JPH08298990A - カルデクリンをコードするｄｎａ及びそれを用いるカルデクリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルデクリンをコードするＤＮＡ及びこのＤ
ＮＡを用いるカルデクリンの製造方法の提供。 【構成】 配列番号１に示す２３９個のアミノ酸から成
る特定のアミノ酸配列を含んで成るカルデクリンをコー
ドするＤＮＡ及び該ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮ
Ａ、並びに該ＤＮＡの導入により形質転換された宿主を
用いるヒトカルデクリンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血清中のカルシウム濃度
を低下させる作用をもつカルデクリンの遺伝子工学的な
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、急性膵炎に際して低カルシウム血
症を伴うことから、膵臓に血清中のカルシウム濃度を低
下させる因子が存在すると考えられてきた。また、高岡
らはブタの膵臓抽出物の投与により血清カルシウム濃度
が低下することを報告し、本発明者らはその一つとして
ブタ膵臓抽出物からの血清カルシウム降下因子、カルデ
クリンの精製に成功した（特開平４−２７９５９８
号）。

【０００３】ブタカルデクリンは分子量約２８，０００
Daの蛋白質であり、マウスにおいて投与量依存的にその
血清カルシウム濃度を降下させ、マウス胎児骨培養系
〔 Raisz, L.G., J. Clin. Invest., 44, 103-116 (1
965)〕における副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）誘導カルシ
ウム遊離に対して阻害活性を有する。これはカルデクリ
ンが生体内でＰＴＨによる骨吸収を阻害する結果として
血清カルシウム濃度を降下させることを示すものであ
る。

【０００４】また、カルデクリンはエラスターゼ、キモ
トリプシン等のセリンプロテアーゼ類に相同性を有し、
それ自体、キモトリプシン型セリンプロテアーゼ活性を
有するが、不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤である、
フェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の
処理によってもマウス血清カルシウム降下作用及びマウ
ス胎児骨培養系における抗ＰＴＨ作用ともに阻害を受け
ない。これはプロテアーゼ活性を消失させたカルデクリ
ンあるいはその断片が血清カルシウム降下作用を発現し
ている可能性を示唆している。

【０００５】

【関連技術】さらに、本発明者らはラット膵臓中にもこ
のような性質を有する因子を見いだし、これを単離精製
し（特願平６−０２７５７８）、その生理学的活性につ
いて報告した（第１２回日本骨代謝学会（１９９４
年）、第１６回米国骨代謝学会（１９９４年）、The 10
th International Conference on Intracellular Prote
inCatabolism(1994年))。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ラットまた
はヒトカルデクリンを遺伝子工学的方法によって多量に
製造することができる方法を提供しようとするものであ
り、さらにその手段としてそれらのカルデクリン又はそ
の前駆体をコードするＤＮＡを提供しようとするもので
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】従って本発明は、配列番
号：１中の１位のアミノ酸Ｖａｌから２３９位のアミノ
酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を含んで成るラットカルデ
クリン又はその前駆体をコードするＤＮＡを提供する。
本発明はその一例として、配列番号：１中の１位のアミ
ノ酸Ｖａｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ
酸配列から成るラットカルデクリンをコードするＤＮＡ
を提供する。本発明はさらに、一例として、配列番号：
１中の−２９位のアミノ酸Ｍｅｔから２３９位のアミノ
酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成るラットカルデクリ
ン前駆体をコードするＤＮＡを提供する。

【０００８】本発明はまた、配列番号：２中の１位のア
ミノ酸Ｖａｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミ
ノ酸配列を含んで成るヒトカルデクリン又はその前駆体
をコードするＤＮＡを提供する。本発明はその一例とし
て、配列番号：２中の１位のアミノ酸Ｖａｌから２３９
位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成るヒトカ
ルデクリンをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさ
らに、一例として、配列番号：２中の−２９位のアミノ
酸Ｍｅｔから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸
配列から成るヒトカルデクリン前駆体をコードするＤＮ
Ａを提供する。

【０００９】本発明はさらに、前記種々のＤＮＡを含ん
で成る発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主、並びに該宿主を培養し、その培養物からヒト
カルデクリン又はその前駆体を採取することを特徴とす
るヒトカルデクリン又はその前駆体の製造方法を提供す
る。本発明はさらに、配列番号：１中の１位のアミノ酸
Ｖａｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配
列を含んで成るラットカルデクリン前駆体を提供する。
本発明はさらに、配列番号：２中の１位のアミノ酸Ｖａ
ｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を
含んで成るヒトカルデクリン前駆体を提供する。

【００１０】

【具体的な説明】本発明者らは、ラット膵臓λｇｔｌｌ
ｃＤＮＡライブラリーから、ブタカルデクリンを抗原と
して免疫したウサギの抗血清を用いて免疫スクリーニン
グを行い、得られた陽性クローンからＤＮＡ断片を調製
して、これをプローブとして用い、完全長のラットカル
デクリンｃＤＮＡを得た。さらに、このｃＤＮＡを宮崎
らによって開発された哺乳動物細胞発現ベクターｐＣＡ
ＧＧＳ〔Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍ
ｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２
００（１９９１）〕のβ−アクチンプロモーターの下流
に挿入し、発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｒａｔ Ｃａ
ｌｄｅｃｒｉｎを構築した。

【００１１】このプラスミドを用いてＧｅｒａｒｄ，
Ｒ．Ｄ．らによって開発されたＢＭＴ−１０細胞をトラ
ンスフェクトし、一過性の発現によるリコンビナントラ
ットカルデクリンの製造を試みた。ｐＣＡＧＧＳ−Ｒａ
ｔ ＣａｌｄｅｃｒｉｎでトランスフェクトしたＢＭＴ
−１０の培養上清には経時的にウェスタンブロットで確
認されるリコンビナントラットカルデクリンが発現し、
前記のマウス胎児骨培養系におけるＰＴＨ誘導カルシウ
ム遊離に対する容量依存的な阻害活性を確認し、本発明
を完成した。

【００１２】本発明においてクローニングしたラットカ
ルデクリンｃＤＮＡは配列番号：１に示す塩基配列を有
し、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：
１に示す。このアミノ酸配列中、Ｎ−末端から３０番目
のＶａｌ（アミノ酸番号１）から始まる配列が、ラット
膵臓から単離されたラットカルデクリンのＮ−末端のア
ミノ酸配列（特願平６−０２７５７８）に相当する。従
って、配列番号：１の１位のアミノ酸Ｖａｌから２３９
位のアミノ酸Ｌｅｕまでが成熟ラットカルデクリンのア
ミノ酸配列であると推定される。

