizados ensaios clínicos padronizados para otimizar a dose e a frequência de dosagem para qualquer agente biologicamente ativo adicional particular.

EXEMPLOS Exemplo 1

[093] A eficácia de um curativo de colágeno para feridas contendo 0,3 mg/ml do fator-BB de crescimento derivado de plaquetas humano recombinante (rhPDGF-BB) foi avaliada no tratamento de feridas de espessura total induzidas cirurgicamente em camundongos tornados diabéticos por uma mutação no receptor de leptina (db/db).

A. Modelo de Estudo

[094] Quinze (15) camundongos db/db machos C57/B6 (Leprdb) com um peso corporal inicial de 41,46 g foram obtidos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), código de estirpe 000642. Os animais foram aclimatizados antes do início do estudo. Durante este período de 3 dias, os animais foram observados diariamente a fim de rejeitar animais que se apresentassem em más condições.

[095] Durante o estudo, todos os animais foram alojados individualmente em condições idênticas em gaiolas descartáveis. O estudo foi realizado em quartos de animais providos com ar filtrado com HEPA, a uma temperatura de 70 °F +/- 5 °F e umidade relativa de 50% +/- 20%. Os quartos dos animais foram ajustados para manter um mínimo de 12 a 15 trocas de ar por hora. O quarto estava em um temporizador automático para um ciclo claro/escuro de 12 horas e 12 horas sem crepúsculo. Material para o leito AlphaDry® foi utilizado. O material para o leito foi alterado um mínimo de uma vez por semana. Gaiolas, topos, garrafas, etc. foram lavados com um detergente comercial e deixados secar ao ar. Um desinfetante comercial foi usado para desinfetar superfícies e materiais introduzidos ao capô. Os pisos foram varridos diariamente e esfregados um mínimo de duas vezes por semana com um detergente comercial. Paredes e prateleiras das gaiolas foram esponjados um mínimo de uma vez por mês com uma solução de branqueamento diluída. Um cartão ou rótulo de gaiola com as informações apropriadas necessárias para identificar o estudo, dose, número de animal e grupo de tratamento marcou todas as gaiolas. A temperatura e a umidade relativa foram registradas durante o estudo, e os registros mantiveram-se. Os animais foram alimentados com uma dieta para roedor Purina Labdiet® 5053 estéril e água foi fornecida ad libitum.

[096] No início do estudo, os quinze (15) animais foram aleatoriamente e prospectivamente divididos em três (3) grupos de cinco (5) animais cada: Grupo 1 - Regranex Gel 0,01% rhPDGF-BB foi aplicado diariamente durante 21 dias como prescrito pelo folheto informativo; Grupo 2 - um curativo de colágeno para feridas combinado com tampão foi aplicado nos dias 0, 7 e 14; e Grupo 3 - foi aplicado um curativo de colágeno para feridas contendo 0,3 mg/ml de fator-BB de crescimento derivado de plaquetas humano recombinante (rhPDGF-BB) nos dias 0, 7 e 14.

[097] Cada animal foi identificado por uma punção na orelha correspondente a um número individual. No Dia 0, foram registados os pesos médios iniciais, para assegurar que os pesos médios iniciais eram comparáveis entre os grupos. Utilizou-se um cartão de gaiola para identificar cada gaiola ou rótulo marcado com o número do estudo (LYN-01), número do grupo de tratamento e o número de animais.

[098] Os artigos de PDGF de colágeno +/- de teste e de controlo foram administrados topicamente como curativos cirúrgicos (como descrito abaixo) imediatamente após a indução da ferida e foram trocados a cada sete (Q7) dias. Os locais tratados com Regranex foram tratados como prescrito nas Instruções de Uso (IFU) incluídas no folheto informativo do produto, incluindo a dosagem diária como descrito abaixo. Todos os curativos foram aplicados e mantidos no lugar usando Tegaderm™ e fixados no lugar fora da área da ferida com benzoína. No momento da troca do curativo, a área da ferida foi enxaguada com solução salina e o enxague foi recolhido e armazenado a -80 °C para futura análise da atividade de protease. Para os locais tratados com o curativo de colágeno para feridas, todo o colágeno não aderente foi suavemente removido da ferida de cicatrização, o local lavado com solução salina e o enxague recolhido como descrito. Depois da remoção do curativo e da coleta do enxague, mediu-se a ferida utilizando um calibrador e fotografou-se antes da reaplicação do curativo/artigo de teste. Todas as áreas de feridas foram relatadas em mm2.

