JPH0923886A - 家蚕由来のプロフェノールオキシダーゼおよびフェノールオキシダーゼ、そのｄｎａならびにその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくとも実質的に配列番号１のＰｈｅ⁵²〜
Ｇｌｙ⁶⁸⁵ のアミノ酸配列を有するフェノールオキシダ
ーゼ(PO)並びにプロフェノールオキシダーゼ(proPO) 、
実質的に配列番号１に示すアミノ酸配列を有するproPO
。これら酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有す
るベクター、該ベクターで形質転換された細胞宿主、該
細胞宿主を培養することによるproPO およびPOの製造
法。 【効果】 本発明により家蚕由来のproPO およびPOの一
次構造及びそれをコードする塩基配列が明らかになっ
た。当該POは新規な標識酸化酵素として有用である。ま
たproPO の一次構造の解明は、微生物の検出（β-1,3-G
及びPG測定）に応用可能なproPO 活性化系の再構成に寄
与する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、家蚕由来のプロフェノ
ールオキシダーゼ（以下、ｐｒｏＰＯという）及びフェ
ノールオキシダーゼ（以下、ＰＯという）、それをコー
ドする遺伝子、その遺伝子を含有する組換えベクター、
該組換えベクターで形質転換された宿主細胞および該宿
主細胞を培養することによるｐｒｏＰＯならびにＰＯの
製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】昆虫体液には、体液のメラニン化に関与
するプロフェノールオキシダーゼ活性化系（以下ｐｒｏ
ＰＯ活性化系という。）と呼ばれる一連の酵素群からな
るカスケード系が存在しており、皮膚が傷ついたとき傷
口を修復する外傷の修復、外因性物質をメラニン層で包
囲する等の生体防御作用あるいはメラニンによる体色の
黒色化などに深く関与していると考えられている〔G.A.
Kerkut & L.I.Gilbert "Comprehensive Insect Physiol
ogy Biochemistry and Pharmacology" Pergamonress, O
xford,1985〕。当該カスケード系は、微生物細胞壁構成
成分であるβ−１，３−グルカン（以下、β−１，３−
Ｇと呼ぶ。）またはペプチドグリカン（以下、ＰＧと呼
ぶ。）によって引き金が引かれ、その後Ｃａ²⁺を要求す
る未解明の酵素による幾つかの反応ステップを経てｐｒ
ｏＰＯ活性化酵素（以下ＰＰＡＥと呼ぶ。）を生成す
る。そして該ＰＰＡＥは、ｐｒｏＰＯに働いて当該酵素
のｐｒｏ配列を切断することにより本カスケード系の最
終酵素であるＰＯを生成する。

【０００３】かくして生成されるＰＯは、チロシンやド
ーパを酸化して黒色のメラニンを合成する酸化酵素であ
る〔Ochiai,M. and Asida,M. (1988) J.Biol.Chem., 26
3, 12056-12062, Yoshida,H. Doctoralthesis, Univers
ity of Tokyo〕。従って、ＰＯの大量取得により、メラ
ニンによる呈色反応を触媒する新規な標識酸化酵素とし
ての利用が期待される。また、上述のｐｒｏＰＯ活性化
系カスケードは、数ｎｇ／ｍｌという僅かなβ−１，３
−Ｇ又はＰＧの存在で活性化されることから、当該β−
１，３−ＧやＰＧを細胞壁の構成成分としている真菌類
及び微生物の微量検出に有用であり、医薬品等の安全性
試験、水や食品等の微生物試験、感染症の診断などへの
応用が期待される（特開昭63-141598 号、特開昭63-141
599 号公報）。このｐｒｏＰＯ活性化系カスケードを構
成する酵素の全容は未だ十分解明されておらず、当該カ
スケード系の一構成酵素であるｐｒｏＰＯの構造および
反応機構の解明は、この系の解明に一役を果たす。さら
に、他の構成酵素の解明によりこれら酵素群によるカス
ケード系の再構成が可能となる結果、真菌類及び微生物
の微量検出が実現できるであろう。

【０００４】ｐｒｏＰＯは昆虫に広く存在しており、そ
の幾つかについて単離精製されている〔家蚕（M.Ashid
a, (1971) Arch.Biochem.Biophys., 144, 749）、タバ
コスズメガ（Y.Aso, K.J.Kramer, T.L.Hopkins & G.L.L
ookhart (1985), Insect Biochem., 15, 9）、チャイロ
コメノゴミムシダマシ（R.A.Heyneman (1965), Bioche
m.Biophys.Res.Commun., 21, 16）、家バエ（T.Tsukamo
to, M.Ishiguro & M.Funatsu (1986), Insect Bioche
m., 16, 573）等〕。しかしながら、それら昆虫のｐｒ
ｏＰＯの一次構造は解明されていなかった。

【０００５】従って従来、昆虫由来のｐｒｏＰＯを取得
する手段としては、昆虫の体液から上述の文献に基づい
て単離精製する方法しかなかった。しかし、カスケード
構成酵素であるｐｒｏＰＯを昆虫体液中より単離するに
は、ｐｒｏＰＯの加水分解を防ぐべくｐｒｏＰＯ活性化
系のカスケード反応を不活化させた状態で行わなければ
ならない一方、僅かな微生物細胞壁構成成分（β−１，
３−Ｇ、ＰＧ）の存在により当該カスケードは活性化さ
れてしまうため、ｐｒｏＰＯを家蚕体液中より単離精製
することは技術的に大変困難であった。さらに、大量の
ｐｒｏＰＯを単離精製するには大量の昆虫が必要であ
り、ｐｒｏＰＯの工業的応用を図るべくｐｒｏＰＯの大
量取得は困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこでｐｒｏＰＯおよ
びＰＯの産業上の利用性を高めるため、遺伝子組換え技
術により家蚕由来のｐｒｏＰＯ並びにＰＯを簡単にかつ
大量に製造することが待望されている。本発明は、この
ような遺伝子技術による製造に必要かつ有用な家蚕由来
のｐｒｏＰＯおよびＰＯの一次構造を示すアミノ酸配
列、それをコードするｍＲＮＡおよびＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含むベクターおよび該ベクターを導入した形質転換体
を提供することを目的とする。更に、本発明はこれらの
発現系を用いた家蚕由来のｐｒｏＰＯおよびＰＯの製造
方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、先に家蚕血球細胞
中のｐｒｏＰＯをコードする２種類のｃＤＮＡのクロー
ン化、及び該ｃＤＮＡの塩基配列からｐｒｏＰＯの一次
構造の決定に成功し、それらに基づいたＰＯ並びにｐｒ
ｏＰＯのアミノ酸配列、それらの酵素をコードする遺伝
子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターで
形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することに
よるｐｒｏＰＯの製造方法についての特許出願をしてい
る（特願平６−８５０９６号）。本発明者らは、更に鋭
意研究を進めた結果、上記２種類のクローンとは若干異
なる３番目の家蚕由来のｐｒｏＰＯをコードするｃＤＮ
Ａのクローン化に成功し、そのｃＤＮＡの塩基配列から
ｐｒｏＰＯの一次構造の決定に成功して本発明を完成さ
せた。

【０００８】すなわち、本発明は、少なくとも実質的に
配列表配列番号１のＰｈｅ⁵²〜Ｇｌｙ⁶⁸⁵ のアミノ酸配
列を有するＰＯ並びにｐｒｏＰＯ、実質的に配列表配列
番号１に示されるアミノ酸配列を有するｐｒｏＰＯに関
する。また、本発明はこれらの酵素をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該ベクターで
形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することに
よるｐｒｏＰＯおよびＰＯの製造方法に関する。

【０００９】本発明のｐｒｏＰＯは、家蚕由来のＰＯの
前駆体であり、ＰＰＡＥによって切断される部位を有す
る分子量約８０，０００の銅蛋白質である〔０．１５〜
０．１６％の銅を含有。２Ｃｕ原子／80,000g タンパク
質〕。さらに、本発明のｐｒｏＰＯは少なくとも実質的
に配列表配列番号１のＰｈｅ⁵²〜Ｇｌｙ⁶⁸⁵ のアミノ酸
配列を有するポリペプチドであり、好ましくは実質的に
配列表配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチドである。ここで「実質的に」とは、本発明の
酵素が後記配列表に示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドに限定されない趣旨である。すなわち、ポリペ
プチドが家蚕由来のｐｒｏＰＯと同等な免疫学的もしく
は生物学的活性（例えば、ＰＰＡＥによって活性化され
る性質等）を有する限り、後記配列表で示されるアミノ
酸配列中のアミノ酸の幾つかについて欠失，置換，付加
等があってもよい意味である。

【００１０】また、本発明のＰＯは、チロシンやドーパ
を酸化してメラニンを合成する触媒活性を有する酵素で
あり、その一次構造として実質的に配列表配列番号１の
Ｐｈｅ⁵²〜Ｇｌｙ⁶⁸⁵ のアミノ酸配列が挙げられる。こ
こで「実質的に」とは、前述のｐｒｏＰＯと同様に家蚕
由来のＰＯと同等な免疫学的もしくは生物学的活性（例
えば、ＰＯ活性等）を有する限り、後記配列表で示され
るアミノ酸配列中のアミノ酸の幾つかについて欠失，置
換，付加等があってもよい意味である。すなわち、本発
明のＰＯには、配列表配列番号１のＰｈｅ⁵²〜Ｇｌｙ
⁶⁸⁵ のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および該ポ
リペプチドと同等の家蚕由来のＰＯ活性を有するポリペ
プチドが全て包含される。

【００１１】本発明のｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡ
は、ｐｒｏＰＯをコードしうるものであればいかなるも
のでもよい。具体的には、配列表配列番号１で示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
および該ポリペプチドと同等の生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ等が挙げられる。より具体
的には、配列表配列番号１の少なくとも２９２〜２１９
３で示される塩基配列を含有するＤＮＡ、好ましくは同
配列表の１３９〜２１９３で示される塩基配列を含有す
るＤＮＡを挙げることができる。また、１つのアミノ酸
に対して複数のコドンが対応することを考慮し、当該Ｄ
ＮＡには、前述の塩基配列のうち１つ以上の塩基が他の
塩基に置換された塩基配列を有するものも含まれる。本
発明のｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡは、いかなる方法
で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調
製される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから
調製されるＤＮＡ、ポリメラーゼチェイン反応法（ＰＣ
Ｒ法）により増幅断片として得られるＤＮＡ、化学合成
によって得られるＤＮＡ、およびこれらを適当に組み合
わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
尚、本発明のｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡは、該ＤＮ
Ａに相応するＲＮＡ、例えばｍＲＮＡで代用することも
可能な場合があることは言うまでもない。

