CZ20014383A3 - Hyaluronidáza z Hirudinaria manilensis, její izolace, čiątění a rekombinantní způsoby její výroby - Google Patents

Description

a rekombinantní způsoby její výroby

Oblast techniky

Vynález se týká izolace, čištění a charakterizace nové hyaluronidázy pocházející z tropické pijavice Hirudinaria manillensis. Proto se podle tohoto vynálezu nový enzym nazývá manilláza. Vynález se týká dále rekombinantního způsobu produkce manillázy, který zahrnuje rozkrytí DNA a sekvencí aminokyselin stejně jako expresních vektorů a hostitelských systémů. Vynález se také týká použití manillázy k terapeutickým účelům, například k léčení nemocí myokardu, thrombotických příhod a nádorů.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronvá kyselina nebo hialuronan (HA) je lineární nerozvětvený glykosaminoglykan s vysokou molekulovou hmotností (2-6 xlO⁶ ) , sestávající z opakující se disacharidové struktury GlcNAc(£l-4)GlcUA. Její karboxylové skupiny jsou plně ionizovány v převažující hodnotě pH extracelulárních kapalin jak κ normálních tak patologických. HA patří spolu se sírany chondroitinu keratenu a heparinu do skupiny glykosaminoglykanů * (Jeanloz R. V., Arthr. Rheum. 3, str. 233 až 237, 1960). Na rozdíl od ostatních nemodifikovaných glykosaminoglykanů (GAG) ‘ nemá žádné sulfátové substituenty nebo kovalentně vázaný peptid a délka jeho řetězce a molekulová hmotnost jsou obvykle ' velmi značně větší- HA je všudypřítomně rozdělen ve pojivových tkáních a byl nalezen snad ve všech částech těla po zavedení zlepšených způsobů fixace (Hellstrom S. a kol., Histochem. J. 22, str- 677 až 682, 1990) a specifických histochemických způsobů s použitím hialuronan vázajících peptidů (HABP). Je rovněž přítomen během vývoje a zrání ve tkáních neuroektodermálního původu.

Výrazem hyaluronidáza se míní obecně a podle vynálezu enzym, který působí na hyaluronovou kyselinu, nezávisle na aktivitě vůči jiným substrátům.

Hyaluronidáza byla poprvé izolována z mikroorganismů a později ze savcích varlat, což je dnes její hlavní zdroj (Meyer K., The Enzyme 307, 1971). Podle reakčního mechanismu byly hyaluronidázy rozděleny do tří hlavních skupin:

V první skupině jsou mikrobiální enzymy kombinovány tak, že působí na své substráty β-eliminací produkující delta-4,5nenasycené disacharidy. Enzym se proto musí jmenovat hyaluronátové lyásy, EC 4.2.99.1.

Druhá skupina, hyaluronoglukosamidáza nebo hyaluronidáza testikulárního typu (EC 3-2.1-35), působí jako endo-N-acety1-β-D-hexosaminidáza degradující HA na menší fragmenty, předně tetrasacharid s hexosaminovým podílem na volném redukujícím konci. Enzymy s podobnými vlastnostmi jako hyaluronidáza získány z pulců, z hadího jedu, ze včelího jezvírecích tkání. z lidského séra a z jiných zdrojů. Je dobře známo, že hyaluronidáza z transglykosilátové účinky (Weissman B. a kol.

208, str. 417 až 429, 1954). Enzymy, patřící do této skupiny hyaluronidáz, vykazují enzymatiké působení nejenom na hyaluronát, ale také na chondroitin-4-sulfát, chondroitin-6-sulfát, a dermatansulfát.

z varlat, byly du, z četných varlat má také , J. Biol. Chem.

Třetí skupinu tvoří hyaluronoglukuronidáza (EC 3.2.1.36), která působí jako endo-£-glukuronidáza. Tento enzym byl izolován z pijavic Hirudo medicinalis (Yuki H., Fushman W.H., J. Biol. Chem. 238, str. 1877 až 1879, 1963) a je absolutně specifický pro HA. Chondroitinsulfát, dermatan a heparin nejsou substráty pro tuto hyaluronidázu. Odbourává pouze hyaluronovou kyselinu na tetrasacharid s glukuronovou kyselinou na volném • · ·· · ·· ·» * ··· · · » · ··«· ····· · · · · · • · · · · · · · · · · ···· · · ··· • > ·· ·····«· ·· ·· · redukujícím konci (Linker A. a kol., J. Biol. Chera. 235, str. 924 až 927, 1960). Na rozdíl od savčích endo-<3-glukosaminidáz, nemá heparin vliv na působení této pijavkové hyaluronidázy. Může se tedy podávat pacientům společně s heparinem a jeho deriváty extensivně používanými jako antikoagulanty. Kyselina hlaluronová, specificky endo-p-glukuronidáza (nazývaná Orgeláza) z druhů (Poecilobdella granulosa) podskupiny Hirudinariinae (včetně Hirudinaria Illebdella, Poecilodbella, sanguisoga) buvolích pijavic je popsána v evropském patentovém spise číslo EP 0193 330 a má molekulovou hmotnosat přibližně 28,5.

Hialuronidázy mají mnoho praktických aplikací in vitro a in vivo. Intravenosní podávání hyaluronidázy je navrhováno k léčení myokardiální infrakce (Kloner R.A- a kol., Circulation 58, str. 220 až 226, 1978; Volf R.A. a kol., Am. J. Cardiol. 53, str. 841 až 944, 1984; Taira A- a kol., Angiology

41, str. 1029 až 1036, 1990). Myokardiální infrakce představuje společnou formu nemechanických poranění; jmenovitě hrubé porušení a uhynutí buněk, způsobené v tomto případě náhlou buněčnou hypoxií. II uměle vyvolané myokardiální infrakce u krys (Waldenstrom A. a kol.,J. Clin. Invest. 88, str. 1622 až 1628, 1991) je zvýšen obsah HA v poraněném srdečním svalu (infraktové oblasti) během 24 hodin přibližně třikrát, normálně po třech dnech a je doprovázen intersticiálním otokem. Poměrný obsah vody v infraktované oblasti také progresivně vzrůstá a dosahuje maximální hodnoty třetího dne a je v silné korelaci s hromaděním HA. Stejná souvislost se zvýšeným obsahem HA s otokem byla pozorována v experimentálním odmítnutí implantátu srdce a ledvin (Hállgren R. a kol.,J. Clin. Invest 85, str. 668 až 673, 1990; Hállgren R. a kol., J. Exp. Med. 171, str.

2063 až 2076, 1990), v odmítnutí lidské implantované ledviny (Wells A. a kol., Transplantátion u plicních onemocnění (Bjermer A.

str. 801 až 806 1987) a u idiopatické intersticiální fibrózy (Bjermer A- a kol., Thorax 44, str. 126 až 131 1989). Všechny

50, str. 240 až 243, 1990), a kol., Brit. Med. J. 295,

tyto studie poskytují nejenom poznatek o zvýšení HA v akutním zánětu, ale dokládají také jeho účast v lokální retenci kapaliny hlavně zodpovědné za zdurení tkáně a ovlivnění mechanických a elektrofyziologických funkcí srdce.

Tyto výsledky mohou vysvětlovat mechanismus působení hyaluronidáz použitých v klinických pokusech- Uvádí se, že ošetření hyaluronidázou omezuje poškození buněk během myokardiální ischemie u krys, psů a lidí (Maclean D. a kol., Science 194, str. 199, 1976). Degradace HA může být následována snížením hromadění vody, snížením tkáňového tlaku a nakonec lepší perf us í .

Bylo doloženo, že hyaluronidáz i extraktů obsahujících hyaluronidázu z pí lavic lze použít k různým léčebným účelfim. Tak hyázová terapie kombinovaná s cyklosporinem, vedla k prodlouženému přežití štěpu (Johnson C. a kol., Transplant Inter. v tisku). Hyáz (rozptylujícího faktoru) v nejširším smyslu se používá ke zvýšení propustnosti tkání ke zlepšení difúze jiných farmakologických činidel (například kombinace s cytostatiky v léčení rakovinových nádorů). Kromě toho bylo možno předvést, že hyaluronidázy jsou užitečné při léčení nádorů, kde působí jako inhibitory angiogenese a jako pomoc při lokálním dodávání drogy při léčení nádorů, k léčení zeleného zákalu a jiných očních chorob a jako přídavek k ostatním terapeutickým činidlům, jako jsou lokální anestetika a antibiotika. Celkový přehled terapeutického použití a relevance podal v přehledném článku Farr a kol. (Wiener Medizinische Wochenschrift 15, str. 347, 1997 a připojený seznam literatury). Existuje tedy potřeba aktivní sloučeniny, jako je hyaluronidáza. Avšak známé a dostupné hyaluronidázy jsou jednak nestabilní (hyaluronidázy z Hirudo medicinalis, Linker a kol., J. Biol. Chem. 235, str. 924, 1960; Yuki a Fishman, J. Biol. Chem. 238, str. 1877, 1963), nebo vykazují spíše nízkou specifikou aktivitu (EP 0193 330, Budds a kol., Comp. Biochem. Physiol 87B 3, str.

