JP2003518934A

JP2003518934A - 補体活性化の阻害剤、それらの製造および使用

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Publication number: JP2003518934A
Application number: JP2001549433A
Authority: JP
Inventors: フィニー、セアラ; シール、リサ; ウォリス、ロバート、ブライアン
Original assignee: バイオ − ディスカバリイリミテッド
Priority date: 1999-12-24
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2003-06-17
Also published as: WO2001047963A3; KR20020073152A; GB9930659D0; CA2393529A1; WO2001047963A2; EP1240202A2; AU2208401A; US20040038869A1

Abstract

(57)【要約】補体活性化の第二経路を阻害するが、古典的経路による補体の活性化には実質的に影響しない外部寄生生物のヒルから単離できるポリペプチドが開示される。本発明の一実施態様においては、ポリペプチドは慣用の一文字コードで表して、以下の一般式：X1-E-F-Q-D-X2-K-K-S-S-D-X3-E-T-L-E-L-R-X4-N-K-X5［配列番号：50］（式中、X1は水素原子（H）または天然に存在するアミノ酸、好ましくはバリンまたはアミノ酸配列であり、X2は任意の単一アミノ酸、好ましくはシステインであり、X3は任意の単一アミノ酸、好ましくはシステインであり、X4は任意の単一アミノ酸、好ましくはシステインであり、X5は天然に存在するアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、その1または2以上は翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンにおけるグリコシル化および／またはチロシンにおけるサルフェートもしくはホスホ基からなる）を有するヒルから誘導されるポリペプチド中に共通して見出されるポリペプチドからなる。ポリペプチドは、綱Rhynchobdellidaのヒル種、さらに特定すれば属Placobdellaのヒル種、とくにPlacobdella papillifera種から調製できる。別法として、ポリペプチドは化学的に合成可能であり、またそれらをコードするDNAを有するトランスジェニック生物によって産生させることができる。したがって、そのポリペプチドを発現できる核酸配列、これらの配列からなる宿主およびベクター、ならびに核酸およびポリペプチドの治療における使用が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、たとえば哺乳動物寄生体組織または分泌物から誘導できるか、また
は適当な遺伝子的に修飾された生物体の培養によって産生可能な補体第二経路の
新規なクラスの阻害剤に関する。

【０００２】（発明の背景）補体系は一群の血漿タンパク質であり、その主要な生理学的機能は炎症の仲介
および異種生物体の排除である。それは複雑な酵素カスケードを形成し、活性化
された場合には、化学療法的および血管作用性のアナフィラトキシン、C3aおよ
びC5a；貪食細胞による認識を引き起こす侵入生物体を被覆するオプソニン、C3b
（いわゆる免疫接着；オプソニンは細胞を被覆するタンパク質である）；ならび
に標的細胞を直接溶解する細胞溶解性「膜攻撃複合体」の産生を導く。それは血
管透過性、血管収縮、白血球活性化および遊走に変化を生じる局所的炎症応答、
ならびに平滑筋の収縮を生じる。

【０００３】すべての生理学的機構と同様に、補体は不適切に活性化することがあり、この
ような環境では著しい炎症を引き起こす。補体は多くの炎症性および自己免疫性
疾患の病理に関与する。したがってこのような疾患の処置；移植組織の組織拒絶
の低下；および異種表面たとえば血液透析器および心腎バイパス回路における補
体活性化を阻害するための補体経路の新たな阻害剤を提供することが望ましい。

【０００４】補体の活性化は2つの経路：古典的経路と第二経路の一つまたは両者によって
起こり、C5と呼ばれるタンパク質の活性化は両者が合同して行い、以後は共通の
経路に従う。

【０００５】古典的補体経路の最初の部分は血液凝固カスケードに類似する他の複雑な酵素
カスケードであるが、これは血液の凝固、したがってうっ血を生じる。古典的経
路の活性化は、抗体被覆表面または他の陰性に荷電した表面で起こり、セリンプ
ロテアーゼ、C1エステラーゼを生じる。これは活性化補因子（C4b）の存在下に
カスケードにおける次のチモーゲン（C2）（チモーゲンはセリンプロテアーゼの
プロ酵素である）を特異的に切断する。このカスケードは最終的に、この場合は
、標的細胞を溶解する膜攻撃複合体である最終生成物を導く。古典的経路はまた
、それ自体生物活性であり、炎症応答を増強する作用を示す様々な副生物の産生
を導く。

【０００６】第二経路を活性化する刺激は、通常、細菌性リポポリサッカライド；酵母（ザ
イモサン）または植物（イヌリン）ポリサッカライド；各種ポリアニオンたとえ
ばデキストラン硫酸、または免疫グロブリンたとえばIgAおよびIgEの抗体結合タ
ンパク質によって提供される。さらに、第二経路は陰性に荷電したリン脂質によ
って活性化されるように思われる。通常、これらのリン脂質は細胞膜の細胞内表
面にのみ存在するが、外傷または血小板活性化の場合のように、それは外表面に
遊走する。これらの表面はすべて、健康な個体でも低濃度で循環するC3bに任意
に結合することが可能であり、続いて（以下のフローチャートに示すように）循
環D因子に結合し、ついで因子D、循環セリンプロテアーゼによって切断可能な形
態で提供される。生じたC3bBb複合体は強力なC3コンバターゼであり、C3を2つの
フラグメント、C3aおよびC3bに切断する。C3aは強力な前炎症作用を有する。C3b
は、活性化を加速する更なる表面と因子Bの複合体化のみでなく、C3bBb複合体の
結合によるC5コンバターゼの形成にも利用される。活性化の初期相にBbとの複合
体化に必要量に対して過剰に形成されるC3bは異種粒子を被覆し、貪食細胞によ
る認識を可能にする。これはC3b被覆粒子に対する貪食細胞の親和性を増大させ
、「免疫接着」として知られている。

【０００７】古典経路による補体の活性化は通常、抗原への抗体の結合によって開始される
高度なスループット機構である。これがたとえば感染を消失させるために十分な
活性化を提供するためには、大量の抗体-抗原複合体の形成が必要である。これ
は通常、後期段階の活性化、すなわち異物に対する特異的抗体が発生したときに
のみ関連する。これに反し、第二経路の活性化は抗体のきわめて低濃度で起こる
ことが可能で、多分、様々な阻害剤の制御下に低速で自発的に起こるものと考え
られる。したがって、古典的経路とは異なり、大量の特異的抗体の関与を必要と
しない最初の補体経路が活性化されるものと考えられる。

【０００８】正常な環境下では、補体活性化の生理学的役割は侵入した生物体の除去による
感染のクリアである。しかしながら、すべての生理学的機構のように、それは不
適切に起こることがあり、罹病率および死亡率に関連づけられる病態を導くこと
がある。病態の一部は制御タンパク質の一つの欠乏によって起こる。たとえば、
C1阻害剤の欠乏は遺伝性血管神経性浮腫として知られた炎症性疾患を生じる。他
の問題は、自己に向けられた抗体により（たとえば、慢性関節リウマチのような
自己免疫疾患）または傷害組織もしくは細胞における補体活性化（たとえば、鎌
型貧血）、または異種表面（たとえば、血液透析器）上のいずれかに生じる。こ
のような条件は通常、症状を緩和するために処置されるか、または処置されない
まま放置される。したがって補体活性化を阻害し、その結果、疾患の原因を修飾
する手段が必要である。

【０００９】異種表面との接触による血液酵素系の活性化はよく調べられている。血液凝固
の固有の経路が活性化されるのみでなく、補体の活性化も起こる。セルロース血
液透析膜は、C3およびC4両者の分解生成物の濃度を上昇させ、両経路の活性化を
指示している（Innes A, Farrel AM, Burden RP, Morgan AG, Powell RJ, J Cli
n Pathol 47: 155-158, 1994）が、第二経路が支配的であるように思われる。補
体活性化は、プロテアーゼ分泌、好中球減少症、および肺動脈高血圧症、この操
作のすべての副作用を導く好中球の活性化に関与することが推定されていた。第
二経路の活性化はまた、心肺バイパスにおいてよく知られていて、好中球刺激、
肺傷害および内皮機能不全の重要な原因と考えられている。これらのいずれも、
この経路を欠くイヌでは起こらない（Finn A, Morgan BP, Rcbuck N, Klein N,
Rogers CA, Hibbs M, Elliott M, Shore DF, Evans TW, Strobel S, Moat N, J
Thoracic Cardiovasc Surg 111: 451-459, 1996）。

【００１０】免疫系が不適切に活性化される他の例は移植組織の拒絶である。ヒトドナーに
よる臓器の不足は、他の種からの臓器の使用（いわゆる異種移植）によって、超
急性拒絶の問題が克服できれば緩和することができる。超急性拒絶の主要なメデ
ィエーターの一つは補体であり、第二経路および古典的経路の両者によるその活
性化は内皮細胞の活性化、血栓症、血管内凝血、浮腫および移植臓器の最終的な
機能喪失を導くことになる。特定の問題は多形核白血球の蓄積による微小循環の
閉塞である。補体阻害剤がこれらの問題すべてを解決するとは考え難いが、それ
らは重要な利益を提供し、多分、他の免疫抑制剤との組み合わせが特殊な治療を
提供するものと思われる。

【００１１】補体は自己免疫疾患において活性化されることが知られている。慢性関節リウ
マチでは、C1 阻害剤-C1 複合体およびC3の上昇が示されている。補体活性化生
成物の増加は、疾患の重症度評点および好中球活性化の診断マーカーたとえばラ
クトフェリンと相関し、したがって、補体の阻害剤はこの補体仲介症状および自
己免疫疾患を緩和することが期待できる。

【００１２】補体活性化はヒトにおいて敗血症でよく調べられている。活性化生成物（すな
わち、C3a, C3d, C5aおよびC4）は上昇し、疾患の重症度および致命的な結果と
相関するからである。5例の患者を用いた一つの小さな試験では、精製したC1阻
害剤が投与され、補体活性化の緩和と症状の改善を伴うことがみられた（Hack C
E, Voerman HJ, Eisele B, Keinecke H-O, Nuijens JH, Eerenberg AJM, Ogilvi
e A, van Schijndel RJMS, Delvos U, Thijs LG, Lancet 339: 378, 1992）。補
体活性化生成物の上昇は、喘息、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病お
よび鎌型細胞疾患においても報告されている。

