JP2003502045A - Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ由来のヒアルロニダーゼ、その単離、精製および組換え製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、熱帯ヒル Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓに由来する、ヒアルロニダーゼの単離、精製および特定に関する。したがって、本発明により、この酵素は「マニラーゼ」と称される。本発明は、さらに、ＤＮＡおよびアミノ酸配列の解明、並びに発現ベクターおよび宿主系を含む、マニラーゼの組換え製造方法にも関する。最後に、本発明は、治療目的、例えば、心筋疾患、血栓発作ならびに腫瘍の治療のための、マニラーゼの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、熱帯のヒル、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓに
由来する、新規なヒアルロニダーゼの単離、精製、ならびに特性の特定に関する
。従って、本発明にかかる、この新規な酵素は、「マニラーゼ」と称される。本
発明は、さらに、ＤＮＡおよびアミノ酸配列、ならびに、発現ベクターと宿主系
の開示を含む、マニラーゼの組換え生産方法に関する。最後に、本発明は、例え
ば、心筋の疾病、血栓の発生や腫瘍の治療用など、治療目的でのマニラーゼの使
用に関する。

【０００２】 ヒアルロン酸あるいはヒアルロナン（ＨＡ）は、ＧｌｃNＡｃ（β１−４）Ｇ
ｌｃＵＡの二糖繰り返し構造で構成される、直鎖で、分岐していない高分子（２
〜６×１０⁶）のグルコサミノグリカンである。そのカルボキシル基は、正常か
、病に冒されているかに関わらず、細胞外液における普通に見られるｐＨにおい
て、完全にイオン化している。ＨＡは、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸およ
びヘパリンと共に、一群のグルコサミノグリカンに属している（Jeanloz R．.W
．，Arthr Rheum．， 1960， 3， 233〜237）。他の非修飾グルコサミノグリカ
ン（ＧＡＧ）と対比すると、硫酸置換、あるいは共有結合したペプチドを持たず
、また、通常、その鎖長および分子量は、はるかにより大きい。ＨＡは、結合組
織内に遍在的に分布しており、また、改良された固定方法（Hellstrom S. et al
.， 1990， Histochem. J. ，22， 677〜682）およびヒアルロナン結合ペプチド
（ＨＡＢＰ）を利用する特異的組織化学的方法の採用がなされて以降、実際に、
体中全ての部位で見出されている。これは、また、神経外胚葉起源の組織におい
て、発育および成熟の際にも関わっている。

【０００３】 ヒアルロニダーゼという用語は、一般にも、また本発明でも、他の基質に対す
る活性には関係なく、ヒアルロン酸に作用する酵素を指す。

【０００４】 ヒアルロニダーゼは、最初に微生物から、その後、ほ乳類の精巣から単離され
、今では、後者が主な供給源である（Meyer K． in The Enzyme， 1971， 307
）。

【０００５】 その反応機構によって、ヒアルロニダーゼは、大きく三種のグループに分類さ
れた。

【０００６】 第１のグループ中の、微生物酵素は、△−４，５−不飽和二糖を生成するβ除
去を伴って、その基質に作用している。従って、該酵素は、ヒアルロン酸リアー
ゼ、ＥＣ ４．２．９９．１と命名すべきである。

【０００７】 第２のグループの、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、または精巣型ヒアルロニ
ダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）は、ＨＡを小さな断片へと分解するエンド−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼとして作用し、まず第１に、遊離の
還元末端に、ヘキソサミン部分を有する四糖類をもたらす。精巣型ヒアルロニダ
ーゼと同様の性質を有する酵素が、オタマジャクシ、蛇毒、蜂毒、多くの動物組
織、ヒト血清ならびにその他の供給源から取得されている。精巣由来のヒアルロ
ニダーゼは、また、グリコシル基転移酵素活性をも有することがよく知られてい
る（Weissman B. et al.， J. Biol. Chem.， 1954， 208， 417〜429）。この
グループのヒアルロニダーゼに属する酵素は、ヒアルロン酸に対してのみでなく
、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチンなら
びにデルマタン硫酸に対する酵素活性をも示す。

【０００８】 第３のグループは、エンド−β−グルクロニダーゼとして作用するヒアルロノ
グルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）から成っている。この酵素は、ヒ
ル Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから単離され（Yuki H. &Fishman W
.H.； J. Biol. Chem. 1963， 238， 1877〜79）、HAに全く特異的である。コン
ドロイチン硫酸、デルマタンおよびヘパリンは、このヒアルロニダーゼに対する
基質ではない。それは、ヒアルロン酸だけを、遊離の還元末端に、グルクロン酸
を有する四糖類に分解する（Linker A.et al.， J. Biol. Chem.， 1960， 235
， 924〜27）。ほ乳類のエンド−β−グルコサミニダーゼとは逆に、ヘパリンは
、このヒルのヒアルロニダーゼの活性に影響を持っていない。従って、それは、
抗凝固剤として広く使用されているヘパリンおよびその誘導体と共に、患者へ共
投与することができる。ｂｕｆｆａｌｏヒルの亜科 Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉｉｎ
ａｅ （ Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ、Ｉｌｌｅｂｄｅｌｌａ、Ｐｏｅｃｉｌｏｄ
ｂｅｌｌａ、Ｓａｎｇｕｉｓｏｇａの各属を含んでいる）の種（Ｐｏｅｃｉｌｏ
ｂｄｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓａ）由来の、分子量約２８．５ｋＤａを有する
、ヒアルロン酸特異的エンド−ベータ−グルクロニダーゼ（「Orgelase」と称す
る）が、ＥＰ０１９３３３０に開示された。

【０００９】 ヒアルロニダーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、多く
の実用的な適用を有する。心筋梗塞の治療用として、ヒアルロニダーゼの静脈内
投与が提案されている（Kloner R. A. et al.， Circulation， 1978， 58， 22
0〜226； Wolf R. A. et al.， Am. J. Cardiol.， 1984， 53， 941〜944； Ta
ira A. et al.， Angiology， 1990， 41， 1029〜1036）。心筋梗塞は、その際
に、突発的な細胞性低酸素が要因となる、一般的な形態の非機械的な傷害、すな
わち、細胞の重篤な損傷や死の代表である。ラットにおいて実験的に心筋梗塞を
誘導した場合（Waldenstrom A. et. al.， 1991， J. Clin. Invest.， 88， 16
22〜1628）、損傷を受けた（侵された領域の）心筋のＨＡ含量は、２４時間以内
に増加し、３日後には正常値の３倍近くに達し、また、同時に間質性浮腫も伴っ
ていた。侵された領域の相対水分含量も、また徐々に増加して、３日目までに最
大値に達しており、ＨＡの蓄積と密接に相関していた。実験的な心臓ならびに腎
臓移植の拒絶（Hallgren R. et al.， J. Clin. Invest.， 1990， 85， 668〜6
73； Hallgren R. et al.， J. Exp. Med.， 1990， 171， 2063〜2076）、ヒト
腎移植の拒絶（Wells A. et al.， Transplantation， 1990， 50， 240〜243）
、肺疾患（Bjermer A. et al.， Brit. Med. J.， 1987， 295， 801〜806）お
よび肺特発性間質線維症症候群（Bjermer A. et al.， Thorax， 1989， 44， 1
26〜131）においても、増加したＨＡ含量と浮腫とに同様の関連が見出されてい
る。これらの研究全ては、急性炎症におけるＨＡの増加の証拠を提供するだけで
なく、さらに、組織の腫脹の主な要因となり、また、心臓の機械的および電気生
理学的機能の双方に影響を及ぼす、流体の局所的停留におけるその役割をも示唆
している。

【００１０】 これらの結果によって、臨床試験で使用されている、ヒアルロニダーゼの作用
機序を説明することができる。ヒアルロニダーゼ処理は、ラット、イヌおよびヒ
トにおける心筋虚血における、細胞損傷を限ったものとすることが報告された（
Maclean D. et al.， Science， 1976， 194， 199）。ＨＡの低下は、その後、
組織における水蓄積の減少、組織な圧力の減少、また、最終的に快方に向かった
灌流を伴っている。

【００１１】 ヒアルロニダーゼ、並びにヒアルロニダーゼを含むヒルの抽出物は、他の治療
目的に使用することができることが示されている。したがって、ｈｙａｓｅ治療
は、単独であるいはシクロスポリンと併用することによって、移植物の長期間の
存続をもたらす（Johnsson C. et al.， Transplant Inter. 印刷中）。最も広
義のｈｙａｓｅ（「拡散因子」）は、（たとえば、癌性腫瘍の治療における、細
胞増殖抑止剤と組み合わせて）他の薬物の拡散を促進するために、組織の浸透性
を増加させる目的に使用される。さらに、ヒアルロニダーゼは、腫瘍治療の際、
血管新生阻害剤や、腫瘍の治療における局所薬剤送達の補助剤として作用し、ま
た、緑内障ならびにその他の眼疾患の治療では、局所麻酔や抗生物質などその他
の治療薬の佐剤として、それぞれ有用である。治療的用途および適性の概観は、
Ｆａｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７、Ｗｉｅｎｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ
Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ、１５、ｐ．３４７）の総説、ならびにそこに引
用されている文献に示されている。したがって、ヒアルロニダーゼなどの活性化
合物が必要とされている。しかし、公知の、入手可能なヒアルロニダーゼは、安
定でないか（hyaluronidase from Hirudo medicinalis， Linker et al.， 1960
， J. Biol. Chem.， 235， p.924； Yuki and Fishman， 1963， J. Biol. Che
m.， 238， p.1877）、あるいは、寧ろ、特異性の低い活性を示すのみである（
ＥＰ ０１９３３３０， Budds et al.， 1987， Comp. Biochem. Physiol．，
87B， 3， p.497）。さらには、公知のヒアルロニダーゼは何れも、集約的な商
業的な使用に不可欠な前提条件である、組換え体が入手できていない。