497, 1987). Kromě toho není žádná ze známých hyaluronidáz dostupná v rekombinantní formě, což je nutný předpoklad k intenzivnímu komerčnímu použití.

Vynález nyní předkládá poprvé novou hyaluronidázu, která byla izolována a vyčištěna z Hirudonaria mannilensis stejně jako rekombinantní verzi uvedeného enzymu získaného technikou biologického inženýrství.

Podstata vynálezu

Vyčištěný protein izolovaný z pijavek druhu Hirudonaria mannilensis mající biologickou aktivitu hyaluronidázy, která není ovlivněna ve svém působení heparinem má podle vynálezu molekulovou hmotnost 53 až 60 v závislosti na glykosylaci.

Nový protein, který se nazývá maní 1láza je glykosylován ve své nativní formě mající molekulovou hmotnost přibližně 58 kD (± 2 kD) a čtyři glykoformy. Vynález se rovněž týká neglykosylovaného proteinu, získatelného enzymatickým nebo chemickým štěpením cukerných zbytků standardními způsoby. Neglykosylovaný enzym podle vynálezu má molekulovou hmotnost přibližně 54 (±2) měřeno SDS-PAGE.

Z přímého porovnání vyplývá, že hyaluronidáza, popsaná v evropském patentovém spise číslo EP 0 193330 Corgeláza) má za těchže podmínek molekulovou hmotnost přibližně 28 a obsahuje mnoho nečistot, jako je hemoglobin. Nativní manilláza podle vynálezu má optimální hodnotu pH 6,0 až 7,0, isoelektrický bod 7,2 až 8,0 a má sekvenci aminokyselin vyznačenou na obr. 7.

S překvapením se zjistilo, že manilláza získaná způsobem preparativního čištění (viz dále) má extrémně vysokou specifickou aktivitu 100 až 150, s výhodou 110 až 140 (WHO) kll/mg proteinu, zatímco specifická aktivita orgelázy je pouze přibližně 1,2 kU/mg. Kromě toho má orgeláza ve srovnání s manil6

lázou nižší optimální hodnotu pH <5,2 až 6,0). Manilláza není jako orgeláza ovlivňována heparinem.

Vynález se dále týká způsobu izolování a čištění manillázy, sestávajícího z následujících stupňů:

Ci) homogenizace hlav pijavic druhu Hirudinaria mannilensis kyselým pufrem a odstředění,

Cii) vysrážení supernatantu ze stupně (i) síranem amonným, Ciii) katexová ehromatografie,

Civ) afinitní ehromatografie konkanavalinu A,

Cv) hydrofobní interakční ehromatografie,

Cvi) afinitní ehromatografie matric povlečených fragmenty hialuronové kyseliny,

Cvii) gelová perraeační ehromatografie a popřípadě

Cviii) enzymatická nebo chemická deglykosyláce vyčištěného proteinu.

Uvedené stupně způsobu podle vynálezu zaručují, že protein podle vynálezu lze získat s takovou vysokou biologickou enzymovou aktivitou- Vynález se proto týká proteinu majícího biologickou aktivitu hyaluronidázy, která není ovlivněna ve své účinnosti heparinem a má molekulovou hmotnost 53 až 60 závislou na glykosylaci, která je získatelná způsobem podle vynálezu a která má specifiskou enzymovou aktivitu vyšší než 100 U/mg proteinu. Pojmem jednotka se míní mezinárodní jednotka CU).

Vynález se týká způsobu přípravy rekombinantní mannillázy, který obsahuje příslušné molekuly DNA, vektory a transformované hostitelské buňky. Vynález se tedy týká sekvence DNA kódující protein mající vlastnosti nativní mannillázy. Doložilo se, že by mohly být vybrány alespoň tři další klony s mírně odlišnými sekvencemi DNA, které kódují proteiny s vlastnostmi manillázy Chyaluronidázy) mající mírně odlišnou sekvenci aminokyselin.

Specifické klony nají sekvence DNA vyznačené na obr. 8, 9 a 10 (horní sekvence), které jsou také předmětem vynálezu stejně jako expresní vektory obsahující uvedené sekvence a hostitelské buňky transformované těmito vektory.

Vynález se kromě toho týká rekombinantního proteinu s biologickou aktivitou hyaluronidázy a s molekulovou hmotností 55 až 59 kD, v závislosti na glykosylaci, mající sekvence aminokyselin vyznačené na obr. 8, 9a 10 (dolní sekvence) nebo sekvenci, která je homologická s těmito sekvencemi nejméně z 80 %. Pojem manilláza zahrnuje všechny tyto proteiny mající shora uvedené vlastnosti.

Nativních nebo rekombinantních proteinů se může používat jako léčiva, které lze pacientům podávat přímo nebo ve formě farmaceutických prostředků. Vynález se tedy týká také shora definovaných rekombinantních nebo nativních proteinů obsahujících uvedený protein, aplikovatelných jako léčivo, a příslušných farmaceutických prostředků obsahujících uvedený protein a k tomu farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo excipient.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou obsahovat přídavně velmi rozmanité farmaceutické látky. Výhodná jsou antikoagulační činidla, která nebrání nebo neovlivňují biologickou a farmakologickou aktivitu proteinu podle vynálezu. Takovými antikoagulačními činidly mohou být například heparin, hirudln nebo dikumarin, s výhodou heparin. Vynález tedy poskytuje farmaceutický prostředek obsahující přídavně farmakologicky účinnou sloučeninu, s výhodou heparin.

V rámci humánní a veterinární terapie působí protein podle vynálezu s výhodou jako dispergační činidlo (rozptylový faktor) nebo podporuje pronikání tkání a pokožkou. Manillázy je tedy možno používat jako adjunktu ostatních látek (jako

- 8 jsou lokálmí anestetika), například v chemoterapii nádorů, k léčení poruch a chorob s ohledem na akutní myokardiální ischemii nebo infarkci, k léčení zeleného zákalu a ostatních očních poruch, například ke zlepšení oběhu fysiologických tekutin v oku, k léčení pokožkových a tkáňových štěpů k odstranění srážlivosti a zlepšení oběhu, jako systému k dodávání drogy pokožkou, membránami, jinou tkání a jako činitele k odstraňování kapes hialuronové kyseliny obklopující určité patogenní mikroorganismy nebo některé nádory a rakovinné tkáně a jako inhibitoru angiogenese, kterého lze použít jako protithrombotického a protinádorového činidla.

Vynález se proto týká použití manillázy definované podle vynálezu k výrobě léčiv k léčení obzvláště myokardiálních, kardiovaskulárních a thrombotických poruch a nádorů.

Výryzem “farmaceuticky přijatelný nosič se vždy míní nosič inertní netoxické pevné nebo tekuté plnidlo, ředidlo nebo zapouzdřující materiál nereagující nepříznivě s účinnou látkou nebo s pacientem. Vhodné, s výhodou tekuté nosiče jsou v oboru známy- příkladně se uvádějí sterilní voda, solanka, vodná dextróza, cukerné roztoky, ethanol, glykoly a oleje, včetně olejů minerálního, živočišného nebo rostlinného původu například podzemnicového, sojového a minerálního oleje.

Prostředky podle vynálezu se mohou podávat v jednotkových dávkách obsahujících obvyklé netoxické, farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, adjuvanty a nosiče, které jsou typické pro parenterální podávání.

Výrazem parenterální se vždy míní subkutánní, intravenozní, Intraartikulární a intratracheální injekční a infusní techniky. Vhodná jsou také jiná podání, jako orální a topické. Parenterální prostředky a kombinace se nejvýhodněji podávají intravenozně bud' ve formě bolusu nebo jako konstantní infúze známými způsoby. Tablety a kapsle k orálnímu podání obsahují konvenční excipíenty jako jsou pojidla, plnidla, ředidla, tabletační činidla, mazadla, rozpadává činidla a smáčedla. Tablety mohou být povlečené způsoby známými v oboru.

Tekuté prostředky k orálnímu podání mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů nebo elixírů nebo se mohou podávat jako suchý produkt ke smísení s vodou nebo jiným vhodným nosičem před použitím. Takové tekuté prostředky mohou obsahovat běžné přísady, jako jsou suspenzační, emulgační činidla, nevodné nosiče a konzervační přísady. Topické aplikace mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, želé nebo s výhodou emulzních mastí.

Jednotkové dávky podle vynálezu mohou obsahovat denní potřebná množství proteinu podle vynálezu, nebo jejich podíly k vytvoření potřebné dávky. Optimální terapeuticky přijatelná dávka nebo dávkovači míra pro jednotlivé pacienty (savce včetně lidí) závisí na mnoha činítelech, jako je účinnost určité použité účinné látky, věk, tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví, dieta, čas a cesta podání, rychlost vymizení, aktivita enzymu (jednotek/mg proteinu), léčená nemoc, například terapie nebo profylaxe a povaha léčené choroby.