【００１３】広範囲の衰弱状態における密接な関連にもかかわらず、ヒトに使用できる補体
を阻害する治療剤はまだない。ダニの唾液中の第二補体経路阻害剤とくに活性化
表面に対するC3bの沈着が以前に記載されている（Ribeiro JMC, Exp Parasitol
64: 347-353, 1987）。遺伝子操作されたヒト補体受容体1（sCR1）は糸球体腎炎
の動物モデルにおける腎障害を減弱させることが示されている（Couser WG, Joh
nson RJ, Young BA, Yeh G, Toth CA, Rudolph AR, J Am Soc Nephrology 5: 1
888-1894, 1995）。アジュバントにより誘発された関節炎ラットにおける動脈内
注射は関節の膨潤および滑液の低下を生じた（Goodfellow RM, Williams AS, Le
vin JL, Williams BD, Morgan BP, Clin Exp Immunol 110: 45-52, 1997）。こ
のような阻害剤があれば、補体が関与する多くの他の疾患にきわめて有用である
可能性が考えられる。

【００１４】多くの炎症性疾患および自己免疫疾患の処置および予防のために利用できる有
効な治療法がないことから、本発明の一態様における目的は、医薬的または治療
的使用に適当な補体第二経路の阻害剤を提供することにある。この目的で、本発
明者らは、補体活性化の第二経路を阻害するが古典的経路には作用しない、外部
寄生性ヒルから単離できる新しいポリペプチドを提供する。

【００１５】（発明の開示）本発明の一実施態様においては、ポリペプチド以下の一般式［配列番号：50］
： X1-E-F-Q-D-X2-K-K-S-S-D-X3-E-T-L-E-L-R-X4-N-K-X5［配列番号：50］（式中、 X1は水素原子（H）または天然に存在する任意のアミノ酸、好ましくはバリン
であるか、またはアミノ酸の配列であり、 X2は任意の単一アミノ酸、好ましくはシステインであり、 X3は任意の単一アミノ酸、好ましくはシステインであり、 X4は任意の単一アミノ酸、好ましくはシステインであり、 X5は天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その1または2以上は
翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンにおけるグリコシ
ル化；および／またはチロシンにおけるサルフェートもしくはホスホ基、を含む
ことができる）からなる、ヒルに由来するポリペプチドに共通して見出されるポ
リペプチドである。

【００１６】 X1がバリンである場合、本発明のポリペプチドは上記一般式［配列番号：50］
のポリペプチドにおいて、成熟ポリペプチドのN末端から最初の21個のアミノ酸
は［配列番号：1］： V-E-F-Q-D-X-K-K-S-S-D-X-E-T-L-E-L-R-X-N-K-［配列番号：1］のポリペプチドである。

【００１７】さらに、より好ましいポリペプチドは、上記式においてX, X2, X3およびX4は
それぞれシステインのポリペプチドである。

【００１８】特に、ポリペプチドは上記一般式［配列番号：50］（式中、X5は［配列番号：51］： -N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-X6
［配列番号：51］（式中、 X6は、天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その1または2以上
は翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンにおけるグリコ
シル化；および／またはチロシンにおけるサルフェートもしくはホスホ基を含む
ことができる）である）を有し、ヒルに由来するポリペプチドに共通して見出さ
れるポリペプチドである。

【００１９】さらに特定すれば、ポリペプチドは上述の一般式［配列番号：51］（式中、X6は以下の［配列番号：54および21〜23］： -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R［配列番号：54］； -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-D-E-D-K［配列番号：21］； -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-D-E-D-K［配列番号：22］；および -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-E-D-K［配列番号：23］の一つから選択されるアミノ酸配列である）を含むこ
とができる。

【００２０】本発明の第二の実施態様においては、ポリペプチドは以下の一般式［配列番号
：60］： X7-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-X
8-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-X9-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-X10［配列番
号：60］（式中、 X7は水素原子または天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その
1または2以上は翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンに
おけるグリコシル化を有し、 X8はDまたはEであり、 X9はTまたはIであり、 X10は-D-E-D-Kまたは-E-D-Kである）を有する。

【００２１】好ましくは、［配列番号：60］においては、X7はペプチドに対する結合であり
、 X8はD, X9はT, X10は -D-E-D-Kであり、すなわち -K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S
-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番
号：30］であるか、または X8はD, X9はI, X10は-D-E-D-Kであり、すなわち -K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S
-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番
号：31］であるか、または X8はE, X9はI, X10は-E-D-Kであり、すなわち -K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S
-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K［配列番号
：32］である。

【００２２】好ましくは、X7は［配列番号：61］： X11-C-N-E-A-Q-C-R-［配列番号：61］（式中、X11はG; Q-Gおよび［配列番号：62］： X12-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-［配列
番号：62］（式中、X12は水素原子または［配列番号：63］： X13-N-T-S-K-C-［配列番号：63］（式中、X13は［配列番号：50］の配列である）のいずれかである）から選択
される）である。

【００２３】 X12が水素原子である場合、さらに好ましくは、X7は上述のように［配列番号
：30］のペプチドに対する結合であり、X11は上に定義したように、G（すなわち
［配列番号：18］）；Q-G（すなわち［配列番号：21］）；または［配列番号：6
2］（すなわち［配列番号：24］）である場合、すなわち G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-
K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-
D-E-D-K［配列番号：18］； Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-
C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-
D-D-E-D-K［配列番号：21］；または E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-
C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-
S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列
番号：24］であり、 X7が上述のように［配列番号：31］のペプチドに対する結合であり、X11が上
に定義したように、G（すなわち、［配列番号：19］）；Q-G（すなわち、［配列
番号：22］）；または［配列番号：62］（すなわち、［配列番号：25］）である
場合、すなわち G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-
K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-
D-E-D-K［配列番号：19］； -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-D-E-D-K［配列番号：22］；または E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-
C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-
S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-D-D-E-D-K［配列番号：2
5］であり、 X7が上述のように［配列番号：32］のペプチドに対する結合であり、X11が上
に定義したように、G（すなわち、［配列番号：20］）；Q-G（すなわち、［配列
番号：23］）；または［配列番号：62］（すなわち、［配列番号：26］）である
場合、すなわち G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-
K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-
E-D-K［配列番号：20］； -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-E-D-K［配列番号：23］；または E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-
C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-
S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-D-D-D-E-D-K［配列番号
：26］である。

【００２４】本発明のポリペプチドはさらに上述のポリペプチドと実質的に類似または同じ
生物活性を有する上述のポリペプチドの誘導体を包含する。これに関連して「誘
導体」の語は生物前駆体、たとえば以下にさらに説明するようにさらにリーダー
またはシグナル配列からなる前述のような配列；それらの修飾体たとえば翻訳後
プロセッシングにより（以下にさらに説明する）修飾された（たとえばグリコシ
ル化またはサルフェート化もしくはホスフェート化）またはシステイン残基間の
ジスルフィド結合の形成；それらの相同体たとえばジスルフィド連結二重鎖相同
体、またはその1または2以上のアミノ酸が変動した多形、アイソフォーム、先端
切断型または伸長型；ならびに上述の任意のポリペプチド塩が包含される。

【００２５】本発明のポリペプチドは、質量スペクトルで測定して、7,000〜17,000 Daの範
囲、好ましくは15,000〜17,000 Daの分子量を有し、これは上述の翻訳後修飾の
存在により、本明細書にとくに記載した配列におけるアミノ酸すべての寄与より
大きい。

【００２６】とくに、［配列番号：50］および［配列番号：60］の両者からなる130-アミノ
酸のポリペプチドが好ましい。130-アミノ酸のポリペプチドが約14,500ダルトン
の計算された分子量を有し、［配列番号：15〜17］： V-E-F-Q-D-C-K-K-S-S-D-C-E-T-L-E-L-R-C-N-K-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-
A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-L-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-
T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-
N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番号：15］； V-E-F-Q-D-C-K-K-S-S-D-C-E-T-L-E-L-R-C-N-K-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-
A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-
T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-
C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番号：16］；および V-E-F-Q-D-C-K-K-S-S-D-C-E-T-L-E-L-R-C-N-K-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-
A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-
T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-
C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K［配列番号：17］から選択され
る配列を有する場合がとくに好ましい。

【００２７】質量スペクトルたとえばMALDI質量スペクトルによる分子量の測定は、前述の
ポリペプチドが翻訳後プロセッシングにより修飾されたアミノ酸残基も包含でき
るように、任意の翻訳後修飾を包含する。モチーフN-T-Sはたとえば配列番号：1
5〜17たとえば16の位置22〜24に存在し、N-連結グリコシル化の可能性がよく知
られた部位である。したがって、本発明は定義されたポリペプチドからアスパラ
ギン-22の4-アミドまたは記載の他の配列における同等な位置に連結する炭水化
物残基からなることによって「誘導可能」な上記配列のポリペプチドを包含する
。このような炭水化物残基は12個以下（すなわち≦12）の糖または糖誘導体の単
一または分岐鎖を含有する。さらに、包含されるポリペプチドは定義されたポリ
ペプチドから、チロシン残基の側鎖にサルフェートまたはホスフェート残基が付
着することによって「誘導可能」でもよい。これは、チロシンの芳香環が通常は
4-位置においてサルフェートまたはホスフェート残基の付着により修飾できるヒ
ル由来のタンパク質における共通の特徴である。本発明は、したがって、さらに
配列番号；15〜17たとえば16の位置119, 120および／または122または記載され
た他の配列の同等な位置における1, 2または3個すべてのチロシン残基がサルフ
ェートまたはホスフェート化とくにホスフェート化された配列を包含する。

