WO2012081711A1 - 細胞遊走調節剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a cell migration regulator and the like. Specifically, the present invention relates to a cell migration regulator containing a peptide capable of promoting or suppressing cell migration ability.
- Coagulation factor 9 (F9) involved in hemostasis coagulation is an essential blood coagulation factor known for a long time, and is well known as a protein causing hemophilia.
- F9 is activated by being cleaved into two fragments (heavy chain and light chain) by coagulation factor 11 (F11) in the course of the coagulation reaction, and promotes the coagulation reaction.
- an important part having a function as a coagulation factor is a trypsin domain on the C-terminal side (heavy chain), and the function on the N-terminal side (light chain) was not well known.
- Thrombus generated by blood coagulation is composed of various proteins including coagulation factors.
- Non-Patent Document 1 Gerottiafas GT et al., Clinical. (see studies with anticoagulants to improve survivor in cancer patents. Pathophysiol Haemost Thromb., 2008, vol. 36 (3-4), p. 204-11), and the mechanisms and major molecules are unexplained. Absent. Since the relationship between thrombus and cancer metastasis was statistically clarified, an attempt was made to suppress cancer metastasis by administering an anticoagulant, and significant suppression of cancer metastasis was confirmed.
- the present invention has been made in consideration of the above situation, and includes the following cell migration regulators (eg, cell migration promoters, cell migration inhibitors), cell migration regulation methods (eg, cell migration promotion methods, cells Migration inhibition method), pharmaceutical composition containing the regulator (pharmaceutical composition for promoting angiogenesis, treating wounds or ulcers, inhibiting or inhibiting cancer metastasis, or inhibiting or inhibiting angiogenesis), and cell development
- the present invention provides a promotion method, a cell epithelial-like sequence retention method, a cell expansion promotion composition, a cell epithelial-like sequence retention composition, and the like.
- a cell migration regulator comprising a peptide comprising the EGF3 domain of a -1 protein, a derivative thereof, or a salt thereof.
- a cell migration regulator comprising the following peptide (a) or (b), a derivative thereof, or a salt thereof: (A) A peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 12.
- a cell migration promoter comprising the following peptide (a) or (b), a derivative thereof, or a salt thereof: (A) A peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, or 12. (B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8 or 12, and having cell migration promoting activity.
- a cell migration inhibitor comprising the following peptide (a) or (b), a derivative thereof, or a salt thereof: (A) A peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8 or 12. (B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8, or 12, and having cell migration inhibitory activity. (5) A method for regulating cell migration, comprising administering the regulator of claim 1 or 2 to a test animal. (6) A method for promoting cell migration, comprising administering the promoter according to claim 3 to a test animal. (7) A method for inhibiting cell migration, comprising administering the inhibitor of claim 4 to a test animal.
- a pharmaceutical composition comprising the regulator according to claim 1 or 2.
- a pharmaceutical composition for promoting angiogenesis comprising the promoter according to claim 3.
- a pharmaceutical composition for treating wounds or ulcers comprising the promoter according to claim 3.
- a pharmaceutical composition for suppressing or inhibiting cancer metastasis comprising the inhibitor according to claim 4.
- a pharmaceutical composition for inhibiting or inhibiting angiogenesis comprising the inhibitor according to claim 4.
- a method for promoting cell expansion comprising using the promoter according to (3).
- a method for maintaining an epithelial-like sequence of cells comprising using the inhibitor according to claim 4.
- examples of the cells include cultured cells.
- a composition for promoting cell development comprising the promoter according to claim 3.
- a composition for maintaining an epithelial-like arrangement of cells comprising the inhibitor according to claim 4.
- examples of the cells include cultured cells.
- a cell migration regulator capable of promoting or suppressing cell migration for example, a cell migration promoting or inhibiting agent can be provided.
- the cell migration regulator of the present invention can be used, for example, in a pharmaceutical composition for promoting angiogenesis, treating wounds or ulcers, suppressing or inhibiting cancer metastasis, or suppressing or inhibiting angiogenesis. It can be applied to the fields of medicine and pharmacy and is extremely useful.
- the cell migration regulator of the present invention also promotes the development of cells (particularly cultured cells) by promoting cell migration, or retains the epithelial-like sequence of cells (particularly cultured cells) by inhibiting cell migration. It can be used effectively.
- FIG. 1 is a view showing the structure on the amino acid sequence constituting blood coagulation factor 9 (F9).
- the numbers in the figure are base numbers, and indicate regions in the base sequence of F9 (SEQ ID NO: 13; GenBank accession number: AK149372) corresponding to each amino acid sequence region of F9. is there.
- F9 (140-1414) is a peptide (SEQ ID NO: 2) consisting of the full length of F9 (definition will be described later), and F9 (140-709) is a trypsin domain (ie, heavy chain of F9) from the full length of F9.
- F9 (140-574) is a peptide consisting of a light chain of F9 (SEQ ID NO: 6), and F9 (290-391) is an EGF1 domain of F9 (SEQ ID NO: 4).
- F9-E1) (SEQ ID NO: 8) (hereinafter the same in the present specification and drawings).
- FIG. 2 is a diagram illustrating a result of the Wound healing assay.
- A Results of SCCKN cells (cell line derived from oral squamous cell carcinoma). Compared to the negative control (NC: AP only), F9 (140-1414) and F9 (140-709) inhibited migration by about 20%, while F9 (140-574) and F9 (290-391) migrated. Increased the ability by about 50%.
- FIG. 3 is a diagram showing the results of Boyden chamber assay.
- A The state of the migrated SCCKN cell is shown.
- the cells that have been dyed blue are cells that have migrated and entered the holes, and the cells that appear white are those that have no cells (the scale bar in the photo is 10 ⁇ m).
- B A graph showing the results of A above. Compared to control (NC: AP only), F9 (140-1414) and F9 (140-709) inhibit migration by about 25%, while F9 (140-574) and F9 (290-391) have migration ability. About 80%.
- C The same assay was performed using Cos cells, and similar results were obtained. 3A to 3C and numbers (for example, 140-1414 and F9 (140-1414)) have the same meaning as in FIG. FIG.
- FIG. 4 shows the structure of the EGF1 domain (F9-E1) of blood coagulation factor 9 (F9) and the EGF3 domain (Del1-E3) of endothelial cell locus-1 (Del-1; developmental endoceral locus-1) protein. It is a figure which shows the homology with the structure of.
- A The position of Del1-E3 on the Del-1 structure is shown.
- B shows homology between Del1-E3 (mDel1 in the figure) and F9-E1 (mF9 in the figure).
- the numbers (134, 145, 108, 119) in the figure represent the numbers of amino acid residues in Del-1 (SEQ ID NO: 10) or F9 (SEQ ID NO: 14).
- FIG. 5 is a diagram illustrating a result of the Wound healing assay.
- A Compared with a negative control (NC; chlorphenicol acetyltransferase protein), the addition of Del1-E3 (E3 in the figure) at a concentration of 1 ng / ml promoted the migration ability, but 100 ng / ml reversed the migration ability. Was suppressed.
- B Cell state 24 hours after addition of recombinant protein (Del1-E3) (scale bar in the picture is 100 ⁇ m). Compared to the negative control, in the group to which 1 ng / ml of Del1-E3 (E3 in the figure) was added, the cells reached far, and the gaps between the cells spread (the migration ability was promoted). In the group to which 100 ng / ml Del1-E3 was added, the cell migration distance was short, and the tip of the cell protrusion was finely divided and contracted (migration ability was suppressed).
- N chlorphenicol acet
- the light chain of F9 in particular, the first EGF (EGF1; epidermal growth factor) domain (F9-E1) of F9 has activity to promote cell migration ability.
- This promoting activity appeared when F9 was cleaved into a light chain and a heavy chain by coagulation factor 11 (F11) in the course of the coagulation reaction (that is, when activated as a coagulation factor).
- the present inventor also applied to the third EGF (EGF3) domain (Del1-E3) of an endothelial cell locus-1 (Del-1; developmental locus-1) protein having an amino acid sequence similar to F9-E1.
- EGF3 epidermal growth factor domain
- the full length F9 before being activated as a coagulation factor has a completely opposite function of suppressing cell migration ability. This inhibitory activity on cell migration was also observed in the portion of the full length F9 excluding the trypsin domain (ie, the heavy chain of F9). Furthermore, the present inventors have clarified that F9-E1 and Del1-E3 having the above-mentioned promoting activity promote cell migration ability at a low concentration, but rather suppress cell migration ability at a high concentration. That is, it was found that F9-E1 and Del1-E3 can regulate cell migration ability depending on the concentration used.
- cell migration is an essential phenomenon for mammals, particularly the human body, and is involved in a wide range of phenomena that occur in vivo. Examples include angiogenesis, wound or ulcer healing process, cancer cell metastasis, and the like. Therefore, by regulating (promoting or suppressing) the above-mentioned cell migration ability, angiogenesis therapy (for example, the therapy for arteriosclerotic ischemia such as myocardial infarction or cerebral infarction), treatment of wounds and ulcers, suppression of cancer metastasis or Inhibition and inhibition or inhibition of angiogenesis can be effectively performed.
- angiogenesis therapy for example, the therapy for arteriosclerotic ischemia such as myocardial infarction or cerebral infarction
- treatment of wounds and ulcers suppression of cancer metastasis or Inhibition and inhibition or inhibition of angiogenesis can be effectively performed.
- the present inventor promotes cell migration (especially cultured cells) by promoting cell migration, or retains epithelial-like sequences of cells (especially cultured cells) by suppressing cell migration. I found out that it can also be done effectively.
- the present invention has been completed based on the above findings. 2.
- the cell migration regulator of the present invention (hereinafter referred to as the regulator of the present invention) comprises (i) a peptide containing the full length of blood coagulation factor 9 (F9), and (ii) the full length of F9.
- a peptide comprising a portion excluding the trypsin domain (ie the heavy chain of F9), (iii) a peptide comprising the light chain of F9, or (iv) a peptide comprising the EGF1 domain of F9 (F9-E1), or (v) the endothelium It includes a peptide containing the EGF3 domain (Del1-E3; one of EGF-like domains) of cellular locus-1 (Del-1) protein.
- the modulator of the present invention comprises (i) a peptide consisting of the full length of F9, (ii) a peptide consisting of the full length of F9 excluding the trypsin domain (ie, the heavy chain of F9), and (iii) a light weight of F9.
- a peptide comprising a chain (iv) a peptide comprising F9-E1, or (v) a peptide comprising Del1-E3.
- the total length of F9 means that the signal peptide and the propeptide portion were removed from the entire amino acid sequence of F9 having the signal peptide and the propeptide (SEQ ID NO: 14; GenBank accession number: BAE28840).
- the signal peptide and the propeptide portion are regions consisting of the first to 46th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 (the same applies in this specification).
- the DNA encoding the peptide (protein) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 (GenBank accession number: AK149372).
- the full length of the Del-1 protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and the DNA encoding the Del-1 protein has the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
- the regulator of the present invention specifically includes the following peptide (a) as described above.
- the peptide (a) is not limited, but a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 12 is preferred.
- amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 and 12 are, in order, (i) the full-length amino acid sequence of F9 (SEQ ID NO: 2) and (ii) the tryptic domain (ie (Iii) the amino acid sequence of the light chain of F9 (SEQ ID NO: 6), (iv) the amino acid sequence of F9-E1 (SEQ ID NO: 8), (V) shows the amino acid sequence of Del1-E3 (SEQ ID NO: 12).
- the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 11 are described later, but DNAs encoding peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 12 respectively in order. It is.
- the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a sequence consisting of the 47th to 471st amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is shown in SEQ ID NO: 14. It is a sequence consisting of the 47th to 236th amino acids of the amino acid sequence, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is a sequence consisting of the 47th to 191st amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
- the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is a sequence consisting of the 97th to 130th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
- amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is a sequence consisting of the 123rd to 157th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
- peptide means a peptide composed of at least two amino acids bonded by peptide bonds, and includes oligopeptides, polypeptides, and the like.
- a polypeptide in which a certain three-dimensional structure is formed is called a protein.
- such a protein is also included in the “peptide”. Therefore, the peptide contained in the regulator of the present invention can mean any of oligopeptides, polypeptides, and proteins.
- the regulator of the present invention may contain the following peptide (b) as a peptide functionally equivalent to the peptide (a).
- amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added include, for example, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6 (1 to several), 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3,
- Examples include amino acid sequences in which ⁇ 2, 1 amino acid has been deleted, substituted or added, and there is no limitation.
- the number of such deletions, substitutions or additions is generally preferably as small as possible.
- the introduction of mutation such as deletion, substitution or addition may be carried out by a mutation introduction kit utilizing site-directed mutagenesis, for example, GeneTailor.
