JP3533699B2

JP3533699B2 - 家蚕由来のプロフェノールオキシダーゼおよびフェノールオキシダーゼ

Info

Publication number: JP3533699B2
Application number: JP08509694A
Authority: JP
Inventors: 正明芦田; 智久川端; 一成平安
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd; Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 2004-05-31
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: JPH07289251A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、家蚕由来のプロフェノ
ールオキシダーゼ（以下、ｐｒｏＰＯという）及びフェ
ノールオキシダーゼ（以下、ＰＯという）、それをコー
ドする遺伝子、その遺伝子を含有する組換えベクター、
該組換えベクターで形質転換された宿主細胞および該宿
主細胞を培養することによるｐｒｏＰＯならびにＰＯの
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】昆虫体液には、体液のメラニン化に関与
するプロフェノールオキシダーゼ活性化系（以下ｐｒｏ
ＰＯ活性化系という。）と呼ばれる一連の酵素群からな
るカスケード系が存在しており、皮膚が傷ついたとき傷
口を修復する外傷の修復、外因性物質をメラニン層で包
囲する等の生体防御作用あるいはメラニンによる体色の
黒色化などに深く関与していると考えられている〔G.A.
Kerkut & L.I.Gilbert "Comprehensive Insect Physiol
ogy Biochemistry and Pharmacology" Pergamonress, O
xford,1985〕。当該カスケード系は、微生物細胞壁構成
成分であるβ−１，３−グルカン（以下、β−１，３−
Ｇと呼ぶ。）またはペプチドグリカン（以下、ＰＧと呼
ぶ。）によって引き金が引かれ、その後Ｃａ²⁺を要求す
る未解明の酵素による幾つかの反応ステップを経てｐｒ
ｏＰＯ活性化酵素（以下ＰＰＡＥと呼ぶ。）を生成す
る。そして該ＰＰＡＥは、ｐｒｏＰＯに働いて当該酵素
のｐｒｏ配列を切断することにより本カスケード系の最
終酵素であるＰＯを生成する。

【０００３】かくして生成されるＰＯは、チロシンやド
ーパを酸化して黒色のメラニンを合成する酸化酵素であ
る〔Ochiai,M. and Asida,M. (1988) J.Biol.Chem., 26
3, 12056-12062, Yoshida,H. Doctoralthesis, Univers
ity of Tokyo〕。従って、ＰＯの大量取得により、メラ
ニンによる呈色反応を触媒する新規な標識酸化酵素とし
ての利用が期待される。また、上述のｐｒｏＰＯ活性化
系カスケードは、数ｎｇ／ｍｌという僅かなβ−１，３
−Ｇ又はＰＧの存在で活性化されることから、当該β−
１，３−ＧやＰＧを細胞壁の構成成分としている真菌類
及び微生物の微量検出に有用であり、医薬品等の安全性
試験、水や食品等の微生物試験、感染症の診断などへの
応用が期待される（特開昭63-141598 号、特開昭63-141
599 号公報）。このｐｒｏＰＯ活性化系カスケードを構
成する酵素の全容は未だ十分解明されておらず、当該カ
スケード系の一構成酵素であるｐｒｏＰＯの構造および
反応機構の解明は、この系の解明に一役を果たす。さら
に、他の構成酵素の解明によりこれら酵素群によるカス
ケード系の再構成が可能となる結果、真菌類及び微生物
の微量検出が実現できるであろう。

【０００４】ｐｒｏＰＯは昆虫に広く存在しており、そ
の幾つかについて単離精製されている〔家蚕（M.Ashid
a, (1971) Arch.Biochem.Biophys., 144, 749）、タバ
コスズメガ（Y.Aso, K.J.Kramer, T.L.Hopkins & G.L.L
ookhart (1985), Insect Biochem., 15, 9）、チャイロ
コメノゴミムシダマシ（R.A.Heyneman (1965), Bioche
m.Biophys.Res.Commun., 21, 16）、家バエ（T.Tsukamo
to, M.Ishiguro & M.Funatsu (1986), Insect Bioche
m., 16, 573）等〕。しかしながら、それら昆虫のｐｒ
ｏＰＯの一次構造は今だ解明されていない。

【０００５】従って従来、昆虫由来のｐｒｏＰＯを取得
する手段としては、昆虫の体液から上述の文献に基づい
て単離精製する方法しかなかった。しかし、カスケード
構成酵素であるｐｒｏＰＯを昆虫体液中より単離するに
は、ｐｒｏＰＯの加水分解を防ぐべくｐｒｏＰＯ活性化
系のカスケード反応を不活化させた状態で行わなければ
ならない一方、僅かな微生物細胞壁構成成分（β−１，
３−Ｇ、ＰＧ）の存在により当該カスケードは活性化さ
れてしまうため、ｐｒｏＰＯを家蚕体液中より単離精製
することは技術的に大変困難であった。さらに、大量の
ｐｒｏＰＯを単離精製するには大量の昆虫が必要であ
り、ｐｒｏＰＯの工業的応用を図るべくｐｒｏＰＯの大
量取得は困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこでｐｒｏＰＯおよ
びＰＯの産業上の利用性を高めるため、遺伝子組換え技
術により家蚕由来のｐｒｏＰＯ並びにＰＯを簡単にかつ
大量に製造することが待望されている。本発明は、この
ような遺伝子技術による製造に必要かつ有用な家蚕由来
のｐｒｏＰＯおよびＰＯの一次構造を示すアミノ酸配
列、それをコードするｍＲＮＡおよびＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含むベクターおよび該ベクターを導入した形質転換体
を提供することを目的とする。更に、本発明はこれらの
発現系を用いた家蚕由来のｐｒｏＰＯおよびＰＯの製造
方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、家蚕血球細胞中の
ｐｒｏＰＯをコードするｃＤＮＡのクローン化に成功
し、そのｃＤＮＡの塩基配列からｐｒｏＰＯの一次構造
の決定に成功して本発明を完成させた。

【０００８】すなわち、本発明は、少なくとも実質的に
配列表配列番号１のＰｈｅ^５２〜Ｖａｌ^６９３のアミノ
酸配列を有するＰＯ並びにｐｒｏＰＯ、実質的に配列表
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するｐｒｏＰＯ
に関する。また、本発明は少なくとも実質的に配列表配
列番号２のＰｈｅ^５２〜Ｇｌｙ^６８５のアミノ酸配列を
有するＰＯ並びにｐｒｏＰＯ、実質的に配列番号２に示
されるアミノ酸配列を有するｐｒｏＰＯに関する。さら
にまた、本発明はそれらの酵素をコードする遺伝子、該
遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターで形質転
換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することによるｐ
ｒｏＰＯおよびＰＯの製造法に関する。

【０００９】本発明のｐｒｏＰＯは、家蚕由来のＰＯの
前駆体であり、ＰＰＡＥによって切断される部位を有す
る分子量約８０，０００の銅蛋白質である〔０．１５〜
０．１６％の銅を含有。２Ｃｕ原子／80,000g タンパク
質〕。さらに、本発明のｐｒｏＰＯは少なくとも実質的
に配列表配列番号１のＰｈｅ⁵²〜Ｖａｌ⁶⁹³のアミノ酸
配列を有するポリペプチドであり、好ましくは実質的に
配列表配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチドである。さらにまた、本発明のｐｒｏＰＯは
少なくとも実質的に配列表配列番号２のＰｈｅ⁵²〜Ｇｌ
ｙ⁶⁸⁵のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、好
ましくは、実質的に配列表配列番号２に記載されるアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで「実質的
に」とは、本発明の酵素が後記配列表に示されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドに限定されない趣旨であ
る。すなわち、ポリペプチドが家蚕由来のｐｒｏＰＯと
同等な免疫学的もしくは生物学的活性（例えば、家蚕Ｐ
ＰＡＥによって活性化される性質等）を有する限り、後
記配列表で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸の幾つか
について欠失，置換，付加等があってもよい意味であ
る。

【００１０】また、本発明のＰＯは、チロシンやドーパ
を酸化してメラニンを合成する触媒活性を有する酵素で
あり、その一次構造として実質的に配列表配列番号１の
Ｐｈｅ⁵²〜Ｖａｌ⁶⁹³のアミノ酸配列または実質的に配
列番号２のＰｈｅ⁵²〜Ｇｌｙ ⁶⁸⁵のアミノ酸配列が挙げ
られる。ここで「実質的に」とは、前述のｐｒｏＰＯと
同様に家蚕由来のＰＯと同等な免疫学的もしくは生物学
的活性（例えば、家蚕ＰＯ活性等）を有する限り、後記
配列表で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸の幾つかに
ついて欠失，置換，付加等があってもよい意味である。
すなわち、本発明のＰＯには、配列表配列番号１のＰｈ
ｅ⁵²〜Ｖａｌ⁶⁹³のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号２のＰｈｅ⁵²〜Ｇｌｙ⁶⁸⁵のアミノ酸配列
を有するポリペプチド、および該ポリペプチドと同等の
家蚕由来のＰＯ活性を有するポリペプチドが全て包含さ
れる。

【００１１】本発明のｐｒｏＰＯをコードする遺伝子と
は、上述のアミノ酸配列を有するｐｒｏＰＯをコードす
るＤＮＡおよびその転写産物であるｍＲＮＡをいう。本
発明のｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡは、ｐｒｏＰＯを
コードしうるものであればいかなるものでもよい。具体
的には、配列表配列番号１または２で示されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドおよびそれと同等の生物学的
活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられ
る。より具体的には、配列表配列番号１の少なくとも１
９８〜２１２３で示される塩基配列を含有するＤＮＡ、
好ましくは同配列表の４５〜２１２３で示される塩基配
列を含有するＤＮＡ、または配列番号２の少なくとも１
６０〜２０６１で示される塩基配列を含有するＤＮＡ、
好ましくは同配列表の７〜２０６１で示される塩基配列
を含有するＤＮＡを挙げることができる。本発明のＤＮ
Ａは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例
えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、
ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって
得られるＤＮＡ、およびこれらを適当に組み合わせて構
築されるＤＮＡをも全て包含するものである。

【００１２】ｐｒｏＰＯのｍＲＮＡは、ｐｒｏＰＯをコ
ードするＤＮＡの塩基配列に対応するＲＮＡ配列を有す
るものである。すなわち、本発明のＲＮＡは、本発明の
ＤＮＡの塩基配列中、チミンがウラシルに置換してなる
配列を有する。