【００１２】また本発明のＰＯをコードするＤＮＡは、
前述の家蚕由来のＰＯをコードするものであればいかな
るものでもよく、具体的には、配列表配列番号１に示さ
れる２９２〜２１９３の塩基配列を含有するＤＮＡを挙
げることができる。また、１つのアミノ酸に対して複数
のコドンが対応することを考慮し、当該ＤＮＡには、前
述の塩基配列のうち１つ以上の塩基が他の塩基に置換さ
れた塩基配列を有するものも含まれる。当該ＤＮＡは、
いかなる方法で得られるものであってもよく、例えばｍ
ＲＮＡから調製される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノ
ムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、ポリメラーゼチェイン
反応法（ＰＣＲ法）により増幅断片として得られるＤＮ
Ａ、化学合成によって得られるＤＮＡ、およびこれらを
適当に組み合わせて構築されるＤＮＡなどが挙げられ
る。尚、本発明のＰＯをコードするＤＮＡは、該ＤＮＡ
に相応するＲＮＡ、例えばｍＲＮＡで代用することも可
能な場合があることは言うまでもない。

【００１３】ｐｒｏＰＯ及びＰＯのｍＲＮＡ等のＲＮＡ
は、ｐｒｏＰＯ及びＰＯをそれぞれコードするＤＮＡの
塩基配列に対応するＲＮＡ配列を有するものである。す
なわち、前記ＲＮＡは、本発明のＤＮＡの塩基配列中、
チミンがウラシルに置換してなる配列を有する。

【００１４】本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯをコードす
るＤＮＡは、常法に従ってｐｒｏＰＯのｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離する
方法、化学合成する方法等により取得することができ
る。 (1) 例えば、ｐｒｏＰＯのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクロ
ーン化する方法としては、以下の方法が挙げられる。ま
ず、家蚕血球細胞などｐｒｏＰＯを産生する細胞から家
蚕ｐｒｏＰＯをコードするｍＲＮＡを、例えばグアニジ
ンチオシアネート法〔Chirgwin, J.M. et. al., Bioche
m., 18, 5294 (1979) 〕などの公知の方法で抽出する。
得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用
いる等の公知の方法〔例えばOkayama,H.らの方法｛Okay
ama,H. et. al., Mol.Cell.Biol.,2,161(1982)及び同誌
3,280(1983) ｝やGubler,U. とHoffman,B.J.の方法｛Gu
bler,H. and Hoffman,B.J., Gene,25,263(1983) ｝が挙
げられる。〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖
ｃＤＮＡへの変換を行う〔Maniatis, T ら, Cell, 8, 1
63 (1976) 〕。このｃＤＮＡをプラスミドベクターもし
くはファージベクターに組み込むことによって家蚕血球
ｃＤＮＡライブラリーを構築する。ここで用いられるプ
ラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるも
のであれば特に制限されず、また用いられるファージベ
クターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。
ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合
は、宿主内でｐｒｏＰＯ遺伝子を発現させうるプロモー
ターを有したベクターである必要がある。

【００１５】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば Maniatis,T.ら, モレキュラークローニン
グ，ア・ラボラトリー・マニュアル〔 (Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual), cold Spring Harbor Lab
oratory, 1, 82 (1982)〕に記載の方法などが挙げられ
る。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法
としては、Hyunh,T. V.らの方法〔Hyunh,T.V., DNA Cl
oning, apractical approach,1,49(1985) 〕などが挙げ
られる。このようにして得られる組換えプラスミドやフ
ァージベクターは原核細胞や真核細胞等の適当な宿主に
導入される。

【００１６】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、Maniatis,T. らモレキュラークローニング，ア・ラ
ボラトリー・マニュアル〔(Molecular Cloning, A Labo
ratoryManual), cold Spring Harbor Laboratory, 1, 8
2 (1982) 〕に記載のカルシウムクロライド法またはカ
ルシウムクロライド／ルビジウムクロライド法等が挙げ
られる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法
としては、ファージＤＮＡをインビトロパッケージング
した後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示され
る。

【００１７】上記の方法によって構築されたｃＤＮＡラ
イブラリーから該酵素をコードするＤＮＡを単離する方
法としては、下記の方法が例示される。例えば、別個に
ｐｒｏＰＯのアミノ酸配列に対応すると考えられるオリ
ゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを³²Ｐでラベ
ルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼ
ーション法〔Crunstein, M. and Hogness, D.S.: Proc.
Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961 (1975) 〕またはプラ
ークハイブリダイゼーション法〔Maniatis,T. et al.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, coldSpring
Harbor Laboratory, 2, 109 (1982)〕により、目的の
ＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする。ま
た、該ｐｒｏＰＯに対する抗体を作製した後、抗原抗体
反応を利用して目的のＤＮＡを含有するクローンを選択
する方法、或いは該酵素の特定領域をポリメラーゼチェ
イン反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該酵素をコー
ドする遺伝子の一部を単離する方法などがある。単離し
た結果、該酵素の全領域が取得されてない場合には、単
離したＤＮＡ断片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションまた
はプラークハイブリダイゼーションによって再度ｃＤＮ
Ａをクローニングすることにより、最終的に全遺伝子領
域を取得することができる。ＰＯをコードするＤＮＡ
は、得られたｐｒｏＰＯの全遺伝子領域からＰＯをコー
ドする部分を制限酵素等により切り出して取得すること
ができる。

【００１８】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560 (1977)
〕あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレ
オチド合成鎖停止の方法〔Messing, J. ら Nucleic Aca
ds Res, 9, 309 (1981) 〕によって決定し、ｐｒｏＰＯ
の存在を確認することができる。かくして得られるクロ
ーンからｐｒｏＰＯの遺伝子の全部または一部を制限酵
素等により切り出すことにより取得できる。

【００１９】(2) また、家蚕血球細胞のゲノムＤＮＡか
らｐｒｏＰＯまたはＰＯをコードするＤＮＡを単離する
ことによる調製方法としては、例えば以下の方法が挙げ
られる。家蚕血球を好ましくはＳＤＳまたはプロテナー
ゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復し
てＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはＲＮア
ーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素
により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファー
ジまたはコスミド中で増幅し、そして目的の配列を有す
るクローンを例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを
用いる方法等により検出し、該クローンからｐｒｏＰＯ
またはＰＯの遺伝子の全部または一部を制限酵素等によ
り切り出し取得する。

【００２０】(3) さらに、ｐｒｏＰＯをコードするＤＮ
Ａは、配列表配列番号１に示される１３９〜２１９３の
塩基配列を化学的手法により合成することにより取得で
きる。一方、ＰＯをコードするＤＮＡについても同様
に、配列表配列番号１に示される２９２〜２１９３の塩
基配列を化学合成することによって取得することができ
る。

【００２１】本発明の組換えベクターは、上述のｐｒｏ
ＰＯをコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、お
よびＰＯをコードするＤＮＡを含有する組換えベクター
である。当該ベクターとしては、原核細胞及び／または
真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖でき
るものであれば特に制限されず、プラスミドベクターお
よびファージベクターが包含される。本発明の組換えベ
クターは、簡便には当業界において入手可能なベクタ
ー、好ましくはプラスミドベクターまたはバクテリオフ
ァージベクターに、ｐｒｏＰＯをコードするＤＮＡまた
はＰＯをコードするＤＮＡを常法により組み込むことに
より調製することもできる。かかるベクターとして、具
体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR32
2, pBR325, pUC12, pUC13など、酵母由来プラスミドと
して例えばpSH19, pSH15など、枯草菌由来プラスミドと
して例えばpUB110,pTP5, pC194 などが挙げられる。ま
た、ファージとしては、λファージなどのバクテリオフ
ァージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイル
ス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルスが例
示される。

【００２２】ｐｒｏＰＯ遺伝子またはＰＯ遺伝子を発現
させ、これら蛋白質を生産させる目的においては、発現
ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細
胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でｐｒｏ
ＰＯ遺伝子またはＰＯ遺伝子を発現し、これら蛋白質を
生産する機能を有するものであれば特に制限されない。
宿主細胞として細菌、特にE. coli を用いる場合、一般
に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレータ
ー領域，開始コドン，本発明のｐｒｏＰＯもしくはＰＯ
をコードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネーター領域
および複製可能単位から構成される。宿主として酵母ま
たは動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくとも
プロモーター，開始コドン，本発明のｐｒｏＰＯもしく
はＰＯをコードするＤＮＡ，終止コドンを含んでいるこ
とが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ，エンハンサー配列，本発明のｐｒｏＰＯもしくはＰ
ＯをコードするＤＮＡの５’側および３’側の非翻訳領
域，スプライシング接合部，ポリアデニレーション部位
または複製可能単位なども発現ベクターに組み込むこと
が可能である。

【００２３】細菌中で本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯを
発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、
プロモーター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(S
D) 配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。
例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐ
プロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモー
ター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーターなどを
含むものが挙げられる。酵母中で本発明のｐｒｏＰＯま
たはＰＯを発現させるためのプロモーターとしては、Ｐ
Ｈ０５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロ
モーター，ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチ
ルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター，ＳＰ０２プ
ロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。
また、宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４
０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモータ
ー，ヒートショックプロモーター、核多角体ウイルスの
有するポリヘドリンプロモーターなどが挙げられる。し
かし、特にこれらに限定されるものではない。また、発
現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。

【００２４】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。終止コドンとしては、常
用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示
される。ターミネーター領域としては、天然または合成
のターミネーターが挙げられる。複製可能単位とは、宿
主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる機
能をもつＤＮＡをいい、天然のプラスミド，人工的に修
飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製された
ＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれ
る。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミ
ドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３
２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグ
メント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵
母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpR
SVneo ATCC 37198, プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145,
プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224,プラスミドpSV2ne
o ATCC 37149等があげられる。

【００２５】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列（７２ｂｐ）、ポリオーマ，アデノ，パ
ピローマ等のＤＮＡ腫瘍ウイルス、レトロウイルスＬＴ
Ｒ（Long Terminal Repeat）、免疫グロブリンＨ鎖，Ｌ
鎖遺伝子などが例示される。

【００２６】発現ベクターは、プロモーター，開始コド
ン，本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯをコードするＤＮ
Ａ，終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ
環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製
することができる。またこの際、所望により制限酵素で
の消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等
の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リン
カー、他のレストリクションサイトなど）を用いること
ができる。

