JP5121400B2 - 筋ジストロフィ治療薬 - Google Patents

Description

本発明は、筋ジストロフィを治療するための薬剤に関するものである。

筋ジストロフィは、骨格筋の変性や壊死を主病変とする。臨床的には、進行性の筋力低下を伴う遺伝子疾患である。

筋肉が萎縮して筋力低下を招来する原因としては、筋肉そのものに原因がある場合（筋原性）の他、筋肉には異常はないが、運動神経に異常が生じて筋肉が働かなくなり、筋萎縮を招く場合（神経原性筋萎縮症）がある。筋ジストロフィは、前者の筋原性疾患の代表といえる。

筋ジストロフィの原因は必ずしも明らかではないが、筋細胞形質膜の直下に存在するジストロフィン、形質膜に存在するアダリン、そして基底膜に存在するメロシンまでの一連のタンパク質の欠損や異常などが考えられている。

かかる知見に基づいて、筋ジストロフィの治療方法としてジストロフィン等を誘導することが考えられるが、臨床試験では未だ有効性が認められていない。

また、治療薬としては、これまでタンパク同化ホルモン、成長ホルモン、カルシウム拮抗剤、ベスタチンなどのタンパク質分解酵素阻害剤、ダントロレンナトリウムなどの筋弛緩薬が使用されている。しかし、これら薬剤は投与初期にはある程度の症状進行抑制効果を示すものの、持続しないことから、主にリハビリテーションなどによる機能障害の進行予防といった対処療法が行われていることが現状である。即ち、薬剤では十分な治療効果は得られていない。そこで、筋ジストロフィを治療するための薬剤に関する研究が行われている。

例えば非特許文献１には、ほぼ４年間動くことができなかった進行性筋ジストロフィ患者にブタ膵臓由来の粗抽出物を投与したところ１週間で改善が見られ、１ヶ月後には自宅へ帰ることができたことが記載されている。また、同じく筋ジストロフィ患者に同粗抽出物を投与したところ、８ヶ月後には体重が増え、１０ヶ月後には足を高く上げられるようになったと記載されている。

しかし、上記学術文献には厳密な試験条件は全く記載されておらず、この結果の信憑性には疑問がある。例えば、上記粗抽出物の投与間、他の治療手段が全く施されなかったとは考えられず、上記改善効果が粗抽出物のみによるものであるとの確証はない。実際、非特許文献１では、上記粗抽出物は筋ジストロフィの重篤度の指標となるＢＵＮ（血清尿素窒素量）を低減する強い活性を有するとされているが、本発明者らが再現実験をしたところ、その効果は弱かった。

また、上記学術文献には、ＰＸからさらに精製を進めたタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列が、ヒトエラスターゼＩＩＩＢに高い相同性を示すことが記載されている。さらに、ＰＸの骨／カルシウム代謝制御活性はエラスターゼＩＩＩＢによるものであると結論付けられている。

しかし、ヒトエラスターゼＩＩＩＢの筋ジストロフィに対する効果が直接実証されたことはなく、また、実際に臨床で用いられたとの報告はない。勿論、実用化もされていない。

ところで友村らは、ブタ膵臓からカルデクリンを単離し、これが血清カルシウム量を低減することを見出している（特許文献１）。また、カルデクリン遺伝子を使用してカルデクリンを製造する技術を完成した（特許文献２）。しかし、このカルデクリンの筋ジストロフィに対する効果は報告されたことがない。
TAKAOKAら，ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・メタボリズム（Journal of Bone and Mineral Metabolism），第１８巻，第２〜８頁（２０００年） 特開平４−２７９５９８号公報 特開平８−２９８９９０号公報

上述した様に、筋ジストロフィは次第に運動機能が消失する難病であるが、根本的な治療方法は確立していない。また、筋ジストロフィの治療につき様々な研究がされているが、実用化され効果を十分に発揮している薬剤は皆無である。

中でも、ブタ膵臓由来の粗抽出物であるＰＸは、筋ジストロフィに対して著効を示したとの報告はあるが（非特許文献１）、実用化はされていない。その理由は不明であるが、本発明者らによる実験によれば、ＰＸのＢＵＮの低減効果はさほど優れたものではなく、また、血中クレアチニン量を増加させるという欠点があることが分かった。クレアチニンは、本来、尿中へ直接排出されるが、腎機能に異常があると血中に蓄積することから、腎機能の評価指標として用いられている。即ち、ＰＸには、腎機能を低下させ得るという問題がある。

