JPH0568548A - ヒトａｌｔをコードする遺伝子断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトの酵素のひとつであるヒトＡＬＴ（アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ、ＧＰＴとも言う）をコ
ードする遺伝子断片を提供する。この遺伝子断片を用い
て遺伝子組換え技術によりヒトＡＬＴを発現させること
により、ヒト血清由来の他の不純物を一切含まないヒト
ＡＬＴを大量に安価にそして安定に供給する。 【構成】 ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからこれまで
に報告のないヒトＡＬＴをコードするｃＤＮＡ遺伝子断
片をクローニングした。この遺伝子断片を用いることに
より、これまで大量供給が不可能であったヒト酵素ＡＬ
Ｔを他の血清由来の不純物を一切含まない形態で安定
に、安価にそして安定して供給することが可能となる。
このようにして得られる遺伝子組換え産生ヒトＡＬＴ
は、血清由来のＡＬＴと同様の生物学的活性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト肝臓を始めとする
ヒト組織及びヒト組織由来細胞より得られるＡＬＴ（ア
ラニン・アミノトランスフェラーゼ：alanine aminotra
nsferase）と同様の酵素活性を有する遺伝子組換え発現
ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする新規DNA及
び該ポリペプチドの製造法に関する。

【０００２】

【発明の背景】ＡＬＴはＧＰＴ（glutamete pyluvate t
ransaminase）とも呼ばれ、次の反応を触媒する。 L-alanine + 2-oxoglutalate → pyruvate + L-glutamate

【０００３】本酵素はＡＳＴ（asparatate aminotransf
erase）とともに肝疾患では血清中に逸脱してくる酵素
としてよく知られており、その診断ならびに経過観察の
重要な指標として必要不可欠の検査項目の一つである。
しかし自動分析機等による測定の際基準として用いられ
ている酵素標品（管理血清）中の本酵素はブタ心臓由来
の粗精製品でしかなく、基質特異性、Ｋｍ値等がヒト酵
素と異なるためもともとヒト酵素測定用として開発され
た測定系では標準物質として用いた場合精度管理の点で
満足すべきものではない。理想的酵素標準用の添加酵素
はヒト血液成分、またはヒト臓器由来のヒト酵素が一番
望ましいが数量的、道義的、及びコスト上の問題があり
量産化、製品化することは難しい。そこで本出願人は先
にヒト由来の細胞を組織培養することにより本酵素を得
ることに成功し特許出願した（特願昭62-165941号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】しかしながらＡＬＴ
を得るために、ヒト肝臓由来培養細胞を原材料とするこ
とにはいくつかの問題点があった。すなわち培養細胞中
におけるＡＬＴの発現量が少ないこと、また培養細胞の
ＡＬＴの発現が不安定であることにより、その製造に非
常にコストがかかることである。従ってより安価に、よ
り大量に、そしてより安定してＡＬＴを供給する方法が
望まれている。

【０００５】

【問題を解決するための手段】本発明者等は、これらの
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトＡＬＴ
ポリペプチドをコードするDNA断片を得ることに成功し
た。このDNA断片を発現プロモーターの下流に正しく組
み込んだ組換えベクターを用いて微生物細胞を形質転換
し、ヒトＡＬＴ遺伝子を発現させることによりヒトＡＬ
Ｔが調製できることを確認し、本発明を完成した。すな
わち、本発明は配列表：配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする
新規DNA、該DNAを含む組換えベクター、該組換えベクタ
ーを保持する形質転換体並びに該ポリペプチドの製造法
を提供するものである。

【０００６】本発明のヒトＡＬＴをコードするDNA、組
換えベクター、形質転換体細胞は、例えば次の如くして
調製される。

【０００７】まずラット肝臓をリン酸バッファ等でホモ
ジナイズし、遠心して破砕物を除去した後上清に硫安塩
析を行ってＡＬＴを含む画分を上清として分取する。得
られた上清を種々のカラムクロマトグラフィーに付すこ
とにより、ＡＬＴを精製することができる。カラムクロ
マトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー等を単独、あるいは組み
合わせて用いることができる。

【０００８】続いて精製されたＡＬＴのアミノ酸配列の
分析を行う。ＡＬＴはそのＮ末端が修飾されておりＮ末
端からの分析が不可能なため、臭化シアン（CNBr）或い
はトリプシン等によってＡＬＴポリペプチドを切断した
後短い断片を分離し、これらの断片についてそのＮ末端
からの分析を行う。得られたアミノ酸配列を基に塩基配
列を予測し、PCR用のプライマーとするオリゴヌクレオ
チドを合成する。

【０００９】PCRのテンプレートDNAとなるcDNAは以下の
ように合成する。ラットの肝組織をグアニジウムチオシ
アネート水溶液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方
法［Biochemistry 18,5294-5299,(1979)］に従って、塩
化セシウム平衡密度勾配超遠心法によって全RNAを沈澱
として分離する。分離後、フェノール抽出、エタノール
沈澱により全RNAを精製する。

【００１０】ほ乳類のmRNAはpoly A部分を含むことが一
般的であることから常法によりこれをオリゴ(dT)セルロ
ースカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、ポリ
(A)含有RNA（poly A+ RNA）を単離とする。このmRNAを
もとにオリゴ(dT)プライマー法、或いはランダムプライ
マー法によりこれらpoly A+ RNAに対するcDNAを得る。
このcDNAをテンプレートとして前述のプライマーを使っ
てPCRを行うことによりALTcDNAの一部が増幅される。

【００１１】このcDNAからcDNAライブラリーを作製する
には次のように行う。cDNAをDNAメチラーゼ（例えばEco
RI メチラーゼ）によりメチル化し、cDNA中に存在する
該制限酵素切断部位を保護した後、両端に該制限酵素切
断部位入りDNAリンカー[例えばEcoRIリンカー(GGAATTC
C)]を付加し、該制限酵素（例えばEcoRI）により消化を
行う。このものをプラスミドあるいはλファージ等のク
ローニングベクターにクローニングする。例えばλgt10
DNAのEcoRI部位に導入することができる。この様にし
て、cDNAが組み込まれたλgt10ファージを大腸菌に感染
させ、LB培地等で培養する。形成されたプラークをハイ
ブリダイゼーションによって選択することにより目的と
するcDNAを得ることができる。このハイブリダイゼーシ
ョン法に使用するプローブはPCRを行って得られたcDNA
より作製する。さらに上記ハイブリダイゼーションスク
リーニング陽性のプラークからファージを増殖させ、そ
のものからλDNA精製キットを用いて、或いはT.Maniati
sらの方法［Molecular Cloning, 2nd Edition, pp2.6
0］によってλDNAを精製し適切な制限酵素（例えばEcoR
I）等で切断後、電気泳動にてcDNA部分を分離する。得
られたcDNAを同じく適当な制限酵素（例えばEcoRI）で
消化した種々のクローニング用プラスミドベクターと再
結合し、組換えプラスミドベクターを作製する。利用で
きるプラスミドベクターとしては、例えば、pBR322、pU
C18、pUC119、pGEM-3Z等が挙げられる。

【００１２】得られたALTcDNA組換えベクターを宿主細
胞に導入し、該宿主細胞を形質転換せしめる。宿主細胞
としては大腸菌が好ましく、例えばHB101、JM109、χ17
76等が利用でき、組換えベクターの導入にはカルシウム
処理や塩化ルビジウム処理によるコンピテント細胞法等
が用いられる。形質転換細胞をベクターの遺伝子マーカ
ーに応じた選択培地中で培養し、菌体中から本発明の組
換えベクターが採取される。また、pUC18、pUC119、pGE
M-3Zをベクターとして用いた場合、得られた組換えベク
ターをアルカリ変性し一本鎖DNAにした後ジデオキシシ
ークエンス法［Sanger.F. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.
USA.74.5463-5467.(1977)］によりDNA塩基配列を決定
することができる。

