JP3095183B2 - 新規酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
新規酵素及びそれをコードするｄｎａInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチジルヒドロキシ
グリシンＮ−Ｃリアーゼ(peptidylhydroxyglycine N-C
lyase)酵素(PHL) 、ＰＨＬをコードするＤＮＡ分子、並
びにＰＨＬの製造及び使用に関する。
グリシンＮ−Ｃリアーゼ(peptidylhydroxyglycine N-C
lyase)酵素(PHL) 、ＰＨＬをコードするＤＮＡ分子、並
びにＰＨＬの製造及び使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの生理的に活性なペプチド、例えば
カルシトニン、成長ホルモン放出因子、LH−RH（黄体形
成ホルモン放出ホルモン）、バソプレッシン、ガストリ
ン、α−MSH(α−メラノトロピン) 等は、それらのＣ−
末端がアミド化されている場合にのみ活性である。しか
しながら、化学合成又は直接的遺伝子工学的方法により
Ｃ−末端がアミド化されたペプチドを直接に工業的に製
造することは困難である。
カルシトニン、成長ホルモン放出因子、LH−RH（黄体形
成ホルモン放出ホルモン）、バソプレッシン、ガストリ
ン、α−MSH(α−メラノトロピン) 等は、それらのＣ−
末端がアミド化されている場合にのみ活性である。しか
しながら、化学合成又は直接的遺伝子工学的方法により
Ｃ−末端がアミド化されたペプチドを直接に工業的に製
造することは困難である。
【０００３】これらの製造は二段階法により一層よく達
成することができ、この方法においては第一段階でアミ
ド化されていないペプチドが製造されそして第二段階で
そのＣ−末端がアミド化される。この様な方法の一例に
おいてはＣ−末端に追加のグリシンユニットを有するペ
プチドを合成し、そして第二段階においてそれを、Ｃ−
末端アミド化酵素、すなわちペプチジルグリシンα−ア
ミド化モノオキシゲナーゼ(PAM) を用いてＣ−末端がア
ミド化された酵素に転換する。
成することができ、この方法においては第一段階でアミ
ド化されていないペプチドが製造されそして第二段階で
そのＣ−末端がアミド化される。この様な方法の一例に
おいてはＣ−末端に追加のグリシンユニットを有するペ
プチドを合成し、そして第二段階においてそれを、Ｃ−
末端アミド化酵素、すなわちペプチジルグリシンα−ア
ミド化モノオキシゲナーゼ(PAM) を用いてＣ−末端がア
ミド化された酵素に転換する。
【０００４】種々の起原、例えばアフリカツメガエル(X
enopus laevis) の体皮(Mizuno,K.ら、Biochem.Biophy
s.Res.Commun. 137, 984−991, 1986; Mizuno,K.ら、Bi
ochem.Biophys.Res.Commun. 148, 546−553, 1987; Ohs
uye,K.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 150, 1275−
1281, 1988) 、ブタ脳下垂体 (Kizer,J.S.ら、Endocrin
ology, 118, 2262−2267, 1986) 、ウシ脳下垂体(Murth
y,A.S.N.ら、J.Biol.Chem. 261, 1815−1822, 1986； E
ipper,B.A.ら、Mol.Endocrinol. 1, 777−790,1987)、
ラット脳下垂体 (Mehta,N.M.ら、Arch.Biochem.Biophy
s., 261, 44−54, 1988；Birtelsen,A.H.ら、Arch.Bioc
hem.Biophys., 279, 87−96, 1990； Stoffers,D.A.
ら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,735−749, 1989)、及
びヒト (Glauder,J.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.
169, 551−558, 1990)のＣ−末端アミド化酵素(PAM) が
精製され、そして対応するcDNAが調製されている。
enopus laevis) の体皮(Mizuno,K.ら、Biochem.Biophy
s.Res.Commun. 137, 984−991, 1986; Mizuno,K.ら、Bi
ochem.Biophys.Res.Commun. 148, 546−553, 1987; Ohs
uye,K.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 150, 1275−
1281, 1988) 、ブタ脳下垂体 (Kizer,J.S.ら、Endocrin
ology, 118, 2262−2267, 1986) 、ウシ脳下垂体(Murth
y,A.S.N.ら、J.Biol.Chem. 261, 1815−1822, 1986； E
ipper,B.A.ら、Mol.Endocrinol. 1, 777−790,1987)、
ラット脳下垂体 (Mehta,N.M.ら、Arch.Biochem.Biophy
s., 261, 44−54, 1988；Birtelsen,A.H.ら、Arch.Bioc
hem.Biophys., 279, 87−96, 1990； Stoffers,D.A.
ら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,735−749, 1989)、及
びヒト (Glauder,J.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.
169, 551−558, 1990)のＣ−末端アミド化酵素(PAM) が
精製され、そして対応するcDNAが調製されている。
【０００５】アフリカツメガエル(Xenopus laevis) の
体皮に由来するＣ−末端アミド化酵素ＰＡＭをコードす
るcDNAがバキュロウイルス(Baculovirus) 発現ベクター
系に挿入され、そして昆虫細胞中で発現された。こうし
て調製された精製酵素を、ヒトカルシトニン(hCT) のＣ
−末端の７個のアミノ酸残基に相当するペプチドのＣ−
末端にグリシンアミノ酸残基を加えることにより調製さ
れたモデルペプチド Ala−Ile −Gly −Val −Gly −Al
a −Pro−Gly に作用した場合、形成された生成物は最
初に予想したアミド化ペプチド(Ala−Ile −Gly −Val
−Gly −Ala −Pro −NH2)ではなく、Ｃ−末端α−ヒド
ロキシグリシン残基を有するペプチド(Ala−Ile −Gly
−Val −Gly −Ala −Pro−Gly −OH) であった (ヨー
ロッパ特許出願No.91810163.5)。
体皮に由来するＣ−末端アミド化酵素ＰＡＭをコードす
るcDNAがバキュロウイルス(Baculovirus) 発現ベクター
系に挿入され、そして昆虫細胞中で発現された。こうし
て調製された精製酵素を、ヒトカルシトニン(hCT) のＣ
−末端の７個のアミノ酸残基に相当するペプチドのＣ−
末端にグリシンアミノ酸残基を加えることにより調製さ
れたモデルペプチド Ala−Ile −Gly −Val −Gly −Al
a −Pro−Gly に作用した場合、形成された生成物は最
初に予想したアミド化ペプチド(Ala−Ile −Gly −Val
−Gly −Ala −Pro −NH2)ではなく、Ｃ−末端α−ヒド
ロキシグリシン残基を有するペプチド(Ala−Ile −Gly
−Val −Gly −Ala −Pro−Gly −OH) であった (ヨー
ロッパ特許出願No.91810163.5)。
【０００６】この知見に基いて推定し得ることは、生理
的Ｃ−末端アミド化反応は２つの酵素的段階、すなわち
今まで知られているＣ−末端アミド化酵素(PAM) により
触媒される基質ペプチドのＣ−末端グリシンのα−ヒド
ロキシル化である第一段階、及び他の新規な酵素により
触媒されるα−ヒドロキシグリシン部分のＮ−Ｃ結合の
開裂によるアミド化である第二段階を含むことである。
的Ｃ−末端アミド化反応は２つの酵素的段階、すなわち
今まで知られているＣ−末端アミド化酵素(PAM) により
触媒される基質ペプチドのＣ−末端グリシンのα−ヒド
ロキシル化である第一段階、及び他の新規な酵素により
触媒されるα−ヒドロキシグリシン部分のＮ−Ｃ結合の
開裂によるアミド化である第二段階を含むことである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｃ−
末端がヒドロキシグリシル化されたペプチドのα−ヒド
ロキシグリシン部分のＮ−Ｃ結合の開裂を触媒する酵素
を同定し、そして提供することである。この様な酵素を
本発明においてはペプチジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃ
リアーゼ(PHL) と命名する。
末端がヒドロキシグリシル化されたペプチドのα−ヒド
ロキシグリシン部分のＮ−Ｃ結合の開裂を触媒する酵素
を同定し、そして提供することである。この様な酵素を
本発明においてはペプチジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃ
リアーゼ(PHL) と命名する。
【０００８】本発明の他の目的は、ＰＨＬをコードする
ＤＮＡ分子を提供すること、及び組換ＤＮＡ技術による
ＰＨＬの製造方法を提供することである。本発明の他の
目的はＰＨＬによるＣ−末端がアミド化されたペプチド
の製造方法を提供することである。
ＤＮＡ分子を提供すること、及び組換ＤＮＡ技術による
ＰＨＬの製造方法を提供することである。本発明の他の
目的はＰＨＬによるＣ−末端がアミド化されたペプチド
の製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ＰＨＬ酵素及び天然源からのその製造 本発明は次の反応 Ｒ−GlyOH →Ｒ−NH2 （式中、Ｒはペプチド残基を表わし、そして GlyOHは該
ペプチドＲのＣ−末端にアミド結合により連結されたα
−ヒドロキシグリシン残基を表わす）を触媒するペプチ
ジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃリアーゼ(PHL) に関す
る。
ペプチドＲのＣ−末端にアミド結合により連結されたα
−ヒドロキシグリシン残基を表わす）を触媒するペプチ
ジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃリアーゼ(PHL) に関す
る。
【００１０】ＰＨＬの検索においては、まずこの様な酵
素の活性測定方法が確立されなければならなかった。や
はり本発明の対象であるこの方法は、（ａ）２mMのベン
ゾイルヒドロキシグリシン及びＰＨＬを含有する溶液を
最終濃度100mM のＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホリノ）−エ
タンスルホン酸〕(pH5.2) に加え、（ｂ）37℃にて30分
間反応を行い、（ｃ）反応混合物に過塩素酸を加えて反
応を停止せしめ、（ｄ）混合物を遠心分離し、そして
（ｅ）常法により、例えばHPLCにより上清中の生成物を
測定する、ことを含んで成る。
素の活性測定方法が確立されなければならなかった。や
はり本発明の対象であるこの方法は、（ａ）２mMのベン
ゾイルヒドロキシグリシン及びＰＨＬを含有する溶液を
最終濃度100mM のＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホリノ）−エ
タンスルホン酸〕(pH5.2) に加え、（ｂ）37℃にて30分
間反応を行い、（ｃ）反応混合物に過塩素酸を加えて反
応を停止せしめ、（ｄ）混合物を遠心分離し、そして
（ｅ）常法により、例えばHPLCにより上清中の生成物を
測定する、ことを含んで成る。
【００１１】上記の条件下で１分間当り１ピコモルのア
ミド化された生成物を形成するＰＨＬ酵素の量を「１ユ
ニット」と定義する。前記の方法によりＰＨＬ活性を種
々の動物組織中で測定することができる。ＰＡＭ酵素を
含有することが知られている動物組織、例えばアフリカ
ツメガエルの体皮、又はウシ、ブタ、ラットもしくはヒ
トの脳下垂体中でＰＨＬが示され得る。
ミド化された生成物を形成するＰＨＬ酵素の量を「１ユ
ニット」と定義する。前記の方法によりＰＨＬ活性を種
々の動物組織中で測定することができる。ＰＡＭ酵素を
含有することが知られている動物組織、例えばアフリカ
ツメガエルの体皮、又はウシ、ブタ、ラットもしくはヒ
トの脳下垂体中でＰＨＬが示され得る。
【００１２】ＰＨＬはこれらの組織から、常法により、
例えば組織のホモジネーション、クロマトグラフィー、
例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマト
グラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィー、沈
澱、例えば硫酸アンモニウムもしくは酸による沈澱、調
製用電気泳動、例えばＳＤＳ−ゲル電気泳動又は等電点
沈澱、等を含む方法により精製することができる。
例えば組織のホモジネーション、クロマトグラフィー、
例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマト
グラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィー、沈
澱、例えば硫酸アンモニウムもしくは酸による沈澱、調
製用電気泳動、例えばＳＤＳ−ゲル電気泳動又は等電点
沈澱、等を含む方法により精製することができる。
【００１３】アフリカツメガエルの体皮からＰＨＬを精
製するための好ましい方法を実施例１に記載する。この
方法は、硫酸アンモニウム沈澱、並びにDEAE−Sepharos
e CL−6Bカラム、 Superose 12分子篩カラム及びMono Q
カラムの使用を含む。天然源から単離されたＰＨＬのア
ミノ酸配列は常法に従って、例えば自動気相アミノ酸配
列決定機により決定することができる。
製するための好ましい方法を実施例１に記載する。この
方法は、硫酸アンモニウム沈澱、並びにDEAE−Sepharos
e CL−6Bカラム、 Superose 12分子篩カラム及びMono Q
カラムの使用を含む。天然源から単離されたＰＨＬのア
ミノ酸配列は常法に従って、例えば自動気相アミノ酸配
列決定機により決定することができる。
【００１４】アフリカツメガエルからのＰＨＬのＮ−末
端及びそのトリプシン分解断片の配列が決定された。こ
れらの配列は、配列表の配列番号：１に示される配列中
383位 (Glu, PHLのＮ−末端) から下流のアミノ酸配列
に相当する。アフリカツメガエルの体皮から得られるＰ
ＨＬのアミノ酸配列を有するポリペプチド (以後、単に
アフリカツメガエル由来のＰＨＬと称する) が本発明の
最も好ましい態様である。アフリカツメガエル由来の天
然ＰＨＬの全アミノ酸配列は383位から約 706位又は約
713位のアミノ酸まで延びる。しかしながら、本発明の
意味におけるＰＨＬは天然ＰＨＬのみならず、ＰＨＬ活
性を有するあらゆるポリペプチドを含む。この様なポリ
ペプチドは天然ＰＨＬをコードするＤＮＡ配列又はその
断片もしくは変異体に由来することができる。
端及びそのトリプシン分解断片の配列が決定された。こ
れらの配列は、配列表の配列番号：１に示される配列中
383位 (Glu, PHLのＮ−末端) から下流のアミノ酸配列
に相当する。アフリカツメガエルの体皮から得られるＰ
ＨＬのアミノ酸配列を有するポリペプチド (以後、単に
アフリカツメガエル由来のＰＨＬと称する) が本発明の
最も好ましい態様である。アフリカツメガエル由来の天
然ＰＨＬの全アミノ酸配列は383位から約 706位又は約
713位のアミノ酸まで延びる。しかしながら、本発明の
意味におけるＰＨＬは天然ＰＨＬのみならず、ＰＨＬ活
性を有するあらゆるポリペプチドを含む。この様なポリ
ペプチドは天然ＰＨＬをコードするＤＮＡ配列又はその
断片もしくは変異体に由来することができる。
【００１５】従って、本発明はまた、ＰＨＬ活性を有す
るより長いポリペプチド、例えば配列番号：１のＤＮＡ
によりコードされる約 363位〜約 383位のアミノ酸から
始まり約 706位〜約 935位のいずれかのアミノ酸まで
（このアミノ酸を含む）延びるポリペプチドに関する。
ＰＨＬ活性を有するより長いポリペプチドはまた、天然
にはそれに直接結合していないアミノ酸配列、例えば大
腸菌由来のアミノ酸配列、例えばTrpEもしくはβ−ガラ
クトシダーゼ、又はさらにＰＨＬコード領域の近傍に位
置するＤＮＡ領域によりコードされるアミノ酸により延
長されていてもよい。
るより長いポリペプチド、例えば配列番号：１のＤＮＡ
によりコードされる約 363位〜約 383位のアミノ酸から
始まり約 706位〜約 935位のいずれかのアミノ酸まで
（このアミノ酸を含む）延びるポリペプチドに関する。
ＰＨＬ活性を有するより長いポリペプチドはまた、天然
にはそれに直接結合していないアミノ酸配列、例えば大
腸菌由来のアミノ酸配列、例えばTrpEもしくはβ−ガラ
クトシダーゼ、又はさらにＰＨＬコード領域の近傍に位
置するＤＮＡ領域によりコードされるアミノ酸により延
長されていてもよい。
【００１６】後者のタイプのポリペプチドは例えば、実
施例３に従って調製されるベクターpVL−PHL 中に挿入
されたコード領域によりコードされている。このポリペ
プチドは、配列表：１のＤＮＡによりコードされるアミ
ノ酸配列のアミノ酸１〜60及び 363〜760 から構成され
る。本発明は好ましくは、約 363位又は約 383位から始
まりそして約 706位、約 713位、約 760位又は約 935位
まで（これらを含む）延び、ＰＨＬ活性を有するポリペ
プチドに関する。天然形に対応する、すなわち 383位か
ら始まり 706位又は713位で終る蛋白質、及びベクター
pVL−PHL の挿入部によりコードされた蛋白質が最も好
ましい。
施例３に従って調製されるベクターpVL−PHL 中に挿入
されたコード領域によりコードされている。このポリペ
プチドは、配列表：１のＤＮＡによりコードされるアミ
ノ酸配列のアミノ酸１〜60及び 363〜760 から構成され
る。本発明は好ましくは、約 363位又は約 383位から始
まりそして約 706位、約 713位、約 760位又は約 935位
まで（これらを含む）延び、ＰＨＬ活性を有するポリペ
プチドに関する。天然形に対応する、すなわち 383位か
ら始まり 706位又は713位で終る蛋白質、及びベクター
pVL−PHL の挿入部によりコードされた蛋白質が最も好
ましい。
【００１７】アフリカツメガエル由来の天然ＰＨＬはさ
らに、 （１）次の反応： Ｒ−GlyOH →Ｒ−NH2 （式中、Ｒはペプチド残基を表わし、そして GlyOHは該
ペプチドＲのＣ−末端に連結されたα−ヒドロキシグリ
シン残基を表わす）を触媒する； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
測定した場合、分子量が約37KDである； （３）至適作用pHが約5.４である； （４）pHに対する安定性に関し、４℃にて24時間置いた
場合約8.５のpH値において最も安定である； （５）活性に対する温度の影響について、活性を30℃,
37℃及び42℃にて測定した場合、30℃及び42℃において
も実質的な活性を示すが、37℃において最高の活性を示
す；並びに （６）グリセロール及びエチレングリコールにより安定
化される；ことを特徴とする。ＰＨＬをコードするＤＮＡ及び組換ＤＮＡ技法によるそ
の製造 ＰＨＬはＣ−末端にアミド構造を有する生理的に活性な
ペプチドの製造のために有用であり、そしてそれ故に工
業的用途のためには多量のＰＨＬが得られなければなら
ない。しかしながら、アフリカツメガエルの体皮のごと
き天然源から多量に得ることは困難であり、そしてそれ
故に遺伝子工学的方法によるＰＨＬの製造が望ましい。
遺伝子工学によるＰＨＬの製造の前提条件はＰＨＬをコ
ードするＤＮＡ分子が入手可能なことである。
らに、 （１）次の反応： Ｒ−GlyOH →Ｒ−NH2 （式中、Ｒはペプチド残基を表わし、そして GlyOHは該
ペプチドＲのＣ−末端に連結されたα−ヒドロキシグリ
シン残基を表わす）を触媒する； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
測定した場合、分子量が約37KDである； （３）至適作用pHが約5.４である； （４）pHに対する安定性に関し、４℃にて24時間置いた
場合約8.５のpH値において最も安定である； （５）活性に対する温度の影響について、活性を30℃,
37℃及び42℃にて測定した場合、30℃及び42℃において
も実質的な活性を示すが、37℃において最高の活性を示
す；並びに （６）グリセロール及びエチレングリコールにより安定
化される；ことを特徴とする。ＰＨＬをコードするＤＮＡ及び組換ＤＮＡ技法によるそ
の製造 ＰＨＬはＣ−末端にアミド構造を有する生理的に活性な
ペプチドの製造のために有用であり、そしてそれ故に工
業的用途のためには多量のＰＨＬが得られなければなら
ない。しかしながら、アフリカツメガエルの体皮のごと
き天然源から多量に得ることは困難であり、そしてそれ
故に遺伝子工学的方法によるＰＨＬの製造が望ましい。
遺伝子工学によるＰＨＬの製造の前提条件はＰＨＬをコ
ードするＤＮＡ分子が入手可能なことである。
【００１８】遺伝子工学によるＰＨＬの製造のため、本
発明はまたＰＨＬをコードする組換ＤＮＡ分子及びこの
様な組換ＤＮＡ分子の製造方法に関する。この様な組換
ＤＮＡ分子は好ましくはＰＨＬ、好ましくはアフリカツ
メガエル由来のＰＨＬをコードするＤＮＡ配列を含んで
成るハイブリドベクターである。しかしながら本発明は
また、ハイブリドベクターではなくその調製のために使
用することができる、ＰＨＬをコードする製造されたＤ
ＮＡ、例えば場合によってはリンカーもしくはベクター
配列のごときフランキング配列と共にハイブリドベクタ
ーから切り出されたＤＮＡ断片に関する。
発明はまたＰＨＬをコードする組換ＤＮＡ分子及びこの
様な組換ＤＮＡ分子の製造方法に関する。この様な組換
ＤＮＡ分子は好ましくはＰＨＬ、好ましくはアフリカツ
メガエル由来のＰＨＬをコードするＤＮＡ配列を含んで
成るハイブリドベクターである。しかしながら本発明は
また、ハイブリドベクターではなくその調製のために使
用することができる、ＰＨＬをコードする製造されたＤ
ＮＡ、例えば場合によってはリンカーもしくはベクター
配列のごときフランキング配列と共にハイブリドベクタ
ーから切り出されたＤＮＡ断片に関する。
【００１９】本発明のハイブリドベクターは、宿主、例
えば細菌、真菌又は高等真核細胞でのＰＨＬ遺伝子のク
ローニング及び／又は発現のために有用である。これら
は、ウイルス、ファージ、コスミド、プラスミド又は染
色体ＤＮＡのごとき形態の遺伝子工学の分野において有
用な任意のベクター、例えばSV40の誘導体、ヘルペスウ
イルス、パピローマウイルス、レトロウイルス、バキュ
ロウイルス、ファージλ、例えば NM989もしくはEMBL4
、又はファージＭ13、細菌プラスミド、例えばpBR322,
pUC18, pSF2124, pBR317もしくはpPLMu 、又は酵母プ
ラスミド、例えば２μプラスミド、あるいはさらに、複
製起点又は自律複製配列(ARS) を含んで成る染色体ＤＮ
Ａ、又は欠損(defective) ウイルス、ファージもしくは
プラスミドの複製を許容するヘルパーウイルス、ファー
ジもしくはプラスミドの存在下での欠損ウイルス、ファ
ージもしくはプラスミド、例えば、M14K07ヘルパーファ
ージの存在下でのM13(＋)KS ベクターに由来することが
できる。
えば細菌、真菌又は高等真核細胞でのＰＨＬ遺伝子のク
ローニング及び／又は発現のために有用である。これら
は、ウイルス、ファージ、コスミド、プラスミド又は染
色体ＤＮＡのごとき形態の遺伝子工学の分野において有
用な任意のベクター、例えばSV40の誘導体、ヘルペスウ
イルス、パピローマウイルス、レトロウイルス、バキュ
ロウイルス、ファージλ、例えば NM989もしくはEMBL4
、又はファージＭ13、細菌プラスミド、例えばpBR322,
pUC18, pSF2124, pBR317もしくはpPLMu 、又は酵母プ
ラスミド、例えば２μプラスミド、あるいはさらに、複
製起点又は自律複製配列(ARS) を含んで成る染色体ＤＮ
Ａ、又は欠損(defective) ウイルス、ファージもしくは
プラスミドの複製を許容するヘルパーウイルス、ファー
ジもしくはプラスミドの存在下での欠損ウイルス、ファ
ージもしくはプラスミド、例えば、M14K07ヘルパーファ
ージの存在下でのM13(＋)KS ベクターに由来することが
できる。
【００２０】本発明において使用することができるバキ
ュロウイルスは、例えばオートグラファ・カリホルニカ
(Autographa californica)核多形体病ウイルス(AcMNP
V)、トリコプルシア・ニ (Trichoplusia ni) MNPV、ラ
チプルシア・オウ(Rachiplusia ou) MNPV、ガレリア・
メロネラ (Galleria mellonella) MNPV、ボンビックス
・モリ (Bombix mori) 核多形体病(BmNPV) 等である。
オートグラファ・カリホルニカ (Autographa californ
ica)核多形体病ウイルスとバキュロウイルストランスフ
ァーベクター pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392及びpV
L1393 との組合せを含んで成るキットがインビトロゲン
(Invitrogen)から市販されている。
ュロウイルスは、例えばオートグラファ・カリホルニカ
(Autographa californica)核多形体病ウイルス(AcMNP
V)、トリコプルシア・ニ (Trichoplusia ni) MNPV、ラ
チプルシア・オウ(Rachiplusia ou) MNPV、ガレリア・
メロネラ (Galleria mellonella) MNPV、ボンビックス
・モリ (Bombix mori) 核多形体病(BmNPV) 等である。
オートグラファ・カリホルニカ (Autographa californ
ica)核多形体病ウイルスとバキュロウイルストランスフ