【００１３】また、本発明はＰＯをコードする遺伝子を
提供する。当該遺伝子にはＰＯをコードするＤＮＡおよ
びその転写産物であるｍＲＮＡが包含される。ＰＯをコ
ードするＤＮＡは、前述の家蚕由来のＰＯをコードする
ものであればいかなるものでもよく、具体的には、配列
表配列番号１に示される１９８〜２１２３の塩基配列を
含有するＤＮＡ、または配列番号２に示される１６０〜
２０６１の塩基配列を含有するＤＮＡを挙げることがで
きる。当該ＤＮＡは、通常化学合成によっても調製する
ことができる。また、本発明のＰＯのｍＲＮＡは、ＰＯ
をコードするＤＮＡの塩基配列に対応するＲＮＡ配列を
有するものである。

【００１４】本発明のｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡ
は、常法に従ってｐｒｏＰＯのｍＲＮＡからｃＤＮＡを
クローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離する方法、化
学合成する方法等により取得することができる。（１）例えば、ｐｒｏＰＯのｍＲＮＡからｃＤＮＡをク
ローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、家蚕血球細胞など家蚕ｐｒｏＰＯを産生（分泌）
する細胞を培養し、その培養液から家蚕ｐｒｏＰＯをコ
ードするｍＲＮＡを例えばグアニジンチオシアネート法
〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１８，５２９４（１９７９）〕などの公知の
方法で調製する。得られたｍＲＮＡを鋳型として、例え
ば逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばＯｋａｙ
ａｍａ，Ｈ．らの方法｛Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１（１
９８２）及び同誌３，２８０（１９８３）｝やＧｕｂｌ
ｅｒ，Ｕ．とＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．の方法｛Ｇｕｂ
ｌｅｒ，Ｈ．ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ，Ｇｅｎ
ｅ，２５，２６３（１９８３）｝が例示される。〕でｃ
ＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換
を行う〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら，Ｃｅｌｌ，８，１６
３（１９７６）〕。このｃＤＮＡをプラスミドベクター
もしくはファージベクターに組み込むことによって家蚕
血球ｃＤＮＡライブラリーを構築する。ここで用いられ
るプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持され
るものであれば特に制限されず、また用いられるファー
ジベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良
い。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場
合は、宿主内でｐｒｏＰＯ遺伝子を発現させうるプロモ
ーターを有したベクターである必要がある。

【００１５】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば Maniatis,T.ら, モレキュラークローニン
グ，ア・ラボラトリー・マニュアル (Molecular Clonin
g, ALaboratory Manual), cold Spring Harbor Labor
atory, 1, 82 (1982)に記載の方法などが挙げられる。
また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、Hyunh,T. V.らの方法〔Hyunh,T.V., DNA Clonin
g, apractical approach,1,49(1985) ｝などが挙げられ
る。このようにして得られる組換えプラスミドやファー
ジベクターは原核細胞や真核細胞等の適当な宿主に導入
する。

【００１６】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、Maniatis,T. らモレキュラークローニング，ア・ラ
ボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Labora
tory Manual), cold Spring Harbor Laboratory, 1, 82
(1982) に記載のカルシウムクロライド法またはカルシ
ウムクロライド／ルビジウムクロライド法等が挙げられ
る。また、ファージベクターを宿主に導入する方法とし
てはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした
後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。

【００１７】上記の方法によって構築されたｃＤＮＡラ
イブラリーから該酵素をコードするＤＮＡを単離する方
法としては、下記の方法が例示される。例えば、別個に
ｐｒｏＰＯのアミノ酸配列に対応すると考えられるオリ
ゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを³²Ｐでラベ
ルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼ
ーション法〔Crunstein, M. and Hogness, D.S.: Proc.
Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961 (1975) 〕またはプラ
ークハイブリダイゼーション法〔Maniatis,T. et al.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, coldSpring
Harbor Laboratory, 2, 109 (1982)〕により、目的の
ＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする。ま
た、該ｐｒｏＰＯに対する抗体を作製した後、抗原抗体
反応を利用して目的のＤＮＡを含有するクローンを選択
する方法、或いは該酵素の特定領域をポリメラーゼチェ
イン反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該酵素をコー
ドする遺伝子の一部を単離する方法などがある。単離し
た結果、該酵素の全領域が取得されてない場合には、単
離したＤＮＡ断片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションまた
はプラークハイブリダイゼーションによって再度ｃＤＮ
Ａをクローニングすることにより、最終的に全遺伝子領
域を取得することができる。

【００１８】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560 (1977)
〕あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレ
オチド合成鎖停止の方法〔Messing, J. ら Nucleic Aca
ds Res, 9, 309 (1981) 〕によって決定し、ｐｒｏＰＯ
の存在を確認することができる。かくして得られるクロ
ーンからｐｒｏＰＯの遺伝子の全部または一部を制限酵
素等により切り出すことにより取得できる。

【００１９】(2) また、家蚕血球細胞のゲノムＤＮＡか
らｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡを単離することによる
調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。家
蚕血球を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用
いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの
脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはＲＮアーゼにより
消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分
消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコ
スミド中で増幅し、そして目的の配列を有するクローン
を例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法
等により検出し、該クローンからｐｒｏＰＯの遺伝子の
全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。

【００２０】(3) さらに、ｐｒｏＰＯをコードするＤＮ
Ａは、配列表配列番号１に示される４５〜２１２３の塩
基配列、また配列表配列番号２に示される７〜２０６１
の塩基配列を化学的手法により合成することにより取得
できる。一方、ＰＯをコードするＤＮＡについても同様
に、配列表配列番号１に示される１６０〜２１２３の塩
基配列、また配列表配列番号２に示される１９８〜２０
６１の塩基配列を化学合成することによって取得するこ
とができる。

【００２１】さらに本発明は、上述のｐｒｏＰＯをコー
ドするＤＮＡを含有する組換えベクター、およびＰＯを
コードするＤＮＡを含有する組換えベクターである。当
該ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の
各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであ
れば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファー
ジベクターが包含される。本発明組換えベクターは、簡
便には当業界において入手可能なベクター、好ましくは
プラスミドベクターまたはバクテリオファージベクター
に、ｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡまたはＰＯをコード
するＤＮＡを常法により組み込むことにより調製するこ
ともできる。かかるベクターとして具体的には、大腸菌
由来のプラスミドとして例えばpBR322, pBR325, pUC12,
pUC13など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19, p
SH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110,
pTP5, pC194 などが例示される。また、ファージとして
は、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレ
トロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルス
などの動物や昆虫のウイルスが例示される。

【００２２】ｐｒｏＰＯ遺伝子またはＰＯ遺伝子を発現
させ、これら蛋白質を生産させる目的においては、発現
ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細
胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でｐｒｏ
ＰＯ遺伝子またはＰＯ遺伝子を発現し、これら蛋白質を
生産する機能を有するものであれば特に制限されない。
宿主細胞として細菌、特にE. coli を用いる場合、一般
に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレータ
ー領域，開始コドン，本発明ｐｒｏＰＯもしくはＰＯを
コードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネーター領域お
よび複製可能単位から構成される。宿主として酵母また
は動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプ
ロモーター，開始コドン，本発明ｐｒｏＰＯもしくはＰ
ＯをコードするＤＮＡ，終止コドンを含んでいることが
好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ，
エンハンサー配列，本発明ｐｒｏＰＯもしくはＰＯの
５’側および３’側の非翻訳領域，スプライシング接合
部，ポリアデニレーション部位または複製可能単位など
も発現ベクターに組み込むことが可能である。

【００２３】細菌中で本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯを
発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、
プロモーター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(S
D) 配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。
例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐ
プロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモー
ター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーターなどを
含むものが例示される。酵母中で本発明のｐｒｏＰＯま
たはＰＯを発現させるためのプロモーターとしては、Ｐ
Ｈ０５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロ
モーター，ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチ
ルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター，ＳＰ０２プ
ロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。
また、宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４
０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモータ
ー，ヒートショックプロモーター、核多角体ウイルスの
有するポリヘドリンプロモーターなどが挙げられるる。
しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、
発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。

【００２４】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。終止コドンとしては、常
用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示
される。ターミネーター領域としては、天然または合成
のターミネーターが挙げられる。複製可能単位とは、宿
主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能
力をもつＤＮＡをいい、天然のプラスミド，人工的に修
飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製された
ＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれ
る。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミ
ドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３
２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグ
メント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵
母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpR
SVneo ATCC 37198, プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145,
プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224,プラスミドpSV2ne
o ATCC 37149等があげられる。

【００２５】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列（７２ｂｐ）、ポリオーマ，アデノ，パ
ピローマ等のＤＮＡ腫瘍ウイルス、レトロウイルスＬＴ
Ｒ（Long Terminal Repeat）、免疫グロブリンＨ鎖，Ｌ
鎖遺伝子などが例示される。

【００２６】発現ベクターは、プロモーター，開始コド
ン，本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯをコードするＤＮ
Ａ，終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ
環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製
することができる。またこの際、所望により制限酵素で
の消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等
の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リン
カー、他のレストリクションサイトなど）を用いること
ができる。

【００２７】本発明の形質転換体（以下、形質移入体を
包含する概念で用いる）は、上述の発現ベクターを宿主
細胞に導入することにより調製することができる。宿主
細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリ
キア属菌、バチルス属菌），酵母（例えば、サッカロマ
イセス属など），動物細胞および昆虫細胞など〕が挙げ
られる。具体的には、エシェリキア属菌ではエシェリキ
ア・コリ（Escherichia coli）K12DH1, M103, JA221, H
B101, C600, XL-1 Blue, JM109などが例示される。バチ
ルス属菌ではバチルス・サチリス（Bacillus subtilis)
MI114, 207-21 などが挙げられる。酵母としてはサッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae) A
H22, AH22R^-, NA87-11A, DKD-5Dなどが挙げられる。動
物細胞としてはサル細胞COS-7, Vero,チャイニーズハム
スター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒトＦＬ細胞などが
挙げられる。昆虫細胞としてはBmN4, Sf9 などが挙げら
れるが、特にこれらに限定されるものではない。宿主細
胞として、一般にＤＮＡ配列のクローニングおよびベク
ターの組立てのためには原核細胞が好ましい。組立てら
れたベクターは、次に適当な宿主細胞に形質転換され、
この場合原核細胞および真核細胞を使用することができ
る。

