JP3014159B2 - ヒト表皮トランスグルタミナーゼをコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト表皮トランスグル
タミナーゼをコードするＤＮＡ配列に関し、さらにその
ＤＮＡ配列を含みかつ一定の宿主の中で複製できる組換
えベクターならびにそれらの使用に関する。本発明によ
ってヒト表皮トランスグルタミナーゼが生産できる。

【０００２】

【従来の技術】皮膚は人体を外界から保護し、体温や水
分調節をおこなう重要な機能を有している。そして、こ
れらの生理作用は表皮を構成する表皮角化細胞（ケラチ
ノサイト）の終末分化すなわち角化という過程におい
て、細胞膜直下に化学的、物理的に強固なコーニファイ
ド・エンベロプを形成することにより皮膚に特徴的な分
化について大きな役割を果している。このコーニファイ
ド・エンベロプは角化細胞内のロリクリン（loricrin）
などの基質蛋白がε−（γ−グルタミル）−リジンイソ
ペプチド結合で架橋されることによって形成されるが、
ヒト表皮トランスグルタミナーゼはこの架橋反応を触媒
することが知られている(Mehrel,T.ら，Cell,61,1103〜
1112ページ，1990、参照）。

【０００３】また、その他のトランスグルタミナーゼに
ついては、ウサギ表皮トランスグルタミナーゼ（Floyd,
E.E.ら，Mol.Cell.Biol,9,4846〜4851ページ，1989、参
照）、モルモット肝トランスグルタミナーゼ（Ikura,K.
ら,Biochemistry,27,2898 〜2905ページ,1988 、参照）
およびヒト血液凝固因子XIIIa （例えば、Grundmann,U.
ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA,83,8024 〜8028ページ,198
6 、参照）に研究が行われ、それらの推定アミノ酸配列
も提案されている。

【０００４】一方、ヒト表皮トランスグルタミナーゼに
ついて、M.Phillipsらは、上記Floyd らにより調製され
たウサギ表皮トランスグルタミナーゼの部分ｃＤＮＡを
用い、Clontech社より購入した培養ヒト表皮細胞ｃＤＮ
ＡのλgtIIライブラリーをスクリーニングし、得られた
４つのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定することによ
りヒト表皮トランスグルタミナーゼの一次構造を推定し
た（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87, 9933−9937ペー
ジ，1990年12月）。このグループが得たこれらのｃＤＮ
Ａクローンの塩基配列からは単一のオープンリーディン
グフレームを確認するに至っておらず、さらに５′非翻
訳領域と翻訳開始コドンの推定は、同時にクローン化し
たラット表皮トランスグルタミナーゼの塩基配列と比較
するに留り、アミノ酸残基数は788 と記し、推定分子量
への言及を避けている。また、H.C.Kim.ら(J.Blol.Che
m.Vol.266. p536−539.1991年１月）は、λgtIIに構築
したヒト包皮表皮または終末分化を誘導した培養正常ヒ
ト表皮ケラチノサイトｃＤＮＡライブラリーを、トラン
スグルタミナーゼファミリーにおいて保存されている活
性部位領域の塩基配列に対応する68塩基からなる合成オ
リゴヌクレオチドでスクリーニングし、２．６Kbにわた
る２つの重複するクローンを得て、これらの塩基配列か
ら69塩基のオリゴヌクレオチドを合成してスクリーニン
グを繰返し、５′非翻訳領域を含む 250bpをクローン化
した。しかし、塩基配列がＡＴＧより36塩基付近におい
てPhillipsらが決定した配列とは異なっており（CCが欠
如）、そのため推定アミノ酸配列のＮ末端からメチオニ
ンを除いて12残基の配列が異なっている。