【００１３】従って本発明は１つの態様において、配列
番号：１中の１位のアミノ酸Ｖａｌから２３９位のアミ
ノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を含んで成るラットカル
デクリン又はその前駆体をコードするＤＮＡを提供す
る。この１つの態様は、配列番号：１の１位のＶａｌか
ら２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成
る成熟ラットカルデクリンをコードするＤＮＡであり、
他の態様は−２９位のＭｅｔから２３９位のアミノ酸Ｌ
ｅｕまでのアミノ酸配列から成るラットカルデクリン前
駆体をコードするＤＮＡを提供する。

【００１４】しかしながら、本発明のＤＮＡがコードす
る前駆体は、上記のものにとどまらず、種々の長さのプ
レ体又はプロ体をコードするＤＮＡをも包含する。本発
明のＤＮＡの具体的な塩基配列としては、配列番号：１
の８８位のヌクレオチドＧから８０４位のヌクレオチド
Ｇまでの塩基配列を含んでなるものが挙げられる。その
具体的な１例として、配列番号：１の８８位のヌクレオ
チドＧから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列か
ら成る、成熟ラットカルデクリンをコードするＤＮＡが
挙げられる。

【００１５】さらに他の態様として、配列番号：１の１
位のヌクレオチドＡから８０４位のヌクレオチドＧまで
の塩基配列から成る、ラットカルデクリン前駆体をコー
ドするＤＮＡが挙げられる。しかしながら、本発明のラ
ットカルデクリン前駆体をコードするＤＮＡの塩基配列
は上記のものにとどまらず、種々の長さのプレ体又はプ
ロ体をコードする、配列番号：１に示す塩基配列の対応
する部分からなるＤＮＡを提供する。

【００１６】本発明者らはまた、ブタ膵臓由来カルデク
リンのマイタケ由来メタロエンドペプチダーゼ分解物中
のブタカルデクリン断片のアミノ酸配列を解析してその
部分アミノ酸配列を明らかにし、この配列とすでに明ら
かとなっているラットカルデクリンｃＤＮＡの配列から
推察されるアミノ酸配列及びヒトエラスターゼ２Ａ，２
Ｂ及び３Ａ，３Ｂのアミノ酸配列とのアラインメントに
より、カルデクリンに特異的な配列を見いだした。

【００１７】このアミノ酸配列に相当する混合オリゴヌ
クレオチドとエラスターゼ及びカルデクリンに共通して
存在するＤＮＡ配列に相当するオリゴヌクレオチドを合
成し、これらをプライマーとし、ヒト膵臓由来ｃＤＮＡ
ライブラリーを鋳型としてＴａｑポリメラーゼによるポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この反応によ
り得られた約２００bpのＤＮＡ配列を解析すると、ラッ
トカルデクリンに含まれるＤＮＡ配列と高い相同性をも
つものであったので、このＤＮＡはヒトカルデクリンｃ
ＤＮＡの断片であると考えられた。

【００１８】次に、得られたＤＮＡ断片をプローブとし
て、ヒト膵臓λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーのハイブ
リダイゼーションスクリーニングを行い、配列番号：２
に示すようなヒトカルデクリンｃＤＮＡ及びその配列か
ら推定されるアミノ酸配列の全長が明らかになった。こ
のアミノ酸配列中Ｎ−末端から３０番目のＶａｌから始
まる配列が、ラットカルデクリン（特願平６−０２７５
７８及び特願平６−１６４８９８）及びブタカルデクリ
ン（特開平４−２７９５９８号）の成熟配列に相当し、
−２９位のＭｅｔから−１４位のＳｅｒまでがシグナル
配列（プレ配列）、−１３位のＣｙｓから−１位のＡｒ
ｇまでがプロ配列に相当すると推察される。

【００１９】また、ハイブリダイゼーションスクリーニ
ングによって得られた複数のクローンは一様ではなく、
配列番号：２中に例示したような配列の多様性を有して
いるが、得られたクローン中にはエラスターゼ類を含む
既知のｃＤＮＡ配列は含まれず、この結果はハイブリダ
イゼーションスクリーニングに用いたＤＮＡ断片がカル
デクリンに特異的な配列であることを支持している。

【００２０】さらに本発明者らは、遺伝子工学的にヒト
カルデクリンを製造するために、昆虫細胞とこれに特異
的に感染し多量の核多角体を発現するバキュロウイルス
を用いる製造法を確立した。すなわち、ヒトカルデクリ
ンｃＤＮＡ中の発現されない５′末端及び３′末端のＤ
ＮＡ配列を除くため、開始コドンから終始コドンまでの
ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、この断片をトランスファ
ーベクターｐＢａｃＰＡＫ９のポリヘドリンプロモータ
ーの下流に挿入した。

【００２１】次にヒトカルデクリンｃＤＮＡを含むトラ
ンスファーベクターをＢｓｕ３６Ｉ消化して複製に不可
欠な遺伝子を一部欠損したウイルスＤＮＡ、ＢａｃＰＡ
Ｋ６とともに宿主となる昆虫細胞Ｓｆ９へトランスフェ
クトすると、トランスファーベクターとウイルスＤＮＡ
の間で相同組み換えが起こり、ヒトカルデクリンｃＤＮ
Ａを含むウイルスのみが感染力をもつ成熟ウイルスとし
て増殖した。このウイルスを再びＳｆ９に感染させ、そ
の培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）に付すと、約３０kDの蛋白の発現が認
められた。

【００２２】このバンドはウェスタンブロットにおいて
抗ブタカルデクリン抗体に反応することから、プロ配列
を含むヒトカルデクリンと考えられた。以上のように、
遺伝子工学的なリコンビナントヒトカルデクリンの製造
法を確立し、本発明を完成した。

【００２３】本発明は一つの態様において、配列番号：
２中の１位のアミノ酸Ｖａｌから２３９位のアミノ酸Ｌ
ｅｕまでのアミノ酸配列を含んで成るヒトカルデクリン
又はその前駆体をコードするＤＮＡを提供する。この一
つの態様は、配列番号：２の１位のアミノ酸Ｖａｌから
２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成る
成熟ヒトカルデクリンをコードするＤＮＡであり、他の
態様は−２９位のアミノ酸Ｍｅｔから２３９位のアミノ
酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成る成熟ヒトカルデク
リン前駆体をコードするＤＮＡである。