ァーベクター pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392及びpV
L1393 との組合せを含んで成るキットがインビトロゲン
(Invitrogen)から市販されている。
【００２１】本発明のハイブリドベクターの作製のため
に適当なベクターは、該ハイブリドベクターの増加及び
ＰＨＬの発現について選択された微生物宿主細胞中で機
能するベクターである。適当なベクターは完全なレプリ
コン及びマーカー遺伝子を含有し、このマーカー遺伝子
は発現プラスミドにより形質転換された微生物の表現形
特徴による選択及び同定を可能にするものである。
に適当なベクターは、該ハイブリドベクターの増加及び
ＰＨＬの発現について選択された微生物宿主細胞中で機
能するベクターである。適当なベクターは完全なレプリ
コン及びマーカー遺伝子を含有し、このマーカー遺伝子
は発現プラスミドにより形質転換された微生物の表現形
特徴による選択及び同定を可能にするものである。
【００２２】従って、本発明のハイブリドベクターは、
染色体外要素として又は宿主染色体への組込みにより、
適当な宿主中で目的とするＤＮＡの複製を提供する。本
発明のクローン化されたＤＮＡの組込み及び発現のため
に幾つかの可能性あるベクター系を用いることができ
る。原理的には、選択された宿主中でＰＨＬが発現され
得る組換ＰＨＬ遺伝子を複製しそして／又は含んで成る
すべてのベクターが適当である。ベクターは形質転換の
ために予想される宿主細胞に依存して選択される。一般
に、この様な宿主細胞は原核性又は真核性微生物、例え
ば細菌、真菌、例えば酵母もしくは糸状真菌、又は高等
真核生物の細胞、例えば動物、例えば哺乳類もしくは昆
虫の細胞であることができる。
染色体外要素として又は宿主染色体への組込みにより、
適当な宿主中で目的とするＤＮＡの複製を提供する。本
発明のクローン化されたＤＮＡの組込み及び発現のため
に幾つかの可能性あるベクター系を用いることができ
る。原理的には、選択された宿主中でＰＨＬが発現され
得る組換ＰＨＬ遺伝子を複製しそして／又は含んで成る
すべてのベクターが適当である。ベクターは形質転換の
ために予想される宿主細胞に依存して選択される。一般
に、この様な宿主細胞は原核性又は真核性微生物、例え
ば細菌、真菌、例えば酵母もしくは糸状真菌、又は高等
真核生物の細胞、例えば動物、例えば哺乳類もしくは昆
虫の細胞であることができる。
【００２３】適当な宿主細胞は後で詳細に記載する。原
理的には、本発明のハイブリドベクターはＰＨＬをコー
ドするＤＮＡ、複製起点又は自律複製配列、場合によっ
ては優性マーカー配列、及び場合によっては追加の制限
部位を含んで成る。複製起点又は自律複製配列（染色体
外要素に自律複製能力を付与するＤＮＡ要素が、例えば
シミアンウイルス(SV40)もしくは他のウイルス源に由来
するような外来源を含むようにベクターを作製すること
により、又は宿主細胞の染色体機構により提供される。
理的には、本発明のハイブリドベクターはＰＨＬをコー
ドするＤＮＡ、複製起点又は自律複製配列、場合によっ
ては優性マーカー配列、及び場合によっては追加の制限
部位を含んで成る。複製起点又は自律複製配列（染色体
外要素に自律複製能力を付与するＤＮＡ要素が、例えば
シミアンウイルス(SV40)もしくは他のウイルス源に由来
するような外来源を含むようにベクターを作製すること
により、又は宿主細胞の染色体機構により提供される。
【００２４】本発明のハイブリドベクターは、形質転換
され、選択されそしてクローン化されるべき宿主に依存
する選択マーカーを含有することができる。マーカーの
表現形発現により形質転換体の選択を促進する任意のマ
ーカー遺伝子を使用することができる。適当なマーカー
は特に、受容生物に対して毒性の化合物に対する耐性を
付与するか又は必須ポリペプチドを欠く変異体例えば栄
養要求性の変異体の酵素系を完成するポリペプチドを発
現することができる遺伝子である。適当なマーカー遺伝
子は、例えば、抗生物質耐性、例えばテトラサイクリ
ン、アンピシリンもしくはシクロヘキシミドに対する耐
性を発現し、又は栄養要求変異株、例えばura3, leu2,
his3もしくはtrp1遺伝子に欠陥を有する酵母において原
栄養性を付与する。
され、選択されそしてクローン化されるべき宿主に依存
する選択マーカーを含有することができる。マーカーの
表現形発現により形質転換体の選択を促進する任意のマ
ーカー遺伝子を使用することができる。適当なマーカー
は特に、受容生物に対して毒性の化合物に対する耐性を
付与するか又は必須ポリペプチドを欠く変異体例えば栄
養要求性の変異体の酵素系を完成するポリペプチドを発
現することができる遺伝子である。適当なマーカー遺伝
子は、例えば、抗生物質耐性、例えばテトラサイクリ
ン、アンピシリンもしくはシクロヘキシミドに対する耐
性を発現し、又は栄養要求変異株、例えばura3, leu2,
his3もしくはtrp1遺伝子に欠陥を有する酵母において原
栄養性を付与する。
【００２５】さらに、形質転換されるべき宿主がマーカ
ーにより発現される生成物について栄養要求性であれ
ば、自律複製セグメントと関連する構造遺伝子をマーカ
ーとして用いることが可能である。本発明のハイブリド
ベクターに挿入されるＰＨＬをコードするＤＮＡは、例
えばヒト、ブタ、ラットもしくはウシ、特にそれらの脳
下垂体から、又はカエル、特にアフリカツメガエルの体
皮からの適切なcDNAライブラリーから単離されたcDNAか
ら成る。
ーにより発現される生成物について栄養要求性であれ
ば、自律複製セグメントと関連する構造遺伝子をマーカ
ーとして用いることが可能である。本発明のハイブリド
ベクターに挿入されるＰＨＬをコードするＤＮＡは、例
えばヒト、ブタ、ラットもしくはウシ、特にそれらの脳
下垂体から、又はカエル、特にアフリカツメガエルの体
皮からの適切なcDNAライブラリーから単離されたcDNAか
ら成る。
【００２６】しかしながら、ＰＨＬをコードするＤＮＡ
はまた、例えば、適当なゲノムライブラリーから、例え
ばヒト、ブタ、ラットもしくはウシの細胞から又はアフ
リカツメガエルの細胞からのゲノムライブラリーから単
離されたゲノムＤＮＡから成る。ＰＨＬをコードするＤ
ＮＡはさらに、天然ＰＨＬをコードするＤＮＡ又はその
変異体のＤＮＡ配列を有する化学合成されたＤＮＡから
成ることができる。
はまた、例えば、適当なゲノムライブラリーから、例え
ばヒト、ブタ、ラットもしくはウシの細胞から又はアフ
リカツメガエルの細胞からのゲノムライブラリーから単
離されたゲノムＤＮＡから成る。ＰＨＬをコードするＤ
ＮＡはさらに、天然ＰＨＬをコードするＤＮＡ又はその
変異体のＤＮＡ配列を有する化学合成されたＤＮＡから
成ることができる。
【００２７】本発明の好ましい組換ＤＮＡ分子は配列番
号：１の配列のＤＮＡ又はＰＨＬ活性を有する本発明の
ポリペプチド、特に本発明の好ましいポリペプチドをコ
ードする該ＤＮＡの断片もしくは変異体を含んで成る。
この様な断片は例えば配列番号：１のＤＮＡ配列により
コードされるAE−III蛋白質の全体ＰＨＬ成分をコード
するＤＮＡ分子である。この断片は、1177位のヌクレオ
チドから2148位又は2169のヌクレオチドに延びる。しか
しながらさらに、より短い又はより長いＤＮＡ断片、例
えば31位〜1117位のいずれかのヌクレオチドから始まり
そして2148位〜2835位のいずれかのヌクレオチドで終る
ＤＮＡ、がＰＨＬ活性を有するポリペプチドをコードす
ることができる。
号：１の配列のＤＮＡ又はＰＨＬ活性を有する本発明の
ポリペプチド、特に本発明の好ましいポリペプチドをコ
ードする該ＤＮＡの断片もしくは変異体を含んで成る。
この様な断片は例えば配列番号：１のＤＮＡ配列により
コードされるAE−III蛋白質の全体ＰＨＬ成分をコード
するＤＮＡ分子である。この断片は、1177位のヌクレオ
チドから2148位又は2169のヌクレオチドに延びる。しか
しながらさらに、より短い又はより長いＤＮＡ断片、例
えば31位〜1117位のいずれかのヌクレオチドから始まり
そして2148位〜2835位のいずれかのヌクレオチドで終る
ＤＮＡ、がＰＨＬ活性を有するポリペプチドをコードす
ることができる。
【００２８】天然ＤＮＡの変異体が天然ＰＨＬ又はＰＨ
Ｌ活性を有するこの変異体をコードしている。本発明の
変異体はまた、配列表：１のＤＮＡの欠失変異体である
ことができる。この様な欠失変異の好ましい例は、配列
表：１の１位〜 210位及び1117位〜2310位に延びる配列
から成るバキュロウイルス発現ベクターAcPHL 又はベク
ター pVL−PHL の挿入部である。
Ｌ活性を有するこの変異体をコードしている。本発明の
変異体はまた、配列表：１のＤＮＡの欠失変異体である
ことができる。この様な欠失変異の好ましい例は、配列
表：１の１位〜 210位及び1117位〜2310位に延びる配列
から成るバキュロウイルス発現ベクターAcPHL 又はベク
ター pVL−PHL の挿入部である。
【００２９】しかしながら、天然ＰＨＬをコードする変
異体ＤＮＡはまた、１又は複数のヌクレオチドが他のヌ
クレオチドにより置き換えられており、この新たなコド
ンが同一のアミノ酸をコードしているサイレント変異で
あることが意図される。この様な変異体ＤＮＡ配列はま
た縮重ＤＮＡ配列である。縮重配列は、それらがコード
しているアミノ酸配列を変化させることなく無制限の数
のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置き換えられ
ている点において遺伝コードの意味で縮重している。こ
の様な縮重ＤＮＡはまた、それらの種々の制限部位及び
／又はＰＨＬの最適発現を得るために特定の宿主により
好まれる特定のコドンの頻度のために有用である。
異体ＤＮＡはまた、１又は複数のヌクレオチドが他のヌ
クレオチドにより置き換えられており、この新たなコド
ンが同一のアミノ酸をコードしているサイレント変異で
あることが意図される。この様な変異体ＤＮＡ配列はま
た縮重ＤＮＡ配列である。縮重配列は、それらがコード
しているアミノ酸配列を変化させることなく無制限の数
のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置き換えられ
ている点において遺伝コードの意味で縮重している。こ
の様な縮重ＤＮＡはまた、それらの種々の制限部位及び
／又はＰＨＬの最適発現を得るために特定の宿主により
好まれる特定のコドンの頻度のために有用である。
【００３０】本発明のハイブリドベクターの増加のため
の宿主株は例えば酵母又は好ましくは大腸菌の株であ
る。本明細書においてハイブリド発現ベクターとも称さ
れるＰＨＬの発現のためのハイブリド発現ベクターも本
発明のハイブリドベクターである。これらは一般に前記
のハイブリドベクターと同じ性質を有し、そしてさらに
ＰＨＬの生産及び場合によっては分泌を可能にする発現
制御配列に作用可能に連結されたＰＨＬ遺伝子を含んで
成る。
の宿主株は例えば酵母又は好ましくは大腸菌の株であ
る。本明細書においてハイブリド発現ベクターとも称さ
れるＰＨＬの発現のためのハイブリド発現ベクターも本
発明のハイブリドベクターである。これらは一般に前記
のハイブリドベクターと同じ性質を有し、そしてさらに
ＰＨＬの生産及び場合によっては分泌を可能にする発現
制御配列に作用可能に連結されたＰＨＬ遺伝子を含んで
成る。
【００３１】すなわち、本発明のハイブリド発現ベクタ
ーは、ＰＨＬ、好ましくはアフリカツメガエル由来のＰ
ＨＬをコードする構造遺伝子に連結したプロモーター領
域、そして場合によってはリーダー又はシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片、転写停止領域及び／又はさ
らに制御配列を含んで成る。宿主細胞の性質に依存して
広範囲のプロモーター配列を用いることができる。強力
で且つ同時によく制御されるプロモーターが最も有用で
ある。翻訳を開始するための配列は例えばシャイン−ダ
ルガーノ(Shine-Dalgano) 配列である。
ーは、ＰＨＬ、好ましくはアフリカツメガエル由来のＰ
ＨＬをコードする構造遺伝子に連結したプロモーター領
域、そして場合によってはリーダー又はシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片、転写停止領域及び／又はさ
らに制御配列を含んで成る。宿主細胞の性質に依存して
広範囲のプロモーター配列を用いることができる。強力
で且つ同時によく制御されるプロモーターが最も有用で
ある。翻訳を開始するための配列は例えばシャイン−ダ
ルガーノ(Shine-Dalgano) 配列である。
【００３２】転写の開始及び停止のため並びにmRNAの安
定化のために必要な配列は一般に、それぞれ、ウイルス
性又は真核性の例えば発現宿主からの、非コード５′−
領域及び３′−領域から得られる。適当なプロモーター
の例は、λＰL ，λＲR もしくはλＮ、大腸菌 lac, tr
p,tacもしくはlpp 、又は酵母TRP1−, ADHI−, ADHII
−, PHO3−, PHO5−もしくは解糖系プロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ(P
GK) 、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼの遺伝子のプロモーター、又は真核性ウイルス、
例えばSV40、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス２、
ウシパピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガ
ロウイルスもしくはバキュロウイルス(Baculovirus) 、
例えばオートグラファ・カリホルニカ (Autographa ca
lifornica)核多形体症ウイルス(AcMNPV)、トリコプルシ
ア・ニ (Trichoplusia ni) MNPV、ラチプルシア・オウ
(Rachiplusia ou) MNPV、ガレリア・メロネラ (Galler
ia mellonella) MNPVに由来するプロモーター、又は例
えばアクチン、コラーゲン、ミオシンもしくはβ−グロ
ビン遺伝子の哺乳類由来プロモーターである。好ましい
真核性プロモーターは、バキュロウイルス、特にオート
グラファ・カリホルニカ (Autographacalifornica)核多
形体症ウイルス(AcMNPV)のポリペドリン遺伝子プロモー
ターである。
定化のために必要な配列は一般に、それぞれ、ウイルス
性又は真核性の例えば発現宿主からの、非コード５′−
領域及び３′−領域から得られる。適当なプロモーター
の例は、λＰL ，λＲR もしくはλＮ、大腸菌 lac, tr
p,tacもしくはlpp 、又は酵母TRP1−, ADHI−, ADHII
−, PHO3−, PHO5−もしくは解糖系プロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ(P
GK) 、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼの遺伝子のプロモーター、又は真核性ウイルス、
例えばSV40、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス２、
ウシパピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガ
ロウイルスもしくはバキュロウイルス(Baculovirus) 、
例えばオートグラファ・カリホルニカ (Autographa ca
lifornica)核多形体症ウイルス(AcMNPV)、トリコプルシ
ア・ニ (Trichoplusia ni) MNPV、ラチプルシア・オウ
(Rachiplusia ou) MNPV、ガレリア・メロネラ (Galler
ia mellonella) MNPVに由来するプロモーター、又は例
えばアクチン、コラーゲン、ミオシンもしくはβ−グロ
ビン遺伝子の哺乳類由来プロモーターである。好ましい
真核性プロモーターは、バキュロウイルス、特にオート
グラファ・カリホルニカ (Autographacalifornica)核多
形体症ウイルス(AcMNPV)のポリペドリン遺伝子プロモー
ターである。
【００３３】真核性プロモーターは、エンハンシング(e
nhancing) 配列、例えば酵母上流活性化配列(USA) 又は
ウイルス性もしくは細胞性エンハンサー、例えばサイト
メガロウイルスＩＥエンハンサー、SV40エンハンサー、
免疫グロブリン遺伝子エンハンサー等と組合わせること
ができる。ＰＨＬの発現のために有用なエンハンサー
は、転写刺激ＤＮＡ配列、例えばシミアンウイルス、サ
イトメガロウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ・パピ
ローマウイルスもしくはモロネー(Moloney) 肉腫ウイル
ス由来の又はゲノム起原のものである。エンハンサー配
列はまたフィザルム・ポリセファルム (Physarum poly
cephalum) (PCT／EP 8500278) の染色体外リボゾームＤ
ＮＡに由来することができ、あるいはそれは酸性ホスフ
ァターゼPHO5遺伝子（ＥＰ出願No.86111820.6)、又は P
H05, trp, PHO5−GAPDH ハイブリド（ＥＰ出願No.86111
820.6)もしくは類似のプロモーターの上流活性化部位で
あることができる。
nhancing) 配列、例えば酵母上流活性化配列(USA) 又は
ウイルス性もしくは細胞性エンハンサー、例えばサイト
メガロウイルスＩＥエンハンサー、SV40エンハンサー、
免疫グロブリン遺伝子エンハンサー等と組合わせること
ができる。ＰＨＬの発現のために有用なエンハンサー
は、転写刺激ＤＮＡ配列、例えばシミアンウイルス、サ
イトメガロウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ・パピ
ローマウイルスもしくはモロネー(Moloney) 肉腫ウイル
ス由来の又はゲノム起原のものである。エンハンサー配
列はまたフィザルム・ポリセファルム (Physarum poly
cephalum) (PCT／EP 8500278) の染色体外リボゾームＤ
ＮＡに由来することができ、あるいはそれは酸性ホスフ
ァターゼPHO5遺伝子（ＥＰ出願No.86111820.6)、又は P
H05, trp, PHO5−GAPDH ハイブリド（ＥＰ出願No.86111
820.6)もしくは類似のプロモーターの上流活性化部位で
あることができる。
【００３４】本発明のために使用されることができるシ
グナル配列は例えば、ポリペプチドの分泌を指令するプ
レ配列もしくは分泌リーダー、又は類似の配列であるこ
とができる。シグナル配列は文献から知られており、例
えばvon Heijine,G., Nucleic Acids Res.14, 4683 (19
86) に集められているものである。他のシグナル配列
は、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列の１
位のアミノ酸から21位のアミノ酸に延びる。
グナル配列は例えば、ポリペプチドの分泌を指令するプ
レ配列もしくは分泌リーダー、又は類似の配列であるこ
とができる。シグナル配列は文献から知られており、例
えばvon Heijine,G., Nucleic Acids Res.14, 4683 (19
86) に集められているものである。他のシグナル配列
は、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列の１
位のアミノ酸から21位のアミノ酸に延びる。
【００３５】リボゾーム結合部位(Shine-Dalgano Seque
nce)は使用されるプロモーターに天然に連結されている
か、あるいはＰＨＬをコードする領域への５′に共有結
合により連結されていてもよい短いヌクレオチド配列で
ある。リボゾーム結合部位は当業界において知られてい
る。本発明のハイブリド発現ベクターの作製のために選
択されるプロモーターは制御蛋白質(regulatory protei
n)により制御されることができ、そして形質転換された
宿主細胞中でのＰＨＬの生産は誘導的(inducible) であ
ることもでき又は抑制解除的(derepressible) であるこ
ともできる。制御蛋白質のための遺伝子は、宿主株のゲ
ノム中、宿主株がそれにより同時形質転換される追加の
プラスミドベクター上、又は本発明のハイブリドベクタ
ー上に位置することができる。
nce)は使用されるプロモーターに天然に連結されている
か、あるいはＰＨＬをコードする領域への５′に共有結
合により連結されていてもよい短いヌクレオチド配列で
ある。リボゾーム結合部位は当業界において知られてい
る。本発明のハイブリド発現ベクターの作製のために選
択されるプロモーターは制御蛋白質(regulatory protei
n)により制御されることができ、そして形質転換された
宿主細胞中でのＰＨＬの生産は誘導的(inducible) であ
ることもでき又は抑制解除的(derepressible) であるこ
ともできる。制御蛋白質のための遺伝子は、宿主株のゲ
ノム中、宿主株がそれにより同時形質転換される追加の
プラスミドベクター上、又は本発明のハイブリドベクタ
ー上に位置することができる。
【００３６】制御蛋白質のための適当な遺伝子の選択は
使用されるプロモーターに依存する。ＰＨＬの生産の誘
導又は抑制解除のための条件はまたプロモーター及び制
御蛋白質に依存する。本発明において使用することがで
きる制御蛋白質は例えば、レプレーッサー蛋白質、例え
ばtrpR, lacI, λcro もしくはλcI遺伝子の産物、又は
それらの温度感受性変異体である。
使用されるプロモーターに依存する。ＰＨＬの生産の誘
導又は抑制解除のための条件はまたプロモーター及び制
御蛋白質に依存する。本発明において使用することがで
きる制御蛋白質は例えば、レプレーッサー蛋白質、例え
ばtrpR, lacI, λcro もしくはλcI遺伝子の産物、又は
それらの温度感受性変異体である。
【００３７】本発明の好ましいハイブリドベクターは実
施例において後記する pAE−III −202 −４， pVL−PH
L 、及びバキュロウイルスAcPHL である。本発明はまた
前に定義した組換ＤＮＡ分子の製造方法にも関する。こ
の方法は： ａ）適切な細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そして例え
ばＤＮＡプローブを用いて、又は適当な発現系を用いそ
して目的とするポリペプチドの発現についてスクリーニ
ングすることにより、目的とするＤＮＡを選択し；ある
いは ｂ）適切な細胞からmRNAを単離し、例えばＤＮＡプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより又は適当な発現系
での発現と目的とするポリペプチドの発現についてのス
クリーニングにより目的とするmRNAを選択し、該mRNAに
対して相補的な単鎖cDNAを調製し、そしてそれから二本
鎖cDNAを調製し；あるいは ｃ）cDNAライブラリーからcDNAを単離し、そして例えば
ＤＮＡプローブを用いて、又は適当な発現系を用いそし
て目的とするポリペプチドの発現についてスクリーニン
グすることにより目的とするcDNAを選択し；あるいは ｄ）前記段階ａ),ｂ）又はｃ）の二本鎖ＤＮＡを適切な
ベクターに導入し、得られたハイブリドベクターにより
適切な宿主細胞を形質転換し、目的とするcDNAを含有す
る形質転換された宿主細胞を未形質転換細胞から選択し
そして該形質転換された細胞を増加せしめ、そして目的
とするＤＮＡを単離することを含んで成る。
施例において後記する pAE−III −202 −４， pVL−PH
L 、及びバキュロウイルスAcPHL である。本発明はまた
前に定義した組換ＤＮＡ分子の製造方法にも関する。こ
の方法は： ａ）適切な細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そして例え
ばＤＮＡプローブを用いて、又は適当な発現系を用いそ
して目的とするポリペプチドの発現についてスクリーニ
ングすることにより、目的とするＤＮＡを選択し；ある
いは ｂ）適切な細胞からmRNAを単離し、例えばＤＮＡプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより又は適当な発現系
での発現と目的とするポリペプチドの発現についてのス
クリーニングにより目的とするmRNAを選択し、該mRNAに
対して相補的な単鎖cDNAを調製し、そしてそれから二本
鎖cDNAを調製し；あるいは ｃ）cDNAライブラリーからcDNAを単離し、そして例えば
ＤＮＡプローブを用いて、又は適当な発現系を用いそし
て目的とするポリペプチドの発現についてスクリーニン
グすることにより目的とするcDNAを選択し；あるいは ｄ）前記段階ａ),ｂ）又はｃ）の二本鎖ＤＮＡを適切な
ベクターに導入し、得られたハイブリドベクターにより
適切な宿主細胞を形質転換し、目的とするcDNAを含有す
る形質転換された宿主細胞を未形質転換細胞から選択し
そして該形質転換された細胞を増加せしめ、そして目的
とするＤＮＡを単離することを含んで成る。
【００３８】本発明はまた前に定義した組換ＤＮＡ分子
の製造方法に関し、この方法は、本発明のハイブリドベ
クターから、場合によって該ベクター又はリンカー配列
に由来するフランキング配列と共に、ＰＨＬをコードす
るＤＮＡ断片を切り出すことを含んで成る。本発明はま
た、ＰＨＬをコードするＤＮＡ分子を化学合成により生
体外で合成することを含んで成る、前に定義した組換Ｄ
ＮＡ分子の調製方法に関する。
の製造方法に関し、この方法は、本発明のハイブリドベ
クターから、場合によって該ベクター又はリンカー配列
に由来するフランキング配列と共に、ＰＨＬをコードす
るＤＮＡ断片を切り出すことを含んで成る。本発明はま
た、ＰＨＬをコードするＤＮＡ分子を化学合成により生
体外で合成することを含んで成る、前に定義した組換Ｄ
ＮＡ分子の調製方法に関する。
【００３９】ゲノムＤＮＡを単離しそして目的のＤＮＡ
についてスクリーニングすることができる（段階ａ）。
ゲノムＤＮＡはＰＨＬ遺伝子を含む細胞から単離され
る。そこからゲノムＤＮＡライブラリーが、確立された
方法による適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化及
び適当なベクターへの導入により調製される。ゲノムＤ
ＮＡライブラリーはＤＮＡプローブによりスクリーニン
グされ、あるいは適当な発現系において発現されそして