[099] Para documentação fotográfica da cicatrização da ferida, a câmara foi montada sobre um tripé a uma distância ideal para assegurar que todas as fotografias fossem consistentes. Uma régua foi colocada de tal forma que foi capturada na imagem para permitir uma estimativa precisa do tamanho da lesão. Além das medidas de vida da área da ferida, todas as fotografias das feridas foram analisadas utilizando o Software ImageJ e a área da ferida foi traçada e quantificada no final do estudo.

[100] Os níveis de glicose no sangue foram determinados antes do início do estudo e novamente logo antes do sacrifício no Dia 21 para confirmar o estado da doença diabética. No final do estudo, o local da ferida foi coletado em NBF a 10% e preparado para histopatologia. O modelo do estudo está resumido abaixo na Tabela 1.Tabela 1 - Modelo do Estudo

B. Artigos de Teste e Preparação de Veículo

[101] As formulações tópicas utilizadas no estudo foram Regranex Gel (0,01% de rhPDGF-BB em gel de carboximetilcelulose) (Grupo 1); um curativo de colágeno para feridas umedecido com rhPDGF-BB (Grupo 3); e um curativo de colágeno para feridas umedecido com solução salina (Grupo 2). Todos os curativos foram cobertos com Tegaderm™ e presos com benzoína.

1. Composições de Curativo a. Dosagem de rhPDGF do Grupo 1

[102] Conforme descrito no Folheto Informativo da embalagem de Regranex, “cada centímetro quadrado de área da superfície da úlcera exigirá aproximadamente 0,25 cm de comprimento de gel espremido do tubo de 15 gramas”. Fórmula: (1 x p) -? 4 = cm de comprimento de Regranex. Para uma ferida quadrada de 1,5 cm x 1,5 cm: (1,5 x 1,5) + 4 = 0,56 cm de comprimento de Regranex. Conforme descrito no Folheto Informativo da Embalagem de Regranex, “o peso do gel Regranex do tubo de 15 g é de 0,25 g/cm de comprimento”. O Regranex é 0,01% de rhPDGF-BB ou 100 μg/g de Regranex. Para 0,56 cm de comprimento do produto, o peso do produto é de 14g para uma dose total de PDGF-BB de 14 μg. Para os locais tratados com Regranex durante 21 dias, a dose total máxima para o período de estudo (assumindo que não houve alteração no tamanho da ferida aberta a partir do Dia 0) seria de 14 μg/dia x 21 dias ou 294 μg de PDGF-BB. No entanto, nos Dias 7 e 14, a dimensão da ferida aberta foi determinada para todos os locais tratados com Regranex e a quantidade de Regranex aplicada foi recalculada utilizando a fórmula acima ([1 x p] * 4 = cm de comprimento de Regranex).

b. Doses de Solução Salina do Grupo 2 e rhPDGF do Grupo 2

[103] A concentração de rhPDGF-BB utilizada no estudo foi de 0,3 mg/ml ou 300 μg/ml. Para não exceder uma dose total para o período de estudo de 294 μg de PDGF-BB (mesma dose máxima total do estudo que Regranex), um total de 0,98 ml de 0,3 mg/ml de PDGF-BB seria aplicado ao local da ferida durante o período de estudo de 21 dias. Assumindo um total de 3 administrações (dias 0, 7 e 14), cada administração consistiria em ~327 μl de PDGF-BB sobre a esponja de colágeno representando uma dose de aproximadamente 98 μg de PDGFBB/administração (ligeiramente mais do que 7 vezes a dose individual inicial para locais tratados com Regranex). Isto representa um total de 145 μl por centímetro quadrado de área de superfície da ferida aberta (327 μl/2,25 cm2 de área de superfície da ferida).

