KR20240001291A - 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형 - Google Patents

재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형 Download PDF

Info

Publication number
KR20240001291A
KR20240001291A KR1020237044402A KR20237044402A KR20240001291A KR 20240001291 A KR20240001291 A KR 20240001291A KR 1020237044402 A KR1020237044402 A KR 1020237044402A KR 20237044402 A KR20237044402 A KR 20237044402A KR 20240001291 A KR20240001291 A KR 20240001291A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
atb200
leu
glucosidase
rhgaa
pro
Prior art date
Application number
KR1020237044402A
Other languages
English (en)
Inventor
힝 차르
세르게이 테슬러
웬디 선덜랜드
엔리크 딜론
러셀 갓샬
헝 두
Original Assignee
아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20240001291A publication Critical patent/KR20240001291A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는 재조합 산 α-글루코시다제; 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 완충액; 및 만니톨, 폴리소르베이트 80 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제를 포함하는 약제학적 제형이 제공되며, 여기서 제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0을 갖는다. 또한, 이들 약제학적 제형을 사용하여 폼페병을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형 {FORMULATIONS COMPRISING RECOMBINANT ACID ALPHA-GLUCOSIDASE}
본 발명의 원리 및 구현예는 일반적으로 재조합 산 α-글루코시다제를 포함하는 제형, 및 특히 액체 제형에 관한 것이다.
산 말타제 결핍 또는 글리코겐 저장 질병 II형으로도 일컬어지는 폼페병(Pompe disease)은 수개의 리소좀 저장 장애 중 하나이다. 리소좀 저장 장애는 리소좀으로 일컬어지는 세포내 구획 내의 세포 글리코스핑골리피드(glycosphingolipid), 글리코겐 또는 뮤코다당류(mucopolysaccharide)의 축적을 특징으로 하는 상염색체 열성 유전병 그룹이다. 이들 질병을 갖는 개체는, 이후, 리소좀 내에 누적되는 이들 기질 중 하나 이상의 가수분해의 촉매에 결함이 있는 효소를 코딩하는 돌연변이 유전자를 보유한다. 리소좀 장애의 다른 예는 고셔병, GM1-강글리오시드축적증, 푸코시드축적증, 뮤코다당증, 후를러-샤이에 질병(Hurler-Scheie disease), 니만-피크(Niemann-Pick) A 및 B 질병 및 파브리병(Fabry disease)을 포함한다. 폼페병은 또한 신경근 질병 또는 대사 근육병으로서 분류된다.
폼페병은 40,000명 중 약 1명꼴로 발생하는 것으로 추정되며, 또한 통상적으로 산 α-글루코시다제로서 일컬어지는 효소 리소좀 α-글루코시다제(EC:3.2.1.20)를 코딩하는 GAA 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 산 α-글루코시다제는 리소좀 내에서 글루코스로의 가수분해를 촉매함으로써, 동물에서 글루코스의 주요 저장형인 분지쇄 다당류인 글리코겐의 대사에 관여한다. 폼페병을 가진 개체는, 불활성이거나, 활성이 감소된 돌연변이체인 결함이 있는 산 α-글루코시다제를 생성하기 때문에, 글리코겐 분해가 서서히 이루어지거나, 전혀 이루어지지 않고, 글리코겐이 다양한 조직, 특히 횡문근의 리소좀 내에 축적되어, 진행성 근육 약화 및 호흡 부전을 포함하는 다양한 종류의 임상 징후를 야기한다. 심근 및 골격근과 같은 조직이 특히 영향을 받는다.
폼페병은 효소 결핍증의 정도, 중증도 및 발병 연령에서 광범위하게 다양할 수 있고, GAA 유전자에서 500개 이상의 상이한 돌연변이가 확인되었으며, 이중 많은 것은 다양한 중증도의 질병 증상을 야기한다. 이 질병은 조기 발병 또는 유년기 및 후기 발병의 다양한 유형으로 분류된다. 질병의 조기 발병 및 더 낮은 효소 활성은 일반적으로 더욱 심각한 임상 경과와 관련된다. 산 α-글루코시다제의 완전하거나, 거의 완전한 결핍으로 인한 유년기 폼페병이 가장 심각하며, 근육 긴장의 심각한 결여, 약화, 비대해진 간 및 심장, 심근병증을 포함하는 증상을 나타낸다. 혀가 비대해지고, 돌출되어, 삼키는 것이 어려워질 수 있다. 대부분의 발병 소아는 2세 이전에 호흡기 또는 심장 합병증으로 사망한다. 후기 발병 폼페병은 12개월을 초과하는 임의의 연령에서 나타날 수 있으며, 심장 관련성이 부재하고, 단기 예후가 더 양호한 것을 특징으로 한다. 증상은 진행성 골격근 기능이상과 관련되며, 몸통, 근위부 하지 및 횡격막의 일반적인 근육 약화 및 호흡근의 소모를 수반한다. 일부 성인 환자는 주요 증상이나 운동 제한이 부재한다. 예후는 일반적으로 호흡근 관련 정도에 따라 달라진다. 폼페병을 갖는 대부분의 대상체는 결국 휠체어 및 보조 환기를 사용할 필요가 있는 신체적 기능저하로 진행되며, 종종, 호흡 부전으로 인한 조기 사망이 발생한다.
폼페병에 대한 최근 치료 선택권으로는 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)를 사용한 효소 대체 요법(ERT)이 포함된다. 기존 rhGAA 제품은 Genzyme사로부터의 상표명 알글루코시다제 알파, 마이오자임(Myozyme)® 또는 루미자임(Lumizyme)®으로 공지되어 있다. ERT는 환자의 평생 동안 요구되는 만성 치료이며, 정맥내 주입에 의한 대체 효소의 투여를 포함한다. 그 후, 대체 효소는 순환계로 수송되고, 세포 내의 리소좀으로 유입되어, 축적된 글리코겐을 분해하는 작용을 하여, 결함이 있는 내산성 돌연변이 효소의 활성 결함을 보충함에 따라, 질병 증상을 경감시킨다.
rhGAA와 같은 대체 효소를 제조하고, 저장하고, 수송하여, 환자에 투여하는 방법에는 난점이 있다. ERT에 사용되는 효소는 일반적으로 비교적 복합적이고, 민감하며, 수반되는 완충액, 부형제 등의 선택이 중요하게 된다. 효소가 적절히 보존되지 않은 경우, 많은 양이 필요할 수 있어, 치료 비용이 많이 들고, 비효율적이 된다.
일부 기존 rhGAA 제품은 보존제가 무함유된 것으로, 단일 사용 바이알 내에 동결건조된(동결하여-건조된) 분말로서 환자에 제공된다. 그 후, rhGAA는 바이알 내에서 재구성한 다음, 희석하여, 정맥내 투여하여야 한다. 동결건조는 제조 후, 효소를 환자에 투여할 준비가 될 때까지, 이를 보존할 수 있도록 하나, 이 공정 자체는 효소를 손상시킬 수 있다. 따라서, rhGAA 제형 내의 성분이 단백질 농도 및 활성을 보존할 수 있도록, 이의 선택에 심혈을 기울여야 한다.