【００１３】このようにして得られる、ラットＡＬＴを
コードする部分の塩基配列は例えば次の如くである。

【００１４】 ATGGCCTCAC GGGTGAATGA TCAAAGCCAG GCTTCAAGGA ATGGGCTGAA GGGAAAGGTG CTAACTCTGG ACACTATGAA CCCATGTGTG CGGAGGGTGG AGTATGCAGT TGAGGACCCA TTGTGCAGCG TGCCTTGGAG CTGGAGCAGG AGCTGCGTCA GGGTGTGAAG AAGCCGTTTA CTGAGGTCAT CCGTGCCAAC ATTGGGGATG CACAAGCCAT GGGGCAGAGA CCCATCACCT TCTTCCGCCA GGTCCTGGCC CTCTGTGTCT ACCCCAATCT TCTGAGCAGT CCTGACTTCC CAGAGGATGC CAAGAGAAGG GCAGAACGCA TCTTGCAGGC CTGCGGGGGC CACAGCCTGG GTGCCTATAG CATTAGCTCT GGAATCCAGC CGATCCGGGA GGATGTGGCG CAATACATTG AGAGAAGAGA CGGAGGCATC CCCGCAGACC CGAACAACAT ATTTCTATCC ACAGGGGCCA GCGATGCCAT CGTGACAATG CTCAAGCTGC TGGTATCTGG CGAGGGCCGT GCACGAACAG GTGTACTCAT TCCCATTCCT CAGTACCCAC TGTACTCAGC CGCGCTGGCT GAACTGGACG CCGTGCAAGT GGACTACTAC CTGGACGAAG AGCGCGCCTG GGCTCTGGAC ATCGCAGAGC TGCGGCGCGC TCTGTGCCAG GCACGTGACC GTTGCTGCCC TCGAGTACTG TGCGTCATCA ACCCCGGCAA CCCCACTGGG CAGGTGCAGA CCCGTGAGTG CATCGAGGCC GTAATCCGCT TTGCTTTCAA AGAAGGACTC TTCTTGATGG CTGATGAGGT ATACCAGGAC AACGTGTATG CCGAGGGCTC TCAGTTCCAT TCATTCAAGA AGGTGCTCAT GGAGATGGGG CCACCGTATT CCACGCAGCA GAGCTTGCTT CTTTCCACTC AGTCTCTAAG GGCTACATGG GCGAGTGCGG GTTTCGTGGT GGCTATGTGG AGGTGGTAAA CATGGATGCT GAGGTGCAGA AACAGATGGG GAAGCTGATG AGTGTGCGGC TGTGTCCACC AGTGCCAGGC CAGGCCTTGA TGGACATGGT GGTCAGTCCG CCAACACCCT CCGAGCCGTC CTTCAAGCAG TTTCAAGCAG AGAGACAGGA GGTGCTGGCT GAACTGGCAG CCAAGGCTAA GCTCACGGAG CAGGTCTTCA ATGAGGCTCC CGGGATCCGC TGCAACCCAG TGCAGGGCGC CATGTATTCC TTCCCTCAAG TGCAGCTGCC CTTGAAAGCG GTGCAGCGTG CTCAGGAACT GGGCCTGGCC CCTGACATGT TCTTCTGCCT GTGCCTCCTG GAAGAGACTG GCATCTGCGT TGTGCCCGGG AGTGGCTTTG GGCAGCAGGA GGGCACCTAT CATTTCCGGA TGACCATTCT GCCCCCCATG GAGAAACTGC GGCTGCTGCT GGAAAAACTC AGTCACTTCC ATGCCAAGTT CACCCATGAG TACTCC

【００１５】次に、このようにして得られたラットALTc
DNAまたはこの一部の遺伝子断片をプローブとして用
い、ヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする。cDNA
ライブラリーは、ヒト肝臓よりmRNAを調製して前述の方
法により作製することができるが、市販のcDNAライブラ
リー、例えばクロンテック社製ヒト肝臓ライブラリー
（λgt10）を利用することができる。

【００１６】このライブラリーを、ラットALTcDNAをプ
ローブとして前述のハイブリダイゼーション法により選
択を行い、目的とするヒトＡＬＴをコードするcDNAを得
ることができる。得られたcDNAは、ラットALTcDNAの時
と同様にプラスミドにクローニングし、ジデオキシシー
クエンス法により塩基配列を決定することができる。こ
のようにして得られる本発明のヒトＡＬＴ遺伝子断片の
うちヒトＡＬＴ構造遺伝子領域の塩基配列は、例えば次
の如くである。

【００１７】 CGCAGAGGTA ACCGGAGCCA GGCGGTGAGG CATGGACTGA GGGCGAAGGT GCTGACGCTG GACGGCATGA ACCCGCGTGT GCGGAGAGTG GAGTACGCAG TGCGTAGCCC CATAGTGCAG CGAGCCTTGG AGCTGGAGCA GGAGCTGCGC CAGGGTGTGA AGAAGCCTTT CACCGAGGTC ATCCGTGCCA ACATCGGGGA CGCACAGGCT ATGGGGCAGA GGCCCATCAC CTTCCTGCGT CAGGTCTTGG CCCTCTGTGT TAACCCTGAT CTTCTGAGCA GCCCCAACTT CCCTGACGAT GCCAAGAAAA GGGCGGAGCG CATCTTGCAG GCGTGTGGGG GCCACAGTCT GGGGGCCTAC AGCGTCAGCT CCGGCATCCA GCTGATCCGG GAGGACGTGG CGCGGTACAT TGAGAGGCGT GACGGAGGCA TCCCTGCGGA CCCCAACAAC GTCTTCCTGT CCACAGGGGC CAGCGATGCC ATCGTGACGG TGCTGAAGCT GCTGGTGGCC GGCGAGGGCC ACACACGCAC GGGTGTGCTC ATCCCCATCC CCCAGTACCC ACTCTACTCG GCCACGCTGG CAGAGCTGGG CGCAGTGCAG GTGGATTACT ACCTGGACGA GGAGCGTGCC TGGGCGCTGG ACGTGGCCGA GCTTCACCGT GCACTGGGCC AGGCGCGTGA CCACTGCCGC CCTCGTGCGC TCTGTGTCAT CAACCCTGGC AACCCCACCG GGCAGGTGCA GACCCGCGAG TGCATCGAGG CCGTGATCCG CTTCGCCTTC GAAGAGCGGC TCTTTCTGCT GGCGGACGAG GTGTACCAGG ACAACGTGTA CGCCGCGGGT TCGCAGTTCC ACTCATTCAA GAAGGTGCTC ATGGAGATGG GGCCGCCCTA CGCCGGGCAG CAGGAGCTTG CCTCCTTCCA CTCCACCTCC AAAGGCTACA TGGGCGAGTG CGGGTTCCGC GGCGGCTATG TGGAGGTGGT GAACATGGAC GCTGCAGTGC AGCAGCAGAT GCTGAAGCTG ATGAGTGTGC GGCTGTGCCC GCCGGTGCCA GGACAGGCCC TGCTGGACCT GGTGGTCAGC CCGCCCGCGC CCACCGACCC CTCCTTTGCG CAGTTCCAGG CTGAGAAGCA GGCAGTGCTG GCAGAGCTGG CGGCCAAGGC CAAGCTCACC GAGCAGGTCT TCAATGAGGC TCCTGGCATC AGCTGCAACC CAGTGCAGGG CGCCATGTAC TCCTTCCCGC GCGTGCAGCT GCCCCCGCGG GCGGTGGAGC GCGCTCAGGA GCTGGGCCTG GCCCCCGATA TGTTCTTCTG CCTGCGCCTC CTGGAGGAGA CCGGCATCTG CGTGGTGCCA GGGAGCGGCT TTGGGCAGCG GGAAGGCACC TACCACTTCC GGATGACCAT TCTGCCCCCC TTGGAGAAAC TGCGGCTGCT GCTGGAGAAG CTGAGCAGGT TCCATGCCAA GTTCACCCTC GAGTACTCCT GA

