JP2003509043A - リソソームターゲティング経路酵素 - Google Patents

リソソームターゲティング経路酵素

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Abstract

(57)【要約】 リソソームターゲッティング経路酵素ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを回収し、これを用いてリソソーム貯蔵障害の治療のために使用できる高リン酸化リソソーム加水分解酵素を生産する。一般にこの酵素をコードする核酸分子が、この酵素を発現する宿主細胞をトランスフェクトするために用いられる発現ベクターへ組み込まれる。発現した酵素を回収し、これを用いて高マンノース構造を有するリソソーム加水分解酵素を処置する。得られたリソソーム加水分解酵素は、マンノースリン酸で高度にリン酸化されたアスパラギン結合オリゴ糖を有する。この高リン酸化リソソーム加水分解酵素は酵素置換療法で細胞およびリソソームへ容易に取り込まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野 本発明は概してリソソームターゲッティング経路に関与する酵素、特に単離・
精製されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−
ＧｌｃＮＡｃアーゼ、該酵素をコードする核酸、組換えＧｌｃＮＡｃホスホトラ
ンスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの製造法、なら
びにリソソーム貯蔵障害の治療に有用である高リン酸化リソソーム酵素の製造の
ための該酵素の使用に関する。
【０００２】 従来技術 リソソームおよびリソソーム貯蔵障害 リソソームは真核細胞中の細胞小器官であり、高分子を、生合成経路で再利用
できる、または廃棄物として細胞により排出される構成要素に分解する働きをす
る。通常、これらの高分子はリソソーム酵素またはリソソーム加水分解酵素とし
て知られる酵素によって分解される。しかしながら、リソソーム酵素がリソソー
ムに存在しないか、または適切に機能しない場合には、高分子基質に特異的な酵
素が「貯蔵物質」としてリソソームに蓄積し、ひとまとめにしてリソソーム貯蔵
障害として知られる種々の疾病を引き起こす。
【０００３】 リソソーム貯蔵障害は毎年何百人という人々に慢性疾患および死を引き起こし
得る。約５０種の公知のリソソーム貯蔵障害、例えば、ポーンプ病、フルラー症
候群、ファブリー病、マロトー・ラミー症候群（ムコ多糖症VI）、モルキオ症候
群（ムコ多糖症IV）、ハンター症候群（ムコ多糖症II）、ファーバー病、酸性リ
パーゼ欠損症、クラッベ病、およびスライ症候群（ムコ多糖症VII）がある。こ
れらの疾病の各々では、特定の分解反応を触媒する酵素がリソソームから欠けて
いる、リソソーム内に低濃度で存在する、またはリソソーム内に十分な濃度で存
在するが適切に機能しないために、リソソームが特定の化合物または化合物群を
分解できない。
【０００４】 リソソーム貯蔵障害は広範囲にわたって研究されており、特定の疾病の原因で
ある酵素（またはその欠如）が確認されている。ほとんどの疾病は、リソソーム
における適切な酵素の欠損により引き起こされ、これは該酵素の構造遺伝子にお
ける変異または欠失によることが多い。いくつかのリソソーム貯蔵障害について
は、酵素欠損症は細胞がリソソームを標的として酵素を輸送できないことにより
引き起こされ、例えば、Ｉ−細胞病および偽ハーラーポリジストロフィーがある
。
【０００５】 リソソーム貯蔵障害は広範囲にわたって研究されており、特定の疾病の原因で
ある酵素（またはその欠如）が同定されている(Scriver, Beaudet, Sly, and Va
le, eds, The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th Edition, 1989, Ly
sosomal Enzymes, Part II, Chapters 61-72,pp.1565-1839)。各疾病内では、重
篤度および疾病の現れる年齢が患者に存在する残存リソソーム酵素量の関数であ
り得る。
【０００６】リソソームターゲッティング経路 リソソームターゲッティング経路は広範囲にわたって研究されており、リソソ
ーム酵素が合成されリソソームに輸送されるプロセスは十分に記載されている。
Kornfeld, S. (1986)."Trafficking of lysosomal enzymes in normal and dise
ase states." Journal of Clinical Investigation 77: 1-6 and Kornfeld, S,(
1990)."Lysosomal enzyme targeting." Biochem. Soc. Trans. 18: 367-374。一
般に、リソソーム酵素は分泌性糖タンパク質とともに粗面小胞体（「ＲＥＲ」）
において膜に結合したポリソームによって合成される。ＲＥＲにおいて、リソソ
ーム酵素は２Ｎ−アセチルグルコサミン、９−マンノースおよび３−グルコース
を含むドリコールリン酸から予め形成されているオリゴ糖のエンブロック転移に
よってＮ−結合オリゴ糖を獲得する。次いで、グリコシル化リソソーム酵素は分
泌タンパク質とともにゴルジ体に輸送される。シス−ゴルジまたは中間コンパー
トメントにおいて、リソソーム酵素は特定のマンノースへのＧｌｃＮＡｃリン酸
の転移によって特異的、かつ、独自に改変される。第２の工程では、マンノース
６−リン酸（「Ｍ６Ｐ」）ターゲッティング決定基を曝露することによってＧｌ
ｃＮＡｃが除去される。曝露されたＭ６Ｐを含むリソソーム酵素はトランス−ゴ
ルジにおいてＭ６Ｐ受容体と結合し、エンドソームさらにリソソームへ輸送され
る。リソソームでは、リソソームホスファターゼによってリン酸が迅速に除去さ
れ、マンノースはリソソームマンノシダーゼによって除去される(Einstein, R.
and Gabel, C.A. (1991). "Cell-and ligand-specific deposphorylation of ac
id hydrolases:evidence that the mannnose 6-phosphate is controlled by co
mpartmentalization." Journal of Cell Biology 112:81-94)。
【０００７】 曝露されたＭ６Ｐを有するリソソーム酵素の合成は２種の異なる酵素によって
触媒され、合成が起こるには双方ともが不可欠である。第１の酵素はＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン：リソソーム酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホス
ホトランスフェラーゼ（「ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼ」）（Ｅ．
Ｃ．２．７．８．１７）である。ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼはＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃからのリソソーム酵素のα１，２−結合マンノースの６位への
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の転移を触媒する。ＧｌｃＮＡｃホスホ
トランスフェラーゼによるＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の認識および
リソソーム加水分解酵素への付加はリソソームターゲッティングにおいて重要か
つ決定的な工程である。第２の工程はＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスホジ
エステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（「ホスホジエステルα−Ｇｌｃ
ＮＡｃアーゼ」）（Ｅ．Ｃ．３．１．４．４５）によって触媒される。ホスホジ
エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼはＧｌｃＮＡｃリン酸修飾されたリソソーム酵
素からのＮ−アセチルグルコサミンの除去を触媒してリソソーム酵素に末端Ｍ６
Ｐを生じさせる。これらの酵素についての予備的研究が実施されている。Bao et
al.はThe Journal of Biological Chemistry, Vol.271, Number 49, Issue of
December 6, 1996,pp.31437-31445でウシＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：
リソソーム酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼの精
製法について記載しており、また該タンパク質の仮定のサブユニット構造を提案
している。Bao et al.はThe Journal of Biological Chemistry, Vol.271, Numb
er 49, Issue of December 6, 1996, pp. 31446-31451でウシＵＤＰ−Ｎ−アセ
チルグルコサミン：リソソーム酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトラ
ンスフェラーゼに関して酵素の特性決定および触媒サブユニットの同定について
記載している。Kornfeld et al.はThe Journel of Biological Chemistry, Vol.
273, Number 36, Isssue of September 4, 1998,pp.23203-23210でウシＮ−アセ
チルグルコサミン−１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニミダー
ゼの精製および多重結合構造について記載している。しかしながら、これらのタ
ンパク質を単離するのに必要な所有権を有するモノクローナル抗体は他者には利
用できるようになっておらず、これらの予備的研究において用いられた酵素のタ
ンパク質配列は公開されていない。
【０００８】 リソソームターゲッティング経路は公知であるが、該経路に関与する天然の酵
素は部分的にしか研究されておらず、リソソームターゲッティング経路における
Ｍ６Ｐ付加を担う酵素は単離および精製することが困難であり、十分に理解され
ていない。リソソームターゲッティング経路酵素およびこれらの作用の分子的機
序についてのさらなる理解が、リソソーム貯蔵障害の治療法、特に標的酵素置換
療法の分野においてこれらの酵素を利用するための有効な技術の開発を助けるた
めに必要である。
【０００９】リソソーム貯蔵障害の治療 酵素の欠損によって引き起こされるリソソーム貯蔵障害は理論上は酵素置換療
法を用いて、すなわち、疾病を治療するために単離・精製された酵素を患者に投
与することにより治療できる。しかしながら、有効であるためには、投与される
リソソーム酵素は細胞によってインターナライズされてリソソームに輸送されな
ければならない。しかしながら、天然の酵素およびそれらの組換え同等物は、精
製もしくは組換えリソソーム酵素が十分な量の曝露されたＭ６Ｐを含まない、ま
たはそれらの分解を媒介する望ましくないオリゴ糖を含むので、酵素置換療法に
おいて限定された価値のものでしかなかった。十分なＭ６Ｐがなければ、投与さ
れたリソソーム酵素はＭ６Ｐ受容体と効率よく結合できず、リソソームに輸送さ
れない。例えば、胎盤から精製されたヒト酸性α−グルコシダーゼはリン酸化さ
れないオリゴマンノースオリゴ糖を含み(Mutasers, J. H. G. M., Van Halbeek,
H. Vliegentbart, J. F. G., Tager, J. M., Reuser, A. J. J., Kroos, M., a
nd Galjaard, H.(1987) "Determination of the structure of the carbohydrat
e chains of acid α-glucosidase from human placenta." Biochimica et Biop
hysica Acta 911:244-251)、該酵素のこのグリコ形態は細胞によって効率よくイ
ンターナライズされない(Reuser, A. J., Kroos, M. A.,Ponne, N. J., Wolterm
an, R. A.,Loonen,M. C., Busch, H. T., Visser, W. J., and Bolbuis, P. A.(
1984) "Uptake and stability of human and bovine acid alpha-glucosidase i
n cultured fibroblasts and skeletal muscle cells from glycogenosis type
II patients." Experimental Cell Research 155:178-189)。所望のオリゴ糖構
造を有するリソソーム酵素を精製または合成できない結果、これらの酵素製剤が
罹患細胞を効率よくターゲッティングせず、これらの疾病の治療において限定さ
れた有効性のものでしかない。従って、酵素置換療法手順に使用できる酵素、特
に、細胞によって効率よくインターナライズされ、リソソームに輸送される高度
リン酸化酵素が必要である。
【００１０】
【発明の概要】
従って本発明の目的は、生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラ
ーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを単離・精製されたポリペ
プチドとして提供することである。
【００１１】 本発明のもう１つの目的は、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホ
スホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードする核酸分子を提供することで
ある。
【００１２】 本発明のもう１つの目的は、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホ
スホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクター
を提供することである。
【００１３】 本発明のさらなる目的は、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼまたはホス
ホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで
トランスフェクトされた宿主細胞を提供することである。
【００１４】 本発明のもう１つの目的は、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼまたはホ
スホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクター
でトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を培養することによる組換え
ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよび組換えホスホジエステルα−Ｇｌ
ｃＮＡｃアーゼの製造法を提供することである。
【００１５】 本発明のもう１つの目的は、単離・精製された組換えＧｌｃＮＡｃホスホトラ
ンスフェラーゼおよび組換えホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを提供す
ることである。
【００１６】 本発明のもう１つの目的は、リソソーム貯蔵障害の治療に有用である高リン酸
化リソソーム酵素の製造法を提供することである。
【００１７】 本発明のさらなる目的は、リソソーム貯蔵障害の治療に有用である高リン酸化
リソソーム加水分解酵素を提供することである。
【００１８】 本発明のさらにもう１つの目的は、リソソーム貯蔵障害の治療法を提供するこ
とである。
【００１９】 本発明のさらにもう１つの目的は、ウシＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラー
ゼおよびウシホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼと選択的に結合できるモ
ノクローナル抗体を提供することである。
【００２０】 これらのおよびその他の目的は単離・精製された生物学的に活性なＧｌｃＮＡ
ｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを
回収し、該酵素を用いて該酵素をコードする核酸分子を得ることによって達成す
る。いずれかの酵素をコードする核酸分子を、該酵素を発現する宿主細胞をトラ
ンスフェクトするのに用いる発現ベクターに組み込む。発現された酵素を回収し
、これを用いてリソソーム貯蔵障害の治療に有用な高リン酸化リソソーム加水分
解酵素を製造する。特に、該酵素は酵素置換療法において効果的に使用できる高
リン酸化リソソーム加水分解酵素を製造するために用いる。
【００２１】 高マンノース構造を有するリソソーム加水分解酵素はＧｌｃＮＡｃホスホトラ
ンスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼで処理すると、
マンノース６−リン酸（「Ｍ６Ｐ」）で高度に修飾されたアスパラギン結合オリ
ゴ糖が生じる。処理された加水分解酵素は細胞膜上のＭ６Ｐ受容体に結合し、細
胞内に輸送され、リソソームに送達され、そこでその正常な、または所望の機能
を発揮できる。
【００２２】 本発明のその他の態様および利点は以下の本発明のさらに詳細な説明および添
付の図面から明らかになる。
【００２３】
【発明の具体的説明】
本明細書において「ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ」とは、ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃからリソソーム酵素のα１，２−結合マンノースの６位へのＮ−ア
セチルグルコサミン−１−リン酸の転移を触媒できる酵素をいう。
【００２４】 本明細書において「ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ」とは、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−リン酸−マンノースジエステル改変されたリソソーム酵素からのＮ−ア
セチルグルコサミンの除去を触媒して末端Ｍ６Ｐを生じさせることができる酵素
をいう。
【００２５】 本明細書において「ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ」および「ホスホ
ジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ」とは、いずれかの真核生物種、特にウシ、
ブタ、ネズミ、ウマ、およびヒトなどの哺乳類種から、ならびに天然、合成、半
合成、または組換えであれ、いずれかの供給源から得られる酵素をいう。この用
語は膜結合酵素および可溶性または完全なアミノ酸配列に満たない末端切断型酵
素および生物学的に活性な変種ならびに遺伝子産物を包含する。
【００２６】 本明細書において「天然の」とは、動物組織または細胞から単離され、精製さ
れた内生または外来のタンパク質を意味する。
【００２７】 本明細書において「単離・精製された」とは、その他のタンパク質またはポリ
ペプチドと本質的に会合していないタンパク質、例えば、抗体の使用またはその
他の方法によって細胞性およびその他の夾雑物から分離されている天然タンパク
質など、あるいは組換え宿主細胞培養物の精製産物などを意味する。
【００２８】 本明細書において「生物学的に活性な」とは、天然分子の構造上の、調節的、
または生物学的機能を有する酵素またはタンパク質を意味する。
【００２９】 本明細書において「ヌクレオチド配列」とは、個別の断片の形態のポリヌクレ
オチド分子あるいは少なくとも一度は実質的に純粋な形態で（すなわち、夾雑内
生物質を含まない）、かつ、標準的な生物学的方法によってその構成要素ヌクレ
オチド配列の同定、操作、および回収が可能な量または濃度で単離されたＤＮＡ
またはＲＮＡに由来する大きな核酸構築物の構成要素を意味する。かかる配列は
内部非翻訳配列または通常真核細胞の遺伝子に存在するイントロンによって中断
されていないオープン・リーディング・フレームの形態で提供されることが好ま
しい。非翻訳ＤＮＡの配列はコード領域の操作または発現に干渉しないオープン
・リーディング・フレームの５’または３’には存在してもよい。
【００３０】 本明細書において「核酸分子」とは、ｃＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖、およ
び直鎖もしくは共有結合により閉鎖した分子を含むＲＮＡまたはＤＮＡを意味す
る。核酸分子はまた全遺伝子またはその断片および誘導体の実質的な部分に相当
するゲノムＤＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は天然ヌクレオチド配列に相当
するか、単一もしくは複数ヌクレオチド置換、欠失および／もしくは付加を含ん
でもよく、これはその断片を含む。核酸分子における総てのかかる変種は適当な
宿主において発現される場合には生物学的に活性な酵素または酵素的に活性なそ
の断片をコードする能力を保持している。本発明の核酸分子は酵素をコードする
ヌクレオチド配列のみを含んでもよいし、酵素の遺伝子にまで及ぶ大きな核酸分
子の一部であってもよい。大きな核酸分子中の酵素をコードしていない配列はベ
クター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、複製、シグナル配列、
または遺伝子の非コーディング領域を含み得る。
【００３１】 本明細書において「変種」とは、１個以上の欠失、挿入、誘導、または置換の
ために天然タンパク質と実質的に相同であるが天然タンパク質（ヒト、ウシ、ヒ
ツジ、ブタ、ネズミ、ウマ、またはその他の真核生物種）とは異なるアミノ酸配
列を有するポリペプチドを意味する。変種アミノ酸配列は天然アミノ酸配列と少
なくとも５０％が同一であることが好ましいが、少なくとも７０％が同一である
ことが最も好ましい。変種は保存的に置換される配列を含んでもよく、これでは
所定のアミノ酸残基が同様の生理化学的特性を有する残基によって置換される。
保存された置換は当技術分野では十分に知られており、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
、またはＡｌａの互いのなどのある脂肪族残基の他のものとの置換、またはＬｙ
ｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；もしくはＧｌｎとＡｓｎ間などのある極性残基の
他のものとの置換が挙げられる。かかる変種を作製および使用するためには従来
の手順および方法を使用できる。同様の疎水特性を有する全領域の置換などのそ
の他のかかる保存された置換が十分に知られている。また、天然変種も本発明に
包含される。かかる変種の例としては交互ｍＲＮＡスプライシングの結果または
生物学的に活性で、かつ、その触媒機能を実施できる酵素を残す酵素のタンパク
質分解性切断の結果生じる酵素がある。ｍＲＮＡの交互スプライシングにより天
然の可溶性型のタンパク質などの末端切断型の生物学的に活性なタンパク質が生
じ得る。タンパク質分解による変化としては、タンパク質からの１個以上の末端
アミノ酸のタンパク質分解による除去による、異なる種類の宿主細胞において発
現されるＮまたはＣ末端の相違が挙げられる。
【００３２】 本明細書において「実質的に同一」とは、タンパク質の性質、すなわち、タン
パク質の構造および／または生物学的活性に大きく影響を及ぼさない配列変化を
有する核酸またはアミノ酸配列を意味する。特に核酸配列に関しては、「実質的
に同一」とはコード領域および発現を管理する保存配列をいい、主に同一のアミ
ノ酸をコードする縮重コドンまたはコードされるポリペプチド中の保存された置
換アミノ酸をコードする代替コドンをいうものとする。アミノ酸配列に関しては
、「実質的に同一」とは一般に保存された置換および／または構造もしくは機能
の決定に関与しないポリペプチド領域における変化をいう。
【００３３】 本明細書において「同一性パーセント」とは、ウィスコンシン大学から入手で
きるＵＷＧＣＧ配列解析プログラムにおいて定義されるアミノ酸配列間の比較を
を意味する(Devereaux et al., Nucl. Acids Res. 12:387-397 (1984))。 本明細書において「高リン酸化リソソーム加水分解酵素」とは、加水分解酵素
をＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼでその後の処理をしないで天然の供給源から単に単離するだけでは得
られない精製されたリソソーム加水分解酵素のリン酸化のレベルを意味する。特
に、「高リン酸化リソソーム加水分解酵素」とは、約６％〜約１００％の二リン
酸化オリゴ糖を含むリソソーム加水分解酵素を意味する。
【００３４】 本発明は、記載される特定の方法論、プロトコール、細胞系統、ベクター、お
よび試薬は変動してもよいので、これらに限定されるものではない。さらに、特
定の具体例のみを記載するために本明細書に用いられる専門用語は本発明の範囲
を限定することを意図するものではない。本明細書および添付の請求の範囲にお
いて、単数形「a」、「an」、および「the」は特に断りのない限り複数を表すこ
とも含み、例えば、「宿主細胞」という場合は複数のかかる宿主細胞を含む。
【００３５】 遺伝暗号の縮重のために、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ホスホジ
エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードする多数のヌクレオチド配列、または
本明細書で示されるその他の配列が生じ得る。これらの配列の中にはいずれかの
公知および天然の遺伝子のヌクレオチド配列と極めて相同なものもあり、また最
低限に相同なものもある。本発明は可能性あるコドン選択に基づく組合せを選択
することにより作製できるヌクレオチド配列の各々および総ての可能性ある変化
を考慮する。これらの組合せは天然のＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼま
たはホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのヌクレオチド配列に用いられる
ような標準的なトリプレット遺伝子暗号に従ってなされ、かかる変化は総て具体
的に開示されていると考えられる。
【００３６】 特に断りのない限り、本明細書に用いられる総ての技術用語および化学用語な
らびにいずれもの頭字語は本発明の分野の当業者に一般に理解されているものと
同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および
材料はいずれも本発明の実施に使用できるが、好ましい方法、装置、および材料
が本明細書に記載されている。
【００３７】 本明細書に記載される総ての特許および刊行物は、本発明とともに使用できる