【００２８】発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転
換（形質移入を含む）〕は従来公知の方法を用いて行う
ことができる。細菌（例えば、E. coli やBacillus sub
tilis)の場合は、例えばCohen らの方法〔Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.,(1972) 69,2110〕、プロトプラスト法
〔Mol.Gen.Genet.,(1979)168,111〕またはコンピテント
法〔J.Mol.Biol.,(1971)56,209〕等によって、Saccharo
myces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1978)75,1927 〕やリチウム
法〔J.Bacteriol.,(1983)153,163〕等によって、動物細
胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virology,(1973)52,
456 〕等によってそれぞれ形質転換することができる
が、特にこれらに限定されるものではない。

【００２９】本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯは、上記の
如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培
地で培養することによって製造することができる。栄養
培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素
源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが
好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキス
トラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源も
しくは有機窒素源としては、例えぱアンモニウム塩類，
硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプト
ン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液な
どが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、
無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウ
ム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例え
ばアンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいて
もよい。

【００３０】培養は当業界において知られている方法に
より行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよ
び醗酵時間は、ｐｒｏＰＯまたはＰＯの最高力価が得ら
れるように適宜選択される。なお、下記に宿主細胞に応
じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示する
が、何らこれらに限定されるものではない。宿主が細
菌，放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上記栄養
源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨ
が５〜８である培地である。宿主がE. coli の場合、好
ましい培地としてＭ９培地〔Miller.J.Exp.Mol.Genet.,
(1972)p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yor
k〕が例示される。かかる場合、培養は、必要により通
気，攪拌をしながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時
間行うことができる。宿主がBacillus属菌の場合、必要
により通気，攪拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１
６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場
合、培地として、例えばBurkholder最小培地〔Bostian.
K.L. et.al(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4505
〕が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。
培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわ
れ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。宿主が
動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児
牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science (1952)122,501 〕，
ＤＭＥＭ培地〔Virology,(1959)8,396〕、ＲＰＭＩ１６
４０培地〔J.Am.Med.Assoc.,(1967)199,519 〕，１９９
培地〔proc.Soc.Exp.Biol.Med.,(1950)73,1 〕等を用い
ることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ま
しく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行
なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。宿
主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's
培地〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,8404〕等が
挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培
養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、
必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【００３１】本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯは、上記培
養により得られる培養物より以下のようにして取得でき
る。すなわち、本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯが、培養
物のうち培養液中に存在す場合は、得られた培養物を濾
過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該
培養濾液から、天然または合成蛋白質を精製並びに単離
するために一般に用いられる常法に従ってｐｒｏＰＯま
たはＰＯを精製、単離する。単離，精製方法としては、
例えば塩析，溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透
析，限外濾過，ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用す
る方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。

【００３２】一方、本発明ｐｒｏＰＯまたはＰＯが培養
された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在
する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に
付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁
し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法
で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、
遠心分離やろ過などの方法でｐｒｏＰＯまたはＰＯを含
有する粗抽出液を得る。そして、当該粗溶出液を、先に
例示したような常法を用いることにより、単離，精製す
ることができる。

【００３３】また、本発明のＰＯは、上述如く方法によ
り調製されるｐｒｏＰＯ産生性形質転換体の培養物また
はその処理物（ｐｒｏＰＯを含有する粗抽出物，精製ｐ
ｒｏＰＯ等）をＰＰＡＥに接触することによっても製造
することができる。すなわち、配列表配列番号１または
２で示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号５１番目の
アルギニンとアミノ酸番号５２番目のフェニルアラニン
との間の結合がＰＰＡＥにより切断されることによりＰ
Ｏが生成する。かかる方法によるＰＯの製造は、ｐｒｏ
ＰＯ産生性形質転換体の培養物またはその処理物をＰＰ
ＡＥの存在下に置くことで達成しうるが、好適には両者
を０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液またはトリス塩酸
緩衝液のもと、ｐＨ６〜１０、温度０〜５５℃の条件下
で１秒〜６０分間反応させることによって行われる。

【００３４】

【発明の効果】本発明は、家蚕由来のｐｒｏＰＯおよび
ＰＯのアミノ酸配列、該配列を有する酵素をコードする
ＤＮＡの塩基配列を初めて明らかにするものである。か
かるアミノ酸配列および塩基配列の解明に基づいて、本
発明は遺伝子工学的手法によるｐｒｏＰＯおよびＰＯの
製造法およびこれに関連する発現系を提供する。本発明
の方法によれば、従来取得の困難であったｐｒｏＰＯお
よびＰＯを容易にかつ大量に取得することができる。か
くして得られるＰＯは、メラニン合成という黒色を呈す
る反応の触媒作用を有することから新規な標識酸化酵素
として有用である。また本発明のｐｒｏＰＯは、家蚕ｐ
ｒｏＰＯ活性化系の一構成酵素であり、この一次構造の
解明により、微生物の検出（β-1,3-G及びPG測定）に応
用可能なｐｒｏＰＯ活性化系の再構成に寄与する。ま
た、ＰＯを製造するための原料として有用である。

【００３５】以下の実施例において、プラスミド，制限
酵素のような酵素，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び他の物質は
市販のものであり、常法に従って使用することできる。
ＤＮＡのクローニング，宿主細胞の形質転換，形質転換
体の培養，得られる培養物からのｐｒｏＰＯまたはＰＯ
の採取，精製等に用いられた操作についても当業者によ
く知られているものであるか、文献により知ることので
きるものである。

【００３６】以下に参考例，実施例を挙げるが、本発明
はかかる記載により何ら限定されるものではない。

【００３７】

【参考例】

参考例１家蚕型ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位
のアミノ酸配列の決定（１）家蚕ｐｒｏＰＯの精製家蚕５令幼虫より得られたヘモリンパ約２００ｍｌに飽
和硫安水溶液（ｐＨ６．５）を加えて７０％飽和硫安溶
液とし、４℃で一晩静置した。それに０．２Ｍのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて４０％飽和硫安
溶液とした。２時間ゆっくり攪拌後静置し、８０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離（日立ＲＰＲ９−２ロータを使
用、以下これに同じ。）して上清を得た。この上清に飽
和硫安水溶液（ｐＨ６．５）を加え５０％飽和硫安溶液
とし、３０分攪拌後一晩静置した。これをさらに８００
０ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈澱を得た。この沈澱
を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）−２０
％飽和硫安（ｐＨ６．５）に溶解して、さらに飽和硫安
水溶液（ｐＨ６．５）を加えて３８％飽和硫安溶液とし
た。当該溶液を１時間攪拌して２．５時間静置した後、
１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を得た。
この上清に飽和硫安水溶液（ｐＨ６．５）を加えて４８
％飽和硫安溶液とした。これを３０分間攪拌後一晩静置
し、８０００ｒｐｍで２０分間遠心して沈澱を得た。こ
の沈澱を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶解して、
同緩衝液中で透析した。

【００３８】透析を終えた試料を１２０００ｒｐｍ，２
０分間遠心後、得られた上清を６５℃水浴中で攪拌しな
がら５４．５℃に下がるまで加温し、５５℃水浴中で５
分間さらに加温した。氷で急冷後、１８０００ｒｐｍで
２０分間遠心し上清を得た。この上清をＤＥＡＥセルロ
ースカラムクロマトグラフィー（和光純薬工業製、φ1.
5×19cm）に付し、ＫＣｌのグラジエントで溶出させて
分画を行った。各分画について粗ＰＰＡＥを使って活性
化後現れるＰＯ活性の有無を調べることによりｐｒｏＰ
Ｏを含有する画分を集めた。なお、画分中のＰＯ活性
は、０．０２ＭL-3,4-dihydroxyphenylalanine １ｍ
ｌ，０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３．９ｍｌ
及び粗ＰＰＡＥ処理した画分０．１ｍｌを混合し、３０
℃で５分間インキュベーションした後、４９０ｎｍの吸
光度を測定することによって検出した（１ユニットはＯ
Ｄ_490nmを０．０１上昇させる活性と定義。）。次いで
集めたｐｒｏＰＯ画分を０．０４ＭＫＣｌ−０．０１
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析した。
さらにこの試料をヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィー（和光純薬工業製、φ 1.5×9.3cm ）に付
し、５０ｍＭ，７５ｍＭ，９５ｍＭの各リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出させて得られた各分画中の
ＰＯ活性を先述の様に調べた。その結果、５０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）画分中にｐｒｏＰＯの
溶出を確認し、当該画分を集めた。この画分をザルトリ
ウス社のCollodion Bag(SM13200)で濃縮し、０．０１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．７５）中で透析し、精製ｐ
ｒｏＰＯ溶液とした。

【００３９】（２）ＰＰＡＥの精製家蚕５令幼虫の表皮より得たホモジネートを硫安分画
し、そのうち０．２〜０．４％飽和硫安画分を集め、
０．０１Ｍトリス塩酸−０．０１ＭＣａＣｌ₂ （ｐＨ
８．５）で透析した後、さらに０．０１Ｍトリス塩酸
（ｐＨ８．５）中でさらに透析した。これをＤＥＡＥセ
ルロースカラムに掛け、０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ
８．５）で溶出した。このうちＰＰＡＥ活性を示す分画
を集め、これをさらにヒドロキシアパタイトカラムに掛
けて０．０１ＭＫ−ＰＯ₄ （ｐＨ７．５）で洗浄後、
０．０１〜０．５ＭＫ−ＰＯ₄ （ｐＨ７．５）のリニ
アグラジエントで溶出した。そのうちＰＰＡＥ活性を示
す分画を集めて精製ＰＰＡＥ溶液とした。