Proto v prostředcích a kombinacích například s antikoagulanty, jako je heparin k léčení pacienta (in vivo), je farmaceuticky přijatelná dávka proteinu podle vynálezu (manillázy) přibližně 0,01 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti (v závislosti na specifické aktivitě 100 kU/mg), s výhodou 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Jednotková dávka podle vynálezu může obsahovat 0,5 až 10 mg manillázy.

Množství například popřípadě heparinu podávaného spolu s manillázou je na den 500 až 4000 U (IU), může však být popřípadě zvýšena nebo snížena10

Čištění manillázy podle vynálezu je podrobně popsáno v příkladech. Tabulka I obsahuje schéma preparativního čištění maní liazy. V tabulce II je zachycen způsob obohacování proteinu podle vynálezu a tabulka III obsahuje porovnání manillázy se známými hyaluronidázami z pijavek.

Enzym zvaný manilláza, štěpící hyaluronovou kyselinu, byl izolován z hlav pijavek Hirudinaria manillensis a vyčištěn do homogenity. Tato hyaluronidáza se čistí použitím kyselinové extrakce, vysrážením síranem amonným, následovaným postupnou chromatografií na sloupcích katexu Concanavalin A-Sepharosa, Propyl-Fractogel, Hyaluronanové fragraenty-Sepharosa a DiolLiChrospher. Hialuronové fragmenty se připraví rozštěpením nativního hyaluronanu s pomocí hyaluronidázy hovězích varlat. Po vyčištění a charakteristice fragmentů se připraví afinitní matrice, jak uvedeno dále. Takových afinitních matric je poprvé použito k čištění hyaluronidázy. Tato vysoce výkonná chromatograf ie je technikou k rychlému a účinnému vyčištění proteinů vázajících hyaluronan. Výtěžek enzymové aktivity je po každém stupni čištění dostatečně vysoký. Výsledky tří nezávislých preparativních čištění jsou porovnatelné. Jejich výsledkem jsou vysoce aktivní vzorky obsahující 20 až 160 kU/mg v závislosti na stupni vyčištění- V porovnávacích pokusech se izolují známé hyaluronidázy podle dosavadního stavu techniky a jejich vlastnosti se porovnávají s proteinem podle vynálezu (tabulka III).

Hialuronidázy vyčištěné způsobem podle schéma uvedeného v tabulce I se liší od jiných pijavkových hyaluronidáz popsaných jinými autory. Podobných molekulových hmotností bylo dosaženo. za nedisociačních podmínek (každý β-merkaptoethanol), což naznačuje, že manilláza je jediným podjednotkovým enzymem v porovnání se širokým oborem hyaluronidázových prostředků ze savčích zdrojů. Tento konečný prostředek je samostatný podjednotkový enzym (obr. 1) se zdánlivou molekulovou hmotností 58 ± 2 stanovenou pomocí MALDI, s isoelektrickým bodem 7,2 až 8,0.

Tabulka I

Preparativní čištění maní liazy

Příprava výchozího materiálu pijavky z Bangladéše, přibližné 15 kg i

Separace živých živočichů zmrazení těchto živočichů i

příprava hlaviček

- 1 kg Ihlaviček pijavek

Con A- afinitní chromatografie dialýza χχχχ j i

Propy-Fraktogelová chromatografie ____ dialýza χχχχ_

Fragmenty hyaluronové kyseliny (HA)-^! afinitní chromatografie dialýza χχχχ 4D i o1-Ličhrospher dialýza χχχχ 7

-> 140 000 WHO jednotek

Reverzní fázová chromatografie analytickáxxxxx -- -—- —

Tabulka II

Čuštění manillázy (obohacování) z 1 kg hlaviček pí lávek

Stupeň čištění	Protein celkea ng	Aktivita celková kU	Výtěžek t i	Specifická aktivita ll/og	Vyčištění, násobek
Stupeň I supernatant po extrakci a vysrážení kyselinou	31 700	633,3	100	20	1
Stupeň II supernatant po vysrážení síranea anonnýa	9 530	443,3	70	45	2,25
Katexová chroeatoaraf ie	426,7	332,5	52.5	770	38.5
Con A afinitní chroraatografie	41.0 Z	1662 Z	26,2	4,000	200
Chronatograf ie PropyI-Fraktogel	11,9	133;0	21,0	11 000	550
Afinitní chromatografie fraguenty hyaluronové kyseliny-Sepharose	1,9	66,4	10,5	35 000	1750
Diol-LiChrospher	0307 /	332	5,2	108 000	5 400

• ·» ·· · • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ······ ·· ···

Tabulka III

Srovnání manillázy se známými pijavkovými hyaluronidázami

	Manillase Hirudinaria manillens. podle vynálezu	Hvaluronidase H. medicinalis srovnávací příklad	Hvaluronidase H. medicinalis Linker et aL; (J.BioLChem, 1960)	Oreelase P. granulosa EP 0 193 330 Budds et al.
specifická 'aktivita WHO(IU) U/mg	140 000	-20 000 semičištěno	<100	<100
homogenita SDS-PAGE MALDI	1 protein homogenní 4 glykoforray	směs proteinů	nejsou dostupné žádné výsledky	směs četných proteinů hlavní nečíst hemoglobin
molekulová hmotnost	58JkD±2kD	n. d.	nesděleno	28^±3kD
aminokyselinová sekvence	determined	n. d.	nesděleno	nestanoveno
pH optimum	6.0-7.0	6.0-7.0	nesděleno	5 J - 6.0
pí	7.5 - 8,0	n. d.	n. d.	n. d.
hydrofobicita	vazba na na PropylHIC při 2 M amoniumsulfátu	žádná vazba na PropylHIC při 2 M amoniumsulfá	tu
aktivita snížení heparinea	bez vlivu	nestanoveno	bez vlivu	bez vlivu

Stabilita při +4 C stálá po 7 dnech — 75% zacho- ned vale aktivity nestálá 100% ztráta aktivity po 7 dnech i nkubace při +37°C stálá po 7 dnech z-v- 60 % Zachovalé aktivity nestálá 100% ztráta aktivity po 7 dnech inkubace poměrně stálá stabilita při +37 C v přitom, nosti psího séra stálá po 7 dnech —100% Zachovalé aktivity nestálá 100% ztráta aktivity po 7 dnech inkubace nesděleno netestováno · ti

Hvězdičky v tabulkách znamenají informaci o stanovení aktivity a biochemické charakterizace (x-xxxxx).

Použité způsoby stanovení aktivity a biochemické charakterizace závisejí na koncentraci manillázy v analyzovaných vzorcích. Proto byly postupně rozšiřovány vhodnými technikami v následujících stupních čištění:

x - stanovení aktivity - test snížení zákalu xx - stanovení aktivity - test snížení zákalu

- stanovení obsahu proteinu (E28O, způsob Pierce BCA)

- SDS-PAGE (SDS-Polyakrylamid Gel Electrophoresis)

- stanovení hemoglobinu xxx - stanovení aktivity - test snižení zákalu

- stanovení obsahu proteinu (Ε28Ο» způsob Pierce BCA)

- SDS-PAGE-Western Blot (antilidská hemoglobinová protilátka) xxxx - stanovení aktivity - test snížení zákalu

- stanovení obsahu proteinu (E28O, způsob Pierce BCA)

- SDS-PAGE-Western Blot (antilidská hemoglobinová protilátka)

- SDS-PAGE-Western Blot protilátky anti Con A

- SDS-PAGE-Western Blot antipeptidových protilátek xxxxx - MALDI

- stanovení obsahu proteinu (způsob Pierce BCA)

- SDS-PAGE-Western Blot - antipeptidové protilátky

Vazba manillázy na Concanavalin A ukazuje, že tato hyaluronidáza je glykoproteinem, jehož cukerné složky jsou zakončeny a-D-mannopyranosylem nebo α-D-glukopyranosylem a stericky odvozenými zbytky. Máni 1lázou-aktivované vzorky vykazují dva pruhy s téměř stejnými hodnotami RF v SDS-PAGE. K lepšímu oddělení pásů se použije delší SDS-PAGE a různých provozních podmínek. Při těchto pokusech bylo možno zjistit dva další slabší pruhy (obr.2). Jejich N-koncová část všech (30 aminoky15 selin) byla Individuálně sekvencována a opět neukázala žádný rozdíl v N-konci. Po deglykosylaci endo F-glykosidázou CNPGase) se zjistilo, že všechny čtyři pruhy vytvořily jediný pruh se snížením MV o přibližně 3. Proto je dosti pravděpodobné, že pozorované rozdíly elektroforetické mobility jsou způsobeny rozdíly v glykosylačním obrazci molekul manillázy. Neuroaminidáza, O-endoglykosidáza a neuraminidáza plus O-glykosidázové zpracování nemají vliv na molekulovou hmotnost vyčištěného enzymu (obr. 3). Tyto výsledky ukázaly, že manilláza obsahuje alespoň jeden N-řízený oligosacharidový řetězec. O-Rízené karbohydrátové řetězce nebylo možno použitým způsobem zjistit.