【００１２】 本発明は、ここに、初めて、Ｈｉｒｕｄｏｎａｒｉａ ｍａｎｎｉｌｅｎｓｉ
ｓから単離・精製された新規のヒアルロニダーゼ、並びに生物工学技術によって
取得された前記酵素の組換え体を開示する。

【００１３】 すなわち、その活性はヘパリンによって影響を受けない、ヒアルロニダーゼの
生物学的活性を有し、グリコシル化に応じて、５３〜６０ｋＤａの分子量を有す
る、ヒル種Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓから単離された精
製蛋白質を提供することが、本発明の形態である。かかる「マニラーゼ」と呼ば
れる、新規蛋白質は、分子量約５８ｋＤａ（±２ｋＤａ）を有する天然型ではグ
リコシル化されており、また、４個の糖形態を有する。しかし、非グリコシル化
蛋白質もまた本発明の目的であり、標準的手法に従って、糖残基の酵素的あるい
は化学的な切断により、取得が可能である。本発明の非グリコシル化酵素は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した際、約５４（±２）ｋＤａの分子量を有してい
る。

【００１４】 直接比較することによって、ＥＰ ０１９３３３０に開示されているヒアルロ
ニダーゼ（「ｏｒｇｅｌａｓｅ」）は、同じ条件下では、約２８ｋＤａの分子量
を有し、また、ヘモグロビンなど多くの不純物を含んでいることが示される。本
発明にかかる、天然のマニラーゼは、至適ｐＨ ６．０〜７．０、等電点 ７．
２〜８．０を有し、かつ、図７に記載のアミノ酸配列を有している。

【００１５】 驚くべきことに、ｏｒｇｅｌａｓｅの比活性は、たった約１．２ｋＵ／ｍｇで
あるのに、調製用精製手順（以下参照）によって取得されたマニラーゼは、１０
０〜１５０、好ましくは１１０〜１４０（ＷＨＯ）ｋＵ／ｍｇ 蛋白質の非常に
高い比活性を有している。さらには、マニラーゼと比較すると、ｏｒｇｅｌａｓ
ｅは至適ｐＨが低い（５．２〜６．０）。マニラーゼは、ｏｒｇｅｌａｓｅのよ
うに、ヘパリンによって影響を受けない。

【００１６】 さらに、 以下の工程： （ｉ）Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ種のヒルの頭部を酸
緩衝液でホモゲナイズし、遠心する工程、 （ｉｉ）工程（ｉ）の上清を硫酸アンモニウムで沈澱する工程、 （ｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィの工程、 （ｉｖ）コンカナバリンＡアフィニティ・クロマトグラフィの工程、 （ｖ）疎水性相互作用クロマトグラフィの工程、 （ｖｉ）ヒアルロン酸フラグメントをコーティングしたマトリックスによるア
フィニティ・クロマトグラフィの工程、 （ｖｉｉ）ゲル濾過クロマトグラフィの工程、ならびに、 場合によって （ｖｉｉｉ）精製蛋白質の酵素的または化学的脱グリコシル化の工程をも含ん
でなる、マニラーゼの単離、精製する方法を提供することが、本発明の形態であ
る。

【００１７】 上に開示する製法工程は、本発明にかかる蛋白質を、このような高い生物学的
酵素活性を保持したまま取得できることを保証する。したがって、ヘパリンによ
って活性に影響を受けないヒアルロニダーゼの生物学的活性を有し、かつ、グリ
コシル化に応じて、５３〜６０ｋＤａの分子量を有し、請求の範囲ならびに、上
に記述する製法工程により取得が可能であり、また、好ましくは、＞１００ｋＵ
／ｍｇ蛋白質の高い酵素比活性を有する蛋白質を提供することが、本発明のさら
に他の形態である。「単位（U）」という用語は、上でも、以降でも、「国際単
位」（ＩＵ）を指す。

【００１８】 本発明は、それぞれ、ＤＮＡ分子、ベクターおよび形質転換された宿主細胞を
含んでいる、組換えマニラーゼの作製方法を開示する。したがって、天然のマニ
ラーゼの特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を提供することも、本発明
の形態である。

【００１９】 わずかに異なったアミノ酸配列を有する、マニラーゼ（ヒアルロニダーゼ）の
特性を具えた蛋白質をコードする、わずかに異なるＤＮＡ配列を持つ、少なくと
も三種の別のクローンを選別することが可能であることを、示すこともできた。

【００２０】 かかる特定のクローンは、図８、９ならびに１０（上側の配列）に示されるＤ
ＮＡ配列を有し、また、前記配列を含む発現ベクター、前記ベクターで形質転換
された宿主細胞とともに、それらは本発明の形態である、 加えて、ヒアルロニダーゼの生物学的活性と、グリコシル化に応じて分子量５
５〜５９ｋＤａとを持ち、図８、９ならびに１０（下側の配列）に記載されるア
ミノ酸配列のいずれか、あるいは、前記配列と少なくとも８０％の相同性を有す
る配列を有する組換え蛋白質を提供することも、本発明の形態である。「マニラ
ーゼ」という用語は、上述の特異的な性質を有するこれらの蛋白質の全てを含ん
でいる。

【００２１】 天然、ならびに組換え蛋白質は、患者に直接に、あるいは、医薬組成物内に含
有させて、適用できる薬物として使用することが可能である。したがって、本発
明の他の態様は、薬物として適用することが可能な、上ならびに以後に定義され
る組換えまたは天然の蛋白質、また、前記蛋白質とその製薬的に許容される希釈
剤、担体または医薬添加物を含んでなる、それぞれの医薬組成物を提供すること
である。

【００２２】 本発明の医薬組成物は、付加的に、非常に多様な、さらなる医薬活性化合物を
含むことも可能である。好ましい薬剤は、本発明にかかる蛋白質の生物学的およ
び薬理学的活性を阻害せず、また影響を及ぼさない、抗凝固剤である。このよう
な抗凝固剤は、たとえば、ヘパリン、ヒルジンあるいはジクマリン、好ましくは
ヘパリンとすることができる。したがって、付加的に薬理活性化合物、好ましく
は、ヘパリンを含む医薬組成物を提供することが、本発明の形態である。

【００２３】 ヒトまたは家畜の治療における用途に関連して、本発明による蛋白質は、分散
剤（「拡散因子」）として作用するか、あるいは、組織や皮膚を通した浸透を助
けることが好ましい。すなわち、マニラーゼは、例えば、腫瘍の化学療法分野に
おいて、急性心筋虚血または梗塞に関する傷害および疾患の治療に対して、たと
えば、眼における生理学的液体の循環を改善する目的で、緑内障およびその他の
眼の傷害の治療に対して、鬱血の除去や循環の改善を目的として、皮膚および組
織移植の治療に対して、皮膚、膜、その他の組織を介した薬剤の送達系として、
ある種の病原微生物またはある種の腫瘍および癌性組織を取り囲むヒアルロン酸
被膜を除去する薬剤として、ならびに、抗血栓薬および抗腫瘍薬として使用する
ことができる血管新生阻害剤として、他の物質（局所麻酔剤など）の佐剤として
、使用することができる。

【００２４】 したがって、上ならびに以降に記載する、マニラーゼの、特に、心筋、心臓血
管および血栓性の障害、ならびに腫瘍の治療用の薬剤の製造における使用は、本
発明の形態の一つである。

【００２５】 本明細書では、「製薬的に許容される担体」とは、該活性化合物または患者と
有害な反応を起こすことのない、不活性な、非毒性の固形または液体の充填剤、
希釈剤、またはカプセル化材料を意味する。無菌水、食塩水、水性デキストロー
ス、糖溶液、エタノール、グリコール、ならびに、例えば、ピーナッツ・オイル
、ダイズ油および鉱物油など、石油、動物、植物または合成のものを含む油脂類
のような、適合し、好ましくは液体の担体は、当該分野では周知である。

【００２６】 本発明による製剤は、非経口投与に一般的な、通常の非毒性の製薬的に許容さ
れる担体、希釈剤、添加物および賦形剤を含む、単回用量として投与することも
可能である。