【００２４】しかしながら、本発明のＤＮＡがコードす
る前駆体は、上記のものにとどまらず、種々の長さのプ
レ体又はプロ体をコードするＤＮＡをも含有する。本発
明のＤＮＡの具体的な塩基配列としては、配列番号：２
の８８位のヌクレオチドＧから８０４位のヌクレオチド
Ｇまでの塩基配列を含んで成るものが挙げられる。その
具体的な一例として、配列番号：２の８８位のヌクレオ
チドＧから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列か
ら成る成熟ヒトカルデクリンをコードするＤＮＡが挙げ
られる。

【００２５】さらに他の態様として、配列番号：２の１
位のヌクレオチドＡから８０４位のヌクレオチドＧまで
の塩基配列から成るヒトカルデクリン前駆体をコードす
るＤＮＡが挙げられる。しかしながら、本発明のヒトカ
ルデクリン前駆体をコードするＤＮＡの配列は上記のも
のにとどまらず、種々の長さのプレ体又はプロ体をコー
ドする、配列番号：２に示す塩基配列の対応する部分か
ら成るＤＮＡを提供する。

【００２６】さらに本発明は、ヒトカルデクリンｃＤＮ
Ａは配列番号：２に示すごとく一様ではないが、配列番
号：２中の６３位のアミノ酸Ｇｌｕから１３１位のアミ
ノ酸Ｔｒｐまでのアミノ酸配列に含まれる配列がカルデ
クリン特異的であることを示しており、そのアミノ酸配
列に相当する塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡを
プローブとするハイブリダイゼーションスクリーニング
によって多様なヒトカルデクリンｃＤＮＡをクローニン
グする方法を提供する。

【００２７】従って、本発明においては、配列番号：２
に示すＤＮＡ及びそれから推定されるアミノ酸配列にと
どまらず、配列番号：２中の６３位のアミノ酸Ｇｌｕか
ら１３１位のアミノ酸Ｔｒｐまでのアミノ酸配列に相当
する塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡにハイブリ
ダイズする、ヒトのｃＤＮＡ及びゲノムライブラリー中
のＤＮＡ及びそれらに相当するアミノ酸配列をも含有す
る。

【００２８】本発明はまた、配列番号：１又は２に示す
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズし、且つ血清
カルシウム降下作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
を提供する。この場合、上述したＤＮＡにハイブリダイ
ズするようなＤＮＡとしては、上記ＤＮＡから調製した
標識ＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション溶
液、例えば、５０mlのホルムアミド、２５mlの２０×Ｓ
ＳＣ、１０mlの５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１mlの１
０％ＳＤＳ及び１mlの１０mg／ml変性サケ精子ＤＮＡを
含む１００mlのハイブリダイゼーション溶液中、４０〜
４５℃で１５〜１６時間のインキュベートによって該標
識ＤＮＡプローブにハイブリダイズするようなＤＮＡが
挙げられる。

【００２９】本発明のＤＮＡは、例えば実施例１及び８
に示すハイブリダイゼーションスクリーニングや実施例
７に示すＰＣＲ法によりクローニングすることができ、
また常法に従って化学合成することができる。本発明の
成熟ヒトカルデクリン又は種々の長さのその前駆体をコ
ードするＤＮＡは、例えば配列番号：１又は２に示す長
いＤＮＡを制限酵素により切断し、又はエクソヌクレア
ーゼにより短縮することにより、あるいは所望のポリペ
プチドのＮ−末端に隣接してその上流に翻訳開始コドン
を挿入することにより作成することができる。

【００３０】本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成る
発現プラスミドに関する。このプラスミドは、該ＤＮＡ
を発現させるためのプロモーター、ターミネーター等の
発現制御配列及び適当な宿主中で複製するための複製起
点を含んで成る。本発明はさらに、前記発現ベクターに
より形質転換された宿主、及び該宿主を用いるヒトカル
デクリン又はその前駆体の製造方法に関する。

【００３１】本発明のヒトカルデクリンＤＮＡは実施例
９に示す昆虫細胞の発現系に限らず、他の発現系にも適
用可能であり、種々の発現ベクターに挿入後、宿主とし
て大腸菌のごとき原核細胞、酵母のごとき下等真核細
胞、哺乳類培養細胞のごとき高等真核細胞等、常用の宿
主を用いてリコンビナントヒトカルデクリンを製造する
ことができる。

【００３２】具体的には、大腸菌、バシルス・ズブチリ
ス(Bacillus subtilis) 等のバシルス (Bacillus) 、酵
母、例えばサッカロミセス・セレビシエー (Saccharomy
cescerevisiae) 等のサッカロミセス(Saccharomyces)
、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー(Aspergillu
s niger) 等のアスペルギルス(Aspergillus) などを使
用することができる。さらに、マウス、ラット、ヒト等
の哺乳類培養細胞、例えばＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞
株、ＣＨＯセルライン、Ｗ１３８，ＢＨＫ，ＣＯＳ−
７，ＭＯＰ及びＭＤＣＫセルライン等が使用できる。

【００３３】これらの宿主に応じて、プロモーターは公
知のものから適宜選択して使用することができる。かか
るプロモーターとしては、例えば、β−ラクタマーゼ及
びラクトースプロモーターシステム、ｔｒｐ，ｔａｃ，
Ｔ₇ プロモーターシステム、ＰＧＫ，ＰＨＯ５，ＳＶ−
４０，ＣＭＶ，ＡＭＬ，ＤＨＦＲなどのプロモーターを
挙げることができる。培養は、宿主の種類に応じて常用
の培地を用いて通常の条件下で行うことができる。培養
物からヒトカルデクリンを回収するには、高速液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等、常法に従って分離精製することができる。

【００３４】かくして本発明の配列番号：１の１位のア
ミノ酸Ｖａｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミ
ノ酸配列を含んでなる、ラットカルデクリン又はその前
駆体及び配列番号：２の１位のアミノ酸Ｖａｌから２３
９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を含んでな
る、ヒトカルデクリン又はその前駆体を得ることができ
る。

【００３５】本発明のリコンビナントヒトカルデクリン
は新規な物質であり、インビボにおいて骨吸収の亢進に
よって上昇する血清カルシウム濃度を降下させる作用を
有するので、種々の骨疾患、例えば骨粗鬆症、原発性及
び続発性副甲状腺機能亢進症、悪性腫瘍に伴う高カルシ
ウム血症等の治療及び予防のための医薬の活性成分とし
て有用であると期待される。