【００１８】本発明のDNA断片は、配列表：配列番号１
に記載のアミノ酸配列をコードする能力を有すれば、上
記の塩基配列には限定されるものではない。また本発明
において構築される組換えベクターも、前記アミノ酸配
列をコードする塩基配列を有し、かつ複製可能であれ
ば、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来、昆虫細胞由
来、ほ乳動物細胞由来などいずれのベクターとの組換え
でもよい。

【００１９】本発明ヒトＡＬＴは前記本発明組換えベク
ターを保持する形質転換細胞を培養し、その培養物から
採取することができる。また、本発明のヒトＡＬＴをコ
ードする遺伝子断片は、転写の下流方向へ順に、プロ
モーター、リボソーム結合部位、開始コドン、本
発明ヒトＡＬＴのアミノ酸配列をコードし得る塩基配列
を有するDNA、終止コドン及び転写ターミネーター
を含むよう発現用組換えベクターを構築し、これを宿主
細胞を導入し発現させることによりＡＬＴを効率よく大
量に調製することが可能である。

【００２０】このような発現組換えベクターを得るため
のベクターの宿主としては、大腸菌(E.coli)、枯草菌
(B.subtilis)、酵母(S.cerevisiae)、昆虫細胞、ほ乳動
物細胞等が利用できる。ベクターとして利用するDNA
は、プラスミドが好ましい。プラスミドDNAは宿主細胞
中にてプラスミドが増殖するために必要なDNA配列、プ
ロモーター、転写ターミネーター、更に好ましくは形質
転換体の選択マーカーとなる遺伝子を含む。このベクタ
ーに本発明ヒトＡＬＴのアミノ酸配列をコードし得る塩
基配列をを有するDNAを組み込むには、これを含むDNAを
適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカー
を付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結
合させることにより行われる。

【００２１】得られた発現用組換えベクターを宿主細胞
に導入すれば、本発明ヒトＡＬＴを効率的に生産する能
力を有する形質転換体細胞が得られる。この形質転換細
胞を培養することにより、該細胞内にヒトＡＬＴを発現
・蓄積させることができる。尚、ＡＬＴ発現に用いたプ
ロモーターに応じては、該プロモーターが効率よく機能
する条件にて形質転換細胞を培養することも必要であ
る。

【００２２】このようにして発現されたＡＬＴが蓄積さ
れた形質転換細胞を回収し、これを化学的または物理的
衝撃を加えることにより細胞を破砕しライセートを得、
これを通常の蛋白精製に用いられる精製法、例えば、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィお
よび硫安塩析等に処すことにより目的のヒトＡＬＴを調
製することができる。このようにして得られる遺伝子組
換え発現のヒトＡＬＴは、従来の血清由来のＡＬＴに比
較して、血清由来の他の不純物を一切含まないヒトＡＬ
Ｔであり、その取り扱いの面でも極めて安全な物質であ
る。

【００２３】次に、実施例を挙げて本発明を説明する
が、本発明は以下の実施例によって限定されるものでは
ない。

【００２４】

【実施例１】１．ラット肝臓ＡＬＴの精製 (1) ラット肝臓約100gに、800mlの50mMリン酸バッファ
ー（pH6.0）を加え、ポリトロン[KINEMATICA社製]で磨
砕した。得られたホモジネ−トを7000rpm，30分間遠心
分離し、上清を分取した。得られた上清に20％飽和とな
るように固形硫安を加え、溶解するまで攪拌した後、4
℃で30分間放置した。その後7000rpm，30分間遠心分離
し上清を分取した。

【００２５】(2) 得られた上清を30％飽和硫安を含む10
mMリン酸バッファー（pH6.6）で平衡化したブチル−ト
ヨパ−ル（φ5.0×15cm）（東ソー社製）に吸着させ、
同バッファーにて充分洗浄した後、25〜15％飽和硫安を
含む10mMリン酸バッファー500mlを用い、直線濃度勾配
により溶出させた。活性画分は15〜17%の飽和硫安濃度
付近にて溶出され270mlを得た。

【００２６】(3) 得られた活性画分を10mMリン酸バッフ
ァー（pH6.6）10lに対して４℃で一夜充分に透析した。
透析液は同バッファーにて平衡化したDEAE-トヨパール
(φ4.4×13.5cm)（東ソ−社製）に通し、同バッファー
にて充分洗浄した後、0-0.2MKClを含む10mMリン酸バッ
ファー500mlを用い、直線濃度勾配により溶出させた。
活性画分は0.06〜0.08M KCl濃度付近にて溶出され、130
mlを得た。

【００２７】(4) 得られた活性画分に25％飽和となるよ
うに固形硫安を添加溶解し、25%飽和硫安を含む10mMリ
ン酸バッファー（pH6.6）で平衡化したブチル−トヨパ
ール（φ7.5×8.0cm)に吸着させ、同バッファーにて充
分洗浄した後、25〜0％飽和硫安を含む10mMリン酸バッ
ファー200mlを用い、直線濃度勾配により溶出させた。
活性画分は13〜15%の飽和硫安濃度付近にて溶出され、2
5mlを得た。

【００２８】(5) (1)〜(4)の精製工程を合計４バッチ行
い、全てのバッチの(4)で得た活性画分をプールして得
た約100mlをミニモジュールNM-3（旭化成社製）及びセ
ントリコン−30（アミコン社製）にて約500μlに濃縮し
た。その濃縮液100μlを、10mMリン酸バッファーで平衡
化したハイドロキシアパタイトのHPLC（BIO-RAD社製）
にかけ、10mM−0.2Mリン酸バッファーで溶出することに
より溶出画分約700μlを得た。

【００２９】(6) (5)で得られた活性画分700μlに最終
1.5Mとなるように硫安を添加溶解し、1.5M硫安を含む50
mMリン酸バッファーで平衡化したフェニル−トヨパール
のHPLC（東ソー社製）にかけ、0.2M NaClを含む0.1Mリ
ン酸バッファーで溶出し、溶出画分約250μlを得た。溶
出画分のうち5μlについてSDS-PAGEを行い、CBB染色を
行ったところＡＬＴのバンドのみが確認できた。

【００３０】２．アミノ酸配列の分析 (1) 精製したラットＡＬＴ250μlを10mMトリス塩酸バッ
ファー（pH8.0）に対して1lで一晩、さらにバッファー
を換えて二晩透析した。次に、最終6Mとなるようにグア
ニジン塩酸、同様に0.1M トリス塩酸、2mM EDTA、2mM D
TTを加えて37℃で３時間静置してＡＬＴを変性した後、
1lの蒸留水に対して一晩透析した。透析液は凍結乾燥
後、70％ギ酸に対して溶解し、溶解液に1mmoleとなるよ
うCNBrを加え、４℃に48時間静置してＡＬＴを断片化し
た。その後ギ酸をとばすため500μlの蒸留水に溶解した
後凍結乾燥する操作を２回繰り返した。そして0.1％TFA
を含む蒸留水に溶解し、C8のHPLC（資生堂社製）にて断
片を分離した。