、その中で報告されるタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞、および方法論を
説明および開示するため、法により許される限りにおいて引用することにより本
明細書の一部とされる。しかしながら、本明細書において本発明が先行発明によ
るかかる開示に先行する権利がないと承認するものと解釈されるべきものはない
。
【００３８】本発明 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ １つの態様では、本発明は単離・精製された生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホ
スホトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびそのサ
ブユニットをコードする核酸ヌクレオチド、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡを有する発現ベクター、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフ
ェラーゼをコードするＤＮＡを有する発現ベクターでトランスフェクトまたは形
質転換された宿主細胞、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼをコードするＤ
ＮＡを有する発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を
培養することによる組換えＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの製造法、単
離・精製された組換えＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ならびにリソソ
ーム貯蔵障害の治療に有用である高リン酸化リソソーム酵素の製造のためのＧｌ
ｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの使用法を提供する。
【００３９】 単離・精製されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびそのサブユニ
ットおよび本発明の酵素をコードする核酸分子を得るために、以下のようにウシ
ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼを得、分析した。ウシＧｌｃＮＡｃホス
ホトランスフェラーゼの部分精製した調製物で免疫化したマウス由来の脾細胞を
骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマのパネルを作製した。ＧｌｃＮＡｃホスホ
トランスフェラーゼに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを
免疫獲得アッセイによって同定した。このアッセイでは、粗供給源からＧｌｃＮ
Ａｃホスホトランスフェラーゼを捕捉できる抗体を特異的ＧｌｃＮＡｃホスホト
ランスフェラーゼ酵素アッセイを用いる免疫沈降というアッセイによって同定し
た。ハイブリドーマを二度サブクローニングし、腹水培養物中に産生される抗体
を固体支持体に結合させ免疫親和性クロマトグラフィーについて評価した。均一
性のためにＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの一段階精製を可能にするモ
ノクローナルＰＴ１８−Ｅｍｐｈａｚｅを見出した。Bao et al.はThe Journal
of Biological Chemistry, Vol.271, Number49, Issue of December 6, 1996, p
p.31437-31445でウシＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：リソソーム酵素Ｎ−
アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼの精製法について記載し
、このタンパク質の仮定サブユニット構造を提案している。Bao et al., The Jo
urnal of Biological Chemistry, Vol.271, Number 49, Issue of Decemver 6,
1996, pp. 31446-31451。この技術を用いて、酵素を２９％の収率で４８８，０
００倍に精製した。溶出したＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼは＞１０６ 、好ましくは＞５×１０６、より好ましくは＞１２×１０６ｐｍｏｌ／時間／ｍ
ｇの特異的活性を有し、かつ、明らかに均一であり、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
基にすると多サブユニット酵素である。さらなる実験に使用するためにモノクロ
ーナル抗体標識したＰＴ１８を選抜した。モノクローナル抗体ＰＴ１８を分泌す
るハイブリドーマを２０００年８月２９日にAmerican Type Culture Collection
, 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号Ｐ
ＴＡ２４３２とされた。
【００４０】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼがサブユニット構造α２β２γ２を含
む６個のポリペプチドからなる複合体であると決定した。図１は定量的アミノ酸
配列決定、サブユニット特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ、およびｃＤＮＡ配列から得られたサブユニット構造のモデルを示す。
モデルの証拠を以下に要約する。ゲル濾過により推定される複合体の分子量は５
７０，０００ダルトンである。１６６，０００ダルトンのα−サブユニットがジ
スルフィド結合ホモ二量体として認められる。同様に、５１，０００ダルトンの
γサブユニットがジスルフィド結合ホモ二量体として認められる。αおよびγサ
ブユニットの双方ともジスルフィド結合ホモ二量体で認められるので、各分子は
少なくとも１個のαおよび１個のγホモ二量体を含むに違いない。５６，０００
ダルトンのβサブユニットはジスルフィド結合ホモ二量体では認められないが、
２本の独立した線という証拠が各複合体が同様に２個のβサブユニットを含むこ
とを強く示唆する。第一に、定量的アミノ末端配列決定によりβおよびγサブユ
ニット間の１：１モル比が証明される。第２に、αおよびβサブユニットが単一
のｃＤＮＡによってコードされ、タンパク質分解処理によって分割されるので、
２個のβサブユニットが各αサブユニット二量体に対して生じる。構成α２β２ γ２に基づいて推定される複合体の質量はゲル濾過により推定される質量とよく
一致する５４６，０００ダルトン（２×１６６，０００＋２×５６，０００＋２
×５１，０００）である。
【００４１】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼは合成アクセプターα−メチルマンノ
シドへのＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸の転移についてのアッセイを用いて精製した
。しかしながら、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの天然アクセプターは
リソソーム加水分解酵素の高マンノースオリゴ糖である。精製されたＧｌｃＮＡ
ｃホスホトランスフェラーゼの糖タンパク質をアクセプターとして利用する能力
を評価するために、リソソーム酵素ウテロフェリンおよびカテプシンＤ、非リソ
ソーム糖タンパク質ＲＮアーゼＢ、およびリソソーム加水分解酵素β−グルコセ
レブロシダーゼ（これはＭ６Ｐ独立経路によって輸送される）へのＧｌｃＮＡｃ
−１−Ｐの転移を調べた。ウテロフェリンおよびカテプシンＤの双方とも精製さ
れたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼによって２０μｍ以下のＫｍｘでア
クセプターとして効率よく利用される。これに対して、ＲＮアーゼＢおよびβ−
グルコセレブロシダーゼのいずれも有効なアクセプターではない。 単一の高マンノースオリゴ糖を含むＲＮアーゼＢがアクセプターとして有効で
ないことは、Ｋｍがタンパク質の可溶性限界に（６００μｍに）到達しなかった
ので特に注目に値する。このデータはこれまでに粗調製物で認められたリソソー
ム加水分解酵素の特異的リン酸化(Waheed, Pholmann A., R., et al., (1982))"
Deficiency of UDP-N-acetylglucosamine:lysosomal enzyme N-acetylglucosami
ne-1phosphotransferase in organs of I-Cell patients." Biochemical and Bi
ophysical Reserch Communications 105(3):1052-10580)はＧｌｃＮＡｃホスホ
トランスフェラーゼ自体の性質であるということを明確に証明する。
【００４２】 αサブユニットは、このサブユニットが［β−３２Ｐ］−５−アジド−ＵＤＰ
−Ｇｌｃで特異的に光親和性標識されたので、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ結合部位を
含有すると同定された。
【００４３】 各サブユニットのアミノ末端および内部（トリプシンによって生じた）タンパ
ク質配列データを得た。Ｎ末端配列は各サブユニットから以下のように得た。Ｇ
ｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの個々のサブユニットはジスルフィド結合
還元の前後にドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって分離した。次いで、エレクトロブロッティングによってサブユニット
をＰＶＤＦメンブランに移し、クーマシーブルー染色によって同定し、切り出し
、Ｎ末端配列決定を行った。内部配列を得るためには、ＧｌｃＮＡｃホスホトラ
ンスフェラーゼを変性させ、還元し、アルキル化し、個々のサブユニットをゲル
濾過クロマトグラフィーによって分離した。次いで、単離したサブユニットをト
リプシンで消化し、トリプシンによって生じたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって
分画した。単一のペプチドのみを含むと思われるピークをＭＡＬＤＩによって純
度について分析し、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行った。
【００４４】 ヒトαサブユニットのアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸１〜９２８で；ヒ
トβサブユニットは配列番号２のアミノ酸１〜３２８で；およびヒトγサブユニ
ットは配列番号３のアミノ酸２５〜３０５で示されている。γサブユニットは配
列番号３のアミノ酸１〜２４で示されるシグナル配列を有する。
【００４５】 ブラストアルゴリズムを用いるデータベースとの比較により、対応するｃＤＮ
ＡのいくつかのＥＳＴ配列は存在するもののこれらのタンパク質はこれまでに記
載されていないということが証明される。
【００４６】 これらのペプチド配列およびライブラリースクリーニング、ＲＡＣＥ、ＰＣＲ
および示された配列タグ（「ＥＳＴ」）ファイルのブラスト検索の組合せを用い
て、各サブユニットをコードする全長ヒトｃＤＮＡをクローニングして配列決定
した。
【００４７】 ヒトα／βサブユニット前駆体ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号４のヌ
クレオチド１６５〜３９３２で示されており；αサブユニットのヌクレオチド配
列は配列番号４のヌクレオチド１６５〜２９４８で示されており；βサブユニッ
トのヌクレオチド配列は配列番号４のヌクレオチド２９４９〜３９３２で示され
ており；およびγサブユニットのヌクレオチド配列は配列番号５のヌクレオチド
９６〜９４１で示されている。γサブユニットシグナルペプチドのヌクレオチド
配列は配列番号５のヌクレオチド２４〜９５で示されている。
【００４８】 各サブユニットについて、Ｎ末端ペプチドおよび２個の内部ペプチド配列を各
々のｃＤＮＡ配列において同定した。タンパク質配列データはウシタンパク質由
来のものであり、ｃＤＮＡ配列はヒト由来であるが、配列は高度に相同であり（
同一性：αサブユニット４３／５０；βサブユニット６４／６４；γサブユニッ
ト３０／３２）、クローニングされたｃＤＮＡがウシＧｌｃＮＡｃホスホトラン
スフェラーゼサブユニットのヒト相同物を表すということを確信させる。αおよ
びβサブユニットは単一のｃＤＮＡによってコードされ、その遺伝子は染色体１
２にあると認められた。γサブユニットは染色体１６に位置する第２の遺伝子の
産物である。α／βサブユニット前駆体遺伝子はクローニングされ配列決定され
ている。この遺伝子は〜８０ｋｂにわたり、２１個のエキソンを含む。γサブユ
ニット遺伝子もゲノム配列決定の試みから報告されたデータにおいて同定されて
いる。γサブユニット遺伝子は１２ｋｂのゲノムＤＮＡにおよぶ１１個のエキソ
ンとして並んでいる。
【００４９】 ヒトｃＤＮＡを用いて、α、β、およびγサブユニットの相同ネズミｃＤＮＡ
を標準的な技術を用いて単離して配列決定した。ネズミα、βサブユニット前駆
体ｃＤＮＡは配列番号１６で示されている。ネズミαサブユニットの推定される
アミノ酸配列は配列番号１５で、βサブユニットは配列番号８で示されている。
【００５０】 マウスγサブユニットｃＤＮＡはγヒトγサブユニットｃＤＮＡをプローブと
として用いてλＺａｐII中のマウス肝臓ライブラリーから単離した。ヒトγサブ
ユニットｃＤＮＡを３２Ｐ−ｄＣＴＰでランダム六量体標識し、λＺａｐII中の
マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブはスクリ
ーニングした５００，０００個のプラークのうちの３個とハイブリダイズした。
各々を均一性のためにサブクローニングし、挿入部分を切り出し、ｐＵＣ１９に
クローニングし、標準的な方法を用いて配列決定した、Sambrook, J., Fritsch
E. F., et al. (1989). Molecular Cloning . A Laboratory Manual Cold Sprin
g Harbor, Cold Spring Harbor Labooratory Press。マウスγサブユニットｃＤ
ＮＡ配列は配列番号１０で示されており、マウスγサブユニットの推定されるア
ミノ酸配列は配列番号９で示されている。
【００５１】 ヒトおよびマウスα、β、およびγサブユニットの推定されるアミノ酸配列の
比較によりタンパク質が約８０％の同一性を有し極めて相同であるということが
証明される。
【００５２】 これらの酵素が種間で実質的に同一であったということを確認するために、α
およびβサブユニットの部分的に相同なラットｃＤＮＡを標準的な技術を用いて
単離して配列決定した。部分ラットαおよびβサブユニットｃＤＮＡは配列番号
１２で示されている。ｃＤＮＡに対応する推定されるアミノ酸配列は配列番号１
１で示されている。さらに、αおよびβサブユニットの部分的に相同なショウジ
ョウバエｃＤＮＡを標準的な技術を用いて単離して配列決定した。部分ショウジ
ョウバエαおよびβサブユニットｃＤＮＡは配列番号１７で示されている。ｃＤ
ＮＡに対応する推定されるアミノ酸配列は配列番号１３で示されている。部分ヒ
ト、ラットおよびショウジョウバエαおよびβサブユニットの推定されるアミノ
酸配列の比較によりタンパク質が極めて相同であるということが示される。
【００５３】ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ もう１つの態様では、本発明は、単離・精製された生物学的に活性なホスホジ
エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを
コードする核酸分子、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤ
ＮＡを有する発現ベクター、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコード
するＤＮＡを有する発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主
細胞、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤＮＡを有する発
現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を培養することに
よる組換えホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの産生方法、単離・精製さ
れた組換えホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ、およびリソソーム貯蔵障
害の治療に有用な高リン酸化リソソーム酵素の製造のためのホスホジエステルα
−ＧｌｃＮＡｃアーゼを用いる方法を提供する。
【００５４】 本発明に従って単離・精製されたホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼお
よびその酵素をコードする核酸分子を得るために、以下のようにウシホスホジエ
ステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを得て分析した。マウスを部分精製したホスホジ
エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ調製物で免疫化し、機能的スクリーニング法を
用いてホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼに特異的なモノクローナル抗体
を同定・単離した。免疫原は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、イミノジ酢酸Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ、およびＳｕｐｅｒｏｓｅ６でのクロマトグラフィーを用い、
ウシ膵臓の膜ペレットからホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを〜６００
０倍部分精製することで調製した。２個体のＢＡＬＢ／ｃマウスに各々、フレン
ドの完全アジュバントに乳化した５μｇの部分精製ホスホジエステルα−Ｇｌｃ
ＮＡｃアーゼの腹腔内注射を施した。２８日目にマウスにフレンドの不完全アジ
ュバントに乳化した５μｇの部分精製ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ
で腹腔内に追加抗原投与した。４２日目にマウスから採血し、ホスホジエステル
α−ＧｌｃＮＡｃアーゼ特異的免疫応答を「キャプチャーアッセイ」によって示
した。キャプチャーアッセイを行うため、血清（５μｌ）を１．２単位の部分精
製ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼとともに一晩インキュベートした。
次ぎに、Ａタンパク質−Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ（商標）樹脂に結合させたウサギ抗
マウスＩｇＧにマウス抗体を捕捉させた。十分洗浄した後Ｕｌｔｒａｌｉｎｋペ
レットにおいて、［３Ｈ］−ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホマンノースα−メチルの
切断のアッセイにより、結合したホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを測
定した。
【００５５】 ２回目のホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの静脈免疫投与の後、脾臓
を摘出し、発明者らの改変に従い、脾臓細胞をＳＰ２／０メラノーマ細胞と融合
させた(標準法としては、Bag, M., Booth J.L., et al. (1996). "Bovine UDP-N
-acetylglucosamine: lysosomal enzyme N-acetylglucosamine-1-phosphotransf
erase. I. Purification and subunit structure." Journal of Biological Che
mistry 271: 31437-31445; Harlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies: a l
aboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory)。融合物を８個の９６ウェ
ルプレート中の、組換えヒトＩＬ−６(Bazin, R. and Lemieux, R. (1989). "In
creased proportion of B cell hybridomas secreteing monoclonal antibodies
of desired specificity in cultures containing macrophage-derived hybrid
oma growth factor (IL-6)." Journal of Immunological Methods 116: 245-249
)を添加した培地に入れ、ハイブリドーマが目に見えるくらいまで増殖させた。
１６ウェルの４８のプールを作製し、抗ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアー
ゼ活性についてキャプチャーアッセイを用いてアッセイした。４つのプールが陽
性であった。次ぎに、１６ウェルの陽性プールにあるウェルから４ウェルのサブ
プールを作製した。４つの１６ウェルプールのうち３つが、抗ホスホジエステル
α−ＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を有する１つの４ウェルプールを含んだ。次ぎに、
４ウェルプールを構成する４つの単独プールについて、抗ホスホジエステルα−
ＧｌｃＮＡｃアーゼを分泌するハイブリドーマを含むウェルを個々に確認するア
ッセイを行った。キャプチャーアッセイを用い、各ハイブリドーマを２回サブク
ローニングし、腹水培養により抗体を作製した。モノクローナルＵＣ２およびＵ
Ｃ３は親和性の低い抗体であることが分かった。親和性の高いＩｇＧモノクロー
ナル抗体であるＵＣ１は腹水培養により作製し、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼの精製のため、Ｅｍｐｈａｚｅに固定化した。さらなる実験に用いる
ため、標識されたモノクローナル抗体ＵＣ１を選択した。モノクローナル抗体Ｕ
Ｃ１を分泌するハイブリドーマは、２０００年８月２９日にAmerican Type Cult
ure Collection, 10801 Univerisity Blvd., Manassas, VA 20110に寄託し、Ａ
ＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３１とされた。
【００５６】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを精製するため、ウシ肝臓から可溶
化した膜画分を調製した。穏やかに回転させながら一晩インキュベートすること
で、Ｅｍｐｈａｚｅに結合させたモノクローナル抗体ＵＣ１にホスホジエステル
α−ＧｌｃＮＡｃアーゼに吸着させた。次ぎに、ＵＣ１−Ｅｍｐｈａｚｅをカラ
ムに充填し、ｐＨ７．０にてＥＤＴＡおよびＮａＨＣＯ３で順次洗浄した後、ホ
スホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをｐＨ１０にてＮａＨＣＯ３で溶出した
。比活性＞５０，０００μ／ｍｇにてホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ
を含む画分をプールし、１／５量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４でｐＨ
８に調整した。ＵＣ１−Ｅｍｐｈａｚｅでのクロマトグラフィーの後、ホスホジ
エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを９２，５００倍精製した（収率３２％）。
【００５７】 ＵＣ１−Ｅｍｐｈａｚｅからのホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを濃
縮し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６にてクロマトグラフィーに付した。クロマトグラムに
おいてタンパク質ピークと一致して対称形の活性ピークとしてホスホジエステル
α−ＧｌｃＮＡｃアーゼが最初に溶出した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６にてクロマトグ
ラフィーに付した後、酵素を〜７１５，０００倍精製した（収率２４％）。精製
タンパク質は、４７２μモル／時／ｍｇの［３Ｈ］−ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホ
マンノース−α−メチルの切断を触媒し、これは比活性４７２，０００単位／ｍ
ｇに相当していた。
【００５８】 精製ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、銀
染色によりタンパク質を検出した(Blum, H., Beier H., et al. (1987). "Impro
ved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gel
s." Electrophoresis: 93-99)。その強度が測定されたホスホジエステルα−Ｇ
ｌｃＮＡｃアーゼ活性によって異なる約７０ｋＤａの分子量を有する拡散したバ
ンドが見られた。この拡散型のバンドは、そのタンパク質が著しくグリコシル化
されている可能性があることを示唆するものである。〜１５０，０００の分子量
を有する微弱なバンドも存在しており、これには活性との相関はなかった。
【００５９】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのサブユニット構造のモデルをゲル
濾過クロマトグラフィーおよびジスルフィド結合の還元を伴う、また伴わないＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって求めた。ゲル濾過による分子量は約３００，０００であ
る。ジスルフィド結合還元を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥでは〜１４０，０００である
。ジスルフィド結合還元後の見掛けの分子量は７０，０００である。これらのデ
ータを考え併せると、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼはジスルフィド
結合したホモ二量体からなる四量体であることが示される。図２はホスホジエス
テルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのサブユニット構造のモデルを示す。
【００６０】 アフィニティー精製した均一なウシホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ
のアミノ末端アミノ酸配列を標準法を用いて求めた(Matsudaira, P., Ed. (1993
). A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microequenc
ing. San Diego, Academic Press, Inc.)。また純粋な酵素をトリプシン消化し
、ＨＰＬＣに付したところトリプシン作用によって生じた２つの内部ペプチドを
生じ、これも配列決定した。これら３つのペプチドのアミノ酸配列は、 ペプチド１−アミノ末端ＤＸＴＲＶＨＡＧＲＬＥＨＥＳＷＰＰＡＡＱＴＡＧＡ
ＨＲＰＳＶＲＴＦＶ（配列番号２３）； ペプチド２−トリプシン作用ＲＤＧＴＬＶＴＧＹＬＳＥＥＥＶＬＤＴＥＮ（配
列番号２４）；および ペプチド３−トリプシン作用ＧＩＮＬＷＥＭＡＥＦＬＬＫ（配列番号２５） である。
【００６１】 これらのペプチド配列と同一である配列についてタンパク質、ヌクレオチドお
よびＥＳＴデータベースを検索し、いくつかのヒトおよびマウスＥＳＴがそれら
のアミノ末端でこの３つのペプチドの配列を有していることが分かった。３つの
ヒト幼児脳ＥＳＴクローンおよび１つのマウス胎児クローンをＡＴＣＣから入手
して配列決定した。３つのヒトクローンはそれらの３’末端における総長以外は
総て同一であり、マウスクローンとは、マウスＥＳＴが３つのヒト脳ＥＳＴには
いずれにも存在しない１０２ｂｐの領域を含むこと以外は実質的に同一であった
。約７００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片をヒトｃＤＮＡクローン（ＡＴ
ＣＣ＃３６７５２４）から切り出し、これを用いてＴｒｉｐｌＥｘベクター(Clo
ntech)に方向指定クローニングを行ったヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをプロー
ビングした。このライブラリーから単離してプラスミド（ｐＴｒｉｐｌＥｘ）へ
変換した陽性クローンのうち、最大のもの（２２００ｂｐ）をクローン６．５と
表し、これを後の解析に用いた。
【００６２】 このｃＤＮＡクローンの両鎖について完全配列決定を行ったが、これは脱グリ
コシル化成熟型ウシ肝臓ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの大きさと一
致する、約５０ｋＤａの成熟タンパク質と推定される新規な配列である。
【００６３】 塩基５１２番に固有ＢａｍＨＩ部位、そして塩基１５８１番に固有ＨｉｎｄＩ
Ｄ部位がある。３つのウシペプチド配列（ペプチド１、２および３）の総てが判
明した。ヒトのおけるペプチド２および３の配列はウシ配列と１００％同一であ
るが、ヒトにおけるアミノ末端ペプチドはウシ配列と６７％同一であるに過ぎな
かった。ヒト肝臓クローンは、ヒト脳ＥＳＴには存在しなかった選択的スプライ
シングセグメントの特徴を有する１０２塩基対の挿入配列を含んでいる。親水性
プロットでは、アミノ酸４４８〜４７４の疎水性膜貫通領域と、シグナル配列モ
チーフに適合するアミノ酸８〜２４のもう１つの疎水領域の存在を示し、Ｇ２４
とＧ２５の間にシグナル配列切断部位が存在する可能性がある。６つのＡｓｎ−
Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ潜在的Ｎ結合グリコシル化部位があり、そのうち１つが１０
２ｂｐ挿入配列内にある。これらの部位は総て、推定されるトランスメンブラン
領域のアミノ末端にある。これらの特徴はホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃア
ーゼがゴルジ体の管腔中にアミノ末端を、またサイトソルにカルボキシル末端を
有するＩ型膜貫通タンパク質であることを示している。この配向は、これまでに
II型膜貫通タンパク質であることが示されている糖タンパク質のプロセッシング
に関わる他のグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼのものとは異
なっている。
【００６４】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ単量体のアミノ酸配列は配列番号６
のアミノ酸５０〜５１５で示されている。シグナルペプチドは配列番号６のアミ
ノ酸１〜２４で示され、プロセグメントは配列番号６のアミノ酸２５〜４９で示
されている。ヒトｃＤＮＡは上記の技術を用いてクローニングした。会合してホ
スホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ四量体を形成する単量体のヌクレオチド
配列は配列番号７のヌクレオチド１５１〜１５４８で示されている。シグナル配
列のヌクレオチド配列は配列番号７のヌクレオチド１〜７２で示されている。プ
ロペプチドのヌクレオチド配列は配列番号７のヌクレオチド７３〜１５０で示さ
れている。
【００６５】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのネズミｃＤＮＡは配列番号１８で
示されている。ネズミ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの推定アミノ
酸配列は配列番号１９で示されている。ヒトおよびマウス酵素の推定アミノ酸配
列の比較により、これらのタンパク質は約８０％の同一性を有し、極めて相同で
あることが証明される。相同性が９０％を超える活性部位の領域では特にそうで
る。ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのネズミ遺伝子は配列番号１４で
示されている。
【００６６】 ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ遺伝子はデータベース検索に
よって同定された。この配列は染色体１６．１３．３からクローン１６５Ｅ７(G
enBank AC007011.1, gi4371266)の配列決定の際に決定された。興味深いことに
、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ遺伝子は配列を解読するのに用いら
れるＳＣＡＮプログラムによっては同定されなかった。
【００６７】 遺伝子コードの縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号４、配列番号５および配列
番号７で示されるものとは異なる可能性があるが、配列番号１、配列番号２、配
列番号３および配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｃＮＡｃホスホ
トランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ酵素をなお
コードしている。かかる変異型ＤＮＡ配列は、例えばＰＣＲ増幅の際に生じるサ
イレント突然変異によるものであるかもしれないし、あるいは天然配列の意図的
な突然変異誘発産物であってもよい。従って本発明は、（ａ）天然哺乳類Ｇｌｃ
ＮＡｃホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡ
ｃアーゼ遺伝子、（ｂ）配列番号４、配列番号５、および配列番号７で示される
ヌクレオチド配列を含んでなるｃＤＮＡ、（ｃ）中程度のストリンジェント条件
下で、天然哺乳類ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびホスホジ
エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ遺伝子とハイブリダイズすることができ、かつ
、生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエス
テルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤＮＡ、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ
）または（ｃ）で定義されたＤＮＡに対する遺伝子コードによって縮重し、かつ
、生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエス
テルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＤＮＡから選択される、生物学的に活
性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−Ｇｌｃ
ＮＡｃアーゼをコードする同等な単離ＤＮＡ配列を提供する。かかるＤＮＡ同等
配列によってコードされるＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホ
ジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼタンパク質も本発明に含まれる。
【００６８】 ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的に機能的なＧｌ
ｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃア
ーゼをコードする配列は好ましくは少なくとも５０〜１００％相同である（なお
ここでは５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％なら
びにこの間のあらゆる値およびサブ領域を含む）。相同性は上記のようにソフト
ウエアＵＷＣＧを用いて決定できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件は当技術分野で公知であり、標的配列に対して特定の相同性を有する配列
をハイブリダイズさせるような条件を含むものとする。かかるストリンジェント
条件の例としては標準的なハイブリダイゼーションバッファー中、６５℃でハイ
ブリダイズさせ、その後０．２Ｘ濃度のＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、４２〜
６５℃、好ましくは６５℃で洗浄するものがある。この条件およびその他のハイ
ブリダイゼーション条件はSambrook, J., Fritsch E.F., et al. (1989). Molec
ular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbo
r Laboratory Pressに開示されている。あるいはハイブリダイゼーション条件の
温度はヌクレオチド配列のＧＣ含量％および長さ、ハイブリダイゼーションバッ
ファー中の塩濃度によって様々であってよく、このようにハイブリダイゼーショ
ン条件は当技術分野で公知の手段によって計算することができる。
【００６９】 本発明によれば、所望のタンパク質に相当するＤＮＡを発現ベクターに組み込
み、そのＤＮＡを好適な宿主細胞で発現させて所望のタンパク質を産生させるこ
とによる、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−
ＧｌｃＮＡｃアーゼ、単離・精製された組換えＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェ
ラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ酵素の組換え発現が提供
される。
【００７０】発現ベクター 酵素をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターは十分公知の方法を用い
て作製できる。発現ベクターは哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由
来するものなど、好適な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結
されたＤＮＡ配列を含む。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレー
ター、エンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、ならびに転写および翻訳の
開始および終結を制御する適当な配列が挙げられる。調節配列が適当な酵素のＤ
ＮＡ配列と機能的に関連している場合に、ヌクレオチド配列は「作動可能に連結
」される。このようにプロモーターヌクレオチド配列が適当なＤＮＡ配列の転写
を制御する場合に、そのプロモーターヌクレオチド配列はＧｌｃＮＡｃホスホト
ランスフェラーゼまたはホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼＤＮＡ配列に
作動可能に連結される。
【００７１】 通常、複製起点、およびそれによって形質転換体が同定される選択遺伝子によ
って確認された所望の宿主細胞内での複製能を発現ベクターへさらに組み込めば
よい。
【００７２】 さらに、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼまたはホスホジエステルα−
ＧｌｃＮＡｃアーゼとは天然に会合しない適当なシグナルペプチドをコードする
配列を発現ベクターに組み込むことができる。例えば、シグナルペプチドのＤＮ
Ａ配列（分泌リーダー）を酵素とフレーム内融合して、まず酵素をシグナルペプ
チドを含んでなる融合タンパク質として翻訳してもよい。意図される宿主細胞で
機能するシグナルペプチドは適当なポリペプチドの細胞外分泌を促進する。この
シグナルペプチドは、細胞から酵素が分泌された際にポリペプチドから切断すれ
ばよい。
【００７３】宿主細胞 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼの発現のために好適な宿主細胞としては、酵母、古細菌およびその他
の真核細胞が挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主とともに用い
られる適当なクローニング・発現ベクターは当技術分野で十分公知である（例え
ば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New Y
ork (1985)）。ベクターはプラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖ファージ
ベクター、または一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター
であってもよい。かかるベクターはＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための
十分公知の方法によってポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして細胞に導入
すればよい。またベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合、感染お
よび導入のための十分公知の方法によってパッケージングされた、またはカプセ
ル化されたウイルスとして細胞に導入してもよく、そうすることが好ましい。ウ
イルスベクターは複製能があっても、複製能が欠損していてもよい。後者の場合
、ウイルスの増殖は一般に宿主細胞を補足する際にしか起こらない。また、本Ｄ
ＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用い、細胞を含まない翻訳系を用いて酵素を産生
させることもできる。
【００７４】 本発明において宿主細胞として有用な原核生物としては、大腸菌(E. coli)ま
たはバチルス(Bacilli)などのグラム陰性またはグラム陽性菌が挙げられる。原
核宿主細胞では、ポリペプチドはその原核宿主細胞内で組換えポリペプチドの発
現を促進するためのＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ末端Ｍｅｔは
発現した組換えＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼまたはホスホジエステル
α−ＧｌｃＮＡｃアーゼポリペプチドから切断可能することができる。組換え原
核宿主細胞発現ベクターに一般に用いられるプロモーター配列としては、β−ラ
クタマーゼおよびラクトースプロモーター系が挙げられる。
【００７５】 原核宿主細胞に用いられる発現ベクターは一般に１以上の表現型選択マーカー
遺伝子を含んでなる。表現型選択マーカー遺伝子としては、例えば抗生物質耐性
を付与する、または独立栄養要求を与えるタンパク質をコードする遺伝子がある
。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例としては、クローニングベクターｐＢ
Ｒ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）などの市販のプラスミドに由来するものがある
。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むので、
形質転換された細胞を同定する簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２を用いて発
現ベクターを構築するには、適当なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ３２
２ベクターに挿入する。
【００７６】 その他の市販のベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３(Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Sweden)およびｐＧＥＭ１(Promega Biotec, Madison, Wis
consin, USA)がある。
【００７７】 組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般に用いられるプロモーター配列として
は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系(Chang e
t al., Nature 275:615, (1978);およびGoeddel et al., Nature 281:544, (197
9))、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Goeddel et al., Nucl. Acids
Res. 8:4057, (1980))およびｔａｃプロモーター(Maniatis, Molecular Cloning
: A Laboraory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412 (1982))が挙げ
られる。
【００７８】 本発明において宿主細胞として有用な酵母はとしては、サッカロミセス属(Sac charomyces )、ピチア属(Pichia)、K.アクチノミセス属(Actinomycetes)、および
クルイベロミセス属(Kluyveromyces)に由来するものがある。酵母ベクターはし
ばしば２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロ
モーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択マーカー遺伝子
を含む。酵母ベクターに好適なプロモーター配列としては、なかでも、メタロチ
オネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzeman et al., Biol. Chem. 25
5:2073, (1980))、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムタ
ーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのその他の解糖系酵素(Holland et al.,
Biochem. 17:4900, (1978))が挙げられる。酵母発現において用いられるその他
の好適なベクターおよびプロモーターはFleer et al., Gene, 107:285-195 (199
1)にさらに記載されている。酵母のためのその他の好適なプロモーターおよびベ
クター、ならびに酵母形質転換プロトコールは当技術分野で十分公知である。
【００７９】 酵母形質転換プロトコール当業者に公知である。かかるプロトコールの１つが
Hinnen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:1
929 (1978)によって記載されている。Hinnenのプロトコールは選択培地でＴｒｐ
．ｓｕｐ．＋形質転換体を選択するが、この選択培地は０．６７％酵母窒素塩基
、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μ
ｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００８０】 また、当技術分野で十分公知の哺乳類または昆虫宿主細胞培養系を用いて組換
えＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼまたはホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼポリペプチドを発現させることもでき、例えば、昆虫細胞における異
種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系(Luckow and Summers, Bio/Tec
hnology 6:47 (1988))、または哺乳類発現のためのチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞が使用できる。哺乳類宿主細胞発現ベクターのための転写および
翻訳制御配列はウイルスゲノムから切り出せばよい。一般に用いられるプロモー
ター配列およびエンハンサー配列はポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シ
ミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。
ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列を用いて、哺乳類宿主細胞で構造
遺伝子配列の発現のためのその他の遺伝エレメント、例えばＳＶ４０起点、初期
および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位
を提供することもできる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両者ともウ
イルスゲノムからウイルス複製起点も含み得る断片として容易に得られるので特
に有用である。哺乳類宿主細胞で用いられる発現ベクターの例は当技術分野で十
分公知である。
【００８１】 本発明の酵素は有益であれば、融合セグメントと結合した酵素を有する融合タ
ンパク質として発現させてもよい。この融合セグメントは、例えば融合タンパク
質をアフィニティークロマトグラフィーにより単離・精製することを可能にする
ことでタンパク質の精製をしばしば助ける。融合タンパク質は、酵素のカルボキ
シル末端および／またはアミノ末端のいずれかに結合した融合セグメントを含む
タンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換した組換え細胞を培養すること
によって生産することができる。好ましい融合セグメントとしては、限定される
ものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、二価の金属イオンに結合し得るポリヒスチジンセグメント、およびマルトー
ス結合タンパク質が挙げられる。さらに、ＨＰＣ−４エピトープ精製系を用いて
本発明の酵素の精製を助けてもよい。ＨＰＣ−４系は米国特許第５，２０２，２
５３号に記載されるが、その関連の記載は引用することにより本明細書の一部と
される。
【００８２】遺伝子活性化法による発現 クローニングしたｃＤＮＡ配列のトランスフェクションを含む発現方法に加え
、内生ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−Ｇｌ
ｃＮＡｃアーゼ遺伝子もプロモーターを変更することで発現させることができる
。
【００８３】 本発明の酵素の生産方法はまた、本明細書に記載されるＧｌｃＮＡｃホスホト
ランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの配列を用い
て、その関連の記載が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５
，９６８，５０２号に記載のタンパク質生産法に従って達成することもできる。
【００８４】発現および回収 本発明によれば、単離・精製されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼま
たはホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ酵素は上記の組換え発現系によっ
て生産してもよい。その方法は酵素の発現を誘導するに十分な条件下で、その酵
素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターで形質転換した宿主細胞を
培養することを含んでなる。次ぎに、用いる発現系にもよるが、培地または細胞
溶解物から酵素を回収する。当業者には公知であるが、組換えタンパク質を精製
する方法は用いる宿主細胞のタイプや組換えタンパク質が培地中に分泌されるか
どうかといった要因によって異なる。組換えタンパク質を分泌する発現系を用い
た場合には、まず培地を濃縮すればよい。濃縮ステップの後、濃縮物をゲル濾過
材などの精製母材に適用することができる。あるいは、例えばジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）のペンダント基を有する母材または支持体など、陰イオン交換
樹脂を用いてもよい。母材はアクリルアミド、寒天、デキストラン、セルロース
、その他、一般にタンパク質精製に用いられるタイプのものであってよい。また
、陽イオン交換ステップを用いてもよい。好適な陽イオン交換樹脂としては、ス
ルホプロピル、またはカルボキシメチル基を含んでなる種々の不溶性母材が挙げ
られる。さらに、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ材（例えば、メチルその他脂肪族ペンダ
ント基を有するシリカゲル）を用いた１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて酵素をさらに精製することもできる。上記
精製ステップのいくつかまたは総ての種々の組合せは当技術分野で十分公知であ
り、これらを用いて単離・精製された組換えタンパク質を得ることができる。
【００８５】 細菌培養において産生された組換えタンパク質は通常、まず宿主細胞を破砕し
、遠心分離し、不溶性のポリペプチドであれば細胞ペレットから、または可溶性
のポリペプチドであれば上清から抽出した後、１回以上の濃縮、塩析、イオン交