추가로, 재조합 효소는 종종 야생형 효소와 구조적으로 상이하다. 재조합 효소 내의 아미노산이 그의 야생형 비교대상과 동일할 수 있는 경우에도, 탄수화물 화학이 상이할 수 있다. 따라서, 신규의 재조합 효소가 발견됨에 따라, 신규하게 발견된 효소의 화학에 특이적인 효소용 제형이 개발되어야 한다.
따라서, rhGAA와 같은 재조합 효소를 저장하고, 수송하기 위한 것으로, 효소 활성 및 농도를 보존하는 제형에 대한 요구가 계속되고 있다.
본 발명의 일 양태는 약제학적 제형에 관한 것이다. 구현예 1에서, 제형은
(a) 재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는 재조합 산 α-글루코시다제;
(b) 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 완충액; 및
(c) 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제,
를 포함하고,
제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0을 갖는다.
구현예 2는 재조합 산 α-글루코시다제는 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 농도로 존재하는 구현예 1의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 3은 재조합 산 α-글루코시다제는 약 15 mg/mL의 농도로 존재하는 구현예 1 또는 2의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 4는 제형은 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.0을 갖는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 5는 제형은 약 pH 6.0을 갖는 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 6은 적어도 1종의 완충액은 시트르산염을 포함하는 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 7은 적어도 1종의 완충액은 칼륨, 나트륨 또는 암모늄 염을 포함하는 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 8은 적어도 1종의 완충액은 시트르산나트륨을 포함하는 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 9는 적어도 1종의 완충액은 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재하는 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 10은 적어도 1종의 완충액은 약 25 mM의 농도로 존재하는 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 11은 트레할로스, 수크로스, 글리신 또는 이들의 조합은 배제되는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 12는 적어도 1종의 부형제는 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 농도로 존재하는 만니톨인 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 13은 적어도 1종의 부형제는 약 0.2 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80인 구현예 1 내지 12 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 14는 만니톨은 약 20 mg/mL의 농도로 존재하고, 폴리소르베이트 80은 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 구현예 1 내지 13 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 15는 (d) 물을 추가로 포함하는 구현예 1 내지 14 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 16은 (d) 알칼리화제; 및/또는 (e) 산성화제를 추가로 포함하며, 알칼리화제 및 산성화제는 약제학적 제형을 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0으로 유지시키는 양으로 존재하는 구현예 1 내지 15 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 17은 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 적어도 30%는 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 하나 이상의 N-글리칸 단위를 포함하는 구현예 1 내지 16 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 18은 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 0.5 몰 내지 7.0 몰의 N-글리칸 단위를 포함하는 구현예 1 내지 17 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 19는 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 3 몰의 만노스-6-인산염 잔기 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 4 몰의 시알산 잔기를 포함하는 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 20은 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 적어도 50%는 제1 부위에 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 적어도 30%는 제2 부위에 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 적어도 30%는 제4 부위에 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 적어도 20%는 제4 부위에 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하는 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 21은 약제학적 제형은
(a) 재조합 산 α-글루코시다제;
(b1) 시트르산나트륨;
(b2) 시트르산 일수화물;
(c1) 만니톨;
(c2) 폴리소르베이트 80;
(d) 물;
(e) 선택적으로, 산성화제; 및
(f) 선택적으로, 알칼리화제
로 필수적으로 이루어지고,
제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0을 갖는 구현예 1 내지 20 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
구현예 22는 약제학적 제형은
(a) 약 15 mg/mL의 농도로 존재하는 재조합 산 α-글루코시다제;
(b) 약 25 mM의 농도로 존재하는 시트르산나트륨 완충액;
(c1) 약 20 mg/mL의 농도로 존재하는 만니톨;
(c2) 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80; 및
(d) 물;
(e) 선택적으로, 산성화제; 및
(f) 선택적으로, 알칼리화제
로 필수적으로 이루어지고,
제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0을 갖는 구현예 1 내지 21 중 어느 하나의 약제학적 제형에 대한 변형을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 동결건조된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 따라서, 구현예 23은 동결건조 후 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 제형을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 구현예 24는
(a) 재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는 재조합 산 α-글루코시다제;
(b) 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충액; 및
(c) 트레할로스, 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제
를 포함하는 동결건조된 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 폼페병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 구현예 25는 구현예 1 내지 22의 약제학적 제형이 필요한 환자에 이를 투여하는 단계를 포함한다. 구현예 26은 환자에의 투여 전에 약제학적 제형을 희석하는 단계를 추가로 포함하는 구현예 25의 방법에 대한 변형을 포함한다. 구현예 27은 구현예 23 또는 24의 약제학적 조성물을 재구성하는 단계; 및 재구성된 약제학적 조성물이 필요한 환자에 이를 투여하는 단계를 포함하는 폼페병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기의 약제학적 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 구현예 28은 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 약제학적 제형을 제조하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 적어도 1종의 완충액, 적어도 1종의 부형제 및 재조합 산 α-글루코시다제를 물에 첨가하여, 용액을 제공하는 단계; 선택적으로 용액의 pH를 조정하는 단계; 및 선택적으로 추가의 물을 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 구현예 29는 구현예 28의 방법에 대한 변형을 포함한다 용액을 여과하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예 30은 구현예 27 또는 28의 방법에 대한 변형을 포함한다 용액을 저장하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 특징은 하기에 작성된 기재내용 및 첨부 도면으로부터 명징해질 것이다:
도 1a는 비인산화된 고만노스 글리칸, 단일-M6P 글리칸, 및 이중-M6P 글리칸을 도시한다.
도 1b는 M6P 기의 화학적 구조를 도시한다.
도 2a는 M6P를 보유하는 글리칸을 통한 표적 조직(예를 들어, 폼페병이 있는 대상체의 근육 조직)으로의 rhGAA의 생산적 표적화를 기재한다.
도 2b는 비 M6P 글리칸과 비 표적 조직의 결합에 의하거나, 비 표적 조직(예를 들어, 간 및 비장)으로의 비 생산적 약제 배출을 기재한다.
도 3a 및 도 3b는 각각 루미자임® 및 마이오자임®의 CIMPR 친화도 크로마토그래피의 결과를 도시하는 그래프이다. 점선은 M6P 용리 구배를 나타낸다. M6P에 의한 용리는 글리칸을 포함하는 M6P를 통해 결합된 GAA 분자를 CIMPR로 대체시킨다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 루미자임® 내의 GAA 활성의 78%는 M6P의 첨가 전에 용리되었다. 도 2b는 73%의 GAA 마이오자임® 활성이 M6P의 첨가 전에 용리됨을 도시한다. 루미자임® 또는 마이오자임® 중 각각 단지 22% 또는 27%의 rhGAA만이 M6P에 의해 용리되었다. 이들 도면은, 이들 2종의 기존 rhGAA 제품의 대부분의 rhGAA가 표적 근육 조직에서 CIMPR을 표적화하기 위해 필요한 M6P를 갖는 글리칸이 부재함을 도시한다.
도 4는 rhGAA를 인코딩하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질전환을 위한 DNA 작제물을 도시한다. CHO 세포를 rhGAA를 인코딩하는 DNA 작제물에 의해 형질전환하였다.