[104] O volume de 0,3 mg/ml de PDGF-BB (Grupo 3) ou tampão/solução salina estéril (Grupo 2) a ser aplicado à nova esponja de colágeno nos Dias 7 e 14 foi determinado utilizando a seguinte fórmula:

[105] 145 x cm2 da área da ferida aberta (comprimento [cm] x largura [cm] de ferida aberta).

c. Esponja de Colágeno

[106] Como descrito acima para os locais tratados no Grupo 1, todas as feridas foram avaliadas e medidas nos Dias 7 e 14 para registar as medições de feridas abertas para cada local individual. Para os locais tratados com uma esponja de colágeno (Grupo 2 e Grupo 3), a esponja foi medida e cortada para se ajustar à parte de ferida aberta da ferida original após remoção do curativo, enxague suave do local e documentação dos achados, incluindo medições e documentação fotográfica.

C. Procedimentos Cirúrgicos

[107] No Dia 0, os animais foram anestesiados com isoflurano. O cabelo na parte de trás foi cortado e a pele esfregada com uma solução asséptica. Utilizou-se um molde para marcar um quadrado de 1,5 x 1,5 cm no meio do dorso do animal e fez-se uma ferida de espessura total, correspondente ao molde, excisando a pele e o panículo carnoso. Uma almofada de circulação de água quente ou equivalente foi colocada sob o animal para manter a temperatura corporal normal durante os procedimentos, e os animais foram recuperados em uma almofada de circulação de água quente semelhante. A buprenorfina (0,06 mg/kg) foi administrada por injeções subcutâneas imediatamente após a recuperação da anestesia e a cada 12 horas, em seguida durante 72 horas. A solução de Ringers aquecida (0,5 mL) foi administrada por injeção subcutânea após os camundongos terem recuperado a consciência. A ferida do animal foi realizada sob condições assépticas. O local da ferida foi fotografado e o comprimento e a largura medidos imediatamente após a excisão e todos os dias subsequentes utilizando um calibrador digital. A partir dos dias 0 a 21, os camundongos foram administrados com os artigos de teste como listado na Tabela 1.

D. Resultados do Estudo 1. Sobrevivência do Animal

[108] Três animais morreram ou foram prematuramente eutanizados durante este estudo (todos os animais do Grupo 1 - Regranex). O primeiro animal foi encontrado morto um dia após a cirurgia (Animal #3). O segundo animal (Animal #1) teve de ser sacrificado no Dia 5 devido à auto-mutilação do flanco traseiro posterior ao local da ferida. O animal #5 no Grupo 1 teve de ser sacrificado no dia 16 como resultado de perder mais de 20% do seu peso corporal de partida. A Tabela 2 a seguir resume as mortes/sacrifícios de animais:Tabela 2 - Resumo de Mortes/Sacrifícios de Animais

2. Medições das Feridas

[109] A área da ferida foi medida utilizando um calibrador digital e registou-se o comprimento (L) e a largura (W) de cada ferida. A área da ferida foi calculada usando a fórmula para calcular a área de um quadrado onde A = L x W. A Figura 1 mostra a área das feridas para cada grupo nos Dias 0, 7, 14 e 21. A área da ferida de pico foi registada no Dia 0 para os três grupos com subsequentes diminuições na área média da ferida no Dia 7, Dia 14 e Dia 21. Todos os grupos tratados mostraram uma diminuição substancial na área da ferida durante o curso do estudo.

[110] Para proporcionar uma medição adicional e considerar as feridas que não podem cicatrizar na forma de um quadrado (e, por conseguinte, não podem ser capturadas na fórmula utilizada acima), o interior das feridas também foi medido traçando a borda interna da ferida usando o Software ImageJ™. A Figura 2 representa a área da ferida de cada animal utilizando esta abordagem para cada grupo de tratamento. As Figuras 3-6 mostram a área média da ferida para todos os grupos de tratamento por dia de avaliação (Dia 0, Dia 7, Dia 14 e Dia 21) como um gráfico de dispersão para proporcionar uma avaliação mais detalhada das medições individuais registadas nesses dias. Para os animais que morreram durante o estudo, o último ponto de dados é levado adiante nas Figuras 3-6. A Figura 7A destaca um aspecto chave da invenção, nomeadamente que se obtém resultados positivos com menos aplicações da composição terapêutica. A Figura 7A mostra a quantidade de redução da área da ferida (mm2) por número cumulativo de tratamentos em cada um dos quatro pontos de tempo (Dia 0, Dia 7, Dia 14 e Dia 21) para os Grupos 1 e 3. A Figura 7B mostra a percentagem média de fechamento da ferida ao longo do estudo para cada Grupo. Para os animais que morreram, o último ponto de dados foi levado à frente.

