DE60036395T2

DE60036395T2 - Enzyme des auf die lysosomen gerichteten weges

Info

Publication number: DE60036395T2
Application number: DE60036395T
Authority: DE
Inventors: Oklahoma City William M. Canfield
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2020-09-15
Also published as: WO2001019955A2; ATE373086T1; US6861242B2; AU7330300A; AU783224B2; US20050089869A1; US6642038B1; US7371366B2; US7067127B2; EP1224266B1; CA2383217C; US20060073498A1; US20080176285A1; US6534300B1; US20020025550A1; WO2001019955A3; EP1224266A2; US6670165B2; JP2003509043A; DE60036395D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von Enzymen, die am lysosomalen Targeting-Weg beteiligt sind, und besonders isolierte und gereinigte GlcNAc-Phosphotransferase und isolierte und gereinigte Phosphodiester-α-GlcNAcase zur Herstellung hoch phosphorylierter lysosomaler Enzyme, die zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten nützlich sind.
Beschreibung des Stands der Technik
Lysosomen und lysosomale Speicherkrankheiten
Lysosomen sind Organellen in eukaryotischen Zellen, die beim Abbau von Makromolekülen in Bestandteile funktionieren, die in biosynthetischen Stoffwechselwegen wiederverwendet oder von der Zelle als Abfall ausgeschieden werden können. Normalerweise werden diese Makromoleküle durch Enzyme, die als lysosomale Enzyme oder lysosomale Hydrolasen bekannt sind, abgebaut. Wenn jedoch ein lysosomales Enzym nicht im Lysosom vorliegt oder nicht richtig funktioniert, sammelt sich das für das Enzym spezifische makromolekulare Substrat im Lysosm als "Speichermaterial" an, was eine Vielfalt von Krankheiten, die gemeinsam als lysosomale Speicherkrankheiten bekannt sind, verursacht.
Lysosomale Speicherkrankheiten können jedes Jahr chronische Krankheit und Tod bei Hunderten von Individuen verursachen. Es gibt ungefähr 50 bekannte lysosomale Speicherkrankheiten, z. B. die Pompe-Krankheit, das Hurler-Syndrom, Morbus Fabry, das Maroteaux-Lamy-Syndrom (Mucopolysaccharidose VI), das Morquio-Syndrom (Mucopolysaccharidose IV), die Hunter-Krankheit (Mucopolysaccharidose II), die Farber-Krankheit, saure Lipase-Mangel, das Krabbe-Syndrom, das Sly-Syndrom (Mucopolysaccharidose VII). Bei jeder dieser Krankheiten sind die Lysosomen unfähig, eine spezifische Verbindung oder Gruppe von Verbindungen abzubauen, weil das Enzym, das eine spezifische Abbaureaktion katalysiert, dem Lysosom fehlt, in niedrigen Konzentrationen im Lysosom vorliegt oder in ausreichenden Konzentrationen im Lysosom vorliegt, aber nicht richtig funktioniert.
Lysosomale Speicherkrankheiten sind ausführlich untersucht worden und die für bestimmte Krankheiten verantwortlichen Enzyme (oder deren Mangel) sind identifiziert worden. Die meisten Krankheiten werden durch einen Mangel des entsprechenden Enzyms im Lysosom verursacht, oft auf Grund von Mutationen oder Deletionen im Strukturgen für das Enzym. Bei manchen lysosomalen Speicherkrankheiten, z. B. der I-Zellen Krankheit und der Pseudo-Hurler Polydystrophie, wird der Enzymmangel durch die Unfähigkeit der Zelle verursacht, die Enzyme auf das Lysosom zu zielen und dorthin zu transportieren.
Lysosomale Speicherkrankheiten sind ausführlich untersucht worden und die für bestimmte Krankheiten verantwortlichen Enzyme (oder deren Mangel) sind identifiziert worden (Scriver, Beaudet, Sly und Vale, Hrsg., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6. Auflage, 1989, Lysosomal Enzymes, Teil 11, Kapitel 61–72, S. 1565–1839). Innerhalb von jeder Krankheit kann der Schweregrad und das Alter, in dem sich die Krankheit zeigt, eine Funktion der Menge an restlichem lysosomalem Enzym sein, die in dem Patienten existiert.
Lysosomaler Targeting-Weg
Die lysosomalen Targeting-Wege sind ausführlich untersucht worden, und der Vorgang, durch den lysosomale Enzyme synthetisiert und zum Lysosom transportiert werden, ist gut beschrieben worden. Kornfeld, S. (1986) "Trafficking of lysosomal enzymes in normal and disease states." Journal of Clinical Investigation 77: 1–6 und Kornfeld, S. (1990) "Lysosomal enzyme targeting." Biochem. Soc. Trans. 18: 367–374. Allgemein werden lysosomale Enzyme zusammen mit sekretorischen Glycoproteinen durch membrangebundene Polysomen im rauen endoplasmatischen Retikulum ("RER") synthetisiert. Im RER erhalten lysosomale Enzyme N-gebundene Oligosaccharide durch Übertragung eines vorgebildeten Oligosaccharids im Ganzen von Dolicholphosphat, das 2-N-Acetylglucosamin, 9-Mannose und 3-Glucose enthält. Glycosylierte lysosomale Enzyme werden dann zusammen mit sekretorischen Proteinen zum Golgi-Apparat transportiert. Im cis-Golgi oder intermediären Kompartiment werden lysosomale Enzyme durch die Übertragung von GlcNAc-Phosphat auf spezifische Mannosen spezifisch und einzigartig modifiziert. In einem zweiten Schritt wird das GlcNAc entfernt, wodurch die Targeting-Determinante Mannose-6-phosphat ("M6P") freigelegt wird. Die lysosomalen Enzyme mit dem freigelegten M6P binden an M6P-Rezeptoren im trans-Golgi und werden zum Endosom und dann zum Lysosom transportiert. Im Lysosom werden die Phosphate schnell durch lysosomale Phosphatasen entfernt und die Mannosen werden durch lysosomale Mannosidasen entfernt (Einstein, R. und Gabel, C. A. (1991) "Cell-and ligand-specific dephosphorylation of acid hydrolases: evidence that the mannose 6-phosphate is controlled by compartmentalization." Journal of Cell Biology 112: 81–94).
Die Synthese lysosomaler Enzyme mit freigelegtem M6P wird durch zwei unterschiedliche Enzyme katalysiert, die beide unentbehrlich sind, wenn die Synthese stattfinden soll. Das erste Enzym ist UDP-N-Acetylglucosamin: lysosomales Enzym N-Acetylglucosamin-1-phosphotransferase ("GlcNAc-Phosphotransferase") (E.C. 2.7.8.17). GlcNAc-Phosphotransferase katalysiert die Übertragung von N-Acetylglucosamin-1-phosphat aus UDP-GlcNAc auf die Position 6 von α-1,2-verknüpften Mannosen auf dem lysosomalen Enzym. Die Erkennung und Hinzufügung von N-Acetylglucosamin-1-phosphat auf lysosomale Hydrolasen durch GlcNAc-Phosphotransferase ist der entscheidende und bestimmende Schritt beim lysosomalen Targeting. Der zweite Schritt wird durch N-Acetylglucosamin-1-phosphodiester-α-N-acetylglucosaminidase ("Phosphodiester-α-GlcNAcase") (E.C. 3.1.4.45) katalysiert. Phosphodiester-α-GlcNAcase katalysiert die Entfernung von N-Acetylglucosamin aus dem mit GlcNAc-Phosphat modifizierten lysosomalen Enzym, um ein terminales M6P auf dem lysosomalen Enzym zu erzeugen. Vorläufige Untersuchungen dieser Enzyme sind durchgeführt worden. Bao et al., in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 271, Nummer 49, Ausgabe vom 6. Dezember 1996, S. 31437–31445, betrifft ein Verfahren zur Reinigung von UDP-N-Acetylglucosamin: lysosomales Enzym N-Acetylglucosamin-1-phosphotransferase aus dem Rind und schlägt eine hypothetische Untereinheitenstruktur für das Protein vor. Bao et al., in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 271, Nummer 49, Ausgabe vom 6. Dezember 1996, S. 31446–31451, betrifft die enzymatische Charakterisierung und Identifizierung der katalytischen Untereinheit für UDP-N-Acetylglucosamin: lysosomales Enzym N-Acetylglucosamin-1-phosphotransferase aus dem Rind. Kornfeld et al., in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 273, Nummer 36, Ausgabe vom 4. September 1998, S. 23203–23210, betrifft die Reinigung und multimere Struktur von N-Acetylglucosamin-1-phosphodiester-α-N-acetylglucosaminidase aus dem Rind. Die zum Isolieren dieser Proteine erforderlichen dem Eigentümer gehörenden Antikörper sind jedoch anderen nicht verfügbar gemacht worden und die in diesen vorläufigen Untersuchungen verwendeten Proteinsequenzen für die Enzyme sind nicht offenbart worden.
Obwohl der lysosomale Targeting-Weg bekannt ist und die an dem Weg beteiligten, natürlich vorkommenden Enzyme partiell untersucht worden sind, sind die zum Hinzufügen von M6P im lysosomalen Targeting-Weg verantwortlichen Enzyme schwer zu isolieren und zu reinigen und sind schlecht verstanden. Ein besseres Verständnis der Enzyme des lysosomalen Targeting-Weges und der molekularen Grundlage für ihre Wirkung wird benötigt, um bei der Entwicklung wirksamer Techniken zur Nutzung dieser Enzyme bei Verfahren zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten, insbesondere auf dem Gebiet der gezielten Enzymersatztherapie, zu helfen.
Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten
Durch das Fehlen von Enzymen verursachte lysosomale Speicherkrankheiten können theoretisch unter Verwendung einer Enzymersatztherapie, d. h. durch Verabreichen isolierter und gereinigter Enyzme an den Patienten, um die Krankheit zu behandeln, behandelt werden. Um wirksam zu sein, muss das verabreichte lysosomale Enzym jedoch von der Zelle aufgenommen und zum Lysosom transportiert werden. Natürlich vorkommende Enzyme und ihre rekombinanten Äquivalente sind jedoch von beschränktem Wert bei der Enzymersatztherapie gewesen, weil die gereinigten oder rekombinanten lysosomalen Enzyme keine adäquaten Mengen von freigelegtem M6P enthalten oder unerwünschte Oligosaccharide enthalten, die ihre Zerstörung vermitteln. Ohne ausreichendes M6P kann das verabreichte lysosomale Enzym nicht effizient an M6P-Rezeptoren binden und zu den Lysosomen transportiert werden. Zum Beispiel enthält aus der Plazenta gereinigte menschliche saure α-Glucosidase Oligomannose-Oligosaccharide, die nicht phosphoryliert sind (Mutsaers, J. H. G. M., Van Halbeek, H., Vliegenthart, J. F. G., Tager, J. M., Reuser, A. J. J., Kroos, M. und Galjaard, H. (1987). "Determination of the structure of the carbohydrate chains of acid α-glucosidase from human placenta." Biochimica et Biophysica Acta 911: 244–251), und diese Glycoform des Enzyms wird durch die Zellen nicht effizient aufgenommen (Reuser, A. J., Kroos, M. A., Ponne, N. J., Wolterman, R. A., Loonen, M. C., Busch, H. F., Visser, W. J. und Bolhuis, P. A. (1984). "Uptake and stability of human and bovine acid alpha-glucosidase in cultured fibroblasts and skeletal muscle cells from glycogenosis type II patients." Experimental Cell Research 155: 178–189). Als Ergebnis der Unfähigkeit, lysosomale Enyzme mit den erwünschten Oligosaccharidstrukturen zu reinigen oder zu synthetisieren, werden diese Enzymherstellungen ineffizient auf betroffene Zeilen gezielt und sind von beschränkter Wirksamkeit bei der Behandlung dieser Krankheiten. Es existiert deshalb ein Bedarf an Enzymen, die in Enzymersatz-Therapieverfahren verwendet werden können, besonders an hoch phosphorylierten Enzymen, die von der Zelle effizient aufgenommen und zum Lysosom transportiert werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, biologisch aktive GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase als isolierte und gereinigte Polypeptide zu verwenden.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung hoch phosphorylierter lysosomaler Enzyme, die zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten nützlich sind, bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolasen, die zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten nützlich sind, bereitzustellen.
Diese und andere Aufgaben werden durch Gewinnen isolierter und gereinigter biologisch aktiver GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase und Verwenden dieser Enzyme erreicht, um hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolasen herzustellen, die für die Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten nützlich sind. Insbesondere werden die Enzyme verwendet, um hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolasen herzustellen, die bei Enzymersatz-Therapieverfahren wirksam verwendet werden können.
Lysosomale Hydrolasen mit mannosereichen Strukturen werden mit GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase behandelt, was zur Produktion von Asparagin-verknüpften Oligosaccariden führt, die mit Mannose-6-phosphat ("M6P") hoch modifiziert sind. Die behandelte Hydrolase bindet an M6P-Rezeptoren auf der Zellmembran und wird in die Zelle transportiert und an das Lysosom abgegeben, wo sie ihre normale oder eine erwünschte Funktion ausüben kann.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden, ausführlicheren Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Modell der Untereinheitenstruktur der GlcNAc-Phosphotransferase. Das Enzym ist ein Komplex aus sechs Polypeptiden. Die α- und β-Untereinheiten sind das Produkt eines einzigen Gens. Nach der Translation werden die α- und β-Untereinheiten durch proteolytische Spaltung zwischen Lys⁹²⁹ und Asp⁹³⁰ getrennt. Die α-Untereinheit ist ein Membranglycoprotein des Typs II mit einer einzelnen aminoterminalen membranumspannenden Domäne. Die β-Untereinheit ist ein membranumspannendes Glycoprotein des Typs I mit einer einzelnen carboxylterminalen membranumspannenden Domäne. Die γ-Untereinheit ist das Produkt eines zweiten Gens. Die γ-Untereinheit ist ein lösliches Protein mit einem abgespaltenen Signalpeptid. Die α-, β- und γ-Untereinheiten sind alle eng miteinander assoziiert.
2 zeigt ein Modell der Untereinheitenstruktur der Phosphodiester-α-GlcNAcase. Das Enzym ist ein Tetramer, das aus vier identischen Untereinheiten besteht, die als zwei nicht kovalent assoziierte Dimere angeordnet sind, die selbst Disulfid-verknüpft sind. Die einzelne Untereinheit ist ein Membranprotein des Typs I, das ein Signalpeptid, eine pro-Region, die im reifen Enzym nicht vorliegt, und eine einzelne carboxylterminale, membranumspannende Domäne enthält.
3 zeigt ein Diagramm der Expression von rekombinantem Glycoprotein in CHO-Zellen. In überexprimierenden CHO-Zellen wird das rh-GAA auf den Wegen 1 und 2 verarbeitet, abhängig davon, ob durch GlcNAc-Phosphotransferase (GnPT) auf das Enyzm eingewirkt wird oder nicht. Die sezernierte GAA enthält vorwiegend sialylierte Glykane des Komplex-Typs mit zwei Antennen und ist kein Substrat für GlcNAc-Phosphotransferase. In Anwesenheit der α-1,2-Mannosidase-Inhibitoren 1-Desoxymannojirimycin oder Kifunensin ist die Umwandlung von MAN9- in MALA5-Strukturen blockiert, was zur Sekretion von GAA-tragenden MAN7-9-Stukturen führt, die mit GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase (UCE) modifiziert werden können, wobei phosphorylierte Spezies erzeugt werden (Weg 3).
4 zeigt eine transiente Expressionsanalyse verschiedener Plasmidkonstrukte der α/β- und γ-Untereinheiten menschlicher GlcNAc-Phosphotransferase. Plasmide, welche die α/β- und/oder die γ-Untereinheiten enthielten, wurden in 293T-Zellen transfiziert, das exprimierte Protein wurde 23, 44,5 und 70 Stunden nach der Transfektion aus der Kultur gereinigt und relative Expressionsmengen wurden durch Messen der Phosphotransferase-Aktivität unter Verwendung von Methyl-α-D-mannosid und [β-³²P]-UDP-GlcNAc als Substrate abeschätzt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff "GlcNAc-Phosphotransferase", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Enzyme, die fähig sind, die Übertragung von N-Acetylglucosamin-1-phosphat von UDP-GlcNAc auf die Position 6' von α-1,2-verknüpften Mannosen auf lysosomalen Enzymen zu katalysieren.
Der Begriff "Phosphodiester-α-GlcNAcase", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Enzyme, die fähig sind, die Entfernung von N-Acetylglucosamin aus mit GlcNAc-Phosphatmannosediester modifizierten Enzymen zu katalysieren, um terminales M6P zu erzeugen.
Die Begriffe "GlcNAc-Phosphotransferase" und "Phosphodiester-α-GlcNAcase", wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen Enzyme, die von jeder beliebigen eukaryotischen Art, besonders Säugerarten, wie zum Beispiel Rinder-, Schweine-, Mäuse-, Pferde- und menschlichen Arten, und aus jeder beliebigen Quelle, ob natürlich, synthetisch, halbsynthetisch oder rekombinant, erhalten werden. Die Begriffe umfassen membrangebundene Enzyme und lösliche oder verkürzte Enzyme mit weniger als der vollständigen Aminosäuresequenz und biologisch aktive Varianten und Genprodukte.
Der Begriff "natürlich vorkommend", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein aus tierischem Gewebe oder Zellen isoliertes und gereinigtes endogenes oder exogenes Protein.
Der Begriff "isoliert und gereinigt", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Protein, das im Wesentlichen frei von einer Verbindung mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ist, z. B. als ein natürlich vorkommendes Protein, das von zellullären und anderen Verunreinigungen durch die Verwendung von Antikörpern oder anderen Verfahren getrennt worden ist, oder als ein Reinigungsprodukt einer rekombinanten Wirtszellkultur.
Der Begriff "biologisch aktiv", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Enzym oder Protein mit strukturellen, regulatorischen oder biochemischen Funktionen eines natürlich vorkommenden Moleküls.
Der Begriff "Nucleotidsequenz", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Polynucleotidmolekül in Form eines getrennten Fragments oder als Komponente eines größeren Nucleinsäurekonstrukts, das aus DNA oder RNA abgeleitet worden ist, die mindestens einmal in im Wesentlichen reiner Form (d. h. frei von kontaminierenden endogenen Materialien) und in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde, die eine Identifikation, Manipulation und Gewinnung ihrer Nucleotidsequenz-Bestandteile durch biochemische Standardverfahren ermöglicht. Derartige Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmens bereitgestellt, der nicht durch interne nicht translatierte Sequenzen oder Introns unterbrochen ist, die normalerweise in eukaryotischen Genen vorliegen. Sequenzen nicht translatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenen Leserahmen vorliegen, wo diese eine Manipulation oder Expression der kodierenden Region nicht stören.