換、アフィニティー精製、またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによっ
て単離される。最後に、最終の精製ステップでＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。
細菌細胞は、凍結−解糖サイクル、音波処理、機械的破砕または細胞溶解剤の使
用をはじめとするいずれかの常法により破砕すればよい。
【００８６】高リン酸化リソソーム酵素の精製 もう１つの態様では、本発明は、高リン酸化リソソーム加水分解酵素およびか
かる加水分解酵素の製造方法を提供する。高リン酸化リソソーム加水分解酵素は
リソソーム貯蔵障害の治療のための臨床適用で使用することができる。
【００８７】 この方法は高マンノース構造を有するアスパラギン結合オリゴ糖を含むリソソ
ーム加水分解酵素を得、さらにＭ６Ｐは細胞膜Ｍ６Ｐ受容体に結合して、細胞お
よびリソソームへ容易に取り込まれることから、in vitroにおいてＭ６Ｐを付加
することによってα１，２結合または他の糖外鎖マンノースを改変してリソソー
ム貯蔵障害の治療に使用できる加水分解酵素を作出することを含んでなる。典型
的には高マンノース構造は６〜９個のマンノース分子と２個のＮ−アセチルグル
コサミン（ＧｌｃＮａｃ）分子からなる。好ましい具体例では、高マンノース構
造は７個のマンノースと２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）分子
からなる特徴的なＭＡＮ７（Ｄ２Ｄ３）異性体構造である。
【００８８】 高リン酸化リソソーム加水分解酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン
酸の、ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃから加水分解酵素のα１，２結合またはその他の糖
外鎖マンノースの６’位への転移を触媒するＧｌｃＮａｃホスホトランスフェラ
ーゼで高マンノース加水分解酵素を処理することにより作出する。次ぎに、この
ＧｌｃＮａｃホスホトランスフェラーゼによって改変された加水分解を、Ｎ−ア
セチルグルコサミンの除去を触媒して加水分解酵素上に末端Ｍ６Ｐを生じさせる
ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼで処理する。
【００８９】 本発明の１つの具体例では、ＧｌｃＮａｃホスホトランスフェラーゼで処理さ
れた加水分解酵素を単離して、その次ぎに何ら処理を施すことなく保存してよい
。次ぎに、このＧｌｃＮａｃホスホトランスフェラーゼで処理された加水分解酵
素を、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼでその加水分解酵素を処理する
ことによりさらに改変してもよい。
【００９０】 驚くことに、この方法によって生じたＭ６Ｐ含有加水分解酵素は、天然に存在
する、または既知の組換え加水分解酵素と比較した場合、高度にリン酸化されて
いる。本発明の高リン酸化リソソーム加水分解酵素は、既知の天然に存在するま
たは組換え加水分解酵素の約５％二リン酸化オリゴ糖という低さに比べ、約６％
〜約１００％の二リン酸化オリゴ糖を含む。
【００９１】 これらの高リン酸化加水分解酵素はＭ６Ｐ受容体に対してより高い親和性を有
することから、原形質膜受容体により細胞へより効果的に取り込まれる(Reuser,
A.J., Kroos, M.A., Ponne, N.J., Wolterman, R.A., Loonen, M.C., Busch, H
.F., Visser, W.J.,およびBolhvis, P.A. (1984), "Uptake and astability of
human and bovine acid alpha-glucosidase in cultures fibroblasts and skel
etal muscle cells from glycogenosis type II patients." Experimental Cell
Research 155: 178-189)。
【００９２】 陽イオン依存性Ｍ６Ｐ受容体に対する高親和性リガンドは、２個のＭ６Ｐ基（
すなわち、二リン酸化オリゴ糖）を含有するオリゴ糖である。二リン酸化オリゴ
糖は、一リン酸化オリゴ糖より３５００倍高い親和性で結合するので、実質的に
リソソーム酵素のＭ６Ｐへの高親和性結合が総て二リン酸化オリゴ糖の含有量に
よることになる(Tong, P.Y., Gregory, W., and Komfeld, S. (1989). "Ligand
interactions of the cation-independent mannose 6-phosohate receptor. The
stoichiometry of mannose 6-phosphate binding." Journal of Biological Ch
emistry 264: 7962-7969)。従って、種々のリソソーム酵素調製物の結合能を比
較するには、二リン酸化オリゴ糖の含有量を用いるのが適当である。
【００９３】 ２つの異なるリソソーム酵素のマンノース６リン酸の限度が公表されている。
チャイニーズハムスター卵巣細胞から分泌されたヒトα−ガラクトシダーゼＡの
オリゴ糖組成が公表されている(Matsuura, F., Ohta, M., Ioannou, Y.A., and
Desnick, R.I. (1988). "Human alpha-galactosidase A: characterization of
the N-linked oligosaccharides on the intracellular and secreted glycofor
ms overexpressed by Chinese hamster ovary cells." Glycobiology 8(4): 329
-39)。ヒドラジン分解によって遊離したα−ｇａｌＡの総てのオリゴ糖のうち、
二リン酸化されているのはわずかに５．２％であり(Zhao et al.)、ＣＨＯ細胞
により分泌された組換えヒトα−イズロニダーゼのオリゴ糖構造が部分的に同定
され(Zhao, K.W., Faull, K.F., Kakkis, E.D., and Neufeld, E.F. (1997). "C
arbohydrate structure of recombinant human alpha-L-iduronidase secreted
by Chinese hamster overy cells." J Biol Chem 272(36): 22758-65)、微量の
オリゴ糖が二リン酸化されたことが実証されている。用いられた定性法では、リ
ン酸化されたオリゴ糖の画分の同定はできなかった。
【００９４】 ＣＨＯ細胞によるヒト酸性α−グルコシダーゼの産生および分泌が報告されて
いる(Van Hove, J.L., Yang, H.W., Wu, J.Y., Brady, R.O., and Chen, Y.T. (
1996). "High level production of recombinant human lysosomal acid alpha-
glucosidase in Chinese hamster overy cells which targets to heart muscle
and corrects glycogen accumulation in fibroblasts from patients with Po
mpe disease." Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 93(1)
: 6570)。この調製物の炭水化物構造はこの刊行物では同定されていない。ｓか
し、この調製物を得て、分析されている。その結果は以下の実施例で示すが、１
％未満のオリゴ糖がいずれかのＭ６Ｐを含んでいることを示し、二リン酸化オリ
ゴ糖は検出できなかった。これらのデータを考え併せると、組換えリソソーム酵
素の既知の調製物は５．２％以下のリン酸化オリゴ糖しか含まないことが示され
る。公知の技術ではより高いリン酸化リソソーム酵素の製造は達成されそうにな
いものと思われる。ヒト胎盤から精製された天然に存在するヒト酸性α−グルコ
シダーゼは非常に低いレベルのＭ６Ｐしか含まない(Mutsaers, Ｊ.H.G.M., Van
Halbeek, H., Vliegenthart, J.F.G., Tager, J.M., Reuser, A.J.J., Kroos, M
., and Galjaard, H. (1987). "Determination of the structure of the carbo
hydrate chains of acid α-glucosidase from human plazenta." Biochemica e
t Biophysica Acta 911: 244-251)。リン酸塩の一または二リン酸化オリゴ糖の
いずれかとしての配置は同定されていないが、いずれかのＭ６Ｐを含むオリゴ糖
は１％未満であった。
【００９５】 本発明の高リン酸化加水分解酵素は、細胞およびリソソームへより容易に取り
込まれることから酵素置換療法に有用である(Reuser, A.J., Kroos, M.A., Ponn
e, N.J., Wolterman, R.A., Loonen, M.C., Busch, H.F., Visser, E.J., and B
olhuis, P.A. (1984). "Uptake and stabolity of human and bovine acid alph
a-gkucosidase in cultured fibroblasts and skeletal muscle cells from gky
cogenosis type II patients." Experimental Cell Research 155: 178-189)。
【００９６】 Ｍ６Ｐ受容体系を用いるリソソーム酵素は本発明の方法に従って処理できる。
例としては、α−グルコシダーゼ（ポーンプ病）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（フ
ルラー症候群）、α−ガラクトシダーゼＡ（ファブリー病）、アリールスルファ
ターゼ（マロトー・ラミー症候群）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフ
ァターゼまたはβ−ガラクトシダーゼ（モルキオ症候群）、イズロネート２−ス
ルファターゼ（ハンター症候群）、セラミダーゼ（ファーバー病）、ガラクトセ
レブロシダーゼ（クラッベ病）、Ｂ−グルコロニダーゼ（スライ症候群）、ヘパ
ランＮ−スルファターゼ（サンフィリポ症候群Ａ）、Ｎ−アセチル−α−グルコ
サミニダーゼ（サンフィリポ症候群Ｂ）、アセチルＣｏＡ−α−グルコサミニド
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサミン−６スルファタ
ーゼ（サンフィリポ症候群Ｄ）、ガラクトース６−スルファターゼ（モルキオＡ
）、アリールスルファターゼＡ、ＢおよびＣ（多発性スルファターゼ欠損症）、
アリールスルファターゼＡセレブロシド（異染性白質萎縮症）、ガングリオシド
（ムコリピドーシスIV）、酸性β−ガラクトシダーゼＧＭ１ガルグリオシド（Ｇ Ｍ１ ガングリオシドーシス）、酸性β−ガラクトシダーゼ（ガラクトシアリドー
シス）、ヘキソサミニダーゼＡ（テイ・サックス病および変異種）、ヘキソサミ
ニダーゼＢ（ザンドホフ病）、α−フコシダーゼ（フクシドーシス（Fucsidosis
））、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（シンドラー病）、糖タンパク質
ノイラミニダーゼ（シアリドーシス）、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ（
アスパルチルグルコサミン尿症）、酸性リパーゼ（ウォルマン病）、酸性セラミ
ダーゼ（ファーバー脂肪肉芽腫症）、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、その
他のスフィンゴミエリナーゼ（ニーマン・ピック病）が挙げられる。
【００９７】 いずれかの特定のリソソーム加水分解酵素を本発明の酵素で処理する方法は当
業者の技術の範囲内である。一般に、約１０ｍｇ／ｍｌ濃度のリソソーム加水分
解酵素および約１００，０００単位／ｍＬ濃度のＧｌｃＮａｃホスホトランスフ
ェラーゼを、ｐＨを約６〜７に維持するバッファーおよび反応を促進するために
必要とされる安定剤または補酵素の存在下、約３７℃で２時間インキュベートす
る。次ぎにこの系にホスホジエステルα−ＧｌｃＮａｃアーゼを約１０００単位
／ｍＬの濃度まで加え、この系さらに約２時間インキュベートする。その後、高
リン酸化オリゴ糖を有する改変されたリソソーム酵素を常法により回収する。
【００９８】 好ましい具体例では、１０ｍｇ／ｍｌのリソソーム加水分解酵素を、５０ｍｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．７、５ｍＭ ＭａＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２
ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ中、３７℃で２時間、１００，０００単位／ｍＬの
ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼとともにインキュベートする。次ぎに、
ホスホジエステルα−ＧｌｃＮａｃアーゼ１０００単位／ｍＬを加え、インキュ
ベーションをさらに２時間続ける。その後、改変された酵素をＱ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅでのクロマトグラフィーおよびＮａＣｌでの段階的溶出により精製する。
【００９９】高マンノースリソソーム加水分解酵素を得る方法 本発明に従う治療のための高マンノースリソソーム加水分解酵素は、例えば天
然に存在する酵素を単離・精製することにより、あるいはタンパク質生産のため
の組換え法をによって、いずれかの通常の供給源から得ることができる。高マン
ノースリソソーム加水分解酵素は、例えば酵母細胞、昆虫細胞、その他の真核細
胞、形質転換チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、またはその他の
哺乳類細胞など、高マンノース構造を有するオリゴ糖改変タンパク質を生じるい
ずれかの宿主細胞系で、特定の加水分解酵素をコードするＤＮＡを発現させるこ
とによって製造することができる。
【０１００】 １つの具体例では、高マンノースリソソーム加水分解酵素は高マンノース構造
を有するペプチドを発現し得る変異型酵母を用いて製造される。これらの酵母と
して、変異型Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)ΔｏｃｈＩ、ΔｍｎｎＩが挙げら
れる(Nakanishi-Shindo, Y., Nakayama, K.I., Tanaka, A., Toda, Y. and Jiga
mi, Y. (1993). "Structure of the N-linked oligosaccharides that shown th
e complete loss of α-1,6-polymannose outer chain from ochI mnnI, and oc
hI mmnI alg3 mutants of Saccharomyces cerevisiae." Journal of Biological
Chemistry 268: 26338-26345)。
【０１０１】 好ましくは高マンノースリソソーム加水分解酵素は、特定の阻害剤の存在下で
培養された過剰発現性形質転換昆虫、ＣＨＯまたはその他の哺乳類細胞を用いて
製造される。通常にはリソソーム加水分解酵素を発現する細胞は、ＧｌｃＮａｃ
ホスホトランスフェラーゼの基質としては働かないシアリル化二アンテナ性複合
体型グリカンをもっぱら含む酸性α−グルコシダーゼを分泌することから、Ｍ６
Ｐ受容体を用いるように改変することができない。
【０１０２】 本発明によれば、細胞が、上記の方法に従って改変できる高マンノース加水分
解酵素を分泌できるよう、組換え加水分解酵素を発現するＤＮＡを含む形質転換
細胞を操作する新たな方法が発見された。この方法では、α１，２−マンノシダ
ーゼ阻害剤の存在下で形質転換細胞を培養し、培地から高マンノース組換え加水
分解酵素を回収する。α１，２−マンノシダーゼを阻害することで、酵素がマン
ノースを切り取ってしまうのを防ぎ、細胞に高マンノース構造を有する糖タンパ
ク質を分泌させる。高マンノース加水分解酵素は常法を用いて培地から回収し、
本明細書の方法に従ってＧｌｃＮａｃホスホトランスフェラーゼおよびホスホジ
エステルαＧｌｃＮＡｃアーゼで処理してＭ６Ｐを有する、従って膜のＭ６Ｐ受
容体と結合して細胞に取り込ませることができる加水分解酵素が得られる。好ま
しくは細胞はＣＨＯ細胞であり、加水分解酵素はＭＡＮ７（Ｄ２Ｄ３）構造を有
する分泌型のものである。図３はこの方法の反応スキームを示す。
【０１０３】 好ましい具体例では、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（「ｒｈ−ＧＡＡ」
）は、α１，２−マンノシダーゼ阻害剤を添加することで改変したイスコブ(Isc
ove)の培地でｒｈ−ＧＡＡを分泌するＣＨＯ細胞を培養することで製造される。
培地からｒｈ−ＧＡＡを免疫沈降させた後、Ｎ−グリカナーゼまたはエンドグリ
コシダーゼ−Ｈのいずれかで消化すると、α１，２−マンノシダーゼ阻害剤の存
在下では、その阻害剤の不在下で分泌した調製物で見られる複合体構造よりも高
いマンノース構造を保持していることが証明される。次ぎに、分泌した、高マン
ノース構造を有するｒｈ−ＧＡＡを、好ましくはまずＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ、フェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのイオン交換クロマトグラフィーおよび
セファデックスＧ−１００でのアフィニティークロマトグラフィーで始めるクロ
マトグラフィーにより精製して均一とする。次ぎに精製されたｒｈ−ＧＡＡをin
vitroにてＧｌｃＮａｃホスホトランスフェラーゼで処理してＧｌｃＮａｃホス
ホ−マンノースジエステルに対して特異的なマンノースに変換する。次ぎにこの
ＧｌｃＮａｃホスホマンノースジエステルを、ホスホジエステルαＧｌｃＮＡｃ
アーゼで処理することでＭ６Ｐ基へ変換する。実験では７４％のｒｈ−ＧＡＡオ
リゴ糖がリン酸化された（６２％が二リン酸化され、１２％が一リン酸化された
）ことを示す。各ｒｈ−ＧＡＡ分子は７つのＮ結合したオリゴ糖を含むことから
、１００％のｒｈ−ＧＡＡ分子がマンノースリン酸修飾を含むと考えられる。
【０１０４】 本発明ではいずれの１，２−マンノシダーゼ阻害剤でも働き得る。好ましくは
阻害剤はデオキシマンノジリマイシン（ｄＭＭ）、キフネンシン、Ｄ−マンノノ
ラクタムアミドラゾン、およびＮ−ブチル−デオキシマンノジリマイシンからな
る群から選択される。最も好ましくは阻害剤はデオキシマンノジリマイシンであ
る。
【０１０５】リソソーム貯蔵障害の治療 さらなる態様では、本発明は、疾病を治療する量の本発明の高リン酸化リソソ
ーム加水分解酵素を対応するリソソーム貯蔵障害患者に投与することによる、リ
ソソーム貯蔵障害に治療法を提供する。用量は疾病および患者によって異なるが
、酵素は一般に一ヶ月に体重５０ｋｇの患者当たり約０．１〜約１０００ｍｇ、
好ましくは一ヶ月に体重５０ｋｇの患者当たり約１〜約５００ｍｇの量で患者に
投与する。本発明の高リン酸化酵素は、天然に存在するまたは低リン酸化酵素よ
りも細胞およびリソソームにより効果的に取り込まれることから、その疾病の治
療に効果的である。各疾病で、その疾病が現れる重篤度および年齢は、患者に存
在する残存リソソーム酵素の量に関数であり得る。リソソーム貯蔵障害を治療す
る本方法はそれ自体、いずれかまたはあらゆる疾病の進行段階において高リン酸
化リソソーム加水分解酵素を提供することを含む。
【０１０６】 このリソソーム酵素は常法のいずれかによって投与する。例えば、この酵素は
酵素およびいずれかの医薬上許容される担体を含有する医薬組成物の形態で、あ
るいはリポソームまたは徐放性医薬組成物などの送達系により投与することがで
きる。「医薬上許容される」とは、生理学上許容され、典型的には投与した際に
アレルギーまたは胃の不調や目眩といった望ましくない反応を生じない分子およ
び組成物をいう。好ましくは「医薬上許容される」とは、動物、好ましくはヒト
に適用される連邦政府もしくは合衆国政府の規制機関、または米国薬局方その他
の一般の認知されている薬局方によって認可されていることを意味する。「担体
」とは、それとともに化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または
ビヒクルをいう。かかる医薬担体は生理食塩水溶液、デキストロース溶液、グリ
セロール溶液、石油系、動物性、植物性または合成起源（落花生油、大豆油、鉱
油、またはゴマ油）のオイルを用いて製造したものなどの水および油エマルショ
ンといった滅菌液体であってよい。水、生理食塩水溶液、デキストロース溶液、
およびグリセロール溶液は好ましくは特に注射液用の担体として用いられる。
【０１０７】 本酵素または組成物は酵素またはそれらの組成物に適合する標準法のいずれに
よっても投与できる。例えば、本酵素または組成物は非経口、経皮、または粘膜
経由、例えば経口もしくは経鼻投与できる。好ましくは酵素または組成物は静脈
注射により投与される。
【０１０８】 以下、実施例により本発明の具体例を示すが、それらは添付の特許請求の範囲
に示される本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例では、記載され
る総ての方法は特に断りのない限り通常のものである。
【０１０９】
【実施例】材料および方法 泌乳ウシ乳房は、Mikkelson Beef, Inc.(Oklahoma City, OK)から得た。Ｕｌ
ｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳカラムは、Beckman Instrumentsから得た。Ｍｉｃ
ｒｏｓｏｒｂ ＭＶ−ＮＨ２カラムは、Rainin Instrument Co., Inc.(Woburn,
MA)から得た。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；末端標識用）
、Ｎａ１２５ＩおよびＬｕｂｒｏｌ（Ｃ１６Ｈ３３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３Ｈ）
はICN(Costa Mesa, CA)から得た。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６（調製用）、ＤＥＡＥ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥの分子量標準、ＨｉＴｒａｐ−タンパク質ＧカラムおよびＭｏｎｏ Ｑ
カラムは、Pharmacia Biotech Inc.から得た。３Ｍ−Ｅｍｐｈａｚｅ Ｂｉｏｓ
ｕｐｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ ＡＢ１、ＩＯＤＯ ＧＥＮヨウ素化試薬およびＢ
ＣＡタンパク質アッセイ試薬は、Pierceから得た。グリセロール、スクロース、
α−メチルマンノシド、α−メチルグルコシド、リアクティブグリーン(reactiv
e green) １９−アガロース、デオキシコール酸ナトリウム、ベンズアミジン、
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｔｒｉｓ、ウサ
ギ抗マウスＩｇＧおよびマウスモノクローナル抗体イソタイプィング試薬(isoty
ping reagent)は、Sigmaから得た。
【０１１０】 ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱは、PerSeptive Biosystems(Cambridge, MA)から得た
。ＰｒｏＢｌｏｔｔポリビニリデンジフルオリドメンブランは、Applied Biosys
tems Inc.(Foster City, CA)から得た。ＱＴ１２型回転タンブラーは、LORTONE,
Inc.(Seattle, WA)から得た。マウス免疫グロブリン標準パネルは、Southern B
iotechnology Associates, Inc.(Binningham, AL)から得た。組換えインターロ
イキン−６、ブタウテロフェリンおよびモノクローナル抗体ＢＰ９５は、同僚か
らの譲渡されたものであった。他の化学薬品は試薬用またはそれ以上であり、一
般的な供給者からのものであった。
【０１１１】実施例１ ウシＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼに特異的なモノクローナル抗体の 作製 ウシＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼを、記載された(Bao, M., Boot
h J. L., et al. (1996). "Bovine UDP-N-acetylglucosamine: Lysosomal enzym
e N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase. I. Purification and subunit
structure," Journal of Biological Chemistry 271: 31437-31445)ように３０
，０００倍に部分精製し、マウスの免疫化に用いた。免疫マウスの脾臓を取り出
し、脾臓細胞とＳＰ２／０骨髄腫細胞とをHarrow(Harrow, E. and Lane, D.(198
8). Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory)に従
って融合させた。融合物を９６ウェルプレートに入れ、ハイブリドーマが肉眼で
観察されるまでＨＡＴ培地で培養した。
【０１１２】 未精製のサンプルからＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼを捕捉し得る
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを、２００単位のハイブリドーマ
培地（２００μｌ）のインキュベーションにより同定した。部分精製したＧｌｃ
ＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼおよびＵｌｔｒａｌｉｎｋ（商標）マトリッ
クスに結合させた、タンパク質Ａ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ上での得られた免疫
複合体の捕捉。次いで、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼに対して向け
られたモノクローナル抗体を含有する免疫複合体を、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトラ
ンスフェラーゼ活性についての免疫複合体のアッセイにより同定した。この方法