【００２８】他の類似のポリペプチドたとえばアンチスタシン（Nutt E, Gasic T, Rodkey
J ら, J Biol Chem 263: 10162-10167, 1985）に対する類似性によって、本発明
のポリペプチドはたとえば配列番号：15〜17たとえば16の位置63および64の間に
「活性部位」を有するらしいことが推測できる。アンチスタシンはその標的プロ
テアーゼ、因子Xaによりこの位置で切断されるので、本発明のポリペプチドはま
たその候補とされる「活性部位」における蛋白分解の基質でもあると考えられる
（Dunwiggle C, Thomberry NA, Bullら, J Biol Chem 264: 16694-16699, 1989
）。アンチスタシンの場合、標的プロテアーゼ、因子Xaによる切断は、単一ペプ
チド結合が切断された同類のポリペプチドが生成する。この切断は存在するジス
ルフィド結合により互いに保持された2つの鎖からなるポリペプチドを生じ、標
的酵素に対する阻害作用は残留する。したがって、2つの鎖の同類体が存在する
ことが可能であり、先端が切断された配列における位置63のアルギニンおよび位
置64のリジンまたは同等なアルギニン-リジン結合からなる上記配列のすべてか
ら「誘導」されると推定するのは合理的である。2つの鎖はまたスルフィド結合
によって互いに保持され、したがってこれらの同族体は補体活性化の第二経路を
阻害するものと思われる。この場合、候補としての可能性が考えられるペプチド
結合は、以下のフラグメント中に矢印で示すように、配列番号：16の位置63およ
び64に連結する。 60 ↓ 70 ----------N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F----------

【００２９】ここで「生物前駆体」の語は、インビボまたは他の使用条件下に本発明のポリ
ペプチドに変換されるポリペプチドを意味する。とくに、本発明はいわゆるリー
ダーまたはシグナル配列が存在し、ポリペプチドがインビボとくにリーダー配列
が天然のリーダー配列［配列番号：38］ M-K-Q-V-A-L-L-F-I-I-L-G-S-V-V-L-A［配列番号：38］または蜜蜂毒メリチン： M-K-F-L-V-N-V-A-L-V-F-M-V-V-Y-I-S-Y-I-Y-A［配列番号：39］からなる場合を包含する。

【００３０】［配列番号：15〜17］に関して上述のポリペプチドはそれぞれ、［配列番号：
10〜12］にそれぞれ示す天然のリーダー配列からなる。 MKQVALLFIILGSVVLAVEFQDCKKSSDCETLELRCNKNTSKCECRNQVCPRACPDGKYKLDEYGCKRCL CQGCNEAQCRKLCWYGFTTDENGCESYCKCNTKETACKNVLCSDSYQCDPESGNCVAVTPGKEHDYYSYN DDDDEDK ［配列番号：10］； MKQVALLFIILGSVVLAVEFQDCKKSSDCETLELRCNKNTSKCECRNQVCPRACPDGKYKLDEYGCKRCL CQGCNEAQCRKLCWYGFTTDENGCESYCKCNTKETACKNVLCSDSYQCDPESGNCVAVIPGKEHDYYSYN DDDDEDK ［配列番号：11］；および MKQVALLFIILGSVVLAVEFQDCKKSSDCETLELRCNKNTSKCECRNQVCPRACPDGKYKLDEYGCKRCL CQGCNEAQCRKLCWYGFTTDENGCESYCKCNTKETACKNVLCSESYQCDPESGNCVAVIPGKEHDYYSYN DDDEDK［配列番号：12］。

【００３１】本発明に包含されるポリペプチドは、適当な非毒性の金属イオンまたは有機も
しくは無機酸または塩基との塩、好ましくは医薬的に許容される塩を形成させる
ことが有利である。このような無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン
酸、ならびに酸性金属塩たとえば一水素ナトリウムオルトリン酸塩およびカリウ
ム水素硫酸塩が包含される。有機酸の例には、モノ、ジおよびトリカルボン酸た
とえば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸およびスルホン酸等が包含される
。塩基の例には、アンモニア、一級、二級および三級アミン、および四級アンモ
ニウム塩が包含される。本発明のポリペプチドは、綱Rhynchobdellidaのヒル種
、さらに特定すれば属Placobdellaのヒル種、とくにPlacobdella papillifera種
から製造することができる。別法として、ポリペプチドは化学的に合成するか、
それらをコードするDNA配列を有するトランスジェニック生物体によって産生さ
せることができる。

【００３２】本発明のポリペプチドは、ヒルの組織または分泌物、たとえば実質的に全体の
ヒルまたは唾液腺もしくは吻部等から適当な緩衝液中で抽出することができる。
したがって本発明はさらに、ヒル組織または分泌物から誘導可能な補体第二経路
の阻害剤を提供する。この関係で用いられる「誘導可能な」の語は直接、抽出ま
たは精製によって誘導できる物質、ならびに直接化学的に修飾された誘導体に誘
導もしくは変換された物質に適用される方法の生成物を物理的に、化学的にもし
くは遺伝子操作によって間接的に誘導される物質を包含する。ポリペプチドは通
常、既知の技術、たとえばイオン交換、ゲルろ過および／または逆相クロマトグ
ラフィーの組み合わせを用いて抽出または精製される。

【００３３】同じ属のヒルまたは同じ種でも、多くの場合、同じ生物学的作用および高度に
相同性のアミノ酸配列を有する2種以上のポリペプチドがそれらの唾液腺に認め
られる。さらに同じ種のヒルでも、特定のポリペプチドに数種の異なるアイソフ
ォームが存在し、これらはわずか数個のアミノ酸で異なるのみである。したがっ
て、本発明は補体の第二経路を阻害し、ポリペプチド鎖中の20％未満のアミノ酸
が上掲の場合と異なるポリペプチド誘導体を包含する。20％の数字は、他のヒル
タンパク質、ヒルジンの多くの同族体が天然にHirudo medicianalis中に存在し
、文献に記載され、多様なこれらの大部分はポリペプチド鎖中の65アミノ酸の15
が異なるという事実に基づくものである。さらに1または2以上の付加的なアミノ
酸が、ポリペプチドの医薬的活性に干渉しないことを条件に、ポリペプチド鎖中
に挿入されてもよい（伸長型）。本発明にはまた、1または2以上のN-またはC-末
端アミノ酸が欠失したポリペプチドの先端切断型も包含される。

【００３４】本発明に包含されるポリペプチドはまたポリペプチドをコードするDNAからな
る発現ベクターでトランスフォームされた宿主を、そこにポリペプチドが発現す
る条件下に提供し、このようにして得られたポリペプチドを任意に単離すること
によって製造することもできる。このアプローチは典型的に、発現を所望のポリ
ペプチドをコードする核酸配列の取得および組換え生物体におけるそのポリペプ
チドの発現に基づくものである。遺伝子的に修飾された生物体のインキュベーシ
ョンは完全な生物学的活性を発揮する所望の生成物の産生を導く。したがって本
発明はまた、組換えDNA技術により製造され、上記に包含される一つのポリペプ
チドからなる。本発明はさらに、合成またはタンパク質操作された上記ポリペプ
チドを包含する。

【００３５】したがって本発明は、（a）本発明に包含されるポリペプチドをコードする核酸配列；（b）配列（a）に実質的に相同であるかまたは緊縮条件下にハイブリダイズす
る配列；（c）遺伝子コドンの縮重がなければ、配列（a）または（b）に実質的に相同
であるかまたはハイブリダイズする配列；および（d）配列（a）、（b）または（c）のいずれかに特異的なオリゴヌクレオチド
からなる核酸配列、とくに単離、精製または組換え核酸配列を提供する。

【００３６】本明細書において用いられる「実質的に相同」の語は核酸配列が、配列のマッ
チングする位置において6個までの塩基がそれらから削除またはそれらに付加さ
れてもよいことを条件に、配列（a）の場合とそのヌクレオチド塩基の少なくと
も80％のホモロジーを有することを意味する。好ましくは、配列（a）と少なく
とも90％のホモロジー、さらに好ましくは少なくとも95％のホモロジーを有する
。このような相同配列は、本発明のタンパク質と実質的に同一の生物学的活性を
有するタンパク質をコードする。

【００３７】上記（a）〜（c）のこれら任意の核酸配列に「特異的」なオリゴヌクレオチド
は本発明の生物学的に活性なペプチドの同定および単離に有用であり、ペプチド
のアミノ酸配列におけるユニークなフラグメントをコードするユニークな配列か
らなる。これらには、実施例4において以下に定義する［配列番号：33〜36］お
よび実施例5において以下に定義する［配列番号：37］が包含される。

【００３８】特に、本発明は配列がDNAまたはRNA, たとえばcDNAまたはmRNAである上に定義
した核酸配列を提供する。さらに特定すれば、本発明は、本明細書において［配
列番号：10］として同定され、そのシグナル配列［配列番号：38］を含む［配列
番号：15］として掲載されるポリペプチドと同一として理解されるポリペプチド
に相当する［配列番号：6］として本明細書で同定されるDNA；ポリペプチド［配
列番号：16］プラスそのシグナル配列を含み［配列番号：11］として本明細書で
同定されるポリペプチドに相当する、本明細書に［配列番号：7］として掲載さ
れるDNA配列；ポリペプチド［配列番号：17］プラスそのシグナル配列を含み、
［配列番号：12］として本明細書に同定されるポリペプチドをいずれもコードし
、互いに多形であるDNA配列［配列番号：8］および［配列番号：9］を提供する
。特に好ましいDNA配列は、蜜蜂毒メリチンのシグナル配列［配列番号：39］を
包含するポリペプチド［配列番号：16］をコードするDNA配列［配列番号：13］
である。

【００３９】したがって、本発明はさらに本発明のポリペプチドの製造方法において、（a）綱Rhynchobdellidaのヒル種、好ましくは属Placobdellaのヒル種、たと
えばPlacobdella papillifera種からの全体のヒル、または組織もしくは抽出液
からの単離および／または精製、または（b）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現、ならびに得られたポリペプ
チドの任意の単離および／またはからなる方法を提供する。