Der Begriff "Nucleinsäuremolekül", wie er hierin verwendet wird, bedeutet RNA oder DNA, einschließlich cDNA, einzel- oder doppelsträngiger und linearer oder kovalent geschlossener Moleküle. Bei einem Nucleinsäuremolekül kann es sich auch um genomische DNA handeln, die dem ganzen Gen oder einem wesentlichen Teil davon bis zu Fragmenten und Derivaten davon entspricht. Die Nucleotidsequenz kann der natürlich vorkommenden Nucleotidsequenz entsprechen oder kann einzelne oder mehrfache Nucleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen, einschließlich von Fragmenten davon, enthalten. Alle derartigen Variationen des Nucleinsäuremoleküls behalten die Fähigkeit bei, ein biologisch aktives Enzym zu kodieren, wenn sie in dem entsprechenden Wirt exprimiert werden, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon. Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül kann nur die ein Enzym kodierende Nucleotidsequenz umfassen oder kann Teil eines größeren Nucleinsäuremoleküls sein, das sich bis zu dem Gen für das Enzym erstreckt. Die nicht das Enzym kodierenden Sequenzen in einem größeren Nucleinsäuremolekül können Vektor-, Promotor-, Terminator-, Enhancer-, Replikations-, Signalsequenzen oder nicht kodierende Regionen des Gens einschließen.
Der Begriff "Variante", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid, das im Wesentlichen zu einem natürlich vorkommenden Protein homolog ist, das aber wegen einer oder mehreren Deletionen, Insertionen, Derivatisierungen oder Substitutionen eine andere Aminosäuresequenz als das natürlich vorkommende Protein (menschliche, Rinder-, Schafs-, Schweine-, Mäuse-, Pferde- oder andere eukaryotische Arten) aufweist. Die variante Aminosäuresequenz ist vorzugsweise zu mindestens 50% mit einer natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz identisch, ist aber am stärksten bevorzugt zu mindestens 70% identisch. Varianten können konservativ substituierte Sequenzen umfassen, bei denen ein gegebener Aminosäurerest durch einen Rest mit ähnlichen physikochemischen Kennzeichen ersetzt wird. Konservative Substitutionen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen die Substitution eines aliphatischen Restes für einen anderen, wie zum Beispiel Ile, Val, Leu oder Ala füreinander, oder Substitutionen eines polaren Restes für einen anderen, wie zum Beispiel unter Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn, ein. Herkömmliche Verfahren und Methoden können zum Herstellen und Verwenden derartiger Varianten verwendet werden. Andere derartige konservative Substitutionen, wie zum Beispiel Substitutionen gesamter Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätskennzeichen, sind wohlbekannt. Natürlich vorkommende Varianten werden auch durch die vorliegende Erfindung umfasst. Beispiele für derartige Varianten sind Enzyme, die sich aus alternativen mRNA-Spleißereignissen oder aus einer proteolytischen Spaltung des Enzyms ergeben, welche das Enzym biologisch aktiv und fähig lassen, seine katalytischen Funktionen auszuüben. Alternatives Spleißen von mRNA kann ein verkürztes, aber biologisch aktives Protein, wie zum Beispiel eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins, ergeben. Die einer Proteolyse zuzuordnenden Variationen schließen Unterschiede in den N- oder C-Termini nach einer Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen auf Grund einer proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren aus dem Protein ein.
Der Begriff "im Wesentlichen gleich", wie er hierin verwendet wird, bedeutet Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen mit Sequenzvariationen, welche die Beschaffenheit des Proteins, d. h. die Struktur und/oder biologische Aktivität des Proteins, nicht grundlegend beeinflussen. Mit besonderem Bezug auf Nucleinsäuresequenzen soll der Begriff "im Wesentlichen gleich" die kodierende Region und konservierte Sequenzen bezeichnen, welche die Expression beherrschen, und bezeichnet in erster Linie degenerierte Codons, welche die gleiche Aminosäure kodieren, oder alternative Codons, welche konservative Ersatz-Aminosäuren im kodierten Polypeptid kodieren. Mit Bezug auf Aminosäuresequenzen bezeichnet der Begriff "im Wesentlichen gleich" allgemein konservative Substitutionen und/oder Variationen in Regionen des Polypeptids, die an der Bestimmung von Struktur oder Funktion nicht beteiligt sind.
Der Begriff "Prozentsatz der Identität", wie er hierin verwendet wird, bedeutet Vergleiche zwischen Aminosäuresequenzen, wie sie in dem von der University of Wisconsin erhältlichen Sequenzanalyseprogramm UWGCG definiert werden (Devereaux et al., Nucl. Acids Res. 12: 387–397 (1984)).
Der Begriff "hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolase", wie er hierin verwendet wird, bedeutet einen Phosphorylierungsspiegel an einer gereinigten lysosomalen Hydrolase, der nicht nur durch Isolieren der Hydrolase aus einer natürlich Quelle und ohne anschließende Behandlung mit der GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase erhalten werden könnte. Insbesondere bedeutet "hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolase" eine lysosomale Hydrolase, die von etwa 6% bis etwas 100% bis-phosphorylierte Oligosaccharide enthält.
Diese Erfindung ist nicht auf die bestimmte Methodik, bestimmten Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien, die beschrieben werden, beschränkt, weil diese variieren können. Ferner dient die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck, bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben, und soll den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken. Wie hierin und in den angehängten Ansprüchen verwendet, schließt die Singularform "ein", "eine", "einer", und "der", "die", "das" den Bezug auf den Plural ein, sofern der Zusammenhang nicht klar das Gegenteil vorschreibt, z. B. schließt der Bezug auf "eine Wirtszelle" eine Vielzahl derartiger Wirtszellen ein.
Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes kann eine Vielfalt von Nucleo tidsequenzen hergestellt werden, die GlcNAc-Phosphotransferase, Phosphodiester-α-GlcNAcase oder andere hierin genannte Sequenzen kodieren. Manche dieser Sequenzen werden hoch homolog und andere werden minimal homolog zu der Nucleotidsequenz irgendeines bekannten und natürlich vorkommenden Gens sein. Die vorliegende Erfindung zieht jede einzelne mögliche Nucleotidsequenzvariation in Betracht, die durch Auswählen von Kombinationen beruhend auf möglicher Kodonwahl gemacht werden könnte. Diese Kombinationen werden in Übereinstimmung mit dem genetischen Dreier- Standardcode gemacht, wie er auf die Nucleotidsequenz von natürlich vorkommender GlcNAc-Phosphotransferase oder Phosphodiester-α-GlcNAcase angewandt wird, und alle derartigen Variationen werden als spezifisch offenbart angesehen.
Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe und alle hierin verwendeten Akronyme die gleichen Bedeutungen, wie sie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung verstanden werden. Obwohl alle Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien hierin beschrieben.
Alle hierin erwähnten Patente und Veröffentlichungen werden hierin in dem durch das Gesetz erlaubten Ausmaß zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung der Proteine, Enzyme, Vektoren, Wirtszellen und Methodiken, über die darin berichtetet wird und die mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, durch Bezugnahme aufgenommen. Nichts hierin soll jedoch als Zugeständnis ausgelegt werden, dass die Erfindung kein Anrecht darauf hat, einer derartigen Offenbarung aufgrund der früheren Erfindung vorauszugehen.
Die Erfindung
GlcNAc-Phosphotransferase
In einer Ausführungsform werden isolierte und gereinigte biologisch aktive GlcNAc-Phosphotransferase, Nucleinsäuremoleküle, die GlcNAc-Phosphotransferase und ihre Untereinheiten kodieren, Expressionsvektoren mit einer DNA, die GlcNAc-Phosphotransferase kodiert, Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren mit DNA, die GlcNAc-Phosphotransferase kodiert, transfiziert oder transformiert worden sind, Verfahren zum Herstellen rekombinanter GlcNAc-Phosphotransferase durch Züchten von Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren mit DNA, die GlcNAc-Phosphotransferase kodiert, transfiziert oder transformiert worden sind, isolierte und gereinigte rekombinante GlcNAc-Phosphotransferase offenbart. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Verwenden von GlcNAc-Phosphotransferase zur Herstellung hoch phosphorylierter lysosomaler Enzyme bereit, die zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten nützlich sind.
Um erfindungsgemäße isolierte und gereinigte GlcNAc-Phosphotransferase und ihre Untereinheiten und die das Enzym kodierenden Nucleinsäuremoleküle zu erhalten, wurde GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind folgendermaßen erhalten und analysiert. Splenozyten aus Mäusen, die mit einer partiell gereinigten Herstellung von GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind immunisiert worden waren, wurden mit Myelomzellen fusioniert, um eine Gruppe von Hybridomen zu erzeugen. Hybridome, die für GlcNAc-Phosphotransferase spezifische monoklonale Antikörper sezernierten, wurden durch einen Immunocapture-Assay identifiziert. Bei diesem Assay wurden Antikörper, die GlcNAc-Phosphotransferase aus einer rohen Quelle einfangen konnten, durch die Analyse von Immunpräzipitaten mit einem spezifischen enzymatischen Assay für GlcNAc-Phosphotransferase identifiziert. Hybridome wurden zweimal subkloniert, Antikörper wurden in Ascites-Kultur hergestellt, an einen festen Träger gekoppelt und auf Immunaffinitätschromatographie hin getestet. Es wurde festgestellt, dass Emphaze mit dem monoklonale Antikörper PT18 eine Reinigung von GlcNAc-Phosphotransferase zur Homogenität in einem einzigen Schritt ermöglichte. Bao, et al., The Journal of Biological Chemistry, Bd. 271, Nummer 49, Ausgabe vom 6. Dezember 1996, S. 31437–31445, betrifft ein Verfahren zur Reinigung von UDP-N-Acetylglucosamin: lysosomales Enzym N-Acetylglucosamin-1-phosphotransferase aus dem Rind und schlägt eine hypothetische Untereinheitenstruktur für das Protein vor. Bao, et al., The Journal of Biological Chemistry, Bd. 271, Nummer 49, Ausgabe vom 6. Dezember 1996, S. 31446–31451. Unter Verwendung dieser Technik wurde das Enzym bei 29% Ausbeute 488.000-fach gereinigt. Die eluierte GlcNAc-Phosphotransferase hat eine spezifische Aktivität von > 10⁶, vorzugsweise > 5 × 10⁶, stärker bevorzugt > 12 × 10⁶ pmol/h/mg und ist, beruhend auf silbergefärbter SDS-PAGE, anscheinend ein homogenes Enzym mit mehreren Untereinheiten. Der PT18 benannte monoklonale Antikörper wurde zur Verwendung bei weiteren Experimenten ausgewählt. Ein Hybridom, das den monoklonalen Antikörper PT18 sezerniert, wurde am 29. August 2000 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, hinterlegt und ihm wurde die ATCC Hinterlegungsnr. PTA 2432 zugewiesen.
Es wurde bestimmt, dass GlcNAc-Phosphotransferase ein Komplex aus sechs Polypeptiden mit der Untereinheitenstruktur α₂β₂γ₂ ist. 1 zeigt ein Modell der Untereinheitenstruktur, das aus einer quantitativen Aminosäuresequenzierung, einer Immunpräzipitation mit untereinheitenspezifischen monoklonalen Antikörpern, einer SDS-PAGE und cDNA-Sequenzen erhalten wurde. Die Beweismittel für das Modell werden nachstehend zusammengefasst. Die durch Gelfiltration geschätzte Molekülmasse des Komplexes beträgt 570.000 Dalton. Die 166.000 Dalton große α-Untereinheit wird als ein Disulfid-verknüpftes Homodimer gefunden. Ähnlich wird die 51.000 Dalton große γ-Untereinheit als ein Disulfid-verknüpftes Homodimer gefunden. Weil sowohl die α- als auch die γ-Untereinheiten in Disulfid-verknüpften Homodimeren gefunden werden, muss jedes Molekül mindestens ein α- und ein γ-Homodimer enthalten. Obwohl die 56.000 Dalton große β-Untereinheit nicht in einem Disulfid-verknüpften Homodimer gefunden wird, legen zwei unabhängige Beweislinien stark nahe, dass jeder Komplex auch zwei β-Untereinheiten enthält. Erstens demonstriert eine quantitative aminoterminale Sequenzierung ein molares Verhältnis von 1:1 zwischen den β- und γ-Untereinheiten. Zweitens, da die α- und β-Untereinheiten durch eine einzige cDNA kodiert und durch proteolytisches Prozessieren geteilt werden, werden zwei β-Untereinheit für jedes α-Untereinheitendimer produziert. Die vorhergesagte Masse des Komplexes, beruhend auf der Zusammensetzung α₂β₂γ₂ beträgt 546.000 Dalton (2 × 166.000 + 2 × 56.000 + 2 × 51.000), in ausgezeichneter Übereinstimmung mit der durch Gelfiltration geschätzten Masse.
GlcNAc-Phosphotransferase wurde unter Verwendung eines Assays für die Übertragung von GlcNAc-1-Phosphat auf den synthetischen Akzeptor α-Methylmannosid gereinigt. Die natürlichen Akzeptoren für die GlcNAc-Phosphotransferase sind jedoch die mannosereichen Oligosaccharide lysosomaler Hydrolasen. Um die Fähigkeit der gereinigten GlcNAc-Phosphotransferase, Glycoproteine als Akzeptoren zu benutzen, auszuwerten, wurde die Übertragung von GlcNAc-1-P auf die lysosomalen Enzyme Uteroferrin und Cathepsin D, das nicht lysosomale Glycoprotein RNAse B und die lysosomale Hydrolase β-Glucocerebrosidase (die durch einen von M6P unabhängigen Weg transportiert wird) untersucht. Sowohl Uteroferrin als auch Cathepsin D werden von gereinigter GlcNAc-Phosphotransferase mit K_m-Werten unterhalb von 20 μm wirksam als Akzeptoren benutzt. Im Gegensatz dazu ist weder RNAse B noch β-Glucocerebrosidase ein wirksamer Akzeptor.
Die Unwirksamkeit von RNAse B, die ein einziges mannosereiches Oligosaccharid enthält, als Akzeptor ist speziell bemerkenswert, da die Km an der Löslichkeitsgrenze des Proteins (bei 600 μm) nicht erreicht wurde. Diese Daten demonstrieren deutlich, dass die spezifische Phosphorylierung von lysosomalen Hydrolasen, die vorher mit rohen Präparaten beobachtet wurde (Waheed, Pohlmann A., R., et al. (1982). "Deficiency of UDP-N-acetylglucosamine: lysosomal enzyme N-Acetylglucosamin-1-phosphotransferase in organs of I-Cell patients." Biochemical and Biophysical Research Communications 105 (3): 1052–10580), eine Eigenschaft der GlcNAc-Phosphotransferase selbst ist.
Die α-Untereinheit wurde als diejenige identifiziert, welche die Bindungsstelle für UDP-GlcNAc enthält, da diese Untereinheit mit [β-³²P]-5-Azido-UDP-Glc spezifisch photoaffinitätsmarkiert wurde.
Die aminoterminalen und internen (tryptischen) Proteinsequenzdaten wurden für jede Untereinheit erhalten. Die N-terminale Sequenz wurde folgendermaßen von jeder Untereinheit erhalten. Einzelne Untereinheiten der GlcNAc-Phosphotransferase wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat vor und nach einer Reduktion der Disulfidbindungen getrennt. Die Untereinheiten wurden dann durch Elektroblotting auf eine PVDF-Membran übertragen, durch Coomassie-Blau-Färbung identifiziert, ausgeschnitten und einer N-terminalen Sequenzierung unterworfen. Um eine interne Sequenz zu erhalten, wurde die GlcNAc-Phosphotransferase denaturiert, reduziert und alkyliert, und einzelne Untereinheiten wurden durch Gelfiltrationschromatographie getrennt. Isolierte Untereinheiten wurden dann mit Trypsin verdaut und die tryptischen Peptide durch Reverse-Phase-HPLC fraktioniert. Peaks, die nur ein einziges Peptid zu enthalten schienen wurden durch MALDI auf Reinheit hin analysiert und einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterworfen.
Die Aminosäuresequenz für die menschliche α-Untereinheit wird in den Aminosäuren 1–928 der SEQ ID NO: 1 gezeigt; die menschliche β-Untereinheit in den Aminosäuren 1–328 der SEQ ID NO: 2; und die menschliche γ-Untereinheit in den Aminosäuren 25–305 der SEQ ID NO: 3. Die γ-Untereinheit hat eine in den Aminosäuren 1–24 der SEQ ID NO: 3 gezeigte Signalsequenz.
Ein Vergleich mit den Datenbanken unter Verwendung der Blast-Algorithmen demonstriert, dass diese Proteine nicht früher beschrieben worden sind, obwohl einige EST-Sequenzen der entsprechenden cDNAs vorliegen.
Unter Verwendung dieser Peptidsequenzen und einer Kombination aus Durch mustern von Banken, RACE, PCR und Blast-Durchsuchen von Dateien mit Expressed-Sequence-Tags ("EST") wurden die menschlichen cDNAs voller Länge, die jede Untereinheit kodieren, kloniert und sequenziert.
Die Nucleotidsequenz für die cDNA des Vorläufers der menschlichen α/β-Untereinheiten wird in den Nucleotiden 165–3932 der SEQ ID NO: 4 gezeigt; die Nucleotidsequenz für die α-Untereinheit wird in den Nucleotiden 165–2948 der SEQ ID NO: 4 gezeigt; die Nucleotidsequenz für die β-Untereinheit wird in den Nucleotiden 2949–3932 der SEQ ID NO: 4 gezeigt; und die Nucleotidsequenz für die γ-Untereinheit wird in den Nucleotiden 96–941 der SEQ ID NO: 5 gezeigt. Die Nucleotidsequenz für das Signalpeptid der γ-Untereinheit wird in den Nucleotiden 24–95 der SEQ ID NO: 5 gezeigt.
Für jede Untereinheit sind eine N-terminale Peptidsequenz und zwei interne Peptidsequenzen in der jeweiligen cDNA-Sequenz identifiziert worden. Obwohl die Proteinsequenzdaten vom Rinderprotein stammen und die cDNA-Sequenzen menschlich sind, sind die Sequenzen hoch homolog (Identitäten: α-Untereinheit 43/50; β-Untereinheit 64/64, γ-Untereinheit 30/32), was bestätigt, dass die klonierten cDNAs die menschlichen Homologe der GlcNAc-Phosphotransferase-Untereinheiten aus dem Rind darstellen. Es wurde gefunden, dass die α- und β-Untereinheiten durch eine einzige cDNA kodiert werden, deren Gen auf Chromosom 12 liegt. Die γ-Untereinheit ist das Produkt eines zweiten, auf Chromosom 16 lokalisierten Gens. Das Vorläufergen für die α/β-Untereinheit ist kloniert und sequenziert worden. Das Gen umspannt ~80 kb und enthält 21 Exons. Das Gen für die γ-Untereinheit ist auch in Daten identifiziert worden, die von einem Genomsequenzierungsprojekt berichtet werden. Das Gen für die γ-Untereinheit ist in 11 Exons angeordnet, die 12 kb genomische DNA umspannen.
Unter Verwendung der menschlichen cDNAs wurden die homologen Maus- cDNAs für die α-, β- und γ-Untereinheiten unter Verwendung von Standardtechniken isoliert und sequenziert. Die cDNA für den Vorläufer der α-β-Untereinheit der Maus wird in SEQ ID NO: 16 gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für die α-Untereinheit der Maus wird in SEQ ID NO: 15 und für die β-Untereinheit in SEQ ID NO: 8 gezeigt.