そこで、本発明が解決すべき課題は、筋ジストロフィに対する治療効果を有する一方で、腎機能を低下させない薬剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、カルデクリンとカルデクリン遺伝子が、腎機能に障害を与えることなく、筋ジストロフィに対して優れた治療効果を示すことを見出して、本発明を完成した。

即ち、本発明に係る第一の筋ジストロフィ治療薬は、カルデクリンを含有することを特徴とする。

上記カルデクリンとしては、具体的には、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を含有するものを例示することができる：
（ａ） 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質。

また、本発明に係る第二の筋ジストロフィ治療薬は、カルデクリン遺伝子を含有することを特徴とする。

上記カルデクリン遺伝子としては、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列を含むカルデクリン遺伝子を含有するものを例示することができる。

さらに、上記カルデクリン遺伝子を含むベクターや、当該ベクターを含む形質転換細胞も、筋ジストロフィの治療に使用し得る。

本発明の筋ジストロフィ治療薬は、筋ジストロフィに対して極めて優れた効果を有する。また、腎機能に障害も与えない。よって、本発明の筋ジストロフィ治療薬は、未だ有効な治療薬の存在しない筋ジストロフィの実用的な治療薬として期待できる。

本発明に係る筋ジストロフィ治療薬は、カルデクリンを含有することを特徴とする。

カルデクリンは、友村らによって発見されたタンパク質である。カルデクリンのプロ型はアミノ酸２５２個から成る分子量約２８ｋＤａのタンパク質であり、そのプレプロ型はアミノ酸２６８個からなる約３０ｋＤａのタンパク質である。マウスにおいては用量依存的にその血清カルシウム濃度を低下させ、マウス胎児骨培養細胞系における副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）誘導カルシウム遊離に対して阻害活性を有する。

本発明で用いるカルデクリンの種類は、筋ジストロフィの治療効果を有するものであれば特に制限されないが、例えばヒト由来のカルデクリンおよびラット由来のカルデクリンを挙げることができる。これらカルデクリンの筋ジストロフィ治療効果は、後記の実施例で実証されている。

本発明のカルデクリンには、その成熟型、プロ型およびプレプロ型が含まれるものとする。その他、標識配列や標識基が結合したものも、カルデクリンと同様に活性を発揮し得る。

カルデクリンは、エラスターゼやキモトリプシン等のセリンプロテアーゼと同族である。例えば、プロ型ラットカルデクリンをコードする遺伝子（配列番号３）と、プロ型ラットエラスターゼＩＶをコードする遺伝子（配列番号５）は高い相同性を示す。しかし、両配列を比較すると、プロ型ラットカルデクリン遺伝子では、２４３番目にアデニンが挿入されている。かかる挿入によりフレームシフト変異が起こる。また、プロ型ラットエラスターゼ遺伝子では、３１２番目にシトシンが挿入されている。その結果、プロ型ラットカルデクリン（配列番号１）とプロ型ラットエラスターゼＩＶ（配列番号６）とを比較すると、両タンパク質のアミノ酸配列は中間付近で明らかに異なる（配列番号１と配列番号６を参照）。より詳しくは、プロ型ラットカルデクリン（配列番号１）とプロ型ラットエラスターゼＩＶ（配列番号６）における１〜８０番目および１０５番目以降のアミノ酸配列はほぼ同一である一方で、両アミノ酸配列の８１番目のアミノ酸はフレームシフト変異にかかわらず偶然にもグルタミン酸で共通するものの、上述したアデニンとシトシンの挿入により両アミノ酸配列の８１〜１０４番目のアミノ酸配列は全く異なっている。

また、カルデクリンはブタ膵臓由来の粗抽出物の活性本体といわれるエラスターゼＩＩＩＢとは、正常マウスの血清カルシウム低下作用を有する点では共通するものの、構造においてもその他の作用においても明らかに異なる。

例えばカルデクリンは、不可逆的なセリンプロテアーゼインヒビターであるフェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の処理によってもマウス血清カルシウム降下作用と抗ＰＴＨ阻害作用を失わない。その一方で、エラスラーゼＩＩＩＢの血清カルシウム降下作用と抗ＰＴＨ阻害作用はＰＭＳＦにより消失する。

本発明で用いるカルデクリンとしては、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を含有するものを例示することができる：
（ａ） 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質。

配列番号１および配列番号２のカルデクリンは、１〜１３番目のプロ配列を含むプロ型である。プロ型カルデクリンは、例えば投与された後に体内に存在するプロテアーゼによりプロ配列が切断されて成熟型となる。しかし、１番目のシステインは内部のシステインと分子内ジスルフィド結合を形成しており、プロ配列は成熟型でも結合したままとなっている。よって、かかる成熟型は、タンパク質（ａ）からプロ配列が結合および切断されたものとして、タンパク質（ｂ）に含まれるものとする。