【０００５】このように、これまでのクローニングで
は、ヒト表皮トランスグルタミナーゼの一次構造は未だ
不明確であり、この蛋白の全アミノ酸配列をコードし、
その一次構造を論理的に推定することができる単一のｃ
ＤＮＡは得られていなかった。しかも、これらの研究は
それぞれの酵素の構造、一般的な作用などに対応するも
のであり、酵素自体を積極的に生産することを目的とす
るものでない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のように表皮の角
化に不可欠な酵素であるヒト表皮トランスグルタミナー
ゼは、その全アミノ酸をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングして、その蛋白の一次構造を明らかにすると共に、
適当な宿主−ベクター系を用いてこのｃＤＮＡを発現さ
せ、本酵素を大量に得る手段を確立することは必要であ
ろう。すなわち、ヒト表皮トランスグルタミナーゼの機
能の解明と蛋白質工学的な酵素機能の改変、本酵素に特
異的な抗体の作製、本酵素の蛋白架橋作用を利用した研
究用試薬および医薬品の開発、ヒト表皮トランスグルタ
ミナーゼ遺伝子の発現調節機構および角化機構の解明、
ならびに先天性および後天性の皮膚角化異常症の診断な
どへの応用を可能とするには、上記手段を手に入れるこ
とが不可欠であるからである。従って、本発明の目的は
ヒト表皮トランスグルタミナーゼをコードするＤＮＡ配
列を提供し、さらにその配列を含み、かつ適当な宿主の
中で複製できる組換えベクターを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述した
ウサギ表皮トランスグルタミナーゼ、モルモット肝トラ
ンスグルタミナーゼ、およびヒト血液凝固因子XIIIa の
アミノ酸配列がそれぞれの活性部位とその周辺領域で高
度の相同性をもつことから、ヒト表皮トランスグルタミ
ナーゼもこの領域に同様な保存配列を持つであろうと考
え、この相同性のある配列に基づくプライマー類を使用
するポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を適用することによっ
て、培養ヒトケラチノサイトからヒト表皮トランスグル
タミナーゼのｃＤＮＡをクローニングすることに成功し
本発明を完成した。

【０００８】従って、上記課題は、本発明に従う後述の
配列表の配列番号１に示されるヒト表皮TGase をコード
するＤＮＡ配列を提供することによって解決される。本
発明はまた、そのＤＮＡ配列を含み、適当な宿主中で複
製できる組換えベクターを提供し、さらにそのベクター
を導入した宿主細胞を誘導的に栄養培地で培養すること
によるヒト表皮トランスグルタミナーゼの生産方法も提
供する。

【０００９】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
のヒト表皮トランスグルタミナーゼをコードするＤＮＡ
配列は、具体的には後述の配列表の配列１に示されるｃ
ＤＮＡごとく、単一のオープンリーディングフレームを
含んでなる。このオープンリーディングフレームは、そ
の塩基配列36〜45（５′−CAGCCCCAGG−３′）が真核細
胞の18ｓｒＲＮＡの３′末端領域の塩基配列（３′−GA
AGGCGUCC−５′）（例えば、Hagenbuchle,O.ら、Cell,1
3,551〜563 ページ，1978、参照）およびKozak （J,Cel
l Biol.108, 229〜241 ページ，1989）に記載されてい
るコンセンサンスシークエンスと比べると一致するもの
とみなせる２つのＡＴＧにとり囲まれた塩基配列と高い
相同性を示すオパールコドンによって５′末端が終了し
ているので完全なものといえる。さらに、このｃＤＮＡ
の停止コドンには25残基のポリ（Ａ）テール以外に 175
bpのコードされない領域が続いており、推定のポリ
（Ａ）付加シグナルAATAA は、ポリ（Ａ）テールの開始
点の13塩基上流に位置する。その上、このｃＤＮＡで
は、オリゴヌクレオチドプライマ−ＴＧ＃１とＴＧ＃３
Ｃ（両者とも詳細は後述する）に相補的な塩基配列が見
い出され、それはスクリーニングプローブに用いられた
pHETGP挿入部の配列と完全に一致するので、配列１で示
されるｃＤＮＡはヒト表皮トランスグルタミナーゼをコ
ードする全塩基配列を含むといえる。

【００１０】この塩基配列から推定されるアミノ酸配列
を同配列表に併記する。このアミノ酸配列から推定され
るタンパク質は、 817アミノ酸残基からなり、その推計
上の分子量は89,799ダルトンである。これは、Shimidt
ら（J.Invest.Dermatol.,90, 475〜 479ページ，1988，
参照）で報告するポリアクリルアミドゲル電気泳動方法
によるヒト表皮トランスグルタミナーゼの分子量84,000
〜92,000とよく一致する。本発明のＤＮＡ配列の発現に
よって得られるヒト表皮トランスグルタミナーゼの活性
部位であるシステイン残基は 374〜 381の間にある。