【００２７】本発明の形質転換体（以下、形質移入体を
包含する概念で用いる）は、上述の発現ベクターを宿主
細胞に導入することにより調製することができる。宿主
細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリ
キア属菌、バチルス属菌），酵母（例えば、サッカロマ
イセス属など），動物細胞および昆虫細胞など〕が挙げ
られる。具体的には、エシェリキア属菌ではエシェリキ
ア・コリ（Escherichia coli）K12DH1, M103, JA221, H
B101, C600, XL-1 Blue, JM109などが例示される。バチ
ルス属菌ではバチルス・サチリス（Bacillus subtilis)
MI114, 207-21 などが挙げられる。酵母としてはサッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae) A
H22, AH22R^- , NA87-11A, DKD-5Dなどが挙げられる。動
物細胞としてはサル細胞COS-7, Vero,チャイニーズハム
スター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒトＦＬ細胞などが
挙げられる。昆虫細胞としてはBmN4, Sf9 などが挙げら
れるが、特にこれらに限定されるものではない。宿主細
胞として、一般にＤＮＡ配列のクローニングおよびベク
ターの組立てのためには原核細胞が好ましい。組立てら
れたベクターは、次に適当な宿主細胞に形質転換され、
この場合原核細胞および真核細胞を使用することができ
る。

【００２８】発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転
換（形質移入を含む）〕は従来公知の方法を用いて行う
ことができる。細菌（例えば、E. coli やBacillus sub
tilis)の場合は、例えばCohen らの方法〔Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.,(1972) 69,2110〕、プロトプラスト法
〔Mol.Gen.Genet.,(1979)168,111〕またはコンピテント
法〔J.Mol.Biol.,(1971)56,209〕等によって、Saccharo
myces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1978)75,1927 〕やリチウム
法〔J.Bacteriol.,(1983)153,163〕等によって、動物細
胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virology,(1973)52,
456 〕等によってそれぞれ形質転換することができる
が、特にこれらに限定されるものではない。

【００２９】本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯは、上記の
如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培
地で培養することによって製造することができる。栄養
培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素
源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが
好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキス
トラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源も
しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，
硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプト
ン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液な
どが挙げられる。また所望により他の栄養素〔例えば、
無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウ
ム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例え
ばアンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいて
もよい。

【００３０】培養は当業界において知られている方法に
より行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよ
び醗酵時間は、ｐｒｏＰＯまたはＰＯの最高力価が得ら
れるように適宜選択される。なお、下記に宿主細胞に応
じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示する
が、本発明は何らこれらに限定されるものではない。宿
主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上
記栄養源を含有する液体培地が適当である。その際、ｐ
Ｈが５〜８であることが望ましい。宿主がE. coli の場
合、好ましい培地としてＭ９培地〔Miller.J.Exp.Mol.G
enet.,(1972)p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,Ne
w York〕が例示される。かかる場合、培養は、必要によ
り通気，攪拌をしながら、通常１４〜４２℃、好ましく
は２８〜３９℃、約３〜２４時間行うことができる。宿
主がBacillus属菌の場合、必要により通気，攪拌をしな
がら、通常１４〜４２℃、好ましくは２８〜３９℃、約
３〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場
合、培地として、例えばBurkholder最小培地〔Bostian.
K.L. et.al(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4505
〕が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。
培養は通常１４〜４２℃、好ましくは２０〜３５℃で約
１２時間〜１０日間行なわれ、必要により通気や攪拌を
行うこともできる。宿主が動物細胞の場合、培地として
例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Sc
ience (1952)122,501 〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,(19
59)8,396〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔J.Am.Med.Assoc.,
(1967)199,519 〕，１９９培地〔proc.Soc.Exp.Biol.Me
d.,(1950)73,1 〕等を用いることができる。培地のｐＨ
は約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４
０℃、好ましくは３４〜３８℃で約１２〜７２時間行な
われ、必要に応じて通気や攪拌を行うこともできる。宿
主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's
培地〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,8404〕等が
挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培
養は通常約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃で約
１２時間〜１０日間行なわれ、必要に応じて通気や攪拌
を行うこともできる。

【００３１】本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯは、上記培
養により得られる培養物より以下のようにして取得でき
る。すなわち、本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯが、培養
物のうち培養液中に存在す場合は、得られた培養物を濾
過または遠心分離等の方法で培養濾液または培養上清を
得、該培養濾液または培養上清から、天然または合成蛋
白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法
に従ってｐｒｏＰＯまたはＰＯを精製、単離する。単
離，精製方法としては、例えば塩析，溶媒沈澱法等の溶
解度を利用する方法、透析，限外濾過，ゲル濾過，ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。

【００３２】一方、本発明のｐｒｏＰＯまたはＰＯが培
養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存
在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法
に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁
し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法
で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、
遠心分離やろ過などの方法でｐｒｏＰＯまたはＰＯを含
有する粗抽出液を得る。そして、当該粗溶出液を、先に
例示したような常法を用いることにより、単離，精製す
ることができる。

【００３３】また、本発明のＰＯは、上述の如く方法に
より調製されるｐｒｏＰＯ産生性形質転換体の培養物ま
たはその処理物（ｐｒｏＰＯを含有する粗抽出物，精製
ｐｒｏＰＯ等）にＰＰＡＥを作用させることによっても
製造することができる。すなわち、配列表配列番号１で
示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号５１番目のアル
ギニンとアミノ酸番号５２番目のフェニルアラニンとの
間の結合がＰＰＡＥにより切断されることによりＰＯが
生成する。かかる方法によるＰＯの製造は、ｐｒｏＰＯ
産生性形質転換体の培養物またはその処理物をＰＰＡＥ
の存在下に置くことで達成し得るが、好適には両者を
０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩
衝液のもと、ｐＨ６〜１０、温度０〜５５℃の条件下で
１秒〜６０分間反応させることによって行われる。

【００３４】

【発明の効果】本発明は、家蚕由来のｐｒｏＰＯおよび
ＰＯのアミノ酸配列、該配列を有する酵素をコードする
ＤＮＡの塩基配列を明らかにするものである。かかるア
ミノ酸配列および塩基配列の解明に基づいて、本発明は
遺伝子工学的手法によるｐｒｏＰＯおよびＰＯの製造法
およびこれに関連する発現系を提供する。本発明の方法
によれば、従来取得の困難であったｐｒｏＰＯおよびＰ
Ｏを容易にかつ大量に取得することができる。かくして
得られるＰＯは、メラニン合成という黒色を呈する反応
の触媒作用を有することから新規な標識酸化酵素として
有用である。また本発明のｐｒｏＰＯは、家蚕ｐｒｏＰ
Ｏ活性化系の一構成酵素であり、この一次構造の解明に
より、微生物の検出（β-1,3-G及びPG測定）に応用可能
なｐｒｏＰＯ活性化系の再構成に寄与する。また、ＰＯ
を製造するための原料として有用である。

【００３５】

【実施例】以下の実施例において、プラスミド，制限酵
素のような酵素，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び他の物質は市
販のものであり、常法に従って使用することできる。Ｄ
ＮＡのクローニング，宿主細胞の形質転換，形質転換体
の培養，得られる培養物からのｐｒｏＰＯまたはＰＯの
採取，精製等に用いられた操作についても当業者によく
知られているものであるか、文献により知ることのでき
るものである。

【００３６】以下に参考例，実施例を挙げるが、本発明
はかかる記載により何ら限定されるものではない。

【００３７】参考例１ 家蚕ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認
識切断部位のアミノ酸配列の決定 （１）家蚕ｐｒｏＰＯの精製 家蚕５令幼虫より得られたヘモリンパ約２００ｍｌに飽
和硫安水溶液（ｐＨ６．５）を加えて７０％飽和硫安溶
液とし、４℃で一晩静置した。それに０．２Ｍのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて４０％飽和硫安
溶液とした。２時間ゆっくり攪拌後静置し、８０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離（日立ＲＰＲ９−２ロータを使
用、以下これに同じ。）して上清を得た。この上清に飽
和硫安水溶液（ｐＨ６．５）を加え５０％飽和硫安溶液
とし、３０分攪拌後一晩静置した。これをさらに８００
０ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈澱を得た。この沈澱
を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）−２０
％飽和硫安（ｐＨ６．５）に溶解して、さらに飽和硫安
水溶液（ｐＨ６．５）を加えて３８％飽和硫安溶液とし
た。当該溶液を１時間攪拌して２．５時間静置した後、
１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を得た。
この上清に飽和硫安水溶液（ｐＨ６．５）を加えて４８
％飽和硫安溶液とした。これを３０分間攪拌後一晩静置
し、８０００ｒｐｍで２０分間遠心して沈澱を得た。こ
の沈澱を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶解して、
同緩衝液中で透析した。

【００３８】透析を終えた試料を１２０００ｒｐｍ，２
０分間遠心後、得られた上清を６５℃水浴中で攪拌しな
がら５４．５℃に下がるまで加温し、５５℃水浴中で５
分間さらに加温した。氷で急冷後、１８０００ｒｐｍで
２０分間遠心し上清を得た。この上清をＤＥＡＥセルロ
ースカラムクロマトグラフィー（和光純薬工業製、φ1.
5×19cm）に付し、ＫＣｌのグラジエントで溶出させて
分画を行った。各分画について粗ＰＰＡＥを使って活性
化後現れるＰＯ活性の有無を調べることによりｐｒｏＰ
Ｏを含有する画分を集めた。なお、画分中のＰＯ活性
は、０．０２ＭL-3,4-dihydroxyphenylalanine １ｍ
ｌ，０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３．９ｍｌ
及び粗ＰＰＡＥ処理した画分０．１ｍｌを混合し、３０
℃で５分間インキュベーションした後、４９０ｎｍの吸
光度を測定することによって検出した（１ユニットはＯ
Ｄ₄₉₀ を０．０１上昇させる活性と定義。）。次いで集
めたｐｒｏＰＯ画分を０．０４Ｍ ＫＣｌ−０．０１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析した。さ
らにこの試料をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィー（和光純薬工業株式会社製、φ 1.5×9.3cm ）
に付し、５０ｍＭ，７５ｍＭ，９５ｍＭの各リン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出させて得られた各分画
中のＰＯ活性を先述の様に調べた。その結果、５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）画分中にｐｒｏＰ
Ｏの溶出を確認し、当該画分を集めた。この画分をザル
トリウス社のCollodion Bag(SM13200)で濃縮し、０．０
１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．７５）中で透析し、精
製ｐｒｏＰＯ溶液とした。