また、本発明のタンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）のＮ末端にプレ配列が結合したプレプロ型カルデクリンが含まれる。カルデクリンは細胞内においてプレプロ型として製造された後、プレ配列が切断され、プロ型として細胞外に分泌される。なお、ラットカルデクリンのプレ配列は配列番号７であり、ヒトカルデクリンのプレ配列は配列番号８である。

また、本発明のカルデクリンには、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質も含まれる。例えば、タンパク質（ｂ）は、活性や安定性の向上などを図る目的で、タンパク質（ａ）のＮ末端またはＣ末端にアミノ酸またはペプチドが付加されたものであってもよい。好適には、かかるアミノ酸やペプチドはＮ末端に付加する。

欠失、置換、付加するアミノ酸の数は、好適には１〜１０、より好適には１〜５、さらに好適には１〜２とする。また、欠失、置換、付加された配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列は、ヒトカルデクリンまたはラットカルデクリンのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有することが好ましく、９０％以上の同一性を有することがより好ましく、９５％以上の同一性を有することがさらに好ましい。この同一性は、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）などのソフトウェアを用いた公知方法により決定することができる。また、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸と同じ分類に属するものとすることが好ましい。かかる分類としては、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸といった分類の他、脂肪族アミノ酸、イミノ酸、芳香族アミノ酸といった分類や、さらに分枝アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、含硫アミノ酸、酸アミドアミノ酸といった分類が挙げられる。

上記（ｂ）の定義において、「筋ジストロフィ治療効果を有する」とは、筋ジストロフィ治療剤としての作用効果のうち少なくとも１つが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と同等かそれ以上であることをいう。筋ジストロフィ治療剤としての作用効果としては、臨床試験や動物実験による筋ジストロフィ症状の軽減の他、筋線維の変性や壊死の指標となる血清尿素窒素の低減、また、筋ジストロフィの副作用の指標として、筋肉内でクレアチンから産生される非タンパク性の窒素化合物であるクレアチニンの血中濃度の低減などがある。

カルデクリンの製造方法は特に制限されず、公知方法により或いは公知方法に準じて製造することができる。

例えばカルデクリンは、友村らの方法（Tomomura et.al., Journal of Biological Chemistry, 270, pp.30315-30321（1995）を参照。）に従って、ラット膵臓から天然物タンパク質として単離精製することができる。この場合、カルデクリンは、共存するプロテアーゼにより活性化された成熟型として精製される。

より具体的には、ラット膵臓を破砕してアセトンにより脱水したアセトンパウダーから、アセトンや硫酸アンモニウムを使った沈殿と、透析等による精製を繰り返し、最後にカラムにより単一のタンパク質を精製した後、血清カルシウム低下作用の確認や、アミノ酸配列の解析などによりカルデクリンのみを含む画分を特定し、凍結乾燥すればよい。タンパク質のより具体的な精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、塩析、アセトンや硫酸アンモニウムを用いる沈殿などを例示することができ、これらを適宜組合わせて使用すればよい。

天然由来のカルデクリンは、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類由来のものであってもよいが、本発明ではヒトの筋ジストロフィ治療に用いることを目的とするため、ヒト由来のものであることが好ましい。

カルデクリンは、特開平４−２７９５９８号公報等に記載の方法に従って、または当該方法に準じて、組換えタンパク質として製造することができる。

具体的には、プレプロ型カルデクリンをコードする遺伝子等を、常法に従ってＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターなどの適切なベクターに組み込む。さらに、当該ベクターを適切な細胞にトランスフェクションした上で培養する。ここで使用できる細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌（原核細胞）；パン酵母などの酵母類；ハスモンヨトウガの卵巣由来細胞（Ｓｆ９細胞株）等の昆虫細胞；チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）；アフリカミドリザルの腎由来細胞（ＣＯＳ細胞）；ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の哺乳動物細胞が挙げられる。培養温度や培地の種類などの培養条件は、使用する細胞に適するものとすればよい。培養後は培地からタンパク質を単離精製し、カルデクリンのみを含む画分を特定し、凍結乾燥すればよい。この場合、カルデクリンは一般的にプロ型として得られる。

その他、本発明で用いるカルデクリンは、既知のペプチド合成法に従って化学合成したものであってもよい。

また、ヒトまたはラット以外の哺乳動物由来の天然カルデクリン中の１または２以上のアミノ酸を、欠失および／または置換するか、１または２以上のアミノ酸を付加することによって、ヒトまたはラット由来の天然カルデクリンと同じアミノ酸配列にしてもよい。