3. Avaliações Clínicas

[111] As imagens das feridas foram também clinicamente avaliadas quanto a possíveis diferenças no grau de cicatrização relativamente à re-epitelização e formação de tecido de granulação. As imagens representativas das feridas de cada animal em cada ponto de tempo são mostradas na Figura 8 a partir do Dia 0 (Figura 8A), Dia 7 (Figura 8B), Dia 14 (Figura 8C) e Dia 21 (Figura 8D). As imagens brutas de cada tratamento mostram que o Grupo 3 (rhPDGF/grupo de esponja de colágeno) resultou em uma aceleração demonstrável na formação de tecido de granulação e re-epitelização em comparação com o Grupo 2 (o grupo de controle da esponja de colágeno tratado com tampão). Além disso, as feridas tratadas com Regranex diariamente (Grupo 1) também mostraram uma melhor taxa de fechamento de feridas em comparação com o Grupo 2 (o controle de tampão + colágeno). A histopatologia em amostras fixadas com formalina das áreas da ferida foi também realizada e confirmou ainda a cicatrização acelerada da ferida, resultante do tratamento com as feridas tratadas com rhPDGF/colágeno e Regranex em comparação com esponjas tratadas com controle de tampão. A patologia também sugere ainda mais melhorias na re-epitelização em feridas tratadas com rhPDGF/colágeno em relação às tratadas com Regranex.

[112] Amostras representativas das amostras histopatológicas lógicas são proporcionadas na Figura 9, que inclui uma série de fotomicrografias de uma seção transversal do local da ferida no dia 21 de três animais de estudo, incluindo o Grupo 1 - Animal 2 (Figuras 9E e 9F), Grupo 2 - Animal 2 (Figuras 9A e 9B) e Grupo 3 - Animal 1 (Figuras 9C e 9D). Para cada conjunto de fotomicrografias, é mostrada uma ampliação de 2x (Figuras 9A, 9C e 9E) e 1Ox (Figuras 9B, 9D e 9F).

[113] Em relação ao Grupo 1, as Figuras 9E e 9F mostram que a ferida foi 100% recoberta no Dia 21, embora alguma deformação estivesse aparente devido à fragilidade da arquitetura dérmico-epidérmica. A seta 60 na Figura 9E indica a localização aproximada da epiderme adjacente à esquerda e o leito da ferida à direita. A Figura 9F proporciona uma imagem de ampliação mais elevada a partir do meio da ferida. O recobrimento epidérmico a 100% é aparente e a presença de estratificação diferenciada na epiderme indica sua maturidade. A neodermia ainda contém uma alta densidade de capilares e nova formação de colágeno está em andamento.

[114] Em relação ao Grupo 2, as fotomicrografias ilustram que uma parte da esponja de colágeno persistiu no leito da ferida durante 21 dias. Nesta borda da ferida, a esponja parecia obstruir o ressurgimento do epitélio. A seta 10 na Figura 9A indica a borda da ferida. Conforme visto na Figura 9A, algum tecido de granulação desenvolveu-se sob a esponja de colágeno. Com referência à Figura 9B, a esponja de colágeno e o tecido de granulação são indicados pelas setas 20 e 30, respectivamente. Conforme ilustrado, a esponja de colágeno pareceu aderente nesta região, embora a infiltração com células seja mínima. Um tecido de granulação clássico é mostrado formado abaixo da esponja.

[115] Em relação ao Grupo 3, as Figuras 9C e 9D ilustram que a ferida é 100% recoberta com epiderme. A seta 40 na Figura 9C indica a borda aproximada do leito da ferida, e a região 50 é a gordura subcutânea. A Figura 9D foi tomada no meio da ferida e mostra que todas as evidências da esponja de colágeno original desapareceram. A ferida é 100% recoberta e está bem estratificada com um estrato córneo indicando maturidade. A neodermia mostra evidência de nova produção de colágeno e a celularidade é diminuída, indicando que o tecido dérmico está amadurecendo e perdendo as características imaturas do tecido de granulação.