Jako závěrečná čisticí operace byla provedena RP-chromatografie. Ačkoli enzymatická aktivita už nemohla být prokázána, mohly být soli a inhibitory peptidové proteázy odstraněny Cobr. 4). Frakce, obsahující protein, byly charakterizovány dále pomocí MALDI. Molekulová hmotnost manillázy, stanovená pomocí MALDI, je 58,3.

Heparin nemá vliv na aktivitu hyaluronidázy (obr. 5). Manilláza je mnohonásobně stabilnější než Hirudo medicinalis hyaluronidáza Cobr.6). Kromě toho vykazují vzorky částečně vyčištěné manil lázy velmi vysokou stabilitu v plasmě psfi a krys v rozmezí -20 až + 37.

Příprava Ha-afinitních matric byla popsána v literatuře CTengblad A., Biochim. Biophys. Acts 578, str. 281 až 289, 1979). HA-matrice se použilo k čištění proteinfl vázajících kartilážhyaluronáty nebo proteglykanprotein-keratansulfátového jádra (Christner J.E., Anal . Biochem. 90, str. 22 až 32, 1978) ze stejného zdroje. HA-vázaného proteinu CHABP), vyčištěného pomocí této afinitní matrice, se použilo dále v histochemických studiích týkajících se rozdělení hyaluronátových receptorů CGreen S.J. a kol., J. Cell Science 89, str. 145 až 156, 1988; Chán F.L. a kol., J. Cell. Biol. 107, str. 289 až 301, «« «· · ·· »· ··· · · · · · ····· · · · • · · « · · · · · •« ·« ······· · · ···

1997) nebo hyaluronanu (Valdenstrom A. a kol.,J. Clin. Invest. 88, str. 1622 až 1628, 1991; Valdenstrom A. a kol., Eur. J. Clin. Invest. 23, str. 277 až 282, 1993) ve tkáních.

Avšak způsob přípravy tohoto gelu, vyvinutý v autorově laboratoři, umožňuje vyrábět gely s přesně definovanou koncentrací Ha-fragmentů ¢1 až 15 mg/ml). To umožňuje používat těchto gelů nejenom k čištění proteinů vázajících hyaluronan, ale také k jejich separaci s využitím jejich různé afinity k hyaluronanu. Tato selektivní separace může být řízena pomocí HA-fragmentů různé délky. Taková separace umožňuje lepší charakterizaci mnoha receptořů biologicky závažných Cnapříklad v onkologi i).

HA-matric připravených způsobem podle vynálezu je možno použít

1) k čištěšní známých HA-vázajících proteinů

2) k čištění neznámých HA-vázajících proteinů

3) k identifikaci nových HA-vázajících proteinů

4) k čištění hyaluronidáz.

HA-Fragmenty, získané způsobem podlo vynálezu, mohou být charakterizovány pomocí moderních analytických metod (NMR, MALDI-MS) a lze jich použít k výzkumu vzájemných interakcí proteinů. Kromě toho je možno těchto fragmentů použít ve výzkumech týkajících se angiogenese a neovaskularizačních procesů.

Seznam obrázků na výkresech

Na obr.l je gelová elektroforéza SDS- polyakrylamidu (SDS PAGE - vybarvení CBB) proteinového standardu, maní 1lázového vzorku (po chromatografi i Diol-LiChrospher)

1- proteinový standard velkého rozsahu

2- manilláza 4 pg • · 9 » » 9 · l »999

3- orgeláza 6 ng

4- hemoglobin 40 pg

Na obr. 2 je a) SDS-PAGE (vybarvení CBB) b) SDS-PAGE -Western blot čtyř manillázou aktivovaných vzorků (řádek 3 až 6) po HA-afinitní chromatografi i. V tomto pokusu je použito králičí P3-2A polyklonální antipeptidové protilátky.

Na obr. 3 je SDS-PAGE (vybarvení CBB) těchto vzorků:

1- LW-MM- markér s nízkou molekulovou hmotností (BioRad)

2- manilláza

3- N-glykosidáza F (PNGase F)

4-	maní 1láza	PO	zpracování	PNGase F
5-	mani 1láza	PO	zpracování	0-g1ykos i dázou
6-	mani 1láza	po	zpracování	O-glykosidázou a neuraminidázou

7- 0-glykosidáza a neuraminidáza

8- markér molekulové hmotnosti (MWM prestained BioRad)

Na obr.4 je chromatografie reversní fáze

a) ribonukleázového standardu

b) vzorku manillázy (specifická aktivita 140 kU/mg)

Na ose x je vždy retenční doba v minutách, na ose y intenzita v 9 U.

Na obr.5 je vliv heparinu na hyaluronidázovou aktivitu manillázay (čára s prázdným kolečkem) a hyaluronidázy z býčích varlat (čára s plným kolečkem).

Na ose x je IU heparin, na ose y je % zbylé aktivity

Na obr.6 je měření stability hyaluronidáz v pufru a v plasmě:

a) manilláza (4 C) (čára s plným kolečkem v pufru, čára s plným trojúhelníčkem ve plasmě)

b) manilláza (-20 °C) (čára s plným kolečkem v pufru, čára s plným trojúhelníčkem ve plasmě)

c) manilláza (37 °C) (čára s plným kolečkem v pufru, čára s plným trojúhelníčkem ve plasmě)

d) hyaluronidáza z býčích varlat (Y) a hyaluronidáza Hirudo medicinalis (A) (čára pro A s plným kolečkem v pufru, čára pro A s plným trojúhelníčkem ve plasmě, čára pro Y s plným čtverečkem v pufru, čára pro Y splným kosočtverečkem ve plasmě,

Na ose x jsou vždy dny inkubace, na ose y jednotky WHO (IU)

Na obr.7 je sekvence aminokyselin nativní manillázy získaná sekvencováním izolovaného a vyčištěného proteinu z Hirudinaria manillensis podle vynálezu (odpovídá SEQ ID No.l)

Na obr. 8 jsou sekvence nukleotidu (horní čáry) a aminokyselin rekomblnantního klonu manillázy (klon 21); (odpovídá SEQ ID No. 2, 3)

Na obr.9 jsou sekvence nukleotidu (horní čáry) a aminokyselin rekombinantního klonu manillázy (klon 31); (odpovídá SEQ ID No. 4, 5)

Na obr.10 jsou sekvence nukleotidu (horní čáry) a aminokyselin rekombinantního klonu manillázy (klon 31); (odpovídá SEQ ID No.

6,	7)
Na	obr.	11	je
Na	obr.	12	je
Na	obr.	13	je
	Vynález

Na obr. 13 je kvasnicový expresní vektor pro manillázu klady praktického provedení. Není-li uvedeno jinak, používá se standardních způsobů známých ze stavu techniky a obecně dostupného materiálu.

« » *

»44 ·* 4 •» r · · ··· • · · λ a • · · 4 · »·»··»» 4 4 ·»·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 (Obecné poznámky)

Četné předběžné pokusy se provedly za pomoci surových extraktů Hirudinaria manillensis k zavedení způsobu čištění. Byly zvoleny a ověřeny následující způsoby: způsob vysrážení síranem amonným, katexová a anexová chromatografie, aflnitni chromatografie s pomocí látek Heparin-Fractogel, Con-A sefaróza, hydrofobní interakční chromatografie (HIC) na oktylsefaróze, propylfraktogelu, fenylfraktogelu, butylfraktogelu, preparativní isoelektrické zaměření a preparativní elektroforéza. Výsledky potvrzují, že kyselinové a amoniové vysrážení, katex, Con-A sefaróza, propylfrakrogel (HIC), Diol-LiChrospher a chromatografie fragmenty kyseliny hyalurové-Sefarózy (HA-Sepharose) jsou vhodné k čištění manillázy. Matrice HA-sefarózy, připravené v autorově laboratoři, bylo s úspěchem použito k čištění této glykosidázy. Všechny přípravy se provádějí za studená, pokud není uvedeno jinak. Čištění se provádí podle schéma uvedeného shora (Tabulka I).

Příklad 2

Příprava výchozího materiálu pro čištění; příprava hlav pijavek

Z Bangladéše přivezené pijavky Hirudinaria manillensis se okamžitě zmrazí a uloží při teplotách -40 až -80 C. Ve zmrazeném stavu se zbaví hlav, přičemž hmotnost hlavy je přibližně 5 % hmotnosti těla.