カルデクリンは、プロ型または成熟型として投与することができる。プロ型カルデクリンを投与した場合、生体内で活性化されて成熟型となり、活性を発揮すると考えられる。または、プロ型カルデクリンをトリプシン等のプロテアーゼにより活性化し、得られた成熟型を投与してもよい。

本発明のカルデクリンは、筋萎縮部位や筋力低下部位に投与されることによって、筋ジストロフィを軽減することができる。剤形としては、カルデクリンはタンパク質であることから注射剤とすることが好ましい。しかし患者にとっては無針投与が望ましく、また、技術の進歩により経口剤や外用剤などいかなる剤形も可能性があり、剤形について何ら制限されるものではない。

上記各種剤形の製剤は、常法により製造することができ、有効成分であるカルデクリン以外の製剤は、各種剤形への調製に使用されている一般的なものを用いることができる。例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製されたカルデクリンの有効量を、例えば蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等の賦形剤；ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール等の保存剤；ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等の無痛化剤；塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤などを加えて、常法に従って凍結乾燥化することにより調製される。

本発明に係る筋ジストロフィ治療薬であるカルデクリンの投与量は、筋ジストロフィ患者の症状や重篤度、年齢や性別などにより適宜調節すればよいが、通常は０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。

本発明に係るカルデクリンの投与は、一般的には、皮下、筋肉内または静脈内注射として、必要量を単回、あるいは複数回に分けて投与されることになるが、より好ましくは、当該筋肉内に直接注射し投与することで効果を上げることができる。また、投与方法としては、注射用アンプル剤の場合は、皮下、筋肉または静脈にそのまま注射することができるが、静脈注射の場合、輸液ポンプを用いて投与することも可能である。さらに本発明の筋ジストロフィ治療薬は、筋ジストロフィ症の治療の際に、ブドウ糖液などの糖輸液に予め所定量を混合して投与するか、または、当該糖輸液の投与と同時にその有効量を単独で末梢静脈などから投与することもできる。

注射用凍結乾燥粉末剤の場合には、当該粉末剤を使用時に蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などに希釈した上で、アンプル剤と同じように投与する。

本発明に係る他の筋ジストロフィ治療薬は、カルデクリン遺伝子を含有することを特徴とする。当該筋ジストロフィ治療薬は、萎縮した筋肉や筋力が低下した筋肉の細胞、或いは患部周辺の細胞を、カルデクリンまたは、カルデクリン前駆体のようなカルデクリンを含むタンパク質を分泌できるように形質転換し、筋ジストロフィの症状を軽減することができる。

上記カルデクリン遺伝子としては、プロ型ラットカルデクリンをコードする遺伝子（配列番号３）、プロ型ヒトカルデクリンをコードする遺伝子（配列番号４）を含むカルデクリン遺伝子を含有するものを例示することができる。ここで、配列番号３または４に示される塩基配列を含むとは、当該塩基配列の前後に、例えば細胞の形質転換を容易にしたり、カルデクリン遺伝子の発現を促進するような配列が結合していてもよいとの意味である。一般的には、プレプロ型カルデクリンをコードする遺伝子を導入する。この場合、カルデクリンはプレプロ型として細胞内で生合成され、プロ型として血中へ分泌される。

カルデクリン遺伝子は、一般的な遺伝子工学分野の常法により製造することができる。例えば、先ず、カルデクリンを産生する細胞から、ｍＲＮＡの逆転写などの常法によりｃＤＮＡライブラリーを調製し、当該ライブラリーから、カルデクリン遺伝子を特定するためのプローブや抗体を用いて、カルデクリン遺伝子を含むｃＤＮＡを得る。当該ｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅し、さらにカラム等で精製すればよい。また、ＰＣＲ反応後は、得られたＤＮＡを細胞に導入してから培養し、さらにＤＮＡ量を増やしてもよい。

カルデクリン遺伝子は、治療薬として患部や患部周辺に送達するためにベクターへ導入することが好ましい。当該ベクターとしては、ヒトへ投与するために一般的に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ−ｂｌｅｏなどのプラスミドベクターを使用することができる。当該ベクターは、さらにエンドサイトーシス等によりカルデクリン遺伝子の標的細胞への取り込みを容易にするために、リポソーム等に封入してもよい。また、アデノウイルスのようなウイルスベクターも使用することができる。

本発明の筋ジストロフィ治療薬は、上記カルデクリン及び、それをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを有効成分とし、好ましくはこれを適当な希釈剤や他の添加剤とともに、適当な剤形にして使用される。