【００４０】（３）ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯが切断
されて得られるペプチド断片のアミノ酸配列分析上記精製ｐｒｏＰＯを精製ＰＰＡＥと共にインキュベー
ションし、その反応溶液をセファデックスＧ−５０カラ
ムに掛け、０．０１ＭＫ−ＰＯ₄ (pH8.0) で溶出し、
ｐｒｏＰＯから切断され遊離してくるペプチド鎖を集め
た。このペプチド鎖をまずＯＤＳカラムにより３種類の
フラグメント（ｆＩ，ｆII，ｆIII）に分けることがで
きた。これらをそれぞれリジルエンドペプチダーゼ処理
して断片化した後、エドマン分解法により、各断片のア
ミノ酸配列を調べた。その結果、ｆＩ，ｆIIからはそれ
ぞれ３種類のペプチドが単離され、それぞれ多少修飾に
違いはあるものの同一のアミノ酸配列（配列番号３、配
列番号４、配列番号５）を有していた。ｆIIIは２種類
のペプチドが単離され、１つはＮ末端がブロックされて
おり配列の決定が出来なかったが、もう一方のペプチド
は配列番号６に示すアミノ酸配列を有していた。

【００４１】（４）ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯから上
記ペプチドが切断されて生じるＰＯのＮ末端のアミノ酸
配列分析０．０１ＭＫ−ＰＯ₄(pH7.5) 中のｐｒｏＰＯをチオ
ウレアと７５ｍＭＫ−ＰＯ₄(pH7.5) 中のＰＰＡＥと
共に０℃で３時間インキュベートし、すべてのｐｒｏＰ
ＯをＰＯに変換した。この反応液をＯＤＳカラムによっ
て２つの主要分画に分け、それぞれのＮ末端のアミノ酸
配列をエドマン分解法によって決定した（配列番号７、
配列番号８）。

【００４２】

【実施例】

実施例１ｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡの塩基配列、
及びｐｒｏＰＯのアミノ酸配列の決定（１）家蚕ｃＤＮＡライブラリーの作製家蚕５令幼虫５００頭より体液を２５ｍｌを採取し、こ
れを遠心分離（４０×ｇ，15分間，４℃）することによ
って血球細胞を沈澱させた。この血球細胞より総ＲＮＡ
調製用試薬であるＩＳＯＧＥＮ（BIOTECX LABORATORIE
S,INC. ）を用いて総ＲＮＡを調製した。この結果、約
８００μｇの総ＲＮＡを調製することができた。また、
このときアガロース電気泳動により、リボゾーム28ＳＲ
ＮＡのバンドを確認し、ＲＮＡの分解のないことも確認
した。この総ＲＮＡよりｍＲＮＡ Purification Kit
（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを精製し、cDNA
Synthesis Kit（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡ
の合成を行った。合成したｃＤＮＡはλZAP IIファージ
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、Gigapack G
old packaging extract （ストラタジーン社製）を用い
てin vitroパッケージングし、その結果４．２×１０⁵
プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）のｃＤＮＡラ
イブラリーを得た。

【００４３】（２）抗ｐｒｏＰＯポリクローナル抗体の
作製０．５ｍｌのphosphate buffer saline （ＰＢＳ）に溶
解した約０．５ｍｇのｐｒｏＰＯと等量のアジュバント
を乳化させた後、これをウサギに皮下注射した。その後
１０日おきに同様の皮下注射を２回行い、最後の皮下注
射から１０日後に当該ウサギの血を採取した。該ウサギ
の血より調製したウサギ抗ｐｒｏＰＯ血清から抗ｐｒｏ
ＰＯ／ＩｇＧをProtein A Sepharose 4B (Bio Rad 社
製) を用いることによって精製、取得した。

【００４４】（３）ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニン
グｐｒｏＰＯクローンのスクリーニングにはPicoBlue^TM I
mmunoscreening Kit（ストラタジーン社製）を用いて行
った。１．５×１０⁴ＰＦＵの家蚕ｃＤＮＡライブラリ
ーと２００μｌのE.coli XL-1 Blue（OD₆₀₀≒0.5)を混
合し３７℃，１５分間インキュベートした後、ＮＺＹプ
レート（１．５％寒天，１％ＮＺアミン，０．２％Ｍｇ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５％バクト酵母抽出物，０．５
％ＮａＣｌ，１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン，ｐ
Ｈ７．５）３ｍｌと共にまき、４２℃で３．５時間程度
培養した。プラークが現れたとき、１０ｍＭイソプロ
ピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（以下、
ＩＰＴＧという）を染み込ませたニトロセルロースフィ
ルター（アマシャム社製）をかぶせ、更に３７℃，３．
５時間培養した後ピンセットで注意深くニトロセルロー
スフィルターを取り、ＴＢＳＴ〔20mM Tris-HCl pH7.5,
150mM NaCl, 0.05% Tween 20(v/v)〕で15分間，３〜５
回洗浄した。また、同一プレートに２枚のスクリーニン
グ用レプリカフィルターを作製するため１枚目のフィル
ターをはがしたのち、再度１０ｍＭＩＰＴＧを染み込
ませたニトロセルロースフィルターをプレートにかぶせ
３７℃，４時間培養した。２枚目のフィルターも１枚目
のそれと同様に洗浄した。この操作を２０プレート行
い、合計約３．０×１０⁵ＰＦＵのレプリカメンブレン
を作製した。このメンブレンをブロッキング溶液（１％
ＢＳＡ，２０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ）中で１時間ゆっくりと振とうした。レプリ
カメンブレンを１回につき５分間，ＴＢＳＴで３〜５回
洗浄後、ブロッキング溶液で適当に希釈したアルカリホ
スファターゼ標識ウサギＩｇＧ抗体溶液中で１時間ゆっ
くりと室温で振盪した。ＴＢＳＴで５分間，３〜５回洗
浄後、ＴＢＳ（トリス塩酸，pH7.5,１５０ｍＭＮａＣ
ｌ，１％ＢＳＡ）で５分洗浄した。レプリカメンブレン
の水滴をフィルターペーパーで吸い取った後、発色液
（0.3mg/ml Nitro Blue Tetrazolium, 0.15mg/ml5-Brom
o-4-Chloro-3-Indolil Phosphate, 100mM Tris-HCl pH
9.5, 100mM NaCl,5mM MgCl₂ ）中で発色させた。ニトロ
セルロースフィルター上で青く発色した位置に対応する
プラークをプレート上よりリフトし、２次スクリーニン
グ、３次スクリーニングを行うことによってファージの
純化を行い、８つのクローンを得た（λPO2,λPO3,λPO
4,λPO5,λPO6,λPO8,λPO17, λPO20）。

【００４５】（４）サブクローニング λZAP IIにクローニングされたＤＮＡ断片はヘルパーフ
ァージの働きにより自動的に切り離されて再閉環し、pB
luescript SK(-) ファージミドベクターにサブクローニ
ングされるため以下の操作を行った。λZAP II組換え体
ファージ１００μｌ（＞1x10⁵ PFU），２００μｌ E.c
oliXL-1 Blue（OD₆₀₀≒1.0 ），１μｌ ExAssist help
er Fhage（＞1x10⁶ PFU）を混合し３７℃で１５分間イ
ンキュベートした後、３ｍｌの２×ＴＹ培地（1% NaCl,
1% Yeast extract, 1.6% Bacto-Tryptone ）を加え、更
に２．５時間振盪培養した。７０℃で２０分間インキュ
ベートし、遠心分離（4,000 ×g,１５分，室温）して上
清を回収した。このうち１μｌを２００μｌの E.coli
SOLR^TM（OD₆₀₀≒1.0 ）と混合し３７℃で１５分間イン
キュベートした後、ＬＢ／Ａｍｐプレート（1.5%Agar,
1% NaCl, 1% Bacto-Tryptone, 0.5% Yeast extract, 50
ug/ml Ampicilin ）にプレーティングし培養後、単一コ
ロニーをリフトした（pPO2, pPO3, pPO4, pPO5, pPO6,
pPO8, pPO17, pPO20）。

【００４６】（５）ｐｒｏＰＯクローンの塩基配列の決
定サブクローニングしたクローンについて制限酵素切断地
図を作製したところ、pPO2, pPO3, pPO4, pPO8, pPO17,
pPO20はその制限酵素部位が類似していることから同一
のタンパク質をコードしているクローンであると考えら
れ、pPO5, pPO6はそれぞれ異なったタンパク質をコード
するか、もしくはpPO6についてはpPO2などの一部分のク
ローンであると考えられた。ここでpPO2, pPO3, pPO4,
pPO8, pPO17, pPO20のうち、最もインサートＤＮＡの大
きいクローンであるpPO17 、及び制限酵素切断地図が異
なりインサートされているＤＮＡの大きいpPO5について
その塩基配列を決定した。塩基配列の決定はDeletion k
it（ニッポンジーン社製）を用いてDeletion mutant を
作製した後、DNA Taq Polymeraseを用いたダイデオキシ
法をにより行った。これから、pPO17 クローンは２７８
５ｂｐの塩基数からなる家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡイ
ンサート配列を持っている（図１参照）ことがわかり、
これにより5'末端から数えて４５塩基目から始まるＡＴ
Ｇを翻訳開始配列とする６９３アミノ酸残基からなるｐ
ｒｏＰＯのアミノ酸配列が解明された。なお、後記塩基
配列表の配列番号１にpPO17 クローンに含有される家蚕
血球細胞由来のｃＤＮＡの塩基配列およびこれからコー
ドされるｐｒｏＰＯのアミノ酸配列を記載する。

【００４７】ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯからｐｒｏ部
分のペプチドが切断されて生じるＰＯのＮ末端アミノ酸
配列（配列番号８）とpPO17 塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列（配列番号１）を比べたところ、pPO17 の翻
訳開始点のメチオニンを１番目としたとき５２番目のフ
ェニルアラニンから６１番目のプロリンまで１００％の
ホモロジーを示した。またＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯ
が切断されて得られるｐｒｏ部分ペプチド断片のアミノ
酸配列（配列番号６）と２４番目のグリシンから５１番
目のアルギニンを比べたところ１００％一致した。この
ことから１番目のメチオニンから５１番目のアルギニン
までがｐｒｏ部分で、５２番目から６９３番目までの配
列が成熟フェノールオキシダーゼのアミノ酸配列である
といえる。また、６９３アミノ酸残基のタンパクは分子
量になおすと80118.13で、プロノールオキシダーゼの分
子量約80000 とほぼ一致した。