【００３１】(2) 分離したペプチドの一部についてアミ
ノ酸配列をアミノ酸分析機(Applied Biosystems社製）
を用いて分析した。その結果、次の配列が得られた。 (A) Ala-Glu-Val-Gln-Lys-Gln-Met (B) Gly-Glu-Cys-Gly-Phe-Arg-Gly-Gly-Tyr-Val-Glu-Val-Val-Asn-Met (C) Ser-Val-Arg-Leu-Cys-Pro-Pro-Val-Pro-Gly-Glu-Ala-Leu-Met (D) Gly-Pro-Pro-Tyr-Ser-Thr-Gln-Gln-Glu-Leu-Ala-Ser-Phe-His-Ser-Val-Ser- Lys-Gly-Tyr-Met (E) Ala-Asp-Glu-Val-Tyr-Gln-Asp-Asn-Val-Tyr-Ala-Glu-Gly-Ser-Gln-Phe-His- Ser-Phe (F) Glu-Lys-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Ser-His-Phe-His-Ala-Lys-Phe- Thr-Leu-Gly-Tyr-Ser (G) Tyr-Ser-Phe-Pro-Gln-Val-Gln-Leu-Pro-Leu-Lys-Ala-Val-Gln-Arg-Ala-Gln- Glu-Leu-Gly-Leu-Ala-Pro-Asp (H) Phe-Pro-Cys-Pro-Gln-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Gly-Ile-Phe (I) Val-Val-Cys-Val-Arg-Thr-Val-Glu-Tyr-Ala-Val-Arg-Gly-Pro-Ile-Val-Gln- Gln-Leu-Gln-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Ala-Gln-Gly-Val (J) Ser-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Glu-Pro-Val-Phe-Lys-Gln-Phe-Gln-Gln-Glu-Arg- Leu-Glu-Val-Leu-Ala-Glu-Leu-Ala-Ala-Gly (K) Gly-Gln-Arg-Pro-Ile-Thr-Phe-Phe-Arg-Gln-Val-Leu-Ala-Leu-Cys-Val-Tyr- Pro-Asn-Leu-Leu

【００３２】３．ラットALTcDNAの部分増幅 (1) ＰＣＲ用プライマーの作製 ２−(2)で得られたアミノ酸配列をもとに、次の塩基配
列から成るＤＮＡをDNAシンセサイザー（Applied Biosy
stems社製）を用いて合成した。 (A) Ala-Glu-Val-Gln-Lys-Gln-Met 3'- CTC CAC GTC TTT GTT TAC CCTTAAGG -5' ：primer-1 C C (EcoRI部位) (B) Met-Gly-Glu-Cys-Gly-Phe-Arg-・・・・ 5'- CCTTAAGG ATG GGG GAA TGT GGG TTT CGG -3' ：primer-2 (EcoRI部位) C C C

【００３３】(2) ラット肝臓cDNAの合成 動物細胞からのｍＲＮＡの抽出（ベクターDNA，榊佳之
著 講談社サイエンティフィック）に準じてポリ(A)を有
するＲＮＡを下記の如く調製した。ラット肝臓約5gを摘
出し、直ちに液体窒素にて凍結した。これをGTSバッフ
ァー（6Mチオシアン酸グアニジン、5mM クエン酸Na、0.
5% サルコシル、0.1M 2-ME pH7.0）30ml中でポリトロン
にて破砕し、可溶化した。この可溶化物約33mlを遠心管
に入っている5.7M塩化セシウム溶液10ml上に静かにの
せ、HITACHI RPS-27Tローターにて24000rpm、20時間遠
心後、RNAを沈澱として回収した。このRNAの沈澱をTEバ
ッファー（10mM トリス塩酸、1mM EDTA pH8.0）400μl
に溶解し、フェノール−クロロホルムで抽出後、エタノ
ール沈澱により回収した。得られたRNA約5mgを65℃、15
分間インキュベートし40μlの5M NaClを加えた。混合物
をオリゴ（dT）セルロースカラム（ファルマシア社製）
クロマトグラフィー（カラム容積0.1ml）にかけた。吸
着したポリ(A)を有するmRNA約40μgを得た。そのmRNA3
μgから、cDNA合成システム・プラス（アマシャム社
製）を使ってcDNAを合成した。合成の手順はキットの説
明書に従って行った。

【００３４】(3) ラットALTcDNAの部分増幅 ３−(1)のプライマーを使用し、ＰＣＲ法により３−(2)
で作製した肝臓cDNA中に存在するALTcDNAの部分増幅を
行った。反応液は、10mM トリス塩酸、50mM KCl、1.5mM
MgCl₂、0.2mMdNTP（N=A,G,C,T)、1μM primer1、1μM p
rimer2、5ng 肝臓cDNA、2.5単位 Taqポリメラーゼ（宝
酒造社製）、蒸留水で最終100μlの組成で、条件は順に
［95℃,1分→55℃,2分→72℃,2分］を１サイクル、[94
℃,1分→55℃,2分→72℃,2分］を３２サイクル、［94
℃,1分→55℃,2分→72℃,5分］を１サイクルの合計３５
サイクル行った。機器はPROGRAM TEMP. CONTROL SYSTEM
PC-500 (アステック社製）を使用した。

【００３５】(4) PCR産物のサブクローニング 反応液をクロロホルム抽出、エタノール沈澱を行った
後、制限酵素EcoRIで消化し、再度エタノール沈澱を行
って10μlのTEバッファーに懸濁した後、１％低融点ア
ガロースゲル電気泳動を行った。増幅されたバンドが存
在する部分のゲルを切り出して68℃にてゲルを融解した
後、予めEcoRIで消化しておいたクローニングベクターp
GEM-3Z（Promega社製）と反応バッファー（50mM トリス
塩酸 pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mM ATP）20μl中
にてT4 DNAリガーゼによって反応させて連結し、組換え
ベクターpR5-1を作製した。反応終了後、2μlをHanahan
らの方法［DNA cloning vol.1,pp109-136,IRL Press,(1
985)］によって調製したコンピテント細胞JM109を形質
転換した。形質転換細胞は50μg/mlアンピシリンを含む
LB培地でアンピシリン耐性によって選択した。

【００３６】(5) PCR産物の塩基配列の決定 塩基配列の決定は、SEQUENASE Ver.2.0 DNA Sequencing
Kit （United statesBiochemical社製）とプライマー
は市販のCAGGAAACAGCTATGACおよびGTTTTCCCAGTCACGACを
用いて行った。操作手順は、キットの取扱い説明書に従
った。PCR産物の一部の塩基配列を決定しアミノ酸配列
を推測したところ、２-(2)で得られたＡＬＴタンパク質
から分析したアミノ酸配列と一致した。３で得られた組
換えファージDNAを調製し、制限酵素EcoRIで消化した
後、アガロースゲル電気泳動を行ったところ約1.7kbのD
NAセグメントがファージDNAに挿入されていることが判
明した。これによりPCR産物がラットＡＬＴのcDNAの一
部であることが確認された。

【００３７】

【実施例２】ラット肝臓cDNAライブラリーのスクリーニング（完全長
の遺伝子を持ったcDNAの取得） (1) ファージライブラリーの感染 cDNAライブラリーの作製はcDNAクローニングシステム・
λgt10（アマシャム社製）を用いて行った。手順はキッ
トの取扱い説明書に従った。約1μgのcDNAから作製し、
約50万のファージからなるライブラリーができた。

【００３８】0.3mlの宿主大腸菌NM514の一夜培養液と、
4×10⁵pfu/mlとなるようにλ希釈液（50mMトリス塩酸
pH7.5、0.1M NaCl、10mM MgCl₂）で調製したcDNAライブ
ラリー0.1mlを混ぜ、37℃で15分間放置してファ−ジを
宿主菌に吸着させた。45℃に保温しておいたLB上層寒天
培地（バクトトリプトン10g，イーストエキストラクト5
g，食塩5g，10mM MgSO₄，アガロース9g，蒸留水1l、pH
7.2）9mlを加え混合した後、直径15cmのLB寒天平板（LB
上層寒天培地のアガロース9gをアガー15gにしたもの）
に撒き、37℃で６時間培養した。