得られたポリペプチドが前記の方法によりスクリーニン
グされる。
についてスクリーニングすることができる（段階ａ）。
ゲノムＤＮＡはＰＨＬ遺伝子を含む細胞から単離され
る。そこからゲノムＤＮＡライブラリーが、確立された
方法による適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化及
び適当なベクターへの導入により調製される。ゲノムＤ
ＮＡライブラリーはＤＮＡプローブによりスクリーニン
グされ、あるいは適当な発現系において発現されそして
得られたポリペプチドが前記の方法によりスクリーニン
グされる。
【００４０】ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡが既
知の方法により適当な細胞から単離される。単離方法は
例えば、洗浄及びリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばヘパ
リン、グアニシニウムイソチオシアナート又はメルカプ
トエタノールの存在下でホモジナイズし、場合によって
は塩及び緩衝液、洗剤及び／又は陽イオンキレート剤の
存在下で適当なクロロホルム・フェノール混合物により
mRNAを抽出し、そして残った水性塩含有相からエタノー
ル、イソプロパノール等によりmRNAを沈澱せしめること
を含む。
知の方法により適当な細胞から単離される。単離方法は
例えば、洗浄及びリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばヘパ
リン、グアニシニウムイソチオシアナート又はメルカプ
トエタノールの存在下でホモジナイズし、場合によって
は塩及び緩衝液、洗剤及び／又は陽イオンキレート剤の
存在下で適当なクロロホルム・フェノール混合物により
mRNAを抽出し、そして残った水性塩含有相からエタノー
ル、イソプロパノール等によりmRNAを沈澱せしめること
を含む。
【００４１】単離されたmRNAはさらに、塩化セシウム勾
配中での遠心分離及びそれに続くエタノール沈澱及び／
又はクロマトグラフ法、例えばアフィニティークロマト
グラフィー、例えばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリ
ゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィーにより
精製することができる。好ましくは、この様な精製され
た全mRNAはサイズに従って、勾配遠心分離により、例え
ば直線シュークロースグラジエントにおいて、適当なサ
イズ分画カラム、例えばアガロースゲル上でのクロマト
グラフィーにより、分画される。
配中での遠心分離及びそれに続くエタノール沈澱及び／
又はクロマトグラフ法、例えばアフィニティークロマト
グラフィー、例えばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリ
ゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィーにより
精製することができる。好ましくは、この様な精製され
た全mRNAはサイズに従って、勾配遠心分離により、例え
ば直線シュークロースグラジエントにおいて、適当なサ
イズ分画カラム、例えばアガロースゲル上でのクロマト
グラフィーにより、分画される。
【００４２】目的のmRNAは、ＤＮＡプローブによりmRNA
を直接スクリーニングすることにより、又は適当な細胞
又は無細胞系での翻訳及びＰＨＬの生産についてのスク
リーニングにより選択される。分画されたmRNAは細胞、
例えばカエルの卵母細胞中で、又は無細胞系、例えば綱
状赤血球溶解物又は小麦胚抽出物中で翻訳され得る。得
られたポリペプチドは酵素活性について、又は天然ポリ
ペプチドに対して生じた抗体との反応について、例えば
イムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イ
ムノアッセイ又は蛍光マーカーを用いるイムノアッセイ
によりスクリーニングされる。この様なイムノアッセイ
並びにモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の製
造は当業界においてよく知られており、そしてそれ故に
それらが適用される。
を直接スクリーニングすることにより、又は適当な細胞
又は無細胞系での翻訳及びＰＨＬの生産についてのスク
リーニングにより選択される。分画されたmRNAは細胞、
例えばカエルの卵母細胞中で、又は無細胞系、例えば綱
状赤血球溶解物又は小麦胚抽出物中で翻訳され得る。得
られたポリペプチドは酵素活性について、又は天然ポリ
ペプチドに対して生じた抗体との反応について、例えば
イムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イ
ムノアッセイ又は蛍光マーカーを用いるイムノアッセイ
によりスクリーニングされる。この様なイムノアッセイ
並びにモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の製
造は当業界においてよく知られており、そしてそれ故に
それらが適用される。
【００４３】選択されたmRNAからの単鎖相補的DNA(cDN
A) の調製は当業界においてよく知られており、単鎖Ｄ
ＮＡから二本鎖ＤＮＡの調製も同様である。mRNA鋳型
は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、場合
によっては放射能をラベルされたデオキシヌクレオシド
トリホスフェート（反応の結果をスクリーニングするこ
とができる様にするため）、mRNAのポリ（Ａ）テイルと
ハイブリダイズするオリゴ−ｄＴ残基のごときプライマ
ー配列、及び例えばトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)から
の逆転写酵素のごとき適当な酵素、の混合物と共にイン
キュベートされる。
A) の調製は当業界においてよく知られており、単鎖Ｄ
ＮＡから二本鎖ＤＮＡの調製も同様である。mRNA鋳型
は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、場合
によっては放射能をラベルされたデオキシヌクレオシド
トリホスフェート（反応の結果をスクリーニングするこ
とができる様にするため）、mRNAのポリ（Ａ）テイルと
ハイブリダイズするオリゴ−ｄＴ残基のごときプライマ
ー配列、及び例えばトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)から
の逆転写酵素のごとき適当な酵素、の混合物と共にイン
キュベートされる。
【００４４】例えばアルカリ加水分解による鋳型mRNAの
分解の後、cDNAをデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェート及び適当な酵素の混合物と共にインキュベートし
て二本鎖ＤＮＡを得る。適当な酵素は例えば逆転写酵
素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片又はT4 D
NAポリメラーゼである。通常、単鎖cDNAにより自然に形
成されるヘアピンループ構造が第二鎖の合成のためのプ
ライマーとして機能する。このヘアピン構造はＳ１ヌク
レアーゼによる消化によって除去される。あるいは、mR
NA鋳型の加水分解及び引き続く第二cDNA鎖の合成に先立
って単鎖ＤＮＡの３′−末端をホモポリマーデオキシヌ
クレオチドテイルにより延長する。
分解の後、cDNAをデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェート及び適当な酵素の混合物と共にインキュベートし
て二本鎖ＤＮＡを得る。適当な酵素は例えば逆転写酵
素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片又はT4 D
NAポリメラーゼである。通常、単鎖cDNAにより自然に形
成されるヘアピンループ構造が第二鎖の合成のためのプ
ライマーとして機能する。このヘアピン構造はＳ１ヌク
レアーゼによる消化によって除去される。あるいは、mR
NA鋳型の加水分解及び引き続く第二cDNA鎖の合成に先立
って単鎖ＤＮＡの３′−末端をホモポリマーデオキシヌ
クレオチドテイルにより延長する。
【００４５】あるいは、ランダムにクローニングしたcD
NAから二本鎖cDNAを単離し、そして目的のcDNAについて
スクリーニングする（段階ｃ）。適当な細胞からmRNAを
単離し、そして前記のようにして単鎖cDNA及び二本鎖cD
NAを調製することによりcDNAライブラリーを作製する。
このcDNAを適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化し
そして確立された方法に従ってλファージ、例えばλシ
ャロン４Ａ又はλgt11に導入する。ニトロセルロース膜
上にレプリカされたcDNAライブラリーをＤＮＡプローブ
を用いてスクリーニングし、あるいは適当な発現系にお
いて発現させそして得られたポリペプチドをＰＨＬ特異
性を有する抗体との反応について又はＰＨＬ酵素活性に
ついてスクリーニングする。
NAから二本鎖cDNAを単離し、そして目的のcDNAについて
スクリーニングする（段階ｃ）。適当な細胞からmRNAを
単離し、そして前記のようにして単鎖cDNA及び二本鎖cD
NAを調製することによりcDNAライブラリーを作製する。
このcDNAを適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化し
そして確立された方法に従ってλファージ、例えばλシ
ャロン４Ａ又はλgt11に導入する。ニトロセルロース膜
上にレプリカされたcDNAライブラリーをＤＮＡプローブ
を用いてスクリーニングし、あるいは適当な発現系にお
いて発現させそして得られたポリペプチドをＰＨＬ特異
性を有する抗体との反応について又はＰＨＬ酵素活性に
ついてスクリーニングする。
【００４６】目的とするＤＮＡ又はＲＮＡの選択は好ま
しくはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて
行われ、これにより翻訳の追加の段階が回避される。適
当なＤＮＡプローブは少なくとも17ヌクレオチドから成
る既知ヌクレオチド配列のＤＮＡ、例えば合成DNA 、 P
HLをコードするmRNAに由来するcDNA、又は例えば天然源
又は遺伝子操作された微生物から単離される隣接するＤ
ＮＡ配列を含んで成るゲノムＤＮＡ断片である。
しくはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて
行われ、これにより翻訳の追加の段階が回避される。適
当なＤＮＡプローブは少なくとも17ヌクレオチドから成
る既知ヌクレオチド配列のＤＮＡ、例えば合成DNA 、 P
HLをコードするmRNAに由来するcDNA、又は例えば天然源
又は遺伝子操作された微生物から単離される隣接するＤ
ＮＡ配列を含んで成るゲノムＤＮＡ断片である。
【００４７】合成ＤＮＡプローブは既知の方法に従っ
て、好ましくは固相ホスホトリエステル、ホスファイト
トリエステル又はホスホラミダイト法を用いての段階的
縮合、例えばエスホトリエステル法によるジヌクレオチ
ドカップリングユニットの縮合により合成される。これ
らの方法は、 Y.Ikeら (Nucleic Acid Research 11, 47
7, 1983)により記載されている適当な縮合段階におい
て、保護された形の２個、３個又は４個のヌクレオチド
ｄＡ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴの混合物あるいは対応
するジヌクレオチドカップリングユニットを用いて、目
的とするオリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合され
る。
て、好ましくは固相ホスホトリエステル、ホスファイト
トリエステル又はホスホラミダイト法を用いての段階的
縮合、例えばエスホトリエステル法によるジヌクレオチ
ドカップリングユニットの縮合により合成される。これ
らの方法は、 Y.Ikeら (Nucleic Acid Research 11, 47
7, 1983)により記載されている適当な縮合段階におい
て、保護された形の２個、３個又は４個のヌクレオチド
ｄＡ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴの混合物あるいは対応
するジヌクレオチドカップリングユニットを用いて、目
的とするオリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合され
る。
【００４８】ハイブリダイゼーションのため、ＤＮＡプ
ローブがラベルされる。例えばよく知られたキナーゼ反
応により放射能ラベルされる。ハイブリダイゼーション
は、既知の方法に従って、すなわち添加剤、例えばカル
シウムキレート剤、粘度調節用化合物、蛋白質、非相同
ＤＮＡ等を含有する緩衝剤及び塩の溶液中で、選択的ハ
イブリダイゼーションに好都合な温度、例えば０℃〜80
℃、例えば25℃〜50℃、又は約65℃の温度において行わ
れる。
ローブがラベルされる。例えばよく知られたキナーゼ反
応により放射能ラベルされる。ハイブリダイゼーション
は、既知の方法に従って、すなわち添加剤、例えばカル
シウムキレート剤、粘度調節用化合物、蛋白質、非相同
ＤＮＡ等を含有する緩衝剤及び塩の溶液中で、選択的ハ
イブリダイゼーションに好都合な温度、例えば０℃〜80
℃、例えば25℃〜50℃、又は約65℃の温度において行わ
れる。
【００４９】二本鎖cDNA又はゲノムＤＮＡを適当なベク
ターに挿入する（段階ｄ）ための種々の方法が当業界に
おいて知られている。例えば、対応するデオキシヌクレ
オシドトリホスフェートとターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼのごとき酵素の存在下でのイ
ンキュベーションにより相補的ホモポリマートラクト(t
ract) を二本鎖ＤＮＡ及びベクターＤＮＡに加えること
ができる。
ターに挿入する（段階ｄ）ための種々の方法が当業界に
おいて知られている。例えば、対応するデオキシヌクレ
オシドトリホスフェートとターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼのごとき酵素の存在下でのイ
ンキュベーションにより相補的ホモポリマートラクト(t
ract) を二本鎖ＤＮＡ及びベクターＤＮＡに加えること
ができる。
【００５０】次に、ベクター及び二本鎖ＤＮＡは相補的
にホモポリマーテイル間の塩基対合により連結され、そ
して最後にリガーゼのごとき特異的連結酵素により結合
される。他の可能性は、二本鎖ＤＮＡへの合成リンカー
の付加、又は平滑末端連結もしくは接着末端連結による
ベクターへの二本鎖ＤＮＡの導入である。適当なベクタ
ーは後でさらに詳細に検討する。
にホモポリマーテイル間の塩基対合により連結され、そ
して最後にリガーゼのごとき特異的連結酵素により結合
される。他の可能性は、二本鎖ＤＮＡへの合成リンカー
の付加、又は平滑末端連結もしくは接着末端連結による
ベクターへの二本鎖ＤＮＡの導入である。適当なベクタ
ーは後でさらに詳細に検討する。
【００５１】得られたハイブリドベクターによる適当な
宿主細胞の形質転換（段階ｅ）並びに形質転換された宿
主細胞の選択及び増加（段階ｆ）は当業界においてよく
知られている。これらの方法の例はさらに後記する。ハ
イブリドベクター及び宿主細胞はＤＮＡの調製のため、
又はそのほかに目的ポリペプチドの製造のために適当で
ある。
宿主細胞の形質転換（段階ｅ）並びに形質転換された宿
主細胞の選択及び増加（段階ｆ）は当業界においてよく
知られている。これらの方法の例はさらに後記する。ハ
イブリドベクター及び宿主細胞はＤＮＡの調製のため、
又はそのほかに目的ポリペプチドの製造のために適当で
ある。
【００５２】目的ＤＮＡの調製は、当業界においてよく
知られている方法、例えばフェノール及び／又はクロロ
ホルムによる抽出により達成される。場合によっては、
ＤＮＡはさらに、例えば、変異体を得るための変異剤に
より、あるいは断片を得るための制限酵素による消化に
より、又はベクターへの導入を容易にするための一端も
しくは両端の修飾、等によりさらに操作することができ
る。
知られている方法、例えばフェノール及び／又はクロロ
ホルムによる抽出により達成される。場合によっては、
ＤＮＡはさらに、例えば、変異体を得るための変異剤に
より、あるいは断片を得るための制限酵素による消化に
より、又はベクターへの導入を容易にするための一端も
しくは両端の修飾、等によりさらに操作することができ
る。
【００５３】本発明のＤＮＡのヌクレオチド配列はそれ
自体既知の方法により、例えば末端ラベル化ＤＮＡを用
いる Maxam-Gilbert法により又はSangerのジデオキシチ
ェインターミネーション法により決定することができ
る。本発明のＰＨＬ遺伝子配列はまた、常法による生体
内合成によっても製造することができる。ＤＮＡ合成の
ための適当な方法はS.A.Narang (Tetrahedron 39,3, 19
83)により要約されている。既知の合成法は、好収量、
高純度及び比較的短時間での長さ 120塩基対までのポリ
ヌクレオチドの調製を可能にする。
自体既知の方法により、例えば末端ラベル化ＤＮＡを用
いる Maxam-Gilbert法により又はSangerのジデオキシチ
ェインターミネーション法により決定することができ
る。本発明のＰＨＬ遺伝子配列はまた、常法による生体
内合成によっても製造することができる。ＤＮＡ合成の
ための適当な方法はS.A.Narang (Tetrahedron 39,3, 19
83)により要約されている。既知の合成法は、好収量、
高純度及び比較的短時間での長さ 120塩基対までのポリ
ヌクレオチドの調製を可能にする。
【００５４】適切に保護されたヌクレオチドが、ホスホ
ジエステル法(K.L.Agarwalら、 Angew.Chemie 84, 489,
1972)、より効率的なホスホトリエステル法(C.B.Rees
e, Tetrahedron 34, 3143, 1972) 、ホスファイトトリ
エステル法(R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc. 98, 365
5, 1976) 又はホスホラミダイト法 (S.L.Beaucage及び
M.H.Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981) により
相互に連結される。固相法によりオリゴヌクレオチド及
びポリヌクレオチドの合成の単純化が可能であり、この
方法においてはヌクレオチド鎖が適当なポリマーに結合
される。
ジエステル法(K.L.Agarwalら、 Angew.Chemie 84, 489,
1972)、より効率的なホスホトリエステル法(C.B.Rees
e, Tetrahedron 34, 3143, 1972) 、ホスファイトトリ
エステル法(R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc. 98, 365
5, 1976) 又はホスホラミダイト法 (S.L.Beaucage及び
M.H.Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981) により
相互に連結される。固相法によりオリゴヌクレオチド及
びポリヌクレオチドの合成の単純化が可能であり、この
方法においてはヌクレオチド鎖が適当なポリマーに結合
される。
【００５５】H.Rinkら (Nucl.Acids Research 12, 636
9, 1984) は個々のヌクレオチドの代りにトリヌクレオ
チドを用い、そしてそれらをホスホトリエステル法によ
り固相合成において連結している。従って、ポリヌクレ
オチドが短時間で且つ好収量で調製され得る。実際の二
本鎖ＤＮＡは両ＤＮＡ鎖からのオーバーラップする化学
的に調製されたオリゴヌクレオチドから酵素的に組立て
られ、この方法においては両ＤＮＡ鎖が塩基対合により
正しい配置で一緒に保持され、そして次に酵素ＤＮＡリ
ガーゼにより化学的に連結される。
9, 1984) は個々のヌクレオチドの代りにトリヌクレオ
チドを用い、そしてそれらをホスホトリエステル法によ
り固相合成において連結している。従って、ポリヌクレ
オチドが短時間で且つ好収量で調製され得る。実際の二
本鎖ＤＮＡは両ＤＮＡ鎖からのオーバーラップする化学
的に調製されたオリゴヌクレオチドから酵素的に組立て
られ、この方法においては両ＤＮＡ鎖が塩基対合により
正しい配置で一緒に保持され、そして次に酵素ＤＮＡリ
ガーゼにより化学的に連結される。
【００５６】他の可能性は、２つのＤＮＡ鎖からのオー
バーラップする単一オリゴヌクレオチドを、４種類の必
要なデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下
で、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ポリメラーゼＩのKlenow断片もしくはT4 DNAポリメ
ラーゼと共に、又はＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）
逆転写酵素と共にインキュベートすることを含む。
バーラップする単一オリゴヌクレオチドを、４種類の必
要なデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下
で、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ポリメラーゼＩのKlenow断片もしくはT4 DNAポリメ
ラーゼと共に、又はＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）
逆転写酵素と共にインキュベートすることを含む。
【００５７】これにより２つのオリゴヌクレオチドが塩
基対合により正しい配置で一緒に保持され、そして酵素
により必要なヌクレオチドが補充されて完全な二本鎖Ｄ
ＮＡが与えられる (S.A.Narangら、Anal.Biochem. 121,
356, 1982) 。本発明のＤＮＡ分子の調製方法は、アフ
リカツメガエルのＰＨＬ酵素の前駆体であるポリペプチ
ドAE−III をコードするＤＮＡ断片を含んで成るハイブ
リドベクターについて例示する。このＤＮＡ断片は配列
番号：１のＤＮＡ配列を有する。
基対合により正しい配置で一緒に保持され、そして酵素
により必要なヌクレオチドが補充されて完全な二本鎖Ｄ
ＮＡが与えられる (S.A.Narangら、Anal.Biochem. 121,
356, 1982) 。本発明のＤＮＡ分子の調製方法は、アフ
リカツメガエルのＰＨＬ酵素の前駆体であるポリペプチ
ドAE−III をコードするＤＮＡ断片を含んで成るハイブ
リドベクターについて例示する。このＤＮＡ断片は配列
番号：１のＤＮＡ配列を有する。
【００５８】全ＤＮＡはＰＨＬの天然源から、例えばア
フリカツメガエルの体皮から、標準的方法により調製す
ることができる。次に、ポリ（Ａ）RNA を全ＲＮＡから
常法により、例えばオリゴ（ｄＴ）−ラテックス（宝酒
造）のごときオリゴ（ｄＴ）−アフィニティーカラムの
使用により調製することができる。常法に従って、例え
ば Gubler,U.ら、Gene, 25,263−269 (1983)の方法に従
ってcDNAを調製することができる。リンカー、例えば E
coRIリンカーをcDNAに連結した後、cDNAをクローニング
ベクターに、例えばファージλgt10の EcoRI部位に挿入
することができる。
フリカツメガエルの体皮から、標準的方法により調製す
ることができる。次に、ポリ（Ａ）RNA を全ＲＮＡから
常法により、例えばオリゴ（ｄＴ）−ラテックス（宝酒
造）のごときオリゴ（ｄＴ）−アフィニティーカラムの
使用により調製することができる。常法に従って、例え
ば Gubler,U.ら、Gene, 25,263−269 (1983)の方法に従
ってcDNAを調製することができる。リンカー、例えば E
coRIリンカーをcDNAに連結した後、cDNAをクローニング
ベクターに、例えばファージλgt10の EcoRI部位に挿入
することができる。
【００５９】クローニングベクターとしてコスミド又は
λ−ファージが使用され、そして常法に従って試験管内
パッケージング反応が行われる。次に、cDNAライブラリ
ーを調製するために大腸菌のごとき適当な宿主を常法に
従って形質転換することができる。次に、対象とするＰ
ＨＬをコードするcDNAを含有すると予想されるクローン
を常用のスクリーニング法に従って、例えば、酵素活
性、特異抗体の結合、又はＰＨＬ遺伝子のＤＮＡ配列に
相同なラベルされたＤＮＡプローブとＤＮＡとのハイブ
リダイゼーションによりライブラリーを検索することに
よってスクリーニングすることができる。
λ−ファージが使用され、そして常法に従って試験管内
パッケージング反応が行われる。次に、cDNAライブラリ
ーを調製するために大腸菌のごとき適当な宿主を常法に
従って形質転換することができる。次に、対象とするＰ
ＨＬをコードするcDNAを含有すると予想されるクローン
を常用のスクリーニング法に従って、例えば、酵素活
性、特異抗体の結合、又はＰＨＬ遺伝子のＤＮＡ配列に
相同なラベルされたＤＮＡプローブとＤＮＡとのハイブ
リダイゼーションによりライブラリーを検索することに
よってスクリーニングすることができる。
【００６０】例えば合成オリゴヌクレオチドであること
ができるＤＮＡプローブの配列を、ＰＨＬアミノ酸配列
の部分を決定しそして対応するＤＮＡ配列を推定するこ
とによりあらかじめ決定することができる。アフリカツ
メガエル体皮からのＰＨＬとcDNAのヌクレオチド配列か
ら推定されたアフリカツメガエルからのＰＡＭ酵素AE−
IIのアミノ酸配列(Ohsuye,K.ら、Biochem.Biophys.Res.
Commun. 150, 1275−1281, 1988) の比較が示すところ
によれば、両酵素は相同な配列を有する区域を共有す
る。
ができるＤＮＡプローブの配列を、ＰＨＬアミノ酸配列
の部分を決定しそして対応するＤＮＡ配列を推定するこ
とによりあらかじめ決定することができる。アフリカツ
メガエル体皮からのＰＨＬとcDNAのヌクレオチド配列か
ら推定されたアフリカツメガエルからのＰＡＭ酵素AE−
IIのアミノ酸配列(Ohsuye,K.ら、Biochem.Biophys.Res.