- TM Site-Directed Mutagenesis System Invitrogen Corporation
- TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System Motan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.
- the peptide functionally equivalent to the peptide of (a) is, for example, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 12. And a peptide having cell migration regulating activity.
- Such peptides include about 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 12. Or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, Examples thereof include peptides having an amino acid sequence having a homology of 99.8% or more and 99.9% or more and having a cell migration regulating activity.
- the cell migration regulating activity means a cell migration ability promoting activity or inhibitory activity
- the promoting activity or inhibitory activity is, for example, according to Wound healing assay or Boyden chamber assay described in Examples described later. Can be measured.
- the regulator of the present invention includes a cell migration promoter and a cell migration inhibitor.
- the cell migration promoter of the present invention includes the following peptide (a1).
- A1) A peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8 or 12.
- the peptide of (a1) is not limited, but a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8 or 12 is preferred.
- the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 8, and 12 are as described above.
- the promoter of the present invention may contain the following peptide (b1) as a peptide functionally equivalent to the peptide (a1).
- (B1) A peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8 or 12, and having cell migration promoting activity.
- the above explanation can be similarly applied to the above-mentioned “amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added”.
- the peptide functionally equivalent to the peptide of (a1) has, for example, an amino acid sequence having 80% or more homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, or 12. Also included are peptides having cell migration promoting activity. Such peptides include about 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8 or 12.
- cell migration promoting activity can be measured by, for example, Wound healing assay or Boyden chamber assay described in Examples described later.
- the cell migration inhibitor of the present invention (hereinafter referred to as the inhibitor of the present invention) comprises the following peptide (a2).
- A2) A peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8 or 12.
- the peptide of the above (a2) is not limited, but a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8 or 12 is preferable.
- the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 8, and 12 are as described above.
- the promoter of the present invention may include the following peptide (b2) as a peptide functionally equivalent to the peptide (a2).
- B2 A peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8 or 12, and having cell migration promoting activity.
- the peptide functionally equivalent to the peptide of (a2) has, for example, an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8, or 12. And peptides having cell migration inhibitory activity.
- Such peptides include about 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 8, or 12. 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.
- Examples thereof include peptides having an amino acid sequence having a homology of 8% or more and 99.9% or more and having a cell migration inhibitory activity.
- the larger the homology value the better.
- the cell migration inhibitory activity can be measured by, for example, Wound healing assay or Boyden chamber assay described in Examples described later.
- the peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or 12 can be included in any of the promoters and inhibitors of the present invention described above, and this is used as described later. This is because cell migration can be promoted or suppressed depending on the concentration, so that it has both functions.
- the peptides (a) and (b) contained in the regulator of the present invention, and the peptides (a1), (a2), (b1) and (b2) contained in the promoter and inhibitor of the present invention are:
- the number of residues of the constituent amino acids is not particularly limited, and can be set as appropriate within a range having a predetermined activity (regulation of cell migration, specifically promotion or suppression activity).
- the peptides (a) and (b) and the peptides (a1), (a2), (b1) and (b2) may be peptides derived from natural products, or may be artificially chemically synthesized.
- a natural product-derived peptide is preferable because it often has no adverse effects such as cytotoxicity or side effects.
- peptides derived from natural products include naturally occurring oligopeptides, polypeptides and proteins, or fragments of these.
- a peptide derived from a natural product may be obtained directly from a natural product by a known recovery method and purification method, or a gene encoding the peptide is incorporated into various expression vectors by a known gene recombination technique. After being introduced into cells and expressed, they may be obtained by known recovery and purification methods.
- a commercially available kit such as a reagent kit PROTEIOS TM (Toyobo), TNT TM System (Promega), PG-Mate of synthesizer TM
- PROTEIOS TM Toyobo
- TNT TM System Promega
- PG-Mate of synthesizer TM The peptide may be produced by a cell-free protein synthesis system using Toyobo, RTS (Roche Diagnostics), etc., and may be obtained by a known recovery method and purification method, and is not limited. Also, chemically synthesized peptides can be obtained using known peptide synthesis methods.
- the synthesis method examples include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method.
- the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis.
- a commercially available peptide synthesizer may be used.
- the peptide can be purified by combining known purification methods such as chromatography.
- the regulator, promoter and inhibitor of the present invention (hereinafter referred to as the regulator of the present invention) are the peptide of (a) or (b), the peptide of (a1) or (b1), or (a2).
- the derivative of the said peptide can be included with or instead of the peptide of (b2).
- the derivative is meant to include all those that can be prepared from the peptide.
- the regulator or the like of the present invention includes the peptide (a) or (b), the peptide (a1) or (b1), the peptide (a2) or (b2), and / or a derivative of the peptide,
- a salt of the peptide and / or the derivative can be included.
- the salt is preferably a physiologically acceptable acid addition salt or basic salt.
- Acid addition salts include, for example, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, or acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, apple
- inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, or acetic acid
- propionic acid fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid
- organic acids such as acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
- Examples of basic salts include salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide and magnesium hydroxide, and salts with organic bases such as caffeine, piperidine, trimethylamine and pyridine.
- Salts can be prepared using a suitable acid such as hydrochloric acid or a suitable base such as sodium hydroxide.
- a suitable acid such as hydrochloric acid or a suitable base such as sodium hydroxide.
- it can be prepared by treatment using standard protocols in water or in a liquid containing an inert water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol or dioxane.
- the regulator of the present invention comprises the peptide (a) or (b), the peptide (a1) or (b1), the peptide (a2) or (b2), a derivative thereof, or a salt thereof.
- the peptide, its derivative or a salt thereof and other components may be included, and is not limited. Examples of other components include buffers such as PBS and Tris-HCl, and additives such as sodium azide and glycerol.
- the content ratio can be appropriately set within the range in which the cell migration regulatory activity (promoting activity or inhibitory activity) by the peptide, derivative thereof or salt thereof is not significantly hindered.
- the peptide concentration is not limited, but is preferably 0.3 ng / ml or more, more preferably 0.3 to 5 ng / ml, still more preferably 0.00. It is 3 to 2 ng / ml, even more preferably 0.4 to 1.5 ng / ml, particularly preferably 0.6 to 1 ng / ml, most preferably 0.8 to 1 ng / ml.
- the cells that are subject to the regulation (promotion or suppression) of cell migration ability by the regulator of the present invention are not limited, and include vascular endothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells, tumor cells (cancer cells) and the like. Examples include various cells.
- a method for regulating cell migration using the regulator of the present invention can also be provided.
- a cell migration promotion method or a cell migration suppression method using the promoter or inhibitor of the present invention can also be provided.
- the method is a method including the step of administering the regulator of the present invention to a test animal, and any other step may be included and is not limited.
- test animals include, but are not limited to, various mammals including humans or non-human animals, preferably humans.
- the administration method of the pharmaceutical composition described later can be applied as appropriate.
- the peptide (a) or (b) as an active ingredient of the regulator of the present invention may be directly administered, Alternatively, it may be introduced (gene introduction) in the state of DNA encoding the peptide, and is not limited.
- DNA can be introduced using various known gene introduction methods such as liposome method (lipoplex method), polyplex method, peptide method, electroporation method (electroporation method), and viral vector method.
- the regulator of the present invention by using the regulator of the present invention, it is possible to provide a method for promoting the expansion of cells (particularly cultured cells), a method for maintaining the epithelial-like arrangement of cells (particularly cultured cells), and the like. Specifically, it is possible to provide a cell expansion promoting method using the promoter of the present invention and a cell epithelial-like sequence retention method using the inhibitor of the present invention. In these methods, it is preferable to directly add the regulator (accelerator, inhibitor) of the present invention to the culture solution of the target cell (cultured cell).
- the concentration in the culture solution is preferably about 0.1 to 10 ng / ml, more preferably 0.1 to 5 ng / ml.
- the concentration in the culture solution is preferably about 1 to 10 ng / ml, more preferably 5 to 10 ng / ml (both added in terms of peptide contained in the regulator of the present invention) ).
- a composition for promoting cell development containing the promoter of the present invention and a composition for maintaining an epithelial-like array of cells containing the inhibitor of the present invention are also provided.
- the expansion of cells means that the cells expand by proliferating and migrating in the incubator, and promoting the expansion means that the cells are wider in a shorter time.
- the epithelial arrangement of cells means that the cells adhere to each other in a cobblestone shape and are arranged without gaps, and holding the epithelium-like arrangement means growth factors, cytokines, F9 It means to maintain the cobblestone arrangement of cells by resisting factors that promote cell migration such as E1.
- the cells (cultured cells) to be promoted for development are not limited, but for example, vascular endothelial cells, keratinized epithelial cells, fibroblasts, induced pluripotent stem cells and the like are preferable.
- the cells (cultured cells) to be the target of maintaining the epithelial-like sequence are not limited, but for example, vascular endothelial cells, keratinized epithelial cells, induced pluripotent stem cells, and the like are preferable.
- As a practical effect by accelerating cell development according to the present invention for example, it is possible to shorten the period of modifying the artificial substrate with cells collected from the human body or cells processed from them.
- DNA, recombinant vector, transformant (1) DNA
- the peptide of (a) or (b), the peptide of (a1) or (b1), or DNA containing the base sequence encoding the peptide of (a2) or (b2) is also included.
- the DNA may be a DNA consisting of a base sequence encoding the peptide (specifically, a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 11 described above), or
- the DNA may be a DNA containing a part of the base sequence and a known base sequence necessary for gene expression (transcription promoter, SD sequence, Kozak sequence, terminator, etc.), and is not limited.
- the type of codon is not limited, and for example, a codon commonly used in mammals such as humans may be used after transcription, It may be one using a codon generally used in microorganisms such as yeast, plants and the like, and can be appropriately selected or designed.
- DNA encoding a protein having a cell migration regulation (promotion or suppression) activity which is capable of hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a simple nucleotide sequence, is also included.
- the stringent conditions are, for example, a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM, a temperature of 55 to 75 ° C., preferably a salt (sodium) concentration of 150 to 200 mM, and a temperature of 60 to 70. Refers to conditions at ° C.
- DNA that can be hybridized includes bases represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 11 when calculated using homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters.
- DNA comprising a sequence, or DNA encoding a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 12, and about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 9 % Or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more,
- a recombinant vector obtained by ligating (inserting) the DNA of the present invention into an appropriate vector is also included.
- the vector for inserting the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and virus.
- plasmid DNA include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, and the like
- phage DNA includes ⁇ phage and the like.
- viruses include adenoviruses and retroviruses.
- the recombinant vector of the present invention includes, in addition to a promoter and the DNA of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a liposome binding sequence (SD sequence), a selectable marker gene, a reporter gene, etc. Can be linked.
- a selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
- the reporter gene include genes such as green fluorescent protein (GFP) or mutants thereof (fluorescent proteins such as EGFP, BFP, YFP), luciferase, alkaline phosphatase, LacZ and the like.
- the present invention also includes a transformant that can be obtained by introducing the above-described recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed.
- the host is not limited as long as it can express the DNA of the present invention, and for example, bacteria and yeasts well known in the art can be used.
- the recombinant vector of the present invention can autonomously replicate in the bacterium, and can contain a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence.
- bacteria include Escherichia coli.
- As the promoter for example, a lac promoter is used.
- vector introduction methods for bacteria include various known introduction methods such as the calcium ion method.
- yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae is used.
- the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast, and examples thereof include the gal1 promoter.
- the method for introducing a vector into yeast include an electroporation method and a spheroplast method. 4).
- Pharmaceutical composition The regulator of the present invention is useful as an active ingredient contained in a pharmaceutical composition.
- the peptide (a) or (b), the peptide (a1) or (b1), or the peptide (a2) or (b2) can also be referred to as the active ingredient.
- the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, but is useful as, for example, a pharmaceutical composition for promoting angiogenesis, treating wounds or ulcers, suppressing or inhibiting cancer (cancer cell) metastasis, and inhibiting or inhibiting angiogenesis. It is.
- the regulator of the present invention is a cell migration promoter, it is a drug for promoting angiogenesis (especially for the treatment of arteriosclerotic ischemia such as myocardial infarction or cerebral infarction), or for treating wounds or ulcers.
- the pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition containing the regulator of the present invention as an active ingredient and further containing a pharmaceutically acceptable carrier.
- “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, taste masking Agents, solubilizers or other additives.
- compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions or syrups can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods. In the case of an injection, it can be produced by dissolving or suspending it in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection. Moreover, when administering the regulator of this invention etc. which is an active ingredient in the living body, a colloid dispersion system can also be used.
- the colloidal dispersion system is expected to increase the in vivo stability of the peptide or to efficiently transport the compound to a specific organ, tissue or cell.