【００１１】注目すべきことは、またこのヒト表皮トラ
ンスグルタミナーゼは、 108アミノ酸残基を含む特異な
Ｎ末端ドメインを持っていることであり、図に示すよう
にハイドロパッシイプロットをすると疎水性の信号ペプ
チド配列を持たない鎖長の中に２つの親水性領域（アミ
ノ酸26〜42，64〜83）の存在が推定される。その各々の
領域はアルギニンとセリンが多く、チュー・ファスマン
分析でβターン構造を持つことが推定される。

【００１２】Ｎ末端領域の機能は現在のところ不明であ
るがこの領域は酵素の活性化、作用、局在化において重
量な役割を果していると考えられる。以上のように、ヒ
ト表皮トランスグルタミナーゼの一次構造とその機能的
特徴から本発明のＤＮＡ配列を特徴付けることもでき
る。本発明のＤＮＡ配列は、以下のようにして得ること
ができる。

【００１３】まず、ヒト表皮トランスグルタミナーゼが
他の既知のトランスグルタミナーゼと高度の相同性をも
つ領域を有するものと推定し、その領域をコードするｃ
ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 増幅に使用するた
めの２種のオリゴヌクレオチドプライマーＴＧ＃１およ
びＴＧ＃Ｂ３Ｃを作製する（図１、参照）。これらの塩
基配列は、 ＴＧ＃１：５′−TATGGCCAGTGCTGGGTCTTTG−３′ ＴＧ＃３Ｃ：３′−AAGCGGCTCCACTTATCACT−５′ である。

【００１４】次に、培養ヒト表皮ケラチノサイトから抽
出した全ＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（dT) をプライマー
として用いる逆転写によって第１ストランドのｃＤＮＡ
を合成し、次いでこのｃＤＮＡを鋳型とし、上記ＴＧ＃
１とＴＧ＃３を使用してＰＣＲ法にかけて約 380bpのバ
ンドを増幅する（図２、参照）。このＰＣＲ生産物を適
当なベクターを用いて二次クローニングし、それらのク
ローンの一つがヒト表皮トランスグルタミナーゼの部分
ｃＤＮＡであることを確認する。

【００１５】一方、培養ヒトケラチノサイト由来するｃ
ＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラリーから上
記クローンの断片をプローブとしてスクリーニングを行
い、ポジティブクローンをプライマーＴＧ＃１とＴＧ＃
３Ｃを用いるＰＣＲ法でさらにスクリーニングする。こ
うして得られるｃＤＮＡフラグメントをプライマーウォ
ーキング法によって２方向からシーケェンス（図２Ａ）
して目的のｃＤＮＡ配列が得られたことを確認する。

【００１６】本発明のＤＮＡ配列は、単一のオープンリ
ーディングフレームとしてヒト表皮トランスグルタミナ
ーゼをコードするので、これを適当なベクターに挿入す
ることによってその発現ベクターを作製することがで
き、さらにこの発現ベクターで適当な宿主を形質転換す
ることによって、ヒト表皮トランスグルタミナーゼ産生
形質転換体を得ることができる。

【００１７】本発明の組換えベクターおよびそれらを導
入することのできる宿主細胞は、それ自体公知でその幾
つかは市販されているものを用いることができる。ま
た、上記組換え方法および導入方法もそれ自体公知の方
法をそのまま、あるいは改良して行うことができる。限
定されるものでないが、本発明で使用できる宿主、ベク
ターおよび導入方法の組み合わせで好ましいものを下記
にまとめる。