論により、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼに対して向けられた４つの
モノクローナル抗体がスクリーニングした５回目の融合物で同定された。同定さ
れたハイブリドーマを同じアッセイを用いて２回サブクローニングし、標準法(H
arlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies: a laboratory manual. Cold Spr
ing Harbor Laboratory)に従ってＢＡＬＢマウスに腹水を生じさせた。さらなる
試験で使用するためにＰＴ１８標識されたモノクローナル抗体を選択した。
【０１１３】実施例２ ウシＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼの精製 屠殺時に泌乳ウシ乳腺（６ｋｇ）を回収し、直ちに１０ｃｍ厚さの薄片にし、
氷で冷やした。Waring工業用ブレンダーでホモジナイズした後、脱核(post-nucl
ear)上清画分を遠心分離により調製した。膜断片を高速遠心分離（３９，０００
×ｇ、４５分）により回収し、膜タンパク質を４％Ｌｕｂｒｏｌ、０．５％デオ
キシコール酸塩に溶解した。Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ（商標）マトリックスと結合し
たモノクローナル抗体ＰＴ１８ １０ｍｌ（置換５ｍｇ／ｍｌ）を加えてインキ
ュベーションして、溶解した膜画分からＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラー
ゼを特異的に吸着させた。次いで、マトリックスを低速遠心分離により回収し、
０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．００５Ｍ ＭｇＣｌ２、１
Ｍ ＮａＣｌを含有する０．３％Ｌｕｂｒｏｌバッファーで洗浄した。次いで、
カラムを２カラム容量の０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．００
５Ｍ ＭｇＣｌ２、０．３％Ｌｕｂｒｏｌバッファーで洗浄した。次いで、Ｇｌ
ｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼを０．１０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ１
０．０、０．００５Ｍ ＭｇＣｌ２、０．３％Ｌｕｂｒｏｌでカラムから溶出し
、１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．０で中和した。典型的には
、回収率はホモジナイズした組織に存在するＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェ
ラーゼ活性の２０〜５０％であり、処理を施した１０ｋｇの組織から約０．５ｍ
ｇの酵素が回収される。
【０１１４】実施例３ ウシＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列決定 実施例３Ａ 各サブユニットの還元、アルキル化および分離 ウシＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼ、１．９ｍｇを、９％蟻酸で平
衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スーパーファインカラムで脱塩し、凍結乾
燥した。凍結乾燥したタンパク質を１ｍｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．６、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴに溶
解し、溶液中でＮ２ガスを泡立たせて脱気し、３７℃で１時間インキュベートし
た。この溶液をヨード酢酸で５ｍＭにし、暗室内３７℃でさらに２．５時間イン
キュベートした。次いで、溶液をβ−メルカプトエタノールで１５ｍＭにし、９
％蟻酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スーパーファインカラムでクロ
マトグラフィーに付した。ボイド画分をプールし、凍結乾燥した。各サブユニッ
トを、９％蟻酸で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２の１．０×３０ｃｍカラム
でのクロマトグラフィーにより分離した。
【０１１５】実施例３Ｂ 各サブユニットのアミノ末端配列決定 ウシＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼ、０．５ｍｇを硫酸ドデシルナ
トリウムで平衡化し、硫酸ドデシルナトリウムの存在下で６％ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動に付した。次いで分離したサブユニットをＰＶＤＦメンブラン
で電気泳動させ、タンパク質バンドをクーマシーブルー染色により検出した。次
いで、個々のサブユニットに対応するバンドをかみそりの刃で切り出し、Applie
d Biosystems ４９２型タンパク質シーケンサーでアミノ末端配列決定を行った
。α−サブユニットのアミノ末端配列はMet Leu Leu Lys Leu Leu Gln Arg Gln
Arg Gln Thr Tyr（配列番号２６）であった。β−サブユニットのアミノ末端配
列はAsp Thr Phe Ala Asp Ser Leu Arg Tyr Val Asn Lys Ile Leu Asn Ser Lys
Phe Gly Phe Thr Ser Arg Lys Val Pro Ala His（配列番号２７）であった。γ
−サブユニットのアミノ末端配列はAla Lys Met Lys Val Val Glu Glu Pro Asn
Thr Phe Gly Leu Asn Asn Pro Phe Leu Pro Gln（配列番号２８）であった。
【０１１６】実施例３Ｃ β−およびγ−サブユニットの内部アミノ酸配列 実施例３Ｂで分離したβ−およびγ−サブユニットを質量比１／４０のトリプ
シンで０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、３７℃で一晩処理した。次
いで、トリプシンによって生じた断片を、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化し
たＣ１８カラムでの逆相クロマトグラフィーにより分離し、アセトニトリルの直
線勾配により展開させた。次いで、十分に分離したピークについて、実施例３Ｂ
に記載したようにアミノ末端配列決定を行った。β−サブユニットから配列決定
されたペプチドは、配列Ile Leu Asn Ser Lys（配列番号２９）、配列Thr Ser P
he His Lys（配列番号３０）、配列Phe Gly Phe Ser Arg（配列番号３１）およ
び配列Ser Leu Val Thr Asn Cys Lys Pro Val Thr Asp Lys（配列番号３２）を
有していた。γ−サブユニットから配列決定されたペプチドは、配列Leu Ala Hi
s Val Ser Glu Pro Ser Thr Cys Val Tyr（配列番号３３）を有していた。配列A
sn Asn Pro Phe Leu Pro Gln Thr Ser Arg Leu Gln Pro（配列番号３４）のキモ
トリプシン消化によりγ−サブユニットの第２のペプチド配列が得られた。
【０１１７】実施例３Ｄ α−サブユニットの内部アミノ酸配列 α−サブユニットの内部ペプチド配列は以下のようにして得た。ウシＧｌｃＮ
Ａｃ−ホスホトランスフェラーゼを、上記のように還元し、アルキル化し、電気
泳動に付し、ＰＶＤＦメンブランに移した。α−サブユニットバンドを切り出し
、トリプシンによるin situ消化によりトリプシンペプチドを生成し、アセトニ
トリル／トリフルオロ酢酸で溶出し、逆相ＨＰＬＣにより分画した。次いで各ピ
ークをマトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量分析法(MALDI-MS)により調
べ、単一質量を含有するピークについて、上記のようにアミノ末端配列決定を行
った。α−サブユニットから決定されたペプチド配列は、Val Pro Met Leu Val
Leu Asp Xaa Ala Pro Thr Xaa Val Xaa Leu Lys（配列番号３５）およびGlu Leu
Pro Ser Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Asp Val Phe Asn Val Ala Lys
Pro Lys（配列番号３６）である。
【０１１８】実施例４ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニットｃＤＮＡの クローニング 単離したウシβ−サブユニットから決定されたアミノ末端タンパク質配列を用
い、プログラムｔｂｌａｓｔｎによりＥｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｔａｇ（ＥＳＴ）データベースを検索した。Altschul, S. F., Gish W., et al.
(1990). "Basic Local Alignment Search Tool," Journal of Molecular Biolo
gy 215: 403-410。この検索で、これまでに位置クローニング法で同定された部
分マウスｃＤＮＡを確認した。Cordes, S. P. and Barsh, G. S. (1994). "The
mouse segmentation gene kr encodes novel basic domain-leucine zipper tra
nscription factor," Cell 79: 1025-11034。
【０１１９】 フォワードＰＣＲプライマーをマウス配列に基づいて設計し、鋳型としてマウ
ス肝臓ポリＡ ＲＮＡを用い、１，８４８ｂｐ産物のＲＴ−ＰＣＲ増幅用オリゴ
ｄＴリバースプライマーとともに用いた。ＰＣＲ産物をクローニングして配列決
定し、決定された総てのβ−サブユニット配列が含まれることを証明して、それ
がネズミβ−サブユニットをコードすることを示した。
【０１２０】 ヒトβ−サブユニットｃＤＮＡを、低ストリンジェンシー条件下（５５℃、２
ＸＳＳＣ）でＡＴＣＣから得たサイズ選択ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー(Fisch
man, K., Edman J. C., et al. (1990), "A murine fer testis-specific trans
cript (fer T encodes a truncated fer protein, "Molecular and Cellular Bi
ology 10: 146-153)をランダム６量体標識したネズミβ−サブユニットｃＤＮＡ
とともにスクリーニングしてクローニングした。α／β−サブユニット前駆体ｃ
ＤＮＡの残りの部分を、ヒトβ−サブユニットをコードするｃＤＮＡ部分から始
めるウォーキング法および標準ライブラリースクリーニング法とを組み合わせて
クローニングした。さらに、ＥＳＴデータベース検索を用い、対応するリポジト
リー(repository)から得られ、配列決定されたヒトα／β ｃＤＮＡ部分を含む
クローンを同定した。同時に、これらの方法によって全長ヒトα／β−サブユニ
ット前駆体ｃＤＮＡ配列の決定がなされた。この配列を含むクローンを好適な断
片を用いて構成し、ｐＵＣ１９にクローニングした。５５９７ｂｐ配列は、配列
番号４で与えられており、ウシα−およびβ−サブユニットから決定された総て
のアミノ末端および内部ペプチド配列に相同なタンパク質配列をコードするもの
と推測されるＤＮＡ配列を含んでいる。
【０１２１】実施例５ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニットｃＤＮＡのクロ ーニング γ−サブユニットアミノ末端およびトリプシンペプチド配列を用い、プログラ
ムｔｂｌａｓｔｎによりＥｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳ
Ｔ）データベースを検索した。Altschul, S. F., Gish W., et al. (1990). "Ba
sic Local Alignment Search Tool," Journal of Molecular Biology 215: 403-
10。決定されたウシタンパク質配列と高い相同性を有する、３つのヒトＥＳＴ配
列が同定された。ＥＳＴ配列２８０３１４が決定されたｃＤＮＡクローン４８２
５０は、Genome Systemsから入手し、標準手法により配列決定した。このクロー
ンには、総ての決定されたタンパク質配列を含み、決定されたアミノ末端配列の
５’にシグナル配列を含んでいると思われる１１９１ｂｐ挿入物が含まれていた
。しかしながら、このクローンには開始メチオニンまたはいかなる５’非コード
配列もなかった。ｃＤＮＡの５’部分をＰＣＲにより得て、リバースプライマー
5'-GCGAAGATGAAGGTGGTGGAGGACC-3'（配列番号３７）およびＴ７プロモータープ
ライマーを、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ(GIBCO)のヒト脳ｃＤＮＡライブラリーの鋳
型ＤＮＡとともに反応に用いた。６５４ｂｐ産物を得て、ｐＣＲ２．１にクロー
ニングし、配列決定した。この配列により、増幅された産物にＥＳＴ２８０３１
４で同定された２３ｂｐの５’非コード配列、開始メチオニンおよびシグナルペ
プチドが含まれることが示された。γ−サブユニットの全長ｃＤＮＡ（ｐＢＣ３
６）を、クローニングしたＰＣＲ産物の７５ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片、
クローン４８２５０のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片およびＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ切断
したｐｃＤＮＡ３(Invitrogen)を連結して構成した。
【０１２２】実施例６ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニット遺伝子のク ローニング プラスミドＤＮＡを製造業者のプロトコールに従い、ヒト脳ｃＤＮＡライブラ
リー(Life Technologies)から調製した。このＤＮＡを、配列5'-TGCAGAGACAGACC
TATACCTGCC-3'（配列番号３８）および5'-ACTCACCTCTCCGAACTGGAAAG-3'（配列番
号３９）のプライマー、Fischer ScientificのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよ
びバッファーＡ、９４℃１分、５５℃１分および７９℃１分の３５サイクルを用
いるＰＣＲの鋳型として用いた。１０６ｂｐ産物を得て、アガロースゲル電気泳
動により精製し、GeneClean(Bio101)により単離し、ｐＣＲ２にクローニングし
た。ＤＮＡ配列決定により、ＥｃｏＲＩでの消化により切除され、ヒトゲノムＢ
ＡＣライブラリーのスクリーニングのためにGenome Systemsに寄託した１０６ｂ
ｐ挿入物を含む得られたプラスミドｐＡＤ３９を同定した。４つのヒトＢＡＣを
同定し、ＢＡＣ＃１４９５１を配列決定した。配列決定のため、ＢＡＣ＃１４９
５１をオクラホマ大学の同僚の研究室に寄託した。次いで、ＢＡＣを噴霧により
断片化し、断片をｐＵＣ１８にクローニングし、ショットガン配列決定を行った
。コンピューター解析によりコンティグを作成し、プライマーウォーキング法に
よりギャップを埋めた。ＢＡＣの配列は１７７，３６４ｂｐにわたっている。Ｇ
ｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニット前駆体遺伝子は８
０ｋｂにわたっており、２１エキソンとして配列されている。
【０１２３】実施例７ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット遺伝子のクロー ニング ヒトγ−サブユニット遺伝子を、全長ヒトサブユニットｃＤＮＡ配列に関する
NCBI High Throughput Genomic Sequence(HGT)データベースのｂｌａｓｔｎ検索
により同定した。この検索により、ヒトγ−サブユニット遺伝子を含むヒト第１
６染色体から誘導されたクローンＨＳ３１６Ｇ１２（ｇｉ４４９５０１９）を同
定した。ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット遺伝子
は約１２ｋｂにわたっており、１１エキソンとして配列されている。エキソン１
〜３および４〜１１は約９ｋｂの大きなイントロンによって分離されている。
【０１２４】実施例８ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニット前駆体ｃＤ ＮＡの改変発現プラスミドの作製 ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼ α／β ｃＤＮＡの発現ベクター
は以下のようにしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）に構築した。ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホ
スホトランスフェラーゼｃＤＮＡの５’非コード配列にある２つの上流ＡＴＧを
除去し、以下のようにしてコザック配列を改変した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に
クローニングしたヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼ ｃｔ／ｐ ｃ
ＤＮＡであるｐＡＤ９８の２断片を切り出した。１０６８ｂｐ ＸｈｏＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片および９７４６ｂｐ ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ断片を配列5'-CTAGCCACCATGG
GGTTCAAGCTCTTGCA-3'（配列番号４０）および5'-AGAGCTTGAACCCCATGGTGG-3'（配
列番号４１）を有するオリゴヌクレオチドと連結し、ｐＡＤ１０５を得た。ｃＤ
ＮＡクローンの３’末端近くのポリＡ配列を、ｃＤＮＡのＮｈｅＩ−ＢｇIII断
片とＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ切断したベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）とを連結す
ることで除去し、ｐＡＤ１２８を得た。
【０１２５】実施例９ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニット前駆体ｃＤ ＮＡの発現プラスミドの作製 ｐＡＤ１２８のＤＮＡ配列決定により、コード配列を分断するＡＡＡＡＡ配列
（配列番号４で示された２７６１〜２７６５番）の１つのＡの欠失が確認された
。これを補正する試みで、５９２９ｂｐ ＮｈｅＩ−ＭｆｅＩ断片と２７３６ｂ
ｐ ＮｈｅＩ−ＡｇｅＩ断片（両方ともｐＡＤ１２４由来の５１５ｂｐ Ｍｆｅ
Ｉ−ＡｇｅＩ断片を有するｐＡＤ１２８のもの）とを連結してプラスミドｐＡＤ
１３０を構築した。次いで、プラスミドｐＡＤ１３０を増殖させた後にプラスミ
ドｐＡＤ１３０の配列決定を行うと、ＡＡＡＡＡ配列がこの地点の配列を不安定
にするＡＡＡＡに再び戻っていたことが分かった。
【０１２６】 この不安定性を取り除くため、リジンをコードする最初のＡＡＡ（配列番号４
で示された２７６１〜２７６３番）をＡＡＧ（これもまたリジンをコードするも
のである）に変えて、コードされるアミノ酸を変えることなく不安定なＡＡＡＡ
Ａ配列を安定したＡＡＧＡＡに変えた。プラスミドｐＡＤ１３０を、２１４ｂｐ
ＭｆｅＩ−ＤｒａIII断片を除去し、それを補正配列を有する断片とを置き換
えることで補正した。補正ＭｆｅＩ−ＤｒａIII断片は、ｐＡＤ１３０を鋳型と
して、フォワードプライマー5'-GAAGACACAATTGGCATACTTCACTGATAGCAAGAATACTGGG
AGGCAACTAAAAGATAC-3'（配列番号４２）（下線を施した所望のＡＡＧＡＡ配列を
有するオリゴＴＴＩ２５）およびリバースプライマー5'-ACTGCATATCCTCAGAATGG-
3'（配列番号４３）（オリゴＴＴＩ２４）とともに用いるＰＣＲにより作製した
。ＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ II（＋）(Stratagene)のＥｃｏ
ＲＶ部位にサブクローニングし、ｐＭＫ１６を得た。挿入物を確認するために配
列決定し、２１５ｂｐ ＭｆｅＩ−ＤｒａIII断片を作製した。ベクターｐｃＤ
ＮＡ３．１（＋）(Invitrogen)のＭｆｅＩ−ＤｒａIII部位を避けるため、Ｎｈ
ｅＩ−ＸｂａＩ断片をｐＡＤ１３０から作製し、ｐＵＣ１９(Life technologies
)のＸｂａＩ部位にサブクローニングして、ｐＭＫ１５を構築した。ｐＭＫ１５
をＭｆｅＩおよびＤｒａIIIで切断し、６３１７ｂｐ断片を精製し、ｐＭＫ１６
のＭｆｅＩ−ＤｒａIII断片と連結し、ｐＵＣ１９に所望の安定した配列を含む
ｐＭＫ１９を作製した。
【０１２７】 α／β−サブユニットの補正ｃＤＮＡをＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片としてｐＭＫ
１９から切り出し、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−ＡのＫｐｎＩおよびＸｂａＩ
部位の間にサブクローニングし、ｐＭＫ２５を設計した。改変ヒトα／β−サブ
ユニット前駆体ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、配列番号２０で示されたｃＤＮＡ
を含むプラスミドｐＭＫ２５は、ヌクレオチド１〜３７６８番で示される。この
配列は配列番号４で示されたヌクレオチド配列１６５〜３９３２番の改変物に相
当しており、その改変物である。
【０１２８】実施例１０ 可溶性ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニット前駆 体ｃＤＮＡの発現プラスミドの構築 ｃＤＮＡの５’および３’末端をＰＣＲにより改変してヒトＧｌｃＮＡｃ−ホ
スホトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットのトランスメンブランドメイ
ンを除去し、それを用いて可溶性ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼを産
生する発現ベクターを構築することができるように、プラスミドｐＭＫ１９をＢ
ｇIIIで消化（配列番号２０で示された２２５番および２７０３番で切断）し、
自己連結し、増幅するｃＤＮＡの長さを約３．５ｋｂ〜１ｋｂま短縮した。この
プラスミドをｐＭＫ２１と名付けた。この方法では、αサブユニットのトランス
メンブランドメインを含む最初の４４アミノ酸（配列番号２０のヌクレオチド１
〜１３２番）をコードするヌクレオチドをＨｉｎｄIII部位に置き換え、βサブ
ユニットのトランスメンブランドメインを含む最後の４７アミノ酸（配列番号２
１のヌクレオチド３６２８〜３７６８番）をコードするヌクレオチドを停止コド
ンおよびＸｂａＩ部位に置き換える。
【０１２９】 プラスミドｐＭＫ２１を鋳型とし、次のプライマー：ＨｉｎｄIII部位（下線
部）、およびαサブユニットの推定トランスメンブランドメインを含んでなる最
初の４４のアミノ酸のコード配列を除去する５’末端のＰＣＲ断片を生成する、
配列番号２０のヌクレオチド１３３〜１５１番に相補的な配列（イタリック体）
を含むフォワードプライマー
【化１】 ＸｂａＩ部位（下線部）、２つの停止コドン（下記の場合）およびβサブユニッ
トの推定トランスメンブランドメインを含んでなる最後の４７アミノ酸のコード
配列を除去し、それを２つの停止コドンで置き換える３’末端のＰＣＲ断片を生
成する、配列番号２１のヌクレオチド３６０８〜３６２７番に相補的な配列（イ
タリック体）を含むリバースプライマー
【化２】 とともにＰＣＲに用いた。得られたＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ
II（＋）(Stratagene)のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。このプラス
ミドをｐＭＫ４２と名付け、これを配列決定してＰＣＲにより変異が導入されて
いないことを確認した。予め除去しておいたＢｇIII−ＢｇIII断片（配列番号２
０で示された２５５〜２７０３番）をｐＭＫ４２のＢｇIII部位にサブクローニ
ングして戻した。この断片の配向が正しいことを調べ、このプラスミドをｐＭＫ
４９と名付けた。このように、プラスミドｐＭＫ４９は、欠失したαサブユニッ
ト推定トランスメンブランドメインおよび２つの停止コドンで置き換えられたβ
サブユニット推定トランスメンブランドメインを有するヒトＧｌｃＮＡｃ−ホス
ホトランスフェラーゼα／β−サブユニット前駆体ｃＤＮＡのコード領域をフラ
ンキングする５’ＨｉｎｄIII部位および３’ＸｂａＩ部位を含んでなるｃＤＮ
Ａ（可溶性α／β−ｃＤＮＡ）を含むものであった。
【０１３０】 この「可溶性α／β−ｃＤＮＡ」は現在、便宜には、ＨＰＣ４エピトープ（可
溶性酵素の迅速精製に用いられる）および異なる分泌シグナルペプチドを含むよ
う構築されたベクターにサブクローニングすることができる。これらのｐｃＤＮ
Ａ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−Ａ＋タグ）ベクターは以下のようにして構築した： 異なる分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列およびＨＰＣ４エ
ピトープをコードするヌクレオチド配列をフランキングする５’−ＮｈｅＩ部位
および３’−ＨｉｎｄIII部位を含む合成オリゴヌクレオチドカセットを、Ｎｈ
ｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断したプラスミドｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−Ａ
に挿入した。以下のプラスミドを示されたカセットで作製した： １．ｐＭＫ４５−マウス免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチド（イタリック体の
配列）およびＨＰＣ４エピトープ（下線の配列）
【化３】
【０１３１】 １．ｐＭＫ４４−トランスフェリンシグナルペプチド配列（イタリック体）およ
びＨＰＣ４エピトープ（下線の配列）
【化４】
【０１３２】 １．ｐＭＫ４３−コザック配列に合うよう改変されたトランスフェリン分泌ペプ
チド配列（イタリック体）およびＨＰＣ４エピトープ（下線の配列）
【化５】
【０１３３】 「可溶性α／βサブユニット」をコードするｃＤＮＡを、ｐＭＫ４９からＨｉ
ｎｄIII−ＸｂａＩ断片として得て、種々のシグナルペプチドおよび可溶性分泌
酵素の精製を容易にするＨＰＣ４エピトープタグを有する総てのものとともに、