- the colloidal dispersion system is not particularly limited as long as it is usually used, but polyethylene glycol, polymer composite, polymer aggregate, nanocapsule, microsphere, bead, and oil-in-water emulsifier, micelle, mixed micelle And lipid-based dispersion systems including liposomes, preferably liposomes or artificial membrane vesicles that are effective in efficiently transporting compounds to specific organs, tissues or cells.
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is the age, sex, body weight and symptom, therapeutic effect, administration method, treatment time, or pharmaceutical composition of a test animal (various mammals including human or non-human animals, preferably humans). It may differ depending on the type of the regulator of the present invention contained in the product. Usually, it can be administered in a range of 100 ⁇ g to 5000 mg per adult per person, but is not limited. For example, in the case of administration by injection, a dose of 100 ⁇ g to 100 mg per kg body weight can be administered to a human patient once to several times per day on an average per day. Examples of the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection, and intravenous injection is preferred.
- injections can be prepared as non-aqueous diluents (eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions, and emulsions.
- non-aqueous diluents eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol
- suspensions emulsions.
- emulsions eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol
- emulsions eg.g, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol
- Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization using a filter, blending of a bactericide, and the like.
- the injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvent before use.
- the concentration used is important because there are cases where cell migration promoting activity and cell migration inhibition activity are exhibited depending on the concentration used.
- it is preferable to administer the peptide so that its blood concentration is 0.1 ng / ml to 10 ng / ml, more preferably 0.1 ng / ml to 5 ng / ml. More preferably, it is 0.1 ng / ml to 1 ng / ml.
- the present invention also provides use of the regulator of the present invention (particularly the promoter of the present invention) for producing a medicament (drug) that promotes angiogenesis.
- the present invention also provides the regulator of the present invention for promoting angiogenesis and the like (particularly the promoter of the present invention).
- the present invention provides a method for promoting angiogenesis characterized by using the regulator of the present invention (especially the promoter of the present invention) (ie, administering to a test animal), and
- the present invention also provides the use of the regulator of the present invention (especially the promoter of the present invention) for promoting angiogenesis.
- the present invention also provides use of the regulator of the present invention (particularly the promoter of the present invention) for producing a medicament (medicine) for treating wounds or ulcers.
- the present invention also provides the regulator of the present invention for treating wounds or ulcers and the like (particularly the promoter of the present invention).
- the present invention provides a method for treating wounds or ulcers characterized by using the regulator of the present invention (especially the promoter of the present invention) (ie, administering to a test animal), and It also provides the use of the modulators of the present invention (especially the promoters of the present invention) for treating wounds or ulcers.
- the present invention also provides use of the regulator of the present invention (particularly the inhibitor of the present invention) for producing a medicament (drug) that suppresses or inhibits metastasis of cancer (cancer cells).
- the present invention also provides the regulator of the present invention for suppressing or inhibiting cancer (cancer cell) metastasis and the like (particularly the inhibitor of the present invention).
- the present invention provides a method for suppressing or inhibiting cancer (cancer cell) metastasis, characterized by using the regulator of the present invention (especially the inhibitor of the present invention) (ie, administering to a test animal).
- the present invention also provides use of the regulator of the present invention (particularly the inhibitor of the present invention) for suppressing or inhibiting cancer (cancer cell) metastasis.
- the present invention also provides use of the regulator of the present invention (particularly the inhibitor of the present invention) for producing a medicament (medicine) that suppresses or inhibits angiogenesis.
- the present invention also provides the regulator of the present invention for inhibiting or inhibiting angiogenesis (particularly the inhibitor of the present invention).
- the present invention provides a method for suppressing or inhibiting angiogenesis characterized by using the regulator of the present invention (especially the inhibitor of the present invention) (that is, administering to a test animal),
- the present invention also provides use of the regulator of the present invention (especially the inhibitor of the present invention) for suppressing or inhibiting angiogenesis.
- Cell migration regulation kit In the present invention, there is also provided a kit for regulating cell migration (for promoting or inhibiting), which comprises the regulator of the present invention as a constituent component.
- the kit of the present invention can promote or suppress the migration ability of various cells, for example, angiogenesis therapy for arteriosclerotic ischemia, treatment of wounds and ulcers, suppression or inhibition of cancer metastasis, or Since it can be used effectively when suppressing or inhibiting angiogenesis, it is extremely useful in various experiments and researches in the fields of medicine and pharmacy.
- the kit of the present invention can also be used effectively for promoting the development of cells (particularly cultured cells) or for maintaining the epithelial-like sequences of cells (particularly cultured cells).
- the kit of the present invention includes various buffers, sterilized water, various reaction containers (Eppendorf tube, etc.), cleaning agents, surfactants, various plates, preservatives, various cell culture containers, An experimental operation manual (instruction) may be included, and is not limited.
- an experimental operation manual instruction
- the present invention will be described more specifically with reference to examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
- recombinant proteins are fusion proteins of the full length of AP and F9 or a part thereof.
- Each of these recombinant proteins is prepared by using a known gene recombination technique with an alkaline phosphatase (AP) expression vector (APtag4).
- a recombinant vector was constructed by inserting cDNA encoding the full-length or a part thereof into a fusion gene with the AP gene, and the vector was introduced into CHO cells to express the fusion protein.
- AP alkaline phosphatase
- Each of the above-mentioned cDNAs are appropriately primer based on the known F9 gene sequence (SEQ ID NO: 13).
- Boyden chamber assay In order to evaluate the cell migration ability by a method different from the wound healing assay of Example 1, Boyden chamber assay was performed using Chemotaxell manufactured by Kurabo Industries. The recombinant protein and negative control used in the assay, and the amount added were the same as in Example 1. In the upper layer, an excessive amount of cells (SCCKN cells or Cos cells) suspended in a culture solution without serum was added, and in the lower layer, a normal culture solution containing serum was added and cultured for 30 minutes to 1 hour. After fixation with 4% paraformaldehyde, the cells were stained with trypan blue, and the percentage of holes into which cells had entered was counted under a microscope. The results are shown in FIG. In addition, the scale bar in the photograph of FIG.
- 3A indicates 10 ⁇ m [Reference Example 2].
- the amino acid sequence of Del-1 (SEQ ID NO: 10) consists of three EGF domains (EGF1 to EGF3) and two discoidin domains from the N-terminus. (Discodin 1 and Discoidin 2) (FIG. 4A). It was shown that the third EGF domain of Del-1 (Del1-E3) shares a consensus sequence with the EGF1 domain of F9 (F9-E1) (FIG. 4B).
- Wound healing assay A plastic ring was placed on a 3 cm culture dish, and COS cells were seeded therein and cultured for 24 hours. The ring was removed and the cells were photographed every minute. Observation was carried out in a normal culture solution for 6 hours, and then 1 ng / ml of CAT (chlorphenicol acetyltransferase) protein (negative control) and Del1-E3 were added to the culture solution and observation was continued.
- CAT chlorphenicol acetyltransferase