Die Maus-cDNA für die γ-Untereinheit wurde aus einer Bank aus Mausleber in λZap II unter Verwendung der menschlichen cDNA für die γ-Untereinheit als Sonde isoliert. Die menschliche cDNA für die γ-Untereinheit wurde zufällig mit ³²P-dCTP Hexamer-markiert und verwendet, um eine cDNA-Bank aus Mausleber in λZap II durchzumustern. Die Sonde hybridisierte an 3 von 500.000 durchgemusterten Plaques. Jeder wurde zur Homogenität subkloniert, das Insert ausgeschnitten, in pUC19 kloniert und unter Verwendung von Standardverfahren, Sambrook. J., Fritsch E. F., et al. (1989). Molecular Cloning. A Laborstory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laborstory Press, sequenziert. Die Sequenz der cDNA für die γ-Untereinheit der Maus wird in SEQ ID NO: 10 gezeigt und die abgeleitete Aminosäuresequenz für die γ-Untereinheit der Maus wird in SEQ ID NO: 9 gezeigt.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der α-, β- und γ-Untereinheiten von Mensch und Maus demonstriert, dass die Proteine mit einer Identität von etwa 80 Prozent hoch homolog sind.
Um zu bestätigen, dass diese Enzyme unter den Arten im Wesentlichen gleich waren, wurde eine partielle homologe cDNA der Ratte für die α- und β-Untereinheiten unter Verwendung von Standardtechniken isoliert und sequenziert. Die partielle cDNA für die α- und β-Untereinheiten der Ratte wird in SEQ ID NO: 12 gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die der cDNA entspricht, wird in SEQ ID NO: 11 gezeigt. Ferner wurde eine partielle homologe cDNA von Drosophila für die α- und β-Untereinheiten unter Verwendung von Standardtechniken isoliert und sequenziert. Die partielle cDNA von Drosophila für die α- und β-Untereinheiten wird in SEQ ID NO: 17 gezeigt. Die der cDNA entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 13 gezeigt. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der partiellen α- und β-Untereinheit von Mensch, Ratte und Drosophila zeigen, dass die Proteine hoch homolog sind.
Phosphodiester-α-GlcNAcase
In einer anderen Ausführungsform werden isolierte und gereinigte biologisch aktive Phosphodiester-α-GlcNAcase, Nucleinsäuremoleküle, die Phosphodiester-α-GlcNAcase kodieren, Expressionsvektoren mit einer DNA, die Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert, Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren mit DNA, die Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert, transfiziert oder transformiert worden sind, Verfahren zum Herstellen rekombinanter Phosphodiester-α-GlcNAcase durch Züchten von Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren mit DNA, die Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert, transfiziert oder transformiert worden sind, isolierte und gereinigte rekombinante Phosphodiester-α-GlcNAcase offenbart. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Verwenden von Phosphodiester-α-GlcNAcase zur Herstellung hoch phosphorylierter lysosomaler Enzyme bereit, die zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten nützlich sind.
Um erfindungsgemäße isolierte und gereinigte Phosphodiester-α-GlcNAcase und das Enzym kodierende Nucleinsäuremoleküle zu erhalten, wurde Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind folgendermaßen erhalten und analysiert. Mäuse wurden mit einer partiell gereinigten Herstellung von Phosphodiester-α-GlcNAcase immunisiert und eine funktionelle Durchmusterungsstrategie wurde benutzt, um einen für Phosphodiester-α-GlcNAcase spezifischen monoklonalen Antikörper zu identifizieren und zu isolieren. Ein Immunogen wurde hergestellt, indem Phosphodiester-α-GlcNAcase aus einem Membranpellet von Rinderpankreas unter Verwendung von Chromatographie auf DEAE-Sepharose, Iminodiessigsäure-Sepharose und Superose 6~6000-fach partiell gereinigt wurde. Zwei Balb/c-Mäusen wurden jeweils 5 μg partiell gereinigte, in vollständigem Freund'schem Adjuvans emulgierte Phosphodiester-α-GlcNAcase intraperitoneal injiziert. Am Tag 28 erhielten die Mäuse intraperitoneal eine Auffrischungsinjektion mit 5 μg in unvollständigem Freund'schem Adjuvans emulgierter Phosphodiester-α-GlcNAcase. Am Tag 42 wurde den Mäusen Blut entnommen und eine für Phosphodiester-α-GlcNAcase spezifische Immunreaktors wurde durch einen "Capture-Assay" dokumentiert. Um den Capture-Assay durchzuführen wurde Serum (5 μl) über Nacht mit 1,2 Einheiten partiell gereinigter Phosphodiester-α-GlcNAcase inkubiert. Der Maus-Antikörper wurde dann auf einem Kaninchen-anti-Maus-IgG eingefangen, das an einen Protein A-Ultralink^TM-Harz gebunden war. Nach ausgiebigem Waschen wurde gebundene Phosphodiester-α-GlcNAcase in dem Ultralink-Pellet durch einen Assay der Spaltung von [³H]-GlcNAc-1-phosphomannose-α-methyl bestimmt.
Nach einer zweiten intravenösen Auffrischungsinjektion mit Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde die Milz entnommen und Splenozyten wurden gemäß unseren Modifikationen (Bag, M., Booth J. L., et al. (1996). "Bovine UDP-N-acetylglucosamine: lysosomal enzyme N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase. I. Purification and subunit structure." Journal of Biological Chemistry 271: 31437–31445) von Standardtechniken (Harlow, E. und Lane, D. (1988). Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory) mit SP2/0-Myelomzellen fusioniert. Die Fusion wurde in 8 Platten mit 96 Vertiefungen in mit rekombinantem menschlichem IL-6 ergänztem Medium ausplattiert (Bazin, R. und Lemieux, R. (1989). "Increased proportion of B cell hybridomas secreting monoclonal antibodies of desired specificity in cultures containing macrophagederived hybridoma growth factor (IL-6)." Journal of Immunological Methods 116: 245–249) und gezüchtet, bis Hybridome gerade sichtbar waren. Achtundvierzig Pools von 16 Vertiefungen wurden konstruiert und unter Verwendung das Capture-Assays auf anti-Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität hin analysiert. Vier Pools waren positiv. Unterpools von 4 Vertiefungen wuden dann aus den in den positiven Pools von 16 Vertiefungen vorliegenden Vertiefungen konstruiert. Drei der vier Pools von 16 Vertiefungen enthielten einen einzelnen Pool von 4 Vertiefungen mit anti-Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität. Die 4 einzelnen Vertiefungen, welche die Pools von 4 Vertiefungen bildeten, wurden dann einzeln analysiert, wobei die Vertiefung identifiziert wurde, die das anti-Phosphodiester-α-GlcNAcase sezernierende Hybridom enthielt. Unter Verwendung des Capture-Assays wurde jedes Hybridom zweimal subkloniert und Antikörper wurden durch Ascites-Kultur hergestellt. Es wurde gefunden, dass die monoklonalen Antikörper UC2 und UC3 Antikörper mit geringer Affinität waren. UC1, ein monoklonaler IgG-Antikörper mit hoher Affinität, wurde durch Ascites-Kultur hergestellt und zur Reinigung von Phosphodiester-α-GlcNAcase auf Emphaze immobilisiert. Der UC1 benannte monoklonale Antikörper wurde zur Verwendung in weiteren Experimenten ausgewählt. Ein den monoklonalen Antikörper UC1 sezernierendes Hybridom wurde am 29. August 2000 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 hinterlegt und ihm wurde die ATCC-Hinterlegungsnr. PTA 2431 zugewiesen.
Um Phosphodiester-α-GlcNAcase zu reinigen, wurde eine solubilisierte Membranfraktion aus Rinderleber hergestellt. Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde durch Inkubation über Nacht unter sanfter Drehbewegung an den monoklonalen Antikörper UC1 adsorbiert, der an ein Emphaze-Harz gekoppelt war. Das UC1-Emphaze wurde dann in eine Säule gepackt, nacheinander mit EDTA und NaHCO₃ bei pH 7,0 gewaschen und dann wurde Phosphodiester-α-GlcNAcase mit NaHCO₃ bei pH 10 eluiert. Fraktionen, die Phosphodiester-α-GlcNAcase bei spezifischen Aktivitäten von > 50.000 μ/mg enthielten, wurden vereinigt und mit 1/5 Volumen 1 M Tris-HCl, pH 7,4, auf pH 8,0 eingestellt. Nach einer Chromatographie auf UC1-Emphaze war die Phosphodiester-α-GlcNAcase bei einer Ausbeute von 32% 92.500-fach gereinigt.
Die Phosphodiester-α-GlcNAcase von UC1-Emphaze wurde konzentriert und auf Superose 6 chromatographiert. Phosphodiester-α-GlcNAcase eluierte früh im Chromatogramm als symmetrischer Aktivitätspeak mit einem zusammenfallenden Proteinpeak. Nach der Chromatographie auf Superose 6 war das Enzym bei einer Ausbeute von 24% ~715.000-fach gereinigt. Das gereinigte Enzym katalysierte die Spaltung von 472 μmol/hr/mg [³H]-GlcNAc-1-phosphomannose-α-methyl, was einer spezifischen Aktivität von 472.000 Einheiten/mg entsprach.
Die gereinigte Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde einer SDS-PAGE unterworfen und Protein wurde durch Silberfärbung nachgewiesen (Slum, H., Beier H., et al. (1987). "Improved silver staining of plant Proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels." Electrophoresis: 93–99). Eine diffuse Bande mit einer Molekülmasse von ungefährt 70 kDa wurde beobachtet, deren Intensität mit der gemessenen Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität variiert. Die diffuse Erscheinung der Bande legt nahe, dass das Protein stark glycosyliert sein kann. Eine schwache Bande mit einer Molekülmasse von ~150.000, die nicht mit der Aktivität korreliert, lag auch vor.
Ein Modell für die Untereinheitenstruktur der Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde durch Gelfiltrationschromatographie und SDS-PAGE mit und ohne Reduktion der Disulfidbindungen bestimmt. Die Masse durch Gelfiltration beträgt etwa 300.000. Eine SDS-PAGE ohne Reduktion der Disulfidbindungen ist ~140.000. Nach einer Reduktion der Disulfidbindungen beträgt die scheinbare Masse 70.000. Zusammen zeigen diese Daten, dass Phosphodiester-α-GlcNAcase ein Tetramer aus Disulfid-verknüpften Homodimeren ist. 2 zeigt ein Modell der Untereinheitenstruktur der Phosphodiester-α-GlcNAcase.
Die aminoterminale Aminosäuresequenz von affinitätsgereinigter, homogener Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind wurde unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt (Matsudaira, P., Hrsg. (1993). A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. San Diego, Academic Press, Inc.). Das reine Enzym wurde auch einem Trypsin-Verdau und einer HPLC unterworfen, um zwei interne tryptische Peptide zu erzeugen, die sequenziert wurden. Die Aminosäuresequenzen dieser drei Peptide sind:

Peptid 1 – Aminoterminal DXTRVHAGRLEHESWPPAAQTAGAHRPSVRTFV (SEQ ID NO: 23);
Peptid 2 – Tryptisch RDGTLVTGYLSEEEVLDTEN (SEQ ID NO: 24) und
Peptid 3 – Tryptisch GINLWEMAEFLLK (SEQ ID NO: 25).

Die Protein-, Nucleotid- und EST-Datenbanken wurden nach Sequenzen durchsucht, welche zu diesen Peptidsequenzen passten, und einige ESTs von Mensch und Maus wurden gefunden, welche die Sequenz des dritten Peptids an ihren Aminotermini hatten. Drei menschliche EST-Klone aus Säuglingsgehirn und ein Klon von einem Mausembryo wurden von der ATCC erhalten und sequenziert. Die drei menschlichen Klone waren alle identisch, außer der Gesamtlänge an ihren 3' Enden, und nahezu identisch zu dem Mausklon, außer dass das Maus-EST eine Region von 102 bp enthielt, die in allen drei menschlichen Gehirn-ESTs fehlte. Ein EcoRI–HindIII Fragment von etwa 700 bp wurde aus dem menschlichen cDNA-Klon (ATCC # 367524) ausgeschnitten und verwendet, um eine menschliche Leber-cDNA-Bank zu sondieren, die in den Vektor TriplEx (Clontech) direktional kloniert war. Von den aus der Bank isolierten und in Plasmide (pTriplEx) umgewandelten positiven Klonen wurde der größte (2200 bp) durch den Klon 6.5 repräsentiert, der für den Rest der Analyse verwendet wurde.
Der cDNA-Klon ist auf beiden Strängen vollständig sequenziert worden und ist eine neue Sequenz, die ein reifes Protein von etwa 50 kDa vorhersagt, was mit der Größe der deglycosylierten reifen Phosphodiester-α-GlcNAcase aus Rinderleber übereinstimmt.
Es gibt eine nur einmal vorkommende BamHI-Stelle an der Base #512 und eine nur einmal vorkommende HindID-Stelle an der Base #1581. Alle drei Rinder-Peptidsequenzen (Peptide 1, 2 und 3) wurden gefunden. Obwohl die Sequenzen der Peptide 2 und 3 bei Menschen zu 100% mit den Rindersequenzen identisch sind, ist das aminoterminale Peptid bei Menschen nur zu 67% mit der Rindersequenz identisch. Der menschliche Leberklon enthält das 102 Basenpaare große Insert, das die Kennzeichen eines alternativ gespleissten Segments hat, das in dem menschlichen Gehirn-EST fehlte. Der Hydrophilizitäts-Plot zeigt die Anwesenheit einer hydrophoben, membranumspannenden Region von Aminosäure 448 bis 474 an und einer anderen hydrophoben Region von Aminosäure 8 bis 24, die zu dem Motiv für eine Signalsequenz passt, und es gibt eine wahrscheinliche Signalsequenz-Spaltungsstelle zwischen G24 und G25. Es gibt sechs potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen Asn-X-Ser/Thr, von denen eine innerhalb des 102 bp großen Inserts liegt. Alle diese Stellen liegen aminoterminal von der mutmaßlichen Transmembranregion. Diese Merkmale zeigen an, dass die Phosphodiester-α-GlcNAcase ein membranumspannendes Glycoprotein des Typs I ist, wobei sich der Aminoterminus im Lumen des Golgi und der Carboxylterminus im Cytosol befindet. Diese Orientierung ist anders als die anderer Glycosyltransferasen und Glycosidasen, die an der Glycoprotein-Verarbeitung beteiligt sind, von denen bis heute gezeigt wurde, dass sie membranumspannende Proteine des Typs II sind.
Die Aminosäuresequenz für das Monomer der Phosphodiester-α-GlcNAcase wird in den Aminosäuren 50–515 der SEQ ID NO: 6 gezeigt. Das Signalpeptid wird in den Aminosäuren 1–24 der SEQ ID NO: 6 gezeigt, und das Pro-Segment wird in den Aminosäuren 25–49 der SEQ ID NO: 6 gezeigt. Die menschliche cDNA wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Techniken kloniert. Die Nucleotidsequenz für das Monomer, das assoziiert, um das Tetramer der Phosphodiester-α-GlcNAcase zu bilden, wird in den Nucleotiden 151–1548 der SEQ ID NO: 7 gezeigt. Die Nucleotidsequenz für die Signalsequenz wird in den Nucleotiden 1–72 von SEQ ID NO: 7 gezeigt. Die Nucleotidsequenz für das Propeptid wird in den Nucleotiden 73–150 von SEQ ID NO: 7 gezeigt.
Die Maus-cDNA für Phosphodiester-α-GlcNAcase wird in SEQ ID NO: 18 gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für die Phosphodiester-α-GlcNAcase der Maus wird in SEQ ID NO: 19 gezeigt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Enzyme von Mensch und Maus demonstriert, dass die Proteine mit einer Identität von etwa 80% hoch homolog sind. Dies ist besonders in der Region des aktiven Zentrums der Fall, wo die Identität 90% übersteigt. Das Mausgen für Phosphodiester-α-GlcNAcase wird in SEQ ID NO: 14 gezeigt.
Das menschliche Gen für Phosphodiester-α-GlcNAcase ist durch eine Durchsu chung von Datenbanken identifiziert worden. Die Sequenz wurde während der Sequenzierung des Klons 165E7 von Chromosom 16.13.3, GenBankAC007011.1, gi4371266, bestimmt. Interessanterweise wurde die Phosphodiester-α-GlcNAcase durch das SCAN-Programm, das zur Annotation der Sequenz verwendet wird, nicht identifiziert.
Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes kann eine DNA-Sequenz von der in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 gezeigten abweichen und immer noch ein GlcNAc-Phosphotransferase- und ein Phosphodiester-α-GlcNAcase-Enzym mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 6 gezeigten Aminosäuresequenz kodieren. Derartige variante DNA-Sequenzen können sich aus stillen Mutationen ergeben, die z. B. während einer PCR-Amplifikation vorkommen, oder können das Produkt der absichtlichen Mutagenese einer nativen Sequenz sein. Die Erfindung stellt deshalb äquivalente isolierte DNA-Sequenzen bereit, die biologisch aktive GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase kodieren, ausgewählt aus: (a) der kodierenden Region eines nativen Gens für GlcNAc-Phosphotransferase und eines nativen Gens für Phosphodiester-α-GlcNAcase aus einem Säuger; (b) cDNA, umfassend die in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 vorgelegte Nucleotidsequenz; (c) DNA, die unter mäßig stringenten Bedingungen zur Hybridisierung mit dem nativen Gen für GlcNAc-Phosphotransferase und dem nativen Gen für Phos phodiester-α-GlcNAcase aus einem Säuger fähig ist und die eine biologisch aktive GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert; und (d) DNA, die als Ergebnis des genetischen Codes zu einer DNA degeneriert ist, die in (a), (b) oder (c) definiert ist und die eine biologisch aktive GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert. Die durch derartige äquivalente DNA-Sequenzen kodierten GlcNAc-Phosphotransferase- und Phosphodiester-α-GlcNAcase-Proteine werden durch die Erfindung umfasst.
Diejenigen Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren und biologisch funktionelle GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase kodieren, sind vorzugsweise mindestens 50–100% homolog, was 55, 60, 65, 70, 75, 75, 80, 85, 90, 95, 99% und alle Werte und Unterbereiche dazwischen einschließt. Homologie kann mit der Software UWCG wie vorstehend beschrieben bestimmt werden. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und sollen diejenigen Bedingungen einschließen, die eine Hybridisierung an diejenigen Sequenzen mit einer spezifischen Homologie zur Zielsequenz ermöglichen. Ein Beispiel für derartige stringente Bedingungen ist eine Hybridisierung bei 65°C in einem Standard-Hybridisierungspuffer und anschließendes Waschen in 0,2 × konzentriertem SSC und 0,1% SDS bei 42–65°C, vorzugsweise 60°C. Diese und andere Hybridisierungsbedingungen werden in Sambrook, J., Fritsch E. F., et al. (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, offenbart. Alternativ dazu kann die Temperatur für Hybridisierungsbedingungen abhängig vom GC-Gehalt und der Länge der Nucleotidsequenz, der Salzkonzentration im Hybridisierungspuffer variieren, und somit können die Hybridisierungsbedingungen durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel berechnet werden.