本発明のカルデクリン遺伝子を含む筋ジストロフィ治療薬の投与方法は、特に制限されない。例えば、生理食塩水等の希釈剤に懸濁した後、さらに必要に応じて他の添加剤を加えた適当な剤形とし、注射剤として投与することができる。

本発明のカルデクリン遺伝子を含む筋ジストロフィ治療薬の投与量も、筋ジストロフィ患者の症状や重篤度、年齢や性別などにより適宜調節すればよいが、通常は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。

本発明に係るカルデクリン遺伝子により形質転換された細胞は、カルデクリンを分泌し、筋ジストロフィの症状を軽減する。よって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで患者の細胞を本発明のカルデクリン遺伝子で形質転換した上で、患部または患部周辺へ移植してもよい。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。

製造例１ ラット膵臓からのカルデクリンの精製
ラット（埼玉実験動物から入手）２５匹を、ネンブタールを投与することにより屠殺し、膵臓を取り出した。得られた膵臓をホモジェナイザー（セントラル科学貿易製、製品名：ポリトロン）で破砕し、アセトンを加えて脱水した。ここへ、２％ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）を加えてよく攪拌してから濾過した。濾液へ、０．４体積倍の冷アセトンを加えてアセトン濃度を３０容積％とし、氷冷下で３０分間攪拌した後、遠心分離により上清を得た。さらに、０．６体積倍の冷アセトンを加えてアセトン濃度を６０容積％とし、氷冷下で３０分間攪拌した。遠心分離によって、沈殿、即ち３０〜６０％アセトン画分を得た。得られた３０〜６０％アセトン画分を蒸留水に溶解し、さらに蒸留水で透析することによりアセトンを除去した。さらに、４５質量％の硫酸アンモニウムを加え、４℃で３０分間攪拌し、遠心分離した。得られた上清へ、６０質量％となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で３０分間攪拌した後に遠心分離することにより沈殿、即ち４５〜６０％硫酸アンモニウム画分を得た。この４５〜６０％硫酸アンモニウム画分を蒸留水に溶解した後、凍結乾燥し、使用時まで冷暗所で保存した。

上記４５〜６０％硫酸アンモニウム画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、同緩衝液で透析した後、この溶液をＱ−セファロース・ファーストフローカラム、スーパーデックス７５ＨＲカラム、およびＭｏｎｏＱ ＨＲカラムで精製し、タンパク質を得た。

得られた精製タンパク質を、逆相カラムを用いたＨＰＬＣとＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動で分析し、単一のタンパク質であることを確認した。また、当該タンパク質のアミノ酸配列を気相シークエンサーにより解析したところ、配列番号１のアミノ酸配列をＮ末端またはＮ末端付近に有することから、当該タンパク質をカルデクリンと同定した。

当該カルデクリンは、リン酸緩衝液に溶解して濃度１ｍｇ／ｍＬの溶液とした後、ポアサイズ０．２２μｍのフィルタを用いて濾過滅菌した。濾液を１ｍＬずつ滅菌済みバイアルに分注し、真空凍結乾燥した後にそのまま密栓し、使用時まで冷暗所で保存した。

製造例２ 膵臓抽出物（ＰＸ）の製造
非特許文献１で引用されている高岡らの方法（Acta Medica Nagasakiensia vol.13，No.1-2，pp28-35，1969年を参照）に準じて、複数のエラスターゼの混合物を主成分とする膵臓抽出物を調製した。即ち、先ず市販の豚アセトンパウダー（Ｓｉｇｍａ製）１０ｇに、重量比で１０倍量の冷水を加えて、冷所で１時間抽出した後に濾過した。得られた濾液へ希塩酸を加えてｐＨを４に調整し、沈殿を生じさせた。当該沈殿物を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより分離した。当該沈殿物を水に溶解し、さらに、希塩酸を加えてｐＨを５．４に調節し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた上清に希塩酸を加え、ｐＨを再度４．０に調整して沈殿を生じさせた。さらに、沈殿物を遠心分離し、精製水に溶解させた。当該溶液に４０質量％の硫酸アンモニウムを加えて室温で１時間静置し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿物に水を加えて溶解した後、透析チューブ（Ｃｕｔ ｏｆｆ ３，５００＜）を使って精製水で透析した。さらに、この透析液に８０質量％の硫酸アンモニウムを加えて沈殿物を得た。当該沈殿物を再度精製水に溶解させた上で透析した。得られた精製溶液を凍結乾燥することによって、１．２ｍｇの膵臓抽出物を得た。当該抽出物は、ビューレット法によって、タンパク質であることを確認した。得られた膵臓抽出物は、製造例１と同様の方法で滅菌した。