- Del1-E3 were added to the culture solution and observation was continued.
- These recombinant proteins can be obtained by known genetic recombination techniques using E. coli. It was prepared by introducing recombinant DNA into E. coli. Two hours before and after the conditioned medium was added to the captured video were analyzed.
- the front of migrating cells was divided every 30 ⁇ m, and the average value of the movement of the front was calculated.
- the migration rate before addition of the conditioned medium was defined as 1, and the migration rate after addition (mean ⁇ SEM) was expressed.
- the results are shown in FIG. P ⁇ 0.01.
- the scale bar in the photograph of FIG. 5B shows 100 ⁇ m.
- Cell migration is involved in a wide range of phenomena that occur in the human body.
- the present invention can be applied to the medical and pharmaceutical fields related to the treatment of such phenomena. For example, it is possible to prepare a peptide of F9-E1 and use it as a drug, and it is considered possible to perform gene therapy using a gene encoding the peptide.
- phenomena that involve migration include angiogenesis, wound or ulcer healing processes, cancer cell metastasis, and the like. Therefore, the present invention is useful for angiogenesis therapy for arteriosclerotic ischemia, treatment of wounds and ulcers, suppression or inhibition of cancer metastasis, suppression or inhibition of angiogenesis, and the like.
- the present invention is also useful for promoting the development of cells (particularly cultured cells) by promoting cell migration, or retaining the epithelial-like sequence of cells (particularly cultured cells) by inhibiting cell migration. is there.
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Abstract
細胞遊走の促進又は抑制を行うことができる細胞遊走調節剤、細胞遊走調節方法、及び当該調節剤を含む医薬組成物等を提供する。本発明に係る細胞遊走調節剤は、血液凝固第9因子の全長、血液凝固第9因子の全長からトリプシンドメインを除いた部分、血液凝固第9因子の軽鎖、若しくは血液凝固第9因子のEGF1ドメイン、又は内皮細胞遺伝子座-1タンパク質のEGF3ドメインを含むペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする。
Description
本発明は、細胞遊走調節剤等に関する。詳しくは、細胞遊走能を促進又は抑制し得るペプチドを含む細胞遊走調節剤等に関する。
止血凝固に携わる凝固第9因子(F9)は古くから知られる必須の血液凝固因子であり、血友病の原因タンパク質として周知である。F9は、凝固反応の過程で凝固第11因子(F11)により2つの断片(重鎖、軽鎖)等に切断されることで活性化され、凝固反応を促進する。F9において、凝固因子としての機能を有する重要な部分はC末端側(重鎖)のトリプシンドメインであり、N末端側(軽鎖)の機能についてはよく知られていなかった。
血液凝固により生じる血栓は、凝固因子を含む種々のタンパク質から構成される。これまで、血栓内に新生血管が形成されやすいことや、血栓形成の認められる癌患者において癌転移率が高いことが確認されているが(例えば、非特許文献1;Gerotziafas GT et al.,Clinical studies with anticoagulants to improve survival in cancer patients.Pathophysiol Haemost Thromb.,2008,vol.36(3−4),p.204−11参照。)、その機序や主要分子については未だ一定の結論が出ていない。血栓と癌転移との関係が統計的に明らかにされたことで、抗凝固剤を投与することにより癌転移を抑制しようという試みがなされ、癌転移の有意な抑制が確認された。しかしながら、抗凝固剤の使用は出血の危険を伴うため、使用量には限界があった。また、経験的には有効であっても、機序が不明であるため、広く普及するには至っていない。
ところで、細胞遊走は、人体の生命活動において必須の現象であり、人体で起こる広範な現象に関与するものであるが、同時に、癌の転移等の好ましくない結果も引きこすことが知られている。また、細胞遊走が関与する他の現象としては、血管新生や、創傷の治癒等が知られている。
血液凝固により生じる血栓は、凝固因子を含む種々のタンパク質から構成される。これまで、血栓内に新生血管が形成されやすいことや、血栓形成の認められる癌患者において癌転移率が高いことが確認されているが(例えば、非特許文献1;Gerotziafas GT et al.,Clinical studies with anticoagulants to improve survival in cancer patients.Pathophysiol Haemost Thromb.,2008,vol.36(3−4),p.204−11参照。)、その機序や主要分子については未だ一定の結論が出ていない。血栓と癌転移との関係が統計的に明らかにされたことで、抗凝固剤を投与することにより癌転移を抑制しようという試みがなされ、癌転移の有意な抑制が確認された。しかしながら、抗凝固剤の使用は出血の危険を伴うため、使用量には限界があった。また、経験的には有効であっても、機序が不明であるため、広く普及するには至っていない。
ところで、細胞遊走は、人体の生命活動において必須の現象であり、人体で起こる広範な現象に関与するものであるが、同時に、癌の転移等の好ましくない結果も引きこすことが知られている。また、細胞遊走が関与する他の現象としては、血管新生や、創傷の治癒等が知られている。
このような状況下において、細胞遊走の促進又は抑制を行うことができる細胞遊走調節剤、細胞遊走調節方法、及び当該調節剤を含む医薬組成物等の開発が望まれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、細胞遊走調節剤(例えば、細胞遊走促進剤、細胞遊走抑制剤)、細胞遊走調節方法(例えば、細胞遊走促進方法、細胞遊走抑制方法)、当該調節剤を含む医薬組成物(血管新生促進用、創傷又は潰瘍治療用、癌転移抑制又は阻害用、あるいは血管新生抑制又は阻害用の医薬組成物)、並びに、細胞の展開促進方法、細胞の上皮様配列保持方法、細胞の展開促進用組成物、及び細胞の上皮様配列保持用組成物等を提供するものである。
(1)血液凝固第9因子の全長、血液凝固第9因子の全長からトリプシンドメインを除いた部分、血液凝固第9因子の軽鎖、若しくは血液凝固第9因子のEGF1ドメイン、又は内皮細胞遺伝子座−1タンパク質のEGF3ドメインを含むペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走調節剤。
(2)以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走調節剤。
(a)配列番号2、4、6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号2、4、6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走調節活性を有するペプチド。
(3)以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走促進剤。
(a)配列番号6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。
(4)以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走抑制剤。
(a)配列番号2、4、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号2、4、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走抑制活性を有するペプチド。
(5)被験動物に請求項1又は2記載の調節剤を投与することを特徴とする、細胞遊走調節方法。
(6)被験動物に請求項3記載の促進剤を投与することを特徴とする、細胞遊走促進方法。
(7)被験動物に請求項4記載の抑制剤を投与することを特徴とする、細胞遊走抑制方法。
(8)請求項1又は2記載の調節剤を含む、医薬組成物。
(9)請求項3記載の促進剤を含む、血管新生促進用医薬組成物。
(10)請求項3記載の促進剤を含む、創傷又は潰瘍治療用医薬組成物。
(11)請求項4記載の抑制剤を含む、癌転移抑制又は阻害用医薬組成物。
(12)請求項4記載の抑制剤を含む、血管新生抑制又は阻害用医薬組成物。
(13)請求項3記載の促進剤を用いることを特徴とする、細胞の展開促進方法。
(14)請求項4記載の抑制剤を用いることを特徴とする、細胞の上皮様配列保持方法。
上記(13)及び(14)の方法において、細胞としては、例えば培養細胞が挙げられる。
(15)請求項3記載の促進剤を含む、細胞の展開促進用組成物。
(16)請求項4記載の抑制剤を含む、細胞の上皮様配列保持用組成物。
上記(15)及び(16)の組成物において、細胞としては、例えば培養細胞が挙げられる。
本発明によれば、細胞遊走の促進又は抑制を行うことができる細胞遊走調節剤、例えば、細胞遊走促進又は抑制剤を提供することができる。
本発明の細胞遊走調節剤は、例えば、血管新生を促進する、創傷又は潰瘍を治療する、癌転移を抑制又は阻害する、あるいは血管新生を抑制又は阻害するための医薬組成物に用い得る点で、医学及び薬学の分野に応用可能であり、極めて有用なものである。
また、本発明の細胞遊走調節剤は、細胞遊走の促進により細胞(特に培養細胞)の展開を促進したり、細胞遊走の抑制により細胞(特に培養細胞)の上皮様配列の保持することにも有効に用い得るものである。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、細胞遊走調節剤(例えば、細胞遊走促進剤、細胞遊走抑制剤)、細胞遊走調節方法(例えば、細胞遊走促進方法、細胞遊走抑制方法)、当該調節剤を含む医薬組成物(血管新生促進用、創傷又は潰瘍治療用、癌転移抑制又は阻害用、あるいは血管新生抑制又は阻害用の医薬組成物)、並びに、細胞の展開促進方法、細胞の上皮様配列保持方法、細胞の展開促進用組成物、及び細胞の上皮様配列保持用組成物等を提供するものである。
(1)血液凝固第9因子の全長、血液凝固第9因子の全長からトリプシンドメインを除いた部分、血液凝固第9因子の軽鎖、若しくは血液凝固第9因子のEGF1ドメイン、又は内皮細胞遺伝子座−1タンパク質のEGF3ドメインを含むペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走調節剤。
(2)以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走調節剤。
(a)配列番号2、4、6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号2、4、6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走調節活性を有するペプチド。
(3)以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走促進剤。
(a)配列番号6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。
(4)以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走抑制剤。
(a)配列番号2、4、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号2、4、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走抑制活性を有するペプチド。
(5)被験動物に請求項1又は2記載の調節剤を投与することを特徴とする、細胞遊走調節方法。
(6)被験動物に請求項3記載の促進剤を投与することを特徴とする、細胞遊走促進方法。
(7)被験動物に請求項4記載の抑制剤を投与することを特徴とする、細胞遊走抑制方法。
(8)請求項1又は2記載の調節剤を含む、医薬組成物。
(9)請求項3記載の促進剤を含む、血管新生促進用医薬組成物。
(10)請求項3記載の促進剤を含む、創傷又は潰瘍治療用医薬組成物。
(11)請求項4記載の抑制剤を含む、癌転移抑制又は阻害用医薬組成物。
(12)請求項4記載の抑制剤を含む、血管新生抑制又は阻害用医薬組成物。
(13)請求項3記載の促進剤を用いることを特徴とする、細胞の展開促進方法。
(14)請求項4記載の抑制剤を用いることを特徴とする、細胞の上皮様配列保持方法。
上記(13)及び(14)の方法において、細胞としては、例えば培養細胞が挙げられる。
(15)請求項3記載の促進剤を含む、細胞の展開促進用組成物。
(16)請求項4記載の抑制剤を含む、細胞の上皮様配列保持用組成物。
上記(15)及び(16)の組成物において、細胞としては、例えば培養細胞が挙げられる。
本発明によれば、細胞遊走の促進又は抑制を行うことができる細胞遊走調節剤、例えば、細胞遊走促進又は抑制剤を提供することができる。
本発明の細胞遊走調節剤は、例えば、血管新生を促進する、創傷又は潰瘍を治療する、癌転移を抑制又は阻害する、あるいは血管新生を抑制又は阻害するための医薬組成物に用い得る点で、医学及び薬学の分野に応用可能であり、極めて有用なものである。
また、本発明の細胞遊走調節剤は、細胞遊走の促進により細胞(特に培養細胞)の展開を促進したり、細胞遊走の抑制により細胞(特に培養細胞)の上皮様配列の保持することにも有効に用い得るものである。
図1は、血液凝固第9因子(F9)を構成するアミノ酸配列上の構造を示す図である。図中の番号(例えば140−1414)は、塩基番号であり、F9の各アミノ酸配列領域に対応する、F9の塩基配列(配列番号13;GenBankアクセッション番号:AK149372)中の領域を示すものである。F9(140−1414)は、F9の全長(定義は後述する)からなるペプチド(配列番号2)であり、F9(140−709)は、F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分からなるペプチド(配列番号4)であり、F9(140−574)は、F9の軽鎖からなるペプチド(配列番号6)であり、F9(290−391)は、F9のEGF1ドメイン(F9−E1)からなるペプチド(配列番号8)である(以下、本明細書及び図面において同様。)。
図2は、Wound healing assayの結果を示す図である。A:SCCKN細胞(口腔扁平上皮癌由来の細胞株)について行った結果である。陰性コントロール(NC:APのみ)に比較して、F9(140−1414)とF9(140−709)は遊走を約20%抑制し、F9(140−574)とF9(290−391)は遊走能を約50%促進させた。B:上記Aの結果を示す写真である。馴化培地(conditioned medium)を加えて6時間後の細胞であり、左図・陰性コントロール(NC:APのみ)、右図・F9(140−574)である。コントロールと比較して、細胞同士が離れており、配列も変化している(写真内のスケールバーは100μm)。C:同様のassayを、Cos細胞(サル腎由来細胞株)(左図)、P5細胞(マウス血管内皮由来細胞株)(右図)についても行い、同様の結果を得た。なお、図2A~C中の番号及び表記(例えば140−1414、及びF9(140−1414))は図1と同様の意味である。
図3は、Boyden chamber assayの結果を示す図である。A:遊走したSCCKN細胞の様子を示す。青く染まっているのは遊走して穴に入り込んだ細胞であり、白く見えるのは、細胞が入り込んでいない穴である(写真内のスケールバーは10μm)。B:上記Aの結果等を示すグラフである。コントロール(NC:APのみ)に比較して、F9(140−1414)とF9(140−709)は遊走を約25%抑制し、F9(140−574)、F9(290−391)は遊走能を約80%促進させた。C:同様のassayをCos細胞を用いても行い、同様の結果を得た。なお、図3A~C中の番号及び表記(例えば140−1414、及びF9(140−1414))は図1と同様の意味である。
図4は、血液凝固第9因子(F9)のEGF1ドメイン(F9−E1)の構造と、内皮細胞遺伝子座−1(Del−1;developmentally endothelial locus−1)タンパク質のEGF3ドメイン(Del1−E3)の構造との相同性を示す図である。A:Del−1の構造上のDel1−E3の位置を示す。B:Del1−E3(図中ではmDel1)とF9−E1(図中ではmF9)との相同性を示す。図中の番号(134,145,108,119)は、Del−1(配列番号10)又はF9(配列番号14)中のアミノ酸残基の番号を表す。
図5は、Wound healing assayの結果を示す図である。A:陰性コントロール(NC;CAT(chloramphenicol acetyl transferase)タンパク質)に比較し、Del1−E3(図中ではE3)を1ng/mlの濃度で添加すると遊走能が促進されたが、100ng/mlでは逆に抑制された。B:組み換えタンパク質(Del1−E3)を加えて24時間後の細胞の状態である(写真内のスケールバーは100μm)。陰性コントロールに比較し、1ng/mlのDel1−E3(図中ではE3)を添加した群では、細胞が遠くまで到達し、細胞間に隙間が広がっていた(遊走能が促進された)が、100ng/mlのDel1−E3を添加した群では、細胞の移動距離は短く、細胞の突起の先が細かく分かれて縮んでいる(遊走能が抑制されている)様子が見られた。
図2は、Wound healing assayの結果を示す図である。A:SCCKN細胞(口腔扁平上皮癌由来の細胞株)について行った結果である。陰性コントロール(NC:APのみ)に比較して、F9(140−1414)とF9(140−709)は遊走を約20%抑制し、F9(140−574)とF9(290−391)は遊走能を約50%促進させた。B:上記Aの結果を示す写真である。馴化培地(conditioned medium)を加えて6時間後の細胞であり、左図・陰性コントロール(NC:APのみ)、右図・F9(140−574)である。コントロールと比較して、細胞同士が離れており、配列も変化している(写真内のスケールバーは100μm)。C:同様のassayを、Cos細胞(サル腎由来細胞株)(左図)、P5細胞(マウス血管内皮由来細胞株)(右図)についても行い、同様の結果を得た。なお、図2A~C中の番号及び表記(例えば140−1414、及びF9(140−1414))は図1と同様の意味である。