【００３９】（２）ＰＰＡＥの精製 家蚕５令幼虫の表皮より得たホモジネートを硫安分画
し、そのうち０．２〜０．４％飽和硫安画分を集め、
０．０１Ｍトリス塩酸−０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂ 、ｐＨ
８．５）で透析した後、さらに０．０１Ｍトリス塩酸
（ｐＨ８．５）中でさらに透析した。これをＤＥＡＥセ
ルロースカラムに掛け、０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ
８．５）で溶出した。このうちＰＰＡＥ活性を示す分画
を集め、これをさらにヒドロキシアパタイトカラムに掛
けて０．０１Ｍ Ｋ−ＰＯ₄ （ｐＨ７．５）で洗浄後、
０．０１〜０．５Ｍ Ｋ−ＰＯ₄ （ｐＨ７．５）のリニ
アグラジエントで溶出した。そのうちＰＰＡＥ活性を示
す分画を集めて精製ＰＰＡＥ溶液とした。

【００４０】（３）ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯが切断
されて得られるペプチド断片のアミノ酸配列分析 上記精製ｐｒｏＰＯを精製ＰＰＡＥと共にインキュベー
ションし、その反応溶液をセファデックスＧ−５０カラ
ムに掛け、０．０１Ｍ Ｋ−ＰＯ₄ (pH8.0) で溶出し、
ｐｒｏＰＯから切断され遊離してくるペプチド鎖を集め
た。このペプチド鎖をまずＯＤＳカラムにより３種類の
フラグメント（ｆＩ，ｆII，ｆIII ）に分けることがで
きた。これらをそれぞれリジルエンドペプチダーゼ処理
して断片化した後、エドマン分解法により、各断片のア
ミノ酸配列を調べた。その結果、ｆＩ，ｆIIからはそれ
ぞれ３種類のペプチドが単離され、それぞれ多少修飾に
違いはあるものの同一のアミノ酸配列を有していた。ｆ
III は２種類のペプチドが単離され、１つはＮ末端がブ
ロックされており配列の決定が出来なかったが、もう一
方のペプチドについてはアミノ酸配列が決定できた。こ
れにより、精製された２種類のｐｒｏＰＯのそれぞれの
ｐｒｏ体（ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯが切断されて得
られるペプチド断片）については、その大部分のアミノ
酸配列が決定できた。

【００４１】（４）ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯから上
記ペプチドが切断されて生じるＰＯのＮ末端のアミノ酸
配列分析 ０．０１Ｍ Ｋ−ＰＯ₄ (pH7.5) 中のｐｒｏＰＯをチオ
ウレアと７５ｍＭ Ｋ−ＰＯ₄ (pH7.5) 中のＰＰＡＥと
共に０℃で３時間インキュベートし、すべてのｐｒｏＰ
ＯをＰＯに変換した。この反応液をＯＤＳカラムによっ
て２つの主要分画に分け、それぞれのＮ末端のアミノ酸
配列をエドマン分解法によって決定した。これにより、
精製された２種類のｐｒｏＰＯから得られた、それぞれ
のＰＯのＮ末端の１０個のアミノ酸配列が決定できた。

【００４２】参考例２ 精製された２種類のｐｒｏＰＯ
をコードするＤＮＡの塩基配列、及びそのアミノ酸配列
の決定 （１）家蚕ｃＤＮＡライブラリーの作製 家蚕５令幼虫５００頭より体液を２５ｍｌを採取し、こ
れを遠心分離（４０×ｇ，15分間，４℃）することによ
って血球細胞を沈澱させた。この血球細胞より総ＲＮＡ
調製用試薬であるＩＳＯＧＥＮ（BIOTECX LABORATORIE
S,INC. ）を用いて総ＲＮＡを調製した。この結果、約
８００μｇの総ＲＮＡを調製することができた。また、
このときアガロース電気泳動により、リボゾーム28ＳＲ
ＮＡのバンドを確認し、ＲＮＡの分解のないことも確認
した。この総ＲＮＡよりｍＲＮＡ Purification Kit
（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを精製し、cDNA
Synthesis Kit（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡ
の合成を行った。合成したｃＤＮＡはλZAP IIファージ
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、Gigapack G
old packaging extract （ストラタジーン社製）を用い
てin vitroパッケージングし、その結果４．２×１０⁵
プラークフォーミングユニット（ｐｆｕ）のｃＤＮＡラ
イブラリーを得た。

【００４３】（２）抗ｐｒｏＰＯポリクローナル抗体の
作製 ０．５ｍｌのphosphate buffer saline （ＰＢＳ）に溶
解した約０．５ｍｇのｐｒｏＰＯと等量のアジュバント
を乳化させた後、これをウサギに皮下注射した。その後
１０日おきに同様の皮下注射を２回行い、最後の皮下注
射から１０日後に当該ウサギの血を採取した。該ウサギ
の血より調製したウサギ抗ｐｒｏＰＯ血清から抗ｐｒｏ
ＰＯ／ＩｇＧをProtein A Sepharose 4B (Bio Rad 社
製) を用いることによって精製、取得した。

【００４４】（３）ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニン
グ ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニングにはPicoBlue^TM I
mmunoscreening Kit（ストラタジーン社製）を用いて行
った。１．５×１０⁴ ｐｆｕの家蚕ｃＤＮＡライブラリ
ーと２００μｌのE.coli XL-1 Blue（OD₆₀₀ ≒0.5)を混
合し３７℃，１５分間インキュベートした後、ＮＺＹプ
レート（１．５％寒天，１％ＮＺアミン，０．２％Ｍｇ
ＳＯ₄ ・７Ｈ2 Ｏ，０．５％バクト酵母抽出物，０．５
％ＮａＣｌ，１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン，ｐ
Ｈ７．５）３ｍｌと共にまき、４２℃で３．５時間程度
培養した。プラークが現れたとき、１０ｍＭ イソプロ
ピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（以下、
ＩＰＴＧという）を染み込ませたニトロセルロースフィ
ルター（アマシャム社製）をかぶせ、更に３７℃，３．
５時間培養した後ピンセットで注意深くニトロセルロー
スフィルターを取り、ＴＢＳＴ〔20mM Tris-HCl pH7.5,
150mM NaCl, 0.05% Tween 20(v/v)〕で15分間，３〜５
回洗浄した。また、同一プレートに２枚のスクリーニン
グ用レプリカフィルターを作製するため１枚目のフィル
ターをはがしたのち、再度１０ｍＭ ＩＰＴＧを染み込
ませたニトロセルロースフィルターをプレートにかぶせ
３７℃，４時間培養した。２枚目のフィルターも１枚目
のそれと同様に洗浄した。この操作を２０プレート行
い、合計約３．０×１０⁵ ｐｆｕのレプリカメンブレン
を作製した。このメンブレンをブロッキング溶液〔１％
ＢＳＡ（牛血清アルブミン），２０ｍＭトリス塩酸，ｐ
Ｈ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で１時間ゆっくり
と振とうした。レプリカメンブレンを１回につき５分
間，ＴＢＳＴで３〜５回洗浄後、ブロッキング溶液で適
当に希釈したアルカリホスファターゼ標識ウサギＩｇＧ
抗体溶液中で１時間ゆっくりと室温で振盪した。ＴＢＳ
Ｔで５分間，３〜５回洗浄後、ＴＢＳ（トリス塩酸，pH
7.5,１５０ｍＭＮａＣｌ，１％ＢＳＡ）で５分洗浄し
た。レプリカメンブレンの水滴をフィルターペーパーで
吸い取った後、発色液（0.3mg/ml Nitro Blue Tetrazol
ium, 0.15mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolil Phosphat
e, 100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl,5mM MgCl₂ ）中
で発色させた。ニトロセルロースフィルター上で青く発
色した位置に対応するプラークをプレート上よりリフト
し、２次スクリーニング、３次スクリーニングを行うこ
とによってファージの純化を行い、８つのクローンを得
た。

【００４５】（４）サブクローニング λZAP IIにクローニングされたＤＮＡ断片はヘルパーフ
ァージの働きにより自動的に切り離されて再閉環し、pB
luescript SK(-) ファージベクターにサブクローニング
されるため以下の操作を行った。λZAP II組換え体ファ
ージ１００μｌ（＞１×10⁵ ｐｆｕ），２００μｌ E.
coli XL-1 Blue （OD₆₀₀ ≒1.0 ），１μｌ ExAssist
helper Fhage（＞１×10 ⁶ ｐｆｕ）混合し３７℃で１５
分間インキュベートした後、３ｍｌの２×ＴＹ培地（1%
NaCl,1% Yeast extract, 1.6% Bacto-Tryptone ）を加
え、更に２．５時間振盪培養した。７０℃で２０分間イ
ンキュベートし、遠心分離（4,000 ×g,１５分，室温）
して上清を回収した。このうち１μｌを２００μｌの
E.coli SOLR ^TM（OD₆₀₀ ≒1.0 ）と混合し３７℃で１５
分間インキュベートした後、ＬＢ／Ａｍｐプレート（1.
5%Agar, 1% NaCl, 1% Bacto-Tryptone, 0.5% Yeast ext
ract,50ug/ml Ampicilin ）にプレーティングし培養
後、単一コロニーをリフトした。

【００４６】（５）精製された２種類のｐｒｏＰＯクロ
ーンの塩基配列の決定 サブクローニングしたクローンについて制限酵素切断地
図を作製し、これらをグループ分けして、そのうち最も
インサートＤＮＡの大きいクローンである pPO17、及び
制限酵素切断地図がpPO17 と異なり、インサートされて
いるＤＮＡが比較的大きいpPO5についてその塩基配列を
決定した。塩基配列の決定はDeletion kit（ニッポンジ
ーン社製）を用いてDeletion mutant を作製した後、DN
A Taq Polymeraseを用いたダイデオキシ法により行っ
た。これから、pPO17 クローンは２７８５ｂｐの塩基数
からなる家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡインサート配列を
持っていることがわかり、これにより5'末端から数えて
４５塩基目から始まるＡＴＧを翻訳開始配列とする６９
３アミノ酸残基からなるｐｒｏＰＯのアミノ酸配列が解
明された（特願平６−８５０９６）。

【００４７】pPO17 塩基配列より推定されるアミノ酸配
列と、家蚕ヘモリンパより精製されたｐｒｏＰＯからＰ
ＰＡＥによってｐｒｏ部分のペプチドが切断されて生じ
るＰＯのＮ末端アミノ酸配列（１０残基）とを比べたと
ころ、１００％のホモロジーを示した。また、同様にpP
O17 塩基配列より推定されるアミノ酸配列と、家蚕ヘモ
リンパより精製されたｐｒｏＰＯがＰＰＡＥによって切
断されて得られるｐｒｏ体のペプチド断片のアミノ酸配
列〔２８残基，参考例１−（３）〕とを比較したとこ
ろ、１００％一致した。このことからpPO17 が家蚕から
精製して得られたｐｒｏＰＯの一つのクローンであると
断定できた。