Příklad 3

Extrakce manillázy z hlav pijavic

* u		o·	e a*		AA		9
•	•	«		9		A	9 ·
•	•	• 4«	9 9	9		9	9
•
•	a	• ·	• *	9		9	<*
99		A A	»AA ♦·*·		9 A		9 9

Při reprezentativním čištění se 1 kg mražených hlav pijavek homogenizuje v mísiči Varing Blender s 2500 ml studené O,1M kyseliny octové jako pufru s hodnotou pH 4,0, obsahující 0,025 % thimerosalu a 16 mg/ml trehalózy (Merck KGaA, Art.No. 1.08216). Homogenní směs se mírně míchá a bezprostředně se přidají následující inhibitory proteázy:

1. PMSF

2. Leupeptin

3. Pepstatln A

4. EGTA

5. p-APMSF

1,7 mg/ml 10,0 pg/ml 0,7 pg(ml 380,35 pg/ml 40,00 pg/ml

10,0 mM 20,0 pM 1 pM 1,0 mM 20,0 pM

V míchání se pokračuje 4 hodiny za studená a odstředění při 4900 otáčkách za minutu trvá 20 minut. Supernatantní roztok (supernatant I) se shromáždí a smísí se supernatantem II následně získaným extrakcí tkáňových pelet. Spojené supernatanty představují materiál stupně I.

Souhrnně proces znázorňuje následují schéma:

Výchozí materiál - h1avy pijavic homogen i zace extrakce I* vysrážen í kyše1 i nou í

odstředění /

supernatant I* dialýza χ (odsolení) supernatant II* \

peleta extrakce II* vysrážen í kyše1 i nou

I odstředění / \

peleta (vyhozeno) « · χ Stanovení aktivity a biochemická charakterizace vzorků se provedou pomocí testu snížení zákalu a stanovení obsahu proteinu CE28O metodou Pierce BCA, SDS-PAGE). V homogenizátu pijavek není možno změřit aktivitu enzymu vzhledem k velmi vysokému obsahu hemoglobinu (měřeno soupravou Merck KGaA 13851 ke stanovení hemoglobinu) a jiných proteinů. Kromě toho není možno měřit aktivitu hyaluronidásy ve stavu před vysrážením kyselinou. Konečné specifické aktivity (aktivita na gram proteinu) těchto extraktů je přibližně 10 až 30 jednotek WHO. Podle SDS-PAGE obsahují surové extrakty velká množství různých proteinů, z nichž hlavní mají molekulové hmotnosti přibližně 120, 55 až 60, 45, 31, 28, 22, 15 a 14 až 10.

Příklad 4

Způsob vysrážení materiálu stupně I síranem amonným

Zkoumá se způsob vysrážení síranem amonným jako první krok čištění manillázy, při kterém dochází k přibližně 5-násobnému obohacení tohoto enzymu.

Enzymaticky inertní materiál se vysráží ze surových extraktů stupně I pomalým přidáváním síranu amonného (Merck kGaA) do o

36% hmotnost/objem při teplotě +4 C. Tato směs se míchá jednu hodinu a odstředí se. Sraženina se vyhodí. Supernatant se dialyžuje oproti tekoucí vodě přes noc a 24 hodin proti 20 mM fosfátovému pufru s hodnotou pH 6,0. Konečné specifické aktivity těchto extraktů jsou přibližně 40 až 150 jednotek WHO. Podle SDS-PAGE obsahují extrakty stupně II velká množství různých proteinů.

Příklad 5

Katexová chronatografie

Katex se použije způsobem absorpce po dávkách. Přes noc se inkubuje enzymem bohatý dialyžovaný vzorek (stupeň II) spolu s 1 litrem katexu EMD S0₃ ^_ 650 (S), Merck KGaft, druh č. 16882. Po ukončení inkubace odstředěním se katex promyje pufrem, odstředí se znovu a sloupec vysoce výkonně HPLC se naplní gelem. Po promytí sloupce použitím 20 mM fosfátového pufru pH 4,9 se vázané proteiny ze sloupce eluují stejným pufrem fosforečnanu sodného pH 6,0, obsahujícím lineární gradient O až 1M chloridu sodného- Frakce se odebírají každé 3 minuty (9 ml) a absorbance se sleduje při 280 nm. Manilláza se eluuje při koncentracích chloridu sodného 0,15 až 0,18 M. Měří se aktivity a obsah proteinu všech frakcí a frakce se shromáždí a dialyzují se přes noc proti 20 mM fosfátovému pufru pH 6,0 obsahujícímu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy.

Stanoví se koncentrace proteinů, specifické aktivity shromážděných frakcí a provedou se analysy SDS-PftGE. Přes velmi dobré výtěžky (aktivity) a vysokou specifickou aktivitu (jednotky aktivity WHO na mg proteinu odpovídají IU) výsledky analýz SDS-PftGE vzorků ukazují stále směs mnoha proteinů. Katexovou chromatografií za použití Fractogelu EMD S0₃~650 (S)^R (Merck KGaft, Německo) se dosahuje velmi vysoký stupeň čistoty přibližně 10 až 50. Tento stupeň velmi účinně snižuje hemoglobinové nečistoty. Kromě toho se zjistilo, že postup po dávkách je velmi užitečným výchozím krokem ke zvládnutí velkých množství supernatantu stupně II (5 až 16).

Příklad 6 ftfinitní chromatografie Concanavalin fl-Sefarózy • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · •· ·· ···«···

Enzymem bohaté shromážděné frakce po zpracování katexem se dále čistí afinitní chromatografií za použití Con A lektinu. Obchodně dostupná Con-A-Sefaróza^B (Pharmacia Biotech, Art 17-0440-01) se promyje octovým pufrem 0,1 M + 0,5M NaCl pH 8,0, 0.1M kyseliny borité + 0,1 % Tritonu xlOO pH 6,0 a nakonec 0,1 M octovým pufrem + 0,5M NaCl, pH 6,0. Vzorek se dialyzuje pres noc proti 20 mM octového pufru + 0,5 mM NaCl + lmM CaCl2⁺ lmM MgCl2 pH 6,0 + 1 mM MnCl2 při teplotě místnosti za nanesení na sloupec 1000 ml Con A a eluuje se dvě hodiny 510 ml 100 mM kyseliny octové jako pufru + 0,5 M NaCl + 1 mM CaCl2 + lmM

MgCl2, pH 6,0 + lmM MnCl2- Následuje desorpce za použití stejného pufru obsahujícího 0,5 M methyl-α-D-mannopyranosidu. Eluce se průběžně sleduje při 280 nm. Shromážděné 3 ml frakce se zkoumají z hlediska aktivity hialuronidázy. Aktivní frakce se shromáždí a dialyzují se přes noc proti 20 mM fosfátovému pufru pH 6,0 obsahujícímu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy. Provede se stanovení koncentrace proteinů, specifických shromážděných aktivit a analysa SDS-PAGE. Tento stupeň je velmi účinný z hlediska odstranění zbytků hemoglobinu. Chromatografií Con A se dosáhne 4 až 10 čisticího faktoru. Tento faktor se mění podle kvality výchozího materiálu.

Příklad 7

Propylfraktogel hydrofobní interakční chromatografie

Do hlaluronidázou aktivních sebraných Con A se přidá síran amonný na konečnou koncentraci 2M. Vzorky se inkubují jednu hodinu při teplotě místnosti se 150 ml Propyl-Fractogelu EMD Propy1 650 (S)^a, Merck KgaA, Německo, druhové číslo 1.10085, vyváženým 0,lM fosfátovým pufrem pH 7,0, obsahujícím 2M síranu amonného. Po ukončené inkubaci se gel promyje dvakrát tímtéž pufrem a připraví se sloupec (2,6 x 60 cm) vysoce výkonné HPLCVázané proteiny se eluují 0,1 M fosfátovým pufrem, pH 7,0. Každé 3 minuty se odebírají 6 ml frakce, přímo se dialyzují » * proti deionizované vodě (2 až 3 hodiny) a pak proti 20 mM fosfátovému pufru, pH 6,0. Frakce se zkoumají z hlediska aktivity hialuronidázy. Aktivní frakce se shromáždí a dialyzují se pres noc proti 20 mM fosfátovému pufru, pH 6,0, obsahujícímu azid sodný a 1? mg/ml trehalózy. Stanoví se protein a aktivita shromážděných frakcí.

Čisticí faktor tohoto chromatografického stupně je přibližně 3 až 5. Malé množsatví Con A, uvolněné z nosičového gelu v předchozím stupni, se odstraní spolu s ostatními prote i novým i nečiš totam i.