【００１８】 宿 主 ベクター 導入方法 大腸菌 プラスミドベクター pMB9 塩化カルシウムなどの pBR322 処理により細胞のＤＮ pMK16 Ａ透過性を高める方法 コスミドベクター pKY2662 ファージ粒子の形成法 pHC79 λファージベクター シャロン１ インビトロパッケージ シャロン21Ａ ング法 枯草菌 プラスミドベクター pUB110 コンピテント細胞の利 pBD8 用 pSL105 酵母 ベクター YRp7 スフェロブラスト形成 YEp21 法 CV7 哺乳動物 ウィルス pSVGT1-X リン酸カルシウム−Ｄ pSVO-X ＮＡ複合体による導入 法、プロトプラスト融 合法、ＤＥＡＥ・デキ ストラン法 ────── ──────────────── ───────── 以上により得られるヒト表皮トランスグルタミナーゼを
コードするＤＮＡ配列を含み、かつ宿主の中で複製でき
る組換えベクターを導入した宿主は、使用する宿主の培
養に適する条件下で培養することができるが、本酵素の
産生は適当な誘導剤の培地への添加を必要とする。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。細胞培養 包皮由来の正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）の二次
培養をSANKO より入手し、3.６×10⁵ セル／30mlＫＧＭ
の割合で直径15cmのプレートに植え付け、２日間培養
し、培地は１mMカルシウムを添加したＫＧＭに代えた。
６日間培養後、細胞はＲＮＡ抽出に供した。

【００２０】なお、上記のヒト表皮ケラチノサイト（角
化細胞）の培養は、増殖因子の存在下、カルシウムイオ
ン（Ca²⁺) 濃度0.03〜0.８mMで行うのが好ましい。増殖
因子の添加方法は、血清の添加、精製された増殖因子の
添加、増殖支持細胞層の添加などである。精製された増
殖因子としては、たとえば、エピダーマルグロースファ
クター、ヘイドロユルチゾン、インシュリンなどであ
る。増殖支持細胞層はたとえば「3T3 SWISS ALBINO」な
どである。また、培養効率を向上させるためにコラーゲ
ンコートを用いて細胞接着により培養することもでき
る。

【００２１】部分ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅 オリゴヌクレオチドプライマーＴＧ＃１とＴＧ＃３Ｃを
ラビット表皮トランスグルタミナーゼ、モルモット肝ト
ランスグルタミナーゼおよびヒト因子XIIIa に保存され
ているアミノ酸配列を基にしてＤＮＡシンセサイザー38
1Ａ（アプライドバイオシステム）で合成した（図１、
参照）。

【００２２】全ＲＮＡはNHEKから作製し、第一ストラン
ドｃＤＮＡはＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成キット（ファ
ルマシア）で合成した。20μｇのｃＤＮＡをＴＧ＃１と
ＴＧ＃３Ｃプライマーを用いたＰＣＲの鋳型として用い
た。加温サイクルは常法に従っておこなった。増幅され
たフラグメントは５％ポリアミドゲルで分離・解析し、
エチジウムブロマイドで発色した。

【００２３】ブラグメントはpGEM4Zベクター（プロメ
ガ）で二次クローニングし、クローンの一つであるpHET
GPの断片をジデオキシ末端法でシークエンスした。ｃＤＮＡクローニングとシークエンス ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡはNHEKの全ＲＮＡから、mRNA純化キ
ット（ファルマシア）を担持するオリゴ（dT) セルロー
ススパンカラム法で純化した。

【００２４】ｃＤＮＡライブラリーはpSPORT中のポリ
（Ａ）⁺ＲＮＡ， SUPERSCRIPTプラスドシステム（BRL)
をもった指向性ファージ化ベクターを用い試薬供給者の
指示通りに構築した。このライブラリーは³²Ｐでラベル
したpHETGP断片でコロニーハイブリダイゼーションして
スクリーニングした。

【００２５】ＴＧ＃１およびＴＧ＃３Ｃプライマーを持
った20ポジティブクローンをＰＣＲスクリーニングして
８×10⁴ の独立した組換え体から14クローンを得た。こ
れらの中で最長のＤＮＡ断片を含む１つのクローンpHET
G −ＭをＴ７シークエンシングシステム（Promega)によ
るプライマーウォーキング法によって２方向シークエン
スした。