Rekombinante Expression für GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase
Isolierte und gereinigte rekombinante GlcNAc-Phosphotransferase- und Phosphodiester-α-GlcNAcase-Enzyme werden erfindungsgemäß durch Eingliedern der dem erwünschten Protein entsprechenden DNA in Expressionsvektoren und Exprimieren der DNA in einer geeigneten Wirtszelle, um das erwünschte Protein herzustellen, bereitgestellt.
Expressionsvektoren
Rekombinante Expressionsvektoren, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, welche die Enzyme kodiert, können unter Verwendung wohlbekannter Techniken herge stellt werden. Die Expressionsvektoren schließen eine DNA-Sequenz ein, die mit einer geeigneten transkriptionellen oder translationalen regulatorischen Nucleotidsequenz, wie zum Beispiel solche, die aus Säuger-, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen abgeleitet sind, funktionell verbunden ist. Beispiele für regulatorische Sequenzen schließen transkriptionelle Promotoren, Operatoren, Enhancer, ribosomale mRNA-Bindungsstellen und entsprechende Sequenzen ein, welche die Initiation und Termination von Transkription und Translation steuern. Nucleotidsequenzen sind "funktionell verbunden", wenn die regulatorische Sequenz mit der DNA-Sequenz für das entsprechende Enzym funktionell in Beziehung steht. Somit ist eine Promotor-Nucleotidsequenz funktionell mit einer DNA-Sequenz für GlcNAc-Phosphotransferase oder Phosphodiester-α-GlcNAcase verbunden, wenn die Promotor-Nucleotidsequenz die Transkription der entsprechenden DNA-Sequenz steuert.
Die Fähigkeit, in erwünschten Wirtszellen zu replizieren, die normalerweise durch einen Replikationsursprung verliehen wird, und ein Selektionsgen, durch das Transformanten identifiziert werden, können zusätzlich in den Expressionsvektor eingegliedert werden.
Zusätzlich können Sequenzen, die entsprechende Signalpeptide kodieren, die nicht natürlich mit GlcNAc-Phosphotransferase oder Phosphodiester-α-GlcNAcase assoziiert sind, in Expressionsvektoren eingegliedert werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) im Leserahmen mit der Enzymsequenz fusioniert sein, so dass das Enzym anfänglich als Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid umfasst. Ein Signalpeptid, das im beabsichtigten Wirt funktionell ist, erhöht die extrazelluläre Sekretion des entsprechenden Polypeptids. Das Signalpeptid kann nach der Sekretion von Enzym aus der Zelle von dem Polypeptid abgespalten werden.
Wirtszellen
Zur Expression von GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase geeignete Wirtszellen schließen Prokaryoten, Hefe, Archaea und andere eukaryotische Zellen ein. Entsprechende Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit zellulären Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugerwirten sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, z. B. Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985). Bei dem Vektor kann es sich um einen Plasmidvektor, einen einzel- oder doppelsträngigen Phagenvektor oder einen einzel- oder doppelsträngigen viralen RNA- oder DNA-Vektor handeln. Derartige Vektoren können als Polynucleotide, vorzugsweise DNA, durch wohlbekannte Techniken zum Einführen von DNA und RNA in Zellen in Zellen eingeführt werden. Im Falle von Phagen- und viralen Vektoren können die Vektoren auch und werden vorzugsweise durch wohlbekannte Techniken zur Infektion und Transduktion als verpackter oder verkapselter Virus in Zellen eingeführt. Virale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefektiv sein. Im letzeren Fall wird eine virale Vermehrung nur in komplementierenden Wirtszellen stattfinden. Zellfreie Translationssysteme könnten auch eingesetzt werden, um die Enzyme unter Verwendung von aus den vorliegenden DNA-Konstrukten abgeleiteten RNAs zu produzieren.
Als Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung nützliche Prokaryoten schließen gram-negative oder gram-positive Organismen wie zum Beispiel E. coli oder Bacilli ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle kann ein Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest einschließen, um eine Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten GlcNAc-Phosphotransferase- oder Phosphodiester-α-GlcNAcase-Polypeptid abgespalten werden. Promotorsequenzen, die allgemein für rekombinante prokaryotische Wirtszellexpressionsvektoren verwendet werden, schließen β-Lactamase und das Lactose-Promotorsystem ein.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen umfassen allgemein ein oder mehrere phänotypische selektierbare Markergene. Ein phänotypisches selektierbares Markergen ist zum Beispiel ein Gen, das ein Protein kodiert, das Antibiotikaresistenz verleiht oder einen autotrophen Bedarf erfüllt. Beispiele für nützliche Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen schließen diejenigen ein, die von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie zum Beispiel dem Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017) abgeleitet sind. pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit einfache Mittel zum Identifizieren transformierter Zellen bereit. Um einen Expressionsvektor unter Verwendung von pBR322 zu konstruieren, werden ein entsprechender Promotor und eine DNA-Sequenz in den Vektor pBR322 eingefügt.
Andere im Handel erhältliche Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA) ein.
Promotorsequenzen, die häufig für rekombinante prokaryotische Wirtszellexpressionsvektoren verwendet werden, schließen β-Lactamase (Penicillinase), das Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, (1978) und Goeddel et al., Nature 281: 544, (1979)), das Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, (1980)) und den tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412 (1982)) ein.
Als Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung nützliche Hefen schließen diejeni gen vom Genus Saccharomyces, Pichia, K. Actinomycetes und Kluyveromyces ein. Hefevektoren werden oft einen Replikationsursprung aus einem 2μ Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen zur Polyadenylierung, Sequenzen zur Transkriptionstermination und ein selektierbares Markergen enthalten. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, (1980)) oder andere glycolytische Enzyme (Holland et al., Biochem. 17: 4900, (1978)), wie zum Beispiel Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase, ein. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden weiter in Fleer et al., Gene, 107: 285–195 (1991) beschrieben. Andere geeignete Promotoren und Vektoren für Hefe und Transformationsprotokolle für Hefe sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Transformationsprotokolle für Hefe sind Fachleuten bekannt. Ein derartiges Protokoll wird von Hinnen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75: 1929 (1978), beschrieben. Das Hinnen-Protokoll selektiert auf Trp.sup.+-Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoffbasis, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Auf dem Fachgebiet wohlbekannte Säuger- oder Insektenwirtszellkultursysteme könnten auch eingesetzt werden, um rekombinante GlcNAc-Phosphotransferase- oder Phosphodiester-α-GlcNAcase-Polypeptide zu exprimieren, z. B. können Baculovirus-Systeme zur Produktion heterologer Proteine in Insektenzellen (Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988)) oder Quarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) zur Expression in einem Säuger verwendet werden. Transkriptionelle und translationale Kontrollsequenzen für Säuger-Wirtszellexpressionsvektoren können aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Enhancersequenzen werden aus Polyomavirus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und menschlichem Cytomegalovirus abgeleitet. Aus dem viralen SV40-Genom abgeleitete DNA-Sequenzen können verwendet werden, um andere genetische Elemente zur Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugerwirtszelle bereitzustellen, z. B. den SV40-Ursprung, frühen und späten Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen von SV40. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht als ein Fragment aus einem viralen Genom erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann. Beispielhafte Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugerwirtszellen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können, wenn es von Vorteil ist, als Fusionsprotein exprimiert werden, in dem das Enzym an einem Fusionssegment befestigt ist. Das Fusionssegment hilft oft bei der Proteinreinigung, z. B. indem es gestattet, das Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie zu isolieren und zu reinigen. Fusionsproteine können durch Züchten einer rekombinanten Zelle hergestellt werden, die mit einer Fusions-Nucleinsäuresequenz transformiert ist, welche ein Protein kodiert, welches das Fusionssegment, das entweder am carboxylterminalen und/oder aminoterminalen Ende des Enzyms befestigt ist, einschließt. Bevorzugte Fusionssegmente schließen Glutathion-S-transferase, β-Galaktosidase, ein Polyhistidinsegment, das fähig ist, an zweiwertige Metallionen zu binden, und das Maltose-bindende Protein ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich kann das HPC-4-Epitop-Reinigungssystem eingesetzt werden, um eine Reinigung der erfindungsgemäßen Enzyme zu erleichtern. Das HPC-4-System wird im US-Patent Nr. 5,202,253 beschrieben, dessen relevante Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Expression durch Genaktivierungstechnologie
Zusätzlich zu Expressionsstrategien, welche die Transfektion einer klonierten cDNA-Sequenz einbeziehen, können die endogenen GlcNAc-Phosphotransferase- und Phosphodiester-α-GlcNAcase-Gene durch Verändern des Promotors exprimiert werden.
Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Enzyme können auch gemäß den Proteinproduktionsverfahren, wie sie im US-Patent Nr. 5,968,502 , dessen relevante Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben werden, unter Verwendung der hierin beschriebenen Sequenzen für GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase erreicht werden.
Expression und Gewinnung
Gemäß der vorliegenden Erfindung können isolierte und gereinigte GlcNAc-Phosphotransferase- oder Phosphodiester-α-GlcNAcase-Enzyme durch die vorstehend beschriebenen rekombinanten Expressionssysteme hergestellt werden. Das Verfahren umfasst das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine das Enzym kodierende DNA-Sequenz umfasst, unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Expression des Enzyms zu fördern. Das Enzym wird dann je nach dem eingesetzten Expressionssystem aus Kulturmedium oder Zellextrakten gewonnen. Wie dem Fachmann bekannt ist, werden Verfahren zum Reinigen eines rekombinanten Proteins gemäß solcher Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszelle und ob das rekombinante Protein in das Kulturmedium sezerniert wird oder nicht, variieren. Wenn Expressionssysteme eingesetzt werden, die das rekombinante Protein sezernieren, kann das Kulturmedium zunächst konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie zum Beispiel ein Gelfiltrationsmedium, aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz eingesetzt werden, z. B. eine Matrix oder ein Substrat, das anhängende Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen hat. Bei den Matrizen kann es sich um Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere häufig bei einer Proteinreinigung eingesetzte Arten handeln. Auch kann ein Kationenaustauschschritt eingesetzt werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizen ein, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen umfassen. Ferner können ein oder mehrere Schritte mit Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Einsatz von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z. B. ein Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) eingesetzt werden, um das Enzym weiter zu reinigen. Manche oder alle vorangegangenen Reinigungsschritte sind in verschiedenen Kombinationen auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können eingesetzt werden, um ein isoliertes und gereinigtes rekombinantes Protein bereitzustellen.
In Bakterienkulturen produziertes rekombinantes Protein wird normalerweise durch anfängliches Aufbrechen der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zell-Pellets, wenn es sich um ein unlösliches Polypeptid handelt, oder aus der Überstandsflüssigkeit, wenn es sich um ein lösliches Polypeptid handelt, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalz-, Ionenaustausch-, Affinitätsreinigungs- oder Größenausschlusschromatographie-Schritten, isoliert. Schließlich kann RP-HPLC für Endreinigungsschritte eingesetzt werden. Mikrobielle Zellen können mit jedem herkömmlichem Verfahren, einschließlich Zyklen von Einfrieren-Auftauen, Sonifizierung, mechanischem Aufbrechen oder Verwendung von zelllysierenden Mitteln, aufgebrochen werden.
Herstellung hoch phosphorylierter lysosomaler Enzyme
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolasen und Verfahren zur Herstellung derartiger Hydrolasen bereit. Die hoch phosphorylierten lysosomalen Hydrolasen können bei klinischen Anwendungen zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten verwendet werden.
Das Verfahren umfasst das Erhalten von lysosomalen Hydrolasen, die Asparagin-verknüpfte Oligosaccharide mit mannosereichen Strukturen aufweisen, und das Modifizieren der α-1,2-verknüpften oder anderen äußeren Mannosen durch Hinzufügen von M6P in vitro, um eine Hydrolase herzustellen, die zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten verwendet werden kann, weil sie an M6P-Rezeptoren der Zellmembran bindet und leicht in die Zelle und in das Lysosom aufgenommen wird. Normalerweise bestehen die mannosereichen Strukturen aus sechs bis neun Mannosemolekülen und zwei N-Acetlyglucosamin(GlcNAc)-Molekülen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die mannosereiche Struktur eine kennzeichnende MAN7(D₂D₃)-Isomerstruktur, die aus sieben Mannosemolekülen und zwei N-Acetylglucosamin(GlcNAc)-Molekülen besteht.
Hoch phosphorylierte lysosomale Hydrolasen werden durch Behandeln der mannosereichen Hydrolasen mit GlcNAc-Phosphotransferase hergestellt, welche die Übertragung von N-Acetylglucosamin-1-phosphat aus UDP-GlcNAc auf die Position 6' von α-1,2-verküpften oder anderen äußeren Mannosen auf der Hydrolase katalysiert. Diese durch GlcNAc-Phosphotransferase modifizierte Hydrolase wird dann mit Phosphodiester-α-GlcNAcase behandelt, welche die Entfernung von N-Acetylglucosamin katalysiert, um terminales M6P auf der Hydrolase zu erzeugen.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann die mit GlcNAc-Phosphotransferase behandelte Hydrolase ohne anschließende Behandlung isoliert und aufbewahrt werden. Anschließend kann die mit GlcNAc-Phosphotransferase behandelte Hydrolase durch Behandeln der Hydrolase mit einer Phosphodiester-α-GlcNAcase weiter modifiziert werden.
Überraschenderweise ist gefunden worden, dass die durch dieses Verfahren erzeugten, M6P enthaltenden Hydrolasen hoch phosphoryliert sind, wenn man sie mit natürlich vorkommenden oder bekannten rekombinanten Hydrolasen vergleicht. Die hoch phosphorylierten lysosomalen Hydrolasen der vorliegenden Erfindung enthalten von etwa 6% bis etwa 100% bisphosphorylierte Oligosaccharide im Vergleich zu weniger als etwa 6% bisphosphorylierten Oligosacchariden auf bekannten natürlich vorkommenden oder rekombinanten Hydrolasen.
Diese hoch phosphorylierten Hydrolasen haben eine höhere Affinität für den M6P-Rezeptor und werden deshalb durch Plasmamembranrezeptoren effizienter in die Zelle aufgenommen (Reuser, A. J., Kroos, M. A., Ponne, N. J., Wolterman, R. A., Loonen, M. C., Busch, H. F., Visser, W. J. und Bolhuis, P. A. (1984). "Uptake and stability of human and bovine acid alpha-glucosidase in cultured fibroblasts and skeletal muscle cells from glycogenosis type II patients." Experimental Cell Research 155: 178–189).
Bei dem Hochaffinitätsliganden für den Kationen-unabhängigen M6P-Rezeptor handelt es sich um ein Oligosaccharid, das zwei M6P-Gruppen enthält (d. h. ein bis-phosphoryliertes Oligosaccharid). Da ein bisphosphoryliertes Oligosaccharid mit einer 3.500-mal höheren Affinität bindet als ein monophosphoryliertes Oligosaccharid, ergibt sich nahezu die ganze Hochaffinitätsbindung eines lysosomalen Enzyms an den M6P-Rezeptor aus dem Gehalt an bisphosphorylierten Oligosacchariden (Tong, P. Y., Gregory, W. und Kornfeld, S. (1989)). "Ligand interactions of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor. The stoichiometry of mannose-6-phosphate binding." Journal of Biological Chemistry 264: 7962–7969). Es ist deshalb angemessen, den Gehalt an bisphosphorylierten Oligosacchariden zu verwenden, um das Bindungspotenzial unterschiedlicher Herstellungen lysosomaler Enzyme zu vergleichen.
Das Ausmaß der Mannose-6-phosphat-Modifikation von zwei unterschiedlichen lysosomalen Enzymen ist veröffentlicht worden. Die Oligosaccharid-Zusammensetzung menschlicher, aus Ovarzellen des Chinesischen Hamsters sezernierter α-Galaktosidase A ist veröffentlicht worden (Matsuura, F., Ohta, M., Ioannou, Y. A. und Desnick, R. I. (1998)." Human alpha-galactosidase A: characterization of the N-linked oligosaccharides an the intracellular and secreted glycoforms overexpressed by Chinese hamster ovary cells." Glycobiology 8 (4): 329–39). Von allen Oligosacchariden auf α-Gal A, die durch Hydrazinolyse freigesetzt wurden, waren nur 5,2% bisphosphoryliert. Zhao et al. charakterisierten die Oligosaccharidstrukturen auf rekombinanter, aus Ovarzellen des Chinesischen Hamsters sezernierter menschlicher α-Iduronidase partiell (Zhao, K. W., Faull, K. F., Kakkis, E. D. und Neufeld, E. F. (1997). "Carbohydrate structures of recombinant human alpha-L-iduronidase secreted by Chinese hamster ovary cells." J. Biol Chem 272 (36): 22758–65) und demonstrierten, dass eine Minderheit der Oligosaccharide bisphosphoryliert waren. Die benutzten qualitativen Techniken schlossen die Bestimmung des Anteils der phosphorylierten Oligosaccharide aus.
Über die Produktion und Sezernierung von menschlicher saurer α-Glucosidase durch CHO-Zellen ist berichtet worden (Van Hove, J. L., Yang, H. W., Wu, J. Y., Brady, R. O. und Chen, Y. T. (1996). "High level production of recombinant human lysosomal acid alopha-glucosidase in Chinese hamster ovary cells which targets to heart muscle and corrects glycogen accumulation in fibroblasts from patients with Pompe disease." Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 93 (1): 6570). Die Kohlenhydratstruktur dieser Herstellung wurde in dieser Veröffentlichung nicht charakterisiert. Diese Herstellung wurde jedoch erhalten und analysiert. Die in den nachstehenden Beispielen angegebenen Ergebnisse zeigten, dass weniger als 1% der Oligosaccharide M6P enthielten und bisphosphorylierte Oligosaccharide nicht nachweisbar waren. Zusammenge nommen zeigen diese Daten, dass bekannte Herstellungen rekombinanter lysosomaler Enzyme nicht mehr als 5,2% phosphorylierte Oligosaccharide enthalten. Es scheint, dass die Herstellung höher phosphorylierter lysosomaler Enzyme mit bekannten Techniken wahrscheinlich nicht erreicht werden kann. Natürlich vorkommende menschliche saure α-Glucosidase, die aus menschlicher Plazenta gereinigt wurde, enhält sehr niedrige M6P-Spiegel (Mutsaers, I. H. G. M., Van Halbeek, H., Vliegenthart, J. F. G., Tager, J. M., Reuser, A. J. J., Kroos, M. und Galjaard, H. (1987). "Determination of the structure of the carbohydrate chains of acid α-glucosidase from human placenta." Biochimica et Biophysica Acta 911: 244–251). Die Anordnung der Phosphate als entweder bis- oder monophosphorylierte Oligosaccharide ist nicht bestimmt worden, aber weniger als 1% der Oligosaccharide enthält M6P.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen hoch phosphorylierten Hydrolasen sind bei Enzymersatz-Therapieverfahren nützlich, weil sie leichter in die Zelle und das Lysosom aufgenommen werden (Reuser, A. J., Kroos, M. A., Ponne, N. J., Wolterman, R. A., Loonen, M. C., Busch, H. F., Visser, W. J. und Bolhuis, P. A. (1984). "Uptake and stability of human and bovine acid alpha-glucosidase in cultured fibroblasts and skeletal muscle cells from glycogenosis type II patients." Experimental Cell Research 155: 178–189).