Příklad 8

Příprava afinitního sloupce oligosacharidu hialuronové kyseliny

a) Hydrolysa hialuronanu (HA) hialuronidázou z býčích varlat

Rozpustí se hialuronová kyselina, 7 g ve 1,25 1 0,1 M pufru octanu sodného obsahujícího 0,15 chloridu sodného a 0,5 o

mM EDTA, pH 5,2 mícháním přes noc při teplotě 4 C v přítomnosti toluenu. Nastaví se hodnota pH roztoku obsahujícího HA o

na 5,2 a po ohřevu na teplotu 37 C se přidá hialuronidáza z býčích varlat (Merck KGaA, 700 WHO jednotek/mg). Na 7 g HA se použije 210 mg enzymu rozpuštěného bezprostředně před použitím v 50 ml uvedeného pufru. Hydrolyza se nechá probíhat o

minut při teplotě 37 C za stálého míchání a ukončí se pěo timinutovým ohřevem na teplotu 100 C v lázni vroucí vody. Reakční směs se vyčeří 30-minutovým odstředěním při 10 000 g, denaturovaný protein obsahující sraženinu se odstraní a supernatant se zfiltruje přes 0,2 pm filtr s předřazeným filtrem ze skleněných vláken. Vyčeřený roztok obsahující, HA oligosacharidy (HAOS), se frakcionuje filtrací přes tři ultrafi 1trační membrány Diaflo (Amicon) s dále uvedenými hodnotami různých • · • * · · * «· • · « · · · · ··· ····· » · · t>

····· · · · · i ···· ·· ·· * · · · «······ · « « molekulárních rezfi.

b) Frakcionace HAOS ultrafiltrací

Roztok obsahující HAOS z předchozího stupně se filtruje přes ultrafiltrační membránu 30 YM Diaflo. Zbytek na filtru se zachová k dalším studiím, zatím co filtrát se podrobí druhé ultrafiltraci přes ultrafiltrační membránu 10 YM Diaflo. Zbytek na filtru se opět zachová k dalším studiím, zatím co roztok, prošlý membránou 10 YM, se podrobí poslední ultrafiltraci přes ultrafiltrační membránu 3 YM Diaflo. Nato se zbytek na filtru obsahující HAOS, přibližně 10 ml roztoku, použije k dalšímu čištění. Tato frakce: HAOS 3-10 se dále čistí a použije se ke kopulaci na Sefarózu.

c) Čištění HAOS 3-10

HAOS 3-10 se čistí (odsoluje) na sloupci Biogel P2^R. Tento sloupec (4x100 cm) se naplní mediem Biogel 2^R 200-400 mesh (BioRad) a promyje se 5 objemy sloupce vodou (Milli Q, Millipore). Frakce 3-10 HAOS, získaná v předchozím stupni (15 ml, 1,5 g oligosacharidů), se nanese na tento sloupec. Sloupec se eluuje vodou, shromáždí se 15 ml frakce a analyzují se na obsah oligosacharidů HA. 01igosacharidy obsahující frakce, eluované před solemi (soli se zjišťují dusičnanem stříbrným) se spojí a znovu se zkoncentrují na membráně 3 YM Diaflo.

d) Analýza HAOS 3-10

Ke zjištění kopulační účinnosti Sefarózy se promyje gel (stejné dávky) a susapenduje se ve vodě k přípravě 50% suspenze. Ze suspenze Sefarózového konjugátu HAOS 3-10 a ze Sefarózy použité jako kontroly, se třikrát odeberou 100 pl podíly a přidají se do 2,5 ml 2,2 N trifluoroctové kyseliny (TFA, Merck KgaA) v teflonové zkumavce se šroubovým uzávěrem. K hyd26 • · « · rolýze se směs propláchne argonem a inkubuje se 16 hodin při teplotě 100 °C. Na konci hydrolýzy se vzorky vysuší v prostředí dusíku, resuspendují se ve vodě a použije se jich ke stanovení glukosamidu a uronové kyseliny. Ke stanovení rozsahu rozkladu uronové kyseliny a glukosáminu pro každou hydrolýzu, se zařadí kontrolní vzorky obsahující známá množství UA a GlcNAc a inkubují se za totožných podmínek.

Za shora popsaných podmínek se kopuluje 5, 8, 9, 11 a 15 mg HAOS 3-10 na 1 ml vysušeného Sefarozového gelu ve dvou nezávislých testech. Tyto výsledky jsou založeny na UA a glukosám i nových testech.

e) Použité testy

Obsah uronové kyseliny v analyzovaných vzorcích se stanoví způsobem známým z literatury (Bitter T. a Muir H.M., Anal. Biochem. 4, str. 330 až 334, 1962. Množství hexosaminu se zjištuje způsobem, který popsali Rondle C.J.M. a Morgan W.T.J. (Biochem. J. 61, str. 586 až 593, 1955).

Příklad 9

Chromatografie sefarózových fragmentů hialuronové kyseliny (HA-Sefarózová chromatografie)

Připraví se chromatografické matrice obsahující 8 až 10 mg/ml. Vzorek, obsahující enzym, se dialyzuje proti 20 mM octovému pufru + 0,15 M NaCl, pH 4,0 a nanese se na sloupec 25 ml HA-Sefarózy. Po promytí tímtéž pufrem se eluuje 20 mM octovým pufrera s 0,15 až 1M gradientem NaCl. Ke stanovení aktivity hialuronidázy se testují 1 ml frakce, shromáždí se, dlalyzují se přes noc proti 20 mM fosfátovému pufru, pH 6,0, obsahujícímu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy. Stanoví se protein a aktivita sebraných frakcí. Čisticí faktor chromatografického stup27 • · • · ·

ně je přibližně 3.

Příklad 10

Diol-LiChrosferová chromatograf ie

Na Diol-LiChrosferový sloupec se nanese 20 ml aktivního vzorku dialyzovaného proti MÍIIÍ-Q-H2O. Sloupec se pak vyváží 15 ml MHII-Q-H2O a promývá se 5 minut 2 ml vody. Provede se 15-minutová eluce aktivního vzorku 20 mM octovým pufrem pH 5,9 (gradient O až 5 mM NaCl) a 35 minut gradientem 20 mM až 100 mM kyseliny octové jako pufru, pH 5,5, obsahující 5 mM NaCl. Frakce se zkoumají z hlediska aktivity hialuronidázy. Aktivní frakce se spojí a dialyzují se přes noc proti 20 mM fopsfátovérau pufru, pH 6,0, obsahujícímu azid sodný a 17 mg/ml trehalózy. Stanoví se protein a aktivita sebraných frakcí. Čisticí faktor chromatografického stupně je přibližně 3.

Příklad 11

Chromatografie RP18e

Tohoto čisticího stupně se může použít pouze jako posledního a záměrem je získat vzorek oproštěný od solí a jiných proteinových nečistot (například inhibitorů peptidové proteázy). Aktivita hialuronidázy je úplně ztracena, jelikož manilláza není odolná vůči organickým rozpouštědlům používaným v tomto stupni. Manillázový vzorek se nenese na sloupec RP 18e. Shromáždí se frakce 0,25 ml/min. Eluce probíhá v přítomnosti 0,1¾ TFA a použije se gradient vody až 99¾ acetonitrilVzorků', vyčištěných RP, se může použít přímo k sekvencování aminokyselin, k měření MALDI, k analýzám karbohydrátové struktury a jako standardu k čištění jiných dávek manillázy.

• · · ·

Příklad 12

Stanovení aktivity - test snížení zákalu

Aktivita hialuronidázy se stanoví měřením snížení zákalu. Obchodně dostupných přípravků hyaluronanu (izolovaných z různých živočišných tkání a tekutin, například z lidské míchy, z kohoutího hřebínku) a hialuronidáz (endo-p-glukosaminidáz z býčích varlat., z kančích varlat., ze včelího jedu; lyáz ze Streptomyces hialurolyticus) se použije ke stanovení vhodných podmínek pro zkoušku aktivity. V autorově laboratoři se částečně vyčistila endo-íS-glukuronidáza z Hirudo médieinal 1 is.

Zásobní roztok hyaluronanu (koncentrace 2 mg/ml) se připraví rozpuštěním HA v 0,3 M fosfátovém pufru, pH 5,3. Roztok se zředí stejným pufrem na koncentraci 0,2 mg/ml těsně před testem. Vzorky, obsahující enzym, se zředí na vhodné množství enzymu (0,5 až 5 jednotek WHO) 20 mM fosfátovým pufrem obsahujícím 0,01 % hovězího albuminu a 77 mM chloridu sodného (enzym ředicí pufr). Do 0,1 ml těchto vzorků se přidá roztok 0,1 ml hyaluronanu (0,2 mg/ml), smísí se a inkubuje 45 minut při teplotě 37 C. Test se provede dvojmo. Reakce se ukončí zředěním 1,0 ml albůminového reakčního činidla (0,1 % albuminu rozpuštěného v 80 mM octové kyselině/40 mM pufru octanu sodného, pH 3,75). Po 10-minutové inkubaci při teplotě místnosti nebo 37 C se odečte optická hustota při 600 nm a aktivita se vyjádří v jednotkách WHO(IU) porovnáním se standardem (program SLT). Přípravek WHO z býčí varlatové hialuronidázy (Humphrey J.H., Bull.-World Health Org. 16, st.r. 291 až 294, 1957) slouží jako standard.

Příklad 13

Stanovení proteinu

Obsah proteinu sloupcových eluentů se stanoví měřením ultrafialové absorbance roztoků při 280 nm. Koncentrace proteinů spojených frakcí se stanoví Piercovou mikrometodou. Jako referenčního proteinu se použije roztoku BSA.