プラスミドｐＭＫ４３に挿入してｐＭＫ５０を、またｐＭＫ４４に挿入してｐＭ
Ｋ５１を、またｐＭＫ４５に挿入してｐＭＫ５２を作製することができる。これ
らのプラスミドは欠失した推定トランスメンブランドメインを有するヒトＧｌｃ
ＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／β−サブユニットをコードし得るプラス
ミドとなる。
【０１３４】実施例１１ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット前駆体ｃＤＮＡ の発現プラスミドの構築 ヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット前駆体ｃＤＮ
Ａを、ＥｃｏＲＩでの切断によりｐＡＣ５．１／Ｖ５−ＨｉｓのプラスミドｐＡ
Ｄ１３３から得た。このｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化したｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／
Ｈｉｓ−Ａに挿入し、配列番号５で示されたｃＤＮＡを含むプラスミドｐＭＫ１
７を作製した。プラスミドｐＭＫ１７をＭｌｕＩ（配列番号５で示された１２４
〜１２９番）およびＥｃｏＲＩ（配列番号５で示された１１０３〜１１０８番）
で消化し、次いで９８０ｂｐ ＭｌｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、配列番号５で示さ
れた９５〜１２３番に相当する位置を含むヌクレオチド配列をフランキングし、
それによってプラスミドｐＭＫ２６のアミノ末端、２４アミノ酸シグナルペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を除去するＨｉｎｄIII部位およびＭｌｕＩ部
位を有する合成二本鎖カセットとともにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳII（＋）
にサブクローニングした。プラスミドｐＭＫ２６を配列決定し、その配列を確認
した。次いで、除去されるシグナルペプチドを有するヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホ
トランスフェラーゼγサブユニットのアミノ酸をコードするｐＭＫ２６の補正ｃ
ＤＮＡを、ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＫ２６から切り出し、
種々のシグナルペプチドおよび可溶性γサブユニットの精製を容易にするＨＰＣ
４エピトープタグを有する総てのものとともに、プラスミドｐＭＫ４３に配置し
てｐＭＫ５８を、またｐＭＫ４４に配置してｐＭＫ５９を、またｐＭＫ４５に配
置してｐＭＫ６４を作製することができる。これらのプラスミドは欠失したその
シグナルペプチドを有するヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼγ−サ
ブユニットをコードし得るプラスミドとなる。
【０１３５】 α／β／γ分泌産物の挙動を調べるために、α／βサブユニット前駆体および
γサブユニットを２シストロン性のベクターｐＩＲＥＳ(Clontech)で同時発現さ
せた。これは、選択したシグナルペプチドおよびＨＰＣ４タグを有する所望のサ
ブユニットを発現するα／βおよびγ ｃＤＮＡをｐＩＲＥＳのＮｈｅＩ部位（
ＭＣＳ−Ａ）およびＸｂａＩ部位（ＭＣＳ−Ｂ）各々にサブクローニングするこ
とで行った。
【０１３６】実施例１２ ２９３Ｔ細胞のヒトＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼα／βおよびγサ ブユニットの一時的発現 プラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ６(Roche)を用い、製造業者の教示に従い、２９
３Ｔ細胞へトランスフェクトした。培地をトランスフェクション２３時間、４４
．５時間および７０時間後に回収した。発現したタンパク質を含むアリコートの
培地を、４℃で一晩インキュベーションしてＵｌｔｒａｌｉｎｋ ビーズ(Pierc
e)と結合させた抗ＨＰＣ４モノクローナル抗体（米国特許第５，２０２，２５３
号）で捕捉した。ビーズを洗浄し、結合していないタンパク質を除去し、直ちに
従前に記載された（参考文献）ようにホスホトランスフェラーゼ活性をアッセイ
した。
【０１３７】 ＨＰＣ４タグをコードする配列を含む、発現に用いたプラスミド総ては次の通
りであった：
【０１３８】 １．ｐＭＫ５０−ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−４の改変トランスフェリン分
泌ペプチドおよびα／βサブユニット
【０１３９】 ２．ｐＭＫ５１−ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−４のトランスフェリン分泌ペ
プチドおよびα／βサブユニット
【０１４０】 ３．ｐＭＫ５２−ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−４のマウス免疫グロブリン分
泌ペプチドおよびα／βサブユニット
【０１４１】 ４．ｐＭＫ７５−ｐＩＲＥＳの改変トランスフェリン分泌ペプチドおよびα／
βサブユニットならびに改変トランスフェリン分泌ペプチドおよびγサブユニッ
ト
【０１４２】 ５．ｐＭＫ８１−ｐＩＲＥＳのトランスフェリン分泌ペプチドおよびα／βサ
ブユニットならびにトランスフェリン分泌ペプチドおよびγサブユニット
【０１４３】 ６．ｐＭＫ７６−ｐＩＲＥＳのマウス免疫グロブリン分泌ペプチドおよびα／
βサブユニットならびにマウス免疫グロブリン分泌ペプチドおよびγサブユニッ
ト
【０１４４】 基質としてメチル−α−Ｄ−マンノシドおよびＵＤＰ−［β−３２Ｐ］−Ｇｌ
ｃＮＡｃを用いたホスホトランスフェラーゼアッセイで検出された発現量の、対
照としてのｐｃＤＮＡ６／Ｖ５／Ｈｉｓ−４でトランスフェクトした細胞との比
較を図４に示している。
【０１４５】実施例１３ ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼのα／β／γの発現および精製 酵素の発現および精製に関し、改変発現プラスミドをｐＥＥ１４由来の改変発
現ベクターにて構築する。このプラスミドはエピトープタグ付き可溶性ＧｌｃＮ
Ａｃ−ホスホトランスフェラーゼ分子の合成を指示する。α／β−サブユニット
前駆体を以下のようにして改変する：α−サブユニット細胞質およびトランスメ
ンブランドメインをコードするｃＤＮＡの５’部分を欠失させ、トランスフェリ
ンシグナルペプチド、続いてモノクローナル抗体ＨＰＣ４のエピトープをコード
するアミノ酸をコードするヌクレオチドで置き換える。ｃＤＮＡの３’部分を、
β−サブユニットトランスメンブランセグメント前に停止コドンを挿入して改変
する。ベクターｐＥＥ１４．１(Lonza Biologics)を、ｐＥＥ１４．１の特異な
ＭｌｕＩ部位に改変血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）プロモーターを含む８５０ｂ
ｐＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片を挿入して改変する。改変ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトラ
ンスフェラーゼα／β−サブユニット前駆体をコードするこのベクターをｐＥＥ
１４．１のＶＥＧＦプロモーターを含む野生型γ−サブユニット構築物とともに
、Ｆｕｇｅｎｅ６を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞で同時トランスフェクトし、９６ウ
ェルプレートで培養する。トランスフェクト細胞を２５μｍメチオニンスルホキ
シミンで選択し、プラスミドを５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭおよび５００
μＭメチオニンスルホキシミンを入れた９６ウェルプレートでの選択により増幅
させる。クローンを２組の９６ウェルプレートに選び取り、最も高い発現をして
いるクローンをドットブロッティング法およびモノクローナル抗体ＨＰＣ４によ
る免疫検出により選択する。最も高い発現をしているクローンを細胞工場で拡張
する。エピトープタグ付き可溶性組換えＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラー
ゼを、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、Ｕｌｔｒａｌｉ
ｎｋと結合させたモノクローナル抗体ＨＰＣ４でのクロマトグラフィーにより培
地から精製する。エピトープタグ付可溶性ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラ
ーゼを５ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２で溶出する。
【０１４６】実施例１４ ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼに特異的なモノクローナル抗体 の作製 ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼに特異的なネズミ・モノクロ
ーナル抗体を、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの部分精製調製物によ
るマウスの免疫化により得た。次いで、免疫マウスから脾臓を取り出し、標準法
(Harrow, E. and Lane, D.(1988). Antibodies: a laboratory manual. Cold Sp
ring Harbor Laboratory)に従ってＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞と融合させた。ハイブ
リドーマを８つの９６ウェルプレートで培養し、ハイブリドーマが肉眼で観察さ
れるまで増殖させた。ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼに対してハイブ
リドーマが分泌する抗体を、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの部分精
製調製物とプールされたハイブリドーマ上清とのインキュベーションにより得ら
れた免疫沈降物のホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を測定して同定
した。１６および４ウェルのプール、次ぎに各ウェルをアッセイした。モノクロ
ーナルＵＣ１をこのプロトコールにより同定し、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼの精製に使用するＵｌｔｒａｌｉｎｋ（商標）に結合させた。
【０１４７】実施例１５ ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの精製 子ウシ肝臓（１ｋｇ）を０．０５Ｍイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡでホモジナイズし、洗浄した脱核上清
を調製した。膜を３０，０００×ｇ ３０分の遠心分離により回収し、上記のバ
ッファーで３回洗浄した。次いで、膜タンパク質を２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、０．０５％デオキシコール酸塩を含むバッファーに溶解し、不溶物上記のよ
うに遠心分離により取り除いた。溶解した膜画分をＵｌｔｒａｌｉｎｋ（商標）
と結合したモノクローナル抗体ＵＣ１ ２０ｍｌ（置換５ｍｇ／ｍｌ）を加えて
、常に回転させながら４℃で１６時間インキュベートした。ＵＣ１−Ｕｌｔｒａ
ｌｉｎｋ（商標）を低速遠心分離により回収し、カラムに充填し、０．０２５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．３％Ｌｕｂｒｏｌ、次ぎに２カラム容量
の０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０、０．３％Ｌｕｂｒｏｌで洗浄した。次
いで、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐ
Ｈ１０．０、０．３％Ｌｕｂｒｏｌで溶出し、１／１０容量の１．０Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５．５で回収した。
【０１４８】実施例１６ ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのアミノ酸配列決定 実施例１６Ａ ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのアミノ末端配列決定 ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをＰＯＲＯＳ ＨＱの０．２
５ｍｌカラムに結合させ、０．５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーで段階的に溶出
した。ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を示す画分をホスホジエス
テルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼアッセイにより同定し、プールし、ProSorb Sample
Preparation Cartridge(Perkin Elmer)にとり、Applied Biosystems ４９２型
タンパク質シーケンサーで製造業者の教示に従い、アミノ末端配列決定を行った
。配列Asp-Xaa-Thr-Arg-Val-His-Ala-Gly-Arg-Leu-Glu-His-Glu-Ser-Trp-Pro-Pr
o-Ala-Ala-Gln-Thr-Ala-Gly-Ala-His-Arg-Pro-Ser-Val-Arg-Thr-Phe-Valを得た
。
【０１４９】実施例１６Ｂ ウシ・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの内部配列 ウシ肝臓ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをＳｐｅｅｄ Ｖａｃ．で
１０μｌに濃縮し、これに３０μｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４
、８Ｍグアニジン−ＨＣｌ、および２〜４μｌの２５ｍＭ ＤＴＴを混合し、５
０℃で１時間インキュベートした。次いで、ヨードアセトアミド２．４μｌ ５
０μＭを加え、インキュベーションを１時間続けた。この後、反応混合物をＧｌ
ｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼで記載したようにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２
５スーパーファインカラムで脱塩し、トリプシンで消化した。ペプチドをＨＰＬ
Ｃにより分画し、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼで記載したように配
列決定した。決定された配列は、Arg Asp Gly Thr Leu Val Thr Gly Tyr Leu Se
r Glu Glu Glu Val Leu Asp Thr Glu AsnおよびGly Ile Asn Leu Trp Glu Met A
la Glu Phe Leu Leu Lysである。
【０１５０】実施例１７ ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼｃＤＮＡのクローニング ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼトリプシンペプチド配列を用いて、
上記のＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼで記載したようにＥＳＴデータ
ベースを検索した。ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼｃＤＮＡを
含む３つのＥＳＴ配列を同定し、クローンＡＴＣＣ＃３６７５２４を得て、この
クローンから〜７００ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出し、これを用い
てヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをベクターＴｒｉｐｌＥｘでプロービングした
。いくつかのクローンを同定し、配列決定した。これらのうちの１つ（クローン
６．５）にヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのほぼ全長のｃＤＮ
Ａが含まれていることが分かった。実施例１８に記載するゲノムクローンにより
、クローン６．５には開始メチオニンだけが存在していないことが示された。
【０１５１】実施例１８ ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ遺伝子のクローニング ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ遺伝子を、プログラムｂｌａ
ｓｔｎによりヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼｃＤＮＡに関する
ＮＣＢＩデータベースｎｒを検索して同定した。このゲノム配列は染色体１６ｐ
ｌ３．３のクローンの配列決定により決定され、１９９９年３月６日に１６１２
６４ｂｐの未確認配列として受託番号ＡＣ００７０１１でGenBankに寄託された
。この遺伝子は染色体１６．１３のゲノムＤＮＡの約１２ｋｂにわたっており、
１１エキソンに配列されている。
【０１５２】実施例１９ ヒト・ホスホジエステルまたはα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの発現ベクターの構築 ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの発現ベクターは以下のよう
にして作製した：クローン６．５の５’末端の配列を、ｃＤＮＡの５’末端と配
列5'-GGAATTCCACCATGGCGACCTCCACGGGTCG-3'（配列番号４９）を有するフォワー
ドプライマーおよび配列5'-TGACCAGGGTCCCGTCGCG-3'（配列番号５０）を有する
リバースプライマーとのＰＣＲ増幅により改変した。これによりクローン６．５
の配列にコンセンサス・コザック配列および開始メチオニンが付加された。〜５
００ｂｐ ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、配列決
定されたｐｃＤＮＡ３．１（−）に連結した。次いで、この構築物をＢａｍＨＩ
およびＨｉｎｄIIIで消化し、クローン６．５のｃＤＮＡの３’部分を含む〜１
６００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片と連結して全長発現プラスミドを得
た。
【０１５３】実施例２０ ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの宿主細胞調製物 Ｃｏｓ細胞をダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）の入った６０ｍｍプレー
トで５％ＣＯ２中、３７℃で５０〜８０％集密状態に達するまで増殖させた。次
いで、プレートをＯｐｔｉＭＥＭＩで洗浄し、細胞をリポフェクタミンプラス(G
IBCO BRL Life Technologies)を用い、製造業者の教示に従い、実施例１９に記
載した発現ベクターでトランスフェクトした。細胞を４８時間で回収し、可溶性
膜画分を調製し、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ活性をアッセイした
。
【０１５４】実施例２１ 可溶性組換えヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの発現および精製 酵素の発現および精製に関し、改変発現プラスミドをｐＥＥ１４．１由来の改
変発現ベクターにて構築する。このプラスミドはエピトープタグ付き可溶性ホス
ホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ分子の合成を指示する。ホスホジエステル
α−ＧｌｃＮＡｃアーゼ前駆体は以下のようして改変する：ホスホジエステルα
−ＧｌｃＮＡｃアーゼトランスメンブランおよび細胞質ドメインをコードするｃ
ＤＮＡの３’部分を欠失させ、モノクローナル抗体ＨＰＣ４のエピトープ、続い
てを停止コドンをコードするヌクレオチドで置き換える。ベクターｐＥＥ１４．
１(Lonza Biologics)を、ｐＥＥ１４．１の特異なＭｌｕＩ部位に改変血管内皮
増殖因子（ＶＥＧＦ）プロモーターを含む８５０ｂｐ ＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片
を挿入して改変する。エピトープタグ付き可溶性ホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼ前駆体をコードするこのベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６を用いてＣＨＯ
−Ｋ１細胞へトランスフェクトし、９６ウェルプレートで培養する。トランスフ
ェクト細胞を２５μｍメチオニンスルホキシミンで選択し、プラスミドを５０μ
Ｍ、１００μＭ、２５０μＭおよび５００μＭメチオニンスルホキシミンを入れ
た９６ウェルプレートでの選択により増幅させる。クローンを２組の９６ウェル
プレートに選び取り、最も高い発現をしているクローンをドットブロッティング
手段およびモノクローナル抗体ＨＰＣ４による免疫検出により選択する。最も高
レベルのエピトープタグ発現を示すクローンの培地のホスホジエステルα−Ｇｌ
ｃＮＡｃアーゼ活性をアッセイする。最も高い発現をしているクローンを細胞工
場で拡張する。エピトープタグ付き可溶性組換えホスホジエステルα−ＧｌｃＮ
Ａｃアーゼを、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、Ｕｌｔ
ｒａｌｉｎｋと結合させたモノクローナル抗体ＨＰＣ４でのクロマトグラフィー
により培地から精製する。エピトープタグ付き可溶性ホスホジエステルα−Ｇｌ
ｃＮＡｃアーゼを５ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２で溶出する。
【０１５５】実施例２２ 可溶性ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの発現ベクターの構築 酵素の発現および精製に関し、改変発現プラスミドをｐＥＥ１４．１ベクター
(Lonza Biologics)由来の改変発現ベクターで構築する。このプラスミドはエピ
トープタグ付き可溶性ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ分子の合成を指
示する。ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ前駆体は以下のようにして改
変する：ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼトランスメンブランおよび細
胞質ドメインをコードするｃＤＮＡの３’部分（配列番号７の１３４２〜１５４
８番）を欠失させ、モノクローナル抗体ＨＰＣ４のエピトープ（EDQVDPRLIDGKD
（配列番号５２））、続いてを停止コドンをコードするヌクレオチド配列GAGGAC
CAGGTGGACCCCAGGCTGATCCACGGCAAGGAT（配列番号５１）で置き換えた。
【０１５６】 この発現ベクターは、２つの中間プラスミドを作製し、各々由来の断片をｐＥ
Ｅ１４．１ベクター(Lonza Biologics)に連結して最終発現ベクターを得ること
で構築した。ｐＫＢ４と名付けた第１の中間プラスミドは、クローン６．５由来
のホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの１０３４ｂｐ ＦｓｅＩ−Ｂｓｕ
３６Ｉ断片（Ｃ末端トランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠く）およびＨ
ＰＣ４エピトープを含むＢｓｕ３６Ｉ−ＸｂａＩオリゴヌクレオチド断片を改変
ｐＵＣ１９ベクターに連結して構築した。ｐＫＢ５と名付けた第２の中間プラス
ミドは、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ(Invitrogen)由来の改変血管内皮増殖因子
（ＶＥＧＦ）プロモーターを含む８５０ｂｐ ＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片、クロー
ン６．５由来のヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのＮ末端をコー
ドする２５６ｂｐ ＢｓｅＩ−ＦｓｅＩ断片、およびオリゴヌクレオチドリンカ
ーを改変ｐＵＣ１９ベクターに連結して構築した。ｐＫＢ６と名付けた最後の発
現ベクターは、ｐＫＢ５のＭｌｕＩ−ＦｓｅＩ断片およびｐＫＢ４のＦｓｅＩ−
ＨｉｎｄIII断片をＭｌｕＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＥＥ１４．１ベクターに連
結して構築した。プラスミドｐＫＢ６には、配列番号２２で示されたヌクレオチ
ド配列が含まれている。
【０１５７】可溶性組換えヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの発現および精製 約１０８個の２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコの改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）を用いた細胞工場で加湿雰囲気下、５％ＣＯ２、３７℃で培
養した。これらの細胞を、可溶性ヒト・ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアー
ゼの一時的発現のため、２ｍｌのトランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６(Roc
he)を用い、約７００ｇのｐＫＢ６でトランスフェクトした。トランスフェクト
細胞を３日間培養した後、エピトープタグ付き可溶性ヒト・ホスホジエステルα
−ＧｌｃＮＡｃアーゼを含む培地を回収し、１ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、Ｕｌ
ｔｒａｌｉｎｋ(Pierce)と結合させたモノクローナル抗体ＨＰＣ４のカラムに入
れた。アフィニティー精製したエピトープタグ付きヒト・ホスホジエステルα−
ＧｌｃＮＡｃアーゼ（約１１ｍｇ）を５ｍＭ ＥＤＴＡを含むバッファーで溶出
し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、５０％
グリセロール、ｐＨ７．２に−２０℃で保存した。この酵素は基質として［３Ｈ