도 5a 및 도 5b는 각각 마이오자임® 및 ATB200 rhGAA의 CIMPR 친화도 크로마토그래피의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 5b로부터 명백한 바와 같이, ATB200 rhGAA 중 약 70%의 rhGAA가 M6P를 함유하였다.
도 6은 음이온 교환(AEX) 칼럼 상의 포획의 존재 및 부재 하에, ATB200 rhGAA의 CIMPR 친화도 크로마토그래피의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 7은 루미자임® 및 ATB200 rhGAA의 Polywax 용리 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 8은 BP-rhGAA, ATB200-1 및 ATB200-2로서 확인되는 ATB200 rhGAA의 3종의 상이한 조제물과 비교하여, 루미자임®의 N-글리칸 구조의 요약을 도시하는 표이다.
도 9a 내지 도 9h는 ATB200 rhGAA의 부위-특이적 N-글리코실화 분석의 결과를 도시한다.
도 10a는 ATB200 rhGAA(좌측 부분)와 루미자임®(우측 부분)의 CIMPR 결합 친화도를 비교하는 그래프이다.
도 10b는 루미자임® 및 ATB200 rhGAA의 이중-M6P 함량을 비교하는 표이다.
도 11a는 다양한 GAA 농도에서 정상 섬유아세포 내에서의 ATB200 rhGAA 활성(좌측 부분)과 루미자임® rhGAA 활성(우측 부분)을 비교하는 그래프이다.
도 11b는 다양한 GAA 농도에서 폼페병을 갖는 대상체로부터의 섬유아세포 내에서의 ATB200 rhGAA 활성(좌측 부분)과 루미자임® rhGAA 활성(우측 부분)을 비교하는 표이다.
도 11c는 정상 대상체 및 폼페병을 갖는 대상체로부터의 섬유아세포의 K흡수를 비교하는 표이다.
도 12a는 비히클(음성 대조군), 20 mg/ml 알글루코시다제 알파(루미자임®) 또는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200과의 접촉 후, 마우스 심장 근육에서 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여량에 대비한 글리코겐의 양을 보여주는 그래프이다.
도 12b는 비히클(음성 대조군), 20 mg/ml 알글루코시다제 알파(루미자임®) 또는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200과의 접촉 후, 마우스 사두근에서 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여량에 대비한 글리코겐의 양을 보여주는 그래프이다.
도 12c는 비히클(음성 대조군), 20 mg/ml 알글루코시다제 알파(루미자임®) 또는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200과의 접촉 후, 마우스 삼두근에서 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여량에 대비한 글리코겐의 양을 보여주는 그래프이다.
도 13은 ATB200 rhGAA 및 샤프론 미글루스타트의 조합이 GAA 녹아웃 마우스에서 미글루스타트 샤프론의 부재하에 루미자임® 또는 ATB200 rhGAA로의 처리보다 유의하게 더 양호한 글리코겐 배출률을 제공하였음을 보여주는 표이다.
도 14는 리소좀 결합 막 단백질(LAMP-1)의 수준을 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 심근, 횡경막 근육 및 비장근의 일련의 전자현미경 사진이다.
도 15는 과요오드산 - Schiff 시약(PAS)의 염색에 의한 글리코겐 수준을 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 심근 및 비장근의 일련의 전자현미경 사진이다.
도 16은 액포(화살표로 표시됨)가 보이도록 메틸렌 블루로 염색된 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근의 일련의 전자현미경 사진(1000x)이다.
도 17은 자식작용 마커 미소관-결합 단백질 1A/1B-경쇄 3 포스파티딜에탄올아민 접합체(LC3A II) 및 p62, 인슐린-의존적 글루코스 수송인자 GLUT4 및 인슐린-비의존적 글루코스 수송인자 GLUT1의 수준을 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근의 일련의 전자현미경 사진(40x)이다.
도 18a 및 도 18b는 미글루스타트의 존재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스에 대한 와이어 핸드(wire hand) 및 악력 근육 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 19a 내지 도 19g는 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근, 삼두근 및 심장 세포의 글리코겐 수준을 보여주는 그래프이다.
도 20은 디스트로핀 신호를 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 외측광근(VL)의 근섬유의 일련의 현미경 사진(100x 및 200x)이다.
도 21은 폼페병을 갖는 성인에서, 경구용 미글루스타트와 공동 투여된 ATB200의 정맥내 주입의 안전성, 내성, PK, PD, 및 효능을 평가하기 위한 공개-표지 일정-순서 상승-투여량 최초 인체 단계 1/2 연구의 연구 설계를 도시한다.
도 22a 내지 도 22b는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 및 130 mg 미글루스타트 또는 20 mg/kg ATB200 및 260 mg 미글루스타트의 투여 후, 인간 대상체의 혈장 중 GAA 총 단백질의 농도-시간 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 22c는 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 및 130 mg 미글루스타트 또는 20 mg/kg ATB200 및 260 mg 미글루스타트의 투여 후, 인간 대상체의 혈장 중 GAA 총 단백질의 AUC를 도시하는 그래프이다.
도 22d는 20 mg/kg ATB200 및 260 mg 미글루스타트의 투여 후, 2명의 개별 인간 대상체의 혈장 중 GAA 총 단백질의 농도-시간 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 23은 130 mg 또는 260 mg의 미글루스타트의 투여 후, 인간 대상체의 혈장 중 미글루스타트의 농도-시간 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 24a 내지 도 24d는 ATB200(5, 10 및 20 mg/kg)의 상승 투여량을 투여한 다음, ATB200(20 mg/kg) 및 미글루스타트(130 및 260 mg)를 공동 투여한 후에, 인간 환자에서 알라닌 아미노기 전달효소(ALT), 아스파르트산염 아미노기 전달효소(AST), 크레아틴 포스포키나제(creatine phosphokinase)(CPK) 및 6탄당 사당류(Hex4) 수준의 변화를 도시하는 그래프이다.
본 발명의 몇몇 예시적인 구현예를 기재하기 전에, 본 발명은 하기의 기재내용에 제시된 구성 또는 공정 단계의 세부사항에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하고, 다양한 방법으로 실시되거나, 실행될 수 있다. 하기에 열거된 구현예는 하기에 열거된 것뿐만 아니라, 본 발명의 범위에 따른 다른 적절한 조합으로 결합될 수 있음을 이해할 것이다.
놀랍게도, 완충액 및 부형제를 유의하여 선택함으로써, 효소 활성 및 효능을 유지하나, 효소의 침전을 최소화하면서, 월등한 안정성을 나타내고, 제형 제조, 저장, 수송, 재구성 및 투여와 관련된 공정을 거칠 수 있는 재조합 GAA 단백질 ATB200을 위한 제형이 제공될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 rhGAA, 완충액, 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는 제형에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 ATB200을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 액체 제형이다. 제형의 다양한 구성요소에 관한 세부사항 및 다양한 구현예가 하기에 이어진다.
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 문맥 내 및 각 용어가 사용되는 구체적 맥락 내에서 당업계에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물 및 방법 및 이들의 제조 및 사용 방법의 기재시, 실무자에게 추가적인 지침을 제공하기 위해, 하기 또는 본 명세서의 다른 부분에서 논의된다.