【００４８】一方、pPO5クローンは３５１４ｂｐの塩基
数からなる家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡインサート配列
を持っており、ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯからｐｒｏ
部分のペプチドが切断されて生じるＰＯのＮ末端アミノ
酸配列（配列番号７）とpPO5塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列を比べたところ、pPO5の翻訳開始点のメチオ
ニンを１番目としたとき５２番目のフェニルアラニンか
ら６１番目のプロリンまで１００％のホモロジーを示し
た。またＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯが切断されて得ら
れるｐｒｏ部分の３種類のペプチド断片アミノ酸配列の
うち、配列番号５と４１番目のチロシンから５１番目の
アルギニンを比べたところ１００％一致した。しかし、
その上流に翻訳開始配列のＡＴＧでコードされるメチオ
ニン残基がなかったことから、Ｎ末端をコードすると考
えられる遺伝子の一部が欠失していると推定された。そ
こでＮ末端部分を保有する遺伝子断片を以下の方法でク
ローニングした。pPO5のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩの約０．
６ｋｂＤＮＡ断片を回収し、これをランダムプライマー
ラベリングキット（TaKaRa社製）を用いて³²Ｐ標識し
た。これをプローブとして上記の方法で構築した家蚕血
球ｃＤＮＡライブラリー約９×１０ ³ｐｆｕからプラー
クハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行っ
た。

【００４９】家蚕血球ｃＤＮＡライブラリー約１０００
ＰＦＵを一晩培養した E.coli XL-1Blue ０．１ｍｌを
混合し、37℃で10分間インキュベートした。溶解後５０
℃に冷やしたトップアガー(1% Trypton, 0.5% yeast ex
tract, 1% NaCl, 0.7% Agar)２．５ｍｌに加え、直ちに
90mmシャーレのボトムアガー(1% Trypton, 0.5% yeast
extract, 1% NaCl, 1.5% Agar)にまいた。37℃で一晩培
養した後、ニトロセルロースフィルター（アマシャム社
製）をプレートにかぶせ、約30秒間放置した。この時プ
レートとニトロセルロースフィルターの両方に注射針を
さして印をつけた。レプリカフィルターは１プレートに
２枚作製し、変性溶液(1.5M NaCl, 0.5MNaOH)に浸した
濾紙上に７分間、中和溶液(1.5M NaCl, 0.5M Tris-Cl,p
H7.2, 0.001M EDTA)に浸した濾紙上に３分間おき、２×
ＳＳＰＥ(0.18M NaCl, 0.01M Na ₂ PO₄ , 0.02M EDTA)で
洗浄して風乾後、80℃の真空オーブンで２時間ベーキン
グした。レプリカフィルターにプレハイブリダイゼーシ
ョン溶液(5xSSPE, 5%ブロックA, 0.5% SDS, 20ug/ml De
naturd Salmon Sperm DNA) を加え65℃、１時間インキ
ュベートした。標識したpPO5のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ
0.6Kb断片ＤＮＡをプレハイブリダイゼーション溶液に
加え６５℃で一晩インキュベートした。次にフィルター
を２×ＳＳＰＥ，６５℃，１０分で２回、１×ＳＳＰ
Ｅ，６５℃，１０分で２回、２×ＳＳＰＥ，６５℃，１
０分で２回洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラム上で黒く発色した位置に対応するプ
ラークをプレート上よりリフトし、２次スクリーニング
を上記の方法で行い、単一プラークを単離した。これに
よって13個のクローンが得られ、pPO5のＮ末端をコード
するクローンpPO5N を得た。pPO5N はpPO5より５’側の
更に８８ｂｐ上流をコードするクローンで、約３．６Ｋ
ｂのインサートｃＤＮＡ配列を持っていた。

【００５０】当該pPO5N クローンの塩基配列を決定した
結果、全長３６０８ｂｐの塩基からなる家蚕血球細胞由
来のｃＤＮＡインサート配列を持っており（図２参
照）、５’末端から数えて７塩基目から始まるＡＴＧを
翻訳開始配列とする６８５アミノ酸残基よりなるｐｒｏ
ＰＯアミノ酸配列が解明された。なお、後記塩基配列表
の配列番号２にpPO5クローンに含有される家蚕血球細胞
由来のｃＤＮＡの塩基配列およびこれからコードされる
ｐｒｏＰＯのアミノ酸配列を記載する。またこの時、pP
O5N はｐｒｏＰＯタンパク質がβーガラクトシダーゼと
の融合タンパク質として発現可能な形でpBluescript SK
(-) ベクターに挿入されていた。ＰＰＡＥによってｐｒ
ｏＰＯが切断されて得られるｐｒｏ部分の３種類のペプ
チド断片アミノ酸配列のうち、配列番号３の６番目のア
スパラギンから２３番目のリジン及び配列番号４の２４
番目のグリシンから４０番目のリジンの配列で１００％
のホモロジーを示した。このことより、１番目のメチオ
ニンから５１番目のアルギニンまでがｐｒｏ部分で、５
２番目から６８５番目までの配列が成熟フェノールオキ
シダーゼであるといえる。また、６８５アミノ酸残基の
タンパクは分子量になおすと78784.08で、プロノールオ
キシダーゼの分子量約80000 とほぼ一致した。

【００５１】pPO17 及びpPO5N にコードされるアミノ酸
配列を比較したところ、約５１％のアミノ酸ホモロジー
を持ち、共に５１アミノ酸残基よりなるｐｒｏ部分を持
つことが分かった。更に５０〜５３番目の４アミノ酸残
基(AsnArgPheGly)が保存されており、ＰＰＡＥによる切
断はこの配列のアルギニンとフェニルアラニンの間で起
こっていた。このことから４アミノ酸残基の配列がＰＰ
ＡＥの認識に重要な役割をもつと考えられた（特願平５
−２８９５１３号参照）。次に、この２つのアミノ酸配
列をGENETIX-CD Ver.24 （ＳＤＣソフトウエア株式会
社）を用いてNBRF-PDB,SWISS-PROT タンパク質データベ
ースよりホモロジー検索を行ったところ、ＰＯと同じく
酸素を輸送する銅タンパク質のヘモシアニンとホモロジ
ーを示した。特に銅の結合部位付近でのホモロジーが高
く、直接の銅結合部位であるヒスチジンは全て保存され
ていた。pPO17 にコードされるアミノ酸配列では２１３
番目，２１７番目，２４３番目のヒスチジンが１つの銅
原子と結合し、３６６番目，３７０番目，４０６番目の
ヒスチジンが更にもう一つの銅原子と結合すると考えら
れ、pPO5N にコードされるアミノ酸配列では２０９番
目，２１３番目，２３９番目のヒスチジンが１つの銅原
子と結合し、３６６番目，３７０番目，４０６番目のヒ
スチジンが更にもう一つの銅原子と結合すると考えられ
た。昆虫におけるｐｒｏＰＯの一次構造の報告はなく、
本発明のｐｒｏＰＯ一次構造が最初の報告であり、科学
的あるいは工業的にも重要な意味を持つものと思われ
る。

【００５２】実施例２ｐｒｏＰＯタンパク質の発現 pPO5N, pPO17及び発現ベクターとして用いたpBluescrip
t SK(-) をE.coli XL-1 Blueに形質転換したものをＬＢ
培地に一晩培養した後、そのうちの２０μｌを約３ｍｌ
のＬＢ培地に植菌し、ＯＤ₆₀₀が0.2 になるまで培養し
た。これにＩＰＴＧを最終濃度１０ｍＭになるように加
え、さらに３時間培養した。遠心分離（5,000rpm，１０
分）後、４倍量のLysis Buffer〔50mM Tris-Cl(pH8.0),
1mM EDTA, 1uM Phenylmethylsulfonyl Fluoride(PMS
F), 10% Sucrose 〕に懸濁した後、ライソザイムを最終
濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加え、氷上に10分置い
た。Triton X-100を最終濃度1%になるように加え、氷上
に１０分間置き、遠心分離（20,000rpm , １時間）後上
清を取った。得られた上清を常法に従ってＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動した後、ニトロセルロースメン
ブラン上にゲルからタンパク質をトランスファーした。
抗ｐｒｏＰＯ抗体を用いてウエスタンブロッティングし
た結果、抗ｐｒｏＰＯ抗体と反応するバンドがみられ、
明らかにｐｒｏＰＯをコードするタンパク質の発現が確
認された。