Commun. 150, 1275−1281, 1988) の比較が示すところ
によれば、両酵素は相同な配列を有する区域を共有す
る。
【００６１】従って本発明においては、ＰＨＬのＤＮＡ
を担持するクローンについてライブラリーを予備スクリ
ーニングするためにAE−IIのcDNAの制限断片を使用する
ことができる。Ohsuyeら (前掲) に従って得られたAE−
IIのcDNAの 814bp長のXbaI(1191)−XbaI(2004)断片をRa
ndom Primed DNA Labeling Kit(Boehringer Mannheim C
o.) により〔α−32Ｐ〕dCTPでラベルし、そしてプロー
ブとして使用した。
を担持するクローンについてライブラリーを予備スクリ
ーニングするためにAE−IIのcDNAの制限断片を使用する
ことができる。Ohsuyeら (前掲) に従って得られたAE−
IIのcDNAの 814bp長のXbaI(1191)−XbaI(2004)断片をRa
ndom Primed DNA Labeling Kit(Boehringer Mannheim C
o.) により〔α−32Ｐ〕dCTPでラベルし、そしてプロー
ブとして使用した。
【００６２】本明細書において、このプローブを「AE−
II−Xba 」と称する。本発明においては、約2.５×105
クローンから成るcDNAライブラリーをスクリーニングし
て13個の陽性クローンを得た。言うまでもなく陽性クロ
ーンはAE−II cDNA クローンを含むから、ＰＨＬをコー
ドする本発明のクローンを第２段階においてスクリーニ
ングしなければならなかった。AE−II及びＰＨＬのアミ
ノ酸配列の相違に基き、AE−II cDNA の EcoRV開裂部位
はＰＨＬをコードするcDNA中には存在しないが Kpn−I
開裂部位が存在することが予想された。
II−Xba 」と称する。本発明においては、約2.５×105
クローンから成るcDNAライブラリーをスクリーニングし
て13個の陽性クローンを得た。言うまでもなく陽性クロ
ーンはAE−II cDNA クローンを含むから、ＰＨＬをコー
ドする本発明のクローンを第２段階においてスクリーニ
ングしなければならなかった。AE−II及びＰＨＬのアミ
ノ酸配列の相違に基き、AE−II cDNA の EcoRV開裂部位
はＰＨＬをコードするcDNA中には存在しないが Kpn−I
開裂部位が存在することが予想された。
【００６３】そのため、陽性クローンの挿入されたＤＮ
Ａ断片をプレート上のプラークから得られたファージＤ
ＮＡから、Saiki,R.K.ら、 Science, 239, 487−491 (1
988)のＲＣＲ法により直接増幅し、そしてそれを２種類
の制限酵素 EcoRV及びKpnIで消化することによりスクリ
ーニングした。その結果、13個の陽性クローンの内４ク
ローンがＰＨＬ型であることが見出された。最も長いコ
ード領域を有すると予想される１個のクローンを選択
し、そしてAE−III −101 ／λgt10と命名した。
Ａ断片をプレート上のプラークから得られたファージＤ
ＮＡから、Saiki,R.K.ら、 Science, 239, 487−491 (1
988)のＲＣＲ法により直接増幅し、そしてそれを２種類
の制限酵素 EcoRV及びKpnIで消化することによりスクリ
ーニングした。その結果、13個の陽性クローンの内４ク
ローンがＰＨＬ型であることが見出された。最も長いコ
ード領域を有すると予想される１個のクローンを選択
し、そしてAE−III −101 ／λgt10と命名した。
【００６４】一層長いcDNAクローンを得るため、クロー
ンAE−III −101 ／λgt10のcDNA挿入部の５′−側に位
置する0.５kbの EcoRI−BamHI 断片を〔α−32Ｐ〕dCTP
によりラベルして第二のプローブAE−III −Bam を得
た。両プローブAE−II−Xba 及びAE−III −Bam を用い
て、cDNAライブラリーをスクリーニングして両プローブ
とハイブリダイズするクローンを得た。
ンAE−III −101 ／λgt10のcDNA挿入部の５′−側に位
置する0.５kbの EcoRI−BamHI 断片を〔α−32Ｐ〕dCTP
によりラベルして第二のプローブAE−III −Bam を得
た。両プローブAE−II−Xba 及びAE−III −Bam を用い
て、cDNAライブラリーをスクリーニングして両プローブ
とハイブリダイズするクローンを得た。
【００６５】前記の場合と同様にして、これらの挿入さ
れたＤＮＡ断片をＰＣＲ法により直接に増幅し、そして
制限酵素 EcoRV及びKpnIを用いてＰＨＬ型のクローンを
見出した。これらの内、最も長いコード領域を有すると
予想されるクローンを選択し、そしてAE−III −202 ／
λgt10と命名した。次に、クローンAE−III −202 ／λ
gt10のcDNA挿入部のＤＮＡ配列を常法に従って決定し
た。この配列を配列表の配列番号：１に示す。AE−III
−202 のcDNA挿入部は3383bpから成り、そして塩基位置
31のＡＴＧから始まって塩基位置2838の終止コドンＴＧ
Ａで終り、 935個のアミノ酸をコードするリーディング
フレームを含んで成る。
れたＤＮＡ断片をＰＣＲ法により直接に増幅し、そして
制限酵素 EcoRV及びKpnIを用いてＰＨＬ型のクローンを
見出した。これらの内、最も長いコード領域を有すると
予想されるクローンを選択し、そしてAE−III −202 ／
λgt10と命名した。次に、クローンAE−III −202 ／λ
gt10のcDNA挿入部のＤＮＡ配列を常法に従って決定し
た。この配列を配列表の配列番号：１に示す。AE−III
−202 のcDNA挿入部は3383bpから成り、そして塩基位置
31のＡＴＧから始まって塩基位置2838の終止コドンＴＧ
Ａで終り、 935個のアミノ酸をコードするリーディング
フレームを含んで成る。
【００６６】このアミノ酸配列を有するペプチドをAE−
III と命名する。AE−III の構造において、シグナルペ
プチド又はその部分であろうと予想される疎水性領域が
アミノ酸位置１から21位に延び、そして本発明のＰＨＬ
活性を有する好ましい蛋白質に相当するアミノ酸配列が
およそ 363〜383 位(Glu) から、 706位(Lys) 〜 935位
(Ser) の間のいずれかのアミノ酸に延び、そして最も好
ましくはおよそ 383位から 706位、 713位又は 935位に
延びる。
III と命名する。AE−III の構造において、シグナルペ
プチド又はその部分であろうと予想される疎水性領域が
アミノ酸位置１から21位に延び、そして本発明のＰＨＬ
活性を有する好ましい蛋白質に相当するアミノ酸配列が
およそ 363〜383 位(Glu) から、 706位(Lys) 〜 935位
(Ser) の間のいずれかのアミノ酸に延び、そして最も好
ましくはおよそ 383位から 706位、 713位又は 935位に
延びる。
【００６７】ＰＨＬ活性を有する他の好ましい蛋白質は
アミノ酸１〜750 、又は１〜59及び363〜760 から成
り、そしてベクター pVL−AE−III 又は pVL−PHL の挿
入部によりコードされている。従って、アフリカツメガ
エルの天然成熟ＰＨＬは前駆体AE−III のプロセシング
により形成される。ＰＨＬの前駆体をコードするAE−II
I 遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子を用いて組換ＤＮＡ技
法により前駆体を製造することができる。それを適切に
短縮し、そしてそれを発現ベクターに挿入することによ
り、それを前記のようにＰＨＬ活性を有する好ましい蛋
白質を直接製造するために使用することができ、しかし
さらに、短縮されたＣ−末端又はＮ−末端を有しＰＨＬ
活性を有する他の蛋白質、及び他の種々の修飾されたＰ
ＨＬ酵素の製造のためにも使用することができる。形質転換された宿主及びその調製 本発明は、本発明の組換ＤＮＡ分子を増幅するため又は
特に本発明の組換ＤＮＡ分子に含まれるＰＨＬ構造遺伝
子を発現するために形質転換された宿主細胞に関する。
アミノ酸１〜750 、又は１〜59及び363〜760 から成
り、そしてベクター pVL−AE−III 又は pVL−PHL の挿
入部によりコードされている。従って、アフリカツメガ
エルの天然成熟ＰＨＬは前駆体AE−III のプロセシング
により形成される。ＰＨＬの前駆体をコードするAE−II
I 遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子を用いて組換ＤＮＡ技
法により前駆体を製造することができる。それを適切に
短縮し、そしてそれを発現ベクターに挿入することによ
り、それを前記のようにＰＨＬ活性を有する好ましい蛋
白質を直接製造するために使用することができ、しかし
さらに、短縮されたＣ−末端又はＮ−末端を有しＰＨＬ
活性を有する他の蛋白質、及び他の種々の修飾されたＰ
ＨＬ酵素の製造のためにも使用することができる。形質転換された宿主及びその調製 本発明は、本発明の組換ＤＮＡ分子を増幅するため又は
特に本発明の組換ＤＮＡ分子に含まれるＰＨＬ構造遺伝
子を発現するために形質転換された宿主細胞に関する。
【００６８】形質転換された微生物宿主株は、当業界に
おいて知られている方法を適用して、該微生物細胞によ
り資化され得る炭素及び窒素源並びに無機塩を含有する
液体培地中で培養される。宿主の培養は常用の栄養培地
中で行われ、この培地には、非−形質転換体すなわち目
的のＤＮＡ分子を欠く宿主からの形質転換体すなわち目
的のＤＮＡ分子を選択マーカーと共に含有する宿主の負
の選択又は正の選択を可能にする化学物質を補充しても
よく又はこの様な化学物質を排除してもよい。
おいて知られている方法を適用して、該微生物細胞によ
り資化され得る炭素及び窒素源並びに無機塩を含有する
液体培地中で培養される。宿主の培養は常用の栄養培地
中で行われ、この培地には、非−形質転換体すなわち目
的のＤＮＡ分子を欠く宿主からの形質転換体すなわち目
的のＤＮＡ分子を選択マーカーと共に含有する宿主の負
の選択又は正の選択を可能にする化学物質を補充しても
よく又はこの様な化学物質を排除してもよい。
【００６９】当業界において有用なあらゆる形質転換可
能な宿主、例えば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisi
ae)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lac
tis) 、又は糸状真菌、例えばアスペルギルス・スペシ
ス(Aspergillus spec.)、例えばＡ．ニドランス（A. ni
dulans) 、Ａ．オリゼー（A. oryzae) 、Ａ．カーボナ
リウス（A. carbonarius)、Ａ．アワモリ（A. awamor
i)又はＡ．ニガー（A. niger)を用いることができる。
能な宿主、例えば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisi
ae)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lac
tis) 、又は糸状真菌、例えばアスペルギルス・スペシ
ス(Aspergillus spec.)、例えばＡ．ニドランス（A. ni
dulans) 、Ａ．オリゼー（A. oryzae) 、Ａ．カーボナ
リウス（A. carbonarius)、Ａ．アワモリ（A. awamor
i)又はＡ．ニガー（A. niger)を用いることができる。
【００７０】しかしながら、制限酵素又は修飾酵素を欠
くか又はその含量が少ない適当な宿主の使用が有利であ
る。この様な宿主の例は細菌、例えばバシルス・ズブチ
リス（Bacillus subtillis)、バシルス・ステアロサー
モフィルス（Bacillus stearothermophilus) 、シュー
ドモナス (Pseudomonas)、ヘモフィルス (Haemophilu
s)、ストレプトコッカス (Streptococcus)等、及び酵
母、例えば、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharom
yces cerevisiae) であり、そして特に大腸菌(Escheri
chia coli) の株、例えば大腸菌X1776 、大腸菌Y1090
、大腸菌W3110 、大腸菌 101／LM1035、大腸菌JA221
、大腸菌 DH5α、又は好ましくは大腸菌DHαＦ′，JM1
09, MH1もしくはHB101 、又は大腸菌Ｋ12株である。
くか又はその含量が少ない適当な宿主の使用が有利であ
る。この様な宿主の例は細菌、例えばバシルス・ズブチ
リス（Bacillus subtillis)、バシルス・ステアロサー
モフィルス（Bacillus stearothermophilus) 、シュー
ドモナス (Pseudomonas)、ヘモフィルス (Haemophilu
s)、ストレプトコッカス (Streptococcus)等、及び酵
母、例えば、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharom
yces cerevisiae) であり、そして特に大腸菌(Escheri
chia coli) の株、例えば大腸菌X1776 、大腸菌Y1090
、大腸菌W3110 、大腸菌 101／LM1035、大腸菌JA221
、大腸菌 DH5α、又は好ましくは大腸菌DHαＦ′，JM1
09, MH1もしくはHB101 、又は大腸菌Ｋ12株である。
【００７１】他の好ましい宿主は高等生物の細胞、特に
樹立された連続性ヒトもしくは動物細胞、例えばヒト胎
児性肺繊維芽細胞L132、ヒト悪性黒色腫 Bowes細胞、Le
La細胞、アフリカミドリザルのSV40ウイルスで形質転換
された腎細胞 COS−7 、チャイニーズハムスター卵巣(C
HO) 細胞である。他の好ましい細胞は樹立された昆虫細
胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ (Spodoptera
frugiperda) 、例えばSf21又は好ましくはSf9(ATCC C
RL1711)、マメストラ・ブラッシカ (Mamestra brassic
a) 、ボンビックス・モリ (Bombyx mori) 細胞系であ
って、ボンビックス・モリ核多形体病ウイルス(BmNPV)
を用いるもの、等である。
樹立された連続性ヒトもしくは動物細胞、例えばヒト胎
児性肺繊維芽細胞L132、ヒト悪性黒色腫 Bowes細胞、Le
La細胞、アフリカミドリザルのSV40ウイルスで形質転換
された腎細胞 COS−7 、チャイニーズハムスター卵巣(C
HO) 細胞である。他の好ましい細胞は樹立された昆虫細
胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ (Spodoptera
frugiperda) 、例えばSf21又は好ましくはSf9(ATCC C
RL1711)、マメストラ・ブラッシカ (Mamestra brassic
a) 、ボンビックス・モリ (Bombyx mori) 細胞系であ
って、ボンビックス・モリ核多形体病ウイルス(BmNPV)
を用いるもの、等である。
【００７２】好ましい形質転換された宿主は、実施例に
記載するプラスミド pAE−III −202 −４, pVL−PHL
又は pVL−AE−III により形質転換された大腸菌HB101
である。他の好ましい形質転換された宿主は実施例３に
おいて調製される組換バキュロウイルス AcPHL又はAcAE
−III により形質転換されたスポドプテラ・フルギペル
ダ (Spodoptera frugiperda Sf9)(ATCC CRL1711)であ
る。
記載するプラスミド pAE−III −202 −４, pVL−PHL
又は pVL−AE−III により形質転換された大腸菌HB101
である。他の好ましい形質転換された宿主は実施例３に
おいて調製される組換バキュロウイルス AcPHL又はAcAE
−III により形質転換されたスポドプテラ・フルギペル
ダ (Spodoptera frugiperda Sf9)(ATCC CRL1711)であ
る。
【００７３】本発明はさらに、この様な形質転換された
宿主の製造方法に関し、この方法は適当な宿主を形質転
換条件下で、本発明の組換ＤＮＡ分子、特に本発明のハ
イブリドベクターにより、及び場合によっては選択マー
カーにより処理し、そして場合によっては形質転換体を
選択することを含んで成る。微生物の形質転換は、文献
に記載されている常法に従って、例えばＳ．セレビシエ
ーについてはA.Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
5, 1929, 1978に記載されている方法に従って、Ｂ．ズ
ブチリスについては Anagnostopoulosら、 J.Bacterio
l. 81, 741, 1961 に記載されている方法に従って、そ
して大腸菌についてはM.Mandelら、J.Mol.Biol. 53, 15
9, 1970 に記載されている方法に従って行われる。
宿主の製造方法に関し、この方法は適当な宿主を形質転
換条件下で、本発明の組換ＤＮＡ分子、特に本発明のハ
イブリドベクターにより、及び場合によっては選択マー
カーにより処理し、そして場合によっては形質転換体を
選択することを含んで成る。微生物の形質転換は、文献
に記載されている常法に従って、例えばＳ．セレビシエ
ーについてはA.Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
5, 1929, 1978に記載されている方法に従って、Ｂ．ズ
ブチリスについては Anagnostopoulosら、 J.Bacterio
l. 81, 741, 1961 に記載されている方法に従って、そ
して大腸菌についてはM.Mandelら、J.Mol.Biol. 53, 15
9, 1970 に記載されている方法に従って行われる。
【００７４】従って、大腸菌細胞の形質転換方法は、例
えば、ＤＮＡの取込みを可能にするための細胞のCa2+に
よる前処理、及びハイブリドベクターとのインキュベー
ションを含む。これに続く形質転換細胞の選択は、例え
ば、ベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存して親
細胞からの形質転換細胞の分離を可能にする選択増殖培
地への細胞の移送により達成することができる。
えば、ＤＮＡの取込みを可能にするための細胞のCa2+に
よる前処理、及びハイブリドベクターとのインキュベー
ションを含む。これに続く形質転換細胞の選択は、例え
ば、ベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存して親
細胞からの形質転換細胞の分離を可能にする選択増殖培
地への細胞の移送により達成することができる。
【００７５】好ましくは、ベクターを含有しない細胞の
増殖を許容しない増殖培地が使用される。例えば、酵母
の形質転換は、グリコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素
的除去、ポリエチレングリコール及びCa2+の存在下での
得られたスフェロプラストのベクターによる処理、並び
に該スフェロプラストの寒天への包埋による細胞壁の再
生の段階を含んで成る。好ましくは、再生用寒天は、前
記の形質転換された細胞の再生と選択とを同時に可能に
するように調製される。
増殖を許容しない増殖培地が使用される。例えば、酵母
の形質転換は、グリコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素
的除去、ポリエチレングリコール及びCa2+の存在下での
得られたスフェロプラストのベクターによる処理、並び
に該スフェロプラストの寒天への包埋による細胞壁の再
生の段階を含んで成る。好ましくは、再生用寒天は、前
記の形質転換された細胞の再生と選択とを同時に可能に
するように調製される。
【００７６】高等真核源、例えば哺乳類細胞系の形質転
換は好ましくはトランスフェクションにより達成され
る。トランスフェクションは常法に従って、例えばリン
酸カルシウム沈澱、マイクロインジェクション、プロト
プラスト融合、又はエレクトロポレーション、すなわち
細胞膜の透過性を一時的に増加させる短い電気パルスに
よるＤＮＡの導入により、あるいはヘルパー化合物、例
えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスル
ホキシド、グリセロール又はポリエチレングリコール等
の存在下で行われる。
換は好ましくはトランスフェクションにより達成され
る。トランスフェクションは常法に従って、例えばリン
酸カルシウム沈澱、マイクロインジェクション、プロト
プラスト融合、又はエレクトロポレーション、すなわち
細胞膜の透過性を一時的に増加させる短い電気パルスに
よるＤＮＡの導入により、あるいはヘルパー化合物、例
えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスル
ホキシド、グリセロール又はポリエチレングリコール等
の存在下で行われる。
【００７７】トランスフェクションの後、選択マーカー
の性質に依存して選択された選択培地、例えば標準培
地、例えば Dulbecoの改変 Eagle培地(DMEM)、最少必須
培地、RPMI1640培地等であって例えば対応する抗生物質
を含有するものの中での培養により、同定及び選択され
る。形質転換された宿主細胞は当業界において知られて
方法により、資化性炭素源、例えば炭水化物、例えばグ
ルコース又はラクトース、資化性窒素源、例えばアミノ
酸、ペプチド、蛋白質又はそれらの分解生成物、例えば
ペプトン、アンモニウム塩等、さらには無機塩、例えば
ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの
硫酸塩、リン酸塩及び／又は炭酸塩を含有する液体培地
中で培養される。培地はさらに、例えば増殖促進物質、
例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等を含有す
る。
の性質に依存して選択された選択培地、例えば標準培
地、例えば Dulbecoの改変 Eagle培地(DMEM)、最少必須
培地、RPMI1640培地等であって例えば対応する抗生物質
を含有するものの中での培養により、同定及び選択され
る。形質転換された宿主細胞は当業界において知られて
方法により、資化性炭素源、例えば炭水化物、例えばグ
ルコース又はラクトース、資化性窒素源、例えばアミノ
酸、ペプチド、蛋白質又はそれらの分解生成物、例えば
ペプトン、アンモニウム塩等、さらには無機塩、例えば
ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの
硫酸塩、リン酸塩及び／又は炭酸塩を含有する液体培地
中で培養される。培地はさらに、例えば増殖促進物質、
例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等を含有す
る。
【００７８】培地は好ましくは、選択圧を生じさせ、そ
して形質転換されていないか又はハイブリドベクターを
失った細胞の増殖を防止するように選択される。従っ
て、例えば、ハイブリドベクターがマーカーとして抗生
物質耐性遺伝子を含有する場合には抗生物質が培地に添
加される。例えば、必須アミノ酸について栄養要求性の
宿主細胞が使用され、ハイブリドベクターが宿主の欠陥
を補完する酵素をコードする遺伝子を含有する場合、形
質転換された細胞を培養するためにそのアミノ酸を欠く
最少培地が使用される。
して形質転換されていないか又はハイブリドベクターを
失った細胞の増殖を防止するように選択される。従っ
て、例えば、ハイブリドベクターがマーカーとして抗生
物質耐性遺伝子を含有する場合には抗生物質が培地に添
加される。例えば、必須アミノ酸について栄養要求性の
宿主細胞が使用され、ハイブリドベクターが宿主の欠陥
を補完する酵素をコードする遺伝子を含有する場合、形
質転換された細胞を培養するためにそのアミノ酸を欠く
最少培地が使用される。
【００７９】高等真核源の細胞、例えば哺乳類細胞は、
商業的に入手可能な培地、例えばDulbeccoの改変 Eagle
培地(DMEM)、最少必須培地、RPMI1640培地等であって、
場合によっては増殖促進物質及び／又は哺乳類血清が補
充されているものを用いて組織培養条件下で増殖させ
る。組織培養条件下での細胞培養の技法は当業界におい
てよく知られており、そしてエアーリフト反応器もしく
は連続攪拌反応器中での均一懸濁培養、あるいは例えば
中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビ
ーズ上、多孔性ガラスビーズ、セラミックカートリッ
ジ、又は他のマイクロキャリヤーでの固定化又は捕捉細
胞培養を含む。
商業的に入手可能な培地、例えばDulbeccoの改変 Eagle
培地(DMEM)、最少必須培地、RPMI1640培地等であって、
場合によっては増殖促進物質及び／又は哺乳類血清が補
充されているものを用いて組織培養条件下で増殖させ
る。組織培養条件下での細胞培養の技法は当業界におい
てよく知られており、そしてエアーリフト反応器もしく
は連続攪拌反応器中での均一懸濁培養、あるいは例えば
中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビ
ーズ上、多孔性ガラスビーズ、セラミックカートリッ
ジ、又は他のマイクロキャリヤーでの固定化又は捕捉細
胞培養を含む。
【００８０】培養は当業界において知られている方法に
より行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH値及び
発酵条件は、本発明のポリペプチド又は誘導体の最高力
価が得られるように選択される。すなわち、大腸菌又は
酵母株は好ましくは好気的条件下で液中培養により攪拌
又は振とうしながら、約20℃〜40℃、好ましくは約30℃
の温度において、そして４〜８、好ましくは約７のpH値
において、約４〜30時間、好ましくは本発明のポリペプ
チド又は誘導体の最高収量が達成されるまで、培養され
る。ＰＨＬの製造 本発明はまた、ＰＨＬの製造方法に関する。
より行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH値及び
発酵条件は、本発明のポリペプチド又は誘導体の最高力
価が得られるように選択される。すなわち、大腸菌又は
酵母株は好ましくは好気的条件下で液中培養により攪拌
又は振とうしながら、約20℃〜40℃、好ましくは約30℃
の温度において、そして４〜８、好ましくは約７のpH値
において、約４〜30時間、好ましくは本発明のポリペプ
チド又は誘導体の最高収量が達成されるまで、培養され
る。ＰＨＬの製造 本発明はまた、ＰＨＬの製造方法に関する。
【００８１】１つの態様は前記の常法に従って天然源か
らＰＨＬを製造する方法である。第２の態様は、ＰＨＬ
活性を有するポリペプチド又は場合によってはイン−ビ
ボもしくはイン−ビトロでこの様なポリペプチドを遊離
するようにプロセシングし得る前駆体をコードする構造
遺伝子を適当な形質転換された宿主中で発現せしめ、そ
してＰＨＬ活性を有する生産されたポリペプチドを、場
合によっては発現された前駆体をプロセシングした後
に、単離することを含んで成る方法によるＰＨＬの製造
である。
らＰＨＬを製造する方法である。第２の態様は、ＰＨＬ
活性を有するポリペプチド又は場合によってはイン−ビ
ボもしくはイン−ビトロでこの様なポリペプチドを遊離
するようにプロセシングし得る前駆体をコードする構造
遺伝子を適当な形質転換された宿主中で発現せしめ、そ
してＰＨＬ活性を有する生産されたポリペプチドを、場
合によっては発現された前駆体をプロセシングした後
に、単離することを含んで成る方法によるＰＨＬの製造
である。
【００８２】ＰＨＬの発現のため、原核性又は真核性宿
主細胞、例えば、プロテアーゼ遺伝子、例えば lonプロ
テアーゼ遺伝子、及びヒートショックにより誘導される
蛋白質合成の制限に関与する遺伝子、例えばhtpR遺伝子
を欠く大腸菌（米国特許No.4,758,512； Buell,Gら、 N
ucleic Acids Res. 13：1928−1938, 1984) 、を用いる
ことができる。
主細胞、例えば、プロテアーゼ遺伝子、例えば lonプロ
テアーゼ遺伝子、及びヒートショックにより誘導される
蛋白質合成の制限に関与する遺伝子、例えばhtpR遺伝子
を欠く大腸菌（米国特許No.4,758,512； Buell,Gら、 N
ucleic Acids Res. 13：1928−1938, 1984) 、を用いる
ことができる。
【００８３】本発明の他の態様によれば、本発明の酵素
をコードするＤＮＡ、例えばcDNAをバキュロウイルスト
ランスファーベクターに挿入して組換バキュロウイルス
トランスファーベクターを作製し、そしてこの組換バキ
ュロウイルストランスファーベクターをバキュロウイル
スＤＮＡと共に昆虫細胞に同時トランスフェクトして相
同性組換を行う。
をコードするＤＮＡ、例えばcDNAをバキュロウイルスト
ランスファーベクターに挿入して組換バキュロウイルス
トランスファーベクターを作製し、そしてこの組換バキ
ュロウイルストランスファーベクターをバキュロウイル
スＤＮＡと共に昆虫細胞に同時トランスフェクトして相
同性組換を行う。
【００８４】バキュロウイルストランスファーベクター
は通常はバキュロウイルスＤＮＡのセグメントを含有す
るプラスミドであり、このセグメントはバキュロウイル
スの複製のために必須でない遺伝子を含んで成る。バキ
ュロウイルスの複製のために必須でない遺伝子は例え
ば、ポリヘドリン構造遺伝子とそのプロモーターとを含
んで成るポリヘドリン遺伝子である。
は通常はバキュロウイルスＤＮＡのセグメントを含有す
るプラスミドであり、このセグメントはバキュロウイル
スの複製のために必須でない遺伝子を含んで成る。バキ
ュロウイルスの複製のために必須でない遺伝子は例え