E. Conclusões do Estudo

[116] As conclusões seguintes foram tiradas deste estudo:(1) 21 aplicações de Regranex foram dadas no Grupo 1, enquanto apenas 3 aplicações de curativos para feridas de tampão/colágeno ou rhPDGF/colágeno foram aplicadas nos Grupos 2 e 3, respectivamente. (2) três animais do Grupo 1 (Regranex) foram ou encontrados mortos ou tiveram que ser eutanizados durante a parte em vida do estudo. (3) todos os grupos tratados mostraram uma diminuição na área da ferida a partir do Dia 0-21, como determinado por medições de calibrador e traçamento de feridas utilizando a análise por software ImagemJ. No momento do sacrifício (Dia 21), 2 de 5 feridas tratadas com Regranex, 3 de 5 feridas tratadas com rhPDGF/colágeno e 0 de 5 feridas tratadas com curativo de colágeno foram curadas. (4) as imagens brutas de cada tratamento mostram que o Grupo 3 (rhPDGF/colágeno) resulta em uma aceleração demonstrável na formação do tecido de granulação e re- epitelização em comparação com o grupo de controle de curativo de colágeno para feridas tratado com tampão (Grupo 2). Além disso, as feridas tratadas com Regranex diariamente (Grupo 1) também apresentaram uma melhor taxa de fechamento em comparação com os animais tratados com esponja de colágeno de controle. (5) a cicatrização avaliada pela re-epitelização da ferida foi maior em feridas tratadas com três aplicações de rhPDGF/colágeno (Grupo 3) em comparação com 21 aplicações de Regranex (Grupo 1) ou três aplicações do curativo de colágeno umedecido com solução salina. (6) três (3) aplicações semanais de rhPDGF/colágeno (Grupo 3) aceleram o fechamento da ferida, incluindo a formação de tecido de granulação e re-epitelização em comparação com um curativo de colágeno para feridas (Grupo 2) e parecem pelo menos tão eficazes quanto 21 doses diárias de Regranex Gel (Grupo 1). (7) rhPDGF/colágeno é seguro e eficaz, promovendo uma melhor cicatrização de feridas diabéticas em comparação com o curativo de colágeno para feridas comercializado. 3 de 5 feridas tratadas com rhPDGF/colágeno cicatrizaram completamente, como evidenciado por re-epitelização completa, em comparação com 0 de 5 animais tratados com curativos para feridas de colágeno. (8) rhPDGF/colágeno é seguro e eficaz, promovendo a angiogênese, formação do tecido de granulação e re- epitelização em comparação com um curativo de colágeno comercializado como demonstrado histologicamente. (9) rhPDGF/colágeno, um produto estéril, é altamente biocompatível conforme demonstrado histologicamente. (10) rhPDGF/colágeno é muito mais fácil de aplicar do que o Regranex Gel, o que deve melhorar a adesão do doente. (11) rhPDGF/colágeno pode ser mais seguro do que o Regranex, dado que os animais que receberam Regranex apresentaram uma taxa de mortalidade elevada, ao passo que não se observou tal mortalidade com rhPDGF/colágeno ou o curativo de colágeno para feridas.

Exemplo 2 - Propético

[117] Realiza-se um estudo para demonstrar a eficácia das novas composições terapêuticas e dos métodos de tratamento de feridas aqui descritos. O mesmo modelo de estudo delineado para o Exemplo 1 é também utilizado para este estudo, incluindo o modelo murino db/db com cinco grupos de teste - um grupo de tratamento padrão (gaze umedecida em solução salina), um grupo Regranex, um grupo de esponja de colágeno e dois grupos que utilizam composições de tratamento de acordo com a presente invenção, compreendendo PDGF-BB e uma esponja de colágeno. Conforme detalhado abaixo, contudo, a frequência da dosagem é alterada neste estudo. O estudo também foi concebido de modo a que a dose total de FCDP entregue ao longo do estudo tanto no grupo Regranex quanto nos grupos esponja de colágeno/PDGF-BB seja a mesma.