図3は、Boyden chamber assayの結果を示す図である。A:遊走したSCCKN細胞の様子を示す。青く染まっているのは遊走して穴に入り込んだ細胞であり、白く見えるのは、細胞が入り込んでいない穴である(写真内のスケールバーは10μm)。B:上記Aの結果等を示すグラフである。コントロール(NC:APのみ)に比較して、F9(140−1414)とF9(140−709)は遊走を約25%抑制し、F9(140−574)、F9(290−391)は遊走能を約80%促進させた。C:同様のassayをCos細胞を用いても行い、同様の結果を得た。なお、図3A~C中の番号及び表記(例えば140−1414、及びF9(140−1414))は図1と同様の意味である。
図4は、血液凝固第9因子(F9)のEGF1ドメイン(F9−E1)の構造と、内皮細胞遺伝子座−1(Del−1;developmentally endothelial locus−1)タンパク質のEGF3ドメイン(Del1−E3)の構造との相同性を示す図である。A:Del−1の構造上のDel1−E3の位置を示す。B:Del1−E3(図中ではmDel1)とF9−E1(図中ではmF9)との相同性を示す。図中の番号(134,145,108,119)は、Del−1(配列番号10)又はF9(配列番号14)中のアミノ酸残基の番号を表す。
図5は、Wound healing assayの結果を示す図である。A:陰性コントロール(NC;CAT(chloramphenicol acetyl transferase)タンパク質)に比較し、Del1−E3(図中ではE3)を1ng/mlの濃度で添加すると遊走能が促進されたが、100ng/mlでは逆に抑制された。B:組み換えタンパク質(Del1−E3)を加えて24時間後の細胞の状態である(写真内のスケールバーは100μm)。陰性コントロールに比較し、1ng/mlのDel1−E3(図中ではE3)を添加した群では、細胞が遠くまで到達し、細胞間に隙間が広がっていた(遊走能が促進された)が、100ng/mlのDel1−E3を添加した群では、細胞の移動距離は短く、細胞の突起の先が細かく分かれて縮んでいる(遊走能が抑制されている)様子が見られた。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2010−276777号明細書(2010年12月13日出願)の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
1.本発明の概要
本発明者は、これまで止血凝固に寄与するだけのタンパク質として考えられてきた凝固第9因子(F9)には、他にも重要な機能があることを見出した。具体的には、F9の軽鎖、特にF9の第一EGF(EGF1;上皮増殖因子)ドメイン(F9−E1)に、細胞の遊走能を促進させる活性があることを発見した。この促進活性は、F9が凝固反応の過程で凝固第11因子(F11)により軽鎖と重鎖等に切断されたとき(すなわち、凝固因子として活性化されたとき)に現れるものであった。
また、本発明者は、F9−E1と類似のアミノ酸配列を有する内皮細胞遺伝子座−1(Del−1;developmentally endothelial locus−1)タンパク質の第三EGF(EGF3)ドメイン(Del1−E3)にも、同様に、効果的な細胞遊走能の促進活性があることを発見した。従来、Del−1遺伝子を虚血モデル動物に導入することにより、血管新生を促進することが知られていたが、その程度は不十分であった。この遺伝子治療の効果は、血管新生療法の標準となっている血管内皮細胞増殖因子(VEGF)による治療に及ぶものではなく、また、どのようなメカニズムで血管新生が進むのかが解明されていなかったため、それ以上の技術発展は不可能と考えられていた。また、Del−1は細胞外基質に沈着する不溶性タンパク質であり、Del−1全長については不溶性のために製剤化が困難であった。よって、Del−1全長のうち特にDel1−E3に優れた血管新生促進活性があることを見出したことは、上記遺伝子治療の効果を高めることになり、またDel1−E3はF9−E1と同様に可溶性であるため製剤化も容易となる。
他方、凝固因子として活性化される前のF9全長には、細胞の遊走能を抑制するという、全く逆の機能があることも発明した。この細胞遊走能の抑制活性は、F9全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分についても認められた。
さらに、本発明者は、上記促進活性を有するF9−E1及びDel1−E3については、低濃度では細胞遊走能を促進させるが、高濃度ではむしろ細胞遊走能を抑制することを明らかにした。つまり、F9−E1及びDel1−E3は、使用濃度によって細胞遊走能を調節できるものであることを見出した。
ところで、前述した通り、細胞の遊走は、哺乳動物、特に人体にとって必須の現象であり、生体内で起こる広範な現象に関与している。例えば、血管新生や、創傷又は潰瘍の治癒過程、癌細胞の転移などが挙げられる。よって、前述した細胞遊走能の調節(促進又は抑制)により、血管新生療法(例えば、心筋梗塞や脳梗塞等の動脈硬化性虚血に対する該療法)、創傷及び潰瘍の治療、癌転移の抑制又は阻害、並びに、血管新生の抑制又は阻害等を効果的に行うことができる。
また、本発明者は、細胞の遊走を促進することにより細胞(特に培養細胞)の展開を促進したり、あるいは細胞の遊走を抑制することにより細胞(特に培養細胞)の上皮様配列を保持することも効果的に行うことができることを見出した。
本発明は、以上の知見に基づいて完成されたものである。
2.細胞遊走調節剤
本発明の細胞遊走調節剤(以下、本発明の調節剤という。)は、先に述べた通り、(i)血液凝固第9因子(F9)の全長を含むペプチド、(ii)F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分を含むペプチド、(iii)F9の軽鎖を含むペプチド、若しくは(iv)F9のEGF1ドメイン(F9−E1)を含むペプチド、又は(v)内皮細胞遺伝子座−1(Del−1)タンパク質のEGF3ドメイン(Del1−E3;EGF類似ドメインのうちの一つ)を含むペプチドを含むものである。
好ましくは、本発明の調節剤は、(i)F9の全長からなるペプチド、(ii)F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分からなるペプチド、(iii)F9の軽鎖からなるペプチド、若しくは(iv)F9−E1からなるペプチド、又は(v)Del1−E3からなるペプチドを含むものである。
ここで、本発明における、F9の全長とは、シグナルペプチド及びプロペプチドを有するF9全体のアミノ酸配列(配列番号14;GenBankアクセッション番号:BAE28840)から、当該シグナルペプチド及びプロペプチド部分が除かれたアミノ酸配列からなるペプチド(タンパク質)を意味する。当該シグナルペプチド及びプロペプチド部分は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第1番目~第46番目のアミノ酸からなる領域である(本明細書中において同様)。なお、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるペプチド(タンパク質)をコードするDNAは、配列番号13に示される塩基配列(GenBankアクセッション番号:AK149372)である。
また、Del−1タンパク質の全長は、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなり、当該Del−1タンパク質をコードするDNAは、配列番号9に示される塩基配列である。
本発明の調節剤は、具体的には、先に述べた通り、下記(a)のペプチドを含むものである。
(a)配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記(a)のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
ここで、配列番号2、4、6、8及び12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ順に、(i)F9の全長のアミノ酸配列(配列番号2)、(ii)F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分のアミノ酸配列(配列番号4)、(iii)F9の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号6)、(iv)F9−E1のアミノ酸配列(配列番号8)、及び(v)Del1−E3のアミノ酸配列(配列番号12)を示すものである。なお、配列番号1、3、5、7及び11に示される塩基配列は、後述するが、それぞれ順に、配列番号2、4、6、8及び12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAである。
配列番号2に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第47番目~第471番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号4に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第47番目~第236番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号6に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第47番目~第191番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号8に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第97番目~第130番目のアミノ酸からなる配列である。
さらに、配列番号12に示されるアミノ酸配列は、配列番号10に示されるアミノ酸配列の第123番目~第157番目のアミノ酸からなる配列である。
本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも2個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明の調節剤に含まれるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。
また本発明の調節剤は、先に述べた通り、前記(a)のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記(b)のペプチドを含むものであってもよい。
(b)配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走調節活性を有するペプチド。
ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、1~15個、1~14個、1~13個、1~12個、1~11個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個(1~数個)、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、1個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされないが、当該欠失、置換又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、GeneTailorTM Site−Directed Mutagenesis System(インビトロジェン社)、及びTaKaRa Site−Directed Mutagenesis System(Mutan−K、Mutan−Super Express Km等:タカラバイオ社製)等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにX線及びNMR等による構造解析法などを用いて確認することができる。
また、前記(a)のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走調節活性を有するペプチドも挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走調節活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、細胞遊走調節活性とは、細胞遊走能の促進活性又は抑制活性を意味し、当該促進活性又は抑制活性は、例えば、後述する実施例に記載のWound healing assay又はBoyden chamber assay等により測定することができる。
本発明の調節剤としては、より詳しくは、細胞遊走促進剤と細胞遊走抑制剤とが挙げられる。
本発明の細胞遊走促進剤(以下、本発明の促進剤という。)は、下記(a1)のペプチドを含むものである。
(a1)配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記(a1)のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ここで、配列番号6、8及び12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、前述した通りである。
また本発明の促進剤は、前記(a1)のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記(b1)のペプチドを含むものであってもよい。
(b1)配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。
ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」についても、前述の説明が同様に適用できる。
また、前記(a1)のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走促進活性を有するペプチドも挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走促進活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、細胞遊走促進活性は、例えば、後述する実施例に記載のWound healing assay又はBoyden chamber assay等により測定することができる。
本発明の細胞遊走抑制剤(以下、本発明の抑制剤という。)は、下記(a2)のペプチドを含むものである。
(a2)配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記(a2)のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ここで、配列番号2、4、8及び12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、前述した通りである。
また本発明の促進剤は、前記(a2)のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記(b2)のペプチドを含むものであってもよい。
(b2)配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。
ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」についても、前述の説明が同様に適用できる。
また、前記(a2)のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走抑制活性を有するペプチドも挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走抑制活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、細胞遊走抑制活性は、例えば、後述する実施例に記載のWound healing assay又はBoyden chamber assay等により測定することができる。
なお、配列番号8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチドは、上記本発明の促進剤及び抑制剤のいずれにも含まれ得るものであるが、これは、後述するように、当該ペプチドは使用濃度によって細胞遊走を促進することもできるし、抑制することもできるという両面の機能を有するためである。使用濃度が低い場合は、細胞遊走を促進する活性を有し、使用濃度が高い場合は、細胞遊走を抑制する活性を有する。
本発明の調節剤に含まれる前記(a)及び(b)のペプチド、並びに、本発明の促進剤及び抑制剤に含まれる(a1)、(a2)、(b1)及び(b2)のペプチドは、その構成アミノ酸の残基数は特に限定はされず、所定の活性(細胞遊走の調節、具体的には促進又は抑制活性)を有する範囲内で適宜設定することができる。
前記(a)及び(b)のペプチド、並びに(a1)、(a2)、(b1)及び(b2)のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされないが、天然物由来のペプチドである場合は、細胞毒性等の悪影響や副作用等がない場合が多いため好ましい。
天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットPROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTM System(プロメガ)、合成装置のPG−MateTM(東洋紡)及びRTS(ロシュ・ダイアグノスティクス)等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
本発明の調節剤、促進剤及び抑制剤(以下、本発明の調節剤等という。)は、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドとともに、又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、当該ペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸(主にその側鎖)の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
本発明の調節剤等は、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチド、及び/又は、当該ペプチドの誘導体とともに、あるいはそれに代えて、当該ペプチド及び/又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
本発明の調節剤等は、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、PBS及びTris−HCl等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩による細胞遊走の調節活性(促進活性又は抑制活性)が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。具体的には、上記ペプチドの溶液で用いる場合、ペプチド濃度は、限定はされないが、0.3ng/ml以上であることが好ましく、より好ましくは0.3~5ng/ml、さらに好ましくは0.3~2ng/ml、さらにより好ましくは0.4~1.5ng/ml、特に好ましくは0.6~1ng/ml、最も好ましくは0.8~1ng/mlである。
本発明の調節剤等による細胞遊走能の調節(促進又は抑制)の対象となる細胞としては、限定はされず、血管内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞(癌細胞)等を含む各種細胞が挙げられる。