Jedes lysosomale Enzym, welches das M6P-Transportsystem verwendet, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden. Beispiele schließen α-Glucosidase (Pombe-Krankheit), α-L-Iduronidase (Hurler-Syndrom), α-Galaktosidase (Morbus Fabry), Arylsulfatase (Maroteaux-Lamy-Syndrom), N-Acetylgalaktosamin-6-sulfatase oder β-Galaktosidase (Morquio-Syndrom), Iduronat-2-sulfatase (Hunter-Krankheit), Ceramidase (Farber-Krankheit), Galaktocerebrosidase (Krabbe-Syndrom), β-Glucuronidase (Sly-Syndrom), Heparan-N-sulfatase (Sanfilippo A), N-Acetyl-α-glucosaminidase (Sanfilippo B), Acetyl CoA-α-Glucosaminid-N-Acetyltransferase, N-Acetylglucosamin-6 sulfatase (Sanfilippo D), Galaktose-6-sulfatase (Morquio A), Arylsulfatase A, B und C (Multipler Sulfatasemangel), Arylsulfatase-A-Cerebrosid (Metachromatische Leukodystrophie), Gangliosid (Mucolipidose IV), saure β-Galactosidase-G_M1-Gangliosid (G_M1-Gangliosidose), saure β-Galactosidase (Galactosialidose), Hexosaminidase A (Tay-Sachs und Varianten), Hexosaminidase B (Sandhoff), α-Fucosidase (Fucosidose), α-N-Acetylgalaktosaminidase (Morbus Schindler), Glycoprotein-Neuraminidase (Sialidose), Aspartylglucosaminamidase (Aspartylglucosaminurie), saure Lipase (Morbus Wolman), saure Ceramidase (Farber-Lipogranulomatose), lysosomale Sphingomyelinase und eine andere Sphingomyelinase (Nieman-Pick) ein.
Verfahren zum Behandeln einer bestimmten lysosomalen Hydrolase mit den erfindungsgemäßen Enzymen gehören zu den Fähigkeiten eines Fachmanns. Allgemein werden die lysosomale Hydrolase bei einer Konzentration von etwa 10 mg/ml und GlcNAc-Phosphotransferase bei einer Konzentration von etwa 100.000 Einheiten/ml bei etwa 37°C 2 Stunden lang in Anwesenheit eines Puffers, der den pH-Wert bei etwa 6–7 aufrechterhält, und aller Stabilisatoren oder Coenzyme, die erforderlich sind, um die Reaktion zu erleichtern, inkubiert. Dann wird Phosphodiester-α-GlcNAcase bis zu einer Konzentration von etwa 1000 Einheiten/ml zu dem System gegeben und man lässt das System 2 weitere Stunden lang inkubieren. Das modifizierte lysosomale Enzym mit hoch phosphorylierten Oligosacchariden wird dann mit herkömmlichen Mitteln gewonnen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die lysosomale Hydrolase bei 10 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 6,7, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCl₂, 2 mM UDP-GlcNAc mit GlcNAc-Phosphotransferase bei 100.000 Einheiten/ml 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Dann wird Phosphodiester-α-GlcNAcase, 1000 Einheiten/ml, zugegeben und die Inkubation wird weitere 2 Stunden lang fortgesetzt. Das modifizierte Enzym wird dann erneut durch Chromatographie auf Q-Sepharose und Elution in einem Schritt mit NaCl gereinigt.
Verfahren zum Erhalten mannosereicher lysosomaler Hydrolasen
Mannosereiche lysosomale Hydrolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, können aus jeder günstigen Quelle, z. B. durch Isolieren und Reinigen natürlich vorkommender Enzyme oder durch rekombinante Techniken zur Herstellung von Proteinen erhalten werden. Mannosereiche lysosomale Hydrolasen können durch Exprimieren der eine bestimmte Hydrolase kodierenden DNA in jedem Wirtszellsystem, das ein Oligosaccharid-modifiziertes Protein mit mannosereichen Strukturen erzeugt, z. B. Hefezellen, Insektenzellen, andere eukaryotische Zellen, transformierte Wirtszellen aus dem Ovar des Chinesischen Hamsters (CHO) oder andere Säugerzellen, hergestellt werden.
In einer Ausführungsform werden mannosereiche lysosomale Hydrolasen unter Verwendung mutanter Hefen hergestellt, die fähig sind, Peptide mit mannosereichen Strukturen zu exprimieren. Diese Hefen schließen die Mutante S. cerevisiae Δ ochl, Δ mnnl ein (Nakanishi-Shindo, Y., Nakayama, K. I., Tanaka, A., Toda, Y. und Jigami, Y. (1993). "Structure of the N-linked oligosaccharides that show the complete loss of α-1,6-polymannose outer chain from ochl, ochl mnnl und ochl mnnl alg3 mutants of Saccharomyces cerevisiae." Journal of Biological Chemistry 268: 26338–26345).
Vorzugsweise werden mannosereiche lysosomale Hydrolasen unter Verwendung überexprimierender, transformierter Insekten-, CHO- oder anderer Säugerzellen herge stellt, die in Anwesenheit bestimmter Inhibitoren gezüchtet werden. Normalerweise sezernieren Zellen, die lysosomale Hydrolasen exprimieren, saure α-Glucosidase, die vorwiegend sialylierte Glycane des Komplextyps mit zwei Antennen enthält, die nicht als Substrat für GlcNAc-Phosphotransferase dienen und deshalb nicht modifiziert werden können, um den M6P-Rezeptor zu verwenden.
Ein neues Verfahren zum Manipulieren transformierter Zellen, die DNA enthalten, die eine rekombinante Hydrolase exprimiert, ist entdeckt worden, so dass die Zellen mannosereiche Hydrolasen sezernieren, die gemäß dem vorstehenden Verfahren modifiziert werden können. Bei diesem Verfahren werden transformierte Zellen in Anwesenheit von Inhibitoren der α-1,2-Mannosidase gezüchtet und die mannosereichen rekombinanten Hydrolasen werden aus dem Kulturmedium gewonnen. Das Inhibieren von α-1,2-Mannosidase hindert das Enzym daran, Mannosen abzuschneiden und zwingt die Zellen, Glycoproteine mit der mannosereichen Struktur zu sezernieren. Mannosereiche Hydrolasen werden unter Verwendung bekannter Techniken aus dem Kulturmedium gewonnen und mit GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren behandelt, um Hydrolasen herzustellen, die M6P aufweisen und deshalb an M6P-Membranrezeptoren binden und in die Zelle aufgenommen werden können. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zellen um CHO-Zellen und die Hydrolasen werden mit der MAN7(D₂D₃)-Struktur sezerniert. 3 zeigt das Reaktionsschema für dieses Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird rekombinante menschliche saure alpha-Glucosidase ("rh-GAA") durch Züchten von CHO-Zellen, die rh-GAA sezernieren, in Iscoves Medium, das durch die Zugabe eines Inhibitors der α-1,2-Mannosidase modifiziert ist, hergestellt. Die Immunpräzipitation von rh-GAA aus dem Medium, gefolgt von einem Verdau mit entweder N-Glycanase oder Endoglycosidase H demonstriert, dass in Anwesenheit des Inhibitors der α-1,2-Mannosidase die rh-GAA anstelle der komplexen Strukturen, die man auf einer in Abwesenheit des Inhibitors sezernierten Herstellung findet, mannosereiche Strukturen beibehält. Die mannosereiche Strukturen tragende sezernierte rh-GAA wird dann zur Homogenität gereinigt, vorzugsweise durch Chromatographie, beginnend mit Ionenaustauschchromatographie auf ConA-Sepharose, Phenyl-Sepharose und Affinitätschromatographie auf Sephadex G-100. Die gereinigte rh-GAA wird dann in vitro mit GlcNAc-Phosphotransferase behandelt, um spezifische Mannosen in GlcNAc-Phosphomannosediester umzuwandeln. Die GlcNAc-Phosphomannosediester werden dann durch Behandlung mit Phosphodiester-α-GlcNAcase in M6P-Gruppen umgewandelt. Experimente zeigen, dass 74% der rh-GAA-Oligosaccharide phosphoryliert waren, wobei 62% bisphosphoryliert und 12% monophosphoryliert waren. Da jedes rh-GAA-Molekül 7 N-verknüpfte Oligosaccharide enthält, ist es wahrscheinlich, dass 100% der rh-GAA-Moleküle die Mannosephosphat-Modifikation enthalten.
Jeder Inhibitor der α-1,2-Mannosidase kann in der vorliegenden Erfindung funktionieren. Vorzugsweise wird der Inhibitor aus der Gruppe bestehend aus Desoxymannojirimycin (dMM), Kifunensin, D-Mannonolactamamidrazon und N-Butyldesoxymannojirimycin ausgewählt. Am meisten wird bevorzugt, dass es sich bei dem Inhibitor um Desoxymannojirimycin handelt.
Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten
Ein Verfahren zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten besteht aus dem Verabreichen einer krankheitsbehandelnden Menge der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen hoch phosphorylierten lysosomalen Hydrolasen an einen Patienten, der an der entsprechenden lysosomalen Speicherkrankheit leidet. Während die Dosierungen abhängig von der Krankheit und dem Patienten variieren können, wird das Enzym allgemein in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 1000 Milligramm pro 50 kg Patient pro Monat an den Patienten verabreicht, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 500 Milligramm pro 50 kg Patient pro Monat. Die hoch phosphorylierten erfindungsgemäßen Enzyme werden effizienter in die Zelle und das Lysosom aufgenommen als die natürlich vorkommenden oder weniger phosphorylierten Enzyme und sind deshalb zur Behandlung der Krankheit wirksam. Innerhalb jeder Krankheit kann der Schweregrad und das Alter, in dem sich die Krankheit zeigt, eine Funktion der Menge an restlichem lysosomalen Enzym sein, die im Patienten existiert. Als solches schließt das vorliegende Verfahren zum Behandeln lysosomaler Speicherkrankheiten das Bereitstellen hoch phosphorylierter lysosomaler Hydrolasen in jedem Stadium und in allen Stadien des Krankheitsfortschreitens ein.
Das lysosomale Enzym wird durch jede beliebige günstige Weise verabreicht. Das Enzym kann zum Beispiel in Form eines Arzneimittels, welches das Enzym und einen beliebigen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, oder mittels eines Abgabesystems, wie zum Beispiel eines Liposoms oder eines Retard-Arzneimittels, verabreicht werden. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bezeichnet Moleküle und Zusammensetzungen, die physiologisch toleriert werden können und normalerweise keine allergische oder ähnliche unerwünschte Reaktion, wie zum Beispiel eine Magenverstimmung oder Schwindel, produzieren, wenn sie verabreicht werden. Vorzugsweise bedeutet "pharmazeutisch verträglich" durch eine Regulierungsbehörde der Bundes- oder Staatsregierung oder in der US-Pharmakopöe oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopöe zu Verwendung in Tieren, vorzugsweise Menschen, zugelassen. Der Begriff "Träger" bezeichnet ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans, einen Exzipienten oder ein Vehikel, mit dem die Verbindung verabreicht wird. Bei derartigen pharmazeutischen Trägern kann es sich um sterile Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Kochsalzlösungen, Dextroselösungen, Glycerinlösungen, Wasser-und-Öl Emulsionen, wie zum Beispiel diejenigen, die mit Ölen aus Erdöl-, tierischem, pflanzlichem- oder synthetischem Ursprung (Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl oder Sesamöl) hergestellt werden, handeln. Wasser, Kochsalzlösungen, Dextroselösungen und Glycerinlösungen werden vorzugsweise als Träger eingesetzt, besonders für injizierbare Lösungen.
Das Enzym oder die Zusammensetzung kann mit jeder Standardtechnik verabreicht werden, die mit Enzymen oder ihren Zusammensetzungen kompatibel ist. Zum Beispiel kann das Enzym oder die Zusammensetzung parenteral, transdermal oder transmucosal, z. B. oral oder nasal, verabreicht werden. Vorzugsweise wird das Enzym oder die Zusammensetzung durch intravenöse Injektion verabreicht.
Die folgenden Beispiele stellen eine Veranschaulichung von Ausführungsformen der Erfindung bereit und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang der Erfindung, die in den angefügten Ansprüchen dargelegt wird, beschränken. In den folgenden Beispiel sind alle beschriebenen Verfahren, sofern nicht anders angegeben, herkömmlich.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Euter taktierender Rinder wurden von Mikkelson Beef, Inc. (Oklahoma City, OK) erhalten. Ultrasphere ODS-Säulen wurden von Beckman Instruments erhalten. Microsorb MV NH₂-Säulen wurden von Rainin Instrument Co., Inc. (Woburn, MA) erhalten. [γ³²P]ATP (7000 Ci/mmol; zur Endmarkierung), Na¹²⁵I und Lubrol (C₁₆H₃₃(CH₂CH₂O)₂₃H) wurden von ICN (Costa Mesa, CA) erhalten. Superose 6 (Präparationsgrad), DEAE-Sepharose FF, QAE-Sephadex A-25, Molekülmassenstandards für SDS-PAGE, HiTrap-Protein G Säulen und Mono Q Säulen wurden von Pharmacia Biotech Inc. erhalten. 3M-Emphaze Biosupport-Medium AB 1, das Iodinierungsreagenz IODO GEN und das Proteinassayreagenz BCA wurden von Pierce erhalten. Glycerin, Saccharose, α-Methylmannosid, α-Methylglucosid, reaktive Green 19-Agarose, Natriumdesoxycholat, Benzamidin, UDP-GlcNAc, Phenylmethylsulfonylfluorid, Tris, Kaninchen anti-Maus IgG und Isotypisierungsreagenzien für monoklonale Mausantikörper wurden von Sigma erhalten.
POROS 50 HQ wurde von PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA) erhalten. ProBlott Polyvinylidendifluoridmembranen wurden von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) erhalten. Ein Rotationsschüttler Modell QT12 wurde von LORTONE, Inc. (Seattle, WA) erhalten. Eine Standardpalette für Maus-Immunglobuline wurde von Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL) erhalten. Rekombinantes Interleukin-6, Schweine-Uteroferrin und der monoklonale Antikörper BP95 waren Geschenke von Kollegen. Andere Chemikalien hatten den Reinheitsgrad "reagent grade" oder besser und stammten von Standard-Anbietern.
Beispiel 1
Herstellung von für GlcNAc-Phosphotransferase spezifischen monoklonalen Antikörpern
GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind wurde wie beschrieben 30.000-fach partiell gereinigt (Bao, M., Booth J. L., et al. (1996). "Bovine UDP-N-acetylglucosamine: lysosomal enzyme N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase. I. Purification and subunit structure." Journal of Biological Chemistry 271: 31437–31445) und verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Milzen immuner Mäuse wurden entnommen und die Splenozyten gemäß Harlow (Harlow, E. und Lane, D. (1988). Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory) mit SP2/0 Myelomzellen fusioniert. Die Fusion wurde in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und in HAT-Medium gezüchtet, bis Hybridome sichtbar waren.
Hybridome, die zum Einfangen von GlcNAc-Phosphotransferase aus einer rohen Probe fähige monoklonale Antikörper sezernierten, wurden durch Inkubation von Hybridommedium (200 μl) mit 200 Einheiten partiell gereinigter GlcNAc-Phosphotransferase und Einfangen des sich ergebenden Immunkomplexes auf Kaninchen anti-Maus IgG, das an Protein A gebunden war, das an eine Ultralink^TM-Matrix gekoppelt war, identifiziert. Immunkomplexe, die gegen GlcNAc-Phosphotransferase gerichtete monoklonale Antikörper enthielten, wurden dann durch einen Assay des Immunkomplexes auf GlcNAc-Phosphotransferase-Aktivität identifiziert. Mit dieser Strategie wurden vier gegen GlcNAc-Phosphotransferase gerichtete monoklonale Antikörper in der fünften durchgemusterten Fusion identifiziert. Die identifizierten Hybridome wurden zweimal unter Verwendung des gleichen Assays subkloniert und in BALBc-Mäusen wurde gemäß Standardtechniken (Harlow, E. und Lane, D. (1988). Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory) ein Ascites produziert. Der PT18 benannte Antikörper wurde zur Verwendung in weiteren Experimenten ausgewählt.
Beispiel 2
Reinigung von GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind
Eine Milchdrüse (6 kg) aus einem taktierenden Rind wurde beim Schlachten gewonnen und sofort in 10 cm dicke Scheiben geschnitten und auf Eis gekühlt. Nach einer Homogenisierung in einem im Handel erhältlichen Waring-Mixer wurde die postnukleare Überstandsfraktion durch Zentrifugation hergestellt. Membranfragmente wurden durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation (39.000 × g, 45 Minuten) gewonnen und Membranproteine wurden in 4% Lubrol, 0,5 % Desoxycholat solubilisiert. GlcNAc-Phosphotransferase wurde aus der solubilisierten Membranfraktion durch Inkubation mit 10 ml monoklonalem Antikörper PT18, gekoppelt an eine Ultralink^TM-Matrix (Substitution 5 mg/ml) über Nacht spezifisch adsorbiert. Die Matrix wurde dann durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gewonnen, mit 1 M NaCl enthaltendem Puffer mit 0,025 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,005 M MgCl₂, 0,3 % Lubrol gewaschen. Die Säule wurde dann mit 2 Säulenvolumina Puffer mit 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,005 M MgCl₂, 0,3 % Lubrol gewaschen. GlcNAc-Phosphotransferase wurde dann mit 0,10 M Tris-HCl, pH 10,0, 0,005 M MgCl₂, 0,3 % Lubrol von der Säule eluiert und mit 1/10 Volumen 1 M Tris-HCl, pH 6.0 neutralisiert. Die Ausbeute ist normalerweise 20–50% der GlcNAc-Phosphotransferase-Aktivität, die im homogenisierten Gewebe vorlag, und ungefähr 0,5 mg Enzym werden pro 10 kg verarbeitetem Gewebe gewonnen.
Beispiel 3
Aminosäuresequenzierung von GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind
Beispiel 3A
Reduktion, Alkylierung und Trennung einzelner Untereinheiten
1,9 mg GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind wurde auf einer in 9% Ameisensäure äquilibrierten Säule mit Sephadex G-25 Superfein entsalzt und lyophilisiert. Das lyophilisierte Protein wurde in 1 ml 500 mM Tris-HCl, pH 8.6, 6 M Guanidinium-HCl, 10 mM EDTA, 2 mM DTT gelöst, durch Sprudeln von N₂-Gas durch die Lösung entgast und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde auf 5 mM Iodessigsäure gebracht und weitere 2 ½ Stunden lang im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wurde dann auf 15 mM β-Mercaptoethanol gebracht und auf einer in 9% Ameisensäure äquilibrierten Säule mit Sephadex G-25 Superfein chromatographiert. Der Durchlauf wurde vereinigt und lyophilisiert. Die einzelnen Untereinheiten wurden durch Chromatographie auf einer mit 9% Ameisensäure äquilibrierten 1,0 × 30 cm großen Säule mit Superose 12 getrennt.
