JP2008179604A - 筋ジストロフィ治療薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の筋ジストロフィ治療薬は、カルデクリンまたはカルデクリン遺伝子を含有することを特徴とする。
【選択図】なし
Description
TAKAOKAら,ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・メタボリズム(Journal of Bone and Mineral Metabolism),第18巻,第2〜8頁(2000年)
(a) 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質。
(a) 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質。
ラット(埼玉実験動物から入手)25匹を、ネンブタールを投与することにより屠殺し、膵臓を取り出した。得られた膵臓をホモジェナイザー(セントラル科学貿易製、製品名:ポリトロン)で破砕し、アセトンを加えて脱水した。ここへ、2%NaClを含む0.1Mトリス塩酸(pH8.0)を加えてよく攪拌してから濾過した。濾液へ、0.4体積倍の冷アセトンを加えてアセトン濃度を30容積%とし、氷冷下で30分間攪拌した後、遠心分離により上清を得た。さらに、0.6体積倍の冷アセトンを加えてアセトン濃度を60容積%とし、氷冷下で30分間攪拌した。遠心分離によって、沈殿、即ち30〜60%アセトン画分を得た。得られた30〜60%アセトン画分を蒸留水に溶解し、さらに蒸留水で透析することによりアセトンを除去した。さらに、45質量%の硫酸アンモニウムを加え、4℃で30分間攪拌し、遠心分離した。得られた上清へ、60質量%となるように硫酸アンモニウムを加え、4℃で30分間攪拌した後に遠心分離することにより沈殿、即ち45〜60%硫酸アンモニウム画分を得た。この45〜60%硫酸アンモニウム画分を蒸留水に溶解した後、凍結乾燥し、使用時まで冷暗所で保存した。
非特許文献1で引用されている高岡らの方法(Acta Medica Nagasakiensia vol.13,No.1-2,pp28-35,1969年を参照)に準じて、複数のエラスターゼの混合物を主成分とする膵臓抽出物を調製した。即ち、先ず市販の豚アセトンパウダー(Sigma製)10gに、重量比で10倍量の冷水を加えて、冷所で1時間抽出した後に濾過した。得られた濾液へ希塩酸を加えてpHを4に調整し、沈殿を生じさせた。当該沈殿物を、3,000rpmで10分間遠心することにより分離した。当該沈殿物を水に溶解し、さらに、希塩酸を加えてpHを5.4に調節し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた上清に希塩酸を加え、pHを再度4.0に調整して沈殿を生じさせた。さらに、沈殿物を遠心分離し、精製水に溶解させた。当該溶液に40質量%の硫酸アンモニウムを加えて室温で1時間静置し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿物に水を加えて溶解した後、透析チューブ(Cut off 3,500<)を使って精製水で透析した。さらに、この透析液に80質量%の硫酸アンモニウムを加えて沈殿物を得た。当該沈殿物を再度精製水に溶解させた上で透析した。得られた精製溶液を凍結乾燥することによって、1.2mgの膵臓抽出物を得た。当該抽出物は、ビューレット法によって、タンパク質であることを確認した。得られた膵臓抽出物は、製造例1と同様の方法で滅菌した。
ヒトカルデクリンcDNA(Stratagene社のcDNAライブラリーからクローニングしたもの)を鋳型にして、プライマーとしてBsa I primer(S:配列番号9,AS:配列番号10)を使って、PCR反応を行った。より詳しくは、ポリメラーゼとしてはStratagene社のPfu DNA polymeraseを用い、96℃で45秒間、50℃で1分間、72℃で2分間のサイクルを30回繰り返した。増幅されたヒトカルデクリンcDNAを、pEXPR−IBA 3 ベクターのBsa I siteにライゲーションした。このベクターは、最終的に得られるタンパク質のC末端へ、ストレプトアビジンに結合できるタグ(STREP−tagII)を付けるために、DNAへSTREP−tagのDNA配列を結合させたものである。当該ベクターを大腸菌(Invitrogen製、Top 10)にトランスフェクションさせ、LB/Amp倍地中、37℃で一晩培養した。次いで、Macherey-Nagel製のNucleoSpin Extract II kitを用いてベクターDNAを精製し、C末端にStrep−tagが結合したヒトカルデクリンcDNAを得た。