【００３６】本発明の血清カルシウム降下因子はタンパ
ク質製剤に一般に使用されている医薬として許容される
キャリア例えば水、生理的食塩水、ポリエチレングリコ
ール、グリセロール、ゼラチン、デンプン、デキストリ
ン、キャリアタンパク質（血清アルブミン等）等を適宜
組合せて製剤化して非経口投与、例えば静脈内投与、皮
下投与、筋肉内投与等、又は経腸もしくは経口投与等に
より投与することができる。

【００３７】

【発明の効果】本発明のＤＮＡを用いることによりカル
デクリンを高効率で多量に製造することが可能となる。
こうして得られたカルデクリンは、血清カルシウムの降
下を必要とする種々の疾患及び骨吸収の過度の亢進によ
り引き起こされる種々の骨疾患の治療及び予防のために
有用である。

【００３８】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１ ．ラットカルデクリンｃＤＮＡのクローニング ラットカルデクリンをコードするｃＤＮＡをクローニン
グするためにラット膵臓λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリ
ー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に対して、ブタ膵臓由来カ
ルデクリンを抗原としてウサギを免疫して得た抗血清を
用い、８００００個のλファージの免疫スクリーニング
を行い、３個の陽性クローンを得た。この陽性クローン
のライソジェンを作り、融合蛋白質を合成させ、抗体と
の反応性を調べた結果、１個の陽性クローンＲＰＣ１８
が得られた。さらにＲＰＣ１８のＰｓｔＩ部位より５′
断片をプローブとして再度ライブラリーのスクリーニン
グを行い完全長のｃＤＮＡクローンを得た。

【００３９】得られたλファージクローンのＤＮＡを調
製し、ＥｃｏＲＩで消化して得られた断片をｐＵＣ１９
のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。このプラスミドで大腸菌
ＪＭ１０９をトランスフォームしてプラスミドを調製
し、サイクルシーケンス法により図１に示すごとく全Ｄ
ＮＡ配列を明らかにした。このクローンの全長は８９９
bpで、このｃＤＮＡから翻訳したアミノ酸配列は２６８
アミノ酸をコードしており、エラスターゼ類をはじめと
する既知のセリンプロテアーゼに対する相同性は高く、
アミノ末端２９残基中にＰｒｅ配列およびＰｒｏ配列を
含み、セリンプロテアーゼの活性部位に特有のヒスチジ
ン、アスパラギン酸、セリン残基が認められた。また、
実施例２に示すごとく、ラット膵臓由来カルデクリンの
酵素消化により生ずる断片を解析して明かとなった部分
アミノ酸配列をすべて含み、単離したｃＤＮＡがラット
カルデクリンのｃＤＮＡに相当することが強く示唆され
た。

【００４０】なお、前記ｃＤＮＡを挿入したベクターｐ
ＣＡＧＧＳ−Ｒａｔ Ｃａｌｄｅｃｒｉｎにより形質転
換された大腸菌は、ＪＭ−１０９（ｐＣＡＧＧＳ−Ｒａ
ｔＣａｌｄｅｃｒｉｎ）として工業技術院生命工学工業
技術研究所に、ＦＥＲＭＢＰ−４７１７として、平成６
年６月２２日にブダペスト条約に基き国際寄託されてい
る。

【００４１】実施例２．ラット膵臓由来カルデクリンと
ｃＤＮＡの比較 実施例１で示したようにして得たｃＤＮＡがラットカル
デクリンのｃＤＮＡであることを確認するために、ｃＤ
ＮＡから予想されるアミノ酸配列とラット膵臓の抽出物
から単離精製したカルデクリンのアミノ酸配列を次の様
にして比較した。ラット膵臓カルデクリンをＰＭＳＦ存
在下でマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）
由来の金属プロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅ
ｐｔｉｄａｓｅ）と反応させ、生成したペプチド断片を
Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーに付した。

【００４２】０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％ア
セトニトリル（Ｂ緩衝液）の濃度グラジエントにより溶
出させると図２に示すような溶出プロフィールが得ら
れ、図中Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅのピークを分取し、常法に
従いエドマン分解法によりアミノ酸配列を決定した。こ
れらの断片のアミノ酸配列はすべて前記のｃＤＮＡから
予想されるアミノ酸配列中に存在した。

【００４３】実施例３．ラットカルデクリンｃＤＮＡの
哺乳動物細胞発現ベクターへの挿入 哺乳動物細胞発現ベクターは宮崎らにより開発された発
現ベクターｐＣＡＧＧＳを用いた。この発現ベクターは
ｐＵＣ１３をもとにＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ Ｏｒ
ｉ）、サイトメガロウイルス初期エンハンサー（ＣＭＶ
−ＩＥ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ニワトリβ−アクチンプ
ロモーター（ＡＧ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ウサギβ−グ
ロビンのポリアデニレーションシグナル（Ａｎ）および
３′−フランキング配列で構成されている。そこで図３
のごとくラットカルデクリンｃＤＮＡをｐＵＣ１９に挿
入したプラスミドよりＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＣＡＧ
ＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。

【００４４】実施例４．ラットカルデクリンの哺乳動物
細胞での発現 哺乳動物細胞はＧｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．により開発され
たＢＭＴ−１０細胞を用いた。この細胞はアフリカミド
リザルの腎臓細胞株ＢＳＣ−１に、ＳＶ４０の複製起点
を除去しＳＶ４０プロモーターをメタロチオネインプロ
モーターに入れ換えたプラスミドｐＫｌｄ１２６をトラ
ンスフェクトし株化した細胞で、重金属存在下でＴ抗原
が誘導される。ｐＣＡＧＧＳ−Ｒａｔ Ｃａｌｄｅｃｒ
ｉｎのＢＭＴ−１０細胞への導入はＤＥＡＥ−デキスト
ラン法を用い、一過性の発現をみた。

【００４５】トランスフェクション後、細胞および培養
上清（１mlあたり）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ウェス
タンブロットを行うと、ラットカルデクリン（Ｎ）は図
４のごとく経時的に細胞内で発現され培地中に分泌され
ていた。ベクターなし（ＭＯＣ）、ベクターのみ（Ｖ）
およびカルデクリンｃＤＮＡを逆方向に発現ベクターに
挿入したもの（ＲＶ）では細胞内および培養上清中にカ
ルデクリンは認められなかった。また、トランスフェク
ション後のグリセリン処理（Ｇｌｙ）は発現には影響し
なかったが、クロロキン処理（Ｃｈｌ）は必要であっ
た。

【００４６】なお、本発明において使用した動物細胞Ｂ
ＭＴ−１０は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、
ＦＥＲＭ ＢＰ−４７１６として、平成６年６月２２日
に、ブダペスト条約に基き国際寄託されている。