본 명세서에서, 명시적인 언어 또는 필요한 의미로 인해, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, "~를 포함하는"이라는 단어 또는 "~를 포함하다" 또는 "~를 포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로 사용되는 것으로서, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하는 것이나, 본 발명의 다양한 구현예에서, 추가의 특징의 존재 또는 첨가를 배제하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 또한, 산 말타제 결핍, 글리코겐 저장 질병 II형(GSDII), 및 글리코겐증 II형으로도 지칭되는 "폼페병"이라는 용어는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 GAA 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는 유전적 리소좀 저장 장애를 지칭하는 것으로 의도된다. 이 용어는 유년기, 청소년기 및 성인 발병형 폼페병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 질병의 초기 및 후기 발병 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "산 α-글루코시다제"는 글리코겐의 D-글루코스 단위, 말토스, 및 이소말토스 사이의 α-1,4 연결을 가수분해하는 리소좀 효소를 지칭하는 것으로 의도된다. 대안적 명칭은 리소좀 α-글루코시다제(EC:3.2.1.20); 글루코아밀라제; 1,4-α-D-글루칸 글루코하이드롤라제; 아밀로글루코시다제; 감마-아밀라제 및 엑소-1,4-α-글루코시다제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 산 α-글루코시다제는 GAA 유전자(미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 유전자 ID 2548)에 의해 인코딩되며, 이는 염색체 17의 긴 아암에 매핑된다(위치 17q25.2-q25.3). 전장 야생형 GAA 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1에 제시되어 있고, 이는 미국 특허 제 8,592,362호에 기재된 바와 같고, GenBank 수탁 번호 AHE24104.1(GI:568760974)을 갖는다.
현재까지 500개 초과의 돌연변이가 인간 GAA 유전자에서 확인되었으며, 이들 중 대부분은 폼페병과 관련된다. 산 α-글루코시다제 효소의 접힘 오류(misfolding) 또는 가공 오류(misprocessing)를 야기하는 돌연변이는 T1064C(Leu355Pro) 및 C2104T(Arg702Cys)를 포함한다. 추가로, 효소의 성숙 및 가공에 영향을 미치는 GAA 돌연변이는 Leu405Pro 및 Met519Thr를 포함한다. 산 α-글루코시다제 단백질의 활성을 위해서는, 아미노산 잔기 516 내지 521의 보존된 헥사펩티드 WIDMNE가 요구된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 약자 "GAA"는 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도되며, 이탤릭체 약자 "GAA"는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 약자 "rhGAA"는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알글루코시다제 알파"는 [199-아르기닌,223-히스티딘]프레프로-α-글루코시다제(인간); 화학물질 색인 정보등록번호 420794-05-0으로서 확인되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다. 알글루코시다제 알파는 제품 루미자임® 및 마이오자임®으로서, 2016년 1월에 Genzyme에 의해 미국에서 판매 승인되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ATB200"은 그 개시내용이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 공동 계류중인 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재된 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "글리칸"은 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 공유결합된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "N-글리칸" 또는 "N-연결된 글리칸"은 아미노산 잔기의 질소 원자와의 공유 결합을 통해, 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 부착된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, N-글리칸은 아스파라긴 잔기의 측쇄의 질소 원자에 공유적으로 결합될 수 있다. 글리칸은 하나 또는 수개의 단당류 단위를 함유할 수 있으며, 단당류 단위는 공유적으로 연결되어, 직쇄 또는 분지쇄를 형성할 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, ATB200에 부착된 N-글리칸 단위는, 각각 비의존성으로 N-아세틸글루코사민, 만노스, 갈락토스 또는 시알산으로부터 선택되는 하나 이상의 단당류 단위를 포함할 수 있다. 단백질 상의 N-글리칸 단위는 임의의 적절한 분석 기법, 예컨대 질량 분광분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸 단위는 Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro™ 질량 분광분석기, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ 질량 분광분석기 또는 Waters Xevo® G2-XS QTof 질량 분광분석기와 같은 기기를 사용하여, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "고-만노스 N-글리칸"은 1개 내지 6개 이상의 만노스 단위를 갖는 N-글리칸을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 고만노스 N-글리칸 단위는 아스파라긴 잔기에 결합되고, 폴리만노스 분지쇄에 추가로 결합된 bis(N-아세틸글루코사민) 사슬을 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 혼용되는 것으로서, 용어 "M6P" 또는 "만노스-6-인산염"은 6 위치에서 인산화된 것으로; 즉, 6 위치에서 하이드록실기에 결합된 인산염 기를 갖는 만노스 단위를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 하나 이상의 N-글리칸 단위의 하나 이상의 만노스 단위는 6 위치에서 인산화되어, 만노스-6-인산염 단위를 형성한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "복합체 N-글리칸"은 하나 이상의 갈락토스 및/또는 시알산 단위를 함유하는 N-글리칸을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 복합체 N-글리칸은 고만노스 N-글리칸일 수 있으며, 하나의 만노스 단위 또는 만노스 단위들은 각각 비의존성으로 N-아세틸글루코사민, 갈락토스 및 시알산으로부터 선택되는 하나 이상의 단당류 단위와 추가로 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료 유효 투여량" 및 "유효량"은, 대상체에서 치료 반응을 야기하기에 충분한 산 α-글루코시다제의 양을 지칭하는 것으로 의도된다. 치료 반응은 사용자(예를 들어, 임상의)가, 본 명세서에 기재되고, 당업계에 공지된 임의의 대용 임상 마커 또는 증상을 포함하여, 치료에 대한 유효한 반응으로 인식하는 임의의 반응일 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 치료 반응은 당업계에 공지된 것과 같은 폼페병의 하나 이상의 증상 또는 마커의 완화 또는 억제일 수 있다. 폼페병의 증상 또는 마커는 저하된 산 α-글루코시다제 조직 활성; 심근병증; 심장비대; 특히 몸통 또는 하지에서의 진행성 근육 약화; 심한 저혈압; 대설증(macroglossia)(및 일부 경우, 혀의 돌출); 연하, 흡인 및/또는 섭식 곤란; 호흡 부전; 간비대(중등도); 안면 근육 이완; 무반사; 운동 불내성; 운동성 호흡 곤란; 기좌 호흡; 수면 무호흡증; 오전 두통; 졸림; 척추전만 및/또는 측만증; 심부건 반사의 저하; 하부 요통; 및 발달 운동 이정표 미충족을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "효소 대체 요법" 또는 "ERT"는 비 천연 정제 효소를 이러한 효소가 결핍된 개체에 도입하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 투여 단백질은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 이 용어는 또한 정제 효소의 투여가 달리 필요하거나, 유익한 개체에게 정제 효소를 도입하는 것을 지칭한다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 개체는 효소 결핍증을 앓고 있다. 