【００２７】 本明細書では、「非経口」という用語は、皮下、静脈内、関節内および気管内
注射および注入法をも含んでいる。経口投与や局所塗布といった、その他の投与
もまた適している。非経口用の組成物および配合物は、公知の手法に従ったボー
ラスの形態、あるいは、均一な融合物として、静脈内に投与することが最も好ま
しい。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化
剤、潤沢剤、崩壊剤、および湿潤剤などの、常用の添加物を含んでいる。錠剤は
、当該分野で周知の方法に従って、コーティングしてもよい。

【００２８】 経口用の液体製剤は、水性または油性の懸濁剤、液剤、エマルジョン、シロッ
プ剤またはエリキシル剤の形態としてもよく、あるいは、使用前に水またはその
他の適切な溶剤により再構成するための乾燥製品として提供してもよい。このよ
うな液体製剤には、懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤および保存剤等の、常用の添
加物を含んでもよい。局所塗布剤は、水性または油性の懸濁剤、液剤、エマルジ
ョン、ジェル、あるいは好ましくはエマルジョン軟膏の形態とすることが可能で
ある。

【００２９】 本発明による単回用量には、１日に必要とする量の本発明の蛋白質、あるいは
、かかる所望の用量を構成する、細分量を含むことが可能である。所与の対象（
ヒトを含むほ乳類）に対する、最適な治療上許容される用量ならびに投薬速度は
、使用する特異的活性物質の活性、年齢、体重、総体的な健康状態、性別、食生
活、投与の時間および経路、クリアランス速度、酵素活性（単位／ｍｇ 蛋白質
）、処置の目的、すなわち、治療または予防、ならびに、治療する疾患の特性な
ど、種々の要素に依存する。

【００３０】 したがって、治療する患者（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ヘパリンのような抗
凝固剤などと、組成物および配合物とする際には、本発明の蛋白質（マニラーゼ
）の製薬的な有効な１日当たりの用量は、（１００ｋＵ／ｍｇの比活性をベース
にして）約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋ
ｇ体重の間である。適用形態に従って、単回用量は、０．５〜１０ｍｇの間のマ
ニラーゼを含むことが可能である。

【００３１】 マニラーゼと一緒に投与する際、たとえば、ヘパリンの濃度は、代表的には、
１日延べで、５００〜４０００Ｕ（ＩＵ）であるが、必要であれば、増減するこ
ともできる。

【００３２】 本発明のマニラーゼの精製は、実施例に詳しく述べるように、達成できた。表
１は、マニラーゼの調製的精製スキームを示す。表２は、本発明にかかる蛋白質
の濃縮工程を示し、また、表３は、公知のヒルのヒアルロニダーゼとマニラーゼ
の比較を示している。

【００３３】 マニラーゼと称する、ヒアルロン酸を分解する酵素は、ヒル Ｈｉｒｕｄｉｎ
ａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓの頭部から単離され、そして、均一となるま
で精製した。このヒアルロニダーゼは、酸抽出、硫酸アンモニウム沈澱を用いて
、続いて、陽イオン交換、コンカナバリン Ａ−セファロース、プロピル−フラ
クトゲル、ヒアルロナン フラグメント−セファロース、ならびにＤｉｏｌ−Ｌ
ｉ Ｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラムによる、一連のクロマトグラフィにより、精製し
た。ヒアルロナン フラグメントは、牛精巣のヒアルロニダーゼによって、天然
のヒアルロナンを切断して、調製した。フラグメントの精製および同定の後、ア
フィニティ・マトリックスを、以下に示したように調製した。このようなアフィ
ニティ・マトリックスは、ヒアルロニダーゼの精製のために、初めて適用された
。この高効率なクロマトグラフィは、ヒアルロナン結合蛋白質の迅速かつ効率的
な精製法である。精製の各工程後、その酵素活性の回収率は、穏当な程度に高か
った。三回の独立した調製用精製における結果は匹敵していた。それらは、精製
の程度に依存して、２０〜１６０ｋＵ／ｍｇの間に制御された、高活性の試料と
なっていた。対比実験では、公知のヒアルロニダーゼを、従来技術の示唆に従っ
て精製し、それらの特性を本発明にかかる蛋白質と比較した（表３）。

【００３４】 表１のスキームに従って精製されたヒアルロニダーゼは、他の著者等が記載し
ている他のヒルのヒアルロニダーゼとは異なっている。非解離条件下（βメルカ
プトエタノール）においては、同様の分子量が得られ、マニラーゼは、ほ乳類起
源の広範なヒアルロニダーゼ調製物と共通性を有する、単一サブユニット酵素で
あることが示唆される。この最終調製物は、ＭＡＬＤＩにより測定される見かけ
の分子量は５８±２ｋＤａ（図１）、等電点は７．２〜８．０の単一サブユニッ
ト酵素である。

【００３５】

【表１】

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】 表中のアスタリスク（*〜*****）は、活性測定および生化学的同定に関する情
報を意味する。

【００３９】 活性測定および生化学的同定に使用される方法は、分析される試料の濃度に依
存する。したがって、それらは、精製の一連の工程に適切な手法によりそれぞれ
進められた。 * −活性測定−濁度低減試験 ** −活性測定−濁度低減試験 −蛋白質含量測定（Ｅ₂₈₀、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ法） −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動） −ヘモグロビン測定 *** −活性測定−濁度低減試験 −蛋白質含量測定（Ｅ₂₈₀、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ法） −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロット（抗ヒトヘモグロビン抗体） **** −活性測定−濁度低減試験 −蛋白質含量測定（Ｅ₂₈₀、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ法） −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロット 抗ヒトヘモグロビン抗体 −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロット 抗ＣｏｎＡ抗体 −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロット 抗ペプチド抗体 ***** −ＭＡＬＤＩ −蛋白質含量測定（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ法） −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロット 抗ペプチド抗体 マニラーゼのコンカナバリンＡに対する結合は、このヒアルロニダーゼは糖タ
ンパク質であり、その糖成分は、α−Ｄ−マンノピラノシルまたはα−Ｄ−グル
コピラノシル、あるいは立体構造的に関連する残基で終端されていることを示し
ている。マニラーゼ活性の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ほとんど同一の
ＲＦ値を有する２本のバンドを示した。より長いＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに異な
る泳動条件が、このバンドの更なる分離のために使用された。これらの実験では
、さらに２本の弱いバンドを検出することができた（図２）。それら全てについ
て、そのＮ末端部分（３０アミノ酸）を独立して配列決定し、かかるＮ末端には
、差異の無いことが再度示された。エンド−Ｆ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ
）により脱グリコシル化に伴い、４本のバンドは、全て、ＭＷが約３ｋＤａ減少
した、１本のバンドとなることが実測された。

【００４０】 したがって、ほぼ間違いなく、電機泳動の移動度において観察された差異は、
マニラーゼ分子のグリコシル化のパターンにおける差異に因る。ノイラミニダー
ゼ、Ｏ−エンド−グリコシダーゼ、ならびにノイラミニダーゼおよびＯ−グリコ
シダーゼの処理は、精製された酵素の分子量になんらの影響を及ばしていない（
図３）。これらの結果は、マニラーゼは、少なくとも１種のＮ−結合オリゴ糖鎖
を含んでいることを示している。Ｏ−結合炭化水素鎖は、使用した方法では、検
出することができなかった。

【００４１】 最終の精製工程として、ＲＰ−クロマトグラフィを実施した。さらなる酵素活
性の検出はできないものの、塩ならびにペプチドプロテアーゼ阻害剤を除去する
ことができた（図４）。蛋白質を含む画分を、さらにＭＡＬＤＩを利用して、特
定した。ＭＡＬＤＩにより測定されるマニラーゼの分子量は、５８．３ｋＤａで
あった。

【００４２】 ヘパリンは、このヒアルロニダーゼの活性に対して、なんらの影響をも持たな
い（図５）。マニラーゼは、Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓのヒアルロ
ニダーゼよりも、何倍も安定である（図６）。さらには、部分精製されたマニラ
ーゼ試料も、イヌならびにラットの血漿中において、変動幅は−２０〜＋３７の
範囲内と、極めて高い安定性を示した。

【００４３】 ＨＡ−アフィニティ・マトリックスの調製は、文献（Tengblad A．， Biochim
. Biophys. Acta， 1979， 578， 281〜289）に記載されている。このＨＡ−マ
トリックスは、同じ原料から、蛋白質あるいはプロテオグリカン蛋白質−硫酸ケ
ラタン核に結合している軟骨ヒアルロニダーゼの精製に使用された（Christner
J.E.， Anal. Biochem.， 1978， 90， 22〜32）。このアフィニティ・マトリッ
クスにより精製されたＨＡ結合蛋白質（ＨＡＢＰ）は、組織中のヒアルロン酸受
容体（Green S.J. et al.， J. Cell Science， 1988， 89， 145〜156； Chan
F.L. et al.， J. Cell. Biol.， 1997， 107， 289〜301）あるいはヒアルロナ
ン（Waldenstrom A. et al.， 1991， J. Clin. Invest.， 88， 1622〜1628；
Waldenstrom A. et al.， Eur. J. Clin. Invest.， 1993， 23， 277〜282）の
分布に関した組織化学的研究にさらに使用された。