本発明においては、本発明の調節剤を用いる細胞遊走調節方法も提供することができる。同様に、本発明の促進剤又は抑制剤を用いる細胞遊走促進方法又は細胞遊走抑制方法を提供することもできる。当該方法は、被験動物に対して本発明の調節剤等を投与する工程を含む方法であり、それ以外にどのような工程を含むものであってもよく、限定はされない。被験動物としては、限定はされないが、ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。本発明の調節剤等の投与方法、用法、用量については、限定はされないが、後述する医薬組成物の投与方法が適宜同様に適用できる。
なお、被験動物の生体内に本発明の調節剤等を投与する場合は、本発明の調節剤の有効成分である前記(a)又は(b)のペプチド等を直接投与してもよいし、あるいは当該ペプチドをコードするDNAの状態で導入(遺伝子導入)してもよく、限定はされない。DNAの導入は、リポソーム法(リポプレックス法)、ポリプレックス法、ペプチド法、エレクトロポレーション法(電気穿孔法)、及びウイルスベクター法などの公知の各種遺伝子導入方法を用いて行うことができる。
また本発明においては、本発明の調節剤を用いることにより、細胞(特に培養細胞)の展開の促進方法や、細胞(特に培養細胞)の上皮様配列を保持する方法等も提供することできる。具体的には、本発明の促進剤を用いる細胞の展開促進方法、及び本発明の抑制剤を用いる細胞の上皮様配列保持方法を提供し得る。これら方法においては、本発明の調節剤(促進剤、抑制剤)を対象とする細胞(培養細胞)の培養液中に直接添加することにより行うことが好ましい。例えば、細胞の展開促進方法の場合は、培養液内濃度で、0.1~10ng/ml程度添加することが好ましく、より好ましくは0.1~5ng/mlであり、細胞の上皮様配列保持方法の場合は、培養液内濃度で、1~10ng/ml程度添加することが好ましく、より好ましくは5~10ng/mlである(いずれも本発明の調節剤に含まれるペプチド換算での添加量)。
さらに、本発明の促進剤を含む細胞の展開促進用組成物、及び本発明の抑制剤を含む細胞の上皮様配列保持用組成物も提供される。
本発明において、細胞(特に培養細胞)の展開とは、細胞が培養器内で増殖、遊走することにより広がることを意味し、当該展開を促進することとは、細胞がより短い時間でより広い面積の基質を覆うことを意味する。
また、細胞(特に培養細胞)の上皮様配列とは、細胞同士が敷石状に接着して隙間なく配列することを意味し、当該上皮様配列を保持することとは、成長因子、サイトカイン、F9−E1等の細胞遊走を促進する因子に抵抗して、細胞の敷石状配列を維持することを意味する。
上記の展開促進の対象となる細胞(培養細胞)としては、限定はされないが、例えば、血管内皮細胞、角化上皮細胞、線維芽細胞、人工多能性幹細胞等が好ましい。また、上記の上皮様配列の保持の対象となる細胞(培養細胞)としては、限定はされないが、例えば、血管内皮細胞、角化上皮細胞、人工多能性幹細胞等が好ましい。
本発明により、細胞の展開を促進することによる実用的な効果としては、例えば、人体から採取した細胞やそれらを加工した細胞によって人工基質を修飾する期間を短縮し得ること等が挙げられる。
また、本発明により、細胞の上皮様配列を保持することによる実用的な効果としては、例えば、人体から採取した細胞やそれらを加工した細胞によって人工基質を修飾する際に、培養液中でそれらの細胞を上皮化し得ること等が挙げられる。
3.DNA、組換えベクター、形質転換体
(1)DNA
本発明においては、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドをコードする塩基配列を含むDNAも包含される。当該DNAは、当該ペプチドをコードする塩基配列からなるDNA(具体的には、前述した配列番号1、3、5、7又は11に示される塩基配列からなるDNA)であってもよいし、あるいは、当該塩基配列を一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列(転写プロモーター、SD配列、Kozak配列、ターミネーター等)を含んでなるDNAであってもよく、限定はされない。なお、当該ペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよいし、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
また本発明においては、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドをコードする塩基配列を含むDNAに対して相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAであって、細胞遊走調節(促進又は抑制)活性を有するタンパク質をコードするDNAも包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩(ナトリウム)濃度が150~900mMであり、温度が55~75℃、好ましくは塩(ナトリウム)濃度が150~200mMであり、温度が60~70℃での条件をいう。
上記以外に当該ハイブリダイズが可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1、3、5、7又は11に示される塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAと、約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上又は99.9%以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。
(2)DNAを含む組換えベクター
本発明においては、適当なベクターに上記本発明のDNAを連結(挿入)することにより得られる組換えベクターも包含される。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA、ウイルス等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のDNAのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リポソーム結合配列(SD配列)、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子などを連結することができる。なお、選択マーカー遺伝子としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はその変異体(EGFP、BFP、YFP等の蛍光タンパク質)、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、LacZ等の遺伝子が挙げられる。
(3)形質転換体
本発明においては、上記本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得ることができる形質転換体も包含される。宿主としては、本発明のDNAを発現し得るものであれば限定されず、例えば、当該分野において周知の細菌、酵母等を用いることができる。
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばlacプロモーターなどが用いられる。細菌へのベクター導入法としては、公知の各種導入方法、例えばカルシウムイオン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター等が挙げられる。酵母へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
4.医薬組成物
本発明の調節剤等は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。なお、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドを、当該有効成分ということもできる。
本発明の医薬組成物は、限定はされないが、例えば、血管新生促進用、創傷又は潰瘍治療用、癌(癌細胞)転移抑制又は阻害用、及び血管新生抑制又は阻害用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の調節剤が細胞遊走促進剤である場合は、血管新生促進用(特に、心筋梗塞や脳梗塞等の動脈硬化性の虚血に対する治療用)や、創傷又は潰瘍治療用の医薬組成物に用いられることが好ましく、本発明の調節剤が細胞遊走抑制剤である場合は、癌(癌細胞)転移抑制又は阻害用や、血管新生抑制又は阻害用の医薬組成物に用いられることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、本発明の調節剤等を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の1種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、1つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。また、有効成分である本発明の調節剤等を生体内に投与する場合、コロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上記ペプチドの生体内の安定性を高めたり、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞である。
本発明の医薬組成物の投与量は、被験動物(ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト)の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の調節剤等の種類などにより異なっていてもよい。通常、成人一人あたり、一回につき100μg~5000mgの範囲で投与することができるが、限定はされない。
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、1回の投与において1kg体重あたり、100μg~100mgの量を、1日平均あたり1回~数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤(例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など)、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
なお、前述したように、本発明の調節剤等に含まれるペプチドとして、配列番号8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド(好ましくは当該アミノ酸配列からなるペプチド)を用いる場合は、当該ペプチドの使用濃度により細胞遊走促進活性を呈する場合と細胞遊走抑制活性を呈する場合とが存在するため、使用濃度が重要である。例えば、細胞遊走促進活性を呈するためには、当該ペプチドの血中濃度が0.1ng/ml~10ng/mlとなるように投与することが好ましく、より好ましくは0.1ng/ml~5ng/ml、さらに好ましくは0.1ng/ml~1ng/mlである。他方、細胞遊走抑制活性を呈するためには、当該ペプチドの血中濃度が100ng/ml~200ng/mlとなるように投与することが好ましく、より好ましくは100ng/ml~500ng/ml、さらに好ましくは100ng/ml~1000ng/mlである。
なお、本発明は、血管新生を促進する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、血管新生促進用の本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする血管新生の促進方法を提供するものであり、また、血管新生を促進するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。
同様に、本発明は、創傷又は潰瘍を治療する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、創傷又は潰瘍治療用の本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする創傷又は潰瘍の治療方法を提供するものであり、また、創傷又は潰瘍を治療するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。
本発明は、癌(癌細胞)の転移を抑制又は阻害する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、癌(癌細胞)転移抑制又は阻害用の本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする癌(癌細胞)転移の抑制又は阻害方法を提供するものであり、また、癌(癌細胞)転移を抑制又は阻害するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。
本発明は、血管新生を抑制又は阻害する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、血管新生抑制又は阻害用の本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする血管新生の抑制又は阻害方法を提供するものであり、また、血管新生を抑制又は阻害するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。
5.細胞遊走調節用キット
本発明においては、構成成分として本発明の調節剤等を含むことを特徴とする、細胞遊走調節用(促進用又は抑制用)キットも提供される。本発明のキットは、各種細胞の遊走能の促進又は抑制を行うことが可能であり、例えば、動脈硬化性の虚血に対する血管新生療法、創傷や潰瘍の治療、癌転移の抑制又は阻害、あるいは血管新生の抑制又は阻害等を行う場合に有効に用いることができるため、医薬及び薬学の分野における各種実験・研究等においても極めて有用性が高いものである。また、上記本発明のキットは、細胞(特に培養細胞)の展開促進、又は細胞(特に培養細胞)の上皮様配列の保持にも有効に用い得る。
本発明のキットは、本発明の調節剤等の他に、各種バッファー、滅菌水、各種反応容器(エッペンドルフチューブ等)、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、防腐剤、各種細胞培養容器、及び実験操作マニュアル(説明書)等を含んでいてもよく、限定はされない。
以下に、実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔参考例1〕
凝固第9因子タンパクの構造
図1に示すとおり、血液凝固第9因子(F9)の全長(図中のF9(140−1414))を構成するアミノ酸配列(配列番号2)においては、N末端側から、GLAドメインに続いて2つのEGFドメイン(EGF1、EGF2)があり、そのC末端側に、45残基程度のアミノ酸配列領域を介して、トリプシンドメインが連なっている。凝固反応が進む過程で、図1中の矢印で示した場所で活性化第11凝固因子(図中のF−11a)によって切断される(この際、上記45残基程度のアミノ酸配列領域が除かれる。)。切断されて除かれたアミノ酸配列領域のN末端側がF9のlight chain(軽鎖)であり、C末端側がF9のheavy chain(重鎖)(すなわち、トリプシンドメイン)である。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2010−276777号明細書(2010年12月13日出願)の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
1.本発明の概要
本発明者は、これまで止血凝固に寄与するだけのタンパク質として考えられてきた凝固第9因子(F9)には、他にも重要な機能があることを見出した。具体的には、F9の軽鎖、特にF9の第一EGF(EGF1;上皮増殖因子)ドメイン(F9−E1)に、細胞の遊走能を促進させる活性があることを発見した。この促進活性は、F9が凝固反応の過程で凝固第11因子(F11)により軽鎖と重鎖等に切断されたとき(すなわち、凝固因子として活性化されたとき)に現れるものであった。
また、本発明者は、F9−E1と類似のアミノ酸配列を有する内皮細胞遺伝子座−1(Del−1;developmentally endothelial locus−1)タンパク質の第三EGF(EGF3)ドメイン(Del1−E3)にも、同様に、効果的な細胞遊走能の促進活性があることを発見した。従来、Del−1遺伝子を虚血モデル動物に導入することにより、血管新生を促進することが知られていたが、その程度は不十分であった。この遺伝子治療の効果は、血管新生療法の標準となっている血管内皮細胞増殖因子(VEGF)による治療に及ぶものではなく、また、どのようなメカニズムで血管新生が進むのかが解明されていなかったため、それ以上の技術発展は不可能と考えられていた。また、Del−1は細胞外基質に沈着する不溶性タンパク質であり、Del−1全長については不溶性のために製剤化が困難であった。よって、Del−1全長のうち特にDel1−E3に優れた血管新生促進活性があることを見出したことは、上記遺伝子治療の効果を高めることになり、またDel1−E3はF9−E1と同様に可溶性であるため製剤化も容易となる。
他方、凝固因子として活性化される前のF9全長には、細胞の遊走能を抑制するという、全く逆の機能があることも発明した。この細胞遊走能の抑制活性は、F9全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分についても認められた。
さらに、本発明者は、上記促進活性を有するF9−E1及びDel1−E3については、低濃度では細胞遊走能を促進させるが、高濃度ではむしろ細胞遊走能を抑制することを明らかにした。つまり、F9−E1及びDel1−E3は、使用濃度によって細胞遊走能を調節できるものであることを見出した。
ところで、前述した通り、細胞の遊走は、哺乳動物、特に人体にとって必須の現象であり、生体内で起こる広範な現象に関与している。例えば、血管新生や、創傷又は潰瘍の治癒過程、癌細胞の転移などが挙げられる。よって、前述した細胞遊走能の調節(促進又は抑制)により、血管新生療法(例えば、心筋梗塞や脳梗塞等の動脈硬化性虚血に対する該療法)、創傷及び潰瘍の治療、癌転移の抑制又は阻害、並びに、血管新生の抑制又は阻害等を効果的に行うことができる。
また、本発明者は、細胞の遊走を促進することにより細胞(特に培養細胞)の展開を促進したり、あるいは細胞の遊走を抑制することにより細胞(特に培養細胞)の上皮様配列を保持することも効果的に行うことができることを見出した。
本発明は、以上の知見に基づいて完成されたものである。
2.細胞遊走調節剤
本発明の細胞遊走調節剤(以下、本発明の調節剤という。)は、先に述べた通り、(i)血液凝固第9因子(F9)の全長を含むペプチド、(ii)F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分を含むペプチド、(iii)F9の軽鎖を含むペプチド、若しくは(iv)F9のEGF1ドメイン(F9−E1)を含むペプチド、又は(v)内皮細胞遺伝子座−1(Del−1)タンパク質のEGF3ドメイン(Del1−E3;EGF類似ドメインのうちの一つ)を含むペプチドを含むものである。
好ましくは、本発明の調節剤は、(i)F9の全長からなるペプチド、(ii)F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分からなるペプチド、(iii)F9の軽鎖からなるペプチド、若しくは(iv)F9−E1からなるペプチド、又は(v)Del1−E3からなるペプチドを含むものである。
ここで、本発明における、F9の全長とは、シグナルペプチド及びプロペプチドを有するF9全体のアミノ酸配列(配列番号14;GenBankアクセッション番号:BAE28840)から、当該シグナルペプチド及びプロペプチド部分が除かれたアミノ酸配列からなるペプチド(タンパク質)を意味する。当該シグナルペプチド及びプロペプチド部分は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第1番目~第46番目のアミノ酸からなる領域である(本明細書中において同様)。なお、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるペプチド(タンパク質)をコードするDNAは、配列番号13に示される塩基配列(GenBankアクセッション番号:AK149372)である。