A. Modelo Experimental

[118] O modelo experimental é refinado pelos resultados do estudo descritos no Exemplo 1, contudo prevê-se que o número de animais por grupo seja maior (isto é, oito) e a duração do estudo seja mais longa, ou seja, 28 dias. Adicionalmente, os artigos de colágeno +/- PDGF de teste e de controle são administrados topicamente como curativos para feridas imediatamente após a indução da ferida e a cerca do Dia 14 para um total de duas aplicações (Grupo 5) ou imediatamente após a cirurgia e nos Dias 7, 14 e 21 para um total de quatro aplicações de artigos de teste, de acordo com as novas composições e métodos de tratamento aqui descritos (veja Tabela X). O controlo negativo (gaze umedecida em solução salina) e os locais tratados com Regranex irão sofrer 28 administrações diárias topicamente como curativos para feridas de acordo com as Instruções de Uso prescritas.

[119] Neste Exemplo, os níveis de glicose no sangue são determinados antes do início do estudo e novamente logo antes do sacrifício no Dia 28 para confirmar o estado da doença diabética. Em todos os outros aspectos, o modelo para este estudo é o mesmo que o descrito no Exemplo 1. Os detalhes do estudo são delineados abaixo na Tabela 3.Tabela 3. Modelo de Estudo do Exemplo 2

* Avaliação da ferida e necropsia; #Avaliação da ferida apenas.

[120] Todos os dias durante o período do estudo, cada animal é inspecionado e a sua sobrevivência registada, a fim de avaliar possíveis diferenças visuais nas respostas dos animais entre os grupos de tratamento. A taxa de fechamento da ferida será determinada, assim como a porcentagem de feridas completamente cicatrizadas em qualquer ponto de tempo.

B. Cálculos da Dose de PDGF-BB

[121] A dosagem de PDGF utilizada neste estudo foi concebida para imitar as doses terapêuticas reais de acordo com a presente invenção (Grupos 4 e 5) ou a dose terapêutica real prescrita de acordo com o marcador Regranex (Grupo 2). A dosagem para o Grupo 2 é determinada da mesma maneira que o grupo Regranex no Exemplo 1. Para os locais tratados com Regranex durante 28 dias, a dose total de PDGF administrada durante o período de estudo é de 14 μg/dia x 28 dias ou 392 μg de PDGF-BB. Esta dose também pode ser a quantidade expressa de PDGF por área do tamanho original da ferida (“dose de área”) de 6,22 μg/cm2/dia ou 174,2 μg/cm2 de PDGF- BB.

[122] Para os Grupos 4 e 5, utiliza-se uma concentração de PDGF de 0,3 mg/ml ou 300 μg/ml. Para atingir uma dose total durante o período de estudo de 392 μg de PDGF-BB (a mesma dose total de estudo que no grupo Regranex), um total de 1,307 ml de solução de PDGF é aplicado ao local da ferida ao longo do período de estudo de 28 dias. Para locais que recebem trocas de curativo a cada 7 dias, há um total de 4 administrações (dias 0, 7, 14 e 21). Cada administração consiste em 327 μl de PDGF-BB (ou tampão apenas) sobre a esponja de colágeno. Em relação à dose de PDGF, cada administração consiste em 0,3 μg/μl x 326 μl ou 98 μg de PDGF-BB (aproximadamente 7x a dose individual de Regranex). Para locais que recebem apenas duas doses, nos dias 0 e 14 há um total de 2 administrações. Cada administração consiste em 654 μl de PDGF-BB sobre a esponja de colágeno. Cada administração consistiria em 0,3 μg/μl x 654 μl de 196 ug de PDGF-BB (aproximadamente 14 vezes a dose individual de Regranex). Estas doses também podem ser expressas como a quantidade de PDGF por área do tamanho original da ferida (“dose de área”). Em relação ao Grupo 4, a dose de PDGF é de 43,5 μg/cm2/dose ou 174 μg/cm2 de PDGF-BB. Em relação ao Grupo 5, a dose de PDGF é de cerca de 87 μg/cm2/dose ou 174 μg/cm2 de PDGF, isto é, a mesma dose cumulativa em todos os grupos, mas os Grupos 4 e 5 têm muito menos doses. Exemplo 3 - Propético

[123] Um ensaio clínico randomizado é conduzido para avaliar a eficácia de várias composições de rhPDGF-BB e colágeno em comparação com o tratamento padrão (consistindo em cicatrização de feridas úmidas com remoção do excesso de exsudado da ferida, desbridamento de tecido necrótico, descarga de pressão, gaze umedecida com solução salina, antibióticos, se necessário, e curativo para feridas) e Regranex no tratamento de úlceras crônicas do pé diabético. A Tabela 4 abaixo resume o modelo do estudo. Para cada braço do estudo (1-37), o produto é aplicado na dosagem e na frequência indicadas na Tabela 4 até 20 semanas ou até o fechamento completo da ferida. O Regranex é aplicado de acordo com a sua rotulagem americana aprovada. Composições de RhPDGF-BB/colágeno são aplicadas de acordo com os procedimentos (etapas 1-5) descritos acima no parágrafo 50.