【００４０】本発明はさらに、本発明の任意の核酸配列からなる組換え構築体；このような
構築体からなるベクター；およびこのようなベクターによってトランスフォーム
またはトランスフェクトされた宿主を提供する。したがって、本発明はさらに、
本明細書に開示された配列が発現可能なように導入されている、本発明のポリペ
プチドを製造するために遺伝子またはタンパク質操作された細胞、プラスミド、
ウイルス、生存生物体または他のビヒクルを提供する。このような細胞には上述
したような状態を処置または防止するための遺伝子療法に使用される、動物たと
えば哺乳動物、たとえばヒトまたは人化細胞が包含される。

【００４１】他の態様においては、本発明は上述のような状態または障害を処置または予防
するための方法において、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現可能なよう
に導入された患者の細胞中で発現させる手段によって投与する方法を提供する。
遺伝子療法の別法として、本発明のポリペプチドを医薬製剤として投与すること
もできる。

【００４２】すなわち本発明によれば、本明細書に記載したポリペプチドまたはそのポリペ
プチドをコードする核酸配列の遺伝子療法を含む医療における使用、および医薬
の製造におけるこのようなポリペプチドの使用も提供される。

【００４３】したがって、本発明のさらに他の態様によれば、本発明のポリペプチド（上述
のような）および医薬的に許容されるそれらの担体からなる医薬製剤が提供され
る。本明細書で使用される「医薬的に許容される担体」の語は、任意の不活性、
非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤もしくは封入物質、または活性成分（
単数または複数）または患者と有害な反応を生じない他の賦形剤を意味するもの
と理解すべきである。

【００４４】このような製剤および担体は本技術分野において周知であり、たとえば患者に
全身的にたとえば非経口的または経口的もしくは局所的に投与される医薬製剤が
包含される。

【００４５】ここで使用される「非経口的」の語には皮下、静脈内、筋肉内、動脈内および
気管内注射ならびに輸液方法が包含される。非経口投与用製剤は静脈内にボーラ
ス型または連続的な輸液として、または皮下に既知の操作で投与されるのが好ま
しい。非経口的使用がよく知られている好ましい液体担体には、滅菌水、食塩水
、デキストロース水溶液、糖溶液、エタノール、グリコール等が包含される。

【００４６】経口投与用の錠剤およびカプセル剤は慣用の賦形剤たとえば結合剤、充填剤、
滑沢剤、湿潤剤等を含有する。経口液体製剤は水性または油性懸濁液、溶液、乳化
液、シロップ、エリキシール等の形態とするか、または使用前に水または他の適
当なビヒクルで再構築する乾燥製品として提供される。このような液体製剤には
慣用の添加物、たとえば懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび防腐剤が含まれ
る。

【００４７】局所的適用に適当な製剤は水性または油性の懸濁液、溶液、乳化液、ゲルまた
は好ましくはエマルジョンベースの軟膏である。

【００４８】本発明による医薬製剤の単位用量は、ポリペプチドの1日必要量または所望の
用量を作成するその約量を含有する。与えられた患者（哺乳動物たとえばヒト）
に対する治療的に許容される至適投与量および用量比は様々な因子、たとえば、
活性成分（単数または複数）の効力；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別
および食餌；投与期間および投与経路；クリアランス速度；処置の目的（たとえ
ば、処置または予防）；および処置される疾患の性質に依存する。

【００４９】全身投与の用量は、0.005〜50 mg/kg体重の範囲、好ましくは0.005〜10 mg/kg
, さらに好ましくは0.01〜1 mg/kgが有効であることが期待される。処置される
疾患の性質により単回用量は全身投与かまたは局所投与によって0.005〜10 mg/k
g体重の範囲の活性成分からなる。

【００５０】本発明のポリペプチドは、非−抗体−コーティング赤血球の第二補体仲介溶血
を阻害する能力を有し、コブラ毒ファクターによって誘導された場合モルモット
赤血球の補体仲介溶血を阻害することができる。ポリペプチドは、第二経路を50
％阻害する濃度の100倍以上の濃度でも古典的経路による抗体仲介補体の活性化
に有意な影響を示さないことから、第二経路に高度に選択的である。しかもそれ
らは第二経路を50％阻害する濃度の100倍以上の濃度においてもプロトロンビン
時間または活性化部分トロンボプラスチン時間のいずれで測定したヒト血漿凝血
時間にも、またもヒト血漿の凝血を溶解するのに必要なストレプトキナーゼ時間
にも有意な影響を示さない。これらの実験のさらに詳細は以下の実施例に示す。

【００５１】すなわちこれから、本発明のポリペプチドは補体活性化の第二経路における1
または2以上の工程を選択的に阻害することがわかる。それらはまた、ヒト血清
がコブラ毒ファクターで活性化された場合にはC3aの産生も阻害することから、
作用の最も可能性のある部位は、第二経路の主要なメディエーターであるプロテ
アーゼ、因子DまたはC3bBb複合体のいずれかまたは両者の阻害によるものと考え
られる。したがって、本発明の更なる態様として、補体因子Dおよび／またはC3b
Bb複合体と相互作用（たとえば、阻害または結合）するポリペプチドが提供され
る。

【００５２】本発明のポリペプチドは、血液透析または心肺バイパス；留置カテーテルまた
は動脈内ステントが存在する場合；移植臓器または組織の拒絶；様々な自己免疫
疾患たとえばループス関節炎（関節炎狼瘡）、慢性関節リウマチ；または糸球体
腎炎；腎炎；ネフロパシー；敗血症；または虚血期間後の再潅流により組織に生
じる傷害、たとえば突然の心臓発作および卒中における患者の補体第二経路の有
害な活性化を阻害するために使用できる可能性がある。生物学的液体中における
活性化成分またはそれらの複合体の出現および／または疾患組織におけるそれら
の沈着から判断して、補体の活性化を伴うアナフィラキシー、喘息、皮膚反応、
感染、鎌型細胞貧血および溶血製貧血のような他の状態も、本発明のポリペプチ
ドによって処置できる可能性がある。

【００５３】したがって本発明の更なる態様は、補体活性化の開始を防止するために、血液
に暴露される人工器官または体外循環の表面に対する本発明に包含されるポリペ
プチドの共有結合複合体を提供する。

【００５４】さらに、上記ポリペプチドは相乗作用的様式で移植の拒絶を有利に低下させる
免疫抑制剤およびステロイドの組み合わせで、または非ステロイド性抗炎症剤と
の組み合わせでそれらの効力を増大させるために使用することができる。「組み
合わせて」の語は、本発明のポリペプチドを1または2以上の免疫抑制剤および／
または抗炎症剤（単数または複数）とともに同時または順次投与することを意味
するものと解釈すべきである。

【００５５】したがって、本発明はさらに（a）本発明のポリペプチドの治療における使用；（b）本発明のポリペプチドの、医薬の製造における使用；（c）患者における第二経路の活性化が関与する状態の処置または予防方法に
おいて、上記患者に、本発明のポリペプチドの非毒性および阻害量を投与するこ
とからなる方法；および（d）古典的および／または凝固（血液クロッティング）経路の阻害に比較し
て補体活性化の第二経路の選択的阻害における本発明のポリペプチドの使用を提
供する。

【００５６】（実施例）次に本発明を以下の実施例を参照しながら、さらに詳細に説明する。実施例1−Placobdella papillifera抽出液の補体第二経路の阻害活性補体阻害因子を同定するために、ヒルの抽出液を調製し、補体第二経路の溶血
アッセイ（AP₅₀）でアッセイした。抽出液の調製には、Placobdella papillifer
aの1検体の唾液腺をリン酸緩衝食塩溶液（PBS）（pH 7.4, 0.5 mL）（Sigma- Al
drich Company Ltd, Fancy Road, Poole, Dorset, UK）中でホモジナイズし、13
,000 rpmにおいて3分間遠心分離して組織屑を除去した。酸性クエン酸デキスト
ロース（ACD）（20％v/v）（Harlan Sera-Lab Ltd, Dodgeford Lane, Belton, L
oughborough, Leicestershire, UK）中ウサギ赤血球を氷冷したACD（Sigma- Ald
rich）で2回、7 mM MgCl₂, 10 mM EGTAを補充したゼラチンベロナール緩衝液（G
VB）（Sigma-Aldrich, 登録商標）pH 7.2（以下、VCM-MEGと呼ぶ）中で3回、懸
濁および2,000 rpm, 10分間の遠心分離により洗浄した。赤血球は、使用までVCM
-MEG中に再懸濁した（1％v/v）。凍結乾燥したヒト血漿（5 mL）（Sigma- Aldri
ch, UK）はアッセイのために、氷冷VCM-MEG 5 mLで再構築し、希釈した（4中1）
。

【００５７】溶血アッセイはPBSまたは抽出液上清（0.03 mL）、希釈血漿（0.075 mL）、ウ
サギ赤血球（0.075 mL）およびVCM-MEG（0.045 mL）を含有するマイクロタイタ
ープレート上で実施した。プレートを37℃で45分間インキュベートし、ついで、
EDTA（0.2 M, 0.0225 mL）を溶血ウエルに加えて反応を停止させた。サンプルを
遠心分離し、上清の吸収をマイクロタイタープレート中405 nmで読み取った。試
験ウエル中の溶血の程度は、水中で調製した完全に溶解した細胞および溶解しな
かった細胞と比較して、血漿をVCM-MGEで置換して評価した。使用した血漿（補
体）の濃度は通常、緩衝液対照に比較して赤血球の70％の溶解を生じた。ヒルの
抽出液はこの百分率を低下させ、それが補体第二経路阻害活性を有することを指
示した（表1）。表1 抽出液 405 nmにおける吸収溶解％完全に溶解した細胞 1.053 100.0 ％ PBS（対照） 0.739 70.2 ％ Placobdella papillifera 0.021 2.0 ％