【００４７】実施例５．培養上清中の抗ＰＴＨ活性 ラットカルデクリン発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｒａ
ｔ Ｃａｌｄｅｃｒｉｎ）あるいはｃＤＮＡを逆方向に
挿入したベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ＲＶ）をＢＭＴ−１
０細胞にトランスフェクションしてから３日後の培養上
清を用いて、培地中の抗ＰＴＨ活性をマウス胎児骨培養
系を用いて検討した。図５のごとくラットカルデクリン
発現ベクターをトランスフェクションした培養上清は容
量依存的にＰＴＨによる⁴⁵Ｃａの流出促進を阻害した。

【００４８】一方、ｐＣＡＧＧＳ−ＲＶをトランスフェ
クションした培養上清には阻害活性は認められなかっ
た。以上のことから、リコンビナントラットカルデクリ
ンはラット膵臓由来カルデクリンと同様の活性を有する
ことを確認し、本発明のｃＤＮＡがラットカルデクリン
のｃＤＮＡであることを示した。

【００４９】実施例６．ブタ膵臓由来カルデクリンの部
分配列の解析 カルデクリン特異的なアミノ酸配列を検索するために、
ブタ膵臓由来カルデクリンを酵素分解してその部分配列
を解析した。ブタ膵臓由来カルデクリンをＰＭＳＦ存在
下でマイタケ（ Grifola frondosa) 由来のメタロエン
ドペプチダーゼで処理し、生成したペプチド断片をＣ１
８逆相カラムクロマトグラフィーに付した。

【００５０】０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％ア
セトニトリル（Ｂ緩衝液）の濃度グラジエントにより溶
出させると図６に示すような溶出プロフィールが得ら
れ、図中１〜９のピークを分取し、常法に従いエドマン
分解により、図７に示すごとく、アミノ酸配列を決定し
た。ピーク８は２成分の混合物であったが、エドマン分
解における各段階毎のフェニルチオヒダントイン化アミ
ノ酸の存在比を連続的に比較することにより、各成分の
アミノ酸配列を決定した。

【００５１】実施例７．ＰＣＲによるヒトカルデクリン
ｃＤＮＡ断片のクローニング 図７に示すように、ラット及びブタカルデクリンとヒト
エラスターゼのアミノ酸配列を比較し、カルデクリン特
異的な配列を見出した。このアミノ酸配列に相当する２
⁷ 種のオリゴヌクレオチドを含み、ＥｃｏＲＩ切断配列
を５′末端に付加した混合オリゴヌクレオチドと、エラ
スターゼ及びラットカルデクリンｃＤＮＡに共通する２
² 種の相補鎖ＤＮＡ配列にＥｃｏＲＩ切断配列を５′末
端に付加した混合オリゴヌクレオチドを合成し、これら
をプライマーとして用い、ヒト膵臓ｃＤＮＡ（Clontech
社製、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ^TMｃＤＮＡ）を鋳型とし
て、常法に従いＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲを行っ
た。この反応液をアガロースゲル電気泳動に付し、得ら
れた約２００bpのバンドをゲルより抽出した。得られた
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＵＣ１９プラスミドベ
クターにクローニングした。

【００５２】実施例８．ヒトカルデクリンｃＤＮＡのク
ローニング 前記ヒトカルデクリンｃＤＮＡ断片を含むｐＵＣ１９か
らＥｃｏＲＩ消化によりヒトカルデクリンｃＤＮＡ断片
を切り出し、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用いてランダムプ
ライマー法によりｃＤＮＡ断片を標識しプローブを調製
し、これを用いてヒト膵臓λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラ
リー（Clontech社製）からハイブリダイゼーションスク
リーニングを行った。λｇｔ１１を宿主大腸菌、Ｙ１０
９０ｒ^-に感染させ、２０，０００プラーク／プレート
（２０cm×１０cm）になるように播種して培養し、これ
をナイロンメンブレンフィルター（Amersham社製、Ｈｙ
ｂｏｎｄ^TM−Ｎ＋）に写し取ってレプリカを作製し、ア
ルカリ変性、中和後、ＵＶ照射してＤＮＡを固定した。

【００５３】このメンブレンフィルターを約１０，００
０cpm の³²Ｐ標識プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン溶液（１００ml中、５０mlのホルムアミド、２５mlの
２０×ＳＳＣ、１０mlの５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、
１mlの１０％ＳＤＳ、１mlの１０mg／ml変性サケ精子Ｄ
ＮＡを含む）中、４２℃、１６時間インキュベートし、
０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２時間、続い
て６５℃、３０分間洗浄した。

【００５４】このフィルターのオートラジオグラフィー
により、使用したＤＮＡプローブにハイブリダイズする
複数のクローンを選択し、それぞれについて再度同様の
ハイブリダイゼーションを繰り返し、λｇｔ１１クロー
ンを単クローン化した。それぞれのλｇｔ１１クローン
をＥｃｏＲＩ消化し、得られた断片をｐＵＣ１９にクロ
ーニングしてその配列を解析した。ＤＮＡ配列の解析
は、Ｔａｑポリメラーゼを用いるサイクルシーケンス反
応を適用し、ＤＮＡシーケンサー（Perkin-Elmer社製、
ＡＢＩ３７３）を用いて行った。

【００５５】実施例９．バキュロウイルス発現系を用い
るリコンビナントヒトカルデクリンの製造 リコンビナントヒトカルデクリンの製造はAutographa c
alifornica（ＡｃＭＮＰＶ）バキュロウイルス発現系
（Clontech社製、ＢａｃＰＡＫ^TM）を適用し行った。図
８に示すごとく、３′および５′末端の非コード領域を
除去するために、５′末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む
オリゴヌクレオチドをプライマーに用い、ヒト膵臓ｃＤ
ＮＡライブラリー（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ^TM）あるい
はクローニングされたヒトカルデクリンｃＤＮＡを含む
ｐＵＣ１９を鋳型として、ヒトカルデクリンｃＤＮＡの
開始コドンから終始コドンまでのＤＮＡをＰＣＲで増幅
し、トランスファーベクターｐＢａｃＰＡＫ９のＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入した。

【００５６】得られたトランスファーベクターｐＢＰＨ
Ｃ１（配列番号：２中、Ｎ＝Ｃ）及びｐＢＰＨＣ２（配
列番号：２中、Ｎ＝Ｔ）をそれぞれ大腸菌ＤＨ５αに導
入して複製させ、多量のプラスミドＤＮＡを得、セシウ
ムクロリド密度勾配遠心により精製した。ｐＢＰＨＣ１
あるいはｐＢＰＨＣ２をウイルスＤＮＡ，ＢａｃＰＡＫ
６（Ｂｓｕ３６Ｉ消化）と共にｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TM
（Gibco-BRL 社製）を用いてＳｆ９細胞に導入した後、
１０％ウシ胎児血清を含むＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培地中
で２７℃、３日間培養し、その上清をウイルスストック
液とした。