Beispiel 3B
Aminoterminale Sequenzierung einzelner Untereinheiten
0,5 mg GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind wurde mit Natriumdodecylsulfat äqulibriert, auf einem 6%igen Polyacrylamidgel in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat elektrophoretisch aufgetrennt. Die getrennten Untereinheiten wurden dann elektrisch auf eine PVDF-Membran übertragen und die Proteinbanden durch Färben mit Coomassie-Blau nachgewiesen. Die den einzelnen Untereinheiten entsprechenden Banden wurden dann mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und einer aminoterminalen Sequenzierung in einem Applied Biosystems Modell 492 Proteinsequenzierer unterworfen. Die aminoterminale Sequenz der α-Untereinheit war Met Leu Leu Lys Leu Leu Gln Arg Gln Arg Gln Thr Tyr (SEQ ID NO: 26). Die aminoterminale Sequenz der β-Untereinheit ist Asp Thr Phe Ala Asp Ser Leu Arg Tyr Val Asn Lys Ile Leu Asn Ser Lys Phe Gly Phe Thr Ser Arg Lys Val Pro Ala His (SEQ ID NO: 27). Die aminoterminale Sequenz der γ-Untereinheit ist Ala Lys Met Lys Val Val Glu Glu Pro Asn Thr Phe Gly Leu Asn Asn Pro Phe Leu Pro Gln (SEQ ID NO: 28).
Beispiel 3C
Interne Aminosäuresequenz der β- und γ-Untereinheiten
Die getrennten β- und γ-Untereinheiten aus Beispiel 3B wurden über Nacht bei 37°C in 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, in einem Massenverhältnis von 1/40 mit Trypsin behandelt. Die tryptischen Fragmente wurden dann durch Reverse-Phase-Chromatographie auf einer mit 0,1% Trifluoressigsäure äquilibrierten C18-Säule getrennt und mit einem linearen Gradienten in Acetonitril entwickelt. Gut getrennte Peaks wurden dann einer wie in Beispiel 3B beschriebenen aminoterminalen Sequenzierung unterworfen. Die von der β-Untereinheit sequenzierten Peptide hatten die Sequenzen Ile Leu Asn Ser Lys (SEQ ID NO: 29), Thr Ser Phe His Lys (SEQ ID NO: 30), Phe Gly Phe The Ser Arg (SEQ ID NO: 31) und Ser Leu Val Thr Asn Cys Lys Pro Val Thr Asp Lys (SEQ ID NO: 32). Das von der γ-Untereinheit sequenzierte Peptid hatte die Sequenz Leu Ala His Val Ser Glu Pro Ser Thr Cys Val Tyr (SEQ ID NO: 33). Eine zweite Peptidsequenz von der γ-Untereinheit mit der Sequenz Asn Asn Pro Phe Leu Pro Gln Thr Ser Arg Leu Gln Pro (SEQ ID NO: 34) wurde durch Chymotrypsin-Verdau erhalten.
Beispiel 3D
Interne Aminosäuresequenz der α-Untereinheit
Interne Peptidsequenzen der α-Untereinheit wurden folgendermaßen erhalten. GlcNAc-Phosphotransferase aus dem Rind wurde wie vorher beschrieben reduziert, alkyliert, elektrophoretisch aufgetrennt und auf PVDF übertragen. Die Bande für die α-Untereinheit wurde ausgeschnitten und tryptische Peptide durch in-situ-Verdau mit Trypsin erzeugt, mit Acetonitril/Trifluoressigsäure eluiert und durch Reverse-Phase-HPLC fraktioniert. Einzelne Peaks wurden dann durch Matrix-assoziierte Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektroskopie (MALDI-MS) untersucht und Peaks, die eine einzige Masse enthielten, wurden einer aminoterminalen Sequenzierung wie vorstehend unterworfen. Die von der α-Untereinheit bestimmten Peptidsequenzen sind Val Pro Met Leu Val Leu Asp Xaa Ala Xaa Pro Thr Xaa Val Xaa Leu Lys (SEQ ID NO: 35) und Glu Leu Pro Ser Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Asp Val Phe Asn Val Ala Lys Pro Lys (SEQ ID NO: 36).
Beispiel 4
Klonierung der cDNA für die α/β-Untereinheit von menschlicher GlcNAc-
Phosphotransferase
Die aminoterminale Proteinsequenz, die von der isolierten β-Untereinheit aus dem Rind bestimmt worden war, wurde verwendet, um die Datenbank der Expressed Sequence Tags (EST) unter Verwendung des Programms tblastn zu durchsuchen. Altschul, S. F., Gish, W., et al. (1990). "Basic Local Alignment Search Tool." Journal of Molecular Biology 215: 403–410. Diese Suche identifizierte eine partielle Maus-cDNA, die vorher während einer positionellen Klonierungsstrategie identifiziert worden war. Cordes, S. P. und Barsh, G. S. (1994). "The mouse segmentation gene kr encodes a novel basic domain-leucine zipper transcription factor." Cell 79: 1025–11034.
Ein vorwärts gerichteter PCR-Primer wurde beruhend auf der Maus-Sequenz entworfen und unter Verwendung von polyA-RNA aus Mäuseleber als Matrize mit einem reversen oligo-dT-Primer zur RT-PCR-Amplifikation eines 1.848 bp großen Produkts verwendet. Das PCR-Produkt wurde kloniert und sequenziert und es stellte sich heraus, dass es die gesamten bestimmten Sequenzen der β-Untereinheit enthielt, was demonstrierte, dass es die β-Untereinheit der Maus kodierte.
Die cDNA für die menschliche β-Untereinheit wurde durch Durchmustern einer von der ATCC erhaltenen größenselektierten cDNA-Bank aus menschlicher Plazenta (Fischman, K., Edman J. C., et al. (1990). "A murine fer testis-specific transcript (ferT encodes a truncated fer Protein)." Molecular and Cellular Biology 10: 146–153) mit der zufällig Hexamer-markierten cDNA für die β-Untereinheit der Maus unter Bedingungen von reduzierter Stringenz (55°C, 2 × SSC) kloniert. Der verbleibende Teil der Vorläufer- cDNA für die α/β-Untereinheit wurde durch eine Kombination aus einer Walking-Strategie, beginnend mit dem Teil der cDNA, der die menschliche β-Untereinheit kodiert, und Standardstrategien für das Durchmustern von Banken kloniert. Zusätzlich wurden EST-Datenbanksuchen verwendet, um Klone zu identifizieren, die Teile der cDNA für menschliches α/β enthielten, die von den entsprechenden Hinterlegungsstellen erhalten und sequenziert wurden. Zusammen ermöglichten diese Strategien die Bestimmung der cDNA-Sequenz voller Länge für den Vorläufer der menschlichen α/β-Untereinheiten. Ein diese Sequenz enthaltender Klon wurde unter Verwendung der entsprechenden Fragmente zusammengesetzt und in pUC19 kloniert. Die 5597 bp große Sequenz wird in Sequenz NO: 4 angegeben und enthält DNA-Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie Proteinsequenzen kodieren, die zu allen aminoterminalen und internen Peptidsequenzen homolog sind, die von den α- und β-Untereinheiten aus dem Rind bestimmt worden sind.
Beispiel 5
Klonierung der cDNA für die γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase
Die aminoterminalen und tryptischen Peptidsequenzen der γ-Untereinheit wurden verwendet, um die Expressed Sequence Tag (EST) Datenbank unter Verwendung des Programms tblastn zu durchsuchen. Altschul, S. F., Gish, W., et al. (1990). "Basic Local Alignment Search Tool." Journal of Molecular Biology 215: 403–10. Drei menschliche EST-Sequenzen wurden identifiziert, die zu den bestimmten Rinder-Proteinsequenzen hoch homolog waren. Der cDNA-Klon 48250, von dem die EST-Sequenz 280314 bestimmt wurde, wurde von Genome Systems erhalten und unter Verwendung von Standardtechniken sequenziert. Dieser Klon enthielt ein 1191 bp großes Insert, das alle bestimmten Proteinsequenzen enthielt und 5' von der bestimmten aminoterminalen Sequenz eine Signalsequenz zu enthalten schien. Dem Klon fehlte jedoch ein Initiator-Methionin oder jegliche nicht kodierende 5'-Sequenz. Der 5'-Teil der cDNA wurde durch PCR erhalten. Der rerverse Primer 5' GCGAAGATGAAGGTGGTGGAGGACC-3' (SEQ ID NO: 37) und ein Primer für den T7-Promotor wurden in einer Reaktion zusammen mit Matrizen-DNA von einer cDNA-Bank aus menschlichem Gehirn in pCMV-SPORT (GIBCO) verwendet. Ein 654 bp großes Produkt wurde erhalten, in pCR2.1 kloniert und sequenziert. Die Sequenz demonstrierte, dass das amplifizierte Produkt 23 bp nicht kodierende 5'-Sequenz, das Initiator-Methionin und das in EST 280314 identifizierte Signalpeptid enthielt. Eine cDNA voller Länge für die γ-Untereinheit (pBC36) wurde durch Ligieren eines 75 bp großen EcoRI-ApaI-Fragments aus dem klonierten PCR- Produkt, eines ApaI-NotI-Fragments aus dem Klon 48250 und EcoRI-NotI-geschnittenem pcDNA3 (Invitrogen) zusammengefügt.
Beispiel 6
Klonierung des Gens für die α/β-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase
Plasmid-DNA wurde von einer cDNA-Bank aus menschlichem Gehirn (Life Technologies) gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt. Diese DNA wurde als Matrize für eine PCR unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen 5'-TGCAGAGACAGACCTATACCTGCC-3' (SEQ ID NO: 38) und 5' ACTCACCTCTCCGAACTG-GAAAG-3' (SEQ ID NO: 39) unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase und Puffer A von Fischer Scientific unter Verwendung von 35 Zyklen von 94°C 1 Minute, 55°C 1 Minute und 79°C 1 Minute verwendet. Ein 106 bp großes Produkt wurde erhalten, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, durch GeneClean (Bio101) isoliert und in pCR2 kloniert. Eine DNA-Sequenzierung bestimmte, dass das so erhaltene Plasmid pAD39 ein 106 bp großes Insert enthielt, das durch Verdau mit EcoRI ausgeschnitten und bei Genome Systems zum Durchmustern einer menschlichen genomischen BAC-Bank eingereicht wurde. Vier menschliche BACs wurden identifiziert und BAC #14951 wurde sequenziert. Zum Sequenzieren wurde BAC #14951 beim Labor eines Kollegen an der University of Oklahoma eingereicht. Das BAC wurde dann durch Versprühen fragmentiert und Fragmente wurden in pUC18 kloniert und Shotgunsequenziert. Contigs wurden durch Computeranalyse erzeugt und Lücken durch Primer-Walking-Strategien geschlossen. Die Sequenz des BAC umspannt 177.364 bp. Das Vorläufergen für die α/β-Untereinheiten der GlcNAc-Phosphotransferase umspannt ~80 kb und ist in 21 Exons angeordnet.
Beispiel 7
Klonierung des Gens für die γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-
Phosphotransferase
Das Gen für die menschliche γ-Untereinheit wurde durch blastn Durchsuchen der NCBI High Throughput Genomic Sequence (HGTS) Datenbank mit der cDNA-Sequenz voller Länge für die menschliche Untereinheit identifiziert. Die Suche identifizierte einen vom menschlichen Chromosom 16 abgeleiteten Klon HS316G12(gi 4495019), der das Gen für die menschliche γ-Untereinheit enthielt. Das Gen für die γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase umspannt etwa 12 kb und ist in 11 Exons angeordnet. Die Exons 1–3 und 4–11 sind durch ein großes Intron von etwa 9 kb getrennt.
Beispiel 8
Herstellung eines modifizierten Expressionsplasmids für die cDNA des Vorläufers der α/β-Untereinheiten der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase
Ein Expressionsvektor für die cDNA von GlcNAc-Phosphotransferase α/β wurde folgendermaßen in pcDNA3.1(+) konstruiert. Zwei stromaufwärts gelegene ATG's in der nicht kodierenden 5'-Sequenz der cDNA für menschliche GlcNAc-Phosphotransferase wurden entfernt und die Kozak-Sequenzen wurden folgendermaßen modifiziert. Zwei Fragmente aus pAD98, bei dem es sich um die in pcDNA3.1(+) klonierte cDNA für menschliche GlcNAc-Phosphotransferase ct/p handelte, wurden ausgeschnitten. Ein 1068 bp großes XhoI-PstI-Fragment und ein 9746 bp großes NheI-XhoI-Fragment wurden mit Oligonucleotiden mit den Sequenzen 5'-CTAGCCACCATGGGGTTCAAGCTCTTGCA-3' (SEQ ID NO: 40) und 5' AGAGCTTGAACCCCATGGTGG-3' (SEQID NO: 41) ligiert, wobei pAD105 erzeugt wurde. Die polyA-Sequenz in der Nähe des 3'-Endes des cDNA-Klons wurde durch Ligieren eines NheI-BglII-Fragments aus der cDNA mit NheI-BamHI-geschnittenem Vektor pcDNA3.1(+) entfernt, wobei pAD128 erzeugt wurde.
Beispiel 9
Herstellung eines Expressionsplasmids für die cDNA des Vorläufers der α/β-Untereinheiten der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase
Eine DNA-Sequenzierung von pAD128 identifizierte die Deletion eines A in einer Sequenz AAAAA (Positionen 2761–2765, gezeigt in SEQ ID NO: 4), welche die kodierende Sequenz unterbrach. Das Plasmid pAD130 wurde bei einem Versuch, dies zu korrigieren, durch Ligieren eines 5929 bp großen NheI-MfeI-Fragments und eines 2736 bp großen NheI-AgeI-Fragments (beide aus pAD128 mit einem aus pAD124 abgeleiteten 515 bp großen MfeI-AgeI-Fragment) konstruiert. Das Plasmid pAD130 wurde dann gezüchtet und eine anschließende Sequenzierung des Plasmids pAD130 demonstrierte, dass die Sequenz AAAAA wieder zu AAAA revertiert war, was eine Instabilität der Sequenz an diesem Punkt anzeigte.
Um diese Instabilität zu eliminieren wurde das erste AAA (Position 2761–2763, gezeigt in SEQ ID NO: 4), das Lysin kodiert, zu AAG geändert (das auch Lysin kodiert), so dass die instabile Sequenz AAAAA zu einem stabilen AAGAA geändert wurde, ohne die kodierte Aminosäure zu verändern. Das Plasmid pAD130 wurde korrigiert, indem ein 214 bp großes MfeI-DraIII-Fragment entfernt wurde und es durch ein Fragment mit der korrekten Sequenz ersetzt wurde. Das korrekte MfeI-DraIII-Fragment wurde durch PCR unter Verwendung von pAD130 als Matrize mit dem vorwärts gerichteten Primer 5'-GAAGACACAATTGGCATACTTCACTGATAGCAAGAATACTGGGAGGCAACTAAAA GATAC-3' (SEQ ID NO: 42) (oligo TTI 25 mit der erwünschten Sequenz AAGAA wie unterstrichen) und dem rückwärts gerichteten Primer 5'-ACTGCATATCCTCAGAATGG-3' (SEQ ID NO: 43) (oligo TTI 24) hergestellt. Das PCR-Fragment wurde in die EcoRV-Stelle von pBluescript KS II (+) (Stratagene) subkloniert, wobei pMK16 erzeugt wurde. Das Insert wurde zur Bestätigung sequenziert und das 215 bp große MfeI-DraIII-Fragment wurde hergestellt. Um MfeI-DraIII-Stellen auf dem Vektor pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) zu vermeiden, wurde das NheI-XbaI-Fragment aus pAD130 hergestellt und in die XbaI-Stelle von pUC19 (Life Technologies) subkloniert, um pMK15 zu konstruieren. pMK15 wurde mit MfeI und DraIII gespalten und das 6317 bp große Fragment wurde gereinigt und mit dem MfeI-DraIII-Fragment aus pMK16 ligiert, um pMK19 zu bilden, welches die erwünschte stabile Sequenz in pUC19 enthielt.
Die korrigierte cDNA für die α/β-Untereinheit wurde als KpnI-XbaI-Fragment aus pMK19 ausgeschnitten und zwischen die KpnI und XbaI-Stellen von pcDNA6/V5/His-A subkloniert und mit pMK25 bezeichnet. Das Plasmid pMK25 enthält die in SEQ ID NO: 20 gezeigte cDNA, wo die Nucleotidsequenz für die modifizierte cDNA für den Vorläufer der meschlichen α/β-Untereinheit in den Nucleotiden 1–3768 gezeigt wird. Diese Sequenz entspricht der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nucleotidsequenz 165–3932 und ist eine Modifikation davon.
Beispiel 10
Konstruktion von Expressionsvektoren für eine cDNA für den Vorläufer der α/β- Untereinheiten der löslichen, menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase
Das Plasmid pMK19 wurde mit BglII (das an den in SEQ ID NO: 20 gezeigten Positionen 255 und 2703 schneidet) verdaut und mit sich selbst ligiert, um die Länge der zu amplifizierenden cDNA von ungef. 3,5 kb auf 1 kb zu reduzieren, so dass die 5'- und 3'-Enden der cDNA durch PCR modifiziert werden können, um die Transmembrandomänen der α- und β-Untereinheiten der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase zu entfernen, und verwendet, um Expressionsvektoren zum Herstellen löslicher GlcNAc-Phosphotransferase zu konstruieren. Dieses Plasmid wurde mit pMK21 bezeichnet. Die Strategie ist, dass die Nucleotide, welche die ersten 44, die Transmembrandomäne der α-Untereinheit enthaltenden Aminosäuren kodieren (Nucleotide 1–132 von SEQ ID NO: 20) durch eine HindIII-Stelle ersetzt werden, und Nucleotide, welche die letzten 47, die Transmembrandomäne der β-Untereinheit enthaltenden Aminosäuren kodieren (Nucleotide 3628–3768 von SEQ ID NO: 21), durch ein Stopp-Codon und eine XbaI-Stelle ersetzt werden.
Das Plasmid pMK21 wurde als Matrize für eine PCR mit den folgenden Primern verwendet: Einem vorwärts gerichteter Primer (5'-TGGTTCTGAAGCTTAGCCGAGATCA TACCATG-3' (SEQ ID NO: 44), Oligo TTI 76), der eine HindIII-Stelle (unterstrichen) und eine zu den Nucleotiden 133 bis 151 von SEQ ID NO: 20 komplementäre Sequenz (kursiv) enthielt, der das 5'-Ende eines PCR-Fragments produziert, welches die kodierende Sequenz der ersten 44 Aminosäuren, umfassend die mutmaßliche Transmembrandomäne der α-Untereinheit, entfernt. Ein rückwärts gerichteter Primer (5'-TAGTACACTCTAGActactaCTTCAATTTGTCTCGATAAG-3' (SEQ ID NO: 45), Oligo TTI 78), der eine XbaI-Stelle (unterstrichen), zwei Stopp-Codons (Kleinbuchstaben) und eine zu den Nucleotiden 3608 bis 3627 von SEQ ID NO: 21 komplementäre Sequenz (kursiv) enthielt, der das 3'-Ende eines PCR-Fragments herstellt, das die kodierende Sequenz der letzten 47 Aminosäuren, umfassend die mutmaßliche Transmembrandomäne der β-Untereinheit, entfernt und sie durch zwei Stopp-Codons ersetzt. Das so erhaltene PCR-Fragment wurde in die EcoRV-Stelle von pBluescript KS II+ (Stratagene) subkloniert. Dieses als pMK42 bezeichnete Plasmid wurde sequenziert um sicherzustellen, dass keine Fehler durch PCR eingeführt wurden. Das BglII-BglII-Fragment (in SEQ ID NO: 20 gezeigte Positionen 255–2703), das vorher entfernt worden war, wurde zurück in die BglII-Stelle von pMK42 subkloniert. Es wurde bestimmt, dass die Orientierung dieses Framents korrekt war und dieses Plasmid wurde als pMK49 bezeichnet. Somit enthielt das Plasmid pMK49 eine cDNA, umfassend eine 5' gelegene HindIII-Stelle und eine 3' gelegene XbaI-Stelle, die eine kodierende Region für die cDNA des Vorläufers der α/β-Untereinheiten der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase flankierten, wobei die mutmaßliche Transmembrandomäne der α-Untereinheit deletiert und die mutmaßliche Transmembrandomäne der β-Untereinheit durch zwei Stopp-Codons ersetzt war (lösliche α/β-cDNA).