【００４８】一方、pPO5クローンは３５１４ｂｐの塩基
数からなる家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡインサート配列
を持っており、pPO5塩基配列より推定されるアミノ酸配
列と、家蚕ヘモリンパより精製されたｐｒｏＰＯがＰＰ
ＡＥによってｐｒｏ部分のペプチドが切断されて生じる
ＰＯのＮ末端アミノ酸配列（１０残基）とを比べたとこ
ろ、１００％のホモロジーを示した。また、同様にpPO5
塩基配列より推定されるアミノ酸配列と、家蚕ヘモリン
パより精製されたｐｒｏＰＯがＰＰＡＥによって切断さ
れて得られる〔または、参考例１−（３）のｆＩ、ｆＩ
Ｉから得られる〕ｐｒｏ部分の３種類のペプチド断片の
アミノ酸配列のうちの一つ（１１残基）とを比較したと
ころ、１００％一致した。しかし、その上流に翻訳開始
配列のＡＴＧでコードされるメチオニン残基がなかった
ことから、このクローンはＮ末端をコードすると考えら
れる遺伝子の一部が欠失していると推定された。そこで
Ｎ末端部分を保有する遺伝子断片をクローニングするた
めに、pPO5のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩの約０．６ｋｂＤＮ
Ａ断片を回収し、これをランダムプライマーラベリング
キット（TaKaRa社製）を用いて³²Ｐ標識して、プローブ
として上記の方法で構築した家蚕血球ｃＤＮＡライブラ
リー約９×１０³ ｐｆｕからプラークハイブリダイゼー
ションによるスクリーニングを行った。その結果、pPO5
のＮ末端をコードするクローンpPO5N を得た。pPO5N は
pPO5より５’側の更に８８ｂｐ上流をコードするクロー
ンで、約３．６ＫｂのインサートｃＤＮＡ配列を持って
いた。

【００４９】当該pPO5N クローンの塩基配列を決定した
結果、全長３６０８ｂｐの塩基からなる家蚕血球細胞由
来のｃＤＮＡインサート配列が存在し、5'末端から数え
て７塩基目から始まるＡＴＧを翻訳開始配列とする６８
５アミノ酸残基よりなるｐｒｏＰＯアミノ酸配列が解明
された（特願平６−８５０９６）。ＰＰＡＥによってｐ
ｒｏＰＯからｐｒｏ部分のペプチドが切断されて生じる
ＰＯのＮ末端アミノ酸配列（１０残基）とpPO5N 塩基配
列より推定されるアミノ酸配列とを比べたところ、１０
０％のホモロジーを示した。またＰＰＡＥによってｐｒ
ｏＰＯが切断されて得られるｐｒｏ体のペプチド断片の
アミノ酸配列（４６残基）についても１００％一致し
た。このことから、pPO5N が家蚕から精製して得られた
ｐｒｏＰＯの一つのクローンであると断定できた。

【００５０】pPO17 及びpPO5N にコードされるアミノ酸
配列を比較したところ、約５１％のアミノ酸ホモロジー
を持ち、共に５１アミノ酸残基よりなるｐｒｏ部分を持
つことが分かった。更に５０〜５３番目の４アミノ酸残
基(AsnArgPheGly)が保存されており、ＰＰＡＥによる切
断はこの配列のアルギニンとフェニルアラニンの間で起
こっていた。このことから４アミノ酸残基の配列がＰＰ
ＡＥの認識に重要な役割をもつと考えられた（特願平５
−２８９５１３号参照）。次に、この２つのアミノ酸配
列をGENETIX-CD Ver.24 （ＳＤＣソフトウエア株式会
社）を用いてNBRF-PDB,SWISS-PROT タンパク質データベ
ースよりホモロジー検索を行ったところ、ＰＯと同じく
酸素を輸送する銅タンパク質のヘモシアニンとホモロジ
ーを示した。特に銅の結合部位付近でのホモロジーが高
く、直接の銅結合部位であるヒスチジンは全て保存され
ていた。pPO17 にコードされるアミノ酸配列では２１３
番目，２１７番目，２４３番目のヒスチジンが１つの銅
原子と結合し、３６６番目，３７０番目，４０６番目の
ヒスチジンが更にもう一つの銅原子と結合すると考えら
れ、pPO5N にコードされるアミノ酸配列では２０９番
目，２１３番目，２３９番目のヒスチジンが１つの銅原
子と結合し、３６６番目，３７０番目，４０６番目のヒ
スチジンが更にもう一つの銅原子と結合すると考えられ
た。

【００５１】実施例１ 新規なｐｒｏＰＯクローンの取
得 家蚕血球ｃＤＮＡライブラリー約１０００ｐｆｕを一晩
培養した E.coli XL-1Blue ０．１ｍｌを混合し、37℃
で10分間インキュベートした。溶解後５０℃に冷やした
トップアガー(1% Trypton, 0.5% yeast extract, 1% Na
Cl, 0.7% Agar)２．５ｍｌに加え、直ちに90mmシャーレ
のボトムアガー(1% Trypton, 0.5% yeast extract, 1%
NaCl, 1.5% Agar)にまいた。37℃で一晩培養した後、ニ
トロセルロースフィルター（アマシャム社製）をプレー
トにかぶせ、約30秒間放置した。この時プレートとニト
ロセルロースフィルターの両方に注射針をさして印をつ
けた。レプリカフィルターは１プレートに２枚作製し、
変性溶液(1.5M NaCl, 0.5MNaOH)に浸した濾紙上に７分
間、中和溶液(1.5M NaCl, 0.5M Tris-Cl,pH7.2, 0.001M
EDTA)に浸した濾紙上に３分間おき、２×ＳＳＰＥ(0.1
8M NaCl, 0.01M Na2 PO4, 0.02M EDTA)で洗浄して風乾
後、80℃の真空オーブンで２時間ベーキングした。レプ
リカフィルターにプレハイブリダイゼーション溶液（５
×SSPE, 5%ブロックA , 0.5% SDS, 20ug/ml Denatured
Salmon Sperm DNA) を加え65℃、１時間インキュベート
した。標識したpPO5のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ 0.6Kb断片
ＤＮＡをプレハイブリダイゼーション溶液に加え６５℃
で一晩インキュベートした。次にフィルターを２×ＳＳ
ＰＥ，６５℃，１０分で２回、１×ＳＳＰＥ，６５℃，
１０分で２回、２×ＳＳＰＥ，６５℃，１０分で２回洗
浄し、オートラジオグラフィーを行った。オートラジオ
グラム上で黒く発色した位置に対応するプラークをプレ
ート上よりリフトし、２次スクリーニングを上記の方法
で行い、単一プラークを単離した。これによって13個の
クローンが得られ、そのうち一つがpPO5N 〔参考例２
（５）参照〕であり、さらに一つは、pPO6と名付けたク
ローンであった。

【００５２】当該pPO6クローンの塩基配列を決定した結
果、全長２４０８ｂｐの塩基からなる家蚕血球細胞由来
のｃＤＮＡインサート配列が存在し、5'末端から数えて
１３９塩基目から始まるＡＴＧを翻訳開始配列とする６
８５アミノ酸残基からなる配列が解明された。なお、後
記配列表の配列番号１にpPO6クローンに含有される家蚕
血球細胞由来のｃＤＮＡの塩基配列およびコードされる
アミノ酸配列を記載する。

【００５３】前記pPO6クローンに含有される家蚕血球細
胞由来のｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列と前記pP
O5N クローンに含有される家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡ
にコードされるアミノ酸配列とを比較したところ、その
相同性は８５．８％と非常に高かった（図１および図２
参照）。また、pPO6クローンにもpPO5N およびpPO17ク
ローンに認められるｐｒｏＰＯの特徴として知られる、
PPAEによる切断点前後の４つのアミノ酸配列（Ａｓｎ⁵⁰
Ａｒｇ⁵¹Ｐｈｅ⁵²Ｇｌｙ⁵³）や２つの銅原子の推定結合
部位 (２０９番目、２１３番目、２３９番目のヒスチジ
ン、および３６６番目、３７０番目、４０６番目のヒス
チジン) が存在し、かつｐｒｏ体の長さ（５１アミノ酸
残基）も一致していることから、pPO6クローンもｐｒｏ
ＰＯクローンの一つであると断定できた。