【００４４】 しかし、当研究室で開発された、このゲルの調製法は、正確に決定された濃度
のＨＡフラグメント（１〜１５ｍｇ／ｍｌ）のゲルの作製を可能とする。代わり
に、これは、かかるゲルを、ヒアルロナン結合蛋白質の精製だけでなく、ヒアル
ロナンに対する、それらの異なる親和性を利用して、それらの分離に使用するこ
とも可能とする。この選択的分離は、異なる長さのＨＡフラグメントを使用する
ことによって、調節することができる。かかる分離は、（たとえば、腫瘍学にお
いて）生物学的に関連する、多くの受容体の更なる特定をも可能とするであろう
。

【００４５】 記載する方法に従って調製されるＨＡマトリックスは、 １）既知のＨＡ結合蛋白質の精製、 ２）未知のＨＡ結合蛋白質の精製、 ３）新規なＨＡ結合蛋白質の同定、 ４）ヒアルロニダーゼの精製 に適用することができる。

【００４６】 本発明において、記載される方法によって得られるＨＡフラグメントは、最新
の分析手法（ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）の利用によって特定でき、また、蛋白
質−蛋白質間相互反応に対する研究に応用することができる。さらには、これら
のフラグメントは、脈管形成ならびに血管新生過程に関する研究の際に、利用す
ることもできる。

【００４７】 本発明を、下記の実施例によって詳しく述する。しかし、これらの実施例は、
本発明を、実験に使用された、また、実施例に記載されている、一般的な材料、
方法、物理学的変数、化合物、生物学的材料、発現ベクターおよび宿主等に限定
するものではない。特記していない限り、当該分野で周知の標準的な手法、なら
びに通常入手可能な材料を使用した。

【００４８】 実施例１（概説）： 精製方法を確立する目的で、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉ
ｓの粗抽出物を使用して、数多くの予備実験を実施した。以下の手法：硫酸アン
モニウム沈澱法、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィ、ヘパリン−フ
ラクトゲル、ＣｏｎＡ−セファロースを利用するアフィニティ・クロマトグラフ
ィ、オクチル−セファロース、プロピル−、フェニル−、ブチル−フラクトゲル
上における疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、調製用等電点集積、な
らびに調製用電気泳動を選択し、検証をした。

【００４９】 その結果は、酸およびアンモニウム沈澱、陽イオン交換、ＣｏｎＡ−セファロ
ース、プロピル−フラクトゲルＨｌＣ、ならびにＤｉｏｌ−Ｌｉ Ｃｈｒｏｓｐ
ｈｅｒおよびヒアルロン酸フラグメント−セファロース（ＨＡ−セファロース）
クロマトグラフィが、マニラーゼの精製に適していることを示している。当研究
室において調製されたＨＡ−セファロース・マトリックスは、このグリコシダー
ゼの精製に、有効に使用された。

【００５０】 特記しない限り、調製は全て、冷所で実施した。上に示したスキーム（表１）
に従って、精製を実施した。

【００５１】 実施例２：−精製用の出発原料の調製；ヒル頭部の調製物。

【００５２】 バングラデシュで採取したヒルＨｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓ
ｉｓは、すぐに急速凍結し、その後、−４０°〜−８０°で保存した。それらを
、凍結状態のまま断首したところ、頭部の重さは、全体重の約５％にあたる。

【００５３】 実施例３：−ヒル頭部からのマニラーゼの抽出方法 代表的な精製では、凍結したヒル頭部１ｋｇは、チメロサール ０．０２５％
およびトレハロース（Merck KGaA， Art.No. 1.08216）１７ｍｇ／ｍｌを含む、
冷却されたｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸緩衝液 ２５００ｍｌと共に、ワーリング
・ブレンダにおいてホモゲナイズした。かかるホモジェネートを、ゆっくり攪拌
しつつ、以下のプロテアーゼ阻害剤を直ちに添加した。

【００５４】 １．ＰＭＳＦ １．７ｍｇ／ｍｌ １０．０ｍＭ ２．ロイペプチン １０．０μｇ／ｍｌ ２０．０μＭ ３．ペプスタチンＡ ０．７μｇ／ｍｌ １μＭ ４．ＥＧＴＡ ３８０．３５μｇ／ｍｌ １．０ｍＭ ５．ｐ−ＡＰＭＳＦ ４０．０μｇ／ｍｌ ２０．０μＭ 冷所で、攪拌を４時間継続し、ついで、４９００ｒｐｍで２０分間遠心した。
上清溶液（上清Ｉ）を分取し、その後組織ペレットの抽出によって得られる上清
ＩＩとともにプールした。プールした上清は、工程Ｉの物質を表す。手順を以下
のスキームにまとめて示す。

【００５５】

【表４】

【００５６】 *試料の活性測定および生化学的特定は、活性測定法−濁度低減試験ならびに
蛋白質含量測定法（Ｅ₂₈₀、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を利
用して実施した。（ヘモグロビン測定キット， Merck kGaA， 13851にて測定し
た）ヘモグロビンおよび他の蛋白質の含量が非常に高いため、ヒルのホモジェネ
ートにおける酵素活性の測定は不可能であった。さらに、ヒアルロニダーゼ活性
は、酸沈澱に先立つ段階においては測定することができなかった。これらの抽出
物の最終的な比活性（蛋白質ｍｇ当たりの活性）は、約１０〜３０ＷＨＯ単位で
あった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、この粗抽出物は、多量の異なる蛋白質を含
み、主要なものは、約１２０、５５〜６０、４５、３１、２８、２２、１５なら
びに１４〜１０ｋＤａの分子量を有していた。

【００５７】 実施例４：−工程Ｉの物質の硫酸アンモニウム沈澱手順 次に、硫酸アンモニウム沈澱方法を、マニラーゼ精製の第１工程として選択し
、この酵素を約５倍に濃縮した。

【００５８】 酵素的に不活性な物質を、＋４℃で、固形の硫酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ
ＫＧａＡ）を３６％ｗ／ｖまでゆっくり添加することによって、工程Ｉの粗抽出
物から沈澱させた。この混合物を１時間攪拌し、遠心した。沈澱物は廃棄した。
上清は、脱イオン水の流水に対して一晩、ついで、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６
．０に対して２４時間透析した。これらの抽出物の最終的な比活性は、約４０〜
１５０ＷＨＯ単位であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、かかる工程ＩＩの抽出
物は、多量の異なる蛋白質を含んでいる。

【００５９】 実施例５：−陽イオン交換クロマトグラフィ 陽イオン交換体を、バッチ吸収様式で使用した。酵素を濃縮した透析試料（工
程ＩＩ）を、一晩、１ｌのフラクトゲル ＥＭＤＳＯ₃ ^- ６５０（Ｓ）陽イオン
交換体、Merck KGaA， Art.No. 16882とインキュベートした。インキュベーショ
ンを遠心により終了した後、緩衝液で陽イオン交換体を洗浄し、再遠心し、次い
で、ＨＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒｆｏｒｍａｃｅカラムにかかるゲルを充填した。２０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ４．９でカラムを洗浄した後、結合されている蛋白質を、
０〜１Ｍの直線勾配のＮａＣｌを含む、同リン酸緩衝液ｐＨ６．０により、カラ
ムから溶出した。画分を３分毎（９ｍｌ）に分取し、２８０ｎｍにおいて、その
吸光度をモニターした。マニラーゼは、ＮａＣｌ濃度 ０．１５〜０．１８Ｍに
て溶出された。画分全体の活性および蛋白含量を測定し、また、該画分をプール
し、アジ化ナトリウムおよびトレハロース１７ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭリン酸
緩衝液ｐＨ６．０に対して一晩透析した。

【００６０】 「プール」の蛋白質濃度、比活性の測定、ならびに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を
実施した。非常に良好な収率（活性）ならびに高い比活性（蛋白質ｍｇ当たりの
ＷＨＯ活性単位、ＩＵに対応）にもかかわらず、試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の
結果では、多くの蛋白質の混入がなお示された。フラクトゲル ＥＭＤＳＯ₃ ^-
６５０（Ｓ）（登録商標）（Merck KGaA，ドイツ）を利用した陽イオン交換クロ
マトグラフィは、約１０〜５０と非常に高い精製倍率を与えた。この工程は、ヘ
モグロビン不純物の低減には、非常に有効である。さらに、かかるバッチ法は、
多量となる工程ＩＩの上清（５〜１６ｌ）を取り扱うための、非常に有用な初期
の工程となることを見出した。

【００６１】 実施例６：−コンカナバリンＡ−セファロース アフィニティ・クロマトグラ
フィ 陽イオン交換の後、酵素の濃縮されたプールの更なる精製は、ＣｏｎＡ レク
チン アフィニティ・クロマトグラフィを利用して行った。市販のPharmacia Bi
otech製、ＣｏｎＡ−セファロース（登録商標） Art. 17−0440−01を、０．１
Ｍ酢酸緩衝液＋ＮａＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ８．０； ホウ酸０．１Ｍ＋０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ｐＨ６．０ ならびに、最後に、０．１Ｍ酢酸緩衝液＋
ＮａＣｌ ０．５ｍＭ ｐＨ６．０により、洗浄した。試料は、２０ｍＭ酢酸緩
衝液＋ＮａＣｌ ０．５ｍＭ＋ＣａＣｌ₂ １ｍＭ＋ＭｇＣＬ₂ １ｍＭ ｐＨ６
．０＋ＭｎＣｌ₂ １ｍＭに対して、一晩透析し、室温で１０００ｍｌのＣｏｎ
Ａカラムに載せ、ついで、５１０ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液＋ＮａＣｌ ０．
５Ｍ＋ＣａＣｌ₂ １ｍＭ＋ＭｇＣＬ₂ １ｍＭ ｐＨ６．０＋ＭｎＣｌ₂ １ｍ
Ｍ で、２時間溶出した。