【００３９】(2) プローブとのハイブリダイゼーショ
ン、オートラジオグラフィー ナイロンフィルター（Hybond-N+・アマシャム社製）を
λgt10ファージプラークの生じたLB寒天平板に被せた。
１分後フィルターを剥がし、ファージプラークの生じた
平板は4℃に保存した。フィルターは変性溶液（0.5N Na
OH，1.5M NaCl）に7分間、次に中和溶液（0.5M トリス
塩酸バッファー、1.5M NaCl，1mM EDTApH7.2）に3分間
浸漬し、最後に2×SSC（0.3M NaCl，0.03M クエン酸3Na
pH7.2）で1分間洗浄後乾燥した。

【００４０】フィルターをハイブリダイゼーションバッ
ファー（6×SSC、0.5％SDS、0.02％ポリビニルピロリド
ン、0.02％ 牛血清アルブミン、0.02％ Ficoll-400、20
μg/ml変性サケ精子DNA）50mlに65℃で2時間浸漬して前
処理を行った。新しいバッファー3mlと交換し、その中
にプローブを90℃、2分間インキュベート後氷冷した後
入れ、65℃で１晩インキュベートした。プローブは組換
えベクターpR5-1をテンプレートとしてRiboprobe Syste
m（Promega社製）を用いて作製した。操作手順はキット
の取扱い説明書に従った。放射性同位元素は、[α-³²P]
UTP(〜3000Cimmole)（アマシャム社製）を使用した。

【００４１】フィルターを洗浄バッファー（0.1×SSC、
0.1％SDS）500mlで65℃、30分間ずつ2回洗浄した。洗浄
したフィルターはＸ線フィルムXAR-5（KODAK社製）にあ
て、−80℃で感光し翌日現像した。

【００４２】(3) 組換えファージDNAの調製 現像したフィルム上で黒点が認められた陽性スポットに
対応するプラークを寒天培地ごと取り1mlのλ希釈液に
移し、ファージを寒天培地中から溶出した。ファージ液
を適当に希釈し、さらに常法通り２回スクリーニング操
作を繰り返してファージの純化を行った。

【００４３】得られた組換えファージのうち100μlを宿
主大腸菌NM514の一夜培養液100μlに感染させ、37℃で1
5分間放置後LB培地10mlを加え菌が溶菌するまで37℃に
て振とう培養を行い、クロロホルムを100μl加え、さら
に2分間振とうを続けた。次に菌体残渣を3000rpm、20分
間の遠心分離により除去し、上清をQIAGEN lambda kit
(QIAGEN社製)を用いて組換えファージDNAの調製を行っ
た。操作手順はキットの取扱い説明書に従った。10mlの
培養液から約10μgのファージDNAを得た。このDNA200ng
をEcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行ったと
ころ約1.7kbのcDNAセグメントがファージDNAに挿入され
ていることが判明した。

【００４４】(4) cDNAのサブクローニング 得られたcDNAセグメントを実施例１の３-(4)と同様に行
ってプラスミドにクローニングした。クローニングベク
ターとしてpGEM-3Z（Promega社製）を用いた。EcoRIで
切断し低融点アガロース電気泳動によりファージDNAと
分離したcDNAセグメントを予めEcoRIで切断しておいたp
GEM-3Zと連結し、組換えベクターpR1.8Fを作製した。

【００４５】(5) ラットALTcDNAの塩基配列の確認 得られたラットALTcDNA組換えベクターpR1.8Fを様々な
制限酵素を用いて処理してcDNAの短鎖化を行い、pGEM-3
Zをベクタ−として短鎖化プラスミド構築した。得られ
た短鎖化プラスミドを用いて実施例１の３-(5)と同様の
方法によりcDNAの塩基配列を決定した。配列表：配列番
号１に塩基配列を示したが、1749bpのcDNAを得ることが
できた。実施例１の２-(2)でＡＬＴタンパク質から分析
したアミノ酸配列のすべてが得られたALTcDNAの塩基配
列から推測されるアミノ酸配列中に存在した（図１）の
で本cDNAがALTをコードするものであることが確認され
た。

【００４６】

【実施例３】ヒト肝臓cDNAライブラリーのスクリーニング（ヒトALTc
DNAのクローニング）(1) ファージライブラリーの感染 ファージライブラリーは、市販のヒト肝臓cDNAライブラ
リーλgt10（クロンテック社製）を使用した。0.3mlの
宿主大腸菌NM514の一夜培養液と、4×10⁵pfu/mlとなる
ようにλ希釈液（50mMトリス塩酸 pH7.5、0.1M NaCl、
10mM MgCl₂）で調製したcDNAライブラリー0.1mlを混
ぜ、37℃で15分間放置してファ−ジを宿主菌に吸着させ
た。45℃に保温しておいたLB上層寒天培地（バクトトリ
プトン10g，イーストエキストラクト5g，食塩5g，10mM
MgSO₄，アガロース9g，蒸留水1l、pH7.2）9mlを加え混
合した後、直径15cmのLB寒天平板（LB上層寒天培地のア
ガロース9gをアガー15gにしたもの）に撒き、37℃で６
時間培養した。

【００４７】(2) プローブとのハイブリダイゼーショ
ン、オートラジオグラフィー ナイロンフィルター（Hybond-N+・アマシャム社製）を
λgt10ファージプラークの生じたLB寒天平板に被せた。
１分後フィルターを剥がし、ファージプラークの生じた
平板は4℃に保存した。フィルターは変性溶液（0.5N Na
OH，1.5M NaCl）に7分間、次に中和溶液（0.5M トリス
塩酸バッファー、1.5M NaCl，1mM EDTApH7.2）に3分間
浸漬し、最後に2×SSC（0.3M NaCl，0.03M クエン酸3Na
pH7.2）で1分間洗浄後乾燥した。

【００４８】フィルターをハイブリダイゼーションバッ
ファー（6×SSC、0.5％SDS、0.02％ポリビニルピロリド
ン、0.02％ 牛血清アルブミン、0.02％ Ficoll-400、20
μg/ml変性サケ精子DNA）50mlに65℃で2時間浸漬して前
処理を行った。新しいバッファー3mlと交換し、その中
にプローブを90℃、2分間インキュベート後氷冷した後
入れ、65℃で１晩インキュベートした。プローブは、組
換えベクターpR1.8Fを制限酵素BamHIとXhoIで消化した
後、低融点アガロースゲル電気泳動を行って得られた約
500bpのDNA断片を切り出して使用した。マルチプライム
DNA標識システム（アマシャム社製）を用いて取扱い説
明書に従って操作して標識した。放射性同位元素は[α-
³²P]dCTP(〜3000Ci/m mole)（アマシャム社製）を使用
した。フィルターを洗浄バッファー（0.1×SSC、0.1％S
DS）500mlで65℃、30分間ずつ2回洗浄した。洗浄したフ
ィルターはＸ線フィルムXAR-5（KODAK社製）にあて、−
80℃で感光し翌日現像した。

【００４９】(3) 組換えファージDNAの調製 現像したフィルム上で黒点が認められた陽性スポットに
対応するプラークを寒天培地ごと取り1mlのλ希釈液に
移し、ファージを寒天培地中から溶出した。ファージ液
を適当に希釈し、さらに常法通り２回スクリーニング操
作を繰り返してファージの純化を行った。