[124] As medidas de resultados para o estudo são: • incidência de fechamento completo da ferida; • tempo para conseguir o fechamento completo da ferida. • redução percentual na superfície total da úlcera em cada visita; • número de recorrências da úlcera observadas 12 semanas após a cicatrização da ferida; • eventos adversos emergentes do tratamento (até 52 semanas).

[125] Os critérios de inclusão para o estudo incluem: • homens ou mulheres com idade igual ou superior a 18 anos, com diabetes mellitus tipo 1 ou 2; • paciente com uma única úlcera nos pés tratados; • paciente capaz e disposto a fornecer consentimento informado; • paciente capaz e disposto a cumprir as visitas e o procedimento do protocolo; • paciente disposto a usar um método de descarga durante toda a duração do estudo; • úlcera plantar, lateral ou dorsal de espessura total da extremidade (abaixo do maléolo), excluindo úlcera interdígitos (espaços em rede), que se estende através da epiderme e da derme, mas não envolve ossos, tendões, ligamentos ou músculos (grau IA conforme definido pela Classificação de Ferida Diabética da Universidade do Texas ou Grau 1 de acordo com a classificação de Wagner); • úlcera crônica de pelo menos seis semanas apesar do cuidado apropriado da ferida; • área da úlcera medida com a fórmula Comprimento x Largura x 0,8 após desbridamento agudo, de 1 a 10 cm2, ambos inclusivos; • infecção bem controlada ou celulite (antibioterapia sistêmica) antes da Visita Inicial; • neuropatia periférica como avaliada pelo teste de monofilamento de Semmes-Weinstein ou pelo bioestesiômetro (limiar de percepção de vibração); • índice de pressão braquial do tornozelo >0,60 e <1,3; • mulheres estéreis cirurgicamente, pós-menopausa, ou que concordam em praticar contracepção adequada e ter um teste de gravidez negativo na triagem; • não enfermagem.

[126] Os critérios de exclusão para o estudo incluem: • úlceras interdígitos; • úlcera de outra causa ou origem: insulto elétrico, químico ou de radiação, escaras, úlcera vascular ou úlceras de deformidades de Charcot; • pé de Charcot; • ferida originada da cama de amputação; • infecção por úlcera ativa avaliada por exame clínico e radiografia, se necessário. Presença de necrose, purulência ou tratos sinusais que não podem ser removidos por desbridamento e controlados por tratamento padrão de feridas; • osteomielite ativa que afeta a área da úlcera alvo; • diabetes mal controlada (glicemia descontrolada: HbA1c% >= 10%), insuficiência renal (creatinina sérica > 3,0 mg/dL), mau estado nutricional (albumina < 3,0 g/dL ou proteína total < 6,5 g/dL); • tecido conectivo conhecido ou doença maligna; • tratamento concomitante com corticosteroides, agentes imunossupressores, radioterapia ou quimioterapia anticâncer; • uso do fármaco/dispositivo de investigação ou do fator de crescimento dentro de 30 dias; • aplicação tópica de qualquer cuidado avançado para ferimentos nesta ferida (antissépticos, antibióticos, debridadores, enzima) dentro de 7 dias; • reconstrução vascular dentro de 8 semanas; • pacientes que se espera não cumprirem o protocolo (não disponíveis durante o ensaio, tratamento ou conformidade dos cuidados com as feridas) ou considerados inadequados pelo Investigador por qualquer outro motivo; • um histórico de eventos cerebrovasculares graves.Tabela 4. Modelo de Estudo do Exemplo 4

[127] Cada uma das composições de rhPDGF/esponja de colágeno tem um desempenho melhor do que Regranex ou padrão tratamento padrão em pelo menos uma das medidas de resultado, e/ou alcança um resultado substancialmente equivalente com a aplicação de menos rhPDGF cumulativo aplicado durante o período de tratamento ou a aplicação de menos tratamentos que leva a uma melhor adesão do paciente.