【００５８】実施例2−Placobdella papilliferaからの活性ポリペプチドの抽出／精製活性なポリペプチドの一例を精製するために、イオン交換クロマトグラフィー
およびゲルろ過の組み合わせを使用した。Placobdella papilliferaの50検体か
らの唾液腺を20 mMのトリス塩酸塩緩衝液（pH 8.0, 6 mL）中でホモジナイズし
た。遠心分離後、上清を20 mMトリス塩酸塩（pH 8.0）で平衡化したHiPrep（登
録商標）16/10 Q XLカラム（Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd, Amersham Pl
ace, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK）に適用した。結合したタンパク
質を、開始緩衝液から1 M NaClを含む20 mMトリス緩衝液（pH 8.0）までの直線
勾配10カラム容量によって溶出し、280 nmにおける吸収を検出した。分画を実施
例1に記載のAP₅₀法でアッセイした。阻害活性を表す分画は約0.56〜0.83 M NaCl
によって溶出した。

【００５９】これらの分画を20 mMギ酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）に対し透析し、Hitrap
（登録商標）SP Sepharose Fast Flowの1 mLカラム（Amersham Pharmacia Biote
ch, UK）に適用し、20 mMギ酸ナトリウム（pH 4.0）から1 M NaClを含む同じ緩
衝液までの直線勾配10カラム容量によって溶出し、タンパク質を280 nmにおける
吸収で検出した。阻害活性はAP₅₀法で測定して0.1〜0.63 M NaClに溶出した。

【００６０】活性ピークを含む分画を凍結乾燥し、水（2 mL）中に再構築し、PBS（pH 7.4）
で平衡化したSephadex（登録商標）75製造用XK 16/30カラム（Amersham Pharmac
ia Biotech, UK）に適用した。阻害活性はAP₅₀法で測定して約0.49カラム容量で
溶出した。

【００６１】阻害活性を含む分画を20 mMギ酸ナトリウム（pH 4.0）に対し透析し、Mini S
（登録商標）PE 4.6/5カラム（Amersham Pharmacia Biotech, UK）に適用した。
20 mMギ酸ナトリウム（pH 4.0）から1 M NaClを含む同じ緩衝液までの直線勾配2
5カラム容量によって主要ピークが溶出し、これは約0.22 M NaClに阻害活性を含
有した。

【００６２】主要ピークを含む分画をSephadex（登録商標）75製造用XK 16/30カラムに適用
し、PBS（pH 7.4）で溶出すると、カラム容量約0.49に分離したピークを生じ、
これは阻害活性を含有した。このピークは1 mLのRESOURCE（登録商標）RPCカラ
ム（Amersham Pharmacia Biotech, UK）上、逆相HPLCで単一の成分を含有した。

【００６３】実施例3−活性ポリペプチドのアミノ酸配列および分子量実施例2によって精製した活性分画をアミノ酸の配列決定に付した。N-末端か
らの、きれいな明瞭なアミノ酸配列が決定された。最初の21個のアミノ酸配列［
配列番号：1］は、 V-E-F-Q-D-X-K-K-S-S-D-X-E-T-L-E-L-R-X-N-K-［配列番号：1］（式中、Xはそれぞれ、同定できなかった単一のアミノ酸であり、したがって、X
はそれぞれ同種または異種である）であることが分かった。

【００６４】さらにアミノ酸配列を同定するため、実施例2からの活性分画の凍結乾燥サンプ
ルをプロテアーゼで消化した。すなわち、凍結乾燥分画約0.01 mgを8 Mの尿素に
溶解し、0.4 M重炭酸アンモニウム（25μL）、0.045 Mジチオスレイトール（5μ
L）を加え、サンプルを50℃で15分間インキュベートした。システイン残基は0.1
Mのヨードアセトアミド（5μL）を加えてカルボキシルメチル化した。サンプル
を水（60μL）で希釈し、0.1μg/mLのLys-CまたはAsp-Nエンドプロテアーゼ（4
μL）（Sigma-Aldrich, UK）を加え、37℃で24時間インキュベートした。−20℃
に凍結して反応を停止させた。切断されたペプチドを1 mLのRESOURCE（登録商標
）RPCカラム（Amersham Pharmacia Biotech, UK）上逆相HPLCで分離し、アミノ
酸配列を決定した。以下のペプチドが同定された。 Lys-Cエンドプロテアーゼ消化から［配列番号：2］： L-X-W-Y-G-F-T-T- Asp-Nエンドプロテアーゼ消化から［配列番号：3］ X-E-Y-G-X-K-R-X-L-X-Q-G-X-N-E-A-Q-X-R-K- （式中、それぞれのX配列番号同定できなかった単一アミノ酸を示し、したがっ
て、それぞれのXは同種または異種である）。

【００６５】活性分画の分子量はMALDI質量スペクトルで約16,180ダルトンと評価された。

【００６６】実施例4−活性ポリペプチドをコードするcDNAのクローニングと配列決定実施例3において同定された利用できるアミノ酸配列（すなわち、［配列番号
：3］）は、これらのポリペプチドが凍結唾液腺からクローン化され、配列決定さ
れるようにオリゴプライマーの設計を可能にした。Placobdella papilliferaか
らの凍結唾液腺（約150 mg）を、Micro（A）Pureキット（Ambion Inc, 2130 Woo
dward Street, Austin, Texas, USA）に記載したグアニジウムチオシアネート溶
解溶液（0.5 mL）中で解凍した。ホモジナイズしたのち、希釈緩衝液（1 mL）（
Ambion, USA）を加え、混合し、12,000 g, 4℃で15分間遠心分離したのち上清を
集めた。ポリA＋RNAをAmbion Micro（A）Pureキットに記載の方法によりオリゴd
T樹脂上に抽出し、それから溶出させた。相補性のDNA鎖をcDNA増幅キット（Clon
tech Laboratory UK Ltd, Unit 2, Intec 2, Wade Road, Basingstoke, Hampshi
re, UK）を用いる逆相転写によって構築し、第二のcDNA鎖はT4 DNAポリメラーゼ
（同じくClontech, UK）により合成した。得られた二重鎖DNAはフェノール／ク
ロロフォルムで抽出し、エタノール中で沈殿させ、滅菌水中に再溶解させた。

【００６７】 5' および3' cDNA末端の単離はMarathon Adaptor配列（Clontech）のライゲー
ションによって容易にした。5' 末端はTaqポリメラーゼ（Life Technologies Lt
d, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley, UK）, APIプライマ
ー（Clontech）および実施例3に記載したAsp-Nエンドペプチダーゼから設計され
た分解プライマー： GC(CT) TC(AG) TT(AG) CA(AGCT) CC(CT) TG(AG) CA［配列番号：33］によるポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて同定された。約300塩基対のDNAフラグメン
トを単離し、Qiagen QIAquick PCR精製キットを用いて精製し、配列決定に使用
できる量を増加させるため、それをプラスミドベクターpCR（登録商標）2.1-TOP
O（登録商標）（TOPO（登録商標）TA Cloning（登録商標）キット）（Invitroge
n BV, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands）にライゲートした
。得られた組換えプラスミドをコンピーテントな大腸菌（TOP10）に導入し、組
換えクローンの株およびプラスミドDNAをQIAprep Spin Miniprepキットを用いて
発生させた。プラスミドを配列決定し、ペプチド［配列番号：1および3］からと
推定される配列を含有する配列を［配列番号：4］と同定した。

【００６８】これは遺伝子特異的なプライマーの設計を可能にし、ペプチドの3' 末端を得
るために使用された。不斉PCRアプローチは、上述のcDNA（5μL）、10×PCR反応
緩衝液（Life Technologies, UK）（5μL）、10 mM dNTPミックス（1μL）、1.5
mM MgCl₂（1.5μL）、0.01 mM遺伝子特異的プライマー（1μL）： GGG GTC GGT AGT TTT GGC GGT AGA G［配列番号：34］， Taqポリメラーゼ（0.5μL）および水（36μL）をインキュベートすることにより
ただ1種のプライマーを用いて特異的な生成物を濃縮するために使用された。反
応混合物を94℃で2分間変性させ、Techne Genius DNA 熱サイクラーにより以下
のようなサイクルに付した：94℃ 30秒, 65℃ 30秒および72℃ 1分間, 15サイク
ル, 最後に72℃ 10分。ついで反応混合物をアダプタープライマー1（Clontech,
USA）および遺伝子特異的プライマーの両者を同じ条件下に用いるPCR反応の鋳型
として使用した。約600塩基対のDNAフラグメントを単離し、精製し、プラスミド
ベクター pCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標）（TOPO（登録商標）TA Cloning
（登録商標）キット）（Invitrogen, The Netherlands）にライゲートし、組換
えクローンの株を上述のように発生させた。プラスミドを配列決定し、アミノ酸
配列［配列番号：1および3］からと推定される配列を含有する配列を［配列番号
：5］と同定した。同定された上述の［配列番号：4］および［配列番号：5］の2
つのcDNA配列から、本発明の一実施態様に相当するポリペプチドのアミノ酸配列
と推定することができた（すなわち、［配列番号：10］）。

【００６９】同定されたDNA配列を用いて、さらに2つの遺伝子特異的プライマーを合成し、
アダプターライゲートcDNAからのペプチドの全コード領域を増幅した。これらは
、以下のPCR反応：上述のcDNA（5μL）、10×PCR反応緩衝液（Life Technologie
sから, 5μL）、10 mM dNTPミックス（1μL）、1.5 mM MgSO₄（1μL）、0.01 mM
遺伝子特異的プライマー（1μL）： CGG GCA GGT ATC ATA ATG［配列番号：35］， 0.01 M遺伝子特異的プライマー（1μL）： AGT CGT TCG TTC GTT TTC ［配列番号：36］，白金Pfx DNAポリメラーゼ（0.5μL）（Life Technologies）および水（35.5μL
）に使用した。反応混合物を94℃で2分間変性させ、Techne Genius DNA熱サイク
ラーにより以下のようなサイクルに付した：94℃ 30秒, 45℃ 30秒および68℃ 1
分間, 30サイクル, 最後に68℃ 10分。3つの独立したPCR反応を実施し、特異的
なDNAフラグメント約500塩基対を単離し、上述のように精製した。3つのフラグ
メントそれぞれをプラスミドベクターpCR（登録商標）Blunt（Zero Blunt（登録
商標）PCRクローニングキット, Invitrogen, NLを使用）にライゲートし、得ら
れた組換えプラスミドをコンピーテントな大腸菌（TOP10）に導入した。組換え
クローンの株およびプラスミドDNAを、OIAprep Spin Miniprepキットを用いて前
述のように発生させた。3つの独立したPCR反応から得られた3つのプラスミドを
配列決定して、それぞれ［配列番号：10］に類似のアミノ酸配列をコードする配
列（すなわち、［配列番号：7］）が同定された。それらはポリペプチド［配列
番号：11］および、いずれもポリペプチド［配列番号：12］をコードするポリペ
プチド［配列番号：8および9］をコードする。