ば、ポリヘドリン構造遺伝子とそのプロモーターとを含
んで成るポリヘドリン遺伝子である。
【００８５】この様なバキュロウイルストランスファー
ベクターは例えば、pAcYM1〔 Matsuura,Y.ら、J.Gen.Vi
rol.(1987), 68, 1233−1250), pAc311, pAc360, pAc37
3, pAc380(米国特許No.4,745,051), pAc700, pAc701, p
Ac702, pVL1392, pVL1393 、等である。 pVL1392を使用
するのが好ましい。本発明において使用されるバキュロ
ウイルスは例えば、トリコプルシア・ニ (Trichoplusia
ni) MNPV、ラチプルシア・オウ(Rachiplusia ou) MN
PV、ガレリア・メロネラ (Galleria mellonella) MNP
V、等である。好ましくはオートグラファ・カリホルニ
カ (Autographa californica) 核多形体病ウイルス(A
cMNPV)が使用される。
ベクターは例えば、pAcYM1〔 Matsuura,Y.ら、J.Gen.Vi
rol.(1987), 68, 1233−1250), pAc311, pAc360, pAc37
3, pAc380(米国特許No.4,745,051), pAc700, pAc701, p
Ac702, pVL1392, pVL1393 、等である。 pVL1392を使用
するのが好ましい。本発明において使用されるバキュロ
ウイルスは例えば、トリコプルシア・ニ (Trichoplusia
ni) MNPV、ラチプルシア・オウ(Rachiplusia ou) MN
PV、ガレリア・メロネラ (Galleria mellonella) MNP
V、等である。好ましくはオートグラファ・カリホルニ
カ (Autographa californica) 核多形体病ウイルス(A
cMNPV)が使用される。
【００８６】オートグラファ・カリホルニカ核多形体病
ウイルスと、バキュロウイルストランスファーベクター
pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392及びpVL1393 との組
合せを含んで成るキットがInvitrogen Corp.サンジエ
ゴ, カリホルニア, 米国から市販されている。本発明に
おいて使用される昆虫細胞は、例えば、スポロプテラ・
フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) 、例えばSf21
又は好ましくはSf9(ATCC CRL1711) 、しかしさらにマメ
ストラ・ブラッシカ (Mamestra brassica) 等である。
ボンビックス・モリ (Bombyx mori) 核多形体病ウイル
ス(BmNPV) を用いるボンビックス・モリ細胞系を本発明
において使用することもできる。
ウイルスと、バキュロウイルストランスファーベクター
pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392及びpVL1393 との組
合せを含んで成るキットがInvitrogen Corp.サンジエ
ゴ, カリホルニア, 米国から市販されている。本発明に
おいて使用される昆虫細胞は、例えば、スポロプテラ・
フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) 、例えばSf21
又は好ましくはSf9(ATCC CRL1711) 、しかしさらにマメ
ストラ・ブラッシカ (Mamestra brassica) 等である。
ボンビックス・モリ (Bombyx mori) 核多形体病ウイル
ス(BmNPV) を用いるボンビックス・モリ細胞系を本発明
において使用することもできる。
【００８７】相同性組換は、例えば、「A Manual of Me
thods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cult
ure Procedures, M.D.Summers, Texas Agricultural Ex
periment Station Bulletin No.1555 」に記載されてい
るような常法に従って行われる。トランスフェクトされ
た昆虫細胞は常法に従って培養される。すなわち、トラ
ンスフェクトされた昆虫細胞は、昆虫細胞が増殖するこ
とができる任意の組織培養培地、例えば、哺乳類血清を
補充した Grace又はTC100 培地、無血清培地EX−CELL40
0 等において、20℃〜30℃、好ましくは27℃〜28℃、例
えば27℃の温度において、２〜10日間、好ましくは３〜
５日間培養することができる。
thods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cult
ure Procedures, M.D.Summers, Texas Agricultural Ex
periment Station Bulletin No.1555 」に記載されてい
るような常法に従って行われる。トランスフェクトされ
た昆虫細胞は常法に従って培養される。すなわち、トラ
ンスフェクトされた昆虫細胞は、昆虫細胞が増殖するこ
とができる任意の組織培養培地、例えば、哺乳類血清を
補充した Grace又はTC100 培地、無血清培地EX−CELL40
0 等において、20℃〜30℃、好ましくは27℃〜28℃、例
えば27℃の温度において、２〜10日間、好ましくは３〜
５日間培養することができる。
【００８８】本発明によれば、発現されたＰＨＬ酵素は
培養上清に分泌され、そして次に常法、例えば遠心分
離、塩析法、もしくは種々のクロマトグラフィー法、又
はそれらの組合せにより培養上清から回収され得る。し
かしながら、発現された蛋白質は生産細胞に、例えば細
胞内又はペリプラズム空間内に付着したまま留る場合が
あり、そして細胞を破壊する常法に従って回収すること
ができる。ＰＨＬによるＣ−末端アミド化ペプチドの製造 本発明はまた、従来知られているＣ−末端アミド化酵素
ＰＡＭとＰＨＬ活性を有する本発明のポリペプチド、好
ましくはアフリカツメガエルのＰＨＬ又はその変異体も
しくは断片との組合せ使用により、Ｃ−末端にグリシン
残基を有するペプチドからＣ−末端がアミド化されたペ
プチドを効果的に製造する方法に関する。
培養上清に分泌され、そして次に常法、例えば遠心分
離、塩析法、もしくは種々のクロマトグラフィー法、又
はそれらの組合せにより培養上清から回収され得る。し
かしながら、発現された蛋白質は生産細胞に、例えば細
胞内又はペリプラズム空間内に付着したまま留る場合が
あり、そして細胞を破壊する常法に従って回収すること
ができる。ＰＨＬによるＣ−末端アミド化ペプチドの製造 本発明はまた、従来知られているＣ−末端アミド化酵素
ＰＡＭとＰＨＬ活性を有する本発明のポリペプチド、好
ましくはアフリカツメガエルのＰＨＬ又はその変異体も
しくは断片との組合せ使用により、Ｃ−末端にグリシン
残基を有するペプチドからＣ−末端がアミド化されたペ
プチドを効果的に製造する方法に関する。
【００８９】本発明はさらに、アミド化されたＣ−末端
を有するペプチドの製造方法に関し、この方法はＣ−末
端にα−ヒドロキシグリシンを有するペプチドを、ＰＨ
Ｌにより、好ましくは後記の配列表の配列番号：１のお
よそ１〜383 位、さらに好ましくは 363〜約383 位から
約 706位〜約 935位、好ましくは 706位、 713位又は93
5位まで延びるアミノ酸配列を有するＰＨＬにより処理
することを含んで成る。
を有するペプチドの製造方法に関し、この方法はＣ−末
端にα−ヒドロキシグリシンを有するペプチドを、ＰＨ
Ｌにより、好ましくは後記の配列表の配列番号：１のお
よそ１〜383 位、さらに好ましくは 363〜約383 位から
約 706位〜約 935位、好ましくは 706位、 713位又は93
5位まで延びるアミノ酸配列を有するＰＨＬにより処理
することを含んで成る。
【００９０】本発明の酵素は単独で、Ｃ−末端α−ヒド
ロキシグリシン含有ペプチド、例えばＣ−末端α−ヒド
ロキシグリシン含有ヒトカルシトニン前駆体 hCT−GlyO
H を対応するＣ−末端アミド化ペプチドに転換するため
に使用することができる。ＰＨＬ酵素が従来知られてい
るＣ−末端アミド化酵素ＰＡＭと組合わせて使用される
場合、反応はまたＣ−末端グリシン−延長ペプチド、例
えば対応するヒトカルシトニン前駆体 hCT−Gly を用い
て出発することができる。後者の場合、ＰＡＭがＣ−末
端にグリシンを有するペプチドのグリシンユニットをα
−ヒドロキシグリシンユニットに転換し、そしてＰＨＬ
酵素がこの中間体ペプチドをＣ−末端がアミド化された
ペプチドに転換する。
ロキシグリシン含有ペプチド、例えばＣ−末端α−ヒド
ロキシグリシン含有ヒトカルシトニン前駆体 hCT−GlyO
H を対応するＣ−末端アミド化ペプチドに転換するため
に使用することができる。ＰＨＬ酵素が従来知られてい
るＣ−末端アミド化酵素ＰＡＭと組合わせて使用される
場合、反応はまたＣ−末端グリシン−延長ペプチド、例
えば対応するヒトカルシトニン前駆体 hCT−Gly を用い
て出発することができる。後者の場合、ＰＡＭがＣ−末
端にグリシンを有するペプチドのグリシンユニットをα
−ヒドロキシグリシンユニットに転換し、そしてＰＨＬ
酵素がこの中間体ペプチドをＣ−末端がアミド化された
ペプチドに転換する。
【００９１】従って、Ｃ−末端アミド化ペプチドをＣ−
末端グリシン含有ペプチドから、これら２種類の酵素の
組合せ使用により高効率で製造することができ、この場
合これらの酵素を１段階で一緒に使用することができ、
又は２段階法において逐次使用することができる。２種
類の酵素が１つの反応混合物中で組合わされる場合、反
応条件、例えば共働因子(co-operative factor) 、pH、
温度等がＰＡＭ酵素及びＰＨＬ酵素の両者にとって適当
でなければならず、そして再酵素の最適pH、最適温度等
は相互に比較的接近していなければならない。
末端グリシン含有ペプチドから、これら２種類の酵素の
組合せ使用により高効率で製造することができ、この場
合これらの酵素を１段階で一緒に使用することができ、
又は２段階法において逐次使用することができる。２種
類の酵素が１つの反応混合物中で組合わされる場合、反
応条件、例えば共働因子(co-operative factor) 、pH、
温度等がＰＡＭ酵素及びＰＨＬ酵素の両者にとって適当
でなければならず、そして再酵素の最適pH、最適温度等
は相互に比較的接近していなければならない。
【００９２】２種類の酵素を２つの異る段階において逐
次反応させる場合、各段階のために個々の反応条件を選
択することができるから、それらは最適反応条件、例え
ば共働因子、最適pH、最適温度等を異にすることができ
る。本発明の好ましい態様においては、使用される酵素
はアフリカツメガエル由来のＰＡＭ及びＰＨＬである。
次反応させる場合、各段階のために個々の反応条件を選
択することができるから、それらは最適反応条件、例え
ば共働因子、最適pH、最適温度等を異にすることができ
る。本発明の好ましい態様においては、使用される酵素
はアフリカツメガエル由来のＰＡＭ及びＰＨＬである。
【００９３】アフリカツメガエル由来のＰＡＭを１段階
法においてアフリカツメガエル由来のＰＨＬと組合わせ
て使用する場合、銅イオン、アスコルビン酸、ＫＩ及び
カタラーゼを共働因子として使用しなければならず、そ
して反応混合物の好ましいpHは約5.５〜約6.０であり、
そして好ましい反応温度は約25℃〜約35℃である。Ｃ−
末端α−ヒドロキシグリシン含有ペプチドを対応するＣ
−末端アミド化ペプチドに転換するために反応混合物中
にアフリカツメガエル由来のＰＨＬのみを使用する場
合、前記の共働因子の使用は不必要であり、そして反応
は好ましくは約５〜約６のpH及び約30℃〜約40℃の反応
温度にて行われる。
法においてアフリカツメガエル由来のＰＨＬと組合わせ
て使用する場合、銅イオン、アスコルビン酸、ＫＩ及び
カタラーゼを共働因子として使用しなければならず、そ
して反応混合物の好ましいpHは約5.５〜約6.０であり、
そして好ましい反応温度は約25℃〜約35℃である。Ｃ−
末端α−ヒドロキシグリシン含有ペプチドを対応するＣ
−末端アミド化ペプチドに転換するために反応混合物中
にアフリカツメガエル由来のＰＨＬのみを使用する場
合、前記の共働因子の使用は不必要であり、そして反応
は好ましくは約５〜約６のpH及び約30℃〜約40℃の反応
温度にて行われる。
【００９４】反応に使用するＰＨＬ酵素の量は基質ペプ
チドの濃度に依存して異るが、約1,000 〜約20,000ユニ
ット／mlそしてさらに好ましくは約5,000 〜約18,000ユ
ニット／ml（ユニットは本明細書において前に定義した
通り）の範囲である。反応温度は基質ペプチドの濃度及
び酵素の量等により異るが、通常は約10分間〜約２日間
である。
チドの濃度に依存して異るが、約1,000 〜約20,000ユニ
ット／mlそしてさらに好ましくは約5,000 〜約18,000ユ
ニット／ml（ユニットは本明細書において前に定義した
通り）の範囲である。反応温度は基質ペプチドの濃度及
び酵素の量等により異るが、通常は約10分間〜約２日間
である。
【００９５】上記の方法のいずれにおいても、使用され
るＰＨＬ酵素は精製酵素、種々の程度に精製された部分
精製酵素、又は粗酵素であることができる。さらに、精
製酵素、部分精製酵素又は粗酵素を、酵素の固定化のた
めの常用手段、例えばキャリヤー結合法、架橋法、包摂
法等により固定化し、そしてその後使用することもでき
る。
るＰＨＬ酵素は精製酵素、種々の程度に精製された部分
精製酵素、又は粗酵素であることができる。さらに、精
製酵素、部分精製酵素又は粗酵素を、酵素の固定化のた
めの常用手段、例えばキャリヤー結合法、架橋法、包摂
法等により固定化し、そしてその後使用することもでき
る。
【００９６】反応後、Ｃ−末端がアミド化されたペプチ
ドを回収しそして精製する。この目的のため、前記Ｃ−
末端がアミド化されたペプチドの回収及び精製のための
常用手段、例えばHPLCのごときクロマトグラフィーを直
接適用することができる。
ドを回収しそして精製する。この目的のため、前記Ｃ−
末端がアミド化されたペプチドの回収及び精製のための
常用手段、例えばHPLCのごときクロマトグラフィーを直
接適用することができる。
【００９７】
【実施例】次に、実施例により本発明を例示するが、こ
れにより本発明の範囲を限定するものではない。実施例1. アフリカツメガエルの体皮からのＰＨＬ酵素
の精製及び特徴付け アフリカツメガエルの成体から皮膚を剥ぎ取り、ドライ
アイス上で凍結し、ハンマーで砕き、そして 100mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含有する 50m
M Tris−Cl緩衝液 (pH7.５）と共にポリトロン(Polytro
n)ホモジナイザーによりホモジナイズする。こうして得
られたホモジネートを遠心分離し、そして上清を硫酸ア
ンモニウム沈澱により分画する。
れにより本発明の範囲を限定するものではない。実施例1. アフリカツメガエルの体皮からのＰＨＬ酵素
の精製及び特徴付け アフリカツメガエルの成体から皮膚を剥ぎ取り、ドライ
アイス上で凍結し、ハンマーで砕き、そして 100mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含有する 50m
M Tris−Cl緩衝液 (pH7.５）と共にポリトロン(Polytro
n)ホモジナイザーによりホモジナイズする。こうして得
られたホモジネートを遠心分離し、そして上清を硫酸ア
ンモニウム沈澱により分画する。
【００９８】すなわち、硫酸アンモニウムを徐々に加え
てその最終濃度を25％飽和とし、この混合物を遠心分離
して沈澱を除去する。この上清にさらに硫酸アンモニウ
ムを加えてその最終濃度を55％飽和とする。生ずる沈澱
を遠心分離により集め、そして100mM PMSFを含有する20
mM bis−Tris−Cl緩衝液（pH6.０）に再溶解する。この
画分を、DEAE−Sepharose CL−6Bカラム(Pharmacia Co.
製)(50×250mm)によりさらに分画する。すなわち、100m
M PMSFを含有する20mM bis−Tris−Cl緩衝液（pH6.０）
中でDEAEカラムを平衡化した後、これに硫酸アンモニウ
ム沈澱画分を適用する。未吸着成分を十分に洗浄除去
し、そして吸着された成分を０〜300mM NaClの直線グラ
ジエントにより分画する。
てその最終濃度を25％飽和とし、この混合物を遠心分離
して沈澱を除去する。この上清にさらに硫酸アンモニウ
ムを加えてその最終濃度を55％飽和とする。生ずる沈澱
を遠心分離により集め、そして100mM PMSFを含有する20
mM bis−Tris−Cl緩衝液（pH6.０）に再溶解する。この
画分を、DEAE−Sepharose CL−6Bカラム(Pharmacia Co.
製)(50×250mm)によりさらに分画する。すなわち、100m
M PMSFを含有する20mM bis−Tris−Cl緩衝液（pH6.０）
中でDEAEカラムを平衡化した後、これに硫酸アンモニウ
ム沈澱画分を適用する。未吸着成分を十分に洗浄除去
し、そして吸着された成分を０〜300mM NaClの直線グラ
ジエントにより分画する。
【００９９】DEAEクロマトグラフィーの間に得られた画
分中のＰＨＬ酵素活性を次の様にして測定する。ＰＨＬ
及び 100mM〔２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン
酸〕(MES) を含有する溶液（pH5.２）に２mMベンゾイル
ヒドロキシグリシンを加える。この混合物を37℃にて30
分間インキュベートする。
分中のＰＨＬ酵素活性を次の様にして測定する。ＰＨＬ
及び 100mM〔２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン
酸〕(MES) を含有する溶液（pH5.２）に２mMベンゾイル
ヒドロキシグリシンを加える。この混合物を37℃にて30
分間インキュベートする。
【０１００】次に、この反応混合物に過塩酸を加えて反
応を停止させる。混合物を遠心分離し、そして上清中の
生成物を、カラムとして Hipore RP−318 (4.6×260mm;
BioRad Co.製) を用いそして溶離剤系として 0.1％ TF
A／12％ CH3CNを用いてHPLCにより上清中の生成物を測
定する。上記の条件下で１分間に１ピコモルのアミド化
生成物を生成する酵素の量を「１ユニット」と定義す
る。
応を停止させる。混合物を遠心分離し、そして上清中の
生成物を、カラムとして Hipore RP−318 (4.6×260mm;
BioRad Co.製) を用いそして溶離剤系として 0.1％ TF
A／12％ CH3CNを用いてHPLCにより上清中の生成物を測
定する。上記の条件下で１分間に１ピコモルのアミド化
生成物を生成する酵素の量を「１ユニット」と定義す
る。
【０１０１】ＰＨＬの活性が２個のピークとして検出さ
れる。主ピークを回収し、 100μMPMSFを含有する 50mM
Tris−Cl緩衝液に対して透析し、そして上記と同じ緩
衝液により平衡化されたMono Qカラム(HR 16／10, Pha
rmacia Co.製) に適用する。未吸着物質を十分に洗浄除
去した後、吸着された物質を０〜300mM NaClの直線グラ
ジエントにより分画する。Amicon社のCentricon を用い
てこの酵素の活性を示す画分を濃縮し、そして分子篩カ
ラムクロマトグラフィーによりさらに精製する。
れる。主ピークを回収し、 100μMPMSFを含有する 50mM
Tris−Cl緩衝液に対して透析し、そして上記と同じ緩
衝液により平衡化されたMono Qカラム(HR 16／10, Pha
rmacia Co.製) に適用する。未吸着物質を十分に洗浄除
去した後、吸着された物質を０〜300mM NaClの直線グラ
ジエントにより分画する。Amicon社のCentricon を用い
てこの酵素の活性を示す画分を濃縮し、そして分子篩カ
ラムクロマトグラフィーによりさらに精製する。
【０１０２】すなわち、直列に連結した２本のSuperose
12 (HR 10／30； Pharmacia Co.製) カラム、及び溶剤
として150mM NaClを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液
を用いて分子篩クロマトグラフィーを行う。溶出液中、
ＰＨＬの活性のピークを示す画分をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析する。分子量標準とし
てホスホリパーゼ（分子量97KDa)、ウシ血清アルブミン
(66KDa) 、オバルブミン(45KDa) 、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(36KDa) 、カーボ
ニックアンヒドラーゼ(31KDa) 及び大豆トリプシンイン
ヒビター(22KDa) を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により測定した場合、この酵素は約37KDa
の分子量を有する。
12 (HR 10／30； Pharmacia Co.製) カラム、及び溶剤
として150mM NaClを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液
を用いて分子篩クロマトグラフィーを行う。溶出液中、
ＰＨＬの活性のピークを示す画分をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析する。分子量標準とし
てホスホリパーゼ（分子量97KDa)、ウシ血清アルブミン
(66KDa) 、オバルブミン(45KDa) 、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(36KDa) 、カーボ
ニックアンヒドラーゼ(31KDa) 及び大豆トリプシンイン
ヒビター(22KDa) を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により測定した場合、この酵素は約37KDa
の分子量を有する。
【０１０３】ＰＨＬをさらに同定するため、これをMono
Qカラム (HR 5／5, Pharmacia Co.製) により分画す
る。 Superose 12カラムクロマトグラフィーにより得ら
れるこの酵素の活性を示す画分を回収し、50mM bis−Tr
is−Cl緩衝液（pH6.０）により10倍希釈し、そして上記
と同じ緩衝液により平衡化されたMono Qカラムに適用す
る。
Qカラム (HR 5／5, Pharmacia Co.製) により分画す
る。 Superose 12カラムクロマトグラフィーにより得ら
れるこの酵素の活性を示す画分を回収し、50mM bis−Tr
is−Cl緩衝液（pH6.０）により10倍希釈し、そして上記
と同じ緩衝液により平衡化されたMono Qカラムに適用す
る。
【０１０４】０〜300mM NaCl直線グラジエントにより、
この酵素の活性を単一ピークとして回収する。ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動においても約37KDa の
分子量を有する単一バンドが観察される。こうして、ア
フリカツメガエルの体皮55ｇから14μｇの精製酵素サン
プルが得られ、回収率３％、精製率約 1,400倍である。
この酵素の活性を単一ピークとして回収する。ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動においても約37KDa の
分子量を有する単一バンドが観察される。こうして、ア
フリカツメガエルの体皮55ｇから14μｇの精製酵素サン
プルが得られ、回収率３％、精製率約 1,400倍である。
【０１０５】最適作用pH、最適作用温度、pHに対する安
定性、及び温度に対する安定性を決定することによりこ
の酵素をさらに特徴付ける。結果は次の通りである。最適作用pH ：酵素を２mMの基質に対して37℃にて、30分
間、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.６及び4.６）、
MES−Na緩衝液 (pH5.４及び6.５）並びにTris−Cl緩衝
液（pH7.５及び8.５)(いずれも125mM)中で作用させた場
合、最適作用pHは約5.４である。pHに対する安定性 ：ＰＨＬを４℃にて24時間、Tris−Cl
緩衝液（pH7.５，8.０及び8.５）並びにグリシン−Ｎa
緩衝液 (pH9.０及び9.５)(いずれも250mM)中で放置し、
その後２mMの基質に対して37℃にて30分間 MES−Na緩衝
液 (pH5.２）中で作用させた場合、pH8.５において最高
活性を示す。最適作用温度 ：ＰＨＬ酵素を２mMの基質に対して30℃,
37℃及び42℃にて30分間、 100mM MES−Na緩衝液 (pH5.
２）中で作用させた場合、37℃において最高活性を示
し、30℃及び42℃においてもかなりの活性を示す。温度に対する安定性 ：酵素を37℃にて83時間置いた場
合、pH7.０にて活性をほとんど完全に失う。しかしなが
ら、25％のグリセロール又はエチレングリコールの存在
下では、上記と同じ条件下で約85％の活性を維持する。
25％のグリセロール又はエチレングリコールの存在下pH
8.５にて約 100％の活性が維持される。
定性、及び温度に対する安定性を決定することによりこ
の酵素をさらに特徴付ける。結果は次の通りである。最適作用pH ：酵素を２mMの基質に対して37℃にて、30分
間、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.６及び4.６）、
MES−Na緩衝液 (pH5.４及び6.５）並びにTris−Cl緩衝
液（pH7.５及び8.５)(いずれも125mM)中で作用させた場
合、最適作用pHは約5.４である。pHに対する安定性 ：ＰＨＬを４℃にて24時間、Tris−Cl
緩衝液（pH7.５，8.０及び8.５）並びにグリシン−Ｎa
緩衝液 (pH9.０及び9.５)(いずれも250mM)中で放置し、
その後２mMの基質に対して37℃にて30分間 MES−Na緩衝
液 (pH5.２）中で作用させた場合、pH8.５において最高
活性を示す。最適作用温度 ：ＰＨＬ酵素を２mMの基質に対して30℃,
37℃及び42℃にて30分間、 100mM MES−Na緩衝液 (pH5.
２）中で作用させた場合、37℃において最高活性を示
し、30℃及び42℃においてもかなりの活性を示す。温度に対する安定性 ：酵素を37℃にて83時間置いた場
合、pH7.０にて活性をほとんど完全に失う。しかしなが
ら、25％のグリセロール又はエチレングリコールの存在
下では、上記と同じ条件下で約85％の活性を維持する。
25％のグリセロール又はエチレングリコールの存在下pH
8.５にて約 100％の活性が維持される。
【０１０６】上に精製した酵素約50pmolを用いそして自
動気相アミノ酸シーケンサー(Applied Biosynthesis; M
odel 470A)を用いてＮ−末端のアミノ酸配列を決定す
る。さらに、約500pmol の酵素をトリプシンで消化す
る。消化生成物を逆相クロマトグラフィー (カラム：Ch
emocosorb ３μ C18−H, 8×75mm, Chemco；溶出：0.１
％トリフルオロ酢酸中０〜60％アセトニトリルの直線グ
ラジエント) により分離して34種類のペプチド断片を得
る。34断片中32断片のアミノ酸配列を上記と同様にして
決定する。これらの断片の配列は、配列表の配列番号：
１のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列に対応
する。実施例2. アフリカツメガエルＰＨＬをコードするcDNA
のクローニング及び配列決定 ２匹のアフリカツメガエルの体皮からグアニジイチオイ
ソシアネート法により全ＲＮＡを抽出する。オリゴ（ｄ
Ｔ）ラテックス（宝酒造）を用いて全ＲＮＡから精製さ
れた形のポリ（Ａ）RNA を調製する。５μｇのポリ
（Ａ）RNA を用いて、 Gubler,U.：Gene, 25,263−269
(1983)の方法に従って二本鎖cDNAを調製する。
動気相アミノ酸シーケンサー(Applied Biosynthesis; M
odel 470A)を用いてＮ−末端のアミノ酸配列を決定す
る。さらに、約500pmol の酵素をトリプシンで消化す
る。消化生成物を逆相クロマトグラフィー (カラム：Ch
emocosorb ３μ C18−H, 8×75mm, Chemco；溶出：0.１
％トリフルオロ酢酸中０〜60％アセトニトリルの直線グ
ラジエント) により分離して34種類のペプチド断片を得
る。34断片中32断片のアミノ酸配列を上記と同様にして
決定する。これらの断片の配列は、配列表の配列番号：
１のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列に対応
する。実施例2. アフリカツメガエルＰＨＬをコードするcDNA
のクローニング及び配列決定 ２匹のアフリカツメガエルの体皮からグアニジイチオイ
ソシアネート法により全ＲＮＡを抽出する。オリゴ（ｄ
Ｔ）ラテックス（宝酒造）を用いて全ＲＮＡから精製さ
れた形のポリ（Ａ）RNA を調製する。５μｇのポリ
（Ａ）RNA を用いて、 Gubler,U.：Gene, 25,263−269
(1983)の方法に従って二本鎖cDNAを調製する。
【０１０７】これに EcoRIリンカーを連結した後、cDNA
をファージλgt10の EcoRI部位に連結し、そしてイン−
ビトロパッケージング反応を行う。こうして、１ナノグ
ラムのポリ（Ａ）RNA から2.５×103 クローンのcDNAラ
イブラリーを得る。ライブラリーのスクリーニングを２
段階法により行う。実施例１において決定されたアフリ
カツメガエルからのＰＨＬのアミノ酸配列と、 Ohsuye.