］ＧｌｃＮＡｃ−ホスホマンノース−α−Ｄ−メチルで５００，０００単位／ｍ
ｇの比活性を有していた(Kornfeld R, et al., JBC 273: 23203-23210)。
【０１５８】実施例２３ 組換えヒト・酸性α−グルコシダーゼを発現するＣＨＯ細胞 ヒト酸性α−グルコシダーゼｃＤＮＡを、Frank Martinuk博士(Martinuk, F.,
Mehler, M., Tzall, S., Meredith, G. and Hirschhorn, F, (1990). "Sequenc
e of the cDNA and 5'-flanking region for human acid alpha-glucosidase, d
etection of an intron in the 5' untranslated leader sequence, definition
of 18-bp polymorphisms, and differences with previous cDNA and amino ac
id sequences." DNA Cell Biol 9(2): 85-94)から得て、発現ベクターｐＥＥ１
４．１にクローニングした。このベクターを用いてＦｕｇｅｎｅ６によりＣＨＯ
−Ｋ１細胞へトランスフェクトし、９６ウェルプレートで培養した。トランスフ
ェクト細胞を２５μｍメチオニンスルホキシミンで選択し、クローンを選び取り
、９６ウェルプレートで培養した。プラスミドを５０μＭ、１００μＭ、２５０
μＭおよび５００μＭメチオニンスルホキシミンでの選択により増幅させた。ク
ローンを２組の９６ウェルプレートに選び取り、最も高い発現をしているクロー
ンを、培地の酸性α−グルコシダーゼ活性についておよび細胞のＤＮＡ含量につ
いてのアッセイにより選択した。次いで、酸性α−グルコシダーゼ活性対ＤＮＡ
含量比に基づき、最も高い発現をしているクローン（クローン３．４９．１３）
を細胞工場で拡大した。このクローンを５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベート
し、２０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．２、５％ウシ胎児血清を含むグラスゴーの最少
必須培地で維持した。
【０１５９】実施例２４ α−１，２−マンノシダーゼ阻害剤の存在下の組換えヒト酸性α−グルコシダー ゼを発現するＣＨＯ細胞の増殖 ヒト酸性α−グルコシダーゼを発現するＣＨＯ細胞を５％ウシ胎児血清、２５
μＭメチオニンスルホキシミン、２０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．２および７．５ｍ
Ｍ １−デオキシマンノジリマイシン−ＨＣｌを含むグラスゴーの最少必須培地
で培養した。あるいは、細胞を１００μｇ／ｍＬ １−デオキシマンノジリマイ
シン−ＨＣｌおよび２５μｇ／ｍＬキフネンシンを含む上記培地で培養してもよ
い。
【０１６０】実施例２５ 組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの単離 組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは組織培養物から以下のようにして精製し
た：培地を３０，０００ダルトン・カットオフ・メンブランでの接線限外濾過に
よって１０倍濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で透析し、Ｃｏｎ
Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(Pharmacia)のカラムに入れた。同じバッファーで洗浄
し、結合していないタンパク質を除去した後、酸性α−グルコシダーゼを１．０
Ｍα−メチルグルコシドで溶出し、プールし、濃縮し、上記のように透析した。
次いで、酸性α−グルコシダーゼを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で
平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００のカラムに入れ、同じバッファーで同
様に溶出した。
【０１６１】実施例２６ 組換えヒト酸性α−グルコシダーゼのＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼ およびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼによる処理 １０ｍｇ／ｍｌのヒト酸性α−グルコシダーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ６．７、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃ中１００，０００ｕ／ｍＬのＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラ
ーゼとともに３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ホスホジエステルα
−ＧｌｃＮＡｃアーゼ、１０００ｕ／ｍＬを加え、インキュベーションをさらに
２時間続けた。この後、酸性α−グルコシダーゼを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで
のクロマトグラフィーおよびＮａＣｌでの段階的溶出により再精製した。
【０１６２】実施例２７ 改変組換えヒト酸性α−グルコシダーゼのオリゴ糖構造の同定 ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−Ｇｌｃ
ＮＡｃアーゼで処理したまたは未処理の組換え酸性α−グルコシダーゼを、Ｎ−
グリカナーゼ(New England Biolabs)またはエンドマンノシダーゼＨ(New Englan
d Biolabs)により、製造業者の条件に従って消化した。次いで、離れたオリゴ糖
類の還元末端を製造業者(Oxford Glycosystems)の教示に従って、２−アミノベ
ンズアミドで標識し、蛍光検出を用いるＨＰＬＣにより分画した。同じ系でクロ
マトグラフィーに付した標準と比較してピークを同定し、結合特異的なグリコシ
ダーゼによる消化および／またはＭＡＬＤＩによる質量分析により確認した。こ
の結果を表１に示す。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】 表１のデータ（モル％で示す）から、本発明のＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランス
フェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを用いて調製した
リソソーム酵素が高度にリン酸化されていることが分かる。データでは、本発明
によって、未処理の酵素および当技術分野で公知の酵素では約２〜０であるのに
対し、酵素当たり約５〜１０のＭ６Ｐ群を有するリソソーム酵素が生成されるこ
とが分かる。天然または組換えリソソーム酵素と比べた場合、in vitro改変調製
物は極めて高度にリン酸化される。最も高度にリン酸化される当技術分野で公知
のリソソーム酵素、Matsuura, F., Ohta, M., Ioannou, Y. A. and Desnick, R.
J. (1998). "Human alpha-galactosidase A: characterization of the N-link
ed oligosaccharides on the intracellular and secreted glycoforms overepr
essed by Chinese hamster ovary cells." Glycobiology 8(4): 329-39により記
載されたα−ガラクトシダーゼＡでは、オリゴ糖類の５．２％が二リン酸化され
る。これとは著しく対照的に、本明細書で記載した調製物、in vitroリン酸化酸
性α−グルコシダーゼではオリゴ糖類の６２％が二リン酸化されたオリゴ糖類で
ある。これは約１２倍の高まりを示している。表１に示されたｒｈ−ＧＡＡのin
vitroリン酸化調製物と当技術分野で公知な方法によってＣＨＯ細胞から分泌さ
れたＧＡＡとを比べると、リン酸化のいっそう大きな高まり、約６２倍の高まり
が示される。
【０１６５】 よって、in vitroリン酸化ＧＡＡは他のいずれの記載した天然または組換えリ
ソソーム酵素の調製物よりも１２〜６２倍高いリン酸化がなされる。この違いが
インターナリゼーションの速度および程度に大きな影響を及ぼしている(Reuser,
A. J., Kroos, M. A., Ponne, N. J., Wolterman, R. A., Loonen, M. C., Bus
ch, H. F., Visser, W. J. and Bolhuis, P. A. (1984). "Uptake and stabilit
y of human and bovine acis alpha-glucosidase in cultured fibroblast and
skeletal muscle cells from glycogenosis type II patients." Experimental
Cell Research 155: 178-189)。
【０１６６】実施例２８ ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−ＧｌｃＮ Ａｃアーゼによる改変をしたまたはしない組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの 細胞取り込みの比較 ヒト・ポンペ病繊維芽細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎児血清含有Ｄ
ＭＥＭで６ウェルプレートで培養し、５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートす
る。異なる炭水化物構造を有する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼのインター
ナリゼーション速度および程度を比較する。対照として、５ｍＭマンノース６−
リン酸を加えてインキュベートした各々の調製物と組換えヒト酸性α−グルコシ
ダーゼを加えないインキュベーション物を含む。試験しようとする異なる調製物
として、ＣＨＯ細胞から分泌された酸性α−グルコシダーゼ、α−１，２−マン
ノシダーゼ阻害剤の存在下、ＣＨＯ細胞から分泌された酸性α−グルコシダーゼ
、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼで処理したα−１，２−マンノシダ
ーゼ阻害剤の存在下、ＣＨＯ細胞から分泌された酸性α−グルコシダーゼ、なら
びにＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼおよびホスホジエステルα−Ｇｌ
ｃＮＡｃアーゼで処理したα−１，２−マンノシダーゼ阻害剤の存在下、ＣＨＯ
細胞から分泌された酸性α−グルコシダーゼを挙げる。４つの異なる調製物を各
ウェルに同量加え、５分〜４時間の種々の時間、３７℃でインキュベートする。
各インキュベーション時間の終了時に細胞単層を５ｍＭマンノース６−リン酸を
含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、単層を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に溶
解し、酵素アッセイにより取り込まれたα−グルコシダーゼについて調べる。
【０１６７】 出願人およびその譲受人は、本明細書について発行された特許の有効期間満了
前に培養物が死滅した場合、培養物の最後の分譲要求の後５年か、または３０年
のうちいずれか長い期間、これらの培養物を継代する責任、および寄託物が必ず
公に利用可能となる時期に、かかる特許の発行を寄託機関に通知する責任を認め
ている。その時期に至るまで、その寄託物は規則３７ＣＦＲ第１．１４項および
米国法３５ＵＳＣ第１１２条において特許庁長官の求めに応じられることとなる
。
【０１６８】 好ましい具体例は本発明を例示するものであって、当業者ならば材料および方
法に数多くの変更を行うことができる。かかる総ての変形は添付の請求の範囲に
より定義される本発明の精神の範囲内にあるものと考えられる。
【０１６９】 本願は１９９９年９月１４日に提出した米国仮出願番号第６０／１５３，８３
１号の優先権を請求するものであり、それは引用することにより本明細書の一部
とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼのサブユニット構造のモデルを示す。
この酵素は６個のポリペプチドの複合体である。αおよびβサブユニットは単一
遺伝子の産物である。翻訳後、αおよびβサブユニットはＬｙｓ９２９とＡｓｐ ９３０ の間でタンパク質分解により切断されて分離する。αサブユニットは単一
のアミノ末端膜貫通ドメインを含むII型膜糖タンパク質である。βサブユニット
は単一のカルボキシル末端膜貫通ドメインを含むＩ型膜貫通糖タンパク質である
。γサブユニットは第２の遺伝子の産物である。γサブユニットは切断されるシ
グナルペプチドを含む可溶性タンパク質である。α、β、およびγサブユニット
はいずれも強固に会合している。
【図２】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼのサブユニット構造のモデルを示す
。この酵素はそれ自体はジスルフィド結合している２個の非共有結合によって会
合した二量体として並ぶ４個の同一のサブユニットからなる四量体である。単一
のサブユニットはシグナルペプチド、成熟酵素には存在しないプロ領域および単
一のカルボキシル末端膜貫通ドメインを含むＩ型膜タンパク質である。
【図３】 ＣＨＯ細胞における組換え糖タンパク質発現のダイアグラムを示す。過剰発現
ＣＨＯ細胞では、ｒｈ−ＧＡＡは酵素がＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ
（ＧｎＰＴ）の影響を受けるか否かによって経路１および２に従って処理される
。分泌されるＧＡＡは主にシアル酸付加二アンテナ性複合体型グリカンを含み、
ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの基質ではない。α１，２−マンノシダ
ーゼ阻害剤、１−デオキシマンノジリマイシンまたはキフネンシンの存在下で、
ＭＡＮ９からＭＡＮ５構造への変換がブロックされ、その結果ＧＡＡ保持ＭＡＮ
７〜９構造ｖ ｂｉｃｈの分泌がＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼおよび
ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ（ＵＣＥ）で改変され、リン酸化種が
生じ得る（経路３）。
【図４】 ヒトＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼのα／βおよびγサブユニットの
種々のプラスミド構築物の一時的発現解析を示す。α／βおよび／またはγサブ
ユニットを含むプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、発現されたタ
ンパク質をトランスフェクションの２３、４４．５および７０時間後に培養物か
ら精製し、基質としてメチル−α−Ｄ−マンノシドおよび［β−３２Ｐ］ＵＤＰ
−ＧｌｃＮＡｃを用いてホスホトランスフェラーゼ活性を測定することによって
発現の相対量を評価した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/10 1/21 9/14 5/10 9/24 9/10 9/26 Ｚ 9/14 15/00 ＺＮＡＡ 9/24 5/00 Ａ 9/26 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA12 BA61 CA04 HA03 4B050 CC03 EE10 LL01 4B065 AB01 BA02 CA29 CA31 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 DC22 NA14 ZC412 4H045 AA11 AA30 DA75 EA27

Claims (105)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ。
  2. 【請求項２】 α、βおよびγサブユニットを含んでなる、請求項１に記載のＧｌｃＮＡｃホ
    スホトランスフェラーゼ。
  3. 【請求項３】 αサブユニットが配列番号１のアミノ酸配列を有し、βサブユニットが配列番
    号２のアミノ酸配列を有し、かつ、γサブユニットが配列番号３のアミノ酸配列
    を有する、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ。
  4. 【請求項４】 αサブユニットが配列番号１のアミノ酸１〜９２８を含み、βサブユニットが
    配列番号２のアミノ酸１〜３２８を含み、かつ、γサブユニットが配列番号３の
    アミノ酸２５〜３０５を含む、請求項３に記載のＧｌｃＮＡｃホスホトランスフ
    ェラーゼ。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載のＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼをコードする単離さ
    れた核酸。
  6. 【請求項６】 配列番号４および配列番号５を含んでなる、請求項５に記載の単離された核酸
    。
  7. 【請求項７】 αサブユニットコード領域が配列番号４のヌクレオチド１６５〜２９４８に含
    まれ、βサブユニットコード領域が配列番号６のヌクレオチド２９４９〜３９５
    ２に含まれ、かつ、γサブユニットコード領域が配列番号５のヌクレオチド９６
    〜９４１に含まれる、請求項５に記載の単離された核酸。
  8. 【請求項８】 ストリンジェントな条件下で請求項６に記載の単離された核酸の少なくとも１
    種とハイブリダイズする単離された核酸であって、ストリンジェントな条件が６
    ５℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することを含んでなる、
    単離された核酸。
  9. 【請求項９】 請求項５に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項５に記載の単離された核酸を含んでなる宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離された核酸分子の発現に好適な条件下で請求項１０に記載の細胞を培養し
    ； 生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼを回収する ことを含んでなる、生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの
    製造法。
  12. 【請求項１２】 αサブユニットが配列番号１５のアミノ酸配列を有し、βサブユニットが配列
    番号８のアミノ酸配列を有し、かつ、γサブユニットが配列番号９のアミノ酸配
    列を有する、請求項２に記載の単離されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラー
    ゼ。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼをコードする単離
    された核酸。
  14. 【請求項１４】 配列番号１６および配列番号１０を含んでなる、請求項１３に記載の単離され
    た核酸。
  15. 【請求項１５】 ストリンジェントな条件下で請求項１４に記載の単離された核酸の少なくとも
    １種とハイブリダイズする核酸を含んでなる単離された核酸であって、ストリン
    ジェントな条件が６５℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する
    ことを含んでなる、単離された核酸。
  16. 【請求項１６】 請求項１３に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  17. 【請求項１７】 請求項１３に記載の単離された核酸を含んでなる細胞。
  18. 【請求項１８】 単離された核酸分子の発現に好適な条件下で請求項１７に記載の細胞を培養し
    ； 生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼを回収する ことを含んでなる、生物学的に活性なＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの
    製造法。
  19. 【請求項１９】 単離されたホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ。
  20. 【請求項２０】 配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１９に記載のホスホジエステ
    ルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載のホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードする単
    離された核酸。
  22. 【請求項２２】 配列番号７である、請求項２１に記載の単離された核酸。
  23. 【請求項２３】 配列番号７のヌクレオチド１５１〜１５４８を含む、請求項２１に記載の単離
    された核酸。
  24. 【請求項２４】 ストリンジェントな条件下で請求項２２に記載の単離された核酸とハイブリダ
    イズする核酸を含んでなる単離された核酸であって、ストリンジェントな条件が
    ６５℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することを含んでなる
    、単離された核酸。
  25. 【請求項２５】 請求項２２に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  26. 【請求項２６】 請求項２２に記載の単離された核酸を含んでなる宿主細胞。
  27. 【請求項２７】 核酸分子の発現に好適な条件下で請求項２６に記載の細胞を培養し；ホスホジ
    エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを回収することを含んでなる、ホスホジエステ
    ルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの製造法。
  28. 【請求項２８】 配列番号１４を含んでなる、請求項１９に記載のホスホジエステルα−Ｇｌｃ
    ＮＡｃアーゼ。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載のホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードする単
    離された核酸。
  30. 【請求項３０】 配列番号１８である、請求項２９に記載の単離された核酸。
  31. 【請求項３１】 ストリンジェントな条件下で請求項３０に記載の単離された核酸とハイブリダ
    イズする核酸を含んでなる単離された核酸であって、６５℃にて０．２×ＳＳＣ
    および０．１％ＳＤＳ中で洗浄することを含んでなる、単離された核酸。
  32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  33. 【請求項３３】 請求項２９に記載の単離された核酸を含んでなる宿主細胞。
  34. 【請求項３４】 核酸分子の発現に好適な条件下で請求項３３に記載の細胞を培養し；ホスホジ
    エステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを回収することを含んでなる、ホスホジエステ
    ルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの製造法。
  35. 【請求項３５】 リソソーム加水分解酵素を単離されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ
    と接触させて改変されたリソソーム加水分解酵素を得ることを含んでなる、リソ
    ソーム加水分解酵素の改変法。
  36. 【請求項３６】 改変されたリソソーム加水分解酵素を接触後に精製することをさらに含んでな
    る、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 リソソーム加水分解酵素が高度マンノース構造を有するアスパラギン結合オリ
    ゴ糖を含んでなる、請求項３５に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから加水分解
    酵素上のマンノースへのＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の転移を触媒す
    る、請求項３５に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 リソソーム加水分解酵素が組換え加水分解酵素である、請求項３５に記載の方
    法。
  40. 【請求項４０】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼが配列番号１、配列番号２、および配
    列番号３を含んでなる、請求項３５に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼが配列番号１のアミノ酸１〜９２８、
    配列番号２のアミノ酸１〜３２８、および配列番号３のアミノ酸２５〜３０５を
    含んでなる、請求項３５に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼが配列番号１５、配列番号８、および
    配列番号９を含んでなる、請求項３５に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 リソソーム加水分解酵素がα−グルコシダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−ガ
    ラクトシダーゼＡ、アリールスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６
    −スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、イズロネート２−スルファターゼ、
    セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、Ｂ−グルコロニダーゼ、ヘパランＮ
    −スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ−
    α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサ
    ミン−６スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、アリールスルファ
    ターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＣ、アリールス
    ルファターゼＡセレブロシド、ガングリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼＧＭ １ ガルグリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソ
    サミニダーゼＢ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、
    糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リ
    パーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミ
    エリナーゼ、およびグルコセレブロシダーゼβ−グルコシダーゼからなる群から
    選択される、請求項３５に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 改変されたリソソーム加水分解酵素を単離されたホスホジエステルα−Ｇｌｃ
    ＮＡｃアーゼと接触させることをさらに含んでなる、請求項３５に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＡＮｃアーゼが改変されたリソソーム加水分解酵
    素からのＮ−アセチルグルコサミンの除去を触媒し、かつその加水分解酵素上に
    末端マンノース６−リン酸を生じさせる、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号６のアミノ酸配列を含ん
    でなる、請求項４４に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号６のアミノ酸５０〜５１
    ５を含んでなる、請求項４４に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号１４のアミノ酸配列を含
    んでなる、請求項４４に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 マンノース６−リン酸を含んでなる精製されたリソソーム加水分解酵素。
  50. 【請求項５０】 リソソーム加水分解酵素を単離されたホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアー
    ゼと接触させることを含んでなる、リン酸化リソソーム加水分解酵素の製造法で
    あって、リソソーム加水分解酵素が末端マンノース６−リン酸を含んでなる、製
    造法。
  51. 【請求項５１】 リン酸化リソソーム加水分解酵素の精製をさらに含んでなる、請求項５０に記
    載の方法。
  52. 【請求項５２】 リソソーム加水分解酵素がα−グルコシダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−ガ
    ラクトシダーゼＡ、アリールスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６
    −スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、イズロネート２−スルファターゼ、
    セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、Ｂ−グルコロニダーゼ、ヘパランＮ
    −スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ−
    α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサ
    ミン−６スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、アリールスルファ
    ターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＣ、アリールス
    ルファターゼＡセレブロシド、ガングリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼＧＭ １ ガルグリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソ
    サミニダーゼＢ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、
    糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リ
    パーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミ
    エリナーゼ、およびグルコセレブロシダーゼβ−グルコシダーゼからなる群から
    選択される、請求項５０に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが改変されたリソソーム加水分解酵
    素からのＮ−アセチルグルコサミンの除去を触媒し、かつその加水分解酵素上に
    末端マンノース６−リン酸を生じさせる、請求項５０に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号６のアミノ酸配列を含ん
    でなる、請求項５０に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号６のアミノ酸５０〜５１
    ５を含んでなる、請求項５０に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号１４のアミノ酸配列を含
    んでなる、請求項５０に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 請求項５０に記載の方法によって得られた、リソソーム加水分解酵素。
  58. 【請求項５８】 リソソーム加水分解酵素を単離されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ
    と接触させて改変されたリソソーム加水分解酵素を得； 改変されたリソソーム加水分解酵素を単離されたホスホジエステルα−Ｇｌｃ
    ＮＡｃアーゼと接触させる ことを含んでなる、リン酸化リソソーム加水分解酵素の製造法。
  59. 【請求項５９】 単離されたホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼとの接触させた後にリン
    酸化リソソーム加水分解酵素を精製することをさらに含んでなる、請求項５８に
    記載の方法。
  60. 【請求項６０】 単離されたホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼとの接触に先立って、改
    変されたリソソーム加水分解酵素を精製することをさらに含んでなる、請求項５
    ８に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 請求項５８に記載の方法によって得られるリン酸化リソソーム加水分解酵素。
  62. 【請求項６２】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼが配列番号１、配列番号２、および配
    列番号３を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼが配列番号１のアミノ酸１〜９２８、
    配列番号２のアミノ酸１〜３２８、および配列番号３のアミノ酸２５〜３０５を
    含んでなる、請求項５８に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼが配列番号１５、配列番号８、および
    配列番号９を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号６のアミノ酸を含んでな
    る、請求項５８に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼが配列番号６のアミノ酸５０〜５１
    ５を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 リソソーム加水分解酵素がα−グルコシダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−ガ
    ラクトシダーゼＡ、アリールスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６
    −スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、イズロネート２−スルファターゼ、
    セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、Ｂ−グルコロニダーゼ、ヘパランＮ
    −スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ−
    α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサ
    ミン−６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、アリールスルフ
    ァターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＣ、アリール
    スルファターゼＡセレブロシド、ガングリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼＧ Ｍ１ ガルグリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキ
    ソサミニダーゼＢ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
    、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性
    リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴ
    ミエリナーゼ、およびグルコセレブロシダーゼβ−グルコシダーゼからなる群か
    ら選択される、請求項５８に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 α１，２−マンノシダーゼ阻害剤の存在下で、組換え加水分解酵素をコードす
    る組換えポリヌクレオチドを含んでなる形質転換細胞を培養し； 培養物から高マンノース組換え加水分解酵素を回収する ことを含んでなる、高マンノースリソソーム加水分解酵素の製造法。
  69. 【請求項６９】 リソソーム加水分解酵素がα−グルコシダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−ガ
    ラクトシダーゼＡ、アリールスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６
    −スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、イズロネート２−スルファターゼ、
    セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、Ｂ−グルコロニダーゼ、ヘパランＮ
    −スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ−
    α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサ
    ミン−６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、アリールスルフ
    ァターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＣ、アリール
    スルファターゼＡセレブロシド、ガングリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼＧ Ｍ１ ガルグリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキ
    ソサミニダーゼＢ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
    、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性
    リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴ
    ミエリナーゼ、およびグルコセレブロシダーゼβ−グルコシダーゼからなる群か
    ら選択される、請求項６８に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 リソソーム加水分解酵素がα−グルコシダーゼである、請求項６８に記載の方
    法。
  71. 【請求項７１】 α１，２−マンノシダーゼ阻害剤がデオキシマンノジリマイシン（ｄＭＭ）、
    キフネンシン、Ｄ−マンノノラクタムアミドラゾン、およびＮ−ブチルデオキシ
    マンノジリマイシンからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 α１，２−マンノシダーゼ阻害剤がキフネンシンである、請求項６８に記載の
    方法。
  73. 【請求項７３】 請求項６８に記載の方法に従って製造される高マンノースリソソーム加水分解
    酵素。
  74. 【請求項７４】 リソソーム貯蔵障害患者の治療法であって、該障害を治療するのに十分な量の
    リン酸化加水分解酵素をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、方
    法。
  75. 【請求項７５】 リン酸化加水分解酵素が末端マンノース−６−リン酸を含んでなる、請求項７
    ４に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 リソソーム貯蔵障害がポーンプ病、フルラー症候群、ファブリー病、マロトー
    ・ラミー症候群、モルキオ症候群、ハンター症候群、ファーバー病、クラッベ病
    、スライ症候群、サンフィリポＡ、サンフィリポＢ、サンフィリポＤ、多発性ス
    ルファターゼ欠損症、異染性白質萎縮症、ムコリピドーシスIV、ＧＭ１ガングリ
    オシドーシス、ガラクトシアリドーシス、テイ・サックス病、ザンドホフ病、フ
    クシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症
    、ウォルマン病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ニーマン・ピック病、およびゴーシ
    ェ病からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 リン酸化加水分解酵素を５０ｋｇの患者に１ヶ月当たり約０．１〜約１０００
    ミリグラムの量で投与する、請求項７４に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 リソソーム貯蔵障害患者の治療法であって、 リン酸化リソソーム加水分解酵素を製造し、ここで該製造法はリソソーム加水
    分解酵素を単離されたＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼと接触させ、リソ
    ソーム加水分解酵素を単離されたホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼと接
    触させてリン酸化リソソーム加水分解酵素を製造することを含んでなり； リソソーム貯蔵障害を治療するのに十分な量のリン酸化リソソーム加水分解酵
    素をそれを必要とする患者へ投与する ことを含んでなる、方法。
  79. 【請求項７９】 リソソーム加水分解酵素がα−グルコシダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−ガ
    ラクトシダーゼＡ、アリールスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６
    −スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、イズロネート２−スルファターゼ、
    セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、Ｂ−グルコロニダーゼ、ヘパランＮ
    −スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ−
    α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサ
    ミン−６スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、アリールスルファ
    ターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＣ、アリールス
    ルファターゼＡセレブロシド、ガングリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼＧＭ １ ガルグリオシド、酸性β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソ
    サミニダーゼＢ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、
    糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リ
    パーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミ
    エリナーゼ、およびグルコセレブロシダーゼβ−グルコシダーゼからなる群から
    選択される、請求項７８に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 リソソーム貯蔵障害がポーンプ病、フルラー症候群、ファブリー病、マロトー
    ・ラミー症候群、モルキオ症候群、ハンター症候群、ファーバー病、クラッベ病
    、スライ症候群、サンフィリポＡ、サンフィリポＢ、サンフィリポＤ、多発性ス
    ルファターゼ欠損症、異染性白質萎縮症、ムコリピドーシスＩＶ、ＧＭ１ガング
    リオシドーシス、ガラクトシアリドーシス、テイ・サックス病、ザンドホフ病、
    フクシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス、アスパルチルグルコサミン尿
    症、ウォルマン病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ニーマン・ピック病、およびゴー
    シェ病からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 リン酸化リソソーム加水分解酵素が末端マンノース６−リン酸を含んでなる、
    請求項７８に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ２４３２で寄託されたＰＴ１８ハイブリドーマによ
    り産生される、請求項１に記載のＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼと結合
    する抗体。
  83. 【請求項８３】 ＡＴＣＣに受託番号２４３１で寄託されたＵＣ１ハイブリドーマにより産生さ
    れる、請求項１９に記載のホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼと結合する
    抗体。
  84. 【請求項８４】 ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼを含む細胞溶解物を請求項８２に記載
    の抗体と接触させ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼと抗体に複合体を形
    成させ； 抗体−ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ複合体を単離する ことを含んでなる、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼの単離法。
  85. 【請求項８５】 ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを含む細胞溶解物を請求項８２に記
    載の抗体と接触させ、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼと抗体に複合体
    を形成させ； 抗体−ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ複合体を単離する ことを含んでなる、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼの単離法。
  86. 【請求項８６】 細胞に含まれる内因性ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ遺伝子（なお、
    該内因性遺伝子は配列番号４または配列番号５の配列を含んでなる）内またはそ
    の上流の標的部位と相同なターゲティング配列、外来の調節配列、エキソン、お
    よびエキソンの３’末端に不対スプライシング供与部位を含んでなるＤＮＡ構築
    物を細胞にトランスフェクトし、そのトランスフェクトによりスプライシング供
    与部位が内因性遺伝子の第２のエキソンに作動可能に連結され、かつ、外来の調
    節配列が、もたらされた構築物、内因性遺伝子、および構築物がもたらしたエキ
    ソンと内因性遺伝子の間に位置するいずれかの配列の転写を制御する相同組換え
    細胞を得て、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼをコードするＲＮＡ転写物
    を産生させ、相同組換え細胞がＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼを産生す
    ることを含んでなる、細胞においてＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼを産
    生する方法。
  87. 【請求項８７】 細胞に含まれる内因性ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼ遺伝子（なお
    、該内因性遺伝子は配列番号７の配列を含んでなる）内またはその上流の標的部
    位に相同なターゲティング配列、外来の調節配列、エキソン、およびエキソンの
    ３’末端に不対スプライシング供与部位を含んでなるＤＮＡ構築物を細胞にトラ
    ンスフェクトし、そのトランスフェクトによりスプライシング供与部位が内因性
    遺伝子の第２のエキソンに作動可能に連結され、かつ、外来の調節配列が、もた
    らされた構築物、内因性遺伝子、および構築物がもたらしたエキソンと内因性遺
    伝子の間に位置するいずれかの配列の転写を制御する相同組換え細胞を得て、ホ
    スホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼをコードするＲＮＡ転写物を産生させ、
    相同組換え細胞がホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを産生することを含
    んでなる、細胞においてホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃアーゼを産生する方
    法。
  88. 【請求項８８】 配列番号１を含んでなる単離されたアミノ酸配列。
  89. 【請求項８９】 請求項８８に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
  90. 【請求項９０】 配列番号４のヌクレオチド１６５〜２９４８を含んでなる、請求項８８に記載
    の単離された核酸。
  91. 【請求項９１】 ストリンジェントな条件下で請求項９０に記載の単離された核酸とハイブリダ
    イズする単離された核酸であって、ストリンジェントな条件が０．２×ＳＳＣお
    よび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することを含んでなる、単離された核酸。
  92. 【請求項９２】 請求項８９に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  93. 【請求項９３】 請求項８９に記載の単離された核酸を含んでなる宿主細胞。
  94. 【請求項９４】 配列番号２を含んでなる単離されたアミノ酸配列。
  95. 【請求項９５】 請求項９４に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
  96. 【請求項９６】 配列番号４のヌクレオチド２９４９〜３９５２を含んでなる、請求項９５に記
    載の単離された核酸。
  97. 【請求項９７】 ストリンジェントな条件下で請求項９６に記載の単離された核酸とハイブリダ
    イズする単離された核酸であって、ストリンジェントな条件が０．２×ＳＳＣお
    よび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することを含んでなる、単離された核酸。
  98. 【請求項９８】 請求項９５に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  99. 【請求項９９】 請求項９５に記載の単離された核酸を含んでなる宿主細胞。
  100. 【請求項１００】 配列番号３を含んでなる単離されたアミノ酸配列。
  101. 【請求項１０１】 請求項１００に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
  102. 【請求項１０２】 配列番号３のヌクレオチド２５〜３０５を含んでなる、請求項１０１に記載の
    単離された核酸。
  103. 【請求項１０３】 ストリンジェントな条件下で請求項１０２に記載の単離された核酸とハイブリ
    ダイズする単離された核酸であって、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で
    洗浄することを含んでなる単離された核酸。
  104. 【請求項１０４】 請求項１０１に記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
  105. 【請求項１０５】 請求項１０１に記載の単離された核酸を含んでなる宿主細胞。
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