製造例3と同様の条件により、phCaldecrin−IRES−bleoを鋳型とし、SacI−ATG caldecrinとSTREP−tag−NotIをプライマーとしてPCRを行い、ヒトカルデクリンDNAを増幅した。得られたDNAを、pIRES−hrGFPのSacI−NotI siteに組み込んだ。当該ベクターを、石原産業製Genome One−Neoのリポソームに封入し調製した。Genome One−Neoは、センダイウイルスHVJの膜からなるベクターである。当該ベクターは、細胞接着活性を残したままウィルス増殖活性は完全に不活化されており、エンドサイトーシスにより治療用遺伝子と共に細胞に取り込まれる。よって、得られたヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターを取り込んだ細胞は、ヒトカルデクリン遺伝子を発現させ、カルデクリンを産生することができる。
財団法人実験動物中央研究所より入手した8週齢C57BL/6J(dy/dy)雄マウスを3匹ずつ3群に分けた。当該マウスは、ミュータントタイプの筋ジストロフィ発症モデルマウスであり、下肢を動かすことができず自力で餌や水を取ることができなくなっており、筋ジストロフィ様の症状が発症していた。1週間馴化後、一晩絶食した翌朝、体重1kg当たり100μgの割合で、製造例1の方法で調整したカルデクリンを、2群のマウスの片側大腿筋に筋肉注射投与し、リン酸緩衝液を対照群に投与した。投与後、3時間後と6時間後にそれぞれ採血し、血清尿素窒素(以下、「BUN」と略す場合がある)の濃度(mg/dl)を、和光純薬製尿素窒素B−テストワコーkitで測定した。結果を表1に示す。なお、表中の値は、平均値±標準偏差であり、「減少率」は対照群のBUN値に対するカルデクリン投与群のBUN値の割合を示す。
マウスとしてミュータントタイプ(dy/dy)およびワイルドタイプの2種類のdyマウスを使い、それぞれ3匹ずつ3群に分けた。別途、製造例3で得たヒトカルデクリンを50分の1の量のトリプシンで30分間活性化し、且つ1mMのPMSFでプロテアーゼ活性を阻害した。1週間馴化後、1群のマウスへ体重1kg当たり100μgの割合で、当該ヒトカルデクリンを4日間連続で注射投与した。対照群には、リン酸緩衝液を同様に投与した。これら群では、最終投与の前夜は絶食させ、翌日の最終投与から3時間後に屠殺して採血した。
試験例2と同様に、同系の正常マウスを対照群として、ミュータントタイプのdy/dyマウスを1週間馴化した後、製造例3のヒトカルデクリンおよび製造例4のヒトカルデクリン遺伝子導入リポソームを投与した。ヒトカルデクリンは、体重1kg当たり100μgを4日間連続して腹腔内投与し、最終投与から3時間後に屠殺した。ヒトカルデクリン遺伝子導入リポソームは、マウス1匹当たり溶液状態で100μL(DNA10μg含む)を片側大腿筋に1回注射投与し、5日目に屠殺した。対照群には、ヒトカルデクリン投与の場合と同様の条件で、リン酸緩衝液を投与した。各群において、屠殺の前日は絶食させた。
6週令のBALB/cCr Slc雄性マウスを試験前日より絶食させた。別途、製造例3で得たヒトカルデクリンまたは製造例2のブタ膵臓抽出物をリン酸緩衝液に溶解し、濃度0.01mg/mLの溶液を調製した。上記マウスを4匹または5匹の群に分け、リン酸緩衝液のみ、ヒトカルデクリン溶液、または膵臓抽出物溶液を、体重10g当たり0.1mL腹腔内注射投与した。投与から5時間後に心臓から採血し、BUNテストワコーおよびクレアチニンテストワコーキットを用いて、血清尿素窒素量(mg/dl)とクレアチニン量(mg/dl)を測定した。血清尿素窒素量の結果を表2に、クレアチニン量の結果を表3に示す。
Claims (6)
- カルデクリンを含有することを特徴とする筋ジストロフィ治療薬。
- 以下の(a)または(b)のタンパク質を含有することを特徴とする筋ジストロフィ治療薬。
(a) 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質。 - カルデクリン遺伝子を含有することを特徴とする筋ジストロフィ治療薬。
- 配列番号3または4に示される塩基配列を含むカルデクリン遺伝子を含有する筋ジストロフィ治療薬。
- 請求項3または4に記載のカルデクリン遺伝子を含むベクター。
- 請求項5に記載のベクターを含む形質転換細胞。
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