【００６２】 これに続き、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド ０．５Ｍを含む同じ緩衝液
を利用した離脱を行った。かかる溶出を継続的に２８０ｎｍにおいてモニターし
た。分取される３ｍｌ画分は、ヒアルロニダーゼ活性を評価された。活性な画分
をプールし、アジ化ナトリウムおよびトレハロース１７ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ６．０に対して、一晩透析した。「プール」の蛋白質濃度
、比活性の測定、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。この工程は、残存
するヘモグロビンの除去に非常に有効である。かかるＣｏｎＡクロマトグラフィ
は、４〜１０倍の精製倍率を与える。出発物質の品質に依存して、この倍率は異
なった。

【００６３】 実施例７：−プロピルフラクトゲル 疎水性相互反応クロマトグラフィ ヒアルロニダーゼ活性なＣｏｎＡプールに、硫酸アンモニウムを最終濃度２Ｍ
になるまで添加した。次いで、この試料は、硫酸アンモニウム２Ｍを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ７．０で平衡化した、１５０ｍｌのプロピル−フラクトゲ
ル ＥＭＤプロピル６５０（Ｓ）（登録商標）、Merck KgaA，ドイツ、 Art.No.
1.10085と共に、室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了
後、かかるゲルは、同一の緩衝液で２回洗浄し、そして、ＨＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒ
ｆｏｒｍａｎｃｅ（２．６ｃｍ×６０ｃｍ）カラムを作製した。結合されている
蛋白質は、０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ７．０で溶出した。６ｍｌの画分を、３
分毎に分取し、直接脱イオン水に対して（２〜３時間）、次いで２０ｍＭリン酸
緩衝液 ｐＨ６．０に対して、透析した。かかる画分は、ヒアルロニダーゼ活性
について評価した。活性な画分を分取し、アジ化ナトリウムおよびトレハロース
１７ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ６．０に対して、一晩透析し
た。該プールの蛋白質および活性の決定を実施した。

【００６４】 このクロマトグラフィ工程の精製倍率は、約３〜５であった。前工程の担体ゲ
ルから遊離した、少量のＣｏｎＡは、他の蛋白質不純物と共に除去された。

【００６５】 実施例８：−ヒアルロン酸オリゴ糖 アフィニティカラムの調製 （ａ）牛精巣ヒアルロニダーゼによるヒアルロナン（ＨＡ）の加水分解 ヒアルロン酸、７ｇを、ＮａＣｌ ０．１５ＭおよびＥＤＴＡ ０．５ｍＭを
含む、１．２５ｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．２に、トルエン存
在下、４℃で一晩混合して溶解した。その後、ＨＡを含んだ溶液のｐＨを、５．
２に調整し、そして、３７℃まで加熱した後、牛精巣ヒアルロニダーゼ（Merck
KGaA；７００ＷＨＯ単位／ｍｇ）を添加した。ＨＡ ７ｇ当たり、使用直前に前
記緩衝液１５０ｍｌに溶解した、酵素２１０ｍｇを使用した。加水分解を、絶え
ず攪拌しつつ、３７℃、３０分間進行させ、そして、沸騰水浴中で１００℃に５
分間加熱することによって停止させた。かかる反応混合液は、１００００ｇで３
０分間の遠心により上清化し、残渣を含む変性蛋白質を廃棄し、また、上清を、
ガラスファイバ製プレフィルタを装着した、０．２μｍフィルタで濾過した。Ｈ
Ａオリゴ糖（ＨＡＯＳ）を含む透明な溶液は、以下のように、異なる分子量カッ
トオフ値を有する３種のＤｉａｆｌｏ限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）による濾過で
、分画された。

【００６６】 （ｂ）限外濾過によるＨＡＯＳの分画 前工程からのＨＡＯＳを含む溶液は、３０ＹＭ Ｄｉａｆｌｏ 限外濾過膜で
濾過した。濾別物は、他の研究用に保存し、一方、濾液は、１０ＹＭ Ｄｉａｆ
ｌｏ 限外濾過膜を通す、第２の限外濾過にかけた。また、濾別物は、他の研究
用に保存し、一方、１０ＹＭを通過した溶液は、３ＹＭ Ｄｉａｆｌｏ膜での最
後の限外濾過にかけた。その後、ＨＡ−ＯＳを含む濾別物、約１０ｍｌの溶液は
、さらなる精製に使用した。この画分：ＨＡＯＳ ３−１０は、以下の通りに精
製して、そして、さらには、セファロースへの結合に使用した。

【００６７】 （ｃ）ＨＡＯＳ ３−１０の精製 ＨＡＯＳ ３−１０は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（登録商標）カラムで精製（脱塩
）した。このカラム（４ｃｍ×１００ｃｍ）は、Ｂｉｏｇｅｌ ２ ｍｅｄｉｕ
ｍ（登録商標）、２００〜４００メッシュ（ＢｉｏＲａｄ）を充填し、５カラム
量の水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で洗浄した。前工程により得
られたＨＡＯＳ ３−１０画分（１５ｍｌ；オリゴ糖 １．５ｇ）を、このカラ
ムに載せた。該カラムは、水で溶出し；１５ｍｌ画分を分取し、ＨＡオリゴ糖の
存在について分析した。塩（これは、ＡｇＮＯ₃で検出）の前に溶出される、オ
リゴ糖を含む画分は、集められ、そして、３ＹＭ Ｄｉａｆｌｏ膜で再度濃縮し
た。

【００６８】 （ｄ）ＨＡＯＳ ３−１０の分析 セファロースとの結合効率を決定するために、ゲル（同一バッチ）を洗浄し、
５０％スラリーを調製するために、水に懸濁した。セファロース−ＨＡＯＳ ３
−１０の複合体、ならびに対照として使用するセファロースの懸濁液から、１０
０μｌの小分けを３連で抜き取り、そして、テフロン（登録商標）製のねじ蓋つ き試験管中に入れた、２．２Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Merck KgaA）２．５ ｍｌに添加した。加水分解のため、該混合物をアルゴンで置換し、１００℃で１ ６時間インキュベートした。加水分解の終了時に、試料を窒素下で乾燥し、水に 再懸濁して、グルコサミンならびにウロン酸の測定に使用した。各加水分解につ いて、ウロン酸ならびにグルコサミンの分解の程度を測定するために、既知量の ＵＡあるいはＧｌｃＮＡｃを含む対照試料を含め、同一条件下でインキュベート した。

【００６９】 上述の条件下で、２つの独立して実験において、抜き出したセファロースゲル
１ｍｌ当たり、５、８、９、１１および１５ｍｇのＨＡＯＳ ３−１０が、結合
していた。この結果は、ＵＡおよびグルコサミンの測定を基としている。

【００７０】 （ｅ）使用した評価法 分析した試料中のウロン酸含量は、Bitter T. and Muir H.M.， Anal. Bioche
m.， 1962， 4， 330〜334に従って、測定した。

【００７１】 ヘキソサミン量は、Rondle C.J.M. and Morgan W.T.J.， Biochem. J.， 1955
， 61， 586〜593の方法で分析した。

【００７２】 実施例９：−ヒアルロン酸フラグメント セファロース クロマトグラフィ（
ＨＡ−セファロース クロマトグラフィ） ８〜１０ｍｇ／ｍｌを含むクロマトグラフィ・マトリックスは、指示通りに調
製した。酵素を含む試料は、２０ｍＭ酢酸緩衝液＋ＮａＣｌ ０．１５Ｍ ｐＨ
４．０に対して透析し、そして、ＨＡ−セファロースカラム２５ｍｌに載せた。
同一の緩衝液で洗浄した後、０．１５〜１ＭのＮａＣｌの勾配を有する２０ｍＭ
酢酸緩衝液で、その溶出を行った。

【００７３】 １ｍｌ画分は、ヒアルロニダーゼ活性測定試験で試験し、プールし、アジ化ナ
トリウムおよびトレハロース１７ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ
６．０に対して、一晩透析した。プールの蛋白質および活性の測定を実施した。
このクロマトグラフィ工程の精製倍率は、約３であった。