【００７０】推定アミノ酸配列（［配列番号：10〜12］）を実施例3において単離された天
然のポリペプチドから得られた配列と比較することによって、 M-K-Q-V-A-L-L-F-I-I-L-G-S-V-V-L-A［配列番号：38］が同定され、これはタンパク質がタンパク質を発現する細胞から分泌される前に
除去されたものと推定される。

【００７１】実施例5−組換え活性ポリペプチドの調製バキュロウイルス感染昆虫細胞中にポリペプチドの一つを発現させるために、
シグナル配列を蜜蜂のメリチンのそれで置換した。オリゴヌクレオチドを、天然
のリーダーまたはシグナル配列を［配列番号：7］におけるメリチンシグナル配
列で置換した。これらのオリゴヌクレオチドは（メリチン特異的）AGA ATT CAT AAA ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCC CTT
GTT TTT ATG GTC GTA TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG GTA GAG TTT CAA GAT TGC
AAG［配列番号：40］（Tessier DC, Thomas DY, Khouri HE, Laliberte F, Vemi
t T, Gene 98: 177-83, 1991に開示されているが、それに付随する（ボールド体
で指示）ポリペプチド遺伝子特異的配列）；および（ポリペプチド遺伝子特異的）ACT GCA GAG TCG TTC GTT CGT TTT CAT TTA TC
［配列番号：37］であった。

【００７２】 BAC-TO-BACバキュロウイルス発現システム説明マニュアル、Gibco BRL（Life
Science Technologies）を用いて、この構築体をpFastBacI中にクローン化し、
その配列を確認した（［配列番号：13］）。大腸菌DH10細胞を組換えpFast Bac1
でトランスフェクトした。転位を青色／白色選択によって確認した。単一コロニ
ーを選択し、Bacmid DNAを単離した。5％熱不活性化ウシ胎児血清（Life Techno
logies）を含有する47.5％Ex-細胞401（AMS Biotechno logy UK Ltd, 185 A & B
Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, UKから入手）および47.5％ TC100（Lif
e Technologies）をシェーカーフラスコ中Sf21細胞（the Nerc, Oxford UKから
入手可能）を、リポフェクチン（Life Technologies）の存在下に、標準方法（
たとえば、King LA & Possee RD, 1992, The Baculovirus Expression System,
Chapman & Hall刊に記載されている）を用いて、精製組換えBacmid DNAでトラン
スフェクトし、トランスフェクション7日後に組換えウイルスを集めた。

【００７３】トランスフェクション混合物を、血清を含まないメジウム（Ex-cell 401）中S
f21細胞の感染に使用して感染96時間後に収穫し、培養メジウムを実施例1に記載
のようにAP₅₀アッセイでアッセイした。最大の阻害作用を示したウイルス株を選
択し、高力価株を感染多重度0.5において、Ex-cell 401, TC 100, 5％ウシ胎児
血清中1.92細胞/mLで培養したSf21（100 mL）中に発生させた。抗生物質は50 IU
/mLのペニシリン, 5μg/mLのストレプトマイシンを加えた。ウイルスを7日後に
収穫し、プラークアッセイ（King LA & Possee RD, 1992, 前出）によって滴定
した。ウイルス株は2×10⁸ pfu/mLであることが見出された。Ex-cell 401中、感
染多重度10におけるウイルス株でのSf21の感染は感染96時間後に、既知濃度の天
然ポリペプチドのプレパレーションと比較して、AP₅₀アッセイの阻害で測定して
6.8 mg/Lの発現を生じた。Ex-cell 405中同じ方法によるHi5細胞（Invitrogen,
NLから入手可能）の感染は阻害性ポリペプチド41.8 mg/Lの発現を生じた。DNA配
列［配列番号：13］は成熟（すなわち、メリチンシグナル配列の切断後）ポリペ
プチド［配列番号：16］をコードする。

【００７４】実施例6−組換え活性ポリペプチドの精製実施例5からの組換えポリペプチドを精製するために、イオン交換およびゲル
ろ過クロマトグラフィーの組み合わせを実施した。Sf21細胞およびHi5細胞の両
者からの培養メジウム（容量計410 mL）をプールし、NaOHでpH 8.0に調整した50
mMトリス塩酸塩, 0.3 M NaCl（pH 8.0）に対して透析し、2,500 rpmで3分間遠
心分離し不溶性の物質を除去した。これを20 mMトリス塩酸塩（pH 8.0）に平衡
化したHiPrep（登録商標）16/10 Ｑ XLカラム（Amersham Pharmacia Biotech, U
K）に適用した。結合したタンパク質を20 mMトリス塩酸塩（pH 8.0）から0.3 M
NaCl含有の同一緩衝液までの段階勾配によって溶出した。タンパク質溶出液を28
0 nmの吸収によって検出した。吸収がベースラインに戻ったとき、50 mMトリス
塩酸塩, 0.3 M NaCl（pH 8.0）から1 M NaCl含有20 mMトリス塩酸塩（pH 8.0）
の10カラム容量にわたる直線勾配をスタートさせた。分画を実施例1記載のAP₅₀
法でアッセイした。活性は0.46〜0.72 M NaClに溶出した。

【００７５】阻害活性を含有する分画を20 mMギ酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）に対して透
析し、HiTrap（登録商標）SP Sepharose Fast Flow（Amersham Pharmacia Biote
ch, UK）の1 mLカラムに適用し、20 mMギ酸ナトリウム（pH 4.0）から1 M NaCl
を含有する同じ緩衝液までの直線勾配により15カラム容量で溶出し、タンパク質
を280 nmの吸収により検出した。AP₅₀アッセイで測定した阻害活性は0.43〜0.50
M NaClに溶出した。

【００７６】活性分画はPBS（pH 7.4）に平衡化したSephadex（登録商標）75製造用のXK 16
/30カラム（Amersham Pharmacia Biotech, UK）に適用した。AP₅₀アッセイで測
定した阻害活性は約0.45カラム容量に溶出した。純粋な組換えポリペプチドのN-アミノ酸配列が期待された［配列番号：16］か
らなるV-E-F-Q-D-であることを確認した。

【００７７】実施例7−活性ポリペプチドの第二経路阻害効力記載したポリペプチドの、補体活性化の第二経路の阻害剤としての効力は実施
例1記載のAP₅₀アッセイで測定した。阻害分画は赤血球の溶解を阻害し、補体活
性化の第二経路に対する阻害作用が指示された。ポリペプチドの濃度を変動させ
ることにより、IC₅₀を測定した（表2）。表2 試験サンプル IC₅₀（ng/mL）実施例2からの天然ポリペプチド 39.6 実施例6からの組換えポリペプチド 35.9

【００７８】実施例8−第二補体経路に対する活性ポリペプチドの選択性本発明のポリペプチドは、溶血（CH₅₀）アッセイにおいて、AP₅₀アッセイでの
IC₅₀の500倍までの濃度で作用を欠くことから判断して古典的経路には作用を示
さないので、補体活性化の第二経路に特異的である。

【００７９】 CH₅₀アッセイのための赤血球の調製は以下のように実施した。ヒツジ赤血球（
Oxford Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, UK）を、0.1％（v/v）ゼラ
チン（CFT-G）を補充したバルビトン補体固定試験希釈液（Oxford, UK）中2,000
rpmで10分間遠心分離し、再懸濁して3回洗浄した。赤血球を以下の操作により
抗体でコーティングした。すなわち、CFT-G（4 mL）中に1：200に希釈したヒツ
ジヘモリシン（Harlan Sera-Lab）をCFT-G（4 mL）に1:4に希釈した赤血球に加
え、37℃で30分間、ついで0℃でさらに30分間ときどき混合しながらインキュベ
ートした。コーティングした赤血球をCFT-G中で2回洗浄し、2.5％（v/v）グルコ
ースおよび0.1％（v/v）ナトリウムアジドを補充したCFT-G中に再懸濁し、CFT-G
中に希釈すると、完全に溶解した場合405 nmにおける0.7の吸収を与えた。

【００８０】アッセイのためには、ブランクマイクロタイタープレートウエル（0％溶血）
はCFT-G（0.2 mL）＋コーティングされた赤血球（0.05 mL）を含有した。水（0.
2 mL）およびコーティングされた赤血球（0.05 mL）を含有するウエルは100％溶
血の吸収を与えた。試験ウエルはCFT-G（0.1 mL）；実施例2からの活性分画の希
釈液またはPBS（0.05 mL）；CFT-G中に希釈し、約75％の溶血を与えるヒト血清
（補体）（0.05 mL）およびコーティングされた赤血球（0.05 mL）を含有した。
プレートを覆い、37℃で1時間インキュベートし、1,000 rpmで3分間遠心分離し
た。上清（0.2 mL）をマイクロタイタープレートに移し、405 nmで吸収を読んだ
。

【００８１】実施例2からの活性分画を0.04 pg/mL〜340 ng/mLの範囲の濃度で含有するウエ
ルの吸収は、PBSを含有する場合の吸収と有意な差を示さなかった（それぞれ、0
.227±0.012対試験サンプル：0.233±0.014, P>0.05, T検定, 有意差なし）。し
かも、活性分画の吸収と濃度とに相関はなく、これらの条件下にはCH₅₀アッセイ
に対しては影響がないことを示した。同様に、実施例6からの組換えポリペプチ
ドは36.9 pg/mL〜19.6μg/mLの範囲で作用を示さなかった（PBS： 1.088±0.044
対試験サンプル：1.065±0.009, P>0.05, T検定, 有意差なし）。