Diese "lösliche α/β-cDNA" kann nun bequem in Vektoren subkloniert werden, die so konstruiert sind, dass sie das HPC4-Epitop (das zur schnellen Reinigung des löslichen Enzyms verwendet wird) und unterschiedliche Sekretions-Signalpeptide enthalten. Diese pcDNA6/V5/His-A+tag)-Vektoren wurden folgendermaßen konstruiert:
Synthetische Oligonucleotidkassetten, die eine 5' gelegene NheI-Stelle und eine 3'-gelegene HindIII-Stelle enthielten, die unterschiedliche Sekretions-Signalpeptide kodierende Nucleotidsequenzen und die das HPC4-Epitop kodierende Nucleotidsequenz flankierten, wurden in das mit NheI und HindIII geschnittene Plasmid pcDNA6/V5/His-A eingefügt. Die folgenden Plasmide wurden mit der angezeigten Kassette hergestellt:
1. pMK45 – Signalpeptid der Immunglobulin-Kappa-Kette der Maus (Sequenz kursiv) und das Epitop HPC4 (Sequenz unterstrichen)
1. pMK44 – eine Transferrin-Signalpeptidsequenz (kursiv) und das Epitop HPC4 (Sequenz unterstrichen)
1. pMK43 – eine Transferrin-Sekretionspeptidsequenz, modifiziert um eine Kozak-Sequenz zu erfüllen (Sequenz kursiv), und das Epitop HPC4 (Sequenz unterstrichen)
Die cDNA, welche die "löslichen α/β-Untereinheiten" kodiert, kann als HindIII-XbaI-Fragment aus pMK49 erhalten und in das Plasmid pMK43 eingefügt werden, um pMK50 zu bilden; pMK44, um pMK51 zu bilden, und in pMK45, um pMK52 zu bilden, Plasmide, die fähig sind, die α/β-Untereinheiten der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase mit deletierten mutmaßlichen Transmembrandomänen zu kodieren, mit unterschiedlichen Signalpeptiden und wobei alle den Epitopanhang HPC4 haben, um eine Reinigung des löslichen, sezernierten Proteins zu erleichtern.
Beispiel 11
Konstruktion von Expressionsvektoren für die cDNA für den Vorläufer der γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase
Die cDNA für den Vorläufer der γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase wurde aus dem Plasmid pAD133 in pAC5.1/V5-His durch Schneiden mit EcoRI erhalten. Diese cDNA wurde in EcoRI-verdautes pcDNA6/V5/His-A eingefügt, um das Plasmid pMK17 zu bilden, das eine wie in SEQ ID NO: 5 gezeigte cDNA enthielt. Das Plasmid pMK17 wurde mit MluI (Position 124–129, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt) und EcoRI (Position 1103–1108, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt) verdaut, und das 980 bp große MluI-EcoRI-Fragment wurde dann mit einer synthetischen, doppelsträngigen Kassette mit einer HindIII-Stelle und einer MluI-Stelle, die eine Nucleotidsequenz flankieren, welche die Positionen einschließt, die 95–123, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt, entsprechen, in pBluescript KSII (+) subkloniert, wodurch die Nucleotidsequenz, die das aminoterminale, 24 Aminosäuren große Signalpeptid in dem Plasmid pMK26 kodiert, entfernt wurde. Das Plasmid pMK26 wurde sequenziert, um seine Sequenz sicherzustellen. Die korrekte cDNA aus pMK26, welche die Aminosäuren für die γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase mit entferntem Signalpeptid kodiert, wird dann durch HindIII- und EcoRI-Verdau aus pMK26 ausgeschnitten und in die Plasmide pMK43 gegeben, um pMK58 zu bilden; pMK44, um pMK59 zu bilden, und in pMK45, um pMK64 zu bilden, Plasmide, mit unterschiedlichen Signalpeptiden und alle mit dem Epitopanhang HPC4, um eine Reinigung der löslichen γ-Untereinheit zu erleichtern, die fähig sind, die γ-Untereinheit der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase mit deletiertem Signalpeptid zu kodieren.
Um das Verhalten von sezernierten α/β/γ-Produkten auszuwerten, wurden der Vorläufer für die α/β-Untereinheit und die γ-Untereinheit in dem bicistronischen Vektor pIRES (Clontech) koexprimiert. Dies wurde durch Subklonieren von cDNAs für α/β und γ, welche die erwünschte Untereinheit exprimieren, mit einem ausgewählten Signalpeptid und dem Anhang HPC4 in die NheI-Stelle (MCS-A) beziehungsweise XbaI-Stelle (MCS-B) von pIRES erreicht.
Beispiel 12
Transiente Expression der α/β- und γ-Untereinheiten der menschlichen GlcNAc-Phosphotransferase in 293T-Zellen
Plasmide wurden unter Verwendung von Fugene6 (Roche) gemäß den Anleitungen des Herstellers in 293T-Zellen transfiziert. Kulturmedium wurde 23 h, 44,5 h und 70 h nach der Transfektion gewonnen. Aliquots von Medien, die exprimiertes Protein enthielten, wurden auf einem an Ultralink-Kugeln (Pierce) konjugierten monoklonalen anti-HPC4-Antikörper ( US-Patent Nr. 5,202,253 ) durch Inkubation über Nacht bei 4°C eingefangen. Die Kugeln wurden gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, und direkt wie früher beschrieben (REF) auf Phosphotransferase-Aktivität analysiert.
Zur Expression verwendete Plasmide, die alle eine den Anhang HPC4 kodierende Sequenz enthielten, waren die Folgenden:

1. pMK50 – modifiziertes Transferrin-Sekretionspeptid und α/β-Untereinheit in pcDNA6/V5/His-4
2. pMK51 – Transferrin-Sekretionspeptid und α/β-Untereinheit in pcDNA6/V5/His-4
3. pMK52 – Sekretionspeptid des Immunglobulins der Maus und α/β-Untereinheit in pcDNA6/V5/His-4
4. pMK75 – modifiziertes Transferrin-Sekretionspeptid und α/β-Untereinheit und modifiziertes Transferrin-Sekretionspeptid und γ-Untereinheit in pIRES
5. pMK81 – Transferrin-Sekretionspeptid und α/β-Untereinheit und Transferrin-Sekretionspeptid und γ-Untereinheit in pIRES
6. pMK76 – Sekretionspeptid des Immunglobulins der Maus und α/β-Untereinheit und Sekretionspeptid des Immunglobulins der Maus und γ in pIRES.

Die relativen Expressionsmengen, die durch einen Assay auf Phosphotransferase unter Verwendung von Methyl-α-D-mannosid und UDP-[β-³²P]-GlcNAc als Substrate mit Zellen, die mit pcDNA6/V5/His-4 transfiziert waren, als Kontrolle nachgewiesen wurden, wird in 4 gezeigt.
Beispiel 13
Expression und Reinigung von GlcNAc-Phosphotransferase α/β/γ
Zur Expression und Reinigung des Enzyms wird ein modifiziertes Expressionsplasmid in einem von pEE14 abgeleiteten modifizierten Expressionsvektor konstruiert. Das Plasmid steuert die Synthese eines löslichen GlcNAc-Phosphotransferase-Moleküls mit anhängendem Epitop. Der Vorläufer für die α/β-Untereinheit wird folgendermaßen modifiziert: Der 5'-Anteil der cDNA, der die cytoplasmatische und Transmembrandomäne kodiert, wird deletiert und durch Nucleotide ersetzt, die das Transferrin-Signalpeptid kodieren, gefolgt von Aminosäuren, welche das Epitop für den monoklonalen Antikörper HPC4 kodieren. Der 3'-Anteil der cDNA wurde durch die Einfügung eines Stopp-Codons vor dem Transmembransegment der β-Untereinheit modifiziert. Der Vektor pEE14.1 (Lonza Biologics) wird durch die Einfügung eines 850 bp großen MluI-NcoI-Fragments modifiziert, das einen modifizierten Promotor des vaskulären Endothelwachstumsfaktors (VEGF) an der nur einmal vorkommenden MluI-Stelle in pEE14.1 enthält. Dieser Vektor, der den Vorläufer für die modifizierte α/β-Untereinheit der GlcNAc-Phosphotransferase kodiert, wird mit einem Wildtypkonstrukt der γ-Untereinheit, das den VEGF-Promotor in pEE14.1 enthält, unter Verwendung von Fugene6 in CHO-K1-Zellen transfiziert und in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Transfektanten werden in 25 μm Methioninsulfoximin selektiert und das Plasmid wird durch Selektion in Platten mit 96 Vertiefungen mit 50 μM, 100 μM, 250 μM und 500 μM Methioninsulfoximin amplifiziert. Klone werden im Duplikat in Platten mit 96 Vertiefungen gepickt und die am höchsten exprimierenden Klone durch Dot-Blotting-Medium und Immunnachweis mit dem monoklonalen Antikörper HPC4 ausgewählt. Der am höchsten exprimierende Klon wird in Wannenstapeln ausgeweitet. Die rekombinante lösliche GlcNAc-Phosphotransferase mit anhängendem Epitop wird durch Chromatographie an dem an Ultralink gekoppelten monoklonalen Antikörper HPC4 in Anwesenheit von 5 mM MgCl₂ und 1 mMCaCl₂ aus dem Medium gereinigt. Die lösliche GlcNAc-Phosphotransferase mit anhängendem Epitop wird mit 5 mM EGTA und 5 mM MgCl₂ eluiert.
Beispiel 14
Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die für Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind spezifisch sind
Monoklonale Mausantikörper, die für Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind spezifisch sind, wurden durch Immunisierung von Mäusen mit einer partiell gereinigten Herstellung von Phosphodiester-α-GlcNAcase erzeugt. Milzen wurden dann aus immunen Mäusen entnommen und gemäß Standardtechniken mit SP2/O-Myelomzellen fusioniert (Harlow, E. und Lane, D. (1988). Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory). Hybridome wurden in acht Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und gezüchtet, bis Hybridome sichtbar waren. Hybridome, die Antikörper gegen Phosphodiester-α-GlcNAcase sezernierten, wurden durch Messen von Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität in Immunpräzipitaten gemessen, die durch Inkubation einer partiell gereinigten Herstellung von Phosphodiester-α-GlcNAcase mit vereinigten Hybridomüberständen hergestellt wurden. Pools aus 16 und 4 Vertiefungen wurden analysiert, gefolgt von einzelnen Vertiefungen. Der monoklonale Antikörper UC1 wurde mit diesem Protokoll identifiziert und zur Verwendung bei der Reinigung von Phosphodiester-α-GlcNAcase an Ultralink^TM gekoppelt.
Beispiel 15
Reinigung von Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind
Kalbsleber aus dem Rind (1 kg) wurde in 0,05 M Imidazol-HCl, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA homogenisiert und ein gewaschener postnukleärer Überstand wurde hergestellt. Membranen wurden durch 30 Minuten lange Zentrifugation bei 30.000 × g gewonnen und dreimal mit dem vorstehenden Puffer gewaschen. Membranproteine wurden dann in Puffer, der 2% Triton X-100, 0,05 % Desoxycholat enthielt, solubilisiert und unlösliches Material wurde wie vorher durch Zentrifugation entfernt. Die solubilisierte Membranfraktion wurde mit 20 ml monoklonalem Antikörper UC1, gekoppelt an Ultralink^TM (Substitution 5 mg/ml), unter konstanter Drehbewegung 16 Stunden lang bei 4°C gekoppelt. Das UC1-Ultralink^TM wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gewonnen, in eine Säule gepackt und mit 0,025 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,3 % Lubrol, gefolgt von 2 Säulenvolumina Puffer mit 0,5 M NaHCO₃, pH 8,0, 0,3 % Lubrol gewaschen. Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde dann mit 0,5 M NaHCO₃, pH 10,0, 0,3 % Lubrol von der Säule eluiert und in 1/10 Volumen 1 M Tris-HCl, pH 5,5 gewonnen.
Beispiel 16
Aminosäuresequenzierung der Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind
Beispiel 16A
Aminoterminale Sequenz der Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind
Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind wurde an eine 0,25 ml große Säule mit POROS HQ gebunden und mit 0,5 M NaCl enthaltendem Puffer in einem Schritt eluiert. Fraktionen, die Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität enthielten, wurden durch einen Phosphodiester-α-GlcNAcase-Assay identifiziert, vereinigt und an eine ProSorb Probenpräparationskartusche (Perkin Elmer) adsorbiert und einer Aminosäuresequenzierung in einem Applied Biosystems Modell 492 Proteinsequenzierer unterworfen, die gemäß den Anleitungen des Herstellers betrieben wurde. Die Sequenz Asp-Xaa-Thr-Arg-Val-His-Ala-Gly-Arg-Leu-Glu-His-Glu-Ser-Trp-Pro-Pro-Ala-Ala-Gln-Thr-Ala-Gly-Ala-His-Arg-Pro-Ser-Val-Arg-Thr-Phe-Val wurde erhalten.
Beispiel 16B
Interne Sequenz der Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Rind
Phosphodiester-α-GlcNAcase aus Rinderleber wurde in einer SpeedVac auf 10 μl konzentriert, mit 30 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 8 M Guanidinium-HCl und 2–4 μl 25 mM DTT kombiniert und 1 Stunde lang bei 50°C inkubiert. 2,4 μl 50 μM Iodacetamid wurden dann zugegeben und die Inkubation wurde 1 Stunde lang fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf einer Säule mit Sephadex G25 Superfein wie für GlcNAc-Phosphotransferase beschrieben entsalzt und mit Trypsin verdaut. Die Peptide wurden durch HPLC fraktioniert und wie für GlcNAc-Phosphotransferase beschrieben sequenziert. Die Sequenzen, die bestimmt wurden, sind Arg Asp Gly Thr Leu Val Thr Gly Tyr Leu Ser Glu Glu Glu Val Leu Asp Thr Glu Asn und Gly Ile Asn Leu Trp Glu Met Ala Glu Phe Leu Leu Lys.
Beispiel 17
Klonierung der cDNA für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase
Die tryptischen Peptidsequenzen der Phosphodiester-α-GlcNAcase wurden verwendet, um die EST-Datenbanken wie für GlcNAc-Phosphotransferase vorstehend beschrieben zu durchsuchen. Drei EST-Sequenzen wurden identifiziert, welche die cDNA für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase enthielten und der Klon ATCC #367524 wurde erhalten und ein ~700 bp großes EcoRI-NotI-Fragment wurde aus diesem Klon ausgeschnitten und verwendet, um eine menschlicher Leber-cDNA-Bank in dem Vektor TriplEx zu sondieren. Einige Klone wurden identifiziert und sequenziert, wobei sich herausstellte, dass einer von ihnen (Klon 6.5) eine cDNA von fast voller Länge für die menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase enthielt. Der in Beispiel 18 beschriebene genomische Klon demonstriert, dass dem Klon 6.5 nur das Initiator-Methionin fehlte.
Beispiel 18
Klonierung des Gens für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase
Das Gen für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde durch Durchsuchen der NCBI-Datenbank nr mit der cDNA für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase unter Verwendung des Programms blastn identifiziert. Die genomische Sequenz wurde während der Sequenzierung eines Klons aus Chromosom 16pl3.3 bestimmt und am 6. März 1999 in GenBank als eine nicht identifizierte Sequenz von 161264 bp mit der Hinterlegungsnummer AC007011 hinterlegt. Das Gen umspannt etwa 12 kb genomischer DNA auf Chromosom 16.13 und ist in 11 Exons angeordnet.
Beispiel 19
Konstruktion eines Expressionsvektors für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase
Ein Expressionsvektor für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase wurde folgendermaßen hergestellt: Das 5'-Ende der Sequenz von Klon 6.5 wurde durch PCR-Amplifikation des Endes der cDNA mit einem vorwärts gerichteten Primer mit der Sequenz 5'-GGAATTCCACCATGGCGACCTCCACGGGTCG-3' (SEQ ID NO: 49) und einem rückwärts gerichteten Primer 5'-TGACCAGGGTCCCGTCGCG-3' (SEQ ID NO: 49) modifiziert. Dies diente zum Hinzufügen einer Kozak-Konsensus-Sequenz und eines Initiator-Methionins zu der Sequenz des Klons 6.5. Das ~500 bp große PCR-Produkt wurde gereinigt, mit EcoRI und BamHI verdaut und in pcDNA3.1(-) ligiert, das sequenziert wurde. Dieses Konstrukt wurde dann mit BamHI und HindIII verdaut und mit einem 1600 bp großen BamHI-HindIII-Fragment ligiert, das den 3'-Anteil der cDNA des Klons 6.5 enthielt, wobei das Expressionsplasmid voller Länge erzeugt wurde.
Beispiel 20
Wirtszellherstellung für menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase
Cos-Zellen wurden in 60 mm großen Platten in Dulbeccos minimalem essentiellem Medium (DMEM) bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet, bis sie 50–80% Konfluenz erreichten. Die Platten wurden dann mit OptiMEM I gewaschen und die Zellen unter Verwendung von Lipofectamine Plus (GIBCO BRL Life Technologies) gemäß den Anleitungen des Herstellers mit dem in Beispiel 19 beschriebenen Expressionsvektor transfiziert.
Nach 48 Stunden wurden die Zellen geerntet, eine solubilisierte Membranfraktion wurde hergestellt und auf Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität hin getestet.