【００５３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２７８５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：Bombyx mori : pPO17 クローン配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：45..2123 特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号： mat peptide 存在位置：45..2123 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AAAGAACGCG TTTATTTTTT ATTTAATTTC AATATTATC AAAA 44 ATG GCT GAC GTT TTT GAA AGC CTC GAG TTG CTG TTC GAT CGT CCA AAT 92 Met Ala Asp Val Phe Glu Ser Leu Glu Leu Leu Phe Asp Arg Pro Asn 1 5 10 15 GAG CCG CTC ATC ACA CCC AAG GGC GAA AAC AAT TCT GTG TTT CAA CTC 140 Glu Pro Leu Ile Thr Pro Lys Gly Glu Asn Asn Ser Val Phe Gln Leu 20 25 30 ACA GAA CAA TTT TTG ACT GAG GAC TAC GCC AAC AAC GGC ATC GAA TTA 188 Thr Glu Gln Phe Leu Thr Glu Asp Tyr Ala Asn Asn Gly Ile Glu Leu 35 40 45 AAC AAC CGT TTC GGT GAC GAT GCT TCT GAG AAG ATA CCC CTC AAG AAC 236 Asn Asn Arg Phe Gly Asp Asp Ala Ser Glu Lys Ile Pro Leu Lys Asn 50 55 60 CTC AGC AAA CTC CCA GAA TTT AAA ATT GCA ACT CAA CTA CCC AAG GAC 284 Leu Ser Lys Leu Pro Glu Phe Lys Ile Ala Thr Gln Leu Pro Lys Asp 65 70 75 80 GCT GAA TTC TCA TTG TTT CTA CCT AAA CAT CAA GAA ATG GCA AAT GAA 332 Ala Glu Phe Ser Leu Phe Leu Pro Lys His Gln Glu Met Ala Asn Glu 85 90 95 CTT CTT GGC GTT CTC ATG GAT GTA CCA GAG AAC GAA TTA CAA GAT TTG 380 Leu Leu Gly Val Leu Met Asp Val Pro Glu Asn Glu Leu Gln Asp Leu 100 105 110 CTA TCG ACA TGC GCC TTT GCA CGA GTA AAC CTG AAC CCT CAG TTG TTC 428 Leu Ser Thr Cys Ala Phe Ala Arg Val Asn Leu Asn Pro Gln Leu Phe 115 120 125 AAC TAT TGT TAC TCT GTG GCA CTG ATG CAC AGA CGT GAT ACC AGA AAA 476 Asn Tyr Cys Tyr Ser Val Ala Leu Met His Arg Arg Asp Thr Arg Lys 130 135 140 GTC AGA GTT AAG AAT TTT GCA GAA GTA TTT CCC TCT AAA TTC TTG GAT 524 Val Arg Val Lys Asn Phe Ala Glu Val Phe Pro Ser Lys Phe Leu Asp 145 150 155 160 TCC CAA GTA TTC ACT CAG GCT CGT GAA ACT GCA GCC GTT ATT CCA CCA 572 Ser Gln Val Phe Thr Gln Ala Arg Glu Thr Ala Ala Val Ile Pro Pro 165 170 175 GAT GTT CCA CGC ATA CCT ATT ATC ATT CCA CGA GAC TAC ACT GCG ACG 620 Asp Val Pro Arg Ile Pro Ile Ile Ile Pro Arg Asp Tyr Thr Ala Thr 180 185 190 GAC TTA GAA GAA GAA CAC CGC CTT GCG TAC TGG CGA GAA GAT ATC GGC 668 Asp Leu Glu Glu Glu His Arg Leu Ala Tyr Trp Arg Glu Asp Ile Gly 195 200 205 ATC AAC CTG CAT CAT TAT CAC TGG CAT TTG GTC TAC CCG TTT ACG GCC 716 Ile Asn Leu His His Tyr His Trp His Leu Val Tyr Pro Phe Thr Ala 210 215 220 AAC GAT CTT TCA ATC GTA GCT AAG GAC CGT CGT GGG GAG TTG TTC TTC 764 Asn Asp Leu Ser Ile Val Ala Lys Asp Arg Arg Gly Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 TAT ATG CAC CAG CAA GTG ATA GCC CGC TTC AAC TGC GAG CGC TTG TGC 812 Tyr Met His Gln Gln Val Ile Ala Arg Phe Asn Cys Glu Arg Leu Cys 245 250 255 AAT TCA TTA AAA AGA GTT AAA AAA TTC AGC AAC TGG AGG GAG CCA ATT 860 Asn Ser Leu Lys Arg Val Lys Lys Phe Ser Asn Trp Arg Glu Pro Ile 260 265 270 CCA GAG GCT TAC TTC CCT AAG CTT GAC AGT TTG ACT TCG TCG CGC GGA 908 Pro Glu Ala Tyr Phe Pro Lys Leu Asp Ser Leu Thr Ser Ser Arg Gly 275 280 285 TGG CCG CCG CGT CAG TCC GGT ATG CAA TGG CAG GAC CTG AAT CGT GCG 956 Trp Pro Pro Arg Gln Ser Gly Met Gln Trp Gln Asp Leu Asn Arg Ala 290 295 300 GCC GAA GGT CTA TTT GTG ACC ATT GAC GAA ATG GAA CGC TGG AGA AGA 1004 Ala Glu Gly Leu Phe Val Thr Ile Asp Glu Met Glu Arg Trp Arg Arg 305 310 315 320 AAC GTT GAA GAA GCT ATC GCG ACT GGT ACC GTT AGA TTG CCA AAC GGG 1052 Asn Val Glu Glu Ala Ile Ala Thr Gly Thr Val Arg Leu Pro Asn Gly 325 330 335 CAG ACT CGG CCT CTT GAC ATC GAT ACG CTC GGC AAC ATG TTG GAG TCC 1100 Gln Thr Arg Pro Leu Asp Ile Asp Thr Leu Gly Asn Met Leu Glu Ser 340 345 350 AGC GCC CTC TCG CCG AAC AGA GAA CTG TAC GGT TCG ATA CAC AAC AAC 1148 Ser Ala Leu Ser Pro Asn Arg Glu Leu Tyr Gly Ser Ile His Asn Asn 355 360 365 GGG CAC AGT TTC ACC GCG TAC ATG CAC GAC CCG GAA CAC AGA TAC CTT 1196 Gly His Ser Phe Thr Ala Tyr Met His Asp Pro Glu His Arg Tyr Leu 370 375 380 GAA CAA TTT GGT GTT ATC GCT GAT GAG GCC ACA ACG ATG CGC GAT CCA 1244 Glu Gln Phe Gly Val Ile Ala Asp Glu Ala Thr Thr Met Arg Asp Pro 385 390 395 400 TTC TTC TAC CGC TGG CAC GCC TAC ATC GAT GAC GTT TTC CAG AAG CAC 1292 Phe Phe Tyr Arg Trp His Ala Tyr Ile Asp Asp Val Phe Gln Lys His 405 410 415 AAG GAA TCT GCC TAC GTG CGT CCT TAC ACT CGA TCT GAG CTC GAG AAC 1340 Lys Glu Ser Ala Tyr Val Arg Pro Tyr Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asn 420 425 430 CCG GGC GTG CAA GTG AGG TCC GTG TCG GTG GAG ACG CCC GGC GGA CAA 1388 Pro Gly Val Gln Val Arg Ser Val Ser Val Glu Thr Pro Gly Gly Gln 435 440 445 CCG AAC ACG CTG AAC ACG TTC TGG ATG CTC AGC GAC GTG AAC TTG TCG 1436 Pro Asn Thr Leu Asn Thr Phe Trp Met Leu Ser Asp Val Asn Leu Ser 450 455 460 CGC GGA CTC GAC TTC TCC GAC AAC GGG CCC GTG TAC GCT CGC TTC ACT 1484 Arg Gly Leu Asp Phe Ser Asp Asn Gly Pro Val Tyr Ala Arg Phe Thr 465 470 475 480 CAC CTC AAC TAC AGG CAT TTC AGC TAC AGA ATA AAC GTG AAC AAC ACC 1532 His Leu Asn Tyr Arg His Phe Ser Tyr Arg Ile Asn Val Asn Asn Thr 485 490 495 GGT AGC AGC CGT CGC ACC ACA GTG CGT ATC TTC ATC ACT CCG AAG TTC 1580 Gly Ser Ser Arg Arg Thr Thr Val Arg Ile Phe Ile Thr Pro Lys Phe 500 505 510 GAC GAG CGC AAT GTC CCC TGG ATA TTC TCG GAC CAA CGC AAG ATG TGT 1628 Asp Glu Arg Asn Val Pro Trp Ile Phe Ser Asp Gln Arg Lys Met Cys 515 520 525 ATT GAA ATG GAC AGA TTC GTC ACT GTC CTG AAC GCC GGA GAG AAT AAT 1676 Ile Glu Met Asp Arg Phe Val Thr Val Leu Asn Ala Gly Glu Asn Asn 530 535 540 ATT GTC CGT CAG TCG ACG GAG TCT TCC ATA ACT ATT CCG TTC GAA CAG 1724 Ile Val Arg Gln Ser Thr Glu Ser Ser Ile Thr Ile Pro Phe Glu Gln 545 550 555 560 ACA TTC CGC GAC CTA TCC GCT CAG GGC AAT GAT CCA CGA CGC GAC GAA 1772 Thr Phe Arg Asp Leu Ser Ala Gln Gly Asn Asp Pro Arg Arg Asp Glu 565 570 575 CTC GCT ACC TTC AAT TAC TGC GGC TGC GGC TGG CCT CAG CAC ATG CTC 1820 Leu Ala Thr Phe Asn Tyr Cys Gly Cys Gly Trp Pro Gln His Met Leu 580 585 590 GTG CCC AAG GGC ACT GAA GCC GGC ATG CCC TTC CAA CTG TTT GTT ATG 1868 Val Pro Lys Gly Thr Glu Ala Gly Met Pro Phe Gln Leu Phe Val Met 595 600 605 TTA TCC AAC TAT GAT TTA GAC CGG ATC GAT CAA GAT GAC GGA AAA CAG 1916 Leu Ser Asn Tyr Asp Leu Asp Arg Ile Asp Gln Asp Asp Gly Lys Gln 610 615 620 CTC ACT TGT GTG GAA GCG TCG AGC TTC TGT GGA TTA AAG GAT AAG AAA 1964 Leu Thr Cys Val Glu Ala Ser Ser Phe Cys Gly Leu Lys Asp Lys Lys 625 630 635 640 TAT CCT GAT AGG CGC GCT ATG GGA TTC CCG TTC GAT CGA CCC TCG AGC 2012 Tyr Pro Asp Arg Arg Ala Met Gly Phe Pro Phe Asp Arg Pro Ser Ser 645 650 655 AGC GCC ACC AGC CTC CAG GAC TTC ATT TTA CCA AAC ATG GGC TTG CAG 2060 Ser Ala Thr Ser Leu Gln Asp Phe Ile Leu Pro Asn Met Gly Leu Gln 660 665 670 GAC ATC ACT ATT CAA TTG CAA AAC GTC ACC GAA CCT AAC CCA CGG AAC 2108 Asp Ile Thr Ile Gln Leu Gln Asn Val Thr Glu Pro Asn Pro Arg Asn 675 680 685 CCT CCC ATG TCT GTT TAAAATGTCG CAAAATTAAA ATGAAATACG CGTCTTAAAC 2163 Pro Pro Met Ser Val 690 CACAAATTCG ATTTTTTATT TAAGTGTAGC ATTTAAAAAA CCAAAAGGCT GATGTATTCA 2223 TCTTAGAATA TTTTAATGTT AAATGTACAT AATTTTGTTA GTTAACCTAC TTAAGTGACC 2283 CGTTTTATGC GGCCGCGAAT TCGCGCCCGC TTTTTTTTTT TGATTTTTTT GTGTTTTATT 2343 CACTTATACC TAGCATTCAC ATCACTTCTT GGAGGCCGCA CCTACTTTAG ATTTCTTGGT 2403 ACCGCGGACC TTCTTCATTC TGTTCTTACG TTCTTTACGC TGTTTGCGCG TGGGCCTCTT 2463 CTTCTCGTAC AGGCCGTGGC GGGCTAACCT GTGCTTGGGC TCGAACTTCT TGGCCAGATC 2523 GAGTGTGTCG TAGATCAAAG CGAATCCAGT TGACTTGCCA CCTCCGAAGT TTGTCTTGAA 2583 ACCGAATACG AACACTACAT CGGGAGTAAC CTTGTACATT TTGGCGAGCT TCTCACGGAT 2643 CTCGGTCTTG CTGACGGTTG GTTTTCCTGG ATGTAAAACA TCGCAAACCA TCTGCTTGCG 2703 CGCCAACAAT CTGTTGGTCA TGAACTTGCG AGTGCGAATA GTCGCTGTTC CTTCACTCAT 2763 TTTGAATTAT TTTCAATAAT TC 2785