また、Del−1タンパク質の全長は、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなり、当該Del−1タンパク質をコードするDNAは、配列番号9に示される塩基配列である。
本発明の調節剤は、具体的には、先に述べた通り、下記(a)のペプチドを含むものである。
(a)配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記(a)のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
ここで、配列番号2、4、6、8及び12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ順に、(i)F9の全長のアミノ酸配列(配列番号2)、(ii)F9の全長からトリプシンドメイン(すなわちF9の重鎖)を除いた部分のアミノ酸配列(配列番号4)、(iii)F9の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号6)、(iv)F9−E1のアミノ酸配列(配列番号8)、及び(v)Del1−E3のアミノ酸配列(配列番号12)を示すものである。なお、配列番号1、3、5、7及び11に示される塩基配列は、後述するが、それぞれ順に、配列番号2、4、6、8及び12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAである。
配列番号2に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第47番目~第471番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号4に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第47番目~第236番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号6に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第47番目~第191番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号8に示されるアミノ酸配列は、配列番号14に示されるアミノ酸配列の第97番目~第130番目のアミノ酸からなる配列である。
さらに、配列番号12に示されるアミノ酸配列は、配列番号10に示されるアミノ酸配列の第123番目~第157番目のアミノ酸からなる配列である。
本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも2個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明の調節剤に含まれるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。
また本発明の調節剤は、先に述べた通り、前記(a)のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記(b)のペプチドを含むものであってもよい。
(b)配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走調節活性を有するペプチド。
ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、1~15個、1~14個、1~13個、1~12個、1~11個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個(1~数個)、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、1個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされないが、当該欠失、置換又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、GeneTailorTM Site−Directed Mutagenesis System(インビトロジェン社)、及びTaKaRa Site−Directed Mutagenesis System(Mutan−K、Mutan−Super Express Km等:タカラバイオ社製)等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにX線及びNMR等による構造解析法などを用いて確認することができる。
また、前記(a)のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走調節活性を有するペプチドも挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走調節活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、細胞遊走調節活性とは、細胞遊走能の促進活性又は抑制活性を意味し、当該促進活性又は抑制活性は、例えば、後述する実施例に記載のWound healing assay又はBoyden chamber assay等により測定することができる。
本発明の調節剤としては、より詳しくは、細胞遊走促進剤と細胞遊走抑制剤とが挙げられる。
本発明の細胞遊走促進剤(以下、本発明の促進剤という。)は、下記(a1)のペプチドを含むものである。
(a1)配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記(a1)のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ここで、配列番号6、8及び12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、前述した通りである。
また本発明の促進剤は、前記(a1)のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記(b1)のペプチドを含むものであってもよい。
(b1)配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。
ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」についても、前述の説明が同様に適用できる。
また、前記(a1)のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走促進活性を有するペプチドも挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号6、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走促進活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、細胞遊走促進活性は、例えば、後述する実施例に記載のWound healing assay又はBoyden chamber assay等により測定することができる。
本発明の細胞遊走抑制剤(以下、本発明の抑制剤という。)は、下記(a2)のペプチドを含むものである。
(a2)配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記(a2)のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ここで、配列番号2、4、8及び12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、前述した通りである。
また本発明の促進剤は、前記(a2)のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記(b2)のペプチドを含むものであってもよい。
(b2)配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。
ここで、上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」についても、前述の説明が同様に適用できる。
また、前記(a2)のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走抑制活性を有するペプチドも挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号2、4、8又は12に示されるアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞遊走抑制活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、細胞遊走抑制活性は、例えば、後述する実施例に記載のWound healing assay又はBoyden chamber assay等により測定することができる。
なお、配列番号8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチドは、上記本発明の促進剤及び抑制剤のいずれにも含まれ得るものであるが、これは、後述するように、当該ペプチドは使用濃度によって細胞遊走を促進することもできるし、抑制することもできるという両面の機能を有するためである。使用濃度が低い場合は、細胞遊走を促進する活性を有し、使用濃度が高い場合は、細胞遊走を抑制する活性を有する。
本発明の調節剤に含まれる前記(a)及び(b)のペプチド、並びに、本発明の促進剤及び抑制剤に含まれる(a1)、(a2)、(b1)及び(b2)のペプチドは、その構成アミノ酸の残基数は特に限定はされず、所定の活性(細胞遊走の調節、具体的には促進又は抑制活性)を有する範囲内で適宜設定することができる。
前記(a)及び(b)のペプチド、並びに(a1)、(a2)、(b1)及び(b2)のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされないが、天然物由来のペプチドである場合は、細胞毒性等の悪影響や副作用等がない場合が多いため好ましい。
天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットPROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTM System(プロメガ)、合成装置のPG−MateTM(東洋紡)及びRTS(ロシュ・ダイアグノスティクス)等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
本発明の調節剤、促進剤及び抑制剤(以下、本発明の調節剤等という。)は、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドとともに、又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、当該ペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸(主にその側鎖)の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
本発明の調節剤等は、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチド、及び/又は、当該ペプチドの誘導体とともに、あるいはそれに代えて、当該ペプチド及び/又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
本発明の調節剤等は、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、PBS及びTris−HCl等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩による細胞遊走の調節活性(促進活性又は抑制活性)が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。具体的には、上記ペプチドの溶液で用いる場合、ペプチド濃度は、限定はされないが、0.3ng/ml以上であることが好ましく、より好ましくは0.3~5ng/ml、さらに好ましくは0.3~2ng/ml、さらにより好ましくは0.4~1.5ng/ml、特に好ましくは0.6~1ng/ml、最も好ましくは0.8~1ng/mlである。
本発明の調節剤等による細胞遊走能の調節(促進又は抑制)の対象となる細胞としては、限定はされず、血管内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞(癌細胞)等を含む各種細胞が挙げられる。
本発明においては、本発明の調節剤を用いる細胞遊走調節方法も提供することができる。同様に、本発明の促進剤又は抑制剤を用いる細胞遊走促進方法又は細胞遊走抑制方法を提供することもできる。当該方法は、被験動物に対して本発明の調節剤等を投与する工程を含む方法であり、それ以外にどのような工程を含むものであってもよく、限定はされない。被験動物としては、限定はされないが、ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。本発明の調節剤等の投与方法、用法、用量については、限定はされないが、後述する医薬組成物の投与方法が適宜同様に適用できる。
なお、被験動物の生体内に本発明の調節剤等を投与する場合は、本発明の調節剤の有効成分である前記(a)又は(b)のペプチド等を直接投与してもよいし、あるいは当該ペプチドをコードするDNAの状態で導入(遺伝子導入)してもよく、限定はされない。DNAの導入は、リポソーム法(リポプレックス法)、ポリプレックス法、ペプチド法、エレクトロポレーション法(電気穿孔法)、及びウイルスベクター法などの公知の各種遺伝子導入方法を用いて行うことができる。
また本発明においては、本発明の調節剤を用いることにより、細胞(特に培養細胞)の展開の促進方法や、細胞(特に培養細胞)の上皮様配列を保持する方法等も提供することできる。具体的には、本発明の促進剤を用いる細胞の展開促進方法、及び本発明の抑制剤を用いる細胞の上皮様配列保持方法を提供し得る。これら方法においては、本発明の調節剤(促進剤、抑制剤)を対象とする細胞(培養細胞)の培養液中に直接添加することにより行うことが好ましい。例えば、細胞の展開促進方法の場合は、培養液内濃度で、0.1~10ng/ml程度添加することが好ましく、より好ましくは0.1~5ng/mlであり、細胞の上皮様配列保持方法の場合は、培養液内濃度で、1~10ng/ml程度添加することが好ましく、より好ましくは5~10ng/mlである(いずれも本発明の調節剤に含まれるペプチド換算での添加量)。
さらに、本発明の促進剤を含む細胞の展開促進用組成物、及び本発明の抑制剤を含む細胞の上皮様配列保持用組成物も提供される。
本発明において、細胞(特に培養細胞)の展開とは、細胞が培養器内で増殖、遊走することにより広がることを意味し、当該展開を促進することとは、細胞がより短い時間でより広い面積の基質を覆うことを意味する。
また、細胞(特に培養細胞)の上皮様配列とは、細胞同士が敷石状に接着して隙間なく配列することを意味し、当該上皮様配列を保持することとは、成長因子、サイトカイン、F9−E1等の細胞遊走を促進する因子に抵抗して、細胞の敷石状配列を維持することを意味する。
上記の展開促進の対象となる細胞(培養細胞)としては、限定はされないが、例えば、血管内皮細胞、角化上皮細胞、線維芽細胞、人工多能性幹細胞等が好ましい。また、上記の上皮様配列の保持の対象となる細胞(培養細胞)としては、限定はされないが、例えば、血管内皮細胞、角化上皮細胞、人工多能性幹細胞等が好ましい。
本発明により、細胞の展開を促進することによる実用的な効果としては、例えば、人体から採取した細胞やそれらを加工した細胞によって人工基質を修飾する期間を短縮し得ること等が挙げられる。
また、本発明により、細胞の上皮様配列を保持することによる実用的な効果としては、例えば、人体から採取した細胞やそれらを加工した細胞によって人工基質を修飾する際に、培養液中でそれらの細胞を上皮化し得ること等が挙げられる。
3.DNA、組換えベクター、形質転換体
(1)DNA
本発明においては、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドをコードする塩基配列を含むDNAも包含される。当該DNAは、当該ペプチドをコードする塩基配列からなるDNA(具体的には、前述した配列番号1、3、5、7又は11に示される塩基配列からなるDNA)であってもよいし、あるいは、当該塩基配列を一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列(転写プロモーター、SD配列、Kozak配列、ターミネーター等)を含んでなるDNAであってもよく、限定はされない。なお、当該ペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよいし、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
また本発明においては、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドをコードする塩基配列を含むDNAに対して相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAであって、細胞遊走調節(促進又は抑制)活性を有するタンパク質をコードするDNAも包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩(ナトリウム)濃度が150~900mMであり、温度が55~75℃、好ましくは塩(ナトリウム)濃度が150~200mMであり、温度が60~70℃での条件をいう。
上記以外に当該ハイブリダイズが可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1、3、5、7又は11に示される塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号2、4、6、8又は12に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAと、約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上又は99.9%以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。
(2)DNAを含む組換えベクター
本発明においては、適当なベクターに上記本発明のDNAを連結(挿入)することにより得られる組換えベクターも包含される。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA、ウイルス等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のDNAのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リポソーム結合配列(SD配列)、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子などを連結することができる。なお、選択マーカー遺伝子としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はその変異体(EGFP、BFP、YFP等の蛍光タンパク質)、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、LacZ等の遺伝子が挙げられる。
(3)形質転換体
本発明においては、上記本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得ることができる形質転換体も包含される。宿主としては、本発明のDNAを発現し得るものであれば限定されず、例えば、当該分野において周知の細菌、酵母等を用いることができる。