Beispiel 21
Expression und Reinigung löslicher, rekombinanter, menschlicher Phosphodiester-α-GlcNAcase
Zur Expression und Reinigung des Enzyms wird in einem von pEE14.1 abgeleiteten, modifizierten Expressionsvektor ein modifiziertes Expressionsplasmid konstruiert. Das Plasmid steuert die Synthese eines löslichen Phosphodiester-α-GlcNAcase-Moleküls mit anhängendem Epitop. Der Vorläufer für Phosphodiester-α-GlcNAcase wird folgendermaßen modifiziert: Der 3'-Anteil der cDNA, der die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne der Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert, wird deletiert und durch Nucleotide, die das Epitop für den monoklonalen Antikörper HPC4 kodieren, gefolgt von einem Stopp-Codon, ersetzt. Der Vektor pEE14.1 (Lonza Biologics) wird durch Einfügen eines 850 bp großen MluI-NcoI-Fragments modifiziert, das einen modifizierten Promotor des vaskulären Endothelwachstumsfaktors (VGEF) an der nur einmal vorkommenden MluI-Stelle in pEE14.1 enthält. Dieser Vektor, der den Vorläufer der löslichen Phosphodiester-α-GlcNAcase mit anhängendem Epitop kodiert, wird unter Verwendung von Fugene6 in CHO-K1-Zellen transfiziert und in eine Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Transfektanten werden in 25 μM Methioninsulfoximin selektiert, und das Plasmid wird durch Selektion in Platten mit 96 Vertiefungen mit 50 μM, 100 μM, 250 μM und 500 μM Methioninsulfoximin amplifiziert. Klone werden im Duplikat in Platten mit 96 Vertiefungen gepickt und die am höchsten exprimierenden Klone durch Dot-Blotting-Medium und Immunnachweis mit dem monoklonalen Antikörper HPC4 ausgewählt. Medium von Klonen, die den höchsten Expressionsspiegel des Epitopanhangs demonstrierten, wird auf Phosphodiester-α-GlcNAcase-Aktivität hin analysiert. Der am höchsten exprimierende Klon wird in Wannenstapeln ausgeweitet. Die rekombinante lösliche Phosphodiester-α-GlcNAcase mit anhängendem Epitop wird durch Chromatographie auf dem an Ultralink gekoppelten monoklonalen Antikörper HPC4 in Anwesenheit von 5 mM MgCl₂ und 1 mM CaCl₂ aus dem Medium gereinigt. Die lösliche Phosphodiester-α-GlcNAcase mit anhängendem Epitop wird mit 5 mM EGTA und 5 mM MgCl₂ eluiert.
Beispiel 22
Konstruktion eines Expressionsvektors für lösliche, menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase
Zur Expression und Reinigung des Enzyms wird in einem von pEE14.1 abgeleiteten, modifizierten Expressionsvektor ein modifiziertes Expressionsplasmid konstruiert. Das Plasmid steuert die Synthese eines löslichen Phosphodiester-α-GlcNAcase-Moleküls mit anhängendem Epitop. Der Vorläufer für Phosphodiester-α-GlcNAcase wird folgendermaßen modifiziert: Der 3'-Anteil der cDNA (1342–1548 von SEQ ID NO: 7), der die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne der Phosphodiester-α-GlcNAcase kodiert, wurde deletiert und durch die Nucleotidsequenz GAGGACCAGGTGGACCCCAGGCTGATCCAC GGCAAGGAT (SEQ ID NO: 51), die das Epitop für den monoklonalen Antikörper HPC4 (EDQVDPRLIDGKD (SEQ ID NO: 52)) kodiert, gefolgt von einem Stopp-Codon, ersetzt.
Dieser Expressionsvektor wurde durch Erzeugen von zwei Plasmid-Zwischenstufen und Ligieren eines Fragments von jedem in den Vektor pEE14.1 (Lonza Biologics) konstruiert, um den endgültigen Expressionsvektor zu ergeben. Die erste, mit pKB4 bezeichnete Plasmid-Zwischenstufe wurde durch Ligieren des 1034 bp großen FseI-Bsu36l-Fragments von Phosphodiester-α-GlcNAcase (dem die C-terminale Transmembran- und cytoplasmatische Domäne fehlt) aus dem Klon 6.5 und einem Bsu36l-XbaI-Oligonucleotidfragment, welches das Epitop HPC4 enthält, in einen modifizierten Vektor pUC19 konstruiert. Die zweite, mit pKB5 bezeichnete Plasmid-Zwischenstufe wurde durch Ligieren eines 850 bp großen MluI-NcoI-Fragments, das einen modifizierten Promotor des vaskulären Endothelwachstumsfaktors (VGEF) aus pcDNA4/HisMax (Invitrogen) enthielt, eines 256 bp großen BseI-FseI-Fragments, das den N-Terminus der menschlichen Phosphodiester-α-GlcNAcase aus dem Klon 6.5 kodiert, und eines Oligonucleotidlinkers in einen modifizierten Vektor pUC19 konstruiert. Der endgültige, mit pKB6 bezeichnete Expressionsvektor wurde durch Ligieren des MluI-FseI-Fragments aus pKB5 und des FseI-HindIII-Fragments aus pKB4 in einen mit MluI/HindIII verdauten Vektor pEE14.1 konstruiert. Das Plasmid pKB6 enthält die in SEQ ID NO: 22 gezeigte Nucleotidsequenz.
Expression und Reinigung von löslicher, rekombinanter, menschlicher Phosphodiester-α-GlcNAcase
Ungefähr 10⁸ 293T-Zellen wurden unter Verwendung von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum enthielt, in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C mit 5% CO₂ in einem Wannenstapel ausplattiert. Diese Zellen wurden mit ungefähr 700 g pKB6 unter Verwendung von 2 ml des Transfektionsreagenzes Fugene-6 (Roche) zur transienten Expression löslicher, menschlicher Phosphodiester-α-GlcNAcase transfiziert. Nach drei Tage langem Züchten der transfizierten Zellen wurde das Medium, das lösliche, menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase mit anhängendem Epitop enthielt, gewonnen und in Anwesenheit von 1 mM CaCl₂ auf eine Säule mit dem an Ultralink (Pierce) gekoppelten monoklonalen Antikörper HPC4 aufgetragen. Affinitätsgereinigte, menschliche Phosphodiester-α-GlcNAcase mit anhängendem Epitop (ungefähr 11 mg) wurde mit 5 mM EDTA enthaltendem Puffer eluiert und bei –20°C in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 50% Glycerin, pH 7,2 aufbewahrt. Das Enzym hatte eine spezifische Aktivität von 500.000 Einheiten/mg mit [³H]-GlcNAc-Phosphomannose-α-methyl als Substrat (Kornfeld R., et al., JBC 273: 23203–23210).
Beispiel 23
CHO-Zellen, die rekombinante menschliche saure α-Glucosidase exprimieren
Die cDNA für menschliche saure α-Glucosidase wurde von Dr. Frank Martinuk (Martiniuk, F., Mehler, M., Tzall, S., Meredith, G. und Hirschhorn, R. (1990) "Sequence of the cDNA and 5'-flanking region for human acid α-glucosidase, detection of an intron in the 5' untranslated leader sequence, definition of 18-bp polymorphisms, and differences with previous cDNA and amino acid sequences." DNA Cell Biol 9 (2): 85–94) erhalten und in den Expressionsvektor pEE14. 1 kloniert. Dieser Vektor wurde verwendet, um CHO-K1-Zellen unter Verwendung von Fugene6 zu transfizieren und in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Transfektanten wurden in 25 μm Methioninsulfoximin selektiert und Klone gepickt und in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Das Plasmid wurde durch Selektion mit 50 μM, 100 μM, 250 μM und 500 μM Methioninsulfoximin amplifiziert. Klone wurden im Duplikat in Platten mit 96 Vertiefungen gepickt und die am höchsten exprimierenden Klone durch eine Analyse der Medien auf saure α-Glucosidase-Aktivität und der Zellen auf DNA-Gehalt ausgewählt. Der am höchsten exprimierende Klon (Klon 3.49.13), beruhend auf dem Verhältnis der Aktivität der sauren α-Glucosidase zum DNA-Gehalt, wurde dann in einen Wannenstapel ausgeweitet. Dieser Klon wurde bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert und in Glasgow Minimal Essential Medium, das 20 mM TES, pH 7,2, 5% fötales Rinderserum enthielt, aufrechterhalten.
Beispiel 24
Züchten von CHO-Zellen, die rekombinante, menschliche, saure α-Glucosidase exprimieren, in Anwesenheit von Inhibitoren der α-1,2-Mannosidase
CHO-Zellen, die rekombinante, menschliche, saure α-Glucosidase exprimieren, wurden in Glasgow Modified Minimal Essential Medium, das 5% fötales Rinderserum, 25 μm Methioninsulfoximin, 20 mM TES, pH 7,2, und 7,5 mM 1-Desoxymannojirimycin-HCl enthielt, gezüchtet. Alternativ dazu können die Zellen in dem vorstehenden Medium, das 100 μg/ml 1-Desoxymannojirimycin-HCl und 25 μg/ml Kifunensin enthält, gezüchtet werden.
Beispiel 25
Isolierung rekombinanter, menschlicher, saurer α-Glucosidase
Rekombinante, menschliche, saure α-Glucosidase wurde aus verbrauchtem Gewebekulturmedium folgendermaßen gereinigt: Das Medium wurde durch tangentielle Ultrafiltration mit einer Membran mit einem Ausschluss von 30.000 Dalton konzentriert und in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, dialysiert und auf eine Säule mit ConA Sepharose (Pharmacia) aufgetragen. Nach einer Waschung mit dem gleichen Puffer zum Entfernen der nicht gebundenen Proteine wurde die saure α-Glucosidase mit 1,0 M α-Methylglucosid eluiert, vereinigt, konzentriert und wie vorher dialysiert. Die saure α-Glucosidase wurde dann auf eine Säule mit Sephadex G-200, die mit 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, äquilibriert war, aufgetragen und mit dem gleichen Puffer isokratisch eluiert.
Beispiel 26
Behandlung von rekombinanter, menschlicher, saurer α-Glucosidase mit GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase
Menschliche, saure α-Glucosidase bei 10 mg/ml wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 6,7, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCl₂, 2 mM UDP-GlcNAc bei 37°C 2 Stunden lang mit GlcNAc-Phosphotransferase bei 100.000 U/ml inkubiert. Dann wurden 1000 U/ml Phosphodiester-α-GlcNAcase zugegeben und die Inkubation wurde weitere 2 Stunden lang fortgesetzt. Die saure α-Glucosidase wurde dann durch Chromatographie auf Q-Sepharose und Elution in einem Schritt mit NaCl erneut gereinigt.
Beispiel 27
Charakterisierung der Oligosaccharidstrukturen auf modifizierter, rekombinanter, menschlicher, saurer α-Glucosidase

Rekombinante, saure α-Glucosidase, die mit GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase behandelt oder nicht behandelt worden war, wurde mit N-Glycanase (New England Biolabs) oder Endomannosidase H (New England Biolabs) gemäß den Bedingungen des Herstellers verdaut. Die freigesetzten Oligosaccharide wurden dann am reduzierenden Terminus mit 2-Aminobenzamid markiert und gemäß den Anleitungen des Herstellers (Oxford Glycosystems) durch HPLC mit einem Fluoreszenznachweis fraktioniert. Peaks wurden durch Vergleich mit Standards, die auf dem gleichen System chromatographiert wurden, identifiziert und durch Verdau mit ver knüpfungsspezifischen Glycosidasen und/oder einer Massenbestimmung durch MALDI bestätigt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Enzymherstellung	M6	M7	M8	M9	1P-Gn	2P-Gn	1M6P	Komplex
Rh-GAA (sezerniert)	0	0	0	0	0	0	1	99
Rh-GAA (dMM/intrazellulär)	23	31	23	6	0	0	17	0
Rh-GAA (dMM/intrazellulär) Ptase-behandelt	6	11	7	2	12	62	0	0

Wenn man sich auf Tabelle 1 bezieht, zeigen die (in Mol-Prozent angegebenen) Daten, dass die unter Verwendung der erfindungsgemäßen GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase hergestellten lysosomalen Enzyme hoch phosphoryliert sind. Die Daten zeigen, dass die vorliegende Erfindung lysosomale Enzyme herstellt, die etwa 5–10 M6P-Gruppen pro Enzym im Vergleich zu etwa 0–2 für unbehandelte Enzyme und auf dem Fachgebiet bekannte Enzyme aufweisen. Wenn man sie mit natürlich vorkommenden oder rekombinanten lysosomalen Enzymen vergleicht, ist die in vitro modifizierte Herstellung sehr hoch phosphoryliert. In dem am höchsten phosphorylierten, auf dem Fachgebiet bekannten lysosomalen Enzym, der von Matsuura, F., Ohta, M., Ioannou, Y. A. und Desnick. R. J. (1998). "Human alpha-galactosidase A: characterization of the N-linked oligosaccharides an the intracellular and secreted glycoforms overexpressed by Chinese hamster ovary cells." Glycobiology 8 (4): 329–39, beschriebenen α-Galaktosidase A, sind 5,2% der Oligosaccharide bisphosphoryliert. In deutlichem Gegensatz dazu enthalten 62% der Oligosaccharide auf der in vitro phosphorylierten, hier beschriebenen Herstellung saurer α-Glucosidase bisphosphorylierte Oligosaccharide. Dies stellt einen etwa 12-fachen Anstieg dar. Wenn die in Tabelle 1 gezeigte in vitro phosphorylierte Herstellung von rh-GAA mit aus CHO-Zellen sezernierter GAA durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verglichen wird, wird ein noch höherer Anstieg der Phosphorylierung offensichtlich, ein etwa 62-facher Anstieg.
Somit ist die in vitro phosphorylierte GAA 12–62-fach stärker phosphoryliert als jede andere beschriebene Herstellung von natürlichem oder rekombinantem lysosomalem Enzym. Dieser Unterschied hat einen bedeutenden Einfluss auf die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Internalisierung (Reuser, A. J., Kroos, M. A., Ponne, N. J., Wolterman, R. A., Loonen, M. C., Busch, H. F., Visser, W. J. und Bolhuis, P. A. (1984). "Uptake and stability of human and bovine acid alpha-glucosidase in cultured fibroblasts and skeletal muscle cells from glycogenosis type II patients." Experimental Cell Research 155: 178–189).
Beispiel 28
Vergleich der Aufnahme rekombinanter menschlicher saurer α-Glucosidase mit oder ohne Modifikation durch GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase in Zellen
Menschliche Fibroblasten aus der Pombe-Krankheit werden von der ATCC erhalten und in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum in Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet und bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Rekombinante, menschliche, saure α-Glucosidasen mit unterschiedlichen Kohlehydratstrukturen werden in Bezug auf die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Internalisierung verglichen. Kontrollen schließen jede Herstellung, die mit 5 mM Mannose-6-phosphat inkubiert wird, und Inkubationen ohne zugegebene rekombinante, menschliche, saure α-Glucosidase ein. Die unterschiedlichen zu untersuchenden Herstellungen schließen aus CHO-Zellen sezernierte saure α-Glucosidase, aus CHO-Zellen in Anwesenheit von Inhibitoren der α-1,2-Mannosidase sezernierte saure α-Glucosidase, aus CHO-Zellen in Anwesenheit von Inhibitoren der α-1,2-Mannosidase sezernierte saure α-Glucosidase, die mit GlcNAc-Phosphotransferase behandelt wurde, und aus CHO-Zellen in Anwesenheit von Inhibitoren der α-1,2-Mannosidase sezernierte saure α-Glucosidase, die mit GlcNAc-Phosphotransferase und Phosphodiester-α-GlcNAcase behandelt wurde, ein. Gleiche Mengen der vier unterschiedlichen Herstellungen werden zu jeder Vertiefung gegeben und bei 37°C über Zeiträume hinweg inkubiert, die von 5 Minuten bis 4 Stunden variieren. Am Ende jedes Inkubationszeitraums werden die einzelligen Zellschichten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, die 5 mM Mannose-6-phosphat enthält, und die einzellige Schicht wird in 1% Triton X-100 solubilisiert und durch einen enzymatischen Assay auf internalisierte saure α-Glucosidase hin analysiert.
Der Anmelder und der Rechtsinhaber erkennen ihre Verantwortung, diese Kulturen zu ersetzen, sollten sie vor dem Ende der Laufzeit eines hierauf erteilten Patents, vor dem Ablauf von 5 Jahren nach der letzten Anforderung einer Kultur oder vor Ablauf von 30 Jahren sterben, je nachdem, was davon das Spätere ist, und ihre Verantwortung, die Hinterlegungsstelle von der Erteilung eines derartigen Patents zu benachrichtigen, zu welchem Zeitpunkt die Hinterlegung unwiderruflich für die Öffentlichkeit zugänglich gemacht wird, an. Bis zu der Zeit wird die Hinterlegung dem Commissioner of Patents unter den Bedingungen von 37 C.F.R.1.14 und 35 U.S.C. 112 zugänglich gemacht.
Während die bevorzugten Ausführungsformen gezeigt werden, um die Erfindung zu veranschaulichen, können durch Fachleute zahlreiche Änderungen der Materialien und Verfahren vorgenommen werden. Alle derartigen Änderungen sind innerhalb des Sinnes der wie durch die angehängten Ansprüche definierten Erfindung eingeschlossen.
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der am 14. September 1999 eingereichten vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/153,831 und wird hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Modifizieren lysosomaler Hydrolasen, umfassend das In-Kontakt-Bringen der lysosomalen Hydrolasen mit einer isolierten GlcNAc-Phosphotransferase, um eine modifizierte lysosomale Hydrolase herzustellen, wobei die GlcNAc-Phosphotransferase SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Reinigen der modifizierten lysosomalen Hydrolase nach dem In-Kontakt-Bringen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lysosomale Hydrolase ein Asparagin-verknüpftes Oligosaccharid mit einer mannosereichen Struktur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die GlcNAc-Phosphotransferase die Übertragung von N-Acetylglucosamin-1-phosphat von UDP-GlcNAc auf eine Mannose auf der Hydrolase katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den lysosomalen Hydrolasen um rekombinante Hydrolasen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die GlcNAc-Phosphotransferase die Aminosäuren 1–928 von SEQ ID NO: 1, die Aminosäuren 1–328 von SEQ ID NO: 2 und die Aminosäuren 25–305 von SEQ ID NO: 3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die GlcNAc-Phosphotransferase SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lysosomale Hydrolase aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus α-Glucosidase, α-Iduronidase, α-Galaktosidase A, Arylsulfatase, N-Acetylgalaktosamin-6-sulfatase, β-Galaktosidase, Iduronat-2-sulfatase, Ceramidase, Galaktocerebrosidase, β-Glucuronidase, Heparan-N- sulfatase, N-Acetyl-α-glucosaminidase, Acetyl-CoA-α-Glucosaminid-N-Acetyltransferase, N-Acetylglucosamin-6-sulfatase, Galaktose-6-sulfatase, Arylsulfatase A, Arylsulfatase B, Arylsulfatase C, Arylsulfatase-A-Cerebrosid, Gangliosid, saure β-Galaktosidase-G_M1-Gangliosid, saure β-Galaktosidase, Hexosaminidase A, Hexosaminidase B, α-Fucosidase, α-N-Acetylgalaktosaminidase, Glycoprotein-Neuraminidase, Aspartylglucosaminamidase, saure Lipase, saure Ceramidase, lysosomale Sphingomyelinase, Sphingomyelinase und Glucocerebrosidase-β-Glucosidase.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das In-Kontakt-Bringen der modifizierten lysosomalen Hydrolase mit einer isolierten Phosphodiester-α-GlcNAcase.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Phosphodiester-α-GlcNAcase das Entfernen von N-Acetylglucosamin von den modifizierten lysosomalen Hydrolasen katalysiert und ein terminales Mannose-6-phosphat auf der Hydrolase erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Phosphodiester-α-GlcNAcase die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 6 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Phosphodiester-α-GlcNAcase die Aminosäuren 50–515 von SEQ ID NO: 6 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Phosphodiester-α-GlcNAcase die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 14 umfasst.