【００５０】得られた組換えファージのうち100μlを宿
主大腸菌NM514の一夜培養液100μlに感染させ、37℃で1
5分間放置後LB培地10mlを加え菌が溶菌するまで37℃に
て振とう培養を行い、クロロホルムを100μl加え、さら
に2分間振とうを続けた。次に菌体残渣を3000rpm、20分
間の遠心分離により除去し、上清をQIAGEN lambda kit
(QIAGEN社製)を用いて組換えファージDNAの調製を行っ
た。操作手順はキットの取扱い説明書に従った。10mlの
培養液から約10μgのファージDNAを得た。このDNA200ng
をEcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行ったと
ころ約1.6kbのcDNAセグメントがファージDNAに挿入され
ていることが判明した。

【００５１】(4) cDNAのサブクローニング 得られたcDNAセグメントをプラスミドにクローニングし
た。クローニングベクターとしてpUC119を用い、操作は
実施例１の３-(4)と同様に行った。組換えベクターpHGT
-36を作製した。

【００５２】(5) ヒトALTcDNA塩基配列の確認 得られたALTcDNA組換えベクターpHGT-36を様々な制限酵
素を用いて処理してcDNAの短鎖化を行い、pUC119をベク
ターとして短鎖化プラスミドを構築した。得られた短鎖
化プラスミドを用いて実施例１の３ー(5)と同様の方法に
より塩基配列を決定した。配列表：配列番号１にその塩
基配列を示すとおり、1648bpのcDNAを得ることができ
た。尚、このプラスミドpHGT-36を組み込んだ大腸菌
が、Escherichia coli HGT-36（微工研菌寄第12396号：
FERM P-12396）として、本出願人により寄託されてい
る。

【００５３】

【実施例４】 発現用組換えベクターの構築及び該組換えベクターによ
る宿主細胞の形質転換(1) 発現用組換えベクターの構築 実施例３-(4)で作製されたヒトALTcDNAを含むプラスミ
ドpHGT-36を制限酵素EcoRI及びBstPIで切断し、約4.9kb
のDNA断片を得た。また次の塩基配列から成るDNAをDNA
シンセサイザー（Applied Biosystems社製）を用いて合
成し、ATG部分を作製した。 HG-4 : 5'---AAT TCG TCG ACA AAC ACA CAT AAA TAA ACA CCA TGG CCT SalI CAC GCA GAG ---3' HG-5 : 5'---GTT ACC TCT GCG TGA GGC CAT GGT GTT TAT TTA TGT GTG TTT GTC GAC G---3' HG-4及びHG-5を65℃にて10分間インキュベート後、室温
まで徐冷してアニールさせた後、4.9kbのDNA断片と連結
した。構築したプラスミドをpHGT-39と名付けた。pHGT-
39を制限酵素HindIIIによってALTcDNAの3'末端側で切断
し、ムングビーンヌクレアーゼ処理により5'突出末端を
削った後SalIリンカーを連結しプラスミドpHGT-40を構
築した。pHGT-40を制限酵素SalIで切断し、低融点アガ
ロースゲル電気泳動により、本発明のヒトALTcDNAを含
んだDNA断片を分離した。そして予め制限酵素SalIで切
断しておいた発現用ベクターpYG10と本DNA断片を連結し
て発現用組換えベクターpHX10-1を構築した。

【００５４】(2) 発現用組換えベクターによる宿主酵母
AH22の形質転換 宿主酵母AH22のシングルコロニーをＬ字管に分注した10
mlのYPD培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グル
コース）に接種し、30℃、一夜培養した。600nmにおけ
る吸光度が約1.0の時遠心集菌し、1mlの0.1Mリチウム酢
酸に懸濁した。30℃で30分間放置した。組換えベクター
pHX10-1を約5μg入れ激しく攪拌した。30℃で30分間振
とうした。100μlのPEG溶液（10mM トリス塩酸、1mM ED
TA pH8.0、60% PEG4000）を入れ、激しく攪拌し室温に
90分間放置した。1mlのH₂Oを入れよく攪拌した後遠心集
菌し上清を取り除いた。1mlの最小培地に懸濁した後遠
心集菌し上清を取り除いた。再度100μlの最小培地に懸
濁し最小寒天培地に撒いた。寒天培地は30℃に入れ培養
した。約20個の形質転換体が得られた。

【００５５】

【実施例５】本発明組換えＡＬＴ酵素活性の測定 (1) 酵母抽出液の作製 実施例４にて作製された酵母AH22/pHX10-1を含む最小寒
天培地上にて30℃、5夜培養し、生じたコロニーをＬ字
管に分注した10mlの最小培地に接種した。30℃、2夜培
養後集菌し1mlのバッファー（25mMKH₂PO₄、2.5mM α-ケ
トグルタル酸、0.1mM EDTA、0.05mM DTT、0.025mM ピリ
ドキサル−3りん酸）及び1gのガラスビーズ(0.25〜0.5m
mφ)を入れ15分間激しく振盪し菌を破砕した。上清を取
り分け、酵母抽出液とした。

【００５６】(2) 活性の測定 ガラスキュベットに1mlの基質バッファ（0.1M トリス塩
酸、pH8.0、80mM アラニン、4mM α−ケトグルタル
酸）、10μlの15mM NADH、2μlの乳酸脱水素酵素（オリ
エンタル酵母社製）を入れた後、5μlの酵母抽出液を入
れて素早く攪拌して340nmでの吸光度を時間を追って計
った。１分間の吸光度の減少値を計算し、次式にて定義
した計算式にて酵素単位を算出した。（340nmにおける
吸光度の減少値）／6.21×1000/200(単位／ml)＝酵素単
位

【００５７】

【００５８】上記の表中に示す通り、本発明の遺伝子断
片を発現させることにより得られるペプチドはヒトＡＬ
Ｔと同様の酵素活性を示し、得られたcDNAがヒトＡＬＴ
をコードしていることが確認された。