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばlacプロモーターなどが用いられる。細菌へのベクター導入法としては、公知の各種導入方法、例えばカルシウムイオン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター等が挙げられる。酵母へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
4.医薬組成物
本発明の調節剤等は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。なお、前記(a)又は(b)のペプチド、(a1)又は(b1)のペプチド、あるいは(a2)又は(b2)のペプチドを、当該有効成分ということもできる。
本発明の医薬組成物は、限定はされないが、例えば、血管新生促進用、創傷又は潰瘍治療用、癌(癌細胞)転移抑制又は阻害用、及び血管新生抑制又は阻害用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の調節剤が細胞遊走促進剤である場合は、血管新生促進用(特に、心筋梗塞や脳梗塞等の動脈硬化性の虚血に対する治療用)や、創傷又は潰瘍治療用の医薬組成物に用いられることが好ましく、本発明の調節剤が細胞遊走抑制剤である場合は、癌(癌細胞)転移抑制又は阻害用や、血管新生抑制又は阻害用の医薬組成物に用いられることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、本発明の調節剤等を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の1種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、1つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。また、有効成分である本発明の調節剤等を生体内に投与する場合、コロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上記ペプチドの生体内の安定性を高めたり、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞である。
本発明の医薬組成物の投与量は、被験動物(ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト)の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の調節剤等の種類などにより異なっていてもよい。通常、成人一人あたり、一回につき100μg~5000mgの範囲で投与することができるが、限定はされない。
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、1回の投与において1kg体重あたり、100μg~100mgの量を、1日平均あたり1回~数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤(例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など)、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
なお、前述したように、本発明の調節剤等に含まれるペプチドとして、配列番号8又は12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド(好ましくは当該アミノ酸配列からなるペプチド)を用いる場合は、当該ペプチドの使用濃度により細胞遊走促進活性を呈する場合と細胞遊走抑制活性を呈する場合とが存在するため、使用濃度が重要である。例えば、細胞遊走促進活性を呈するためには、当該ペプチドの血中濃度が0.1ng/ml~10ng/mlとなるように投与することが好ましく、より好ましくは0.1ng/ml~5ng/ml、さらに好ましくは0.1ng/ml~1ng/mlである。他方、細胞遊走抑制活性を呈するためには、当該ペプチドの血中濃度が100ng/ml~200ng/mlとなるように投与することが好ましく、より好ましくは100ng/ml~500ng/ml、さらに好ましくは100ng/ml~1000ng/mlである。
なお、本発明は、血管新生を促進する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、血管新生促進用の本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする血管新生の促進方法を提供するものであり、また、血管新生を促進するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。
同様に、本発明は、創傷又は潰瘍を治療する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、創傷又は潰瘍治療用の本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする創傷又は潰瘍の治療方法を提供するものであり、また、創傷又は潰瘍を治療するための、本発明の調節剤等(特に本発明の促進剤)の使用を提供するものでもある。
本発明は、癌(癌細胞)の転移を抑制又は阻害する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、癌(癌細胞)転移抑制又は阻害用の本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする癌(癌細胞)転移の抑制又は阻害方法を提供するものであり、また、癌(癌細胞)転移を抑制又は阻害するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。
本発明は、血管新生を抑制又は阻害する医薬(薬剤)を製造するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。また、本発明は、血管新生抑制又は阻害用の本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を提供するものでもある。さらに、本発明は、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)を用いること(すなわち被験動物に投与すること)を特徴とする血管新生の抑制又は阻害方法を提供するものであり、また、血管新生を抑制又は阻害するための、本発明の調節剤等(特に本発明の抑制剤)の使用を提供するものでもある。
5.細胞遊走調節用キット
本発明においては、構成成分として本発明の調節剤等を含むことを特徴とする、細胞遊走調節用(促進用又は抑制用)キットも提供される。本発明のキットは、各種細胞の遊走能の促進又は抑制を行うことが可能であり、例えば、動脈硬化性の虚血に対する血管新生療法、創傷や潰瘍の治療、癌転移の抑制又は阻害、あるいは血管新生の抑制又は阻害等を行う場合に有効に用いることができるため、医薬及び薬学の分野における各種実験・研究等においても極めて有用性が高いものである。また、上記本発明のキットは、細胞(特に培養細胞)の展開促進、又は細胞(特に培養細胞)の上皮様配列の保持にも有効に用い得る。
本発明のキットは、本発明の調節剤等の他に、各種バッファー、滅菌水、各種反応容器(エッペンドルフチューブ等)、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、防腐剤、各種細胞培養容器、及び実験操作マニュアル(説明書)等を含んでいてもよく、限定はされない。
以下に、実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔参考例1〕
凝固第9因子タンパクの構造
図1に示すとおり、血液凝固第9因子(F9)の全長(図中のF9(140−1414))を構成するアミノ酸配列(配列番号2)においては、N末端側から、GLAドメインに続いて2つのEGFドメイン(EGF1、EGF2)があり、そのC末端側に、45残基程度のアミノ酸配列領域を介して、トリプシンドメインが連なっている。凝固反応が進む過程で、図1中の矢印で示した場所で活性化第11凝固因子(図中のF−11a)によって切断される(この際、上記45残基程度のアミノ酸配列領域が除かれる。)。切断されて除かれたアミノ酸配列領域のN末端側がF9のlight chain(軽鎖)であり、C末端側がF9のheavy chain(重鎖)(すなわち、トリプシンドメイン)である。
Wound healing assay
3cm培養皿にプラスチック製のリングを置き、その中にSCCKN細胞(口腔扁平上皮癌由来の細胞株)を播いて24時間培養した。リングをはずし、1分おきに細胞を撮影した。通常の培養液の中で6時間観察し、その後、培養液中にアルカリホスファターゼ(AP;陰性コントロール)、並びにAP−F9(140−1414)、AP−F9(140−709)、AP−F9(140−574)及びAP−F9(290−391)の組み換えタンパク質(図2中では単にF9(140−1414)等と表記)を、それぞれ0.1pmol/mlの濃度で添加して観察を続けた。これらの組み換えタンパク質は、APとF9の全長又はその一部との融合タンパク質であり、それぞれ、アルカリホスファターゼ(AP)発現ベクター(APtag4)に、公知の遺伝子組み換え技術を用いて、所定のペプチド(F9の全長又はその一部)をコードするcDNAをAP遺伝子との融合遺伝子となるように挿入した組み換えベクターを構築し、当該ベクターをCHO細胞に導入して当該融合タンパク質を発現させ作製した。なお、上記各cDNA(具体的には、配列番号1、3、5及び7に示される塩基配列からなるDNAを含むもの)は、公知のF9の遺伝子配列(配列番号13)に基づいて適宜プライマーを設計し、PCRにより所望のcDNA断片を増幅して得、APtag4に組み込んで用いた。
撮影された動画の、馴化培地(conditioned medium)を加える前後2時間の遊走について解析した。遊走する細胞の前線を30μm毎に分割し、前線の移動の平均値を算出した。conditioned mediumを加える前の遊走速度を1として、添加後の遊走速度(平均±SEM)を表した。同様のassayをCos細胞及びP5細胞についても行った。その結果を図2に示した。P<0.01。なお、図2Bの写真内のスケールバーは100μmを示す。
3cm培養皿にプラスチック製のリングを置き、その中にSCCKN細胞(口腔扁平上皮癌由来の細胞株)を播いて24時間培養した。リングをはずし、1分おきに細胞を撮影した。通常の培養液の中で6時間観察し、その後、培養液中にアルカリホスファターゼ(AP;陰性コントロール)、並びにAP−F9(140−1414)、AP−F9(140−709)、AP−F9(140−574)及びAP−F9(290−391)の組み換えタンパク質(図2中では単にF9(140−1414)等と表記)を、それぞれ0.1pmol/mlの濃度で添加して観察を続けた。これらの組み換えタンパク質は、APとF9の全長又はその一部との融合タンパク質であり、それぞれ、アルカリホスファターゼ(AP)発現ベクター(APtag4)に、公知の遺伝子組み換え技術を用いて、所定のペプチド(F9の全長又はその一部)をコードするcDNAをAP遺伝子との融合遺伝子となるように挿入した組み換えベクターを構築し、当該ベクターをCHO細胞に導入して当該融合タンパク質を発現させ作製した。なお、上記各cDNA(具体的には、配列番号1、3、5及び7に示される塩基配列からなるDNAを含むもの)は、公知のF9の遺伝子配列(配列番号13)に基づいて適宜プライマーを設計し、PCRにより所望のcDNA断片を増幅して得、APtag4に組み込んで用いた。
撮影された動画の、馴化培地(conditioned medium)を加える前後2時間の遊走について解析した。遊走する細胞の前線を30μm毎に分割し、前線の移動の平均値を算出した。conditioned mediumを加える前の遊走速度を1として、添加後の遊走速度(平均±SEM)を表した。同様のassayをCos細胞及びP5細胞についても行った。その結果を図2に示した。P<0.01。なお、図2Bの写真内のスケールバーは100μmを示す。
Boyden chamber assay
細胞の遊走能を実施例1のWound healing assayとは別の方法で評価するため、クラボウ社製のChemotaxicellを用いて、Boyden chamber assayを施行した。Assayに用いた組み換えタンパク質及び陰性コントロール、並びにその添加量については、実施例1と同様にして行った。上層には血清のない培養液に浮遊させた過剰量の細胞(SCCKN細胞又はCos細胞)を入れ、下層には血清入りの通常の培養液を入れ、30分から1時間培養した。4%パラフォルムアルデヒドで固定後にトリパンブルーで染色し、顕微鏡下に、細胞が入り込んだ穴の割合を数えた。その結果を図3に示した。なお、図3Aの写真内のスケールバーは10μmを示す
〔参考例2〕
F9の構造とDel−1の構造との相同性
図4に示すとおり、Del−1のアミノ酸配列(配列番号10)は、N末端より、3つのEGFドメイン(EGF1~EGF3)と2つのdiscoidinドメイン(Discoidin1、Discoidin2)から構成される(図4A)。Del−1の3番目のEGFドメイン(Del1−E3)が、F9のEGF1ドメイン(F9−E1)とコンセンサス配列を共有することを示した(図4B)。
細胞の遊走能を実施例1のWound healing assayとは別の方法で評価するため、クラボウ社製のChemotaxicellを用いて、Boyden chamber assayを施行した。Assayに用いた組み換えタンパク質及び陰性コントロール、並びにその添加量については、実施例1と同様にして行った。上層には血清のない培養液に浮遊させた過剰量の細胞(SCCKN細胞又はCos細胞)を入れ、下層には血清入りの通常の培養液を入れ、30分から1時間培養した。4%パラフォルムアルデヒドで固定後にトリパンブルーで染色し、顕微鏡下に、細胞が入り込んだ穴の割合を数えた。その結果を図3に示した。なお、図3Aの写真内のスケールバーは10μmを示す
〔参考例2〕
F9の構造とDel−1の構造との相同性
図4に示すとおり、Del−1のアミノ酸配列(配列番号10)は、N末端より、3つのEGFドメイン(EGF1~EGF3)と2つのdiscoidinドメイン(Discoidin1、Discoidin2)から構成される(図4A)。Del−1の3番目のEGFドメイン(Del1−E3)が、F9のEGF1ドメイン(F9−E1)とコンセンサス配列を共有することを示した(図4B)。
Wound healing assay
3cm培養皿にプラスチック製のリングを置き、その中にCOS細胞を播いて24時間培養した。リングをはずし、1分おきに細胞を撮影した。通常の培養液の中で6時間観察、その後培養液中に1ng/mlのCAT(chloramphenicol acetyl transferase)タンパク質(陰性コントロール)とDel1−E3を添加して観察を続けた。これらの組み換えタンパク質は、公知の遺伝子組み換え技術により、E.coliに組み換えDNAを導入して作製された。撮影された動画の、conditioned mediumを加える前後2時間の遊走について解析した。遊走する細胞の前線を30μm毎に分割し、前線の移動の平均値を算出した。馴化培地(conditioned medium)を加える前の遊走速度を1として、添加後の遊走速度(平均±SEM)を表した。その結果を図5に示した。P<0.01。なお、図5Bの写真内のスケールバーは100μmを示す。
3cm培養皿にプラスチック製のリングを置き、その中にCOS細胞を播いて24時間培養した。リングをはずし、1分おきに細胞を撮影した。通常の培養液の中で6時間観察、その後培養液中に1ng/mlのCAT(chloramphenicol acetyl transferase)タンパク質(陰性コントロール)とDel1−E3を添加して観察を続けた。これらの組み換えタンパク質は、公知の遺伝子組み換え技術により、E.coliに組み換えDNAを導入して作製された。撮影された動画の、conditioned mediumを加える前後2時間の遊走について解析した。遊走する細胞の前線を30μm毎に分割し、前線の移動の平均値を算出した。馴化培地(conditioned medium)を加える前の遊走速度を1として、添加後の遊走速度(平均±SEM)を表した。その結果を図5に示した。P<0.01。なお、図5Bの写真内のスケールバーは100μmを示す。
細胞の遊走は人体で起こる広範な現象に関与している。本発明はそのような現象の治療に関連した医学及び薬学の分野に応用し得るものである。例えば、F9−E1のペプチドを作製して薬剤として使用することが可能であり、該ペプチドをコードする遺伝子を用いて遺伝子治療を行うことも可能と考えられる。遊走が関与する現象の例としては、血管新生、創傷又は潰瘍の治癒過程、癌細胞の転移などが挙げられる。よって、本発明は、動脈硬化性の虚血に対する血管新生療法、創傷や潰瘍の治療、癌転移の抑制又は阻害、血管新生の抑制又は阻害等に有用なものである。また、本発明は、細胞遊走の促進により細胞(特に培養細胞)の展開を促進したり、あるいは細胞遊走の抑制により細胞(特に培養細胞)の上皮様配列を保持することにも有用なものである。
Claims (18)
- 血液凝固第9因子の全長、血液凝固第9因子の全長からトリプシンドメインを除いた部分、血液凝固第9因子の軽鎖、若しくは血液凝固第9因子のEGF1ドメイン、又は内皮細胞遺伝子座−1タンパク質のEGF3ドメインを含むペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走調節剤。
- 以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走調節剤。
(a)配列番号2、4、6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号2、4、6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走調節活性を有するペプチド。 - 以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走促進剤。
(a)配列番号6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号6、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走促進活性を有するペプチド。 - 以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩を含むことを特徴とする、細胞遊走抑制剤。
(a)配列番号2、4、8若しくは12に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
(b)配列番号2、4、8若しくは12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞遊走抑制活性を有するペプチド。 - 被験動物に請求項1又は2記載の調節剤を投与することを特徴とする、細胞遊走調節方法。
- 被験動物に請求項3記載の促進剤を投与することを特徴とする、細胞遊走促進方法。
- 被験動物に請求項4記載の抑制剤を投与することを特徴とする、細胞遊走抑制方法。
- 請求項1又は2記載の調節剤を含む、医薬組成物。
- 請求項3記載の促進剤を含む、血管新生促進用医薬組成物。
- 請求項3記載の促進剤を含む、創傷又は潰瘍治療用医薬組成物。
- 請求項4記載の抑制剤を含む、癌転移抑制又は阻害用医薬組成物。
- 請求項4記載の抑制剤を含む、血管新生抑制又は阻害用医薬組成物。
- 請求項3記載の促進剤を用いることを特徴とする、細胞の展開促進方法。
- 請求項4記載の抑制剤を用いることを特徴とする、細胞の上皮様配列保持方法。
- 細胞が培養細胞である、請求項13又は14記載の方法。
- 請求項3記載の促進剤を含む、細胞の展開促進用組成物。
- 請求項4記載の抑制剤を含む、細胞の上皮様配列保持用組成物。
- 細胞が培養細胞である、請求項16又は17記載の組成物。
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