Příklad 14

Elektroforéza SDS-PAGE

Elektroforéza se provádí Laemmliho způsobem (Nátuře 227, str. 680 až 685, 1970). Použije se následujících gelů = 4 až 20¾ gradient nebo nebo 12,5¾ separační gely se 4¾ zásobním gelem. Vzorky se podrobí elektroforéze v přítomnosti dodecylsulfátu sodného a β-sulfanylethanolu. Proteiny se zviditelní vybarvením Comassiovou brilantní modří nebo vybarvením stříbrem (podle instrukcí Pharmacia).

Příklad 15

Isoelektrické zaostření

Ke sledování studií isoelektrického zaostření při přípravě manilláz se volí protokol poskytnutý dodavatelem (Pharmacia). Po zaostření se gel fixuje a vybarví stříbrem (podle protoko1u Pharmac i a).

Příklad 16

Příprava imunoglobinu z imunitního králičího séra (anti-ConA, antihemoglobinové a antipeptidové králičí protilátky

Opatří se králičí séra s použitím následujících imunogenů: concanavalin A lectin, směs hemoglobinů a konjugátů peptid-KLH. Peptidová sekvence je totožná se 14 aminokyselinovou N-koncovou částí manillázy (KEIAVTIDDKNVIA).

• · ··

Sera se vyčistí na sloupci Protein Pt Sefarozy (Pharmacia, 17-0780-01) podle standardních instrukcí Pharmacia. Čistota vzorků lgG se kontroluje pomocí testu SDSPAGE a ELISA.

Příklad 17

Test Western-Immunoblot

Vhodné podíly vzorků a předem obarvený markér proteinu známé molekulové hmotnosti se podrobí SDS-PAGE, jak shora uvedeno. Použije se markéru molekulové hmotnosti předem obarveného BloRad. Protein se převede elektroforeticky z polyakrylamidových gelů (0,8 mA/cm²) na imobilní polyvinyldifluoridové membrány (PVDF) v přítomnosti transferového pufru pro 100 minut. Membrána PVDF se inkubuje blokovacím roztokem (PBS pH 7,5 + 2 % odtučněného mléka) jednu hodinu při teplotě místnosti. Membrána se Inkubuje dvě hodiny při teplotě místnosti s protilátkou, příslušně zředěnou blokovacím roztokem. Membrána se promyje TBS + 0,05¾ Tween 20, pH 7,5 a inkubuje se dvě hodiny při teplotě místnosti (druhá protilátka) s kozím protikrálIčím alkalinfosfátovým konjugátem, BioRad. Membrána se promyje dvakrát TBS + Tween 20 a inkubuje se 10 minut s BCIP alkalickým roztokem fosfatázového substrátu. Reakce se ukončí přísadou ukončovacího pufru.

Příklad 18

Sekvencování aminokyselin

Sekvence N-koncových 33 zbytků aminokyselin manillázy se získá Edmanovým odbouráním- Po SDS-PAGE mani1lázo-aktivních vzorků se pruhy převedou na PDVF membránu, vybarví se Coomassiovou modří, vyříznou a sekvencují. Stejná aminosekvence se najde pro vzorky získané za pomoci RP sloupcové chromatografie.

• · · ·

Příklad 19

Závislost enzymové aktivity na pH (Pro hialuronidázu izolovanou z Hirudinaria manillensis a z hlav pijavek Hirudo médieinalis)

Vzorky hialuronidázy, použité v tomto pokusu, se extrahují jednak z Hirudinaria manillensis, jednak z hlav pijavek Hirudo medicinalis a částečně se vyčistí vysrážením síranem amonným a katexovou chromatografií. Každý vzorek, obsahující 500 WHO o o o jednotek/ml, se inkubuje při teplotě 20 C, +4 C a 37 C v rozmezí hodnot pH 2,6 až 9,0 (20 mM octového pufru pro pH

2,6 až 5, 20 mM fosfátového pufru pro pH 5 až 9). Aktivita enzymu se měří po 1,2a 7 dní inkubační periody. Jak u kyselinových tak u zásaditých krajních hodnot pH se pozoruje stejný rozsah aktivity u obou hialuronidáz. Avšak v průběhu delších inkubačních period je manilláza stabilnější než hialuronidáza Hirudo medicinalis: například po 7 dnech inkubace při pH 7,0 o O při teplotách +4 Ca 37 C si manilláza uchovala 75 % a 60 % výchozí aktivity. Hialuronidáza Hirudo medicinalis, inkubovaná za stejných podemínek, byla už neaktivní po 1 dnu.

Příklad 20

Měření stability hialuronidáz v přítomnosati psího séra (pro hialuronidázu izolovanou z Hirudinaria manillensis a z hlav pijavek Hirudo medicinalis)

Vzorky 5 kU/ml manillázy, Hirudo medicinalis a hialuronidázy z býčích varlat se zředí v citrátované psí nebo krysí plasmě na koncovou koncentraci 250 U/ml. Pak se tyto roztoky inkubují při teplotách -20 C, + 4 C a + 37 C po dobu 0 až 7 dní. Do tohoto pokusu se zařadí kontrolní vzorky obsahující stejné hialuronidázy zředěné v pufru. Nakonec se změří aktivita hialuronidáz.

·· • · • · · ·

Příklad 21

Aktivity kontaminovaných enzymů

V každém stupni čištění pilávkové hialuronidázy se prostředek kontroluje z hlediska jiných enzymů schopných odbourávat protein pomocí univerzálního proteinového substrátu (Boehringer Mannheim katalogové číslo 1080 733) podle Twininga S.

S. (Anal. Biochem. 143, str. 30 až 34 1984).

Příklad 22

Působení heparinu na aktivitu hialuronidázy

Rozštěpení hyaluronanu hialuronidázou vede k uvolnění redukčních cukrů. Množství uvolněných cukrů se měří kolorimetricky upravenou Parkovou metodou (Park J. & Johnson M. J., Biol. Chem. 181, atr. 149, 1949). K měření vlivu heparinu na aktivitu manillázy a hialuronidázy z býčích varlat se provedou dvě stanovení aktivity; jedno v přítomnosti heparinu a druhé bez heparinu. Hialuronidázové vzorky, 25 pl ¢3,2 jednotek VHO) o

se inkubují 30 minut při teplotě 37 C s 25 pl roztoku heparinu (Liquemin, Fa Hoffmann La Roche) obsahujícím 0 až 24 jednotek heparinu. Pak se přidá 50 pl hyaluronanu (2,5 mg/ml) a o

v inkubaci se pokračuje 30 minut při teplotě 37 C. Reakce se o

ukončí dvouminutovým ohřevem na teplotu 100 C. Pak se přidá 100 pl karbonát-kyanidového roztoku a 100 pl roztoku ferrikyanidu draselného do inaktivovaného digestu. Vzorky se zahřívají 15 minut v lázni vroucí vody, načež se ochladí v ledové lázni. Potom se do reakčních směsí přidá 0,75 pl amoniumsulfátu železitého. Po 15-minutové inkubaci při teplotě místnosti se vytvořené zbarvení měří při 690 nm spektrofotometrem Shimadzu. Do každé zkoušky se vloží vhodné nulové a neenzymové kontroly. Očekávané snížení cukru (glukuronové kyseliny nebo N-acetylglukosaminu, 1 až 15 pg) pro typ analyzovaného vzorku se pou33 • · · žije jako standard.

Příklad 23

Deglykosyzace manillázy

Vzorky manillázy se deglykosylují pomocí enzymu PNGase F (BioLabs Art. č. 701 L) podle dodavatelových instrukcí. Deglykosy láce se provádí za denaturačních a nativních podmínek. O-Glykanázové, neuraminidázové a neuraminidázové + 0-glykanázové zpracování se provede podle standardních předpisů společnosti Boehringer Mannheim. Všechny vzorky se charakterizují SDS-PAGE a aktivitním determinačníra testem.

Příklad 24

Konstrukce expresního vektoru E.coli (obr. 11)

K expresi v E. coli se použije modifikované verse plasmidu pASK75, který nese tet promotérovou oblast (Skera, Gene 151, str. 131 až 135, 1994). Modifikace se provede klonováním nového spojovníku mezi místy Xbal a Hind III. Nový spojovník obsahu- je vůdčí sekvenci ompA, jiné multiplitní klonovací místo a 6xHis-tag místo strep-tagu.

119

Xbal _

CTAGATAACG AGGGCAAAAA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCAcl Vij G

TATTGC TCCCGÍT ΓΤΤ TACTITrTCT GTCGATAGCG CTAACGTCAC CGTGACCGAC ďMtetlysLysT hrAlalleAl alleAlaVal AlaLeuAlaG

179

Gal EcoK

GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG GC AT CGA TGA ATT CAAAGCGATG GCATCGCGTC CG TA QCT ACT TAA

Sít Kpnl Sňal BamHI CGA GCT CGS TAC CCG 033 GCT CGA GCC ATG GGC CCC

14> I yPheAl aTh rValAlaGIn AI a Xhol Sil FSI

230 ATC CCT CGA GGT CGA CCT GCA 'TAG GGA GCT CCA QCT GGA CGT

Hind III

B»47III

Q3C AGC GCTATGAGAGGATCQCATCACCATCACCA CCG TCG CGATACTCTCCTAGCGTAGTQGTAGrGGT iFAIaAtetArgGI ySerHi sHisHi sHi sHi

286 TCACTAATAGA

ACTGATTATCTTCGA

1Ú> sHI s......