【００５４】配列番号：２配列の長さ：３０６８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：Bombyx mori : pPO5Nクローン配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：7..2061 特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号： mat peptide 存在位置：7..2061 特徴を決定した方法：Ｅ配列 ACCAAG 6 ATG TCT GAC GCC AAG AAC AAC CTG TTA CTG TTC TTC GAC CGT CCC TCA 54 Met Ser Asp Ala Lys Asn Asn Leu Leu Leu Phe Phe Asp Arg Pro Ser 1 5 10 15 GAG CCA TGC TTC ATG CAA AAG GGA GAA GAG AAT GCA GTA TTC GAG ATT 102 Glu Pro Cys Phe Met Gln Lys Gly Glu Glu Asn Ala Val Phe Glu Ile 20 25 30 CCT GAC AAT TAC TAC CCG GAG AAG TAC CAG CGT GTG TCA AAT GCT ATA 150 Pro Asp Asn Tyr Tyr Pro Glu Lys Tyr Gln Arg Val Ser Asn Ala Ile 35 40 45 GGC AAC AGG TTC GGT AGC GAC GCG GGC CGC ATG ATA CCC ATC AGG AAC 198 Gly Asn Arg Phe Gly Ser Asp Ala Gly Arg Met Ile Pro Ile Arg Asn 50 55 60 ATT GCC CTG CCC AAT CTG GAC CTG CCC ATG GAG CTG CCC TAT AAC GAG 246 Ile Ala Leu Pro Asn Leu Asp Leu Pro Met Glu Leu Pro Tyr Asn Glu 65 70 75 80 CAG TTC TCC TTG TTC GTC CCT AAG CAC AGA AAA TTG GCA GGA AGG CTG 294 Gln Phe Ser Leu Phe Val Pro Lys His Arg Lys Leu Ala Gly Arg Leu 85 90 95 ATT GAC ATC TTT ATG GGA ATG CGT GAT GTT GAA GAT CTT CAG TCT GTC 342 Ile Asp Ile Phe Met Gly Met Arg Asp Val Glu Asp Leu Gln Ser Val 100 105 110 TGT TCG TAC TGT CAG CTG CGG ATT AAT CCT TAC ATG TTC AAT TAC TGC 390 Cys Ser Tyr Cys Gln Leu Arg Ile Asn Pro Tyr Met Phe Asn Tyr Cys 115 120 125 CTC TCC GTC GCC ATT TTG CAC AGG CCG GAC ACC AAG GGC TTG AGC ATC 438 Leu Ser Val Ala Ile Leu His Arg Pro Asp Thr Lys Gly Leu Ser Ile 130 135 140 CCG ACT TTC GCG GAG AGC TTC CCC GAT AAG TTT ATG GAC CCG AAA GTT 486 Pro Thr Phe Ala Glu Ser Phe Pro Asp Lys Phe Met Asp Pro Lys Val 145 150 155 160 TTC CGT CAA GCC AGG GAG GTG TCC AGC GTT GTA CCT TCT GGA GCC AGG 534 Phe Arg Gln Ala Arg Glu Val Ser Ser Val Val Pro Ser Gly Ala Arg 165 170 175 ATG CCA ATA GTT ATT CCG TCG AAC TAC ACC GCG TCT GAC ACG GAG CCG 582 Met Pro Ile Val Ile Pro Ser Asn Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Glu Pro 180 185 190 GAG CAG CGC GTG GCG TAC TTC CGC GAG GAC ATC GGC ATC AAC CTG CAC 630 Glu Gln Arg Val Ala Tyr Phe Arg Glu Asp Ile Gly Ile Asn Leu His 195 200 205 CAC TGG CAC TGG CAC CTC GTG TAC CCC TTC GAC GCC GCA GAC CGC GCC 678 His Trp His Trp His Leu Val Tyr Pro Phe Asp Ala Ala Asp Arg Ala 210 215 220 ATC GTC AAC AAG GAC CGC CGC GGG GAG CTC TTC TAC TAC ATG CAC CAG 726 Ile Val Asn Lys Asp Arg Arg Gly Glu Leu Phe Tyr Tyr Met His Gln 225 230 235 240 CAG ATC ATC GCC AGG TAC AAC GTT GAG CGT ATG TGC AAC AAC CTG AGC 774 Gln Ile Ile Ala Arg Tyr Asn Val Glu Arg Met Cys Asn Asn Leu Ser 245 250 255 AGA GTG AGG AGG TAC AAT AAC TTC AGG GCC GCG ATC GAG GAG GGC TAC 822 Arg Val Arg Arg Tyr Asn Asn Phe Arg Ala Ala Ile Glu Glu Gly Tyr 260 265 270 TTC CCC AAG CTA GAC TCA ACA GTC GCC AGC AGA GCC TGG CCT CCC AGG 870 Phe Pro Lys Leu Asp Ser Thr Val Ala Ser Arg Ala Trp Pro Pro Arg 275 280 285 TTT GCT GGC ACT ACC ATC CGT GAC CTG GAC AGA CCC GTT GAT CAG ATC 918 Phe Ala Gly Thr Thr Ile Arg Asp Leu Asp Arg Pro Val Asp Gln Ile 290 295 300 AGG AGT GAC GTC TCC GAG CTG GAG ACC TGG AGG GAC CGG TTC CTG CAA 966 Arg Ser Asp Val Ser Glu Leu Glu Thr Trp Arg Asp Arg Phe Leu Gln 305 310 315 320 GCT ATC GAG AAT ATG TCC GTG ATG CTG CCC AAC GGT CGT CAA CTT CCC 1014 Ala Ile Glu Asn Met Ser Val Met Leu Pro Asn Gly Arg Gln Leu Pro 325 330 335 TTG GAT GAG GAG ACC GGC ATC GAC GTG CTG GGC AAC CTT ATG GAG TCC 1062 Leu Asp Glu Glu Thr Gly Ile Asp Val Leu Gly Asn Leu Met Glu Ser 340 345 350 TCC ATC ATC AGC AGG AAC CGA CCC TAC TAC GGC GAC CTC CAC AAC ATG 1110 Ser Ile Ile Ser Arg Asn Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Leu His Asn Met 355 360 365 GGA CAC GTC TTC ATC TCT TAC TCT CAT GAT CCT GAT CAT CGT CAT CTG 1158 Gly His Val Phe Ile Ser Tyr Ser His Asp Pro Asp His Arg His Leu 370 375 380 GAG CAA TTC GGC GTG ATG GGT GAC TCC GCG ACG GCC ATG CGG GAC CCC 1206 Glu Gln Phe Gly Val Met Gly Asp Ser Ala Thr Ala Met Arg Asp Pro 385 390 395 400 GTG TTC TAC CGC TGG CAC GCG TAC ATC GAC GAC ATT TTC CAC CTC TAC 1254 Val Phe Tyr Arg Trp His Ala Tyr Ile Asp Asp Ile Phe His Leu Tyr 405 410 415 AAG TAC AAG CTC ACG CCT TAC GGT AAC GAC AGG CTG GAC TTC CCC AAC 1302 Lys Tyr Lys Leu Thr Pro Tyr Gly Asn Asp Arg Leu Asp Phe Pro Asn 420 425 430 ATC AGG GTG TCG TCC GTC AGC ATC GAG GGT GGC GGA ACT CCC AAC ACG 1350 Ile Arg Val Ser Ser Val Ser Ile Glu Gly Gly Gly Thr Pro Asn Thr 435 440 445 CTG AAC ACG CTG TGG GAG CAG AGC ACC GTG GAC CTC GGC CGC GGA ATG 1398 Leu Asn Thr Leu Trp Glu Gln Ser Thr Val Asp Leu Gly Arg Gly Met 450 455 460 GAC TTC ACT CCT CGC GGC AGT GTC CTC GCC AGG TTC ACG CAC TTG CAG 1446 Asp Phe Thr Pro Arg Gly Ser Val Leu Ala Arg Phe Thr His Leu Gln 465 470 475 480 CAC GAC GAA TAC AAC TAT GTG ATT GAA GTG AAC AAC ACA GGA GGC AGC 1494 His Asp Glu Tyr Asn Tyr Val Ile Glu Val Asn Asn Thr Gly Gly Ser 485 490 495 AGC GTA ATG GGA ATG TTC AGG ATA TTC ATC GCG CCA ACA GTG GAC GAA 1542 Ser Val Met Gly Met Phe Arg Ile Phe Ile Ala Pro Thr Val Asp Glu 500 505 510 AGT GGG AAG CCA TTC TCC TTT GAC GAG CAA AGG AAA CTA ATG ATT GAA 1590 Ser Gly Lys Pro Phe Ser Phe Asp Glu Gln Arg Lys Leu Met Ile Glu 515 520 525 CTG GAC AAA TTC TCT CAA GGA GTG AAA CCT GGC AAC AAC ACA ATC CGA 1638 Leu Asp Lys Phe Ser Gln Gly Val Lys Pro Gly Asn Asn Thr Ile Arg 530 535 540 CGT AAG AGT ATA GAC TCC TCA GTG ACT ATA CCA TAC GAG AGA ACG TTC 1686 Arg Lys Ser Ile Asp Ser Ser Val Thr Ile Pro Tyr Glu Arg Thr Phe 545 550 555 560 CGC AAC CAG GCG GAC CGG CCA GCA GAT CCA GGA ACC GCT GGG GCT GCC 1734 Arg Asn Gln Ala Asp Arg Pro Ala Asp Pro Gly Thr Ala Gly Ala Ala 565 570 575 GAG TTC GAC TTC TGC GGC TGC GGG TGG CCT CAC CAC ATG CTG GTG CCC 1782 Glu Phe Asp Phe Cys Gly Cys Gly Trp Pro His His Met Leu Val Pro 580 585 590 AAG GGA ACT ACT CAA GGA TAT CCT ATG GTG CTG TTC GTC ATG GTG TCC 1830 Lys Gly Thr Thr Gln Gly Tyr Pro Met Val Leu Phe Val Met Val Ser 595 600 605 AAC TGG AAT GAT GAC CGG GTG GAG CAA GAC CTG GTG GGG TCG TGC AAT 1878 Asn Trp Asn Asp Asp Arg Val Glu Gln Asp Leu Val Gly Ser Cys Asn 610 615 620 GAT GCG GCG TCG TAC TGC GGC ATC CGC GAC CGC AAG TAC CCG GAC CGG 1926 Asp Ala Ala Ser Tyr Cys Gly Ile Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asp Arg 625 630 635 640 CGC GCC ATG GGC TTC CCG TTC GAC CGG CCC GCG CCC GCC GCC ACC ACG 1974 Arg Ala Met Gly Phe Pro Phe Asp Arg Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr 645 650 655 CTG TCC GAC TTC CTG CGC CCC AAC ATG GCC GTG CGC GAC TGC ATC GTG 2022 Leu Ser Asp Phe Leu Arg Pro Asn Met Ala Val Arg Asp Cys Ile Val 660 665 670 CGC TTC ACC GAC AGG ACC CGC CAG CGC GGC CAG CAG GGG TAGGTCTGTC 2071 Arg Phe Thr Asp Arg Thr Arg Gln Arg Gly Gln Gln Gly 675 680 685 GCCTCCTCCA CCACGCAACA CAACATCACG GGATGACGGG TCTTGACTTT TTTGCACATA 2131 ATTTCTCTTT AATACATACA AACATGCATC GGGTTTTTTT ATTAACTGGA CTATGTAGCG 2191 GTGGTGTGGT ACCCTGCACA TATAAATAAT TAAAAAAACA AATTGACGGC TTATCTATCC 2251 AAGAGACATA TTATGGTAAT AGTCGACTTG ATGTTGTAGT TACTAATAAA GGAAAACTCT 2311 TTTTGGTTCT GTTGGTTTTT CTATAAGAAA AAGACAAAAA GTTACACGGA CTTTGTACTA 2371 CTTTTTTCGA ACTTTTGAAA TGATTAATTT AAATATGATT CCTTTAAACA TTAAATATTC 2431 AAAAAAGGTT TTTCTGTTTG TATCTCAAAC CGGATTATAA AAATAAATCA CACTGCTTAA 2491 AGAATACGGT TAAACTCATT TCAACACAAT GTATCATATT GTAATTAGCA AAATTGTATT 2551 CTTGAAATAA ATCATCATCA TTATTGGGCT ATATCAGTCC ACTGTTGGAT ACAGACTACG 2611 AATACTAAAA CTATGGAACA GTAACTCGCC TTCAATTGCA CTTTAGATTA TGGTTCCATT 2671 TACGCACACA AATAAAAGCA AATACAACGA ACACTCACAC TCTTTCATAA ACAAACACTT 2731 GCACGTGATT GGTCGCGCCA AGGTCACGGT TCGCAAGCGC CACCCAGCGC ACCCTTATGA 2791 CGATGACGTT ATGCAGTAGT AATTAATTCA TTAAATATTT TCTCGTTTTT TTATTAGATG 2851 ACTTTATTAC TGCAATAAAA ATAAATGCAG TTTATAAGTT AGTACATGAG ATGAAACTAT 2911 GATAATTAAA CTTAAAATCA ATACTACTAT TACTACTACT ACTACTAGTA TACCTTTTCT 2971 AAAGTACACG ACTTCCACTT TCAAGTATGT ACATGGCCTC TTTTTGAAAG TGTATGCTGC 3031 ATATTGTGGT ATTTTTGCAA TGCGTCCAAT TTATTTCATT TCTTTCCAAG CGTACTATCA 3091 CAAGCGGCTA TCCATTTTTT ACGTTGAATT TCATTTGTCG GATATCTGCA GTAATAAAAT 3151 TATTTGTTAT CGCTGCATAA TATCATACTT GTTACTTAAA TAAAACTTAT GTTTTATCCG 3211 AGCAGAATAA AGAACTACTA CAGCATAGAA AAAGTAATCG TACATATTGC ATAACACTAT 3271 CCATCATCAA TAGTATGAAA TTTTACGATG TTTGTATACT TACTTATGAA AGTTAATTTC 3331 ACTGTTTTTC ATATCTGTAT GGCTTTTACA CCATTTCACG ACACACGATT GCATACTTGC 3391 AAAATTAAAA AGCGCAAAAT AATAATTATC TGCTCAACCG AAAACTGACG CAACACGACC 3451 GCACGACACG AGTGCCACAG CGAACTGGCG CGCCGTTCTG TAGCTATTTT AAGCCCCGCC 3511 CTCCGCGGTA GCTATTTACG TGGAACCATT TTTGAAGCGC AATTACTTTT CTATAGTTTT 3571 ATTATTCGTA GGATATAGGT CTCTCACAAA AAAAAAA 3608