【００５９】配列番号：１ 配列の長さ：１６４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ヒト 配列 CGC AGA GGT AAC CGG AGC CAG GCG GTG AGG CAT GGA CTG AGG GCG AAG 48 Arg Arg Gly Asn Arg Ser Gln Ala Val Arg His Gly Leu Arg Ala Lys 1 5 10 15 GTG CTG ACG CTG GAC GGC ATG AAC CCG CGT GTG CGG AGA GTG GAG TAC 96 Val Leu Thr Leu Asp Gly Met Asn Pro Arg Val Arg Arg Val Glu Tyr 20 25 30 GCA GTG CGT AGC CCC ATA GTG CAG CGA GCC TTG GAG CTG GAG CAG GAG 144 Ala Val Arg Ser Pro Ile Val Gln Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln Glu 35 40 45 CTG CGC CAG GGT GTG AAG AAG CCT TTC ACC GAG GTC ATC CGT GCC AAC 192 Leu Arg Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Arg Ala Asn 50 55 60 ATC GGG GAC GCA CAG GCT ATG GGG CAG AGG CCC ATC ACC TTC CTG CGT 240 Ile Gly Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Arg Pro Ile Thr Phe Leu Arg 65 70 75 80 CAG GTC TTG GCC CTC TGT GTT AAC CCT GAT CTT CTG AGC AGC CCC AAC 288 Gln Val Leu Ala Leu Cys Val Asn Pro Asp Leu Leu Ser Ser Pro Asn 85 90 95 TTC CCT GAC GAT GCC AAG AAA AGG GCG GAG CGC ATC TTG CAG GCG TGT 336 Phe Pro Asp Asp Ala Lys Lys Arg Ala Glu Arg Ile Leu Gln Ala Cys 100 105 110 GGG GGC CAC AGT CTG GGG GCC TAC AGC GTC AGC TCC GGC ATC CAG CTG 384 Gly Gly His Ser Leu Gly Ala Tyr Ser Val Ser Ser Gly Ile Gln Leu 115 120 125 ATC CGG GAG GAC GTG GCG CGG TAC ATT GAG AGG CGT GAC GGA GGC ATC 432 Ile Arg Glu Asp Val Ala Arg Tyr Ile Glu Arg Arg Asp Gly Gly Ile 130 135 140 CCT GCG GAC CCC AAC AAC GTC TTC CTG TCC ACA GGG GCC AGC GAT GCC 480 Pro Ala Asp Pro Asn Asn Val Phe Leu Ser Thr Gly Ala Ser Asp Ala 145 150 155 160 ATC GTG ACG GTG CTG AAG CTG CTG GTG GCC GGC GAG GGC CAC ACA CGC 528 Ile Val Thr Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Gly Glu Gly His Thr Arg 165 170 175 ACG GGT GTG CTC ATC CCC ATC CCC CAG TAC CCA CTC TAC TCG GCC ACG 576 Thr Gly Val Leu Ile Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr 180 185 190 CTG GCA GAG CTG GGC GCA GTG CAG GTG GAT TAC TAC CTG GAC GAG GAG 624 Leu Ala Glu Leu Gly Ala Val Gln Val Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Glu 195 200 205 CGT GCC TGG GCG CTG GAC GTG GCC GAG CTT CAC CGT GCA CTG GGC CAG 672 Arg Ala Trp Ala Leu Asp Val Ala Glu Leu His Arg Ala Leu Gly Gln 210 215 220 GCG CGT GAC CAC TGC CGC CCT CGT GCG CTC TGT GTC ATC AAC CCT GGC 720 Ala Arg Asp His Cys Arg Pro Arg Ala Leu Cys Val Ile Asn Pro Gly 225 230 235 240 AAC CCC ACC GGG CAG GTG CAG ACC CGC GAG TGC ATC GAG GCC GTG ATC 768 Asn Pro Thr Gly Gln Val Gln Thr Arg Glu Cys Ile Glu Ala Val Ile 245 250 255 CGC TTC GCC TTC GAA GAG CGG CTC TTT CTG CTG GCG GAC GAG GTG TAC 816 Arg Phe Ala Phe Glu Glu Arg Leu Phe Leu Leu Ala Asp Glu Val Tyr 260 265 270 CAG GAC AAC GTG TAC GCC GCG GGT TCG CAG TTC CAC TCA TTC AAG AAG 864 Gln Asp Asn Val Tyr Ala Ala Gly Ser Gln Phe His Ser Phe Lys Lys 275 280 285 GTG CTC ATG GAG ATG GGG CCG CCC TAC GCC GGG CAG CAG GAG CTT GCC 912 Val Leu Met Glu Met Gly Pro Pro Tyr Ala Gly Gln Gln Glu Leu Ala 290 295 300 TCC TTC CAC TCC ACC TCC AAA GGC TAC ATG GGC GAG TGC GGG TTC CGC 960 Ser Phe His Ser Thr Ser Lys Gly Tyr Met Gly Glu Cys Gly Phe Arg 305 310 315 320 GGC GGC TAT GTG GAG GTG GTG AAC ATG GAC GCT GCA GTG CAG CAG CAG 1008 Gly Gly Tyr Val Glu Val Val Asn Met Asp Ala Ala Val Gln Gln Gln 325 330 335 ATG CTG AAG CTG ATG AGT GTG CGG CTG TGC CCG CCG GTG CCA GGA CAG 1056 Met Leu Lys Leu Met Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val Pro Gly Gln 340 345 350 GCC CTG CTG GAC CTG GTG GTC AGC CCG CCC GCG CCC ACC GAC CCC TCC 1104 Ala Leu Leu Asp Leu Val Val Ser Pro Pro Ala Pro Thr Asp Pro Ser 355 360 365 TTT GCG CAG TTC CAG GCT GAG AAG CAG GCA GTG CTG GCA GAG CTG GCG 1152 Phe Ala Gln Phe Gln Ala Glu Lys Gln Ala Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 GCC AAG GCC AAG CTC ACC GAG CAG GTC TTC AAT GAG GCT CCT GGC ATC 1200 Ala Lys Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Phe Asn Glu Ala Pro Gly Ile 385 390 395 400 AGC TGC AAC CCA GTG CAG GGC GCC ATG TAC TCC TTC CCG CGC GTG CAG 1248 Ser Cys Asn Pro Val Gln Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Arg Val Gln 405 410 415 CTG CCC CCG CGG GCG GTG GAG CGC GCT CAG GAG CTG GGC CTG GCC CCC 1296 Leu Pro Pro Arg Ala Val Glu Arg Ala Gln Glu Leu Gly Leu Ala Pro 420 425 430 GAT ATG TTC TTC TGC CTG CGC CTC CTG GAG GAG ACC GGC ATC TGC GTG 1344 Asp Met Phe Phe Cys Leu Arg Leu Leu Glu Glu Thr Gly Ile Cys Val 435 440 445 GTG CCA GGG AGC GGC TTT GGG CAG CGG GAA GGC ACC TAC CAC TTC CGG 1392 Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Arg Glu Gly Thr Tyr His Phe Arg 450 455 460 ATG ACC ATT CTG CCC CCC TTG GAG AAA CTG CGG CTG CTG CTG GAG AAG 1440 Met Thr Ile Leu Pro Pro Leu Glu Lys Leu Arg Leu Leu Leu Glu Lys 465 470 475 480 CTG AGC AGG TTC CAT GCC AAG TTC ACC CTC GAG TAC TCC TGAGCACCCC 1489 Leu Ser Arg Phe His Ala Lys Phe Thr Leu Glu Tyr Ser 485 490 AGCTGGGGCC AGGCTGGGTC GCCCTGGACT GTGTGCTCAG GAGCCCTGGG AGGCTCTGGA 1549 GCCCACTGTA CTTGCTCTTG ATGCCTGGCG GGGTGGGGTG GGGGGGGTGC TGGGCCCCTG 1609 CCTCTCTGCA GGTCCCTAAT AAAGCTGTGT GGCAGTCTG 1648