製造例３ 遺伝子を使ったカルデクリンの製造
ヒトカルデクリンｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたもの）を鋳型にして、プライマーとしてＢｓａ Ｉ ｐｒｉｍｅｒ（Ｓ：配列番号９，ＡＳ：配列番号１０）を使って、ＰＣＲ反応を行った。より詳しくは、ポリメラーゼとしてはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、９６℃で４５秒間、５０℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３０回繰り返した。増幅されたヒトカルデクリンｃＤＮＡを、ｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ ３ ベクターのＢｓａ Ｉ ｓｉｔｅにライゲーションした。このベクターは、最終的に得られるタンパク質のＣ末端へ、ストレプトアビジンに結合できるタグ（ＳＴＲＥＰ−ｔａｇＩＩ）を付けるために、ＤＮＡへＳＴＲＥＰ−ｔａｇのＤＮＡ配列を結合させたものである。当該ベクターを大腸菌（Invitrogen製、Top 10）にトランスフェクションさせ、ＬＢ／Ａｍｐ倍地中、３７℃で一晩培養した。次いで、Macherey-Nagel製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ ｋｉｔを用いてベクターＤＮＡを精製し、Ｃ末端にＳｔｒｅｐ−ｔａｇが結合したヒトカルデクリンｃＤＮＡを得た。

得られたｃＤＮＡを鋳型にして、プライマーとして、Ｓとして配列番号１１のＤＮＡと、ＡＳとして配列番号１２のＳＴＲＥＰ−ｔａｇ−ＮｏｔＩ ＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。より詳しくは、ポリメラーゼとしてはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で２分間のサイクルを３２回繰り返した。増幅されたヒトカルデクリンＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ−ｂｌｅｏ３ ベクターのＥｃｏＲＶ−Ｎｏｔ Ｉ ｓｉｔｅにライゲーションした。当該ベクターを大腸菌（ＴＡＫＡＲＡ製、ＤＨ５α）にトランスフェクションさせ、上記と同様の条件でＤＮＡを精製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用い、得られたＤＮＡをＧｉｂｃｏ ＢＲＬ製のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせた。別途、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製のＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地（１０％ ＦＢＳ，１００μｇ／ｍＬ ペニシリンＧ，０．２５μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）へ、４００μｇ／ｍＬの割合でブレオマイシンを添加した。当該倍地中、３７℃で１４日間、トランスフェクションされた上記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を選択的に培養した。

培地を７００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清に６５質量％の硫酸アンモニウムを加えることによりタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して回収し、沈殿に洗浄用緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて溶解した。当該溶液を、Ｓｔｒｅｐｔ−Ｔａｃｔｉｎ固相化ゲル（Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ）にアプライし、上記洗浄用緩衝液で洗浄後、Ｄｅｓｔｉｏｂｉｏｔｉｎを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡで溶出した。溶出液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で透析後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏ Ｓイオン交換カラムにアプライし、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出することによって、プロテアーゼ活性を示さないプロ型ヒトカルデクリンを得た。当該プロ型ヒトカルデクリンは、ヒトカルデクリンのＣ末端に、ストレプトアビジンへ結合できるタグが結合しているものである。

製造例４ ヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターの調製
製造例３と同様の条件により、ｐｈＣａｌｄｅｃｒｉｎ−ＩＲＥＳ−ｂｌｅｏを鋳型とし、ＳａｃＩ−ＡＴＧ ｃａｌｄｅｃｒｉｎとＳＴＲＥＰ−ｔａｇ−ＮｏｔＩをプライマーとしてＰＣＲを行い、ヒトカルデクリンＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰのＳａｃＩ−ＮｏｔＩ ｓｉｔｅに組み込んだ。当該ベクターを、石原産業製Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｎｅ−Ｎｅｏのリポソームに封入し調製した。Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｎｅ−Ｎｅｏは、センダイウイルスＨＶＪの膜からなるベクターである。当該ベクターは、細胞接着活性を残したままウィルス増殖活性は完全に不活化されており、エンドサイトーシスにより治療用遺伝子と共に細胞に取り込まれる。よって、得られたヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターを取り込んだ細胞は、ヒトカルデクリン遺伝子を発現させ、カルデクリンを産生することができる。