• ·

Ke konstrukci expresního vektoru pro manillázu je nutno zavést restrikční místa 5 Clal a 3 Eco47111 způsobem PCR. Proto se použije dvou přiměřil 5 ATC GAT AAA GAG ATT GCC GTG AC a 3 GTT GTT TCC GAT GCT AAA GCG CT. Produkt PCR se klonuje napřed do vektorového systému PCR II (invitrogen) a sekvencuje se. Ve druhém stupni se manillázový gen klonuje do modifikovaného vektoru pASK75 za použití restrikčních míst 5 Clal a 3 Eco47111. Po expresi a ověření aktivity této rekombinované maní liazy ve druhé reakci PCR se His-tag odstraní a startovací kodon mani1lázového genu se přímo fuzuje do vůdčí sekvence omp

A.	Příměry	pro tuto reakci	PCR	jsou :
5 '	ACC GTA	GCG CAG GCC AAA	GAG	ATT GCC GTG a
3'	CAC GGC	AAT CTC TTT GGC	CTG	CGC TAC GGT.
Příklad 25
Konstrukce	Baculo Donorového plasmidu (obr.

K expresi manillázy v expresním systému Baču1o viru se použije expresního systému Bac-To-Bac™ Baculovirus Expression System (společnosti Gibco Life Technologies. K získání sekčního systému vůdčí sekvence melitinu ze včelího medu se fuzuje na manillázový gen a k zavedení restrikčních míst 5 BamHI a 3 Kpnl se provede jediná reakce pCR.

přiměř:

CGG ATC CAT GAA ATT CTT AGT CAA CGT TGC CCT TGT TTT TAT GGT CGT ATA CAT TTC TTA CAT CTA TGC GAA AGA GAT TGC CGT GAC 3 primer:

AAT GTT GAA GCA TAA GGT ACC

Produkt PCR se klonuje do vektoru PCR II (invitrogen) a sekvencuje se. Pak se mel1itin-mani1lázová fúze klonuje do vektoru pFastBac pomocí restrikčních míst 5 BamHI a 3 Kpnl (obr. 12) .

• ·

Příklad 26

Konstrukce kvasnicového expresního vektoru (obr.13)

K expresi v kvasnicích se použije expresního systému pichia multi copy (Invitrogen). Ke konstrukci expresního vektoru pro mani liazu se použije způsobu zesílení PCR mani1lázového genu tak, že kompatibilní restrikční konce (5 EcoRI, 3 Not I) se generují k vazbě do příslušného vektoru (pPIC9K). Použije se následujících příměrů:

5' GTA GAA TTC AAA GAG ATT GCC GTG ACA

3' GAT GCT AAT GTT GAA GCA TAA TGA GCG GCC GC

Před transformací Pichia Speroplastů je třeba expresní vektor linearizovat pomocí Sal I.

Příklad 26

Exprese E.coli

K expresi se transformuje vektor pRG72, který obsahuje strukturní gen Sarastatinu fúzovaného na vůdčí sekvenci ompA do příslušných buněk W3110- Buňky se nechají růst v mid-log fázi a pak se zavede promotér přidáním 200 ug TC/1. Po jedné hodině je možná zřetelná detekce rekombinantní manillázy.

Příklad 27

Generace rekombinantních baculovirů a exprese manillázy expresním systémem Bac-To-Bac

Donorový plasmid pTD13 se transformuje do příslušných buněk DHlOBac, které obsahují bacmid s cílovým místem míni-attTn? a pomocný plasmid. Mini-Tn7 element na donorovém plasmidu se transponuje do cílového místa mini-attTn7 na bacmidu v přítomnosti transposičních proteinů opatřených pomocným • ·· • · 9 9 plasmidem. Kolonie, obsahující rekombinantní plasmidy, se identifikují přetržením genu lacZ. Vysokomolekulární mini-prep DNA se připraví ze selektovaných klonů E. coli obsahující rekombinanantní bacmid se této DNA se pak použije k transfektu hmyzích buněk.

Podrobný popis je v instrukční příručce expresního kitu.

Příklad 28

Exprese v kvasnicích

K ujištění existence integrovaného mani 1lázového genu je třeba kolonie skrínovat na mutanty His* a Mutx.

S použitém jedné kolony se naočkuje 100 ml media do baňky o o

obsahu 1 litr. Růstové podmínky jsou 28 až 30 C, 250 otáček za minutu, do OD 2-6. K vyvolání exprese se kulura napřed odstředí, supernatant se dekantuje a resuspenduje se buněčná peleta do nového media s použitím 1/5 objemu původní kultury. Přidá se 100 % methanolu do konečné koncentrace 0,5 % každých 24 hodin k udržení indukce. Po maximálně 6 dnech se supernatant analyzuje SDS-PAGE a zkouškou aktivity.

Průmyslová využitelnost

Rekombinantní způsob produkce manillázy, který zahrnuje rozkrytí DNA a sekvencí aminokyselin stejně jako vektorů a hostujících systémů- Manillázy lze použít pro výrobu farmaceutických prostředků například k léčení nemocí myokardu, thrombotických příhod a nádorů.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY ‘Wj

   1. Vyčištěný protein izolovaný z pijavek druhu Hirudonaria mannilensis mající biologickou aktivitu hyaluronidázy, která není ovlivněna ve svém působení heparinem a má molekulovou hmotnost 53 až 60 v závislosti na glykosylaci.
2. 2. Glykolyzovaný protein podle nároku 1 mající molekulovou hmotnost 58 (±2).
3. 3. Glykolyzovaný protein podle nároku 1 mající molekulovou hmotnost 54 (±2).
4. 4. Protein podle nároku 1 až 3 mající isoelektrický bod 7,2 až 8,0.
5. 5. Protein podle nároku 1 až 4 mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 7 a SEQ ID No.l.
6. 6. Protein podle nároku 1 až 5 mající specifickou enzymatickou aktivitu větší než 100 kU/mg proteinu.
7. 7. Způsob izolování a čištění proteinu podle nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že sestává z následujících stupňů:

   (i) homogenizace hlav pijavic druhu Hirudinaria mannilensis kyselým pufrem a odstředění,

   Cii) vysrážení supernatantu ze stupně (i) síranem amonným, Ciii) katexová chromatografie,

   Civ) aflnitni chromatografie konkanavalinu A, (v) hydrofobní interakční chromatografie, (ví) afinitní chromatografie matric povlečených fragmenty hialuronové kyseliny, (vii) gelová permeační chromatografie a popřípadě (viii) enzymatická nebo chemická deglykosyláce vyčištěného proteinu.

   • «
8. 8. Protein mající biologickou aktivitu hialuronidázy, která není ovlivněna působením heparinu s molekulovou hmotností 53 až 60 v závislosti na glykosylaci, získatelný výrobními stupni podle nároku 7.
9. 9. Protein podle nároku 8 mající specifickou enzymatickou aktivitu větší než 10 kU/mg proteinu.
10. 10. Sekvence DNA kódující protein podle nároku 1 a 9.
11. 11. Sekvence DNA kódující protein podle nároku 8 zahrnující všechn nukleotidové sekvence vyznačené na obr- 8 (SEQ.ID No.2), obr. 9 (SEQ.ID No.4) a obr. 10 (SEQ.ID No.6).
12. 12. Rekombinantní protein s biologickou aktivitou hialuronidázy kodovanou kteroukoli sekvencí DNA podle nároku 11.
13. 13. Rekombinantní protein s biologickou aktivitou hialuronidázy a molekulovou hmotností 55 až 59 závislou na glykosylaci, mající kteroukoli sekvenci aminokyselin vyznačenou na obr. 8, 9 a 10 (SEQ.ID No. 3, 5, 7) nebo sekvenci, která má nejméně 80¾ homologii k uvedeným sekvencím.
14. 14. Expresní vektor mající sekvenci DNA podle nároku 10 nebo 11.
15. 15. Hostitelská buňka vhodná k expresi proteinu podle nároku 12 nebo 13, transformovaná vektorem podle nároku 14.
16. 16. Protein podle nároku 1 až 6, 8, 9, 12 a 13, který je léčivem.
17. 17. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje protein podle nároku 16 a farmaceuticky vhodné ředidlo, nosič nebo exeipient.
18. 18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje přídavně farmakologicky aktivní látku.
19. 19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, v y z n a čující se tím, že obsahuje jako přídavnou farmakologicky aktivní látku je heparin.
20. 20. Použití proteinu podle nároků 1 až 6, 8, 9, 12 a 13 k vý- robě léčiv k léčení myokardiálních, kardiovaskulárních a thrombotických nemocí a nádorů.