【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：１７３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ラット 配列 TGCAGTGTGA AGGGTGTTGT CTTACCTCTC GCAGACTTTC CCATTCCCAG CCCTGATTTC 60 CCCACTGGAC CCTTCTCCTT CTGAACCAGC ATCCTGCCTG GTTTGAGCAG TC ATG GCC 118 Met Ala 1 TCA CGG GTG AAT GAT CAA AGC CAG GCT TCA AGG AAT GGG CTG AAG GGA 166 Ser Arg Val Asn Asp Gln Ser Gln Ala Ser Arg Asn Gly Leu Lys Gly 5 10 15 AAG GTG CTA ACT CTG GAC ACT ATG AAC CCA TGT GTG CGG AGG GTG GAG 214 Lys Val Leu Thr Leu Asp Thr Met Asn Pro Cys Val Arg Arg Val Glu 20 25 30 TAT GCA GTT CGA GGA CCC ATT GTG CAG CGT GCC TTG GAG CTG GAG CAG 262 Tyr Ala Val Arg Gly Pro Ile Val Gln Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln 35 40 45 50 GAG CTG CGT CAG GGT GTG AAG AAG CCG TTT ACT GAG GTC ATC CGT GCC 310 Glu Leu Arg Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Arg Ala 55 60 65 AAC ATT GGG GAT GCA CAA GCC ATG GGG CAG AGA CCC ATC ACC TTC TTC 358 Asn Ile Gly Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Arg Pro Ile Thr Phe Phe 70 75 80 CGC CAG GTC CTG GCC CTC TGT GTC TAC CCC AAT CTT CTG AGC AGT CCT 406 Arg Gln Val Leu Ala Leu Cys Val Tyr Pro Asn Leu Leu Ser Ser Pro 85 90 95 GAC TTC CCA GAG GAT GCC AAG AGA AGG GCA GAA CGC ATC TTG CAG GCC 454 Asp Phe Pro Glu Asp Ala Lys Arg Arg Ala Glu Arg Ile Leu Gln Ala 100 105 110 TGC GGG GGC CAC AGC CTG GGT GCC TAT AGC ATT AGC TCT GGA ATC CAG 502 Cys Gly Gly His Ser Leu Gly Ala Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Ile Gln 1 15 120 125 130 CCG ATC CGG GAG GAT GTG GCG CAA TAC ATT GAG AGA AGA GAC GGA GGC 550 Pro Ile Arg Glu Asp Val Ala Gln Tyr Ile Glu Arg Arg Asp Gly Gly 135 140 145 ATC CCC GCA GAC CCG AAC AAC ATA TTT CTA TCC ACA GGG GCC AGC GAT 598 Ile Pro Ala Asp Pro Asn Asn Ile Phe Leu Ser Thr Gly Ala Ser Asp 150 155 160 GCC ATC GTG ACA ATG CTC AAG CTG CTG GTA TCT GGC GAG GGC CGT GCA 646 Ala Ile Val Thr Met Leu Lys Leu Leu Val Ser Gly Glu Gly Arg Ala 165 170 175 CGA ACA GGT GTA CTC ATT CCC ATT CCT CAG TAC CCA CTG TAC TCA GCC 694 Arg Thr Gly Val Leu Ile Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala 180 185 190 GCG CTG GCT GAA CTG GAC GCC GTG CAA GTG GAC TAC TAC CTG GAC GAA 742 Ala Leu Ala Glu Leu Asp Ala Val Gln Val Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu 195 200 205 205 GAG CGC GCC TGG GCT CTG GAC ATC GCA GAG CTG CGG CGC GCT CTG TGC 790 Glu Arg Ala Trp Ala Leu Asp Ile Ala Glu Leu Arg Arg Ala Leu Cys 210 215 220 CAG GCA CGT GAC CGT TGC TGC CCT CGA GTA CTG TGC GTC ATC AAC CCC 838 Gln Ala Arg Asp Arg Cys Cys Pro Arg Val Leu Cys Val Ile Asn Pro 225 230 235 GGC AAC CCC ACT GGG CAG GTG CAG ACC CGT GAG TGC ATC GAG GCC GTA 886 Gly Asn Pro Thr Gly Gln Val Gln Thr Arg Glu Cys Ile Glu Ala Val 240 245 250 ATC CGC TTT GCT TTC AAA GAA GGA CTC TTC TTG ATG GCT GAT GAG GTA 934 Ile Arg Phe Ala Phe Lys Glu Gly Leu Phe Leu Met Ala Asp Glu Val 255 260 265 TAC CAG GAC AAC GTG TAT GCC GAG GGC TCT CAG TTC CAT TCA TTC AAG 982 Tyr Gln Asp Asn Val Tyr Ala Glu Gly Ser Gln Phe His Ser Phe Lys 270 275 280 285 AAG GTG CTC ATG GAG ATG GGG CCA CCG TAT TCC ACG CAG CAG GAG CTT 1030 Lys Val Leu Met Glu Met Gly Pro Pro Tyr Ser Thr Gln Gln Glu Leu 290 295 300 GCT TCT TTC CAC TCA GTC TCT AAG GGC TAC ATG GGC GAG TGC GGG TTT 1078 Ala Ser Phe His Ser Val Ser Lys Gly Tyr Met Gly Glu Cys Gly Phe 305 310 315 CGT GGT GGC TAT GTG GAG GTG GTA AAC ATG GAT GCT GAG GTG CAG AAA 1126 Arg Gly Gly Tyr Val Glu Val Val Asn Met Asp Ala Glu Val Gln Lys 320 325 330 CAG ATG GGG AAG CTG ATG AGT GTG CGG CTG TGT CCA CCA GTG CCA GGC 1174 Gln Met Gly Lys Leu Met Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val Pro Gly 335 340 345 CAG GCC TTG ATG GAC ATG GTG GTC AGT CCG CCA ACA CCC TCC GAG CCG 1222 Gln Ala Leu Met Asp Met Val Val Ser Pro Pro Thr Pro Ser Glu Pro 3 50 355 360 365 TCC TTC AAG CAG TTT CAA GCA GAG AGA CAG GAG GTG CTG GCT GAA CTG 1270 Ser Phe Lys Gln Phe Gln Ala Glu Arg Gln Glu Val Leu Ala Glu Leu 370 375 380 GCA GCC AAG GCT AAG CTC ACG GAG CAG GTC TTC AAT GAG GCT CCC GGG 1318 Ala Ala Lys Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Phe Asn Glu Ala Pro Gly 385 390 395 ATC CGC TGC AAC CCA GTG CAG GGC GCC ATG TAT TCC TTC CCT CAA GTG 1366 Ile Arg Cys Asn Pro Val Gln Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Val 400 405 405 CAG CTG CCC TTG AAA GCG GTG CAG CGT GCT CAG GAA CTG GGC CTG GCC 1414 Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Gln Arg Ala Gln Glu Leu Gly Leu Ala 410 415 420 CCT GAC ATG TTC TTC TGC CTG TGC CTC CTG GAA GAG ACT GGC ATC TGC 1462 Pro Asp Met Phe Phe Cys Leu Cys Leu Leu Glu Glu Thr Gly Ile Cys 4 25 430 435 440 GTT GTG CCC GGG AGT GGC TTT GGG CAG CAG GAG GGC ACC TAT CAT TTC 1510 Val Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Gln Glu Gly Thr Tyr His Phe 445 450 455 CGG ATG ACC ATT CTG CCC CCC ATG GAG AAA CTG CGG CTG CTG CTG GAA 1558 Arg Met Thr Ile Leu Pro Pro Met Glu Lys Leu Arg Leu Leu Leu Glu 460 465 470 AAA CTC AGT CAC TTC CAT GCC AAG TTC ACC CAT GAG TAC TCC 1600 Lys Leu Ser His Phe His Ala Lys Phe Thr His Glu Tyr Ser 480 485 495 TGAAGCCACT GCTAGGGCCA CACTGGACAG TCTCTGACGC AACAAACCGA GGGTCCTTAG 1660 GAACCCTCAG TATTTCTGAT TTTGTCTAGG GTCTCGGTAA CTGTCCTGCG GGTCCCTAAT 1720 AAATCTGATG TCAGCCTG 1738

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の２-(2)においてＡＬＴ蛋白質から分
析したアミノ酸配列が、実施例２-(5)で得られたALTcDN
Aの塩基配列がコードするアミノ酸配列のどの領域に相
当するかを示した図である。下線の配列がＡＬＴ蛋白質
から分析したアミノ酸配列に相当する領域を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 岡 徹也 熊本県熊本市湖東２−44−２

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表：配列番号１に記載のアミノ酸順
   位１から４９３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
   有することを特徴とするヒトＡＬＴをコードする遺伝子
   断片。
2. 【請求項２】 該遺伝子断片が、配列表：配列番号１に
   記載の塩基番号１から１４７９の塩基配列を有する前記
   第(1)項記載のヒトＡＬＴをコードする遺伝子断片。
3. 【請求項３】 前記第(1)項または(2)項のＤＮＡ断片を
   適当な宿主細胞内で発現させ、これを回収することによ
   り得られる、血清由来の他の成分を一切含まない遺伝子
   組換え発現ヒトＡＬＴ。
4. 【請求項４】 配列表：配列番号１に記載のアミノ酸順
   位１から４９３のアミノ酸配列を含み、ヒト血清由来の
   他の成分を一切含まないことを特徴とするヒトＡＬＴ。
5. 【請求項５】 前記第(1)項または(2)項に記載のＤＮＡ
   断片を、適当な外来遺伝子発現用ベクターに組み込み、
   これを宿主細胞に導入し発現させ、これを回収すること
   を特徴とするヒト血清由来の他の成分を一切含まないヒ
   トＡＬＴの製法。