도입 효소는 시험관내에서 생성된 정제된 재조합 효소, 또는 예를 들어 태반 또는 동물 우유와 같은 단리 조직이나, 유체 또는 식물로부터 정제된 단백질일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 인간에 투여되는 경우, 생리상 내성이며, 일반적으로, 부반응을 생성시키지 않는 분자체 및 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 동물 및 더욱 특히 인간용으로서, 미연방 또는 주 정부 규제 당국에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는 제형 내에 포함된 활성 구성요소 이외의 물질을 지칭하며, 일반적으로 불활성 재료이다. 부형제는, 약제가 효과를 발휘하거나, 활성 약제의 방출을 제어하거나, 가용화를 지원하도록 의도된 부위로 활성 약제를 수송할 수 있거나, 다양한 다른 기능을 수행할 수 있다. 부형제의 예로는 완충제, 계면활성제, 항균제, 항산화제, 증량제, 안정화제, 등장성 조정제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "완충액"은, 약산 및 그 공액 약염기 둘 모두를 함유하여, 그 pH가 알칼리 또는 산의 첨가에 따라 단지 소폭 변하는 용액을 지칭하는 것으로 의도된다. 하기에서 추가로 설명하는 바와 같이, 일부 구현예에서, 약제학적 제형에 사용되는 완충액은 시트르산염 및/또는 인산염 완충액이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비 인간 동물을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은, 측정 성질 또는 정확도를 감안한, 측정된 양의 허용 오차를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 오차는, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 측정을 위해 제공된 유효 숫자의 수에 의해 나타낼 수 있으며, 측정을 위해 기록된 가장 정확한 유효 숫자의 ±1의 변동을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 오차의 통상의 예는 일정한 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 및 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 일정한 값의 척도의 1배 이내, 바람직하게는 5배 이내 및 더욱 바람직하게는 2배 이내의 값을 의미할 수 있다. 본 명세서에 제공된 수량은, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약" 또는 "대략"이 명시되지 않은 경우에도, 유추될 수 있는 근사치이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "하나의 구현예," "특정 구현예," "다양한 구현예," "하나 이상의 구현예" 또는 "일 구현예"에 대한 언급은, 구현예와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조, 재료 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸친 다수의 부분에서, "하나 이상의 구현예에서", "특정 구현예", "다양한 구현예에서", "일 구현예에서" 또는 "구현예에서"와 같은 어구의 출현은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정 특성, 구조, 재료 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
ATB200 rhGAA
제형은 효소 대체 요법에 사용하기에 적합한 재조합 GAA(rhGAA) 단백질인 ATB200을 포함한다. ATB200뿐만 아니라, 변이체의 구조 및 생성과 관련한 세부사항이 하기에 제공된다.
적어도 하나의 구현예에서, ATB200은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파의 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함한다. rhGAA에는 7개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. 존재하는 N-연결된 올리고당류(N-글리칸)의 유형에서, 각각의 글리코실화 부위가 이종이므로, rhGAA는 M6P 수용체 및 다른 탄수화물 수용체에 대해 다양한 결합 친화도를 갖는 N-글리칸과 단백질의 복합체 혼합물로 이루어진다. 하나의 M6P 기(단일-M6P)를 갖는 고만노스 N-글리칸을 함유하는 rhGAA는 CIMPR과 낮은(약 6,000 nM) 친화도로 결합하나, 동일한 N-글리칸에 2개의 M6P 기(이중-M6P)를 함유하는 rhGAA는 높은(약 2 nM) 친화도로 결합한다. 비인산화된 단일-M6P, 및 이중-M6P 글리칸의 대표적인 구조가 도 1a에 도시되어 있다. 만노스-6-P 기는 도 1b에 도시되어 있다. 리소좀 내의 경우, rhGAA는 축적된 글리코겐을 효소적으로 분해할 수 있다. 그러나, 기존 rhGAA는 M6P- 및 이중-M6P 보유 글리칸의 총 수준이 낮으며, 따라서, 근육 세포를 불충분하게 표적화함으로써, 리소좀으로의 rhGAA의 저조한 전달을 야기한다. rhGAA의 생산적 약제 표적화가 도 2a에 도시되어 있다. 이들 기존 제품 내의 대부분의 rhGAA 분자는 인산화된 N-글리칸을 갖지 않음으로써, CIMPR에 대한 친화도가 부재한다. 비인산화된 고만노스 글리칸은 또한 만노스 수용체에 의해 배출될 수 있으며, 이는 ERT의 비생산적 배출을 야기한다(도 2b).
갈락토스 및 시알산을 함유하는 복합체 탄수화물인 다른 유형의 N-글리칸이 또한 rhGAA에 존재한다. 복합체 N-글리칸이 인산화되어 있지 않으므로, 이는 CIMPR에 대한 친화도를 갖지 않는다. 그러나, 갈락토스 잔기가 노출되어 있는 복합체 유형 N-글리칸은 간의 간세포에서 아시알로당단백질 수용체에 대해, 중간 정도의 친화도 내지 높은 친화도를 가지며, 이는 rhGAA의 빠른 비생산적 배출을 야기한다(도 2b).
적어도 하나의 구현예에서, 산 α-글루코시다제는 공동 계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재되어 있는 바와 같이, 본 명세서에서 ATB200으로서 지칭되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제이다. ATB200은, 높은 친화도를 가지며(약 2 내지 4 nM의 K D ), 폼페 섬유아세포 및 골격 근육 근아세포에 의해 효율적으로 내재화되는(약 7 내지 14 nM의 K흡수) 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와 결합하는 것으로 나타났다. ATB200은 생체내에서 특성화되었으며, 알글루코시다제 알파(약 60분의 t1/2)보다 더 짧은 겉보기 혈장 반감기(약 45분의 t1/2)를 갖는 것으로 나타났다.
하나 이상의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는, 단일 펩티드 및 전구체 펩티드를 포함하는 초기 56개의 잔기를 제거하는 천연 세포내 단백분해 처리 후, 야생형(WT) 인간 GAA와 동일하고, 아미노산 잔기 57 내지 952에 상응하는, SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 야생형 GAA 아미노산 서열을 갖는다. ATB200 아미노산 서열을 트립신 분해 후, 액체 크로마토그래피/질량 분광분석뿐만 아니라, 아미노산 시퀀싱(amino acid sequencing)에 의해, 검증하였다. 이와 달리, 치료 rhGAA 효소 대체 요법(ERT)(알글루코시다제 알파를 함유하는 시판 제품은 대부분의 국가에서는 마이오자임®이며, 미국에서는 루미자임®이고, Genzyme, Sanofi사의 것임)의 현 표준은 WT GAA와 상이하며, 3개의 아미노산 잔기 치환을 함유한다: 위치 199에서 히스티딘은 아르기닌으로 변화되었고, 223에서는 아르기닌이 히스티딘으로 변화되었으며, 780에서는 발린이 이소류신으로 변화되었다.
적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 단백질 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 번역 후 및/또는 화학적 변형을 거친다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파라긴 잔기는 아스파르트산으로의 탈아미드화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파르트산은 이소-아스파르트산으로의 이성질체화를 거칠 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이 효소는 처음에는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 이러한 효소는 번역 후 및/또는 화학적 변형 중 하나 이상을 거친다. 이러한 변형은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 미국 특허 제 8,592,362호에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 1에 제시된 야생형 GAA 아미노산 서열을 가지며, GenBank 수탁 번호 AHE24104.1(GI:568760974)을 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 관찰된 9개의 GAA 유전자 일배체형 중 가장 우성인 것에 의해 인코딩되는 인간 산 α-글루코시다제 효소인 글루코시다제 알파이다.