【００７４】 実施例１０：−Ｄｉｏｌ−Ｌｉ Ｃｈｒｏｓｐｈｅｒ クロマトグラフィ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに対して透析した、活性な試料２０ｍｌを、Ｄｉｏｌ
−Ｌｉ Ｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラムに載せた。次いで、このカラムは、Ｍｉｌｌ
ｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏ １５ｍｌで平衡化し、水２ｍｌで５分間洗浄した。２０ｍＭ酢
酸緩衝液 ｐＨ５．９（勾配、ＮａＣｌ ０〜５ｍＭ）で１５分、ならびにＮａ
Ｃｌ ５ｍＭを含み、２０ｍＭ〜１００ｍＭの勾配の酢酸緩衝液 ｐＨ５．５で
３５分、活性試料の溶出を行った。画分は、ヒアルロニダーゼ活性について評価
した。活性な画分をプールし、アジ化ナトリウムおよびトレハロース１７ｍｇ／
ｍｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０に対して、一晩透析した。プールの
蛋白質および活性の測定を実施した。精製倍率：３。

【００７５】 実施例１１：−ＲＰ １８ｅクロマトグラフィ この精製工程は、最終工程としてのみ使用し、また、塩ならびにその他の蛋白
質不純物（例えば、ペプチド プロテアーゼ阻害剤）を含まない試料を得ること
を目的としている。マニラーゼは、この工程で使用される有機溶媒に対して耐性
ではないため、ヒアルロニダーゼ活性は、完全に消失した。マニラーゼ試料は、
ＲＰ １８ｅカラムに載せた。０．２５ｍｌ／ｍｉｎの画分を分取した。０．１
％ＴＦＡの存在下で溶出を実施し、水対アセトニトリル９９％までの勾配を使用
した。ＲＰ精製試料は、直接アミノ酸分析、ＭＡＬＤＩ測定、炭水化物の構造分
析ならびに、その他のマニラーゼ バッチの精製用標準として使用することがで
きる。

【００７６】 実施例１２：−活性測定−濁度低減試験 ヒアルロニダーゼ活性測定は、濁度低減測定で実施した。（種々の動物組織お
よび体液、例えば、ヒト脊髄、雄鳥の鶏冠から単離された）ヒアルロナンならび
にヒアルロニダーゼ（ウシ精巣、ブタ精巣、蛇毒由来のエンド−β−グルコサミ
ニダーゼ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来の溶
解酵素）の市販の調製物を、適正な活性測定条件の確立のために使用した。Ｈｉ
ｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ由来のエンド−β−グルクロニダーゼは、当
研究室で部分精製した。

【００７７】 ヒアルロナン保存溶液（濃度 ２ｍｇ／ｍｌ）は、ＨＡを０．３Ｍリン酸緩衝
液 ｐＨ５．３に溶解することによって調製した。この溶液は、同緩衝液で試験
直前に希釈して、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度とした。酵素を含む試料は、０．０１
％ウシアルブミンおよびＮａＣｌ ７７ｍＭを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（酵素
希釈緩衝液）で適切な酵素量（０．５〜５ＷＨＯ単位）に希釈した。これらの試
料０．１ｍｌに、ヒアルロナン（０．２ｍｇ／ｍｌ）溶液０．１ｍｌを添加、混
合して、３７℃で４５分間インキュベートした。試験は２連で行った。アルブミ
ン試薬（８０ｍＭ酢酸／４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．７５に溶解し
た０．１％アルブミン）１．０ｍｌによる希釈によって、反応を停止した。室温
または３７℃で１０分間インキュベートした後、６００ｎｍにおける光学密度を
、読み取り、そして、活性は、標準との比較（ＳＬＴ−プログラム）により、Ｗ
ＨＯ（ＩＵ）単位で表した。ウシ精巣ヒアルロニダーゼのＷＨＯ調製物（Humphr
ey J.H.， Bull. World Health Org. 1957， 16， 291〜294）を標準として使用
した。

【００７８】 実施例１３：−蛋白質量の推定 カラム溶出物の蛋白質含量は、２８０ｎｍにおける溶液の紫外線吸収を測定す
ることによって決定した。プールした画分の蛋白質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅミクロ
法を利用して決定した。ＢＳＡ溶液を、対照蛋白質として使用した。

【００７９】 実施例１４：−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動 電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉ法（Nature， 1970， 227， 680〜685）に従って
行った。以下のゲル；４％のスタック用ゲルを具えた、４〜２０％の勾配あるい
は１２．５％の分離用ゲルを使用した。試料は、ドデシル硫酸ナトリウムおよび
β−メルカプトエタノールの存在下、電気泳動した。（Ｐｈａｒｍａｃｉａの指
示書に従い）クーマシー・ブリリアント・ブルーによる染色および／または銀染
色を施して、蛋白質を視覚化した。

【００８０】 実施例１５：−等電点分離 マニラーゼ調製物に対する等電点分離の研究を進めるため、供給者（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）が提供するプロトコールを採用した。分離後、（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａのプロトコルに従って）ゲルを固定し、そして、銀染色した。

【００８１】 実施例１６：−ウサギの免疫血清からのイムノグロブリンの精製（抗ＣｏｎＡ
、抗ヘモグロビンならびに抗ペプチド ウサギ抗体） ウサギ血清は、以下の免疫原、コンカナバリンＡ レクチン、ヘモグロビン混
合物およびペプチド−ＫＬＨ複合体を使用して、創製した。かかるペプチド配列
は、マニラーゼのＮ末端部分の１４アミノ酸（ＫＥＩＡＶＴＩＤＤＫＮＶＩＡ）
と一致させた。

【００８２】 かかる血清は、Ｐｈａｒｍａｃｉａの標準指示書に従って、プロテインＡ セ
ファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、１７−０７８０−０１）で精製した。
ＩｇＧ試料の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ試験を利用して調べた
。

【００８３】 実施例１７：−ウェスタン−イムノブロット アッセイ 試料の適切な小分けおよび予備染色した既知の分子量の蛋白質マーカを、上述
の通りに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。予備染色したＢｉｏＲａｄ分子量マーカ
を使用した。蛋白質は、ポリアクリルアミドゲルから固定ポリビニルジフルオリ
ド（ＰＶＤＦ）膜へ、移動緩衝液の存在下１００分間、電気泳動的（０．８ｍＡ
／ｃｍ²）に移動させた。ＰＶＤＦ膜は、ブロック溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５＋
２％無脂肪ミルク）中において室温で１時間インキュベートした。次に、膜をブ
ロック溶液で適切に希釈した抗体と、室温で２時間インキュベートした。膜をＴ
ＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５で洗浄し、室温で（第２抗体の）
ヤギ抗ウサギ抗体−アルカリ・ホスファターゼ複合体、ＢｉｏＲａｄと、室温で
２時間インキュベートした。膜をＴＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄し、ＢＣＩ
Ｐアルカリ・ホスファターゼ基質溶液と、１０分間インキュベートした。停止緩
衝液の添加で、反応を停止させた。

【００８４】 実施例１８：−アミノ酸配列決定 マニラーゼのＮ末端３３アミノ酸残基の配列をエドマン分解によって得た。マ
ニラーゼ活性試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、バンドをＰＤＶＦ膜に移し、クー
マシー・ブルー染色し、切り出し、そして、配列決定した。ＲＰ−カラムクロマ
トグラフィを利用する最終精製工程後に得られる試料に対しても、同一のアミノ
酸配列が見出された。

【００８５】 実施例１９：−酵素活性のｐＨ依存性 （Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓならびにＨｉｒｕｄｏ
ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓのヒル頭部から単離されたヒアルロニダーゼについて） この実験で使用したヒアルロニダーゼの試料は、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍ
ａｎｉｌｌｅｎｓｉｓあるいはＨｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓのヒル頭
部から抽出し、硫酸アンモニウム沈澱および陽イオン交換クロマトグラフィを利
用して部分精製した。５００ＷＨＯ単位／ｍｌを含む各試料を、それぞれ２０℃
、＋４℃および３７℃で、ｐＨ２．６〜９．０の範囲（ｐＨ２．６〜５までは２
０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５〜９までは２０ｍＭリン酸緩衝液）でインキュベート
した。酵素活性を、１、２および７日のインキュベート期間後に測定した。ｐＨ
の酸性ならびにアルカリ性の両端において、両ヒアルロニダーゼについて、同程
度の活性阻害が観測された。しかし、長時間のインキュベーションの間、マニラ
ーゼは、Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓのヒアルロニダーゼよりもより
安定であった。たとえば、ｐＨ７．０、＋４℃ならびに３７℃で、７日間インキ
ュベーションした後、マニラーゼは、それぞれ当初の活性の７５％および６０％
を保持していた。同条件でインキュベートした、Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎ
ａｌｉｓのヒアルロニダーゼは、１日後には既に不活性となっていた。

【００８６】 実施例２０：−イヌ血清存在下における、ヒアルロニダーゼの安定性測定（Ｈ
ｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓならびにＨｉｒｕｄｏ ｍｅｄ
ｉｃｉｎａｌｉｓのヒル頭部から単離されたヒアルロニダーゼについて） マニラーゼ、Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓならびにウシ精巣ヒアル
ロンダーゼの試料各５ｋＵ／ｍｌを、最終濃度が２５０Ｕ／ｍｌとなるまで、イ
ヌあるいはラットのクエン酸添加血漿で希釈した。次いで、これらの溶液を、−
２０℃、＋４℃および＋３７℃で、０〜７日間インキュベートした。緩衝液で希
釈した、同一のヒアルロニダーゼを含む対照を、この実験に含めた。最後に、ヒ
アルロニダーゼ活性を測定した。