[128] As formas de realização, variações e sequências aqui descritas devem proporcionar uma indicação da utilidade e versatilidade da presente invenção. Outras formas de realização que não proporcionam todas as características e vantagens aqui descritas também podem ser utilizadas, sem afastamento do espírito e do âmbito da presente invenção. Tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do âmbito da invenção.

Claims

1. Composição terapêutica, caracterizada por compreender uma solução de rhPDGF estéril e uma matriz porosa estéril biocompatível, em que: (a) a solução de rhPDGF estéril compreende entre 0,05 mg/ml e 5 mg/ml de rhPDGF-BB, em que pelo menos 80% em peso do rhPDGF-BB é rhPDGF-BB não cortado; (b) a matriz, compreendendo colágeno, esponja de colágeno ou gelatina, inclui poros possuindo tamanho na faixa entre 50 μm e 1 mm, ou uma média de tamanho de poros entre 50 microns e 500 microns; ou em que a matriz compreendendo colágeno, esponja de colágeno ou gelatina fornece um suporte celular poroso que possui uma distribuição de tamanho de poros entre cerca de 10 microns a cerca de 2000 microns, e em que pelo menos 50% do referido rhPDGF-BB é preso dentro dos referidos poros; e (c) a razão do rhPDGF para a matriz está entre 75 μg de PDGF/cm3 da matriz e 225 μg de PDGF/cm3 da matriz.

2. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a solução terapêutica ser formada a partir de um pó de rhPDGF estéril contendo rhPDGF-BB liofilizado, em que pelo menos 80% do referido rhPDGF-BB liofilizado em uma base de peso é rhPDGF-BB liofilizado não cortado.

3. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender rhPDGF-BB produzido através de um sistema de expressão de E. coli.

4. Composição terapêutica, caracterizada por compreender: (a) uma solução de rhPDGF-BB compreendendo uma solução fisiológica contendo entre 0,05 mg/ml a 5 mg/ml de rhPDGF- BB, e (b) um carreador, para uso em um método de tratamento de uma ferida; em que a razão de rhPDGF-BB para o carreador está entre 75 μg de PDGF/cm3 do carreador para 225 μg de PDGF/cm3 do carreador; e em que o método compreende administrar 1 a 27 tratamentos com a composição à superfície da ferida em uma quantidade que compreende pelo menos 10 μg de rhPDGF-BB por cm2 de área de superfície de ferida tratada em intervalos de tratamento de 3 ou mais dias.

5. Composição terapêutica para uso, conforme definida na reivindicação 4, caracterizada por o método compreender administrar a composição à superfície da ferida em uma quantidade que compreende pelo menos 10 μg de rhPDGF-BB/cm2 de área de superfície da ferida tratada até 100 μg de rhPDGF- BB/cm2 de área de superfície da ferida tratada a cada retratamento.

6. Composição terapêutica para uso, conforme definida na reivindicação 4, caracterizada por a quantidade total cumulativa de rhPDGF-BB aplicada à ferida durante o período de tratamento ser superior a 0 mg, porém inferior a 50 mg de rhPDGF-BB; de modo que a quantidade total cumulativa de rhPDGF-BB aplicada à ferida durante o período de tratamento seja superior a 0 mg mas menor que 25 mg de rhPDGF-BB.

7. Composição terapêutica para uso, conforme definida na reivindicação 4, caracterizada por o método compreender retratar a ferida entre 1 e 20 vezes.

8. Composição terapêutica para uso, conforme definida na reivindicação 4, caracterizada por o carreador ser um polímero natural selecionado a partir do grupo que consiste em colágeno, gelatina, fibrina, alginato, celulose, quitosana e fibronectina; ou em que o carreador é uma esponja de colágeno.

9. Composição terapêutica para uso, conforme definida na reivindicação 4, caracterizada por a ferida ser uma úlcera diabética, úlcera de pressão, úlcera neuropática ou úlcera vascular.

10. Composição terapêutica para uso, conforme definida na reivindicação 4, caracterizada por a composição ser administrada à superfície da ferida uma vez pelo menos a cada 8 dias.