【００５４】実施例２ ｐｒｏＰＯタンパクの発現 クローニングベクターとしてpBluescript SK(-) を使用
したpPO6クローンからその挿入断片（約2.4kb)を制限酵
素ＸｂａＩで消化して切り出し(5' 側は９２番目のＣか
ら切り出される。) 、さらにＤＮＡポリメラーゼを用い
てその両末端を平滑化した。この断片を発現ベクターで
あるpTrcHis-B (Invitrogen 社) の同じく平滑化したＢ
ａｍＨＩサイトに挿入してｐｒｏＰＯ発現プラスミドpP
O6His を構築した。そのpPO6His で形質転換したE.coli
XL-1 Blueを１ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン含有）で
一晩培養した。その後、そのうちの１００μｌを約５ｍ
ｌのＬＢ培地（アンピシリン含有）に植菌して、ＯＤ
₆₀₀ が約 0.2 になるまでさらに培養し、この培養液を
用いて以下の操作を行った。ここで、試験対照としてこ
の培養液の１ｍｌを採取し、遠心して菌体を沈殿させた
後、得られた菌体に等容量の２×SDS-loading buffer[6
0mM Tris-HCl(pH6.8), 0.1%bromphenol blue, 10%glyce
rol, 2%SDS, 2%mercaptoethanol]を加えた。１ｍｌを採
取した残りの培養液には、組換えタンパク産生のための
誘導物質であるＩＰＴＧを最終濃度１０ｍＭになるよう
に加え、さらに３時間培養を続けて得られた培養液のう
ち０．５ｍｌを採取し、上記試験対照培養液と同様に遠
心沈殿して得られた菌体に等容量の２×SDS-loading bu
fferを加え、対照として用したＩＰＴＧ誘導前のサンプ
ルと共に３分間の煮沸の後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分析を行った。泳動後、クイックＣＢＢ
キット（和光純薬工業株式会社製）により染色した結
果、ＩＰＴＧで誘導したサンプルに約８万ダルトンの大
きさの組み換えｐｒｏＰＯタンパクの発現が確認でき
た。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２４０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Bombyx mori : pPO6クローン 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：139..2193 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号： mat peptide 存在位置：139..2193 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTGCCTCCTA CGGCCAGCCG GT 22 ATATTTAT CAAAGTTCAT TTTCAATTAT TTAAGATTTA TTTTTTATTT ATCATAAAAT 80 AATTTTAGAT TCTAGATTTT ATAGCGTGAA TACTTTTAGT TTAAAATCAA ATAAAAAG 138 ATG TCT GAC GCC AAG AAA AAC CTG TTA CTG TTC TTC GAC CGT CCC TCA 186 Met Ser Asp Ala Lys Lys Asn Leu Leu Leu Phe Phe Asp Arg Pro Ser 1 5 10 15 GAG CCA TGC TTC ATG CAA AAG GGA GAA GAG AAG GCA GTA TTC GAT ATT 234 Glu Pro Cys Phe Met Gln Lys Gly Glu Glu Lys Ala Val Phe Asp Ile 20 25 30 CCT GAC AAT TAC TAC CCG GAG AAG TAC CAG CGT GTG TCA AAT GCT ATA 282 Pro Asp Asn Tyr Tyr Pro Glu Lys Tyr Gln Arg Val Ser Asn Ala Ile 35 40 45 AGC AAC AGG TTC GGT AGC GAC GCG GGC CGC ATG ATA CCC ATC AGG AAC 330 Ser Asn Arg Phe Gly Ser Asp Ala Gly Arg Met Ile Pro Ile Arg Asn 50 55 60 ATT GCC CTG CCC AAT CTG GAC CTG CCC ATG GAG CTG CCC TAC AAC GAG 378 Ile Ala Leu Pro Asn Leu Asp Leu Pro Met Glu Leu Pro Tyr Asn Glu 65 70 75 80 CAG TTC TCC TTG TTC GTC CCT AAA CAC AGG CAA ATG GCA GGA AAG CTG 426 Gln Phe Ser Leu Phe Val Pro Lys His Arg Gln Met Ala Gly Lys Leu 85 90 95 ATT GAT ATC TTC ATG GGA ATG CGT GAC GTA GAA GAT CTC CAG AGT ATC 474 Ile Asp Ile Phe Met Gly Met Arg Asp Val Glu Asp Leu Gln Ser Ile 100 105 110 TGT GCG TAC TGC CAA CTG CGG ATC AAT CCC TAT ATG TTC AAT TAT TGC 522 Cys Ala Tyr Cys Gln Leu Arg Ile Asn Pro Tyr Met Phe Asn Tyr Cys 115 120 125 CTC TCC GTC GCC ATC TTG CAT AGA TCA GAC ACG AAA GGT TTG CAA ATC 570 Leu Ser Val Ala Ile Leu His Arg Ser Asp Thr Lys Gly Leu Gln Ile 130 135 140 CCA ACC TTT GCT GAG TGC TTT CCC GAT AAG TTC ATG GAC CCG AAG GTG 618 Pro Thr Phe Ala Glu Cys Phe Pro Asp Lys Phe Met Asp Pro Lys Val 145 150 155 160 TTC CGC AAA GCC AGA GAA GTG ACC AGC GTT GTA CCG ACT GGA GCC AGG 666 Phe Arg Lys Ala Arg Glu Val Thr Ser Val Val Pro Thr Gly Ala Arg 165 170 175 ATG CCA ATA GTG ATT CCG TCG AAC TAC ACC GCG TCG GAC GCG GAG CCG 714 Met Pro Ile Val Ile Pro Ser Asn Tyr Thr Ala Ser Asp Ala Glu Pro 180 185 190 GAG CAG CGC GTG GCG TAC TTC CGC GAG GAC ATC GGC ACC AAC CTG CAC 762 Glu Gln Arg Val Ala Tyr Phe Arg Glu Asp Ile Gly Thr Asn Leu His 195 200 205 CAC TGG CAC TGG CAC CTC GTG TAC CCC TTC GAC GCC GCA GAC CGC GCC 810 His Trp His Trp His Leu Val Tyr Pro Phe Asp Ala Ala Asp Arg Ala 210 215 220 ATC GTC AAC AAG GAC CGC CGC GGG GAG CTC TTC TAC TAC ATG CAC CAG 858 Ile Val Asn Lys Asp Arg Arg Gly Glu Leu Phe Tyr Tyr Met His Gln 225 230 235 240 CAG ATG ATC GCC AGA TTC AAC ATC GAA CGA TTC TGC AAC GAC CTG AGG 906 Gln Met Ile Ala Arg Phe Asn Ile Glu Arg Phe Cys Asn Asp Leu Arg 245 250 255 AAA GTG GAA ACC TAC AGT GAC TTC AGG GGT CCC ATT AAA GAG GGC TAC 954 Lys Val Glu Thr Tyr Ser Asp Phe Arg Gly Pro Ile Lys Glu Gly Tyr 260 265 270 TTC CCT AAG ATG GAC TCG CAA GTT GCC AGC AGA GCC TGG CCT CCT AGA 1002 Phe Pro Lys Met Asp Ser Gln Val Ala Ser Arg Ala Trp Pro Pro Arg 275 280 285 TTT GCT GGT TCG TTT CTC CGT GAC TTA GAC AGA CCG ATA GAC CAG ATC 1050 Phe Ala Gly Ser Phe Leu Arg Asp Leu Asp Arg Pro Ile Asp Gln Ile 290 295 300 AGA ATC GAT ATC TCT GAG CTG GAG ATC TGG AGG GAC AGG TTT CTG AAG 1098 Arg Ile Asp Ile Ser Glu Leu Glu Ile Trp Arg Asp Arg Phe Leu Lys 305 310 315 320 GCG ATC GAG GAT ATG GCA GTG ATC CTG CCC AAT GGG CGT CAA ATG CCT 1146 Ala Ile Glu Asp Met Ala Val Ile Leu Pro Asn Gly Arg Gln Met Pro 325 330 335 CTG GAC GAA GAG ACT GGT ATT GAC GTG CTG GGT AAC CTG ATG GAA TCG 1194 Leu Asp Glu Glu Thr Gly Ile Asp Val Leu Gly Asn Leu Met Glu Ser 340 345 350 TCC ACC ATC AGT GTA AAC CGC CCA TAC TAC GGT GAC CTC CAC AAC ATG 1242 Ser Thr Ile Ser Val Asn Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Leu His Asn Met 355 360 365 GGG CAC GTC TTT ATC GGG TAC TGC CAC GAC CCT GAT CAT CGT CAT CTG 1290 Gly His Val Phe Ile Gly Tyr Cys His Asp Pro Asp His Arg His Leu 370 375 380 GAA CCG TTC GGC GTG ATG GGA GAC CTG GCA ACG ACC ATG CGT GAC CCA 1338 Glu Pro Phe Gly Val Met Gly Asp Leu Ala Thr Thr Met Arg Asp Pro 385 390 395 400 TTG TTC TTT CGC TGG CAT GGA TAC ATA GAT TCT GTT TTC CAC CTC TAC 1386 Leu Phe Phe Arg Trp His Gly Tyr Ile Asp Ser Val Phe His Leu Tyr 405 410 415 AAG TAC AAA CTT ACA CCT TAT AGC GAT GAT AGG CTG ATC TTC CCC GAC 1434 Lys Tyr Lys Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Asp Arg Leu Ile Phe Pro Asp 420 425 430 ATC AGG GTT CGG TCC ATT AGT CTC GAT GGT AAA GGA GCT CCT AAC ATG 1482 Ile Arg Val Arg Ser Ile Ser Leu Asp Gly Lys Gly Ala Pro Asn Met 435 440 445 CTG AAT ACT TTC TGG GAG CAG AGT ACT GTG GAC TTG GCT CGT GGC TTG 1530 Leu Asn Thr Phe Trp Glu Gln Ser Thr Val Asp Leu Ala Arg Gly Leu 450 455 460 GAC TTT AGT CCC CGT GGC AGT GTT CTG GCC AGG TTC ACT CAT CTA CAG 1578 Asp Phe Ser Pro Arg Gly Ser Val Leu Ala Arg Phe Thr His Leu Gln 465 470 475 480 CAT GAA GAC TAC AGT TAT GTG ATC GAA GTG AAT AAC ACG GGC CGC AGT 1626 His Glu Asp Tyr Ser Tyr Val Ile Glu Val Asn Asn Thr Gly Arg Ser 485 490 495 AGT GTC ATG GGC ATG TTT AGG ATA TTC ATC GCC CCA ACA CTT GAC GAG 1674 Ser Val Met Gly Met Phe Arg Ile Phe Ile Ala Pro Thr Leu Asp Glu 500 505 510 AAT AAG CGG CCT CTG AAC TTC GAC GAG CAA CGG AAA CTC ATG ATC GAA 1722 Asn Lys Arg Pro Leu Asn Phe Asp Glu Gln Arg Lys Leu Met Ile Glu 515 520 525 CTC GAC AAG TTC TCA CAG GGC TTG AAG CCC GGC AAC AAT ACA GTA CGT 1770 Leu Asp Lys Phe Ser Gln Gly Leu Lys Pro Gly Asn Asn Thr Val Arg 530 535 540 CGT CGC AGT GTG GAC TCC TCA GTG ACC GTT CCG TTT GAG AGG ACA TTC 1818 Arg Arg Ser Val Asp Ser Ser Val Thr Val Pro Phe Glu Arg Thr Phe 545 550 555 560 AGC AAC CAG GCT GAC AGG CCA GGT AAT CCG GGA TCT CCC GAG TCT GCC 1866 Ser Asn Gln Ala Asp Arg Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ala 565 570 575 GAG TTT GAC TTC TGC GGC TGC GGG TGG CCT CAG CAC ATG CTC ATA CCC 1914 Glu Phe Asp Phe Cys Gly Cys Gly Trp Pro Gln His Met Leu Ile Pro 580 585 590 AAG GGA ACC ACT CAA GGA TAT CCT ATG GTG CTG TTC GTC ATG GTG TCC 1962 Lys Gly Thr Thr Gln Gly Tyr Pro Met Val Leu Phe Val Met Val Ser 595 600 605 AAC TGG AAC GAT GAC CGG GTG GAG CAA GAC CTG GTG GGG TCG TGC AAT 2010 Asn Trp Asn Asp Asp Arg Val Glu Gln Asp Leu Val Gly Ser Cys Asn 610 615 620 GAC GCG GCG TCG TAC TGC GGC ATC CGC GAC CGC AAG TAC CCG GAC CGG 2058 Asp Ala Ala Ser Tyr Cys Gly Ile Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asp Arg 625 630 635 640 CGC GCC ATG GGC TTC CCG TTC GAC CGG CCC GCG CCC GCC GCC ACC ACG 2106 Arg Ala Met Gly Phe Pro Phe Asp Arg Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr 645 650 655 CTG TCC GAC TTC CTG CGC CCC AAC ATG GCC GTG CGC GAC TGC ATC GTG 2154 Leu Ser Asp Phe Leu Arg Pro Asn Met Ala Val Arg Asp Cys Ile Val 660 665 670 CGC TTC ACC GAC AGG ACC CGC CAG CGC GGC CAG CAG GGG TAGGTCCGCC 2203 Arg Phe Thr Asp Arg Thr Arg Gln Arg Gly Gln Gln Gly 675 680 685 GCCTCCACCA CCACGCAACA CTACACACCT CATCACGGAT TTGGCTACTA TCATAAGTAC 2263 AAAATAAACA AGGTCACCTT CGGAGGCGCT CGGGCGGGTT GTTAGCATAT CCCACCCCTC 2323 CTGGCTGAGC CTTTGCTCGC CCACTTGTCC TGGTGAAACT AGAAAGGCCT CGGGCCACCA 2383 GTAATCTTTC AATCATAAAA AAAAA 2408