K.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 150, 1275−1281
(1988) に公表されているcDNAのヌクレオチド配列から
推定されるアフリカツメガエル体皮からのＰＡＭ酵素AE
−IIのアミノ酸配列との比較が示すところによれば、両
酵素は相同な配列を有するセクションを共有する。
をファージλgt10の EcoRI部位に連結し、そしてイン−
ビトロパッケージング反応を行う。こうして、１ナノグ
ラムのポリ（Ａ）RNA から2.５×103 クローンのcDNAラ
イブラリーを得る。ライブラリーのスクリーニングを２
段階法により行う。実施例１において決定されたアフリ
カツメガエルからのＰＨＬのアミノ酸配列と、 Ohsuye.
K.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 150, 1275−1281
(1988) に公表されているcDNAのヌクレオチド配列から
推定されるアフリカツメガエル体皮からのＰＡＭ酵素AE
−IIのアミノ酸配列との比較が示すところによれば、両
酵素は相同な配列を有するセクションを共有する。
【０１０８】従って、本発明においてはＰＨＬのＤＮＡ
を担持するクローンについてライブラリーを予備スクリ
ーニングするためにAE−IIのcDNAの制限断片を使用する
ことができる。従って、ＰＨＬをコードするcDNAを選択
するための第一段階において、AE−IIをコードするcDNA
の制限断片をプローブとして使用する。すなわち、Ohsu
yeら、 Biochem.Biophys.Res.Commun. 150, 1275−1281
(1988) に記載されている方法に従って得たAE−IIをコ
ードするcDNAを制限酵素XbaIで消化してXbaI(1191)−Xb
aI(2004)の 814bpのXbaI断片を得、そしてこのＤＮＡ断
片をRandom Primed DNA Labeling Kit(Boehringer-Mann
heim Co.) により〔α− 32Ｐ〕dCTPを用いてラベルし、
そしてプローブとして使用する。このプローブをAE−II
−Xba と命名する。
を担持するクローンについてライブラリーを予備スクリ
ーニングするためにAE−IIのcDNAの制限断片を使用する
ことができる。従って、ＰＨＬをコードするcDNAを選択
するための第一段階において、AE−IIをコードするcDNA
の制限断片をプローブとして使用する。すなわち、Ohsu
yeら、 Biochem.Biophys.Res.Commun. 150, 1275−1281
(1988) に記載されている方法に従って得たAE−IIをコ
ードするcDNAを制限酵素XbaIで消化してXbaI(1191)−Xb
aI(2004)の 814bpのXbaI断片を得、そしてこのＤＮＡ断
片をRandom Primed DNA Labeling Kit(Boehringer-Mann
heim Co.) により〔α− 32Ｐ〕dCTPを用いてラベルし、
そしてプローブとして使用する。このプローブをAE−II
−Xba と命名する。
【０１０９】cDNAライブラリーから取った約2.５×105
個の組換えファージをナイロンフィルターに移し、そし
て前記プローブAE−II−Xba とと、37℃にて16時間、50
％ホルムアミド、５×Denhardt溶液（１×Denhardt溶
液：0.２％ BSAフラクションＶ、0.２％ポリビニルピロ
リドン、0.２％ Ficoll-400)、６×SSPE (SSPE：150mMN
aCl, 10mM NaH2PO4・H2O, 0.1mM EDTA, pHを7.４に調
整）、0.１％ SDS及び 100μｇ／mlの変性したサケ精子
ＤＮＡを含有する溶液中でハイブリダイズさせる。
個の組換えファージをナイロンフィルターに移し、そし
て前記プローブAE−II−Xba とと、37℃にて16時間、50
％ホルムアミド、５×Denhardt溶液（１×Denhardt溶
液：0.２％ BSAフラクションＶ、0.２％ポリビニルピロ
リドン、0.２％ Ficoll-400)、６×SSPE (SSPE：150mMN
aCl, 10mM NaH2PO4・H2O, 0.1mM EDTA, pHを7.４に調
整）、0.１％ SDS及び 100μｇ／mlの変性したサケ精子
ＤＮＡを含有する溶液中でハイブリダイズさせる。
【０１１０】フィルターを１％ SDS及び２×SSC (SSC：
150mM NaCl, 15mMクエン酸三ナトリウム・2H2O，pHを7.
０に調整）により68℃にて３回、いずれも３分間洗浄す
る。上記の方法により約2.５×105 個のファージをスク
リーニングして13個の陽性クローンを得、これらのクロ
ーンからＰＨＬをコードするcDNAを次のようにして選択
する。
150mM NaCl, 15mMクエン酸三ナトリウム・2H2O，pHを7.
０に調整）により68℃にて３回、いずれも３分間洗浄す
る。上記の方法により約2.５×105 個のファージをスク
リーニングして13個の陽性クローンを得、これらのクロ
ーンからＰＨＬをコードするcDNAを次のようにして選択
する。
【０１１１】まず、陽性クローンの挿入されたＤＮＡ断
片を、プレート上のプラークから得られたファージＤＮ
Ａから、Saiki,R.K.ら、 Science, 239, 487−491 (198
8)のＰＣＲ法に従ってλgt10プライマー（宝酒造）を用
いて直接に増幅する。こうして得られた各ＤＮＡ断片
を、制限酵素 EcoRV及びKpnIを用いての開裂の可能性に
基いて試験する。AE−II型のクローンは1770位に EcoRV
の開裂部位を有する。
片を、プレート上のプラークから得られたファージＤＮ
Ａから、Saiki,R.K.ら、 Science, 239, 487−491 (198
8)のＰＣＲ法に従ってλgt10プライマー（宝酒造）を用
いて直接に増幅する。こうして得られた各ＤＮＡ断片
を、制限酵素 EcoRV及びKpnIを用いての開裂の可能性に
基いて試験する。AE−II型のクローンは1770位に EcoRV
の開裂部位を有する。
【０１１２】他方、ＰＨＬ型のクローンは対応する Eco
RV開裂部位を有しないが1788位にKpnI開裂部位を有す
る。その結果、13個の陽性クローンの内４個がＰＨＬ型
でありそして８個がAEII型であることが示される。ＰＨ
Ｌをコードすると予想される最も長いcDNA鎖を有するク
ローンをAE−III −101 ／λgt10と命名する。次に、完
全長を有するさらに長いcDNAを得るため、クローンAE−
III −101 ／λgt10の挿入されたcDNAの５′−側に位置
する0.５kbの EcoRI／BamHI 断片を調製し、そしてこれ
を前記のプローブと同様にして〔α−32Ｐ〕dCTPにより
ラベルし、そして第二のプローブとして使用する。この
プローブをAE−III −Bam と命名し、そしてこのものは
配列番号：１の配列の 745位から1275位に延びる配列に
相当する配列を有する。
RV開裂部位を有しないが1788位にKpnI開裂部位を有す
る。その結果、13個の陽性クローンの内４個がＰＨＬ型
でありそして８個がAEII型であることが示される。ＰＨ
Ｌをコードすると予想される最も長いcDNA鎖を有するク
ローンをAE−III −101 ／λgt10と命名する。次に、完
全長を有するさらに長いcDNAを得るため、クローンAE−
III −101 ／λgt10の挿入されたcDNAの５′−側に位置
する0.５kbの EcoRI／BamHI 断片を調製し、そしてこれ
を前記のプローブと同様にして〔α−32Ｐ〕dCTPにより
ラベルし、そして第二のプローブとして使用する。この
プローブをAE−III −Bam と命名し、そしてこのものは
配列番号：１の配列の 745位から1275位に延びる配列に
相当する配列を有する。
【０１１３】このプローブAE−III −Bam 及び前記プロ
ーブAE−II−Xba を使用して2.５×106 個の組換ファー
ジから成るcDNAを前記の方法と同様にしてスクリーニン
グし、両プローブとハイブリダイズする15個の陽性クロ
ーンを得る。これらを第一スクリーニングと同様して分
析し、15個の陽性クローンの内５個の陽性クローンがＰ
ＨＬ型でありそして８個がAE−II型であることが示され
る。
ーブAE−II−Xba を使用して2.５×106 個の組換ファー
ジから成るcDNAを前記の方法と同様にしてスクリーニン
グし、両プローブとハイブリダイズする15個の陽性クロ
ーンを得る。これらを第一スクリーニングと同様して分
析し、15個の陽性クローンの内５個の陽性クローンがＰ
ＨＬ型でありそして８個がAE−II型であることが示され
る。
【０１１４】これらの内から、ＰＨＬを予想通りコード
する最長のcDNAを有するクローンを選択し、そしてAE−
III −202 ／λgt10と命名する。実施例２において得ら
れたクローンAE−III −202 ／λgt10のcDNA部分のＤＮ
Ａ配列を次の様にして決定する。超遠心分離 (Grossber
ger,D., Nucl.Acids.Res. 15, 6737, 1987) によりAE−
III −202 ／λgt10のファージＤＮＡを調製し、そして
EcoRIにより消化し、そしてcDNAを含有する２種類のＤ
ＮＡを Bluescript IIベクター(Strategene)にサブクロ
ーニングしてプラスミド pAE−III −202 −１及び pAE
−III −202 −２を得る。
する最長のcDNAを有するクローンを選択し、そしてAE−
III −202 ／λgt10と命名する。実施例２において得ら
れたクローンAE−III −202 ／λgt10のcDNA部分のＤＮ
Ａ配列を次の様にして決定する。超遠心分離 (Grossber
ger,D., Nucl.Acids.Res. 15, 6737, 1987) によりAE−
III −202 ／λgt10のファージＤＮＡを調製し、そして
EcoRIにより消化し、そしてcDNAを含有する２種類のＤ
ＮＡを Bluescript IIベクター(Strategene)にサブクロ
ーニングしてプラスミド pAE−III −202 −１及び pAE
−III −202 −２を得る。
【０１１５】これらのプラスミドを種々の制限酵素で消
化してＤＮＡ断片を得る。これらを、ベクターM13mp18,
M13mp19, pUC118及びpUC119を用いてサブクローニング
し、そしてジデオキシ法に従ってＤＮＡ配列を決定す
る。こうして決定された全配列を配列表の配列番号：１
に示す。こうしてAE−III −101 ／λgt10のcDNA挿入部
の配列を決定する。
化してＤＮＡ断片を得る。これらを、ベクターM13mp18,
M13mp19, pUC118及びpUC119を用いてサブクローニング
し、そしてジデオキシ法に従ってＤＮＡ配列を決定す
る。こうして決定された全配列を配列表の配列番号：１
に示す。こうしてAE−III −101 ／λgt10のcDNA挿入部
の配列を決定する。
【０１１６】これは、配列番号：１の配列の 745位のヌ
クレオチドから始まり３′−末端で終る全領域に相当す
る。プラスミド pAE−III −202 −１の挿入部のＤＮＡ
配列は１位のヌクレオチドから1891位のヌクレオチドに
延び、そしてプラスミド pAE−III −202 −２の挿入部
のそれは1891位から3383位に延びる。プラスミド pAE−
III −202 −１をPstIで消化し、小断片を除去し、大Ｄ
ＮＡ断片を連結し、こうして得られたプラスミドを Eco
RIにより切断し、そしてそれを、 pAE−III −202 −２
から単離されたEcoRI cDNA断片と連結することによりプ
ラスミド pAE−III −202 −４を調製する。 pAE−III
−202 −４の挿入部のＤＮＡ配列は配列表の配列番号：
１に示されるそれと同一である。実施例3. バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)を用
いてのAE−III cDNAの発現 3.1. 発現ベクター pVL−AE−III の作製 配列表：１の配列の１位から1891位に延びるＤＮＡ配列
を含むPstI／EcoRI DNA 断片をAE−III cDNAクローン p
AE−III −202 −１から調製する。この断片を、PstI及
びEcoRI により消化されたバキュロウイルストランスフ
ァーベクター pVL1392(Invitrogen Corp.)に挿入する。
次に、生ずるプラスミドＤＮＡをSmaI及びEcoRI で消化
する。
クレオチドから始まり３′−末端で終る全領域に相当す
る。プラスミド pAE−III −202 −１の挿入部のＤＮＡ
配列は１位のヌクレオチドから1891位のヌクレオチドに
延び、そしてプラスミド pAE−III −202 −２の挿入部
のそれは1891位から3383位に延びる。プラスミド pAE−
III −202 −１をPstIで消化し、小断片を除去し、大Ｄ
ＮＡ断片を連結し、こうして得られたプラスミドを Eco
RIにより切断し、そしてそれを、 pAE−III −202 −２
から単離されたEcoRI cDNA断片と連結することによりプ
ラスミド pAE−III −202 −４を調製する。 pAE−III
−202 −４の挿入部のＤＮＡ配列は配列表の配列番号：
１に示されるそれと同一である。実施例3. バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)を用
いてのAE−III cDNAの発現 3.1. 発現ベクター pVL−AE−III の作製 配列表：１の配列の１位から1891位に延びるＤＮＡ配列
を含むPstI／EcoRI DNA 断片をAE−III cDNAクローン p
AE−III −202 −１から調製する。この断片を、PstI及
びEcoRI により消化されたバキュロウイルストランスフ
ァーベクター pVL1392(Invitrogen Corp.)に挿入する。
次に、生ずるプラスミドＤＮＡをSmaI及びEcoRI で消化
する。
【０１１７】他方、AE−III cDNAクローン pAE−III −
202 −２をAccIにより消化して短いＤＮＡ断片を除去
し、そして長い方の断片の両端をＤＮＡポリメラーゼＩ
により平滑末端化する。こうして得られた線状ＤＮＡ断
片を自己連結する。生ずるプラスミド pVL−PEは配列番
号：１の配列の1891位から2310位に延びる配列を含有す
る。これを HindIIIにより消化し、末端を平滑化し、そ
して次に EcoRIにより消化する。
202 −２をAccIにより消化して短いＤＮＡ断片を除去
し、そして長い方の断片の両端をＤＮＡポリメラーゼＩ
により平滑末端化する。こうして得られた線状ＤＮＡ断
片を自己連結する。生ずるプラスミド pVL−PEは配列番
号：１の配列の1891位から2310位に延びる配列を含有す
る。これを HindIIIにより消化し、末端を平滑化し、そ
して次に EcoRIにより消化する。
【０１１８】AE−III のcDNAクローンの EcoRI(1891)−
AccI(2310)部分を含有する EcoRI−HindIII(平滑化) Ｄ
ＮＡ断片を単離し、そして、 PstI(1)−EcoRI(1891) 断
片 (カッコ内の数字は配列番号：１における位置を示
す）を含有する前記のSmaI及びEcoRI で消化されたプラ
スミドに挿入する。こうして得られた pVL−AE−III プ
ラスミドベクターはAE−III cDNAのPstI(1) −AccI(231
0)部分を担持する。この実施例3.１、及び次の実施例3.
２において行われるすべてのクローニング段階は大腸菌
HB101 を用いて行われる。
AccI(2310)部分を含有する EcoRI−HindIII(平滑化) Ｄ
ＮＡ断片を単離し、そして、 PstI(1)−EcoRI(1891) 断
片 (カッコ内の数字は配列番号：１における位置を示
す）を含有する前記のSmaI及びEcoRI で消化されたプラ
スミドに挿入する。こうして得られた pVL−AE−III プ
ラスミドベクターはAE−III cDNAのPstI(1) −AccI(231
0)部分を担持する。この実施例3.１、及び次の実施例3.
２において行われるすべてのクローニング段階は大腸菌
HB101 を用いて行われる。
【０１１９】3.2. 発現ベクター pVL−PHL の作製 実施例3.1.に記載した pVL−PEをXbaIで消化し、そして
平滑末端化する。次に、実施例3.1.において得られた p
VL−AE−III をBstII(1117) により消化し、平滑末端化
し、そしてSphIで消化する。AE−III cDNAのBstEII(111
7)−AccI(2310)部分を含有するBstEII (平滑) −SphI断
片を、AE−III cDNAの PstI(1)−XbaI(211) を含有する
XbaI (平滑) 断片及び pVL−AE−III の pVL1392ベクタ
ー部位に連結する。こうして得られた pVL−PHL ベクタ
ーは、 212位と1117位の間のＤＮＡ配列によりコードさ
れるAE−IIIのＰＨＭドメインを含有せず、ＰＨＬドメ
インのみを含有する。3.3. 昆虫細胞の培養 スポドプテラ・フルギペルダ (Spodoptera frugiperd
a)(Sf9)細胞(ATCC CRL1711)は、10％ウシ胎児血清及び
抗生物質を補充された TNM−FH培地中で単層培養物とし
て維持される。組換ウイルスの感染の後、培地を無血清
培地EX−CELL 400(J-R. Scientific) により交換する。
野性型バキュロウイルス及びトランスファーベクターpV
L1392 はInvitrogen Corp., サンジエゴ, カリホルニ
ア, 米国から得る。3.4. 組換バキュロウイルスの作製 Sf９細胞を、野性型AcNPV のＤＮＡと、 pVL−AE−III
又は pVL−PHL のいずれかとの混合物によりトランスフ
ェクトし、それぞれ組換ウイルスAcAE−III 及びAcPHL
を導く。組換ウイルスを単離し、そしてcDNAハイブリダ
イゼーションとプラークアッセイとの組合わせにより精
製し、そしてそれを使用して次の実験のためにSf９細胞
の単層に感染させる。3.5. 細胞の抽出及び酵素の測定 野性型AcNPN 又は組換体AcAE−III もしくは AcPHLウイ
ルスにより感染された昆虫細胞 (細胞画分) 及び培地
(培地画分) を感染の４日後に集める。細胞は 50mM Tri
s−Cl, 0.５％ Lubrol PX(pH7.5) に再懸濁する。４℃
にて15分間混合した後上清を集め、そして細胞画分とし
て使用する。
平滑末端化する。次に、実施例3.1.において得られた p
VL−AE−III をBstII(1117) により消化し、平滑末端化
し、そしてSphIで消化する。AE−III cDNAのBstEII(111
7)−AccI(2310)部分を含有するBstEII (平滑) −SphI断
片を、AE−III cDNAの PstI(1)−XbaI(211) を含有する
XbaI (平滑) 断片及び pVL−AE−III の pVL1392ベクタ
ー部位に連結する。こうして得られた pVL−PHL ベクタ
ーは、 212位と1117位の間のＤＮＡ配列によりコードさ
れるAE−IIIのＰＨＭドメインを含有せず、ＰＨＬドメ
インのみを含有する。3.3. 昆虫細胞の培養 スポドプテラ・フルギペルダ (Spodoptera frugiperd
a)(Sf9)細胞(ATCC CRL1711)は、10％ウシ胎児血清及び
抗生物質を補充された TNM−FH培地中で単層培養物とし
て維持される。組換ウイルスの感染の後、培地を無血清
培地EX−CELL 400(J-R. Scientific) により交換する。
野性型バキュロウイルス及びトランスファーベクターpV
L1392 はInvitrogen Corp., サンジエゴ, カリホルニ
ア, 米国から得る。3.4. 組換バキュロウイルスの作製 Sf９細胞を、野性型AcNPV のＤＮＡと、 pVL−AE−III
又は pVL−PHL のいずれかとの混合物によりトランスフ
ェクトし、それぞれ組換ウイルスAcAE−III 及びAcPHL
を導く。組換ウイルスを単離し、そしてcDNAハイブリダ
イゼーションとプラークアッセイとの組合わせにより精
製し、そしてそれを使用して次の実験のためにSf９細胞
の単層に感染させる。3.5. 細胞の抽出及び酵素の測定 野性型AcNPN 又は組換体AcAE−III もしくは AcPHLウイ
ルスにより感染された昆虫細胞 (細胞画分) 及び培地
(培地画分) を感染の４日後に集める。細胞は 50mM Tri
s−Cl, 0.５％ Lubrol PX(pH7.5) に再懸濁する。４℃
にて15分間混合した後上清を集め、そして細胞画分とし
て使用する。
【０１２０】培地及び細胞画分中のＰＨＭ活性を実施例
１に記載した方法にわずかの変更を加えて測定する。す
なわち、使用する標準反応混合物を、 200mM TES−Na(p
H6.4), 2mM L−アスコルビン酸、10mM KI, 1μM CuSO4,
2mM N−エチルマレイミド、20μM Ｎ−dansyl−Tyr −
Phe −Gly, 100μｇ／mlカタラーゼに変える。実施例１
に前記したようにして単離されるα−ヒドロキシル化前
駆体Ｎ−dansyl−Tyr −Phe −Gly(OH) からのＮ−dans
yl−Tyr −Phe −NH2 の生産としてＰＨＬ活性を測定す
る。反応混合物は 200mM TES−Na(pH6.4) 及び20μM Ｎ
−dansyl−Tyr −Phe −Gly(OH) に調整する。30℃にて
15分間のインキュベーションの後、EDTAを50mMの最終濃
度に添加することにより反応を停止せしめる。結果
（「ユニット」は前に定義した通りである）を次の表１
に示す。
１に記載した方法にわずかの変更を加えて測定する。す
なわち、使用する標準反応混合物を、 200mM TES−Na(p
H6.4), 2mM L−アスコルビン酸、10mM KI, 1μM CuSO4,
2mM N−エチルマレイミド、20μM Ｎ−dansyl−Tyr −
Phe −Gly, 100μｇ／mlカタラーゼに変える。実施例１
に前記したようにして単離されるα−ヒドロキシル化前
駆体Ｎ−dansyl−Tyr −Phe −Gly(OH) からのＮ−dans
yl−Tyr −Phe −NH2 の生産としてＰＨＬ活性を測定す
る。反応混合物は 200mM TES−Na(pH6.4) 及び20μM Ｎ
−dansyl−Tyr −Phe −Gly(OH) に調整する。30℃にて
15分間のインキュベーションの後、EDTAを50mMの最終濃
度に添加することにより反応を停止せしめる。結果
（「ユニット」は前に定義した通りである）を次の表１
に示す。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】実施例4. 「アミド化酵素」ＰＡＭによる
Ｃ−末端ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシトニンの製
造 ２mMのＬ−アスコルビン酸、0.１mg／mlのカタラーゼ及
び10mMのヨウ化カリウムを含有する0.2M MES−Na緩衝液
(pH6.０）に26mgのＣ−末端グリシン延長ヒトカルシト
ニン (ヒトカルシトニンの32−プロリンのＣ−末端に追
加のグリシン残基を有するペプチド hCT−Gly)を加え
る。さらに、これに0.６mgの精製されたペプチジルグリ
シンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（英国特許
出願No.9006354.6に記載されているペプチジルグリシン
α−アミド化モノオキシゲナーゼＰＡＭと同一) を加え
る。
Ｃ−末端ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシトニンの製
造 ２mMのＬ−アスコルビン酸、0.１mg／mlのカタラーゼ及
び10mMのヨウ化カリウムを含有する0.2M MES−Na緩衝液
(pH6.０）に26mgのＣ−末端グリシン延長ヒトカルシト
ニン (ヒトカルシトニンの32−プロリンのＣ−末端に追
加のグリシン残基を有するペプチド hCT−Gly)を加え
る。さらに、これに0.６mgの精製されたペプチジルグリ
シンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（英国特許
出願No.9006354.6に記載されているペプチジルグリシン
α−アミド化モノオキシゲナーゼＰＡＭと同一) を加え
る。
【０１２３】この混合物を30℃にて５時間インキュベー
トした後、これをSEPPAK C−18(Waters)により処理し、
凍結乾燥し、そして次にHPLCにより精製する。すなわ
ち、20.5mgの乾燥生成物を0.６mlの90％酢酸中に溶解
し、そして Bio-Rad Hi Pore RP304 (10×250mm)カラム
により精製する。10mMの蟻酸アンモニウム（pH４）中19
％−23％アセトニトリルの直線濃度勾配により溶出を行
う。
トした後、これをSEPPAK C−18(Waters)により処理し、
凍結乾燥し、そして次にHPLCにより精製する。すなわ
ち、20.5mgの乾燥生成物を0.６mlの90％酢酸中に溶解
し、そして Bio-Rad Hi Pore RP304 (10×250mm)カラム
により精製する。10mMの蟻酸アンモニウム（pH４）中19
％−23％アセトニトリルの直線濃度勾配により溶出を行
う。
【０１２４】溶出画分を一緒にし、そして凍結乾燥して
14.6mgのＣ−末端ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシト
ニン(hCT−GlyOH)を得る。 Bio-Rad Pore RP304 (4.6×
250mm)カラムを用い10mM蟻酸アンモニウム (pH4.０）中
80％−50％アセトニトリルの直線グラジエントによりHP
LCを行い、そして 210nmにて吸光度を測定する。この結
果によれば、ここに得られた粉末は純粋である。ヒト−ヒドロキシグリシン延長カルシトニンの分析 アミノ酸配列 実施例４で得られたペプチド30μｇを用いて気相シーケ
ンサーにより Edman分解を行い、そして得られたＰＴＨ
−アミノ酸をＰＴＨアナライザーにより同定してアミノ
酸配列を決定する。この結果が示すところによれば、前
記の実施例において得られたペプチドはヒトカルシトニ
ンの１位〜32位のアミノ酸残基と完全に一致する。
14.6mgのＣ−末端ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシト
ニン(hCT−GlyOH)を得る。 Bio-Rad Pore RP304 (4.6×
250mm)カラムを用い10mM蟻酸アンモニウム (pH4.０）中
80％−50％アセトニトリルの直線グラジエントによりHP
LCを行い、そして 210nmにて吸光度を測定する。この結
果によれば、ここに得られた粉末は純粋である。ヒト−ヒドロキシグリシン延長カルシトニンの分析 アミノ酸配列 実施例４で得られたペプチド30μｇを用いて気相シーケ
ンサーにより Edman分解を行い、そして得られたＰＴＨ
−アミノ酸をＰＴＨアナライザーにより同定してアミノ
酸配列を決定する。この結果が示すところによれば、前
記の実施例において得られたペプチドはヒトカルシトニ
ンの１位〜32位のアミノ酸残基と完全に一致する。
【０１２５】 1Ｈ−NMR スペクトル 実施例３において得られたペプチド５mgを水（軽水90
％、重水10％、pH3.２）に溶解する。その 500MHz 1H−
NMR を測定し、そしてその結果を分析する。 DQF−COSY
(二重量子濾過相関分光分析法) によりプロトンシグナ
ルを帰属せしめる。
％、重水10％、pH3.２）に溶解する。その 500MHz 1H−
NMR を測定し、そしてその結果を分析する。 DQF−COSY
(二重量子濾過相関分光分析法) によりプロトンシグナ
ルを帰属せしめる。
【０１２６】α−ヒドロキシグリシンのα−陽子に帰属
されるシグナルが約5.４ppm において観察される。 DQF
−COSYスペクトル (α−陽子とNH陽子のクロスゾーン)
(ヒドロキシグリシン中のα−陽子とアミド陽子のクロ
スピークが5.４ppm 及び8.７ppm において観察される）
はまた、α−ヒドロキシグリシンがペプチド中に存在す
ることを示す。
されるシグナルが約5.４ppm において観察される。 DQF
−COSYスペクトル (α−陽子とNH陽子のクロスゾーン)
(ヒドロキシグリシン中のα−陽子とアミド陽子のクロ
スピークが5.４ppm 及び8.７ppm において観察される）
はまた、α−ヒドロキシグリシンがペプチド中に存在す
ることを示す。
【０１２７】陽イオン FAB−MS 前記実施例において得られたペプチド20μｇを用いて陽
イオン FAB−MSを測定する。その結果、対応するプロト
ン化分子がおよそｍ／ｚ＝3,490 において観察される。
これはＣ−末端ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシトニ
ンの構造を満足させる。実施例5. ヒトカルシトニン前駆体 hCT−Gly からのヒ
トカルシトニンの製造 ヒトカルシトニン(hCT) のＣ−末端に追加のグリシンユ
ニットを有するヒトカルシトニン前駆体(hCT−Gly)0.5m
M(87μg)を基質とし含有しさらに２mMのアスコルビン
酸、0.５μＭのCuSO4 , 10mMのKI, 20μｇ／mlのカタラ
ーゼ及び１％のアセトニトリルを含有する 200mM MES−
Na緩衝液 (pH5.5)50μｌに、（１）実施例１に従って得
られた精製されたペプチジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃ
リアーゼ(PHL) 又は実施例３において AcPHLの生成物と
して得られた組換PHL 800ユニット（約20ng) 、（２）
アフリカツメガエルからの精製されたペプチジルグリシ
ンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ(PHM)5,700ユ
ニット（６μg)、（３）実施例１に従って得られた精製
されたペプチジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃリアーゼ(P
HL)800ユニット（約20ng) とアフリカツメガエルからの
精製されたPHM 5,700ユニット（６μg)との組合せ、あ
るいは（４）実施例３に従って得られたAcAE−III の生
成物 800ユニット、のいずれかを加える。
イオン FAB−MSを測定する。その結果、対応するプロト
ン化分子がおよそｍ／ｚ＝3,490 において観察される。
これはＣ−末端ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシトニ
ンの構造を満足させる。実施例5. ヒトカルシトニン前駆体 hCT−Gly からのヒ
トカルシトニンの製造 ヒトカルシトニン(hCT) のＣ−末端に追加のグリシンユ
ニットを有するヒトカルシトニン前駆体(hCT−Gly)0.5m
M(87μg)を基質とし含有しさらに２mMのアスコルビン
酸、0.５μＭのCuSO4 , 10mMのKI, 20μｇ／mlのカタラ
ーゼ及び１％のアセトニトリルを含有する 200mM MES−
Na緩衝液 (pH5.5)50μｌに、（１）実施例１に従って得
られた精製されたペプチジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃ
リアーゼ(PHL) 又は実施例３において AcPHLの生成物と
して得られた組換PHL 800ユニット（約20ng) 、（２）
アフリカツメガエルからの精製されたペプチジルグリシ
ンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ(PHM)5,700ユ
ニット（６μg)、（３）実施例１に従って得られた精製
されたペプチジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃリアーゼ(P
HL)800ユニット（約20ng) とアフリカツメガエルからの
精製されたPHM 5,700ユニット（６μg)との組合せ、あ
るいは（４）実施例３に従って得られたAcAE−III の生
成物 800ユニット、のいずれかを加える。
【０１２８】得られる反応混合物を30℃にて50分間反応
させた後、反応混合物中に得られたペプチドを分離し、
そしてHPLC系を用いて検出する。検出は 210nmの波長に
おいて行う。カラムとしてHipore RP304 (4.６×250mm,
Bio-Rad Co.製) を使用する。溶離剤系として26％のア
セトニトリルを含有する10mM蟻酸アンモニウム (pH4.