적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 처음에는 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 야생형 GAA의 전장의 952개의 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 아미노산의 일부분, 예를 들어 처음 56개의 아미노산이 제거되는 세포내 가공을 거친다. 따라서, 숙주 세포에 의해 분비되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제는, 처음에 세포 내에서 발현되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제보다 더 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 더 짧은 단백질은 SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 단지, 신호 펩티드 및 전구체 펩티드를 포함하는 처음 56개의 아미노산이 제거됨으로써, 896개의 아미노산을 갖는 단백질이 생성된다는 점에서, SEQ ID NO: 1과 상이하다. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열에 대비하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 갖는 것과 같은, 아미노산 수의 다른 변형이 또한 가능하다. 일부 구현예에서, rhGAA 제품은 상이한 아미노산 길이를 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자의 혼합물을 포함한다.
적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 단백질 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 번역 후 및/또는 화학적 변형을 거친다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, N-말단의 글루타민은 피로-글루타메이트(pyro-glutamate)를 형성할 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파라긴 잔기는 아스파르트산으로의 탈아미드화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 아스파르트산 잔기는 이소-아스파르트산으로의 이성질체화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 단백질 내의 비쌍 시스테인 잔기는 유리 글루타티온 및/또는 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이 효소는 처음에는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 이러한 효소는 번역 후 및/또는 화학적 변형 중 하나 이상을 거친다. 이러한 변형은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
바람직하게는, 총 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5% 이하는 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위가 부재하거나, 양이온 비의존성인 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와의 결합능이 부재한다. 대안적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, 100% 미만은 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 적어도 하나의 N-글리칸 단위를 포함하거나, CIMPR과의 결합능을 갖는다.
재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 그의 글리칸 상에 1, 2, 3 또는 4개의 만노스-6-인산염(M6P) 기를 가질 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 상의 단지 하나의 N-글리칸만이 M6P(단일 인산화)를 보유할 수 있거나, 단일 N-글리칸이 2개의 M6P 기(이중 인산화)를 보유할 수 있거나, 동일한 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 상의 2개의 상이한 N-글리칸이 각각 단일 M6P 기를 보유할 수 있다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 또한 M6P 기를 보유하지 않는 N-글리칸을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 평균적으로 N-글리칸은 3 mol/mol 초과의 M6P 및 4 mol/mol 초과의 시알산을 함유함으로써, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 3 몰의 만노스-6-인산염 잔기 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 4 몰의 시알산을 포함한다. 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 글리칸 중 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%가 단일-M6P 글리칸의 형태일 수 있고, 예를 들어, 총 글리칸 중 약 6.25%가 단일 M6P 기를 보유할 수 있고, 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 글리칸 중 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%가 이중-M6P 글리칸의 형태이며, 평균적으로 총 재조합 인간 산 α-글루코시다제 중 25% 미만이 CIMPR과 결합한 인산화 글리칸을 함유하지 않는다.
재조합 인간 산 α-글루코시다제는 0.5 mol/mol 내지 7.0 mol/mol 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 범위 또는 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0 mol/mol 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 하위범위의 임의의 중간 값의 M6P를 보유하는 N-글리칸의 함량 평균값을 가질 수 있다. M6P-보유 또는 이중-M6P-보유 글리칸 수의 평균값이 상이한 재조합 인간 산 α-글루코시다제 조제물을 제공하기 위해, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 분획화함으로써, 특정 분획을 선택하거나, 상이한 분획을 선택적으로 조합함으로써, 표적 조직에서, 리소좀을 표적화하는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 추가로 지정할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 2.0 몰 내지 8.0 몰의 M6P를 보유한다. 이러한 범위는 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0 mol M6P/mol 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하여, 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다.
재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸의 최대 60%가 완전히 시알릴화될 수 있으며, 예를 들어, 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%의 N-글리칸이 완전히 시알릴화될 수 있다. 일부 구현예에서, 총 N-글리칸 중 4% 내지 20%가 완전히 시알릴화된다. 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸 중 5%, 10%, 20% 또는 30% 이하가 시알산 및 말단 갈락토스 잔기(Gal)를 보유한다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예를 들어, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 7% 내지 30%가 시알산 및 말단 갈락토스를 보유할 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸 중 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20% 이하는 말단 갈락토스만을 가지며, 시알산을 함유하지 않는다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예를 들어, 조성물 중 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 8% 내지 19%는 말단 갈락토스만을 가질 수 있으며, 시알산을 함유하지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 40, 45, 50, 55 내지 60%가 복합체형 N-글리칸이거나; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% 이하가 혼성체형 N-글리칸이고; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 고만노스형 N-글리칸 중 5, 10 또는 15% 이하가 비인산화된 것이고; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 고만노스형 N-글리칸 중 적어도 5% 또는 10%가 단일-M6P 인산화된 것이고/이거나; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 고만노스형 N-글리칸 중 적어도 1 또는 2%가 이중-M6P 인산화된 것이다. 이들 값은 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 전술된 함량 범위 중 하나 이상을 충족할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 2.0 몰 내지 8.0 몰의 시알산 잔기를 보유할 것이다. 이러한 범위는 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0 mol 잔기/mol 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하여, 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 시알산 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 존재는 아시알로당단백질 수용체에 의해 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 비생산적 배출을 억제할 수 있는 것으로 여겨진다.
하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 재조합 인간 리소좀 단백질의 특정 N-글리코실화 부위에 M6P 및/또는 시알산 단위를 갖는다. 예를 들어, rhGAA 상에는 7개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. 이들 잠재적 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2의 하기의 위치에 존재한다: N84, N177, N334, N414, N596, N826 및 N869. 유사하게는, SEQ ID NO: 1의 전장의 아미노산 서열의 경우, 이들 잠재적 글리코실화 부위는 하기의 위치에 존재한다: N140, N233, N390, N470, N652, N882 및 N925. rhGAA의 다른 변이체는 아스파라긴 잔기의 위치에 따라, 유사한 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 일반적으로, 단백질 아미노산 서열 중 ASN-X-SER 또는 ASN-X-THR의 서열은 잠재적 글리코실화 부위를 나타내며, 단, X는 HIS 또는 PRO일 수 없다.
다양한 구현예에서, rhGAA는 특정 N-글리코실화 프로파일을 갖는다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N84 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N140)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에 이중-M6P 단위를 보유한다.
하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N177 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N223)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에 이중-M6P 단위를 보유한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N334 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N390)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제3 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 비인산화된 고만노스 글리칸, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸, 및 혼성체형 글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.
하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N414 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N470)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 이중-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% 또는 25%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 시알릴화된다.
하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N596 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N692)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제5 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 푸코실화된 디-안테너리 복합체 글리칸을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.
하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N826 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N882)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제6 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.
하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N869 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N925)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 일부 구현예에서, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 미만의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에 임의의 글리칸을 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 30%, 35% 또는 40%의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에 글리칸을 갖는다.