【００８２】実施例9−CVF誘導補体仲介赤血球溶血の阻害古典的経路および第二経路に加え、コブラ毒因子（CVF）により補体カスケー
ドは活性化できる。CVFは因子Bと複合体を形成し、古典的経路および第二経路活
性化工程の両者のバイパスである活性C3およびC5コンバターゼを生じる（Vogel
C-W, Muller-Eberhard HJ, J Immunol Methods 73: 203-220, 1984）。本発明の
ポリペプチドの顕著な特徴はそれらがCVFによって引き起こされる補体仲介赤血
球の溶血を強力に阻害することである。

【００８３】モルモット赤血球（Harlan Sera-Lab）を使用前にGVB（Sigma-Aldrich）中で3
回洗浄し、希釈した（1：5）。アッセイサンプルはモルモット血清（Harlan Ser
a-Lab）（0.02 mL）；洗浄したモルモット赤血球（Harlan Sera-Lab）（0.02 mL
）；およびPBSに溶解した試験サンプルの系列希釈液（0.02 mL）を含有した。溶
血はCVF（Quidel, Appligene-Oncor-Lifescreen, 15単位, The Metro Centre, D
wight Road, Watford, Hertfordshire, UK）（130°g/mLの0.02 mL）の添加によ
り刺激した。37℃で30分間インキュベートしたのち、氷冷GVB（0.5 mL）を加え
て反応を停止させた。遠心分離後、上清（0.1 mL）をマイクロタイタープレート
に移し、405 nmで吸収を読んだ。ポリペプチドは同様のIC₅₀でCVFにより誘導される補体介在溶血を阻害した（
表3）。表3 試験サンプル IC₅₀（ng/ml）実施例2からの天然ポリペプチド 970 実施例6からの組換えポリペプチド 1217 実施例10−活性なポリペプチドによるCVF誘導因子Dの阻害溶血を刺激するその脳直に加えて、コブラ毒因子は第二経路の活性化を招き、
これが、C3から切断されるペプチドフラグメント、C3aの発生を招来する。C3の
産生は酵素イッムノアッセイ（Quidel, UK）で測定することができる。

【００８４】アッセイサンプルは、PBSに溶解した試験サンプル（0.02 mL）；GVB（Sigma-
Aldrich）（0.02 mL）およびヒト血清（0.02 mL）を含有した。補体はCVF（Quid
el）（0.02 mL）によって活性化され、サンプルは37℃で30分間インキュベート
した。PBSでCVFを置換した活性化されなかった血清対照は4℃で30分間インキュ
ベートした。すべてのサンプルをサンプル緩衝液（Quidel）で10,000倍に希釈し
たのち、ELISAキット（Quidel）によりC3aを測定した。

【００８５】天然および組換えの両ポリペプチドはCVFを介して誘導される補体発生C3aを阻
害した。表4 試験サンプル IC₅₀（ng/mL）実施例2からの天然ポリペプチド 95 実施例6からの組換えポリペプチド 138

【００８６】コブラ毒因子で刺激された血清中C3aの産生を導く生化学経路はプロテアーゼ
、因子Dによる複合体中の因子Bの切断および生じたC3bBb複合体の蛋白分解作用
によるC3の切断が関与すると考えられている。大量のモル濃度のCVFが使用され
たので、上記例における因子Bの大部分が活性な因子Bbに変換されたとするのは
合理的な推定である。血清での文献値から、アッセイにおける因子Bの濃度は約5
40 nmole/Lと推定されたのに対し、因子Dは約20 nmole/Lであった。阻害の化学
量論は酵素1モルを阻害するポリペプチド阻害剤は1モル未満ではあり得ないこと
から、50％阻害する阻害剤濃度は酵素濃度50％未満ではあり得ない。この実施例
では、アッセイを50％阻害するポリペプチドの濃度は天然のポリペプチドの場合
5.9 nmole/L, 組換えポリペプチドの場合8.6 nmole/Lであった。これらのIC₅₀は
因子Dの濃度の50％とほぼ同等であるが、因子Bまたはアッセイにおける他成分の
濃度の2％未満であり、ポリペプチドはこのアッセイでは因子Dを阻害することに
より主として作用すると考えるのが最も適当である。

【００８７】実施例11−活性ポリペプチドの因子Dとの直接相互作用記載したポリペプチドの因子Dに対する直接結合を、Biacore（登録商標）X分
析システム（Biacore AB, Uppsala, Sweden）上表面プラズモン共鳴分析により
検討した。

【００８８】ヒト因子D（Calbiochem，CN Bioscience UK, Boulevard Industrial Park, Pa
dge Road, Beeston, Nottingham, UK）をセンサーチップ（CM5）（Biacore, SE
）の表面上に5μL/分の速度でセンサーチップ表面ウイルスを絶えず試薬を流す
のとにより固定化した。デキストランチップ上のカルボキシル基は新たに混合し
たN-エチル-N'-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／N-ヒドロキ
シスクシンイミド（EDC/NHS; 1:1 v/v）（Biacore, SE）によって2分間活性化し
た。これについで、マレイン酸ナトチウム, pH 3.1（20 mM）に希釈した因子D（
100μg/mL）により2分間20μg/mLに活性化した。因子Dの注入を安定状態のRUの
読みが得られるまで反復し、ついで過剰の活性化合物カルボキシル基をエタノー
ルアミン塩酸塩pH 8.5（EA-HCl）（1 M）でキャップした。固定化されたタンパ
ク質を再生緩衝液（1 M塩化ナトリウムPBS）で処理して非共有的に結合したリガ
ンドを除去した。

【００８９】実施例6のように精製した組換えポリペプチドをPBS（pH 7.4）中様々な濃度（
25, 50, 75, 100および250 nM）に希釈した。固定化因子Dに対するポリペプチド
の濃度依存性結合を、ポリペプチドをセンサーチップ上に通過させて得られた共
鳴センソグラムから同時に流した因子Dを欠くチップから得られたバックグラン
ド共鳴単位を差し引いて測定した。25℃における因子Dに対するポリペプチドの
濃度依存性結合は、注入の前後での共鳴の差によって確認された。配列番号1 一本鎖アミノ酸配列配列番号2 一本鎖アミノ酸配列配列番号3 一本鎖アミノ酸配列 Xはカルボキシメチルシステインの期待される位置に溶出するアミノ酸を表す配列番号4 二重鎖DNA配列ボールド体＝AP1プライマー配列イタリック体＝非翻訳領域ボールド体下線＝分解プライマーに由来するプライマー配列配列番号5 二重鎖DNA配列ボールド体AP1プライマー配列イタリック体＝非翻訳領域ボールド体下線＝分解プライマーに由来するプライマー配列配列番号6 二重鎖DNA配列配列番号7 二重鎖DNA配列ボールド体下線＝プライマー配列配列番号8 二重鎖DNA配列ボールド体下線＝プライマー配列配列番号9 二重鎖DNA配列ボールド体下線＝プライマー配列配列番号10 一本鎖アミノ酸配列配列番号11 一本鎖アミノ酸配列配列番号12 一本鎖アミノ酸配列配列番号13 二重鎖DNA配列正常体＝pFastBaclの多重クローニング部位イタリック体＝メリチンシグナル配列ボールド体＝配列番号16のポリペプチドをコードする成熟配列配列番号14 一本鎖アミノ酸配列配列番号15 一本鎖アミノ酸配列配列番号16 一本鎖アミノ酸配列配列番号17 一本鎖アミノ酸配列配列番号18 一本鎖アミノ酸配列配列番号19 配列番号20 一本鎖アミノ酸配列配列番号21 一本鎖アミノ酸配列配列番号22 一本鎖アミノ酸配列配列番号23 一本鎖アミノ酸配列配列番号24 一本鎖アミノ酸配列配列番号25 一本鎖アミノ酸配列配列番号26 一本鎖アミノ酸配列配列番号30 一本鎖アミノ酸配列配列番号31 一本鎖アミノ酸配列配列番号32 一本鎖アミノ酸配列配列番号33 一本鎖DNA配列配列番号34 一本鎖DNA配列配列番号35 一本鎖DNA配列配列番号36 一本鎖DNA配列配列番号37 一本鎖DNA配列配列番号38 一本鎖アミノ酸配列配列番号39 一本鎖アミノ酸配列配列番号40 一本鎖DNA酸配列配列番号50 一本鎖アミノ酸配列配列番号51 一本鎖アミノ酸配列配列番号54 一本鎖アミノ酸配列配列番号60 一本鎖アミノ酸配列配列番号61 一本鎖アミノ酸配列配列番号62 一本鎖アミノ酸配列配列番号63 一本鎖アミノ酸配列