【００５５】配列番号：３配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：Bombyx mori 配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ配列 Asn Asn Leu Leu Leu Phe Phe Asp Arg Pro Ser Glu Pro Cys Phe 1 5 10 15 Met Gln Lys 18

【００５６】配列番号：４配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：Bombyx mori 配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ配列 Gly Glu Glu Asn Ala Val Phe Glu Ile Pro Asp Asn Tyr Tyr Pro 1 5 10 15 Glu Lys 17

【００５７】配列番号：５配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：Bombyx mori 配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ

【００５８】配列番号：６配列の長さ：２８配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：Bombyx mori 配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ配列 Gly Glu Asn Asn Ser Val Phe Gln Leu Thr Glu Gln Phe Leu Thr 1 5 10 15 Glu Asp Tyr Ala Asn Asn Gly Ile Glu Leu Asn Asn Arg 20 25 28

【００５９】配列番号：７配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：Bombyx mori 配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ

【００６０】配列番号：８配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：Bombyx mori 配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＰ０１７クローンの制限酵素地図を示す図で
ある。

【図２】ｐＰ０５Ｎクローンの制限酵素地図を示す図で
ある。

【図３】ｐｒｏＰＯクローンであるｐＰ０１７およびｐ
Ｐ０５Ｎのスクリーニングおよびβ−ガラクトシダーゼ
との融合タンパク質発現システムの構築スキームを示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (56)参考文献ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍ．, 1980年，10，ｐ．37−47 ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，1971年，Ｖｏｌ．144，ｐｐ. 749−62 ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，1995年，Ｖｏｌ．320 （１），ｐｐ．14−23 ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍ．, 1988年，Ｖｏｌ．18，ｐｐ．11−19 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 9/99 ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＰｕｂＭｅｄＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも下記に示されるアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列に於いて１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有
するプロフェノールオキシダーゼ。
【請求項２】下記に示されるアミノ酸配列、又は該ア
ミノ酸配列に於いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項１
記載のプロフェノールオキシダーゼ。
【請求項３】少なくとも下記に示されるアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列に於いて１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有
するプロフェノールオキシダーゼ。
【請求項４】下記に示されるアミノ酸配列、又は該ア
ミノ酸配列に於いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項３
記載のプロフェノールオキシダーゼ。
【請求項５】請求項１又は２に記載のプロフェノール
オキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項６】少なくとも下記に示される塩基配列、又
は該塩基配列に於いて１若しくは数個の塩基が欠失、置
換若しくは付加された塩基配列を有する請求項１又は２
に記載のプロフェノールオキシダーゼをコードするＤＮ
Ａ。
【請求項７】下記に示される塩基配列、又は該塩基配
列に於いて１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加された塩基配列を有する請求項２記載のプロフェノ
ールオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項８】請求項３又は４に記載のプロフェノール
オキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項９】少なくとも下記に示される塩基配列、又
は該塩基配列に於いて１若しくは数個の塩基が欠失、置
換若しくは付加された塩基配列を有する請求項３又は４
に記載のプロフェノールオキシダーゼをコードするＤＮ
Ａ。
【請求項１０】下記に示される塩基配列、又は該塩基
配列に於いて１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しく
は付加された塩基配列を有する請求項４に記載のプロフ
ェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】少なくとも下記に示されるアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列に於いて１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有
するフェノールオキシダーゼ。
【請求項１２】少なくとも下記に示されるアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列に於いて１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有
するフェノールオキシダーゼ。
【請求項１３】請求項１１に記載のフェノールオキシ
ダーゼをコードする遺伝子。
【請求項１４】少なくとも下記に示される塩基配列、
又は該塩基配列に於いて１若しくは数個の塩基が欠失、
置換若しくは付加された塩基配列を有する請求項１１に
記載のフェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１２に記載のフェノールオキシ
ダーゼをコードする遺伝子。
【請求項１６】少なくとも下記に示される塩基配列、
又は該塩基配列に於いて１若しくは数個の塩基が欠失、
置換若しくは付加された塩基配列を有する請求項１２に
記載のフェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１７】請求項５〜１０及び請求項１３〜１６
のいずれか１の請求項に記載のＤＮＡを含有する組換え
ベクター。
【請求項１８】請求項１７記載の組換えベクターで形
質転換された宿主細胞。
【請求項１９】請求項１８記載の宿主細胞を培地で培
養し、得られる培養物からプロフェノールオキシダーゼ
を採取することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１
の請求項に記載のプロフェノールオキシダーゼの製造方
法。
【請求項２０】請求項１８記載の宿主細胞を培地で培
養し、得られる培養物からフェノールオキシダーゼを採
取することを特徴とする請求項１１又は１２のいずれか
１の請求項に記載のフェノールオキシダーゼの製造方
法。
【請求項２１】家蚕由来のプロフェノールオキシダー
ゼをプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素とともにイ
ンキュベートし、得られた反応液をオクタデシルで修飾
したシリカゲルを担体とする逆相クロマトグラフィーで
処理して、主要な２つのポリペプチド分画と数種のペプ
チド断片を得て、それぞれのアミノ酸配列を決定し、こ
れらのアミノ酸配列と、別途、家蚕由来のプロフェノー
ルオキシダーゼのクローンスクリーニングから得られた
数種のクローンに由来するアミノ酸配列とを対比して、
その相同性からプロフェノールオキシダーゼのアミノ酸
配列を決定する方法。