０）を使用する。1.０ml／分の流速において、基質(hCT
−Gly)及びα−ヒドロキシル化中間体(hCT−GlyOH)は相
互にわずかに分離され、そして開始後それぞれ10.9分及
び10.2分に検出される。
させた後、反応混合物中に得られたペプチドを分離し、
そしてHPLC系を用いて検出する。検出は 210nmの波長に
おいて行う。カラムとしてHipore RP304 (4.６×250mm,
Bio-Rad Co.製) を使用する。溶離剤系として26％のア
セトニトリルを含有する10mM蟻酸アンモニウム (pH4.
０）を使用する。1.０ml／分の流速において、基質(hCT
−Gly)及びα−ヒドロキシル化中間体(hCT−GlyOH)は相
互にわずかに分離され、そして開始後それぞれ10.9分及
び10.2分に検出される。
【０１２９】アミド化生成物、すなわちヒトＣＴは開始
後約13.5分間で検出される。精製されたＰＨＬ酵素のみ
を使用した場合、HPLCにおいて検出されるピークはシフ
トせず、基質 hCT−Gly に変化が起っていない。他方、
アフリカツメガエルからの精製されたＰＨＭのみを使用
した場合、ピークはわずかにシフトし、基質CT−Glyが
中間体 hCT−GlyOH に転換されている。
後約13.5分間で検出される。精製されたＰＨＬ酵素のみ
を使用した場合、HPLCにおいて検出されるピークはシフ
トせず、基質 hCT−Gly に変化が起っていない。他方、
アフリカツメガエルからの精製されたＰＨＭのみを使用
した場合、ピークはわずかにシフトし、基質CT−Glyが
中間体 hCT−GlyOH に転換されている。
【０１３０】AcAE−III の生成物か、あるいはＰＨＭ酵
素とＰＨＬ酵素との組合せを使用した場合、ピークは大
幅にシフトし、基質 hCT−Gly がヒトカルシトニンｈＣ
Ｔに転換されたことが示される。実施例6. ヒトカルシトニン前駆体 hCT−GlyOH からの
ヒトカルシトニンの製造 本発明の精製された酵素（ペプチジルヒドロキシグリシ
ンＮ−Ｃリアーゼ）1000ユニット (約25ng) を、ヒトカ
ルシトニン(hCT) のＣ−末端にα−ヒドロキシグリシン
ユニットが付加されているヒトカルシトニン前駆体 hCT
−GlyOH(実施例４において調製されたペプチド0.5mM(87
μg)を基質として含有する 200mM MES−Na緩衝液 (pH6.
0)50μｌに加え、そしてこの混合物を30℃にて１時間反
応せしめる。
素とＰＨＬ酵素との組合せを使用した場合、ピークは大
幅にシフトし、基質 hCT−Gly がヒトカルシトニンｈＣ
Ｔに転換されたことが示される。実施例6. ヒトカルシトニン前駆体 hCT−GlyOH からの
ヒトカルシトニンの製造 本発明の精製された酵素（ペプチジルヒドロキシグリシ
ンＮ−Ｃリアーゼ）1000ユニット (約25ng) を、ヒトカ
ルシトニン(hCT) のＣ−末端にα−ヒドロキシグリシン
ユニットが付加されているヒトカルシトニン前駆体 hCT
−GlyOH(実施例４において調製されたペプチド0.5mM(87
μg)を基質として含有する 200mM MES−Na緩衝液 (pH6.
0)50μｌに加え、そしてこの混合物を30℃にて１時間反
応せしめる。
【０１３１】反応後、反応混合物中のペプチドを分離
し、そしてHPLC系を用いて検出する。生成物の検出を上
記のようにして分析する場合、精製されたＰＨＬ酵素は
hCT−GlyOH を基質として使用し、そしてそれをアミド
化されたｈＣＴに転換することが明らかである。寄託された微生物 プラスミド pAE−III −202 −４を含有する大腸菌 Esc
herichia coli HB101： pAE−III −202 −４は、 FER
M BP−3174として、ブタペスト条約に従って、工業技術
院微生物工業技術研寄所 (茨城県つくば市東１丁目１−
３）に、1990年11月26日に寄託された。
し、そしてHPLC系を用いて検出する。生成物の検出を上
記のようにして分析する場合、精製されたＰＨＬ酵素は
hCT−GlyOH を基質として使用し、そしてそれをアミド
化されたｈＣＴに転換することが明らかである。寄託された微生物 プラスミド pAE−III −202 −４を含有する大腸菌 Esc
herichia coli HB101： pAE−III −202 −４は、 FER
M BP−3174として、ブタペスト条約に従って、工業技術
院微生物工業技術研寄所 (茨城県つくば市東１丁目１−
３）に、1990年11月26日に寄託された。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：3383塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：recombinant 起源：アフリカツメガエル（Xenopus laevis) 直接の起源：プラスミド pAE-III-202-4（微工研条寄第
3174号） (FERM BP-3174) 配列の特徴：31位〜2835位：ＰＨＭ及びＰＨＬドメイン
を含む ＡＥ−III 蛋白質のコード領域 1177位〜2145位：天然成熟ＰＨＬのコード領域 性質：本ＤＮＡは成熟ＰＨＬ酵素の前駆体であるアフリ
カツメガエルの蛋白質ＡＥ−III をコードする。本ＤＮ
Ａは、ＰＨＬの製造のための発現ベクターの作製のため
の、ＰＨＬをコードするＤＮＡ断片の入手源として役立
つ。 配列： CTGCAGTAAG GCACAGACCA CAGGGTGGAC ATG GCC AGC CTC AGT 45 Met Ala Ser Leu Ser 5 AGC AGC TTT CTT GTG CTC TTT CTC TTA TTT CAG AAC AGC TGC TAC 90 Ser Ser Phe Leu Val Leu Phe Leu Leu Phe Gln Asn Ser Cys Tyr 10 15 20 TGT TTC AGG AGT CCC CTC TCT GTC TTT AAG AGG TAT GAG GAA TCT 135 Cys Phe Arg Ser Pro Leu Ser Val Phe Lys Arg Tyr Glu Glu Ser 25 30 35 ACC AGA TCA CTT TCC AAT GAC TGC TTG GGA ACC ACG CGG CCC GTT 180 Thr Arg Ser Leu Ser Asn Asp Cys Leu Gly Thr Thr Arg Pro Val 40 45 50 ATG TCT CCA GGC TCA TCA GAT TAT ACT CTA GAT ATC CGC ATG CCA 225 Met Ser Pro Gly Ser Ser Asp Tyr Thr Leu Asp Ile Arg Met Pro 55 60 65 GGA GTA ACT CCG ACA GAG TCG GAC ACA TAT TTG TGC AAG TCT TAC 270 Gly Val Thr Pro Thr Glu Ser Asp Thr Tyr Leu Cys Lys Ser Tyr 70 75 80 CGG CTG CCA GTG GAT GAT GAA GCC TAT GTA GTT GAC TTC AGA CCA 315 Arg Leu Pro Val Asp Asp Glu Ala Tyr Val Val Asp Phe Arg Pro 85 90 95 CAT GCC AAT ATG GAT ACT GCA CAT CAC ATG CTT CTA TTT GGA TGC 360 His Ala Asn Met Asp Thr Ala His His Met Leu Leu Phe Gly Cys 100 105 110 AAT ATA CCT TCT TCC ACT GAT GAT TAC TGG GAC TGT AGT GCG GGA 405 Asn Ile Pro Ser Ser Thr Asp Asp Tyr Trp Asp Cys Ser Ala Gly 115 120 125 ACT TGC ATG GAC AAA TCC AGT ATA ATG TAT GCC TGG GCA AAG AAT 450 Thr Cys Met Asp Lys Ser Ser Ile Met Tyr Ala Trp Ala Lys Asn 130 135 140 GCA CCA CCC ACC AAA CTT CCA GAA GGA GTT GGC TTT CGT GTT GGA 495 Ala Pro Pro Thr Lys Leu Pro Glu Gly Val Gly Phe Arg Val Gly 145 150 155 GGG AAA TCA GGC AGT AGA TAT TTT GTG CTT CAA GTT CAC TAT GGA 540 Gly Lys Ser Gly Ser Arg Tyr Phe Val Leu Gln Val His Tyr Gly 160 165 170 AAT GTG AAA GCA TTC CAG GAT AAA CAT AAA GAT TGC ACG GGG GTG 585 Asn Val Lys Ala Phe Gln Asp Lys His Lys Asp Cys Thr Gly Val 175 180 185 ACA GTA CGA GTA ACA CCT GAA AAA CAA CCG CAA ATT GCA GGC ATT 630 Thr Val Arg Val Thr Pro Glu Lys Gln Pro Gln Ile Ala Gly Ile 190 195 200 TAT CTT TCA ATG TCT GTG GAC ACT GTT ATT CCA CCT GGG GAA GAG 675 Tyr Leu Ser Met Ser Val Asp Thr Val Ile Pro Pro Gly Glu Glu 205 210 215 GCA GTT AAT TCT GAT ATC GCC TGC CTC TAC AAC AGG CCG ACA ATA 720 Ala Val Asn Ser Asp Ile Ala Cys Leu Tyr Asn Arg Pro Thr Ile 220 225 230 CAC CCA TTT GCC TAC AGA GTC CAC ACT CAT CAG TTG GGG CAG GTC 765 His Pro Phe Ala Tyr Arg Val His Thr His Gln Leu Gly Gln Val 235 240 245 GTA AGT GGA TTT AGA GTG AGA CAT GGC AAG TGG TCT TTA ATT GGT 810 Val Ser Gly Phe Arg Val Arg His Gly Lys Trp Ser Leu Ile Gly 250 255 260 AGA CAA AGC CCA CAG CTG CCA CAG GCA TTT TAC CCT GTA GAG CAT 855 Arg Gln Ser Pro Gln Leu Pro Gln Ala Phe Tyr Pro Val Glu His 265 270 275 CCA GTA GAG ATT AGC CCT GGG GAT ATT ATA GCA ACC AGG TGT CTG 900 Pro Val Glu Ile Ser Pro Gly Asp Ile Ile Ala Thr Arg Cys Leu 280 285 290 TTC ACT GGT AAA GGC AGG ACG TCA GCA ACA TAT ATT GGG GGC ACA 945 Phe Thr Gly Lys Gly Arg Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Gly Gly Thr 295 300 305 TCT AAC GAT GAA ATG TGT AAT TTA TAC ATC ATG TAT TAC ATG GAT 990 Ser Asn Asp Glu Met Cys Asn Leu Tyr Ile Met Tyr Tyr Met Asp 310 315 320 GCG GCC CAT GCT ACG TCA TAC ATG ACC TGT GTA CAG ACA GGT GAA 1035 Ala Ala His Ala Thr Ser Tyr Met Thr Cys Val Gln Thr Gly Glu 325 330 335 CCA AAG CTA TTT CAA AAC ATC CCT GAG ATT GCA AAT GTT CCC ATT 1080 Pro Lys Leu Phe Gln Asn Ile Pro Glu Ile Ala Asn Val Pro Ile 340 345 350 CCT GTA AGC CCT GAC ATG ATG ATG ATG ATG GGA CAT GGT CAC CAC 1125 Pro Val Ser Pro Asp Met Met Met Met Met Gly His Gly His His 355 360 365 CAT ACA GAA GCT GAG CCT GAG AAG AAT ACA GGA CTT CAG CAG CCT 1170 His Thr Glu Ala Glu Pro Glu Lys Asn Thr Gly Leu Gln Gln Pro 370 375 380 AAA CGA GAG GAG GAA GAA GTA TTA GAT CAG GAT GTC CAT TTA GAG 1215 Lys Arg Glu Glu Glu Glu Val Leu Asp Gln Asp Val His Leu Glu 385 390 395 GAA GAT ACA GAC TGG CCG GGG GTG AAC CTC AAA GTG GGA CAA GTG 1260 Glu Asp Thr Asp Trp Pro Gly Val Asn Leu Lys Val Gly Gln Val 400 405 410 TCA GGC TTG GCT CTG GAT CCC AAG AAT AAT CTG GCT ATT TTT CAC 1305 Ser Gly Leu Ala Leu Asp Pro Lys Asn Asn Leu Ala Ile Phe His 415 420 525 AGG GGG GAT CAT GTC TGG GAT GAA AAT TCA TTT GAC AGG AAC TTT 1350 Arg Gly Asp His Val Trp Asp Glu Asn Ser Phe Asp Arg Asn Phe 430 435 440 GTT TAT CAA CAA AGA GGA ATC GGA CCA ATC CAG GAG AGC ACC ATC 1395 Val Tyr Gln Gln Arg Gly Ile Gly Pro Ile Gln Glu Ser Thr Ile 445 450 455 CTT GTT GTT GAT CCA AGC TCC TCT AAA GTC CTC AAG TCA ACA GGG 1440 Leu Val Val Asp Pro Ser Ser Ser Lys Val Leu Lys Ser Thr Gly 460 465 470 AAA AAT TTG TTT TTT TTG CCC CAC GGC CTG ACT ATC GAC AGA GAT 1485 Lys Asn Leu Phe Phe Leu Pro His Gly Leu Thr Ile Asp Arg Asp 475 480 485 GGG AAT TAC TGG GTC ACA GAT GTA GCC CTT CAT CAG GTT TTC AAA 1530 Gly Asn Tyr Trp Val Thr Asp Val Ala Leu His Gln Val Phe Lys 490 495 500 TTG GGA GCT GGA AAA GAA ACA CCA CTC CTT GTA TTA GGG AGG GCA 1575 Leu Gly Ala Gly Lys Glu Thr Pro Leu Leu Val Leu Gly Arg Ala 505 510 515 TTT CAG CCG GGG AGT GAT CGA AAA CAT TTC TGT CAG CCT ACT GAC 1620 Phe Gln Pro Gly Ser Asp Arg Lys His Phe Cys Gln Pro Thr Asp 520 525 530 GTT GCA GTC GAC CCA ATA ACT GGC AAC TTC TTT GTG GCG GAT GGC 1665 Val Ala Val Asp Pro Ile Thr Gly Asn Phe Phe Val Ala Asp Gly 535 540 545 TAC TGT AAC AGT CGC ATC ATG CAG TTC TCA CCT AAT GGA ATG TTC 1710 Tyr Cys Asn Ser Arg Ile Met Gln Phe Ser Pro Asn Gly Met Phe 550 555 560 ATC ATG CAG TGG GGA GAA GAA ACA TCC TCA AAC GTT CCC AGA CCT 1755 Ile Met Gln Trp Gly Glu Glu Thr Ser Ser Asn Val Pro Arg Pro 565 570 575 GGT CAG TTC CGC ATC CCG CAC AGT CTG ACA ATG GTA CCT GAC CAG 1800 Gly Gln Phe Arg Ile Pro His Ser Leu Thr Met Val Pro Asp Gln 580 585 590 GGA CAA CTA TGT GTA GCC GAC AGA GAG AAT GGC CGG ATC CAG TGC 1845 Gly Gln Leu Cys Val Ala Asp Arg Glu Asn Gly Arg Ile Gln Cys 595 600 605 TTC CAT GCT GAA ACG GGC AAC TTT GTC AAG CAA ATC AAG CAT CAG 1890 Phe His Ala Glu Thr Gly Asn Phe Val Lys Gln Ile Lys His Gln 610 615 620 GAA TTC GGA AGA GAG GTG TTT GCT GTC TCG TAT GCA CCA GGT GGA 1935 Glu Phe Gly Arg Glu Val Phe Ala Val Ser Tyr Ala Pro Gly Gly 625 630 635 GTG CTG TAC GCT GTT AAT GGA AAG CCG TAC TAT GGA TAT TCC GCC 1980 Val Leu Tyr Ala Val Asn Gly Lys Pro Tyr Tyr Gly Tyr Ser Ala 640 645 650 CCT GTA CAA GGC TTT ATG CTG AAT TTC TCC AAT GGG GAT ATT CTA 2025 Pro Val Gln Gly Phe Met Leu Asn Phe Ser Asn Gly Asp Ile Leu 655 660 665 GAT ACC TTC ATT CCT GCT AGA AAG AAT TTT GAC ATG CCC CAT GAT 2070 Asp Thr Phe Ile Pro Ala Arg Lys Asn Phe Asp Met Pro His Asp 670 675 680 ATT GCT GCG GCA GAT GAT GGA ACA GTG TAT GTT GGG GAT GCA CAT 2115 Ile Ala Ala Ala Asp Asp Gly Thr Val Tyr Val Gly Asp Ala His 685 690 695 GCC AAC GCA GTG TGG AAG TTC TCC CCT TCA AAG GCC GAA CAT CGA 2160 Ala Asn Ala Val Trp Lys Phe Ser Pro Ser Lys Ala Glu His Arg 700 705 710 TCT GTG AAA AAA GCT GGA ATA GAG GTT GAA GAA ATA ACA GAA ACA 2205 Ser Val Lys Lys Ala Gly Ile Glu Val Glu Glu Ile Thr Glu Thr 715 720 725 GAG ATT TTC GAG ACC CAT ATA AGA AGC AGA CCG AAG ACA AAT GAG 2250 Glu Ile Phe Glu Thr His Ile Arg Ser Arg Pro Lys Thr Asn Glu 730 735 740 TCT GTT GAG AAA CAA ACA CAG GAG AAG CAG CAG AAG CAA AAG AAC 2295 Ser Val Glu Lys Gln Thr Gln Glu Lys Gln Gln Lys Gln Lys Asn 745 750 755 AGT GCT GGG GTG TCT ACA CAA GAG AAG CAA AAT GTT GTG CAA GAG 2340 Ser Ala Gly Val Ser Thr Gln Glu Lys Gln Asn Val Val Gln Glu 760 765 770 ATC AAT GCT GGG GTG CCT ACA CAA GAG AAG CAG AAT GTT GTG CAA 2385 Ile Asn Ala Gly Val Pro Thr Gln Glu Lys Gln Asn Val Val Gln 775 780 785 GAG AGT AGT GCT GGG GTG TCT ACA CAG GAG AAG CAG AGT GTT GTG 2430 Glu Ser Ser Ala Gly Val Ser Thr Gln Glu Lys Gln Ser Val Val 790 795 800 CAA GAG AGT AGT GCT GGG GTG TCT ACA CAG GAG AAG CAG AGT GTT 2475 Gln Glu Ser Ser Ala Gly Val Ser Thr Gln Glu Lys Gln Ser Val 805 810 815 GTA CAA GAG AGC AGC GCT GGG GTG TCC TTC GTT CTT ATC ATC ACT 2520 Val Gln Glu Ser Ser Ala Gly Val Ser Phe Val Leu Ile Ile Thr 820 825 830 CTT CTC ATC ATT CCT ATC GCA GTT CTC ATT GCC ATT GCA ATC TTC 2565 Leu Leu Ile Ile Pro Ile Ala Val Leu Ile Ala Ile Ala Ile Phe 835 840 845 ATT CGC TGG AGG AAA GTC AGA ATG TAT GGA GGT GAC ATT GAC CAC 2610 Ile Arg Trp Arg Lys Val Arg Met Tyr Gly Gly Asp Ile Asp His 850 855 860 AAA TCA GAA TCC AGT TCA GTG GGC ATT TTG GGA AAA CTT AGA GGG 2655 Lys Ser Glu Ser Ser Ser Val Gly Ile Leu Gly Lys Leu Arg Gly 865 870 875 AAG GGC AGC GGA GGC CTT AAT CTG GGA ACA TTC TTT GCA ACT CAC 2700 Lys Gly Ser Gly Gly Leu Asn Leu Gly Thr Phe Phe Ala Thr His 880 885 890 AAA GGC TAC AGT AGA AAA GGC TTC GAC AGG CTG AGT ACA GAA GGA 2745 Lys Gly Tyr Ser Arg Lys Gly Phe Asp Arg Leu Ser Thr Glu Gly 895 900 905 AGT GAC CAA GAG AAA GAC GAT GAT GAT GGC TCA GAC TCT GAA GAA 2790 Ser Asp Gln Glu Lys Asp Asp Asp Asp Gly Ser Asp Ser Glu Glu 910 915 920 GAG TAT TCT GCC CCT CCT ATT CCA CCA GCT CCT GTA TCT TCC TCC 2835 Glu Tyr Ser Ala Pro Pro Ile Pro Pro Ala Pro Val Ser Ser Ser 925 930 935 TGAAACAGTT GACTTCTTCC ATACAACCTT TTGCCCCATT AGCACGTTTA 2885 AGATTGTGTA TTTAAGTGTT ACTGTACTAG TCTGTGGACT GTACAATTGT 2935 CATAGTTTTT CCTTTTATTT TTATTTGAAG TGCTGTTGTA GTCTTTATAT 2985 GAACATTCAA AATAATTCTA TTTGGTAGAA TGACTTTGGC TTTAGAGAGC 3035 GTTTTATCCA GTGTTTGATG GCCTTCCTCT GCTTCACCAA TAGCACTTTA 3085 ACTGCCAATT ATTTTCAAGC CTTTAACTGA AAACGAATCG CATTACAAAG 3135 ATATGTGCCA CATAAATGCA AAGCTGCTAA ATCTCTTCTA TTTTTTTAAA 3185 TTAACAACAT GATATTACGT CCAAGAAAGG AAATGATAGA CAAAATATTT 3235 AATGTTTCTT ATTTCTTTCT ATTTTTTTTC TCTTCGTTTT TGGTGTTTAT 3285 TGGGATGTCT TATTTTTAGA TGGTTCCACT GTTTAGAACA CTATTTTCAG 3335 AATTTGAATG TACTTTGTGT AATAAAGTGT TCGCAGAGCA TTACTCTC 3383
3174号） (FERM BP-3174) 配列の特徴：31位〜2835位：ＰＨＭ及びＰＨＬドメイン
を含む ＡＥ−III 蛋白質のコード領域 1177位〜2145位：天然成熟ＰＨＬのコード領域 性質：本ＤＮＡは成熟ＰＨＬ酵素の前駆体であるアフリ
カツメガエルの蛋白質ＡＥ−III をコードする。本ＤＮ
Ａは、ＰＨＬの製造のための発現ベクターの作製のため
の、ＰＨＬをコードするＤＮＡ断片の入手源として役立