【００５７】リコンビナントヒトカルデクリン発現に際
しては、このストック液をＳｆ９細胞に加え、血清を含
まないＴＮＭ−ＦＨ培地中で２７℃、３日間培養し、そ
の上清を採取した。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
し、ブタ膵臓由来カルデクリンをウサギに免疫して得た
抗血清を用いてウェスタンブロットを行い、約３０kDの
ヒトプロカルデクリンの発現を確認した。結果を図９に
示す。

【００５８】実施例１０．リコンビナントヒトカルデク
リンの精製およびその血清カルシウム降下作用 実施例９で得られたリコンビナントヒトカルデクリンＨ
Ｃ２の発現培養上清を用い、以下のように精製および活
性の検討を行った。培養上清を分画分子量１０，０００
の限外濾過膜 (Amicon社製）で１０倍に濃縮し、溶媒を
Sephadex Ｇ−２５(Pharmacia社製、ＰＤ−１０）ある
いは透析により１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH６．
８）に交換した。

【００５９】この溶液をハイドロキシアパタイトカラム
(BIO-RAD社製、Ｂｉｏ−ＳｃａｌｅＣＨＴ−１）に吸着
させ、５００mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH６．８）の
１０％および２０％溶液で十分洗浄後、同３０％溶液で
溶出させ、プロカルデクリンを左右対称の単一ピークと
して得た。なお、トリプシン処理あるいは非処理の各画
分について、次のようにプロテアーゼ活性を測定した。
すなわち、各画分１５μｌにトリプシン（２０μｇ／m
l）５μｌを加え、２５℃で１５分間処理した後、０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．８）、１０mM ＣａＣｌ
₂ に溶解した０．１mM succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ni
troanilideを２００μｌ加えて５分間反応させた。

【００６０】３０μｌの３６％酢酸を加えて反応を停止
させ４１５nmにおける吸光度を測定した。その結果、５
００mMリン酸ナトリウムの３０％溶液で溶出された画分
にのみプロテアーゼ活性が検出された。トリプシン非処
理の各フラクションについてはいずれもプロテアーゼ活
性は検出されなかった。このことから得られたカルデク
リン画分はプロ体であることが明らかとなった。また、
実施例９で得られたＨＣ１発現培養上清に関してもＨＣ
２と同様の方法で精製し、単一のピークは得られなかっ
たものの、プロテアーゼ活性を指標として部分的に精製
されたプロカルデクリン画分を得た。

【００６１】上記のＨＣ１及びＨＣ２のプロカルデクリ
ン画分について実施例９と同様にしてウェスタンブロッ
トを行い、約３０kDのバンドが抗ブタカルデクリン抗血
清に反応することを確認した。上記のようにして得られ
た精製プロカルデクリン溶液１mlに対して１μｌの２mg
／mlトリプシン溶液を加えて２５℃、３０分間処理し、
プロカルデクリンの活性化を行い、この溶液及びプロテ
アーゼ阻害剤、５０mMフェニルメタンスルフォニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）溶液を２０μｌ添加した溶液をリン
酸緩衝生理的食塩水に溶媒置換した。

【００６２】この溶液を前日より絶食した４〜５週齢の
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウスの尾静脈より、体重１kg当たり
総蛋白量として１２５μｇ投与し、２時間後に心臓採血
して血清を得た。血清カルシウム濃度はメルクオートＣ
ａキットを用いて測定した。その結果は下記の通りであ
った。なお、コントロール群にはリン酸緩衝生理的食塩
水を投与した。

【００６３】

【表１】

【００６４】なお、前記ベクターｐＢＰＨＣ１を導入し
た大腸菌ＤＨ５αをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α（ｐＢＰＨＣ１）と命名し、工業技術院生命
工学工業技術研究所に、平成７年１月２５日に、ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４９７８としてブダペスト条約に基き国際寄
託した。また、前記ベクターｐＢＰＨＣ２を導入した大
腸菌ＤＨ５αをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ５α（ｐＢＰＨＣ２）と命名し、工業技術院生命工学
工業技術研究所に、平成７年１月２５日に、ＦＥＲＭ
ＢＰ−４９７９としてブダペスト条約に基き国際寄託さ
れた。