다양한 구현예에서, rhGAA는 평균 rhGAA의 mol 당 0 mol 내지 5 mol의 푸코스 함량, rhGAA의 mol 당 10 mol 내지 30 mol의 GlcNAc 함량, rhGAA의 mol당 5 mol 내지 20 mol의 갈락토스 함량, rhGAA의 mol 당 10 mol 내지 40 mol의 만노스 함량, rhGAA의 mol 당 2 mol 내지 8 mol의 M6P 함량 및 rhGAA의 mol 당 2 mol 내지 8 mol의 시알산 함량을 갖는다. 다양한 구현예에서, rhGAA는 평균 rhGAA의 mol 당 2 mol 내지 3 mol의 푸코스 함량, rhGAA의 mol 당 20 mol 내지 25 mol의 GlcNAc 함량, rhGAA의 mol 당 8 mol 내지 12 mol의 갈락토스 함량, rhGAA의 mol 당 22 mol 내지 27 mol의 만노스 함량, rhGAA의 mol 당 3 mol 내지 5 mol의 M6P 함량 및 rhGAA의 mol 당 4 mol 내지 7 mol의 시알산 함량을 갖는다.
재조합 인간 산 α-글루코시다제는 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO 세포주 GA-ATB200 또는 ATB200-001-X5-14에 의하거나, 이러한 CHO 세포 배양의 계대배양물 또는 유도체에 의해 생성된다. SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 것과 같은 산 α-글루코시다제의 대립유전자 변이체 또는 다른 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열을 발현하는 DNA 작제물이 CHO 세포에서 작제되고, 발현될 수 있다. 이들 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 대비하여, 결실, 치환 및/또는 삽입을 함유할 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 당업자는 이러한 DNA 작제물의 생성을 위해, CHO 세포의 형질전환에 적합한 대안적 벡터를 선택할 수 있다.
GCG 서열 분석 패키지(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학)의 일부로서 이용 가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하여, 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2개의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해, 사용될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 디폴트 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 구체적 폴리펩티드와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가지며, 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라, 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 달리 명시되지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용을 기반으로 할 것이다. BLASTP가 사용되는 경우, 유사성 퍼센트는 BLASTP 양의 점수를 기반으로 하며, 서열 동일성 퍼센트는 BLASTP 동일성 점수를 기반으로 한다. BLASTP "동일성"은 높은 점수의 서열 쌍에서의 동일한 총 잔기의 수 및 분획을 나타내고; BLASTP "양성"은, 정렬 점수가 양의 값을 가지며, 서로 유사한 잔기의 수 및 분획을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열에 대해 이러한 동일성 또는 유사성 정도 또는 임의의 중간 정도의 유사성의 동일성을 갖는 아미노산 서열이 고려되며, 본 개시내용에 의해 포괄된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드를 사용하여 추론되며, 이는 통상의 수단, 특히, 유전자 코드를 사용한 아미노산 서열의 역번역에 의해, 얻을 수 있다.
일부 구현예에서, 생체내에서 그의 비생산적 배출을 감소시키는 글리코실화 패턴뿐만 아니라, 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR) 및 세포 리소좀을 표적화하는 월등한 능력을 가진 재조합 인간 산 α-글루코시다제가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 세포는, 알글루코시다제 알파와 같은 기존의 재조합 인간 산 α-글루코시다제 제품보다 유의하게 더 고수준의, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 발현시키도록 유도될 수 있다. 예를 들어, ATB200에 의해, 예시된 바와 같이, 이들 세포에 의해 생성된 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 루미자임®과 같은 기존의 산 α-글루코시다제보다 유의하게 더 많은 근육 세포-표적화 만노스-6-인산염(M6P) 및 이중-만노스-6-인산염 N-글리칸 잔기를 갖는다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 광범위한 글리코실화에 의해, ATB200 효소가 더욱 효율적으로 표적 세포 내로 흡수될 수 있게 됨으로써, 예를 들어, 훨씬 더 낮은 M6P 및 이중-M6P 함량을 갖는 알글루코시다제 알파와 같은 다른 재조합 인간 산 α-글루코시다제보다 더욱 효율적으로, 순환계로부터 배출될 수 있게 되는 것으로 여겨진다. ATB200은 CIMPR과 효율적으로 결합하고, 골격근 및 심근에 의해 효율적으로 흡수되며, 유리한 약동학적 프로파일을 제공하고, 생체내에서 비생산적인 배출을 감소시키는 글리코실화 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한, ATB200의 광범위한 글리코실화가, 예를 들어, 알글루코시다제 알파와 비교하여, ATB200의 면역원성의 감소에 기여할 수 있는 것으로 고려된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 포유류 당이 보존된 단백질의 글리코실화는 일반적으로 산물의 용해도를 증대시키며, 산물의 응집 및 면역원성을 감소시킨다. 글리코실화는, 면역계로부터 면역원성 단백질 에피토프를 보호할 뿐만 아니라, 단백질 응집을 최소화함으로써, 단백질의 면역원성을 간접적으로 변이시킨다(문헌[Guidance for Industry - Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, August 2014]). 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여는 항 약제 항체를 유도하지 않는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여는 대상체에서, 알글루코시다제 알파의 투여에 의해 유도되는 항 약제 항체의 수준보다 더 낮은 항 약제 항체의 발생을 유도한다.
공동 계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재된 바와 같이, CHO 세포와 같은 세포가 상기 문헌 내에 기재된 rhGAA를 생성하기 위해, 사용될 수 있으며, 이러한 rhGAA는 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 CHO 세포주의 예는 상기 문헌 내에 기재된 바와 같은 rhGAA 조성물을 생성하는 GA-ATB200 또는 ATB200-001-X5-14 또는 그의 계대배양물이다. 이러한 CHO 세포주는 GAA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 5, 10, 15 또는 20개 이상의 복제물과 같은 다수의 유전자 복제물을 함유할 수 있다.
고 M6P 및 이중-M6P rhGAA, 예컨대 ATB200 rhGAA는, GAA를 인코딩하는 DNA 작제물에 의해, CHO 세포를 형질전환시킴으로써, 생성될 수 있다. CHO 세포는 rhGAA의 제조에 종래부터 사용되어 왔으나, 형질전환된 CHO 세포가, CIMPR을 표적화하는 M6P 및 이중-M6P 글리칸의 고 함량을 갖는 rhGAA가 생성되는 방식으로, 배양되고, 선택될 수 있음은 이해되지 않았다.