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｈ０４５Ａ６１Ｐ 7/06 11/06 9/10 13/12 11/06 17/00 13/12 19/02 17/00 29/00 １０１ 19/02 31/00 29/00 １０１ 31/04 31/00 37/02 31/04 37/06 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/435 37/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/435 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウォリス、ロバート、ブライアンイギリス国スワンシー、ポンタードレイス、タイニイボナウ、バイオ − ディスカバリィリミテッドＦターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 CA12 CA20 DA02 DA06 EA02 EA04 FA18 GA11 GA13 HA03 HA17 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC01 CC24 CD30 CE03 CE06 CE07 CE11 DA01 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 BA05 BB01 BD14 CA24 CA44 4C084 AA01 AA13 BA22 BA23 CA51 NA14 ZA36 ZA55 ZA59 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB15 ZB31 ZB35 4C087 AA01 AA02 BB12 BB63 BB64 BB65 BC83 NA14 ZA36 ZA55 ZA59 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB15 ZB31 ZB35 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 BA50 BA53 CA50 EA20 EA22 FA74 GA22 GA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】質量スペクトルにより測定して7,000〜17,000 Daの範囲の分
子量を有する単離、精製または組換えポリペプチドを包含するポリペプチドにお
いて、外部寄生生物のヒル（特にリンコブデリダ（Rhynchobdellida）綱のヒル
種、さらに特定すればプラコブデラ（Placobdella）属のヒル種、特にプラコブ
デラパピリフェラ（Placobdella papillifera）種からのヒル）に由来し、か
つ補体活性化の第二経路を阻害できるが、古典的経路による補体の活性化には実
質的に影響しないポリペプチド。
【請求項２】アミノ酸はそれらの慣用の一文字コードで表して以下の一般
式［配列番号：50］： X1-E-F-Q-D-X2-K-K-S-S-D-X3-E-T-L-E-L-R-X4-N-K-X5［配列番号：50］（式中、 X1は水素原子（H）または天然に存在するアミノ酸またはアミノ酸配列であり
、 X2は任意の単一アミノ酸であり、 X3は任意の単一アミノ酸であり、 X4は任意の単一アミノ酸であり、 X5は天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その1または2以上は
翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンにおけるグリコシ
ル化；および／またはチロシンにおけるサルフェートもしくはホスホ基、を含む
ことができる）からなる「請求項１」記載のポリペプチド。
【請求項３】［配列番号：50］のポリペプチドにおいて、X1はバリンであ
り、成熟ポリペプチドのN末端から最初の21個のアミノ酸は［配列番号：1］： V-E-F-Q-D-X-K-K-S-S-D-X-E-T-L-E-L-R-X-N-K-［配列番号：1］（式中、それぞれのXは同種または異種の単一アミノ酸を表す）からなる「請求
項２」記載のポリペプチド。
【請求項４】 X, X2, X3および／またはX4の1または2以上はシステインで
ある「請求項２または３」記載のポリペプチド。
【請求項５】［配列番号：50］においてX5はアミノ酸配列［配列番号：51
］： -N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-X6
［配列番号：51］（式中、 X6は、天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その1または2以上
は翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンにおけるグリコ
シル化；および／またはチロシンにおけるサルフェートもしくはホスホ基を含む
ことができる）である［配列番号：50］からなる「請求項１〜４」のいずれかに
記載のポリペプチド。
【請求項６】 X6は以下の［配列番号：54および21〜23］： -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R［配列番号：54］； -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-D-E-D-K［配列番号：21］； -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-D-E-D-K［配列番号：22］；および -Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A
-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D
-D-E-D-K［配列番号：23］の一つから選ばれるアミノ酸配列である「請求項５」
記載のポリペプチド。
【請求項７】以下の一般式［配列番号：60］： X7-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-X
8-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-X9-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-X10［配列番
号：60］（式中、 X7は水素原子または天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その
1または2以上は翻訳後修飾、たとえばアスパラギン、セリンまたはスレオニンに
おけるグリコシル化を有することができ、 X8はDまたはEであり、 X9はTまたはIであり、 X10は-D-E-D-Kまたは-E-D-Kである）を有する「請求項１〜６」のいずれかに
記載のポリペプチド。
【請求項８】 X7はペプチドに対して結合しており、［配列番号：30］におけるように、X8はD, X9はT, X10は-D-E-D-Kであり、すな
わち -K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S
-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番
号：30］であるか、または［配列番号：31］におけるように、X8はD,X9はI,X10は-D-E-D-Kであり、すな
わち -K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S
-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番
号：31］であるか、または［配列番号：32］におけるように、X8はE,X9はI,X10は-E-D-Kであり、すなわ
ち -K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S
-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K［配列番号
：32］である「請求項７」記載のポリペプチド。
【請求項９】 X7は［配列番号：61］： X11-C-N-E-A-Q-C-R-［配列番号：61］（式中、X11はG; Q-Gおよび［配列番号：62］： X12-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-［配列
番号：62］（式中、X12は水素原子または［配列番号：63］： X13-N-T-S-K-C-［配列番号：63］（式中、X13は［配列番号：50］の配列である）である）から選択される）であ
る「請求項７または８」記載のポリペプチド。
【請求項１０】［配列番号：15〜17］： V-E-F-Q-D-C-K-K-S-S-D-C-E-T-L-E-L-R-C-N-K-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-
A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-
T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-
C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番号：15］； V-E-F-Q-D-C-K-K-S-S-D-C-E-T-L-E-L-R-C-N-K-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-
A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-
T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-
C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K［配列番号：16］；および V-E-F-Q-D-C-K-K-S-S-D-C-E-T-L-E-L-R-C-N-K-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-
C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-
D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-
V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K［配列番号：17］のいずれかから
なる「請求項１〜９」記載のポリペプチド。
【請求項１１】類似または実質的に同じ生物活性を有する「請求項２〜１
０」のいずれかに記載のポリペプチド誘導体である「請求項１」記載のポリペプ
チド。
【請求項１２】誘導体は、さらにリーダーまたはシグナル配列を含む「請
求項１〜１０」のいずれかに記載の配列を含む生物前駆体；翻訳後プロセッシン
グによるまたはシステイン残基間のジスルフィド結合の形成によるグリコシル化
もしくはサルフェート化を含む修飾；ジスルフィド連結二重結合鎖同族体；およ
び多形を包含する、1または2以上のアミノ酸が変化した配列；アイソフォーム；
先端切断または伸長型；ならびに上述の任意の塩から選択される「請求項１１」
記載のポリペプチド。
【請求項１３】（a）「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチ
ドをコードする核酸配列；（b）配列（a）に実質的に相同であるかまたは緊縮条件下にハイブリダイズす
る配列；（c）遺伝子コドンの縮重がなければ、配列（a）または（b）に実質的に相同
であるかまたはハイブリダイズする配列；および（d）上記配列（a）、（b）または（c）のいずれかに特異的なオリゴヌクレオ
チドを含む単離、精製または組換え核酸配列を包含する核酸配列。
【請求項１４】核酸配列は、6個までの塩基がそれから削除されるかまた
はそれに付加されてもよく、また相同の配列が「請求項１〜１２」のいずれかに
記載のポリペプチドと類似または実質的に同じ生物活性を有するポリペプチドを
コードすることを条件に、「請求項１３」（a）に記載の配列のヌクレオチド塩
基と、配列中のマッチングする位置で、ヌクレオチド塩基の少なくとも90％の同
一性を有する単離、精製または組換え核酸配列を包含する核酸配列。
【請求項１５】オリゴヌクレオチドは［配列番号：33〜37］： GC(CT) TC(AG) TT(AG) CA(AGCT) CC(CT) TG(AG) CA［配列番号：33］； GGG GTC GGT AGT TTT GGC GGT AGA G［配列番号：34］； CGG GCA GGT ATC ATA ATG［配列番号：35］； AGT CGT TCG TTC GTT TTC［配列番号：36］；および ACT GCA GAG TCG TTC GTT CGT TTT CAT TTA TC［配列番号：37］から選択される配列を含む「請求項１３または１４」のいずれかに記載の核酸配
列に特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】配列はcDNAまたはmRNAを含むDNAまたはRNA配列である「請
求項１３〜１５」のいずれかに記載の核酸配列。
【請求項１７】配列は［配列番号：4または5］のいずれかを含む「請求項
１３〜１６」のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１８】配列は［配列番号：6〜9および13］のいずれかを含む「請
求項１３〜１６」のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１９】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドの製
造方法において、（a）リンコブデリダ（Rhynchobdellida）のヒル種から誘導可能な物質の単離
および／または精製；または（b）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現、および任意に、得られたポ
リペプチドを単離および／または精製することからなる方法。
【請求項２０】「請求項１３〜１８」のいずれかに記載の任意の核酸配列
を含む組換え構築体。
【請求項２１】「請求項２０」記載の構築体を含むベクター。
【請求項２２】「請求項２１」記載のベクターによって形質転換またはト
ランスフェクトされた宿主。
【請求項２３】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドを製
造するために、「請求項１３〜１８」のいずれかに記載の配列を発現可能なよう
に導入した、遺伝子操作またはタンパク質操作された細胞、細胞系、プラスミド
、ウイルス、生存生物体または他のビヒクル。
【請求項２４】治療に用いるための「請求項２３」記載の細胞または細胞
系。
【請求項２５】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドおよ
び医薬的に許容されるその担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドまた
はそのポリペプチドをコードする核酸配列の、タンパク質または遺伝子療法を含
む医療における使用。
【請求項２７】「請求項１〜１２」のいずれかに記載されたポリペプチド
の医薬の製造における使用。
【請求項２８】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドの、
補体活性化の第二経路における1または2以上の工程を阻害するための使用。
【請求項２９】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドを、
補体因子Dおよび／またはC3bBb複合体と相互作用させるための使用。
【請求項３０】「請求項１〜１２」のいずれかに記載のポリペプチドの、
古典的および／または凝固（血液クロッティング）経路の阻害に比較して補体活
性化の第二経路を選択的に阻害するための使用。
【請求項３１】補体第二経路の活性化が関与する患者の状態を処置または
防止する方法において、上記患者に非毒性、阻害有効量の「請求項１〜１２」の
いずれかに記載のポリペプチドを投与することからなる方法。
【請求項３２】血液透析および心肺バイパス；留置したカテーテルおよび
動脈内ステントの存在；移植臓器または組織の拒絶；自己免疫疾患たとえばルー
プス関節炎（関節炎狼瘡）；慢性関節リウマチ；糸球体腎炎；腎炎；ネフロパシ
ー；敗血症；虚血期間後再循環および補体活性化に伴う他の状態により組織に生
じた傷害たとえばアナフィラキシー、喘息、皮膚反応、感染、鎌型赤血球貧血お
よび溶血性貧血から選択される状態のための「請求項２６〜３１」のいずれかに
記載の使用または方法。
【請求項３３】特定の例を参照して実質的に上述したポリペプチド、核酸
配列、方法、構築ベクター、宿主、細胞系、組成物または使用。