【００６５】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：８０７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起原： 生物名：ラット 株名： 配列の特徴： アミノ酸番号 -29 − -14 プレ配列 アミノ酸番号 -13 − -1 プロ配列 アミノ酸番号 １−２３９ 成熟配列 配列： ATG TTG GGA ATT ACG GTC CTC GCT GCC ATC CTG GCC TGC GCC TCT TGC 48 Met Leu Gly Ile Thr Val Leu Ala Ala Ile Leu Ala Cys Ala Ser Cys -29 -25 -20 -15 TGC GGG AAC CCC GCC TTC CCA CCT AAC CTG TCA ACC AGA GTG GTA GGA 96 Cys Gly Asn Pro Ala Phe Pro Pro Asn Leu Ser Thr Arg Val Val Gly -10 -5 -1 1 GGA GAG GAT GCT GTC CCC AAC AGC TGG CCT TGG CAG GTC TCT CTC CAG 144 Gly Glu Asp Ala Val Pro Asn Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln 5 10 15 TAC CTC AAG GAC GAC ACA TGG AGG CAC ACC TGT GGG GGA AGT CTC ATC 192 Tyr Leu Lys Asp Asp Thr Trp Arg His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile 20 25 30 35 ACC ACC AGC CAC GTC CTC ACT GCC GCC CAC TGC ATC AAC AAA GAC TTC 240 Thr Thr Ser His Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Asn Lys Asp Phe 40 45 50 ACT TAC CGT GTG GGC CTG GGG AAG TAT AAT CTG ACA GTG GAG GAT GAG 288 Thr Tyr Arg Val Gly Leu Gly Lys Tyr Asn Leu Thr Val Glu Asp Glu 55 60 65 GAA GGC TCC GTG TAC GCT GAG GTG GAC ACC ATC TAC GTC CAT GAG AAG 336 Glu Gly Ser Val Tyr Ala Glu Val Asp Thr Ile Tyr Val His Glu Lys 70 75 80 TGG AAC CGA CTC TTC CTG TGG AAC GAC ATC GCT ATC ATT AAG TTG GCT 384 Trp Asn Arg Leu Phe Leu Trp Asn Asp Ile Ala Ile Ile Lys Leu Ala 85 90 95 GAG CCT GTG GAA CTG AGC AAC ACC ATC CAG GTG GCC TGC ATC CCA GAG 432 Glu Pro Val Glu Leu Ser Asn Thr Ile Gln Val Ala Cys Ile Pro Glu 100 105 110 115 GAA GGT TCC CTG CTG CCT CAG GAC TAT CCC TGC TAT GTC ACG GGC TGG 480 Glu Gly Ser Leu Leu Pro Gln Asp Tyr Pro Cys Tyr Val Thr Gly Trp 120 125 130 GGT CGC CTC TGG ACC AAT GGT CCC ATC GCT GAA GTG CTC CAG CAG GGC 528 Gly Arg Leu Trp Thr Asn Gly Pro Ile Ala Glu Val Leu Gln Gln Gly 135 140 145 CTG CAG CCC ATC GTG AGC CAT GCC ACG TGC TCC AGG TTG GAC TGG TGG 576 Leu Gln Pro Ile Val Ser His Ala Thr Cys Ser Arg Leu Asp Trp Trp 150 155 160 TTC ATC AAG GTC CGG AAG ACG ATG GTG TGC GCT GGG GGT GAT GGC GTC 624 Phe Ile Lys Val Arg Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Asp Gly Val 165 170 175 ATC TCT GCC TGT AAC GGA GAT TCT GGC GGC CCA CTG AAC TGC CAA GCA 672 Ile Ser Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Gln Ala 180 185 190 195 GAA GAC GGC TCA TGG CAG GTG CAC GGC ATC GTG AGC TTC GGT TCC AGT 720 Glu Asp Gly Ser Trp Gln Val His Gly Ile Val Ser Phe Gly Ser Ser 200 205 210 AGC GGC TGC AAC GTA CAC AAG AAA CCG GTA GTC TTC ACC CGA GTG TCT 768 Ser Gly Cys Asn Val His Lys Lys Pro Val Val Phe Thr Arg Val Ser 215 220 225 GCC TAC AAT GAC TGG ATC AAC GAG AAA ATA CAA CTG TGA 807 Ala Tyr Asn Asp Trp Ile Asn Glu Lys Ile Gln Leu 230 235

【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：８０７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 株名： 配列の特徴： アミノ酸番号 −２９〜−１４ プレ配列 アミノ酸番号 −１３〜−１ プロ配列 アミノ酸番号 １〜２３９ 成熟配列 ＮはＴあるいはＣを示し、ＸａａはＴｒｐあるいはＡｒ
ｇを示す。 配列： ATG TTG GGC ATC ACT GTC CTC GCT GCG CTC TTG GCC TGT GCC TCC AGC 48 Met Leu Gly Ile Thr Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Cys Ala Ser Ser -29 -25 -20 -15 TGT GGG GTG CCC AGC TTC CCG CCC AAC CTA TCC GCC CGA GTG GTG GGA 96 Cys Gly Val Pro Ser Phe Pro Pro Asn Leu Ser Ala Arg Val Val Gly -10 -5 -1 1 GGA GAG GAT GCC CGG CCC CAC AGC TGG CCC TGG CAG ATC TCC CTC CAG 144 Gly Glu Asp Ala Arg Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Gln 5 10 15 TAC CTC AAG AAC GAC ACG TGG AGG CAT ACG TGT GGC GGG ACT TTG ATT 192 Tyr Leu Lys Asn Asp Thr Trp Arg His Thr Cys Gly Gly Thr Leu Ile 20 25 30 35 GCT AGC AAC TTC GTC CTC ACT GCC GCC CAC TGC ATC AGC AAC ACC NGG 240 Ala Ser Asn Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asn Thr Xaa 40 45 50 ACC TAC CGT GTG GCC GTG GGA AAG AAC AAC CTG GAG GTG GAA GAC GAA 288 Thr Tyr Arg Val Ala Val Gly Lys Asn Asn Leu Glu Val Glu Asp Glu 55 60 65 GAA GGA TCC CTG TTT GTG GGT GTG GAC ACC ATC CAC GTC CAC AAG AGA 336 Glu Gly Ser Leu Phe Val Gly Val Asp Thr Ile His Val His Lys Arg 70 75 80 TGG AAT GCC CTC CTG TTG CGC AAT GAT ATT GCC CTC ATC AAG CTT GCA 384 Trp Asn Ala Leu Leu Leu Arg Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Ala 85 90 95 GAG CAT GTG GAG CTG AGT GAC ACC ATC CAG GTG GCC TGC CTG CCA GAG 432 Glu His Val Glu Leu Ser Asp Thr Ile Gln Val Ala Cys Leu Pro Glu 100 105 110 115 AAG GAC TCC CTG CTC CCC AAG GAC TAC CCC TGC TAT GTC ACC GGC TGG 480 Lys Asp Ser Leu Leu Pro Lys Asp Tyr Pro Cys Tyr Val Thr Gly Trp 120 125 130 GGC CGC CTC TGG ACC AAC GGC CCC ATT GCT GAT AAG CTG CAG CAG GGC 528 Gly Arg Leu Trp Thr Asn Gly Pro Ile Ala Asp Lys Leu Gln Gln Gly 135 140 145 CTG CAG CCC GTG GTG GAT CAC GCC ACG TGC TCC AGG ATT GAC TGG TGG 576 Leu Gln Pro Val Val Asp His Ala Thr Cys Ser Arg Ile Asp Trp Trp 150 155 160 GGC TTC AGG GTG AAG AAA ACC ATG GTG TGC GCT GGG GGC GAT GGC GTC 624 Gly Phe Arg Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Asp Gly Val 165 170 175 ATC TCA GCC TGC AAT GGG GAC TCC GGT GGC CCA CTG AAC TGC CAG TTG 672 Ile Ser Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Gln Leu 180 185 190 195 GAG AAC GGT TCC TGG GAG GTG TTT GGC ATC GTC AGC TTT GGC TCC CGG 720 Glu Asn Gly Ser Trp Glu Val Phe Gly Ile Val Ser Phe Gly Ser Arg 200 205 210 CGG GGC TGC AAC ACC CGC AAG AAG CCG GTA GTC TAC ACC CGG GTG TCC 768 Arg Gly Cys Asn Thr Arg Lys Lys Pro Val Val Tyr Thr Arg Val Ser 215 220 225 GCC TAC ATC GAC TGG ATC AAC GAG AAA ATG CAG CTG TGA 807 Ala Tyr Ile Asp Trp Ile Asn Glu Lys Met Gln Leu ^*** 230 235