【００２６】塩基配列とアミノ酸配列の解析 ＤＮＡとアミノ酸配列はSDC −GENETYX(Software Devel
oping)とIDEAS でDDBJのNIG コンピューターシステムを
用いて解析した。レプリカ培養 クローニングしたヒト表皮トランスグルタミナーゼｃＤ
ＮＡのなかでＰＣＲ法を用いて増幅して得た開始コドン
ATG からBgI11 切断部位までのＤＮＡ断片とｃＤＮＡの
制限酵素処理により得たBgI11 − Sac１（805 −2620）
断片を大腸菌の発現プロモーターの１つである。 tacプ
ロモーター、SD配列、転写終結領域を有するpBR322由来
の発現ベクターpKK223−３のEcoR１部位Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて挿入し、JM109 株を形質転換することによ
りアンピシリン耐性のコロニーから、ヒト表皮トランス
グルタミナーゼ発現プラスミドpKHETGを得た。このプラ
スミドを持つ大腸菌JM109 を培養し、IPTG（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導すること
により、大腸菌封入体から、ヒト表皮トランスグルタミ
ナーゼの活性が認められた。

【００２７】

【発明の効果】本発明によって、ヒト表皮トランスグル
タミナーゼをコードするＤＮＡ配列およびそれを含み、
かつ宿主中で複製できる組換えベクターが提供される。
これによって、ヒト表皮トランスグルタミナーゼの生産
が容易になるだけでなく、本酵素のプロテインエンジニ
アリング的な改変、本酵素に特異的な抗体の作製、各種
研究試薬および医薬品開発の端緒が開ける。