【００８７】 実施例２１：−混入酵素の活性 ヒルのヒアルロニダーゼ精製手順の各段階において、その調製物について、Tw
inig S.S. （Anal. Biochem.， 1984， 143， 30〜34）に従って、共通のプロテ
アーゼ基質（Boehringer Mannheim， cat.no. 1080 733）を利用して、蛋白質分
解能を有するその他の酵素に関する検証を行った。

【００８８】 実施例２２：−ヒアルロニダーゼ活性に対するヘパリンの影響 ヒアルロニダーゼによるヒアルロナンの分解は、還元糖の遊離が生じさせる。
遊離した糖の量は、Ｐａｒｋの変法（Park J. & Johnson M.； J. Biol. Chem.
1949， 181， 149）によって、比色定量した。マニラーゼおよびウシ精巣ヒアル
ロニダーゼの活性に対するヘパリンの影響を評価するため、２種の活性測定を；
１種はヘパリン存在下で、２種はヘパリン無しで、実施した。ヒアルロニダーゼ
試料２５μｌ（３．２ＷＨＯ単位）を、０〜２４単位のヘパリンを含んだ、ヘパ
リン（Liquemin， Fa. Hoffmann LaRoche）溶液２５μｌとともに、３７℃で３
０分間インキュベートした。次に、ヒアルロナン５０μｌ（２．５ｍｇ／ｍｌ）
を添加して、インキュベートを３７℃で３０分間続けた。この反応を、１００℃
で２分間加熱することによって停止させた。次いで、炭酸塩−シアン化物溶液１
００μｌおよびフェリシアン化カリウム溶液１００μｌを、不活性化処理を行っ
た消化物に添加した。この試料を、沸騰水浴で１５分間煮沸し、次いで、氷浴で
冷却した。その後、硫酸第二鉄アンモニウム溶液０．７５μｌを反応混合物に添
加した。室温で１５分間インキュベーション後、発色を、島津分光光度計にて６
９０ｎｍで測定した。適切なブランク試料および酵素の入っていない対照が、各
測定に含まれる。分析される試料の種類において、予測される還元糖（グルクロ
ン酸またはＮ−アセチル−グルコサミン、１〜１５μｇ）を、標準として使用し
た。

【００８９】 実施例２３：−マニラーゼの脱グリコシル化 マニラーゼの試料を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（BioLabs Art.No. 710L）を利用
して、提供者の指示書に従って脱グリコシル化した。脱グリコシル化は、変性な
らびに天然の条件下で行った。Ｏ−グリカナーゼ、ノイラミニダーゼ、ならびに
ノイラミニダーゼ＋Ｏ−グリカナーゼ処理を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍの標準的処方に従って行った。試料は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活
性測定試験で特定した。

【００９０】 実施例２４：−Ｅ．ｃｏｌｉ用発現ベクターの構築（図１１） Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のため、ｔｅｔ プロモータ領域を保持している、
改良型のプラスミドｐＡＳＫ７５（Skerra， Gene 151， (1994)， pp131〜135
）を使用した。改良は、Ｘｂａ IとＨｉｎｄ III部位の間に、新しいリンカーを
クローニングすることによってなされている。この新しいリンカーには、ｏｍｐ
Ａリーダー配列、他のマルチクローニングサイトならびにstrep−tagの代わりに
６×His−tagが含まれている。ｐＡＳＫ７５にクローニングしたリンカー配列：

【００９１】

【化１】

【００９２】 マニラーゼの発現ベクターを構築するためには、ＰＣＲ法によって５’ Cla I
および３’ Eco47 III 制限部位の導入が必要であった。したがって、２種のプ
ライマ： ５’ ATC GAT AAA GAG ATT GCC GTG AC および ３’ GTT GTT TCC GAT GCT AAA GCG CT を使用した。ＰＣＲ産物は、最初にPCR II ベクター系（Invitrogen）にクロー
ニングし、配列決定した。

【００９３】 第２工程では、マニラーゼ遺伝子を、制限部位５’ Cla I および３’ Eco47
III を使用して、改良型ｐＡＳＫ７５ベクター中にクローニングした。

【００９４】 この組換えマニラーゼの発現と、その活性を確認した後、第２のＰＣＲ反応に
て、Ｈｉｓ−ｔａｇを除去し、マニラーゼ遺伝子の開始コドンを直接ｏｍｐＡリ
ーダー配列に連結した。このＰＣＲ反応用プライマは、 ５’ ACC GTA GCG CAG GCC AAA GAG ATT GCC GTG および ３’ CAC GGC AAT CTC TTT GGC CTG CGC TAC GGT であった。

【００９５】 実施例２５：−Ｂａｃｕｌｏ Ｄｏｎｏｒプラスミドの構築（図１２） Ｂａｃｕｌｏウイルス発現系においてマニラーゼを発現させるため、Gibco Li
fe Technologies 製 Bac-To-Bac （商標）バキュロウイルス発現系を使用した。
切断系を取得するため、ミツバチのメリチンリーダー配列をマニラーゼ遺伝子に
連結して、また、制限部位５’ BamH I および３’ Kpn I を導入するために、
一回のＰＣＲ反応を実施した。

【００９６】 ５’プライマ： CGG ATC CAT GAA ATT CTT AGT CAA CGT TGC CCT TGT TTT TAT GGT CGT ATA CTA TTC TTA CAT CTA TGC GAA AGA GAT TGC CGT GAC ３’プライマ： AAT GTT GAA GCA TAA GGT ACC ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ II ベクター（Invitrogen）にクローニングして、配列
決定した。次いで、メリチン−マニラーゼ融合物を、制限部位５’ BamH I およ
び３’ Kpn I を使用して、ｐＦａｓｔＢａｃベクターにクローニングした（図
１２）。

【００９７】 実施例２６：−酵母用発現ベクターの構築（図１３） 酵母で発現させるため、ピキア・マルチコピー発現系（Invitrogen）を使用し
た。マニラーゼの発現ベクターを構築するために、適切なベクター（ｐＰＩＣ９
Ｋ）内へのライゲーション用に、適合する制限末端（５’ ＥｃｏＲ Ｉ、３’
Ｎｏｔ Ｉ）を形成するように、マニラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅法を使用した
。したがって、下記のプライマー： ５’ GTA GAA TTC AAA GAG ATT GCC GTG ACA ５’ GAT GCT AAT GTT GAA GCA TAA TGA GCG GCC GC を使用した。

【００９８】 ピキア・スフェロプラストに形質転換する前に、発現ベクターは、Sal I で直
線状とする必要がある。

【００９９】 実施例２６：−Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現 ｏｍｐＡリーダー配列に連結されたＳａｒａｓｔａｔｉｎの構造遺伝子を含む
、ｐＲＧ７２発現ベクター中に入れ、Ｗ３１１０コンピテント細胞を形質転換し
た。細胞を対数増殖中期まで増殖させ、そして、２００μｇ ａＴＣ／ｌを添加
することによってプロモータを誘導した。その１時間後、組換えマニラーゼが明
らかに検出された。

【０１００】 実施例２７：−組換えバキュロウイルスの創製およびＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ発
現系によるマニラーゼの発現 ドナー・プラスミドｐＴＤ１３によって、ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７標的部位を
有するｂａｃｍｉｄならびにヘルパー・プラスミドを含んでいる、ＤＨ１０Ｂａ
ｃコンピテント細胞を形質転換した。ドナー・プラスミドのｍｉｎｉ−Ｔｎ７部
分は、ヘルパー・プラスミドにより供給される転位蛋白質の存在下、ｂａｃｍｉ
ｄ上のｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７標的部位に転位することができる。組換えｂａｃ
ｍｉｄを含んでいるコロニーは、ｌａｃＺ遺伝子の分断によって同定した。高分
子量のｍｉｎｉ−ｐｒｅｐＤＮＡを、組換えｂａｃｍｉｄを含んでいる選択され
たＥ．ｃｏｌｉクローンから調製し、そして、このＤＮＡを、昆虫細胞へのトラ
ンスフェクトに使用した。

【０１０１】 詳細な手順書は、発現キットの指示マニュアルに見いだすことができる。

【０１０２】 実施例２８：−酵母での発現 マニラーゼ遺伝子の融合を確認するためには、コロニーをＨｉｓ⁺Ｍｕｔ⁺−変
異体についてスクリーニングする必要がある。

【０１０３】 単一のコロニーを使用して、１ｌ容フラスコに入れた培地１００ｍｌに接種し
た。増殖条件は、２８〜３０℃、２５０ｒｐｍ、ＯＤ２〜６までとする。発現を
誘導するために、まず培養液を遠心して、上清を傾瀉し、細胞ペレットを、元の
培養量の１／５を使用して、新しい培地に再懸濁する。２４時間毎に、１００％
メタノールを最終濃度０．５％となるまで添加して、誘導を維持する。最大６日
間の後、上清を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよび活性測定によって分析する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 標準蛋白質、（Ｄｉｏｌ−Ｌｉ Ｃｈｒｏｓｐｈｅｒクロマトグラフィ後の）
マニラーゼ試料のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ−ＣＢＢ染色）を示す図である。 １−広範な標準蛋白質 ２−マニラーゼ、４μｇ ３−Ｏｒｇｅｌａｓｅ、６μｇ ４−ヘモグロビン、４０μｇ