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ラットカルデクリンをコードするｃＤ
ＮＡの配列決定方法、及び該ｃＤＮＡの塩基配列から推
定されるラットカルデクリンのアミノ酸配列とラット膵
臓カルデクリンの酵素分解断片との位置関係を示す図で
ある。

【図２】図２はラット膵臓由来カルデクリンのメタロエ
ンドペプチダーゼ（マイタケ由来）消化によるペプチド
断片のＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーでの溶出の
プロフィールを示す図である。

【図３】図３は、実施例３で使用した、ラットカルデク
リンＤＮＡを挿入するための発現用プラスミドの構造を
示す図である。

【図４】図４は動物細胞での本発明のラットカルデクリ
ンの発現を示す、電気泳動図である。

【図５】図５は本発明のｃＤＮＡ発現生成物がＰＴＨに
よるカルシウム放出を阻害する作用を有することを示す
図である。

【図６】図６はブタ膵臓由来カルデクリンのマイタケ由
来メタロエンドペプチダーゼ消化によるペプチド断片の
Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーでの溶出のプロフ
ィールを示す図である。

【図７】図７はラットカルデクリンｃＤＮＡから推定さ
れるアミノ酸配列、ブタ膵臓由来カルデクリンのマイタ
ケ由来メタロエンドペプチダーゼ消化により生成するペ
プチド断片のアミノ酸配列及びヒトエラスターゼ類のア
ミノ酸配列のアラインメントを示す図である。図中、番
号付きの直線は図６におけるピーク番号に相当するペプ
チド断片のアミノ酸配列を示し、四角で囲まれた部分
は、実施例７においてＰＣＲのプライマーとして用いた
オリゴヌクレオチドに相当する、カルデクリン特異的配
列あるいはカルデクリンを含むエラスターゼ類に共通の
配列を示す。

【図８】図８はバキュロウイルス発現系を用いてリコン
ビナントヒトカルデクリンを発現するためのトランスフ
ァーベクターｐＢＰＨＣ１及びｐＢＰＨＣ２の構築方法
及びその構造を示す図である。

【図９】図９は昆虫細胞での本発明のヒトカルデクリン
の発現を示すウェスタンブロット用写真であり電気泳動
図である。図中ＨＣ１はｐＢＰＨＣ１、ＨＣ２はｐＢＰ
ＨＣ２を用いた場合のウェスタンブロット用写真であ
る。各培地を５倍、凍結乾燥で濃縮し、１２．５％ゲル
に実施例９で得た培養上清をレーン１には２μｌ、レー
ン２には５μｌスポットしたものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１中の１位のアミノ酸Ｖａｌ
   から２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を含
   んで成るラットカルデクリン又はその前駆体をコードす
   るＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号：１中の１位のアミノ酸Ｖａｌ
   から２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から
   成るラットカルデクリンをコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号：１中の−２９位のＭｅｔから
   ２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成る
   ラットカルデクリン前駆体をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号：１中の８８位のヌクレオチド
   Ｇから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列を含ん
   で成る、請求項１に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号：１中の８８位のヌクレオチド
   Ｇから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列から成
   る請求項２に記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号：１中の１位のヌクレオチドＡ
   から８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列から成
   る、請求項３に記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを含んで成る発現ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現ベクターにより形
   質転換された宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の宿主細胞を培養し、該
   培養物からラットカルデクリン又はその前駆体を採取す
   ることを特徴とする、ラットカルデクリン又はその前駆
   体の製造方法。
10. 【請求項１０】 配列番号：１中の１位のアミノ酸Ｖａ
    ｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を
    含有するラットカルデクリン前駆体。
11. 【請求項１１】 配列番号：２中の１位のアミノ酸Ｖａ
    ｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を
    含んで成るヒトカルデクリン又はその前駆体をコードす
    るＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 配列番号：２中の１位のアミノ酸Ｖａ
    ｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列か
    ら成るヒトカルデクリンをコードするＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 配列番号：２中の−２９位のアミノ酸
    Ｍｅｔから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配
    列から成るヒトカルデクリン前駆体をコードするＤＮ
    Ａ。
14. 【請求項１４】 配列番号：２中の８８位のヌクレオチ
    ドＧから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列を含
    んで成る請求項１１に記載のＤＮＡ。
15. 【請求項１５】 配列番号：２中の８８位のヌクレオチ
    ドＧから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列から
    成る請求項１２に記載のＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 配列番号：２中の１位のヌクレオチド
    Ａから８０４位のヌクレオチドＧまでの塩基配列から成
    る請求項１３に記載のＤＮＡ。
17. 【請求項１７】 配列番号：２中の６３位のアミノ酸Ｇ
    ｌｕから１３１位のアミノ酸Ｔｒｐまでのアミノ酸配列
    に相当する塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡにハ
    イブリダイズする、ヒトのｃＤＮＡライブラリー又はゲ
    ノムライブラリー中のＤＮＡ。
18. 【請求項１８】 請求項１１〜１７のいずれか１項に記
    載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の発現ベクターによ
    り形質転換された宿主細胞。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の宿主細胞を培養
    し、該培養物からヒトカルデクリン又はその前駆体を採
    取することを特徴とする、ヒトカルデクリン又はその前
    駆体の製造方法。
21. 【請求項２１】 配列番号：２中の１位のアミノ酸Ｖａ
    ｌから２３９位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を
    含有するヒトカルデクリン前駆体。
22. 【請求項２２】 ラットカルデクリン又はヒトカルデク
    リンを医薬として許容されるキャリアと共に含んで成る
    血清カルシウム降下剤。
23. 【請求項２３】 前記ラットカルデクリンが配列番号：
    １に示すアミノ酸番号１のＶａｌからアミノ酸番号２３
    ９のＬｅｕまでのアミノ酸配列を有し、前記ヒトカルデ
    クリンが配列番号：２に示すアミノ酸番号１のＶａｌか
    らアミノ酸番号２３９のＬｅｕまでのアミノ酸配列を有
    する、請求項２２に記載の血清カルシウム降下剤。
24. 【請求項２４】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の
    ＤＮＡにハイブリダイズし、且つ血清カルシウム降下作
    用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
25. 【請求項２５】 請求項１１〜１６のいずれか１項に記
    載のＤＮＡにハイブリダイズし、且つ血清カルシウム降
    下作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
26. 【請求項２６】 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の
    少なくとも一部分から成るヒトカルデクリン。