試験例１
財団法人実験動物中央研究所より入手した８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｄｙ／ｄｙ）雄マウスを３匹ずつ３群に分けた。当該マウスは、ミュータントタイプの筋ジストロフィ発症モデルマウスであり、下肢を動かすことができず自力で餌や水を取ることができなくなっており、筋ジストロフィ様の症状が発症していた。１週間馴化後、一晩絶食した翌朝、体重１ｋｇ当たり１００μｇの割合で、製造例１の方法で調整したカルデクリンを、２群のマウスの片側大腿筋に筋肉注射投与し、リン酸緩衝液を対照群に投与した。投与後、３時間後と６時間後にそれぞれ採血し、血清尿素窒素（以下、「ＢＵＮ」と略す場合がある）の濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、和光純薬製尿素窒素Ｂ−テストワコーｋｉｔで測定した。結果を表１に示す。なお、表中の値は、平均値±標準偏差であり、「減少率」は対照群のＢＵＮ値に対するカルデクリン投与群のＢＵＮ値の割合を示す。

上記結果の通り、カルデクリンの投与によって、血清中の尿素窒素量は約７０〜８０％まで明らかに減少している。血清尿素窒素量は筋組織の崩壊により上昇することから、カルデクリンは、筋組織の崩壊を抑制できることが実証された。

試験例２
マウスとしてミュータントタイプ（ｄｙ／ｄｙ）およびワイルドタイプの２種類のｄｙマウスを使い、それぞれ３匹ずつ３群に分けた。別途、製造例３で得たヒトカルデクリンを５０分の１の量のトリプシンで３０分間活性化し、且つ１ｍＭのＰＭＳＦでプロテアーゼ活性を阻害した。１週間馴化後、１群のマウスへ体重１ｋｇ当たり１００μｇの割合で、当該ヒトカルデクリンを４日間連続で注射投与した。対照群には、リン酸緩衝液を同様に投与した。これら群では、最終投与の前夜は絶食させ、翌日の最終投与から３時間後に屠殺して採血した。

また、残りの１群には、製造例４のヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターから調製した１０μｇＤＮＡ／１００μＬの溶液を、片側大腿筋に１匹当たり１００μＬ筋肉注射した。ＤＮＡの投与からタンパク質が発現するまでは、最低でも１日要するので、当該投与から５日目にマウスを屠殺した。屠殺の前日は絶食させ、屠殺してから採血した。

各群から採取した血液から血清を分離し、血清におけるＢＵＮ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を測定した。結果を図１に示す。図１の通り、ミュータントタイプおよびワイルドタイプのいずれのｄｙマウスにおいても、カルデクリンの投与によって、筋ジストロフィ発症モデルマウスの血清ＢＵＮ量を低減することができた。

試験例３
試験例２と同様に、同系の正常マウスを対照群として、ミュータントタイプのｄｙ／ｄｙマウスを１週間馴化した後、製造例３のヒトカルデクリンおよび製造例４のヒトカルデクリン遺伝子導入リポソームを投与した。ヒトカルデクリンは、体重１ｋｇ当たり１００μｇを４日間連続して腹腔内投与し、最終投与から３時間後に屠殺した。ヒトカルデクリン遺伝子導入リポソームは、マウス１匹当たり溶液状態で１００μＬ（ＤＮＡ１０μｇ含む）を片側大腿筋に１回注射投与し、５日目に屠殺した。対照群には、ヒトカルデクリン投与の場合と同様の条件で、リン酸緩衝液を投与した。各群において、屠殺の前日は絶食させた。

各群において、ＰＢＳに溶解した１％エバンスブルー（ＥＶ）を、屠殺の２４時間前に体重１０ｇ当たり５０μＬの容量で腹腔に注射投与した。このエバンスブルーは、無傷の細胞には浸入しないが、細胞膜が損傷を受けると細胞内に浸入する。屠殺後、大腿筋を摘出し、一部は１０％ホルマリンで固定し、一部は凍結した。なお、ヒトカルデクリン遺伝子導入リポソームの投与群では、大腿筋の摘出は、筋注射を行った反対側の脚から行った。

ホルマリン固定した筋からは、大腿筋の最大割断面で５μｍ厚の切片を作製し、ＨＥ染色を行った。結果を図２に示す。図２の通り、正常マウスの筋組織では、筋線維断面の不揃いが少なく、筋線維の周辺に濃色の核が認められる。しかし、筋ジストロフィ発症モデルマウスの対照群の筋組織は、筋線維の変性や壊死により細い、即ち断面積の小さい筋線維が生じ、また、核が筋線維の中心付近に移動している。それに対して、カルデクリンおよびカルデクリン遺伝子を投与したマウスでは、筋組織の基本構築がよく保たれており、明らかに症状は改善している。