【図２】 ＨＡ−アフィニティ・クロマトグラフィ後の−マニラーゼ活性試料、４種（レ
ーン３〜６）についての、 ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）および ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットを示す図である。この実験では、ウ
サギＰ３−２Ａポリクローナル抗ペプチド抗体を使用した。

【図３】 以下の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）を示す図である。 １−ＬＷ−ＭＭ−低量分子量マーカ（ＢｉｏＲａｄ） ２−マニラーゼ ３−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ） ４−ＰＮａｓｅ Ｆ処理済みマニラーゼ ５−Ｏ−グリコシダーゼ処理済みマニラーゼ ６−Ｏ−グリコシダーゼおよびノイラミニダーゼ処理済みマニラーゼ ７−Ｏ−グリコシダーゼおよびノイラミニダーゼ ８−分子量マーカ（ＭＷＭ−予備染色 ＢｉｏＲａｄ）

【図４】 ａ）標準リボヌクレアーゼ ｂ）マニラーゼ試料（比活性１４０ｋＵ／ｍｇ） の逆相クロマトグラフィを示す図である。

【図５】 マニラーゼ（−○−）および牛精巣ヒアルロニダーゼ（−●−）のヒアルロニ
ダーゼ活性に対する、ヘパリンの影響を示す図である。 Ｘ軸：ＩＵ ヘパリン、Ｙ軸：残存活性 ％

【図６ａ】 緩衝液ならびに血漿中における、ヒアルロニダーゼの安定性の評価を示す図で
ある。図６（ａ）は、マニラーゼ（４℃）の結果をしめす。 Ｘ軸：インキュベーションの日数； Ｙ軸：ＷＨＯ（ＩＵ）単位

【図６ｂ】 緩衝液ならびに血漿中における、ヒアルロニダーゼの安定性の評価を示す図で
ある。図６（ｂ）は、マニラーゼ（−２０℃）の結果をしめす。 Ｘ軸：インキュベーションの日数； Ｙ軸：ＷＨＯ（ＩＵ）単位

【図６ｃ】 緩衝液ならびに血漿中における、ヒアルロニダーゼの安定性の評価を示す図で
ある。図６（ｃ）は、マニラーゼ（３７℃）の結果をしめす。 Ｘ軸：インキュベーションの日数； Ｙ軸：ＷＨＯ（ＩＵ）単位

【図６ｄ】 緩衝液ならびに血漿中における、ヒアルロニダーゼの安定性の評価を示す図で
ある。図６（ｄ）は、牛精巣ヒアルロニダーゼ（Ｙ）およびＨｉｒｕｄｏ ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌｉｓのヒアルロニダーゼ（Ａ）の結果の対比をしめす。 Ｘ軸：インキュベーションの日数； Ｙ軸：ＷＨＯ（ＩＵ）単位

【図７】 本発明にかかる、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ由来の単
離、精製された蛋白質の配列決定によって得られた、天然マニラーゼのアミノ酸
配列（配列番号：１に対応）を示す図である。

【図８】 組換えマニラーゼ・クローン（クローン２１）の塩基（上列）ならびにアミノ
酸配列（配列番号：２、３に対応）を示す図である。

【図９】 組換えマニラーゼ・クローン（クローン３１）の塩基（上列）ならびにアミノ
酸配列（配列番号：４、５に対応）を示す図である。

【図１０】 組換えマニラーゼ・クローン（クローン３１）の塩基（上列）ならびにアミノ
酸配列（配列番号：６、７に対応）を示す図である。

【図１１】 Ｅ．ｃｏｌｉ用のマニラーゼ発現ベクターを示す図である。

【図１２】 マニラーゼのＢａｃｕｌｏ用ドナー・プラスミドを示す図である。

【図１３】 酵母用のマニラーゼ発現ベクターを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 35/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/26 Ｚ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 9/26 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 コルドウィッツ、 マリア ドイツ連邦共和国 デー−64347 グリー スハイム ハインリッヒシュトラーセ 20 (72)発明者 グェッソウ、 デトレフ ドイツ連邦共和国 デー−63283 ダルム シュタット グラーフェンシュトラーセ 27 (72)発明者 ホフマン、 ウヴェ ドイツ連邦共和国 デー−64342 シーハ イム ホッホシュテッター シュトラーセ ５アー (72)発明者 パキュースカ、 タデウス ポーランド共和国 ピーエル−02−230 ワルシャワ ジュトルツェンキ 87／89 (72)発明者 ガーダス、 アーンジェーイ ポーランド共和国 ピーエル−01−813 ワルシャワ シンフォニー ２／12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA12 CA04 DA06 DA12 EA02 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 DD11 FF01C FF03C FF11C FF12C FF14C LL01 4B065 AA26X AA77X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 4C084 AA02 AA07 DC01 DC50 MA02 NA14 ZA362 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA27 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA54 ZB26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 その活性はヘパリンによって影響を受けない、ヒアルロニダ
   ーゼの生物学的活性を有し、グリコシル化に応じて、５３〜６０ｋＤａの分子量
   を有することを特徴とするヒル種 Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎ
   ｓｉｓから単離された精製蛋白質。
2. 【請求項２】 分子量５８（±２）ｋＤａを有する請求項１に記載のグリコ
   シル化蛋白質。
3. 【請求項３】 分子量５４（±２）ｋＤａを有する請求項１に記載の非グリ
   コシル化蛋白質。
4. 【請求項４】 等電点７．２〜８．０を有する請求項１〜３のいずれかに記
   載の蛋白質。
5. 【請求項５】 図７に示す配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項１〜４
   のいずれかに記載の蛋白質。
6. 【請求項６】 比活性＞１００ｋＵ／ｍｇ蛋白質の酵素比活性を有する請求
   項１〜５に記載の蛋白質。
7. 【請求項７】 以下の工程： （ｉ）Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ種のヒルの頭部を酸
   緩衝液でホモゲナイズし、遠心する工程、 （ｉｉ）工程（ｉ）の上清を硫酸アンモニウムで沈澱する工程、 （ｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィの工程、 （ｉｖ）コンカナバリンＡアフィニティ・クロマトグラフィの工程、 （ｖ）疎水性相互作用クロマトグラフィの工程、 （ｖｉ）ヒアルロン酸フラグメントをコーティングしたマトリックスによるア
   フィニティ・クロマトグラフィの工程、 （ｖｉｉ）ゲル濾過クロマトグラフィの工程、ならびに、 場合によって （ｖｉｉｉ）精製蛋白質の酵素的または化学的脱グリコシル化の工程をも含ん
   でなる、請求項１〜６に規定する蛋白質を単離、精製する方法。
8. 【請求項８】 その活性はヘパリンによって影響を受けない、ヒアルロニダ
   ーゼの生物学的活性を有し、かつ、グリコシル化に応じて、５３〜６０ｋＤａの
   分子量を有し、請求項７の製造工程によって取得可能な蛋白質。
9. 【請求項９】 比活性＞１００ｋＵ／ｍｇ蛋白質の酵素比活性を有する請求
   項８に記載の蛋白質。
10. 【請求項１０】 請求項１ならびに９の蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
11. 【請求項１１】 図８（配列番号２）、図９（配列番号４）ならびに図１０
    （配列番号６）に記載される、いずれかの塩基配列を含んでなる、請求項８の蛋
    白質をコードするＤＮＡ配列。
12. 【請求項１２】 請求項１１のＤＮＡ配列のいずれかによってコード化され
    ている、ヒアルロニダーゼの生物学的活性を有する組換え蛋白質。
13. 【請求項１３】 ヒアルロニダーゼの生物学的活性を有し、グリコシル化に
    応じて分子量５５〜５９ｋＤａを有し、図８、９ならびに１０に記載されるアミ
    ノ酸配列（配列番号３、５、７）のいずれか、あるいは、前記配列と少なくとも
    ８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する組換え蛋白質。
14. 【請求項１４】 請求項１０または１１のＤＮＡ配列を含んでなる発現ベク
    ター。
15. 【請求項１５】 請求項１４のベクターで形質転換され、請求項１２または
    １３の蛋白質の発現に適合する宿主細胞。
16. 【請求項１６】 医薬としての、請求項１〜６、８、９、１２および１３の
    いずれかに記載の蛋白質。
17. 【請求項１７】 請求項１６の蛋白質と、その製薬学的に許容される希釈剤
    、担体または添加物とを含んでなる医薬組成物。
18. 【請求項１８】 付加的に、薬理学的活性化合物をさらに含んでなる医薬組
    成物。
19. 【請求項１９】 該薬理学的活性化合物はヘパリンであることを特徴とする
    請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 【請求項２０】 心筋の、心血管の、ならびに血栓性の疾患および腫瘍の治
    療用の医薬製造における、請求項１〜６、８、９、１２および１３のいずれかに
    記載の蛋白質の使用。