【００２８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：2734 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens） 細胞の種類：角化細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：81..2534 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GGGTCCTGTC CCATCCATCC TGACCTGTTC CATCTCAGCC CCAGGACTCA GTACTGCGGT 60 TGCCAACACT GCTGCCAGGC ATG ATG GAT GGG CCA CGT TCC GAT GTG GGC CGT 113 Met Met Asp Gly Pro Arg Ser Asp Val Gly Arg 1 5 10 TGG GGT GGC AAC CCC TTG CAG CCC CCT ACC ACG CCA TCT CCA GAG CCA 161 Trp Gly Gly Asn Pro Leu Gln Pro Pro Thr Thr Pro Ser Pro Glu Pro 15 20 25 GAG CCA GAG CCA GAC GGA CGC TCT CGC AGA GGA GGA GGC CGT TCC TTC 209 Glu Pro Glu Pro Asp Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly Arg Ser Phe 30 35 40 TGG GCT CGC TGC TGT GGC TGC TGT TCA TGC CGA AAT GCG GCA GAT GAC 257 Trp Ala Arg Cys Cys Gly Cys Cys Ser Cys Arg Asn Ala Ala Asp Asp 45 50 55 GAC TGG GGA CCT GAA CCC TCT GAC TCC AGG GGT CGA GGG TCC AGC TCT 305 Asp Trp Gly Pro Glu Pro Ser Asp Ser Arg Gly Arg Gly Ser Ser Ser 60 65 70 75 GGC ACT CGA AGA CCT GGC TCC CGG GGC TCA GAC TCC CGC CGG CCT GTA 353 Gly Thr Arg Arg Pro Gly Ser Arg Gly Ser Asp Ser Arg Arg Pro Val 80 85 90 TCC CGG GGC AGC GGT GTC AAT GCA GCT GGA GAT GGC ACC ATC CGA GAG 401 Ser Arg Gly Ser Gly Val Asn Ala Ala Gly Asp Gly Thr Ile Arg Glu 95 100 105 GGC ATG CTA GTA GTG AAC GGT GTG GAC TTG CTG AGC TCG CGC TCG GAC 449 Gly Met Leu Val Val Asn Gly Val Asp Leu Leu Ser Ser Arg Ser Asp 110 115 120 CAG AAC CGC CGA GAG CAC CAC ACA GAC GAG TAT GAG TAC GAC GAG CTG 497 Gln Asn Arg Arg Glu His His Thr Asp Glu Tyr Glu Tyr Asp Glu Leu 125 130 135 ATA GTG CGC CGC GGG CAG CCT TTC CAT ATG CTC CTC CTC CTG TCC CGG 545 Ile Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe His Met Leu Leu Leu Leu Ser Arg 140 145 150 155 ACC TAT GAA TCC TCT GAT CGC ATC ACC CTT GAG TTA CTC ATC GGA AAC 593 Thr Tyr Glu Ser Ser Asp Arg Ile Thr Leu Glu Leu Leu Ile Gly Asn 160 165 170 AAC CCC GAG GTG GGC AAG GGC ACG CAC GTG ATC ATC CCA GTG GGC AAG 641 Asn Pro Glu Val Gly Lys Gly Thr His Val Ile Ile Pro Val Gly Lys 175 180 185 GGG GGC AGT GGA GGC TGG AAA GCC CAG GTG GTC AAG GCC AGT GGG CAG 689 Gly Gly Ser Gly Gly Trp Lys Ala Gln Val Val Lys Ala Ser Gly Gln 190 195 200 AAT CTG AAC CTG CGG GTC CAC ACT TCC CCC AAC GCC ATC ATC GGC AAG 737 Asn Leu Asn Leu Arg Val His Thr Ser Pro Asn Ala Ile Ile Gly Lys 205 210 215 TTT CAG TTC ACA GTC CGC ACA CAA TCA GAC GCT GGG GAG TTC CAG TTG 785 Phe Gln Phe Thr Val Arg Thr Gln Ser Asp Ala Gly Glu Phe Gln Leu 220 225 230 235 CCC TTT GAC CCC CGC AAT GAG ATC TAC ATC CTC TTC AAC CCC TGG TGC 833 Pro Phe Asp Pro Arg Asn Glu Ile Tyr Ile Leu Phe Asn Pro Trp Cys 240 245 250 CCA GAG GAC ATT GTG TAC GTG GAC CAT GAG GAT TGG CGG CAG GAG TAT 881 Pro Glu Asp Ile Val Tyr Val Asp His Glu Asp Trp Arg Gln Glu Tyr 255 260 265 GTT CTT AAT GAG TCT GGG AGA ATT TAC TAC GGG ACC GAA GCA CAG ATT 929 Val Leu Asn Glu Ser Gly Arg Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Ala Gln Ile 270 275 280 GGT GAG CGG ACC TGG AAC TAC GGC CAG TTT GAC CAC GGG GTG CTG GAT 977 Gly Glu Arg Thr Trp Asn Tyr Gly Gln Phe Asp His Gly Val Leu Asp 285 290 295 GCC TGC TTA TAC ATC CTG GAC CGG CGG GGG ATG CCA TAT GGA GGC CGT 1025 Ala Cys Leu Tyr Ile Leu Asp Arg Arg Gly Met Pro Tyr Gly Gly Arg 300 305 310 315 GGA GAC CCA GTC AAT GTC TCC CGG GTC ATC TCT GCC ATG GTG AAC TCC 1073 Gly Asp Pro Val Asn Val Ser Arg Val Ile Ser Ala Met Val Asn Ser 320 325 330 CTG GAT GAC AAT GGA GTC CTG ATT GGG AAC TGG TCT GGT GAT TAC TCC 1121 Leu Asp Asp Asn Gly Val Leu Ile Gly Asn Trp Ser Gly Asp Tyr Ser 335 340 345 CGA GGC ACC AAC CCA TCA GCG TGG GTG GGC AGC GTG GAG ATC CTG CTT 1169 Arg Gly Thr Asn Pro Ser Ala Trp Val Gly Ser Val Glu Ile Leu Leu 350 355 360 AGC TAC CTA CGC ACG GGA TAT TCC GTC CCC TAT GGC CAG TGC TGG GTC 1217 Ser Tyr Leu Arg Thr Gly Tyr Ser Val Pro Tyr Gly Gln Cys Trp Val 365 370 375 TTT GCT GGA GTG ACC ACC ACA GTG CTG CGC TGC CTG GGT CTG GCC ACC 1265 Phe Ala Gly Val Thr Thr Thr Val Leu Arg Cys Leu Gly Leu Ala Thr 380 385 390 395 CGT ACT GTC ACC AAC TTC AAC TCC GCC CAC GAC ACA GAC ACA TCC CTT 1313 Arg Thr Val Thr