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＰＯ５Ｎクローンに含有される家蚕血球細胞
由来のｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列とｐＰＯ６
クローンに含有される家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡにコ
ードされるアミノ酸配列（１文字表記）とを、Ｎ末端側
から１位〜５４０位まで比較した図である。図中、配列
上段はｐＰＯ５Ｎがコードするアミノ酸配列、配列下段
はｐＰＯ６がコードするアミノ酸配列を示し、一致した
アミノ酸に＊印を付した。

【図２】ｐＰＯ５Ｎクローンに含有される家蚕血球細胞
由来のｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列とｐＰＯ６
クローンに含有される家蚕血球細胞由来のｃＤＮＡにコ
ードされるアミノ酸配列（１文字表記）とをＮ末端側か
ら５４１位〜６８５位まで比較した図である。図中、配
列上段はｐＰＯ５Ｎがコードするアミノ酸配列、配列下
段はｐＰＯ６がコードするアミノ酸配列を示し、一致し
たアミノ酸に＊印を付した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 田中 巧 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも実質的に下記に示されるアミ
   ノ酸配列を有するプロフェノールオキシダーゼまたはフ
   ェノールオキシダーゼ。 Phe Gly Ser Asp Ala Gly Arg Met Ile Pro Ile Arg Asn Ile Ala Leu Pro Asn Leu Asp Leu Pro Met Glu Leu Pro Tyr Asn Glu Gln Phe Ser Leu Phe Val Pro Lys His Arg Gln Met Ala Gly Lys Leu Ile Asp Ile Phe Met Gly Met Arg Asp Val Glu Asp Leu Gln Ser Ile Cys Ala Tyr Cys Gln Leu Arg Ile Asn Pro Tyr Met Phe Asn Tyr Cys Leu Ser Val Ala Ile Leu His Arg Ser Asp Thr Lys Gly Leu Gln Ile Pro Thr Phe Ala Glu Cys Phe Pro Asp Lys Phe Met Asp Pro Lys Val Phe Arg Lys Ala Arg Glu Val Thr Ser Val Val Pro Thr Gly Ala Arg Met Pro Ile Val Ile Pro Ser Asn Tyr Thr Ala Ser Asp Ala Glu Pro Glu Gln Arg Val Ala Tyr Phe Arg Glu Asp Ile Gly Thr Asn Leu His His Trp His Trp His Leu Val Tyr Pro Phe Asp Ala Ala Asp Arg Ala Ile Val Asn Lys Asp Arg Arg Gly Glu Leu Phe Tyr Tyr Met His Gln Gln Met Ile Ala Arg Phe Asn Ile Glu Arg Phe Cys Asn Asp Leu Arg Lys Val Glu Thr Tyr Ser Asp Phe Arg Gly Pro Ile Lys Glu Gly Tyr Phe Pro Lys Met Asp Ser Gln Val Ala Ser Arg Ala Trp Pro Pro Arg Phe Ala Gly Ser Phe Leu Arg Asp Leu Asp Arg Pro Ile Asp Gln Ile Arg Ile Asp Ile Ser Glu Leu Glu Ile Trp Arg Asp Arg Phe Leu Lys Ala Ile Glu Asp Met Ala Val Ile Leu Pro Asn Gly Arg Gln Met Pro Leu Asp Glu Glu Thr Gly Ile Asp Val Leu Gly Asn Leu Met Glu Ser Ser Thr Ile Ser Val Asn Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Leu His Asn Met Gly His Val Phe Ile Gly Tyr Cys His Asp Pro Asp His Arg His Leu Glu Pro Phe Gly Val Met Gly Asp Leu Ala Thr Thr Met Arg Asp Pro Leu Phe Phe Arg Trp His Gly Tyr Ile Asp Ser Val Phe His Leu Tyr Lys Tyr Lys Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Asp Arg Leu Ile Phe Pro Asp Ile Arg Val Arg Ser Ile Ser Leu Asp Gly Lys Gly Ala Pro Asn Met Leu Asn Thr Phe Trp Glu Gln Ser Thr Val Asp Leu Ala Arg Gly Leu Asp Phe Ser Pro Arg Gly Ser Val Leu Ala Arg Phe Thr His Leu Gln His Glu Asp Tyr Ser Tyr Val Ile Glu Val Asn Asn Thr Gly Arg Ser Ser Val Met Gly Met Phe Arg Ile Phe Ile Ala Pro Thr Leu Asp Glu Asn Lys Arg Pro Leu Asn Phe Asp Glu Gln Arg Lys Leu Met Ile Glu Leu Asp Lys Phe Ser Gln Gly Leu Lys Pro Gly Asn Asn Thr Val Arg Arg Arg Ser Val Asp Ser Ser Val Thr Val Pro Phe Glu Arg Thr Phe Ser Asn Gln Ala Asp Arg Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ala Glu Phe Asp Phe Cys Gly Cys Gly Trp Pro Gln His Met Leu Ile Pro Lys Gly Thr Thr Gln Gly Tyr Pro Met Val Leu Phe Val Met Val Ser Asn Trp Asn Asp Asp Arg Val Glu Gln Asp Leu Val Gly Ser Cys Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Cys Gly Ile Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asp Arg Arg Ala Met Gly Phe Pro Phe Asp Arg Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr Leu Ser Asp Phe Leu Arg Pro Asn Met Ala Val Arg Asp Cys Ile Val Arg Phe Thr Asp Arg Thr Arg Gln Arg Gly Gln Gln Gly
2. 【請求項２】 実質的に下記に示されるアミノ酸配列を
   有する請求項１に記載のプロフェノールオキシダーゼ。 Met Ser Asp Ala Lys Lys Asn Leu Leu Leu Phe Phe Asp Arg Pro Ser Glu Pro Cys Phe Met Gln Lys Gly Glu Glu Lys Ala Val Phe Asp Ile Pro Asp Asn Tyr Tyr Pro Glu Lys Tyr Gln Arg Val Ser Asn Ala Ile Ser Asn Arg Phe Gly Ser Asp Ala Gly Arg Met Ile Pro Ile Arg Asn Ile Ala Leu Pro Asn Leu Asp Leu Pro Met Glu Leu Pro Tyr Asn Glu Gln Phe Ser Leu Phe Val Pro Lys His Arg Gln Met Ala Gly Lys Leu Ile Asp Ile Phe Met Gly Met Arg Asp Val Glu Asp Leu Gln Ser Ile Cys Ala Tyr Cys Gln Leu Arg Ile Asn Pro Tyr Met Phe Asn Tyr Cys Leu Ser Val Ala Ile Leu His Arg Ser Asp Thr Lys Gly Leu Gln Ile Pro Thr Phe Ala Glu Cys Phe Pro Asp Lys Phe Met Asp Pro Lys Val Phe Arg Lys Ala Arg Glu Val Thr Ser Val Val Pro Thr Gly Ala Arg Met Pro Ile Val Ile Pro Ser Asn Tyr Thr Ala Ser Asp Ala Glu Pro Glu Gln Arg Val Ala Tyr Phe Arg Glu Asp Ile Gly Thr Asn Leu His His Trp His Trp His Leu Val Tyr Pro Phe Asp Ala Ala Asp Arg Ala Ile Val Asn Lys Asp Arg Arg Gly Glu Leu Phe Tyr Tyr Met His Gln Gln Met Ile Ala Arg Phe Asn Ile Glu Arg Phe Cys Asn Asp Leu Arg Lys Val Glu Thr Tyr Ser Asp Phe Arg Gly Pro Ile Lys Glu Gly Tyr Phe Pro Lys Met Asp Ser Gln Val Ala Ser Arg Ala Trp Pro Pro Arg Phe Ala Gly Ser Phe Leu Arg Asp Leu Asp Arg Pro Ile Asp Gln Ile Arg Ile Asp Ile Ser Glu Leu Glu Ile Trp Arg Asp Arg Phe Leu Lys Ala Ile Glu Asp Met Ala Val Ile Leu Pro Asn Gly Arg Gln Met Pro Leu Asp Glu Glu Thr Gly Ile Asp Val Leu Gly Asn Leu Met Glu Ser Ser Thr Ile Ser Val Asn Arg Pro Tyr Tyr Gly Asp Leu His Asn Met Gly His Val Phe Ile Gly Tyr Cys His Asp Pro Asp His Arg His Leu Glu Pro Phe Gly Val Met Gly Asp Leu Ala Thr Thr Met Arg Asp Pro Leu Phe Phe Arg Trp His Gly Tyr Ile Asp Ser Val Phe His Leu Tyr Lys Tyr Lys Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Asp Arg Leu Ile Phe Pro Asp Ile Arg Val Arg Ser Ile Ser Leu Asp Gly Lys Gly Ala Pro Asn Met Leu Asn Thr Phe Trp Glu Gln Ser Thr Val Asp Leu Ala Arg Gly Leu Asp Phe Ser Pro Arg Gly Ser Val Leu Ala Arg Phe Thr His Leu Gln His Glu Asp Tyr Ser Tyr Val Ile Glu Val Asn Asn Thr Gly Arg Ser Ser Val Met Gly Met Phe Arg Ile Phe Ile Ala Pro Thr Leu Asp Glu Asn Lys Arg Pro Leu Asn Phe Asp Glu Gln Arg Lys Leu Met Ile Glu Leu Asp Lys Phe Ser Gln Gly Leu Lys Pro Gly Asn Asn Thr Val Arg Arg Arg Ser Val Asp Ser Ser Val Thr Val Pro Phe Glu Arg Thr Phe Ser Asn Gln Ala Asp Arg Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ala Glu Phe Asp Phe Cys Gly Cys Gly Trp Pro Gln His Met Leu Ile Pro Lys Gly Thr Thr Gln Gly Tyr Pro Met Val Leu Phe Val Met Val Ser Asn Trp Asn Asp Asp Arg Val Glu Gln Asp Leu Val Gly Ser Cys Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Cys Gly Ile Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asp Arg Arg Ala Met Gly Phe Pro Phe Asp Arg Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr Leu Ser Asp Phe Leu Arg Pro Asn Met Ala Val Arg Asp Cys Ile Val Arg Phe Thr Asp Arg Thr Arg Gln Arg Gly Gln Gln Gly