また、凍結した大腿筋からは１０μｍの凍結切片を作製し、エバンスブルーによる自家蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。当該蛍光顕微鏡写真を図３示す。図３の通り、この組織像を蛍光顕微鏡で観察すると、正常マウスでは筋組織がよく保たれていることもあり、前日投与されたエバンスブルーによる赤色蛍光は、筋線維の周囲に限局していた。エバンスブルーは、崩壊した筋線維に特異的に取り込まれ、染色する。即ち、当該結果は、エバンスブルーは筋細胞内にはほとんど存在していないことから、正常マウスでは筋線維に障害は生じていないことを示す。カルデクリンを投与、またはカルデクリンを遺伝子導入したマウスにおいても同様であった。一方、筋ジストロフィ発症モデルマウスの筋組織では、筋線維の変性や壊死に伴って筋線維の断面積の不揃いが観察され、また、エバンスブルーが筋線維内に浸入している。それに対して、カルデクリンまたはカルデクリン遺伝子を投与した筋組織では、一部に筋線維内へのエバンスブルーの侵入が見られるが、その割合は低減しており、明らかに赤色蛍光像が減少したことから、筋組織崩壊の抑制効果があることが証明されている。

試験例４
６週令のＢＡＬＢ／ｃＣｒ Ｓｌｃ雄性マウスを試験前日より絶食させた。別途、製造例３で得たヒトカルデクリンまたは製造例２のブタ膵臓抽出物をリン酸緩衝液に溶解し、濃度０．０１ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。上記マウスを４匹または５匹の群に分け、リン酸緩衝液のみ、ヒトカルデクリン溶液、または膵臓抽出物溶液を、体重１０ｇ当たり０．１ｍＬ腹腔内注射投与した。投与から５時間後に心臓から採血し、ＢＵＮテストワコーおよびクレアチニンテストワコーキットを用いて、血清尿素窒素量（ｍｇ／ｄｌ）とクレアチニン量（ｍｇ／ｄｌ）を測定した。血清尿素窒素量の結果を表２に、クレアチニン量の結果を表３に示す。

上記結果の通り、血清尿素窒素量は膵臓抽出物の投与によっても低減できてはいるが、カルデクリンを投与すれば血清尿素窒素量をより一層低減できる。よって、カルデクリンは、筋ジストロフィによる筋組織の崩壊を、より効果的に抑制できることが実証された。

また、血中クレアチニン量に関しては、膵臓抽出物によりかえって増加している。クレアチニンは、本来、腎臓を介して尿中に排泄されるべきものであることから、血中クレアチニン量は、腎機能の評価に用いられる。よって、上記結果は、膵臓抽出物の投与により腎機能が障害を受けていることを強く示唆している。

一方、カルデクリンを投与した場合、血中クレアチニン量の増加は顕著に抑制されており、対照群とほぼ変わらない。このことは、カルデクリンの投与によって、腎機能に悪影響を及ぼすことなく筋ジストロフィを治療できることを示す。

以上の通り、カルデクリンは膵臓由来のタンパク質であり、エラスターゼに類似する塩基配列を有するものであるにも関わらず、膵臓の粗抽出物でありエラスターゼ混合物を主成分とするＰＸよりも、極めて高い血清尿素窒素の低減作用を有する。また、ＰＸが血中クレアチニン量を増加させることから、腎機能に悪影響を及ぼす可能性があるのに対して、カルデクリンにはその様な欠点は見られない。従って、カルデクリンおよびその遺伝子は、従来、有効な治療剤の存在しない筋ジストロフィを治療できるものとして、極めて有効である。

ヒトカルデクリンまたはヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターを筋ジストロフィ発症モデルマウスに投与した場合における、血清尿素窒素量の変化を示す図である。 正常マウスおよび筋ジストロフィ発症モデルマウスにおいて、ヒトカルデクリンまたはヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターを投与した場合における、筋組織をＨ．Ｅ．染色した結果を示す写真である。 正常マウスおよび筋ジストロフィ発症モデルマウスにおいて、ヒトカルデクリンまたはヒトカルデクリン遺伝子発現ベクターを投与した場合における、筋組織の状態をエバンスブルーの自家蛍光で示す蛍光顕微鏡写真である。

Claims (6)

1. カルデクリンを含有することを特徴とする筋ジストロフィ治療薬。
2. 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を含有することを特徴とする筋ジストロフィ治療薬。
   （ａ） 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ） 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ筋ジストロフィ治療効果を有するタンパク質。
3. カルデクリン遺伝子を含有することを特徴とする筋ジストロフィ治療薬。
4. 配列番号３または４に示される塩基配列を含むカルデクリン遺伝子を含有する筋ジストロフィ治療薬。
5. 前記カルデクリン遺伝子がベクターに含まれているものである請求項３または４に記載の筋ジストロフィ治療薬。
6. 前記ベクターがさらに形質転換細胞に含まれているものである請求項５に記載の筋ジストロフィ治療薬。