Asn Phe Asn Ser Ala His Asp Thr Asp Thr Ser Leu 400 405 410 ACC ATG GAC ATC TAC TTC GAC GAG AAC ATG AAG CCC CTG GAG CAC CTG 1361 Thr Met Asp Ile Tyr Phe Asp Glu Asn Met Lys Pro Leu Glu His Leu 415 420 425 AAC CAT GAT TCT GTC TGG AAC TTC CAT GTG TGG AAC GAC TGC TGG ATG 1409 Asn His Asp Ser Val Trp Asn Phe His Val Trp Asn Asp Cys Trp Met 430 435 440 AAG AGG CCG GAT CTG CCC TCG GGC TTT GAT GGG TGG CAG GTG GTG GAT 1457 Lys Arg Pro Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asp Gly Trp Gln Val Val Asp 445 450 455 GCC ACA CCC CAA GAG ACT AGC AGT GGC ATC TTC TGC TGC GGC CCC TGC 1505 Ala Thr Pro Gln Glu Thr Ser Ser Gly Ile Phe Cys Cys Gly Pro Cys 460 465 470 475 TCT GTG GAG TCC ATC AAG AAT GGC CTG GTC TAC ATG AAG TAC GAC ACG 1553 Ser Val Glu Ser Ile Lys Asn Gly Leu Val Tyr Met Lys Tyr Asp Thr 480 485 490 CCT TTC ATT TTT GCT GAG GTG AAT AGT GAC AAG GTG TAC TGG CAG CGG 1601 Pro Phe Ile Phe Ala Glu Val Asn Ser Asp Lys Val Tyr Trp Gln Arg 495 500 505 CAG GAT GAT GGC AGC TTC AAG ATT GTT TAT GTG GAG GAG AAG GCC ATC 1649 Gln Asp Asp Gly Ser Phe Lys Ile Val Tyr Val Glu Glu Lys Ala Ile 510 515 520 GGC ACA CTC ATT GTC ACA AAG GCC ATC AGC TCC AAC ATG CGG GAG GAC 1697 Gly Thr Leu Ile Val Thr Lys Ala Ile Ser Ser Asn Met Arg Glu Asp 525 530 535 ATC ACC TAC CTC TAT AAG CAC CCA GAA GGC TCA GAC GCA GAG CGG AAG 1745 Ile Thr Tyr Leu Tyr Lys His Pro Glu Gly Ser Asp Ala Glu Arg Lys 540 545 550 555 GCA GTA GAG ACA GCA GCA GCC CAC GGC AGC AAA CCC AAT GTG TAT GCC 1793 Ala Val Glu Thr Ala Ala Ala His Gly Ser Lys Pro Asn Val Tyr Ala 560 565 570 AAC CGG GGC TCA GCG GAG GAT GTG GCC ATG CAG GTG GAG GCA CAG GAC 1841 Asn Arg Gly Ser Ala Glu Asp Val Ala Met Gln Val Glu Ala Gln Asp 575 580 585 GCG GTG ATG GGG CAG GAT CTG ATG GTC TCT GTG ATG CTG ATC AAT CAC 1889 Ala Val Met Gly Gln Asp Leu Met Val Ser Val Met Leu Ile Asn His 590 595 600 AGC AGC AGC CGC CGC ACA GTG AAA CTG CAC CTC TAC CTC TCA GTC ACT 1937 Ser Ser Ser Arg Arg Thr Val Lys Leu His Leu Tyr Leu Ser Val Thr 605 610 615 TTC TAT ACT GGT GTC AGT GGT ACC ATC TTC AAG GAG ACC AAG AAG GAA 1985 Phe Tyr Thr Gly Val Ser Gly Thr Ile Phe Lys Glu Thr Lys Lys Glu 620 625 630 635 GTG GAG CTG GCA CCA GGG GCC TCG GAC CGT GTG ACC ATG CCA GTG GCC 2033 Val Glu Leu Ala Pro Gly Ala Ser Asp Arg Val Thr Met Pro Val Ala 640 645 650 TAC AAG GAA TAC CGG CCC CAT CTT GTG GAC CAG GGG GCC ATG CTG CTC 2081 Tyr Lys Glu Tyr Arg Pro His Leu Val Asp Gln Gly Ala Met Leu Leu 655 660 665 AAT GTC TCA GGC CAC GTC AAG GAG AGC GGG CAG GTG CTG GCC AAG CAG 2129 Asn Val Ser Gly His Val Lys Glu Ser Gly Gln Val Leu Ala Lys Gln 670 675 680 CAC ACC TTC CGT CTG CGC ACC CCA GAC CTC TCC CTC ACG TTA CTG GGA 2177 His Thr Phe Arg Leu Arg Thr Pro Asp Leu Ser Leu Thr Leu Leu Gly 685 690 695 GCA GCA GTG GTT GGC CAG GAG TGT GAA GTA CAG ATT GTC TTC AAG AAC 2225 Ala Ala Val Val Gly Gln Glu Cys Glu Val Gln Ile Val Phe Lys Asn 700 705 710 715 CCC CTT CCC GTC ACC CTC ACC AAT GTC GTC TTC CGG CTC GAA GGC TCT 2273 Pro Leu Pro Val Thr Leu Thr Asn Val Val Phe Arg Leu Glu Gly Ser 720 725 730 GGG TTA CAG AGG CCC AAG ATC CTC AAC GTT GGG GAC ATT GGA GGC AAT 2321 Gly Leu Gln Arg Pro Lys Ile Leu Asn Val Gly Asp Ile Gly Gly Asn 735 740 745 GAA ACA GTG ACA CTG CGC CAG TCG TTT GTG CCT GTG CGA CCA GGC CCC 2369 Glu Thr Val Thr Leu Arg Gln Ser Phe Val Pro Val Arg Pro Gly Pro 750 755 760 CGC CAG CTC ATT GCC AGC TTG GAC AGC CCA CAG CTC TCC CAG GTG CAC 2417 Arg Gln Leu Ile Ala Ser Leu Asp Ser Pro Gln Leu Ser Gln Val His 765 770 775 GGT GTC ATC CAG GTG GAT GTG GCC CCA GCC CCT GGG GAT GGG GGC TTC 2465 Gly Val Ile Gln Val Asp Val Ala Pro Ala Pro Gly Asp Gly Gly Phe 780 785 790 795 TTC TCA GAC GCT GGA GGT GAC AGT CAC TTA GGA GAG ACC ATC CCT ATG 2513 Phe Ser Asp Ala Gly Gly Asp Ser His Leu Gly Glu Thr Ile Pro Met 800 805 810 GCA TCT CGA GGT GGA GCT TAG CCCT GTGCCAGGAG CAATGGGACT GGAGTCAGAT 2568 Ala Ser Arg Gly Gly Ala 815 817 GAGCAAGGAC ATTGCCCCAA GATAGGGGCA CACTACAGAG CAGCTCCCCA GGAGCTCAGG 2628 TGGGGAGTCC AGGGCTCCCG GAGAGGGAGT CAGTCTTCAC TTGCACTGGG GGAACAGATG 2688 CTAATAAACT GTTTTTTAAT GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 2734