つ。 配列： CTGCAGTAAG GCACAGACCA CAGGGTGGAC ATG GCC AGC CTC AGT 45 Met Ala Ser Leu Ser 5 AGC AGC TTT CTT GTG CTC TTT CTC TTA TTT CAG AAC AGC TGC TAC 90 Ser Ser Phe Leu Val Leu Phe Leu Leu Phe Gln Asn Ser Cys Tyr 10 15 20 TGT TTC AGG AGT CCC CTC TCT GTC TTT AAG AGG TAT GAG GAA TCT 135 Cys Phe Arg Ser Pro Leu Ser Val Phe Lys Arg Tyr Glu Glu Ser 25 30 35 ACC AGA TCA CTT TCC AAT GAC TGC TTG GGA ACC ACG CGG CCC GTT 180 Thr Arg Ser Leu Ser Asn Asp Cys Leu Gly Thr Thr Arg Pro Val 40 45 50 ATG TCT CCA GGC TCA TCA GAT TAT ACT CTA GAT ATC CGC ATG CCA 225 Met Ser Pro Gly Ser Ser Asp Tyr Thr Leu Asp Ile Arg Met Pro 55 60 65 GGA GTA ACT CCG ACA GAG TCG GAC ACA TAT TTG TGC AAG TCT TAC 270 Gly Val Thr Pro Thr Glu Ser Asp Thr Tyr Leu Cys Lys Ser Tyr 70 75 80 CGG CTG CCA GTG GAT GAT GAA GCC TAT GTA GTT GAC TTC AGA CCA 315 Arg Leu Pro Val Asp Asp Glu Ala Tyr Val Val Asp Phe Arg Pro 85 90 95 CAT GCC AAT ATG GAT ACT GCA CAT CAC ATG CTT CTA TTT GGA TGC 360 His Ala Asn Met Asp Thr Ala His His Met Leu Leu Phe Gly Cys 100 105 110 AAT ATA CCT TCT TCC ACT GAT GAT TAC TGG GAC TGT AGT GCG GGA 405 Asn Ile Pro Ser Ser Thr Asp Asp Tyr Trp Asp Cys Ser Ala Gly 115 120 125 ACT TGC ATG GAC AAA TCC AGT ATA ATG TAT GCC TGG GCA AAG AAT 450 Thr Cys Met Asp Lys Ser Ser Ile Met Tyr Ala Trp Ala Lys Asn 130 135 140 GCA CCA CCC ACC AAA CTT CCA GAA GGA GTT GGC TTT CGT GTT GGA 495 Ala Pro Pro Thr Lys Leu Pro Glu Gly Val Gly Phe Arg Val Gly 145 150 155 GGG AAA TCA GGC AGT AGA TAT TTT GTG CTT CAA GTT CAC TAT GGA 540 Gly Lys Ser Gly Ser Arg Tyr Phe Val Leu Gln Val His Tyr Gly 160 165 170 AAT GTG AAA GCA TTC CAG GAT AAA CAT AAA GAT TGC ACG GGG GTG 585 Asn Val Lys Ala Phe Gln Asp Lys His Lys Asp Cys Thr Gly Val 175 180 185 ACA GTA CGA GTA ACA CCT GAA AAA CAA CCG CAA ATT GCA GGC ATT 630 Thr Val Arg Val Thr Pro Glu Lys Gln Pro Gln Ile Ala Gly Ile 190 195 200 TAT CTT TCA ATG TCT GTG GAC ACT GTT ATT CCA CCT GGG GAA GAG 675 Tyr Leu Ser Met Ser Val Asp Thr Val Ile Pro Pro Gly Glu Glu 205 210 215 GCA GTT AAT TCT GAT ATC GCC TGC CTC TAC AAC AGG CCG ACA ATA 720 Ala Val Asn Ser Asp Ile Ala Cys Leu Tyr Asn Arg Pro Thr Ile 220 225 230 CAC CCA TTT GCC TAC AGA GTC CAC ACT CAT CAG TTG GGG CAG GTC 765 His Pro Phe Ala Tyr Arg Val His Thr His Gln Leu Gly Gln Val 235 240 245 GTA AGT GGA TTT AGA GTG AGA CAT GGC AAG TGG TCT TTA ATT GGT 810 Val Ser Gly Phe Arg Val Arg His Gly Lys Trp Ser Leu Ile Gly 250 255 260 AGA CAA AGC CCA CAG CTG CCA CAG GCA TTT TAC CCT GTA GAG CAT 855 Arg Gln Ser Pro Gln Leu Pro Gln Ala Phe Tyr Pro Val Glu His 265 270 275 CCA GTA GAG ATT AGC CCT GGG GAT ATT ATA GCA ACC AGG TGT CTG 900 Pro Val Glu Ile Ser Pro Gly Asp Ile Ile Ala Thr Arg Cys Leu 280 285 290 TTC ACT GGT AAA GGC AGG ACG TCA GCA ACA TAT ATT GGG GGC ACA 945 Phe Thr Gly Lys Gly Arg Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Gly Gly Thr 295 300 305 TCT AAC GAT GAA ATG TGT AAT TTA TAC ATC ATG TAT TAC ATG GAT 990 Ser Asn Asp Glu Met Cys Asn Leu Tyr Ile Met Tyr Tyr Met Asp 310 315 320 GCG GCC CAT GCT ACG TCA TAC ATG ACC TGT GTA CAG ACA GGT GAA 1035 Ala Ala His Ala Thr Ser Tyr Met Thr Cys Val Gln Thr Gly Glu 325 330 335 CCA AAG CTA TTT CAA AAC ATC CCT GAG ATT GCA AAT GTT CCC ATT 1080 Pro Lys Leu Phe Gln Asn Ile Pro Glu Ile Ala Asn Val Pro Ile 340 345 350 CCT GTA AGC CCT GAC ATG ATG ATG ATG ATG GGA CAT GGT CAC CAC 1125 Pro Val Ser Pro Asp Met Met Met Met Met Gly His Gly His His 355 360 365 CAT ACA GAA GCT GAG CCT GAG AAG AAT ACA GGA CTT CAG CAG CCT 1170 His Thr Glu Ala Glu Pro Glu Lys Asn Thr Gly Leu Gln Gln Pro 370 375 380 AAA CGA GAG GAG GAA GAA GTA TTA GAT CAG GAT GTC CAT TTA GAG 1215 Lys Arg Glu Glu Glu Glu Val Leu Asp Gln Asp Val His Leu Glu 385 390 395 GAA GAT ACA GAC TGG CCG GGG GTG AAC CTC AAA GTG GGA CAA GTG 1260 Glu Asp Thr Asp Trp Pro Gly Val Asn Leu Lys Val Gly Gln Val 400 405 410 TCA GGC TTG GCT CTG GAT CCC AAG AAT AAT CTG GCT ATT TTT CAC 1305 Ser Gly Leu Ala Leu Asp Pro Lys Asn Asn Leu Ala Ile Phe His 415 420 525 AGG GGG GAT CAT GTC TGG GAT GAA AAT TCA TTT GAC AGG AAC TTT 1350 Arg Gly Asp His Val Trp Asp Glu Asn Ser Phe Asp Arg Asn Phe 430 435 440 GTT TAT CAA CAA AGA GGA ATC GGA CCA ATC CAG GAG AGC ACC ATC 1395 Val Tyr Gln Gln Arg Gly Ile Gly Pro Ile Gln Glu Ser Thr Ile 445 450 455 CTT GTT GTT GAT CCA AGC TCC TCT AAA GTC CTC AAG TCA ACA GGG 1440 Leu Val Val Asp Pro Ser Ser Ser Lys Val Leu Lys Ser Thr Gly 460 465 470 AAA AAT TTG TTT TTT TTG CCC CAC GGC CTG ACT ATC GAC AGA GAT 1485 Lys Asn Leu Phe Phe Leu Pro His Gly Leu Thr Ile Asp Arg Asp 475 480 485 GGG AAT TAC TGG GTC ACA GAT GTA GCC CTT CAT CAG GTT TTC AAA 1530 Gly Asn Tyr Trp Val Thr Asp Val Ala Leu His Gln Val Phe Lys 490 495 500 TTG GGA GCT GGA AAA GAA ACA CCA CTC CTT GTA TTA GGG AGG GCA 1575 Leu Gly Ala Gly Lys Glu Thr Pro Leu Leu Val Leu Gly Arg Ala 505 510 515 TTT CAG CCG GGG AGT GAT CGA AAA CAT TTC TGT CAG CCT ACT GAC 1620 Phe Gln Pro Gly Ser Asp Arg Lys His Phe Cys Gln Pro Thr Asp 520 525 530 GTT GCA GTC GAC CCA ATA ACT GGC AAC TTC TTT GTG GCG GAT GGC 1665 Val Ala Val Asp Pro Ile Thr Gly Asn Phe Phe Val Ala Asp Gly 535 540 545 TAC TGT AAC AGT CGC ATC ATG CAG TTC TCA CCT AAT GGA ATG TTC 1710 Tyr Cys Asn Ser Arg Ile Met Gln Phe Ser Pro Asn Gly Met Phe 550 555 560 ATC ATG CAG TGG GGA GAA GAA ACA TCC TCA AAC GTT CCC AGA CCT 1755 Ile Met Gln Trp Gly Glu Glu Thr Ser Ser Asn Val Pro Arg Pro 565 570 575 GGT CAG TTC CGC ATC CCG CAC AGT CTG ACA ATG GTA CCT GAC CAG 1800 Gly Gln Phe Arg Ile Pro His Ser Leu Thr Met Val Pro Asp Gln 580 585 590 GGA CAA CTA TGT GTA GCC GAC AGA GAG AAT GGC CGG ATC CAG TGC 1845 Gly Gln Leu Cys Val Ala Asp Arg Glu Asn Gly Arg Ile Gln Cys 595 600 605 TTC CAT GCT GAA ACG GGC AAC TTT GTC AAG CAA ATC AAG CAT CAG 1890 Phe His Ala Glu Thr Gly Asn Phe Val Lys Gln Ile Lys His Gln 610 615 620 GAA TTC GGA AGA GAG GTG TTT GCT GTC TCG TAT GCA CCA GGT GGA 1935 Glu Phe Gly Arg Glu Val Phe Ala Val Ser Tyr Ala Pro Gly Gly 625 630 635 GTG CTG TAC GCT GTT AAT GGA AAG CCG TAC TAT GGA TAT TCC GCC 1980 Val Leu Tyr Ala Val Asn Gly Lys Pro Tyr Tyr Gly Tyr Ser Ala 640 645 650 CCT GTA CAA GGC TTT ATG CTG AAT TTC TCC AAT GGG GAT ATT CTA 2025 Pro Val Gln Gly Phe Met Leu Asn Phe Ser Asn Gly Asp Ile Leu 655 660 665 GAT ACC TTC ATT CCT GCT AGA AAG AAT TTT GAC ATG CCC CAT GAT 2070 Asp Thr Phe Ile Pro Ala Arg Lys Asn Phe Asp Met Pro His Asp 670 675 680 ATT GCT GCG GCA GAT GAT GGA ACA GTG TAT GTT GGG GAT GCA CAT 2115 Ile Ala Ala Ala Asp Asp Gly Thr Val Tyr Val Gly Asp Ala His 685 690 695 GCC AAC GCA GTG TGG AAG TTC TCC CCT TCA AAG GCC GAA CAT CGA 2160 Ala Asn Ala Val Trp Lys Phe Ser Pro Ser Lys Ala Glu His Arg 700 705 710 TCT GTG AAA AAA GCT GGA ATA GAG GTT GAA GAA ATA ACA GAA ACA 2205 Ser Val Lys Lys Ala Gly Ile Glu Val Glu Glu Ile Thr Glu Thr 715 720 725 GAG ATT TTC GAG ACC CAT ATA AGA AGC AGA CCG AAG ACA AAT GAG 2250 Glu Ile Phe Glu Thr His Ile Arg Ser Arg Pro Lys Thr Asn Glu 730 735 740 TCT GTT GAG AAA CAA ACA CAG GAG AAG CAG CAG AAG CAA AAG AAC 2295 Ser Val Glu Lys Gln Thr Gln Glu Lys Gln Gln Lys Gln Lys Asn 745 750 755 AGT GCT GGG GTG TCT ACA CAA GAG AAG CAA AAT GTT GTG CAA GAG 2340 Ser Ala Gly Val Ser Thr Gln Glu Lys Gln Asn Val Val Gln Glu 760 765 770 ATC AAT GCT GGG GTG CCT ACA CAA GAG AAG CAG AAT GTT GTG CAA 2385 Ile Asn Ala Gly Val Pro Thr Gln Glu Lys Gln Asn Val Val Gln 775 780 785 GAG AGT AGT GCT GGG GTG TCT ACA CAG GAG AAG CAG AGT GTT GTG 2430 Glu Ser Ser Ala Gly Val Ser Thr Gln Glu Lys Gln Ser Val Val 790 795 800 CAA GAG AGT AGT GCT GGG GTG TCT ACA CAG GAG AAG CAG AGT GTT 2475 Gln Glu Ser Ser Ala Gly Val Ser Thr Gln Glu Lys Gln Ser Val 805 810 815 GTA CAA GAG AGC AGC GCT GGG GTG TCC TTC GTT CTT ATC ATC ACT 2520 Val Gln Glu Ser Ser Ala Gly Val Ser Phe Val Leu Ile Ile Thr 820 825 830 CTT CTC ATC ATT CCT ATC GCA GTT CTC ATT GCC ATT GCA ATC TTC 2565 Leu Leu Ile Ile Pro Ile Ala Val Leu Ile Ala Ile Ala Ile Phe 835 840 845 ATT CGC TGG AGG AAA GTC AGA ATG TAT GGA GGT GAC ATT GAC CAC 2610 Ile Arg Trp Arg Lys Val Arg Met Tyr Gly Gly Asp Ile Asp His 850 855 860 AAA TCA GAA TCC AGT TCA GTG GGC ATT TTG GGA AAA CTT AGA GGG 2655 Lys Ser Glu Ser Ser Ser Val Gly Ile Leu Gly Lys Leu Arg Gly 865 870 875 AAG GGC AGC GGA GGC CTT AAT CTG GGA ACA TTC TTT GCA ACT CAC 2700 Lys Gly Ser Gly Gly Leu Asn Leu Gly Thr Phe Phe Ala Thr His 880 885 890 AAA GGC TAC AGT AGA AAA GGC TTC GAC AGG CTG AGT ACA GAA GGA 2745 Lys Gly Tyr Ser Arg Lys Gly Phe Asp Arg Leu Ser Thr Glu Gly 895 900 905 AGT GAC CAA GAG AAA GAC GAT GAT GAT GGC TCA GAC TCT GAA GAA 2790 Ser Asp Gln Glu Lys Asp Asp Asp Asp Gly Ser Asp Ser Glu Glu 910 915 920 GAG TAT TCT GCC CCT CCT ATT CCA CCA GCT CCT GTA TCT TCC TCC 2835 Glu Tyr Ser Ala Pro Pro Ile Pro Pro Ala Pro Val Ser Ser Ser 925 930 935 TGAAACAGTT GACTTCTTCC ATACAACCTT TTGCCCCATT AGCACGTTTA 2885 AGATTGTGTA TTTAAGTGTT ACTGTACTAG TCTGTGGACT GTACAATTGT 2935 CATAGTTTTT CCTTTTATTT TTATTTGAAG TGCTGTTGTA GTCTTTATAT 2985 GAACATTCAA AATAATTCTA TTTGGTAGAA TGACTTTGGC TTTAGAGAGC 3035 GTTTTATCCA GTGTTTGATG GCCTTCCTCT GCTTCACCAA TAGCACTTTA 3085 ACTGCCAATT ATTTTCAAGC CTTTAACTGA AAACGAATCG CATTACAAAG 3135 ATATGTGCCA CATAAATGCA AAGCTGCTAA ATCTCTTCTA TTTTTTTAAA 3185 TTAACAACAT GATATTACGT CCAAGAAAGG AAATGATAGA CAAAATATTT 3235 AATGTTTCTT ATTTCTTTCT ATTTTTTTTC TCTTCGTTTT TGGTGTTTAT 3285 TGGGATGTCT TATTTTTAGA TGGTTCCACT GTTTAGAACA CTATTTTCAG 3335 AATTTGAATG TACTTTGTGT AATAAAGTGT TCGCAGAGCA TTACTCTC 3383
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寒川 賢治 宮崎県宮崎郡清武町加納甲1520−24 (72)発明者 オレステ ギザルバ スイス国，4153 ライナッハ，エッシェ ンベーク ３ (56)参考文献 特開 平１−104168（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−172899（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500560（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／2460（ＷＯ，Ａ１) 英国特許出願公開2092157（ＧＢ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】 次の性質： （１）次の反応： Ｒ−GlyOH →Ｒ−NH2 （式中、Ｒはペプチド残基を表わし、そして GlyOHは該
ペプチドＲのＣ−末端に連結されたα−ヒドロキシグリ
シン残基を表わす）を触媒する； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
測定した場合、分子量が約37KDである； （３）至適作用pHが約5.４である；並びに （４）活性に対する温度の影響について、活性を30℃,
37℃及び42℃にて測定した場合、30℃及び42℃において
も実質的な活性を示すが、37℃において最高の活性を示
す； を有する、アフリカツメガエル(Xenopus laevis) 由来
のポリペプチド。 - 【請求項２】 さらに次の性質： （５）pHに対する安定性に関し、４℃にて24時間置いた
場合約8.５のpH値において最も安定である；及び （６）グリセロール及びエチレングリコールにより安定
化される； を有する、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有
するか、あるいは配列番号：１のアミノ酸配列において
１〜複数個のアミノ酸の欠失により修飾されたアミノ酸
配列を有し、そして次の反応： Ｒ−GlyOH →Ｒ−NH2 （式中、Ｒはペプチド残基を表わし、そして GlyOHは前
記ペプチドＲのＣ−末端に連結されたα−ヒドロキシグ
リシン残基を表わす）を触媒することを特徴とするペプ
チジルヒドロキシグリシンＮ−Ｃリアーゼ(PHL) 活性を
有するポリペプチド。 - 【請求項４】 約１位〜約 383位のアミノ酸から約706
〜約935 位のアミノ酸まで延びる、請求項３に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項５】 約 383位のアミノ酸から 706位、 713位
又は 935位のいずれかまで延びる、請求項４に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項６】 アミノ酸１〜60及び 363〜760 から成り
そしてベクター pVL−PHL の挿入部によりコードされて
いる、請求項３に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポ
リペプチド又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列を含
んで成る組換ＤＮＡ分子。 - 【請求項８】 配列番号：１のＤＮＡ配列又はその断片
もしくは変異体を含んで成る、請求項７に記載のＤＮＡ
分子。 - 【請求項９】 ハイブリドベクターである、請求項７に
記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１０】 ベクター pAE−III −202 −４(FERM
BP−3174), pVL−AE−III, AcAE−III, pPV−PHL 又は
AcPLL である、請求項９に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１１】 発現ベクターである、請求項９に記載
のＤＮＡ分子。 - 【請求項１２】 請求項７〜11のいずれか１項に記載の
組換ＤＮＡ分子を含んで成る形質転換された宿主。 - 【請求項１３】 pAE−III −202 −４(FERM BP−317
4) により形質転換された大腸菌HB101 である、請求項1
2に記載の形質転換された宿主。 - 【請求項１４】 請求項12に記載の適当な形質転換され
た宿主中で請求項１に記載のＰＨＬ活性を有するポリペ
プチド又はその前駆体をコードする構造遺伝子を発現せ
しめ、そして生産された該ポリペプチドを単離すること
を含んで成る、ＰＨＬ活性を有するポリペプチドの製造
方法。 - 【請求項１５】 請求項７に記載の組換ＤＮＡ分子の製
造方法であって、 ａ）適切な細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そして例え
ばＤＮＡプローブを用いて、又は適当な発現系を用いそ
して目的とするポリペプチドの発現についてスクリーニ
ングすることにより、目的とするＤＮＡを選択し；ある
いは ｂ）適切な細胞からmRNAを単離し、例えばＤＮＡプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより又は適当な発現系
での発現と目的とするポリペプチドの発現についてのス
クリーニングにより目的とするmRNAを選択し、該mRNAに
対して相補的な単鎖cDNAを調製し、そしてそれから二本
鎖cDNAを調製し；あるいは ｃ）cDNAライブラリーからcDNAを単離し、そして例えば
ＤＮＡプローブを用いて、又は適当な発現系を用いそし
て目的とするポリペプチドの発現についてスクリーニン
グすることにより目的とするcDNAを選択し；あるいは ｄ）前記段階ａ),ｂ）又はｃ）の二本鎖ＤＮＡを適切な
ベクターに導入し、得られたハイブリドベクターにより
適切な宿主細胞を形質転換し、目的とするcDNAを含有す
る形質転換された宿主細胞を未形質転換細胞から選択し
そして該形質転換された細胞を増加せしめ、そして目的
とするＤＮＡを単離し；あるいは ｅ）本発明のハイブリドベクターから、場合によっては
該ベクターに由来するフランキング配列又はリンカー配
列と共に、ＰＨＬ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ断片を切り出し；あるいは ｆ）ＰＨＬ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを化学合成により生体外で合成する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項１６】 請求項12又は13に記載の形質転換され
た宿主の製造方法であって、場合によっては選択マーカ
ー遺伝子と共に請求項７〜11のいずれか１項に記載の組
換ＤＮＡ分子により形質転換条件下で適切な宿主細胞を
処理することを含んで成る方法。 - 【請求項１７】 そのＣ−末端にグリシンを有するペプ
チドをペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナ
ーゼ(PAM) 及び請求項１〜６のいずれか１項に記載のＰ
ＨＬ活性を有するポリペプチドの両者と反応せしめるこ
とを含んで成る、アミド化されたＣ−末端を有するペプ
チドの製造方法。 - 【請求項１８】 そのＣ−末端にヒドロキシグリシンを
有するペプチドを請求項１〜６のいずれか１項に記載の
ＰＨＬ活性を有するポリペプチドと反応せしめることを
含んで成る、アミド化されたＣ−末端を有するペプチド
の製造方法。
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