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のプロフェノー
   ルオキシダーゼまたはフェノールオキシダーゼをコード
   するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 少なくとも実質的に下記に示される塩基
   配列を有する、プロフェノールオキシダーゼまたはフェ
   ノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ。 TTCGGTAGCG ACGCGGGCCG CATGATACCC ATCAGGAACA TTGCCCTGCC CAATCTGGAC CTGCCCATGG AGCTGCCCTA CAACGAGCAG TTCTCCTTGT TCGTCCCTAA ACACAGGCAA ATGGCAGGAA AGCTGATTGA TATCTTCATG GGAATGCGTG ACGTAGAAGA TCTCCAGAGT ATCTGTGCGT ACTGCCAACT GCGGATCAAT CCCTATATGT TCAATTATTG CCTCTCCGTC GCCATCTTGC ATAGATCAGA CACGAAAGGT TTGCAAATCC CAACCTTTGC TGAGTGCTTT CCCGATAAGT TCATGGACCC GAAGGTGTTC CGCAAAGCCA GAGAAGTGAC CAGCGTTGTA CCGACTGGAG CCAGGATGCC AATAGTGATT CCGTCGAACT ACACCGCGTC GGACGCGGAG CCGGAGCAGC GCGTGGCGTA CTTCCGCGAG GACATCGGCA CCAACCTGCA CCACTGGCAC TGGCACCTCG TGTACCCCTT CGACGCCGCA GACCGCGCCA TCGTCAACAA GGACCGCCGC GGGGAGCTCT TCTACTACAT GCACCAGCAG ATGATCGCCA GATTCAACAT CGAACGATTC TGCAACGACC TGAGGAAAGT GGAAACCTAC AGTGACTTCA GGGGTCCCAT TAAAGAGGGC TACTTCCCTA AGATGGACTC GCAAGTTGCC AGCAGAGCCT GGCCTCCTAG ATTTGCTGGT TCGTTTCTCC GTGACTTAGA CAGACCGATA GACCAGATCA GAATCGATAT CTCTGAGCTG GAGATCTGGA GGGACAGGTT TCTGAAGGCG ATCGAGGATA TGGCAGTGAT CCTGCCCAAT GGGCGTCAAA TGCCTCTGGA CGAAGAGACT GGTATTGACG TGCTGGGTAA CCTGATGGAA TCGTCCACCA TCAGTGTAAA CCGCCCATAC TACGGTGACC TCCACAACAT GGGGCACGTC TTTATCGGGT ACTGCCACGA CCCTGATCAT CGTCATCTGG AACCGTTCGG CGTGATGGGA GACCTGGCAA CGACCATGCG TGACCCATTG TTCTTTCGCT GGCATGGATA CATAGATTCT GTTTTCCACC TCTACAAGTA CAAACTTACA CCTTATAGCG ATGATAGGCT GATCTTCCCC GACATCAGGG TTCGGTCCAT TAGTCTCGAT GGTAAAGGAG CTCCTAACAT GCTGAATACT TTCTGGGAGC AGAGTACTGT GGACTTGGCT CGTGGCTTGG ACTTTAGTCC CCGTGGCAGT GTTCTGGCCA GGTTCACTCA TCTACAGCAT GAAGACTACA GTTATGTGAT CGAAGTGAAT AACACGGGCC GCAGTAGTGT CATGGGCATG TTTAGGATAT TCATCGCCCC AACACTTGAC GAGAATAAGC GGCCTCTGAA CTTCGACGAG CAACGGAAAC TCATGATCGA ACTCGACAAG TTCTCACAGG GCTTGAAGCC CGGCAACAAT ACAGTACGTC GTCGCAGTGT GGACTCCTCA GTGACCGTTC CGTTTGAGAG GACATTCAGC AACCAGGCTG ACAGGCCAGG TAATCCGGGA TCTCCCGAGT CTGCCGAGTT TGACTTCTGC GGCTGCGGGT GGCCTCAGCA CATGCTCATA CCCAAGGGAA CCACTCAAGG ATATCCTATG GTGCTGTTCG TCATGGTGTC CAACTGGAAC GATGACCGGG TGGAGCAAGA CCTGGTGGGG TCGTGCAATG ACGCGGCGTC GTACTGCGGC ATCCGCGACC GCAAGTACCC GGACCGGCGC GCCATGGGCT TCCCGTTCGA CCGGCCCGCG CCCGCCGCCA CCACGCTGTC CGACTTCCTG CGCCCCAACA TGGCCGTGCG CGACTGCATC GTGCGCTTCA CCGACAGGAC CCGCCAGCGC GGCCAGCAGG GG
5. 【請求項５】 実質的に下記に示される塩基配列を有す
   る、プロフェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ。 ATGTCTGACG CCAAGAAAAA CCTGTTACTG TTCTTCGACC GTCCCTCAGA GCCATGCTTC ATGCAAAAGG GAGAAGAGAA GGCAGTATTC GATATTCCTG ACAATTACTA CCCGGAGAAG TACCAGCGTG TGTCAAATGC TATAAGCAAC AGGTTCGGTA GCGACGCGGG CCGCATGATA CCCATCAGGA ACATTGCCCT GCCCAATCTG GACCTGCCCA TGGAGCTGCC CTACAACGAG CAGTTCTCCT TGTTCGTCCC TAAACACAGG CAAATGGCAG GAAAGCTGAT TGATATCTTC ATGGGAATGC GTGACGTAGA AGATCTCCAG AGTATCTGTG CGTACTGCCA ACTGCGGATC AATCCCTATA TGTTCAATTA TTGCCTCTCC GTCGCCATCT TGCATAGATC AGACACGAAA GGTTTGCAAA TCCCAACCTT TGCTGAGTGC TTTCCCGATA AGTTCATGGA CCCGAAGGTG TTCCGCAAAG CCAGAGAAGT GACCAGCGTT GTACCGACTG GAGCCAGGAT GCCAATAGTG ATTCCGTCGA ACTACACCGC GTCGGACGCG GAGCCGGAGC AGCGCGTGGC GTACTTCCGC GAGGACATCG GCACCAACCT GCACCACTGG CACTGGCACC TCGTGTACCC CTTCGACGCC GCAGACCGCG CCATCGTCAA CAAGGACCGC CGCGGGGAGC TCTTCTACTA CATGCACCAG CAGATGATCG CCAGATTCAA CATCGAACGA TTCTGCAACG ACCTGAGGAA AGTGGAAACC TACAGTGACT TCAGGGGTCC CATTAAAGAG GGCTACTTCC CTAAGATGGA CTCGCAAGTT GCCAGCAGAG CCTGGCCTCC TAGATTTGCT GGTTCGTTTC TCCGTGACTT AGACAGACCG ATAGACCAGA TCAGAATCGA TATCTCTGAG CTGGAGATCT GGAGGGACAG GTTTCTGAAG GCGATCGAGG ATATGGCAGT GATCCTGCCC AATGGGCGTC AAATGCCTCT GGACGAAGAG ACTGGTATTG ACGTGCTGGG TAACCTGATG GAATCGTCCA CCATCAGTGT AAACCGCCCA TACTACGGTG ACCTCCACAA CATGGGGCAC GTCTTTATCG GGTACTGCCA CGACCCTGAT CATCGTCATC TGGAACCGTT CGGCGTGATG GGAGACCTGG CAACGACCAT GCGTGACCCA TTGTTCTTTC GCTGGCATGG ATACATAGAT TCTGTTTTCC ACCTCTACAA GTACAAACTT ACACCTTATA GCGATGATAG GCTGATCTTC CCCGACATCA GGGTTCGGTC CATTAGTCTC GATGGTAAAG GAGCTCCTAA CATGCTGAAT ACTTTCTGGG AGCAGAGTAC TGTGGACTTG GCTCGTGGCT TGGACTTTAG TCCCCGTGGC AGTGTTCTGG CCAGGTTCAC TCATCTACAG CATGAAGACT ACAGTTATGT GATCGAAGTG AATAACACGG GCCGCAGTAG TGTCATGGGC ATGTTTAGGA TATTCATCGC CCCAACACTT GACGAGAATA AGCGGCCTCT GAACTTCGAC GAGCAACGGA AACTCATGAT CGAACTCGAC AAGTTCTCAC AGGGCTTGAA GCCCGGCAAC AATACAGTAC GTCGTCGCAG TGTGGACTCC TCAGTGACCG TTCCGTTTGA GAGGACATTC AGCAACCAGG CTGACAGGCC AGGTAATCCG GGATCTCCCG AGTCTGCCGA GTTTGACTTC TGCGGCTGCG GGTGGCCTCA GCACATGCTC ATACCCAAGG GAACCACTCA AGGATATCCT ATGGTGCTGT TCGTCATGGT GTCCAACTGG AACGATGACC GGGTGGAGCA AGACCTGGTG GGGTCGTGCA ATGACGCGGC GTCGTACTGC GGCATCCGCG ACCGCAAGTA CCCGGACCGG CGCGCCATGG GCTTCCCGTT CGACCGGCCC GCGCCCGCCG CCACCACGCT GTCCGACTTC CTGCGCCCCA ACATGGCCGT GCGCGACTGC ATCGTGCGCT TCACCGACAG GACCCGCCAG CGCGGCCAGC AGGGG
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
   を含有する組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターで形質転
   換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載の宿主細胞を培地で培養
   し、得られる培養物からプロフェノールオキシダーゼま
   たはフェノールオキシダーゼを採取することを特徴とす
   る請求項１または２に記載のプロフェノールオキシダー
   ゼまたはフェノールオキシダーゼの製造方法。