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ用プライマーの設計を示し、プライマー
ＴＧ＃１とＴＧ＃３はトランスグルタミナーゼファミリ
ーのウサギ表皮トランスグルタミナーゼ（RBTG) 、モル
モット肝トランスグルタミナーゼ(GLTG)およびヒト凝固
因子XIIIa(XIII) において保存されているアミノ酸配列
に相当する塩基配列から導いた。

【図２】ｃＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を示し、プライマー
ＴＧ＃１とＴＧ＃３Ｃを持ったＰＣＲ産生物は実施例に
示したように電気泳動法で解析した。 左側ライン：pUC18HpaIIマーカー 右側ライン：矢印は約 380bpの増幅バンドを示す。

【図３】シークエンス手順を示す。ｃＤＮＡのコードさ
れた領域は斜線ボックスで、コードされない領域は実線
で示した。矢印はプライマーウォーキングによる塩基配
列決定の巾と方向を示す。

【図４】ヒト表皮トランスグルタミナーゼの推定される
アミノ酸配列のハイドロパッシイプロットを示す。正値
はカイト・ドーリットル法による疎水領域を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土井 浩 茨城県つくば市春日２−26−２ 苅間ハ イツＣ−106 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．226，Ｎｏ．１（1991）ｐ. 536−539 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で特定されるアミノ
   酸配列を有するヒト表皮トランスグルタミナーゼをコー
   ドするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１のコード領域の塩基
   配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含み、
   宿主の中で複製できる組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載のベクターを導入した宿主
   を培養し、前記ＤＮＡを誘導的に発現させることを特徴
   とするヒト表皮トランスグルタミナーゼの生産方法。