놀랍게도, CHO 세포주를 형질전환시키고, CIMPR을 표적화하는 M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 글리칸의 고 함량을 함유하는 rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하며, 이러한 고-M6P rhGAA를 안정하게 발현시키는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 CHO 세포주의 제조 방법이 또한 공동 계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재되어 있다. 이러한 방법은 GAA 또는 GAA 변이체를 인코딩하는 DNA에 의해 CHO 세포를 형질전환시키는 단계, GAA를 인코딩하는 DNA를 그의 염색체(들) 내로 안정하게 혼입시키고, GAA를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 선택하는 단계 및 M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 글리칸의 고 함량을 갖는 GAA를 발현하는 CHO 세포를 선택하는 단계 및 선택적으로, 시알산 함량이 높은 N-글리칸을 가지고/가지거나, 비인산화된 고만노스 함량이 낮은 N-글리칸을 갖는 CHO 세포를 선택하는 단계를 포함한다. CHO 세포주를 배양하고, CHO 세포의 배양으로부터 상기 조성물을 회수함으로써, 이들 CHO 세포주를 사용하여, rhGAA 및 rhGAA 조성물을 생성할 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, ATB200은 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 범위의 양으로 존재한다. 추가의 구현예에서, ATB200은 약 5, 8, 10 또는 12 내지 약 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/mL의 범위의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, ATB200은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 mg/mL의 범위의 양으로 존재한다. 추가의 구현예에서, ATB200은 약 15 mg/mL의 범위의 양으로 존재한다.
pH 및 완충액
제형의 pH는 약 5.0 내지 약 7.0 또는 약 5.0 내지 약 6.0의 범위일 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, pH는 약 5.5 내지 약 6.0의 범위이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 또는 6.5의 pH를 갖는다. 일반적으로, 열거된 바와 같은 성분의 양은 약 5.0 내지 약 6.0의 범위의 pH를 생성한다. 그러나, pH는 pH 조정제(즉, 알칼리화제 및 산성화제), 예컨대 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용함으로써, 표적 pH로 조정할 수 있다.
제형은 또한 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충액을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완충액"은 약산 및 그의 공액 염기를 함유하여, pH의 변화를 방지하는 완충액 용액을 지칭한다. 시트르산염 및/또는 인산염은 시트르산나트륨 또는 인산나트륨일 수 있다. 다른 염은 칼륨 및 암모늄 염을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 완충액은 시트르산염을 포함한다. 추가의 구현예에서, 완충액은 시트르산나트륨(예를 들어, 시트르산나트륨 이수화물 및 시트르산 일수화물의 혼합물)을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 시트르산염을 포함하는 완충액 용액은 시트르산나트륨 및 시트르산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시트르산염 및 인산염 완충액 둘 모두가 존재한다.
부형제
제형은 또한 적어도 1종의 부형제를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예는 등장성을 보조하거나, 증량제로서 작용하거나, 안정화제로서 작용하는 부형제를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 1종의 부형제는 만니톨, 폴리소르베이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 부형제는 등장성 조정제 및/또는 증량제로서 작용할 수 있는 구성요소, 특히 만니톨을 포함한다. 등장화제는, 제형이 인간 혈액과 유사하거나, 동일한 삼투압을 갖도록 보장하는 성분이다. 증량제는 (예를 들어, 동결건조된) 제형에 질량을 보조하고, 케이크(cake)에 적절한 구조를 제공하는 구성요소이다.
하나 이상의 구현예에서, 등장화제 및/또는 증량제의 총 양은 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 양의 범위이다. 추가의 구현예에서, 등장화제 및/또는 증량제의 총 양은 약 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 내지 약 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/mL의 양의 범위이다. 일부 구현예에서, 등장화제 및/또는 증량제는 만니톨을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 만니톨은 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 양으로 존재한다. 추가의 구현예에서, 만니톨은 약 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 내지 약 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/mL의 양으로 존재한다. 추가의 구현예에서, 만니톨은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 mg/mL의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 만니톨이 단일 등장화제 및/또는 증량제이다. 다른 등장화제 및/또는 증량제의 예는 염화나트륨, 수크로스, 및 트레할로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 부형제는 안정화제로서 작용할 수 있는 구성요소, 예컨대 폴리소르베이트 80을 포함한다. 안정화제는, 소수성 공기-물 계면에 응집체 형성을 방지하거나, 최소화할 수 있는 화합물이다. 일부 구현예에서, 안정화제는 계면활성제이다. 하나 이상의 구현예에서, 안정화제의 총 양은 약 0.1 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL의 범위이다. 추가의 구현예에서, 안정화제의 총 양은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 내지 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 0.9 또는 1.0 mg/mL의 범위이다. 추가의 구현예에서, 안정화제의 총 양은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 0.9 또는 1.0 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트 80이 단일 안정화제이다. 따라서, 하나 이상의 구현예에서, 폴리소르베이트 80은 약 0.1 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL의 범위이다. 추가의 구현예에서, 폴리소르베이트 80은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 내지 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 0.9 또는 1.0 mg/mL의 범위이다. 추가의 구현예에서, 폴리소르베이트 80은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 0.9 또는 1.0 mg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 제형으로부터 특정 성분을 배제하는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, 일정한 질병의 치료를 위한 제형의 제조시, 근본적인 질병을 악화시키는 특정 화합물을 배제하는 것이 요망될 것이다. 상기에서 논의된 바와 같이, 폼페병이 있는 개체는 글리코겐을 분해하는 능력이 저하되었거나, 결핍되어 있다. 수크로스, 트레할로스 및 글리신과 같이 흔히 사용되는 여러 부형제가 체내에서 글루코스로 전환될 수 있으며, 이는 결국 폼페병을 악화시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 수크로스, 트레할로스 및/또는 글리신은 제형으로부터 배제된다. 유사하게, 특정 상황이 주어진 경우, 제형에 최적격으로 적합하지 않은 특정 성분은 배제될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴록사머(poloxamer)는 배제될 수 있다.
예시적 구현예
하나 이상의 구현예에서, 제형은
(a) ATB200(예를 들어, 재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는 재조합 산 α-글루코시다제);
(b) 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 완충액;
(c) 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제
를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지고,
제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0 또는 pH 7.0을 갖는다.
일부 구현예에서, 제형은
(a) ATB200(예를 들어, 재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는 재조합 산 α-글루코시다제);
(b1) 시트르산나트륨;
(b2) 시트르산 일수화물;
(c1) 만니톨;
(c2) 폴리소르베이트 80;
(d) 물;
(e) 선택적으로, 산성화제; 및
(f) 선택적으로, 알칼리화제
를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지고,
제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0 또는 pH 7.0을 갖는다. 추가의 구현예에서, pH는 약 5.5 내지 약 6.0의 범위이다. 추가의 구현예에서, pH는 약 6.0이다.
구체적 구현예에서, 제형은
(a) 약 5-30 mg/mL 또는 약 15 mg/mL의 농도로 존재하는 ATB200(예를 들어, 재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는 재조합 산 α-글루코시다제);
(b) 약 10 mM 내지 100 mM 또는 약 25 mM의 농도로 존재하는 시트르산나트륨 완충액;
(c1) 약 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 또는 약 20 mg/mL의 농도로 존재하는 만니톨;
(c2) 약 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL 또는 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80; 및
(d) 물;
(e) 선택적으로, 산성화제; 및
(f) 선택적으로, 알칼리화제
를 포함하고,
제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0 또는 pH 7.0을 갖는다. 추가의 구현예에서, pH는 약 5.5 내지 약 6.0의 범위이다. 추가의 구현예에서, pH는 약 6.0이다.
제형의 제조
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예에서, 제형은 효소 용액으로부터 제조될 수 있다. 이 용액을 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 필요한 바에 따라, 표적 농도 및 완충액으로 농축하여, 완충액 교환할 수 있다. 그 후, 추가의 성분(예를 들어, 부형제 및 pH 조정제)을 첨가할 수 있다. 그 후, 제형을 여과하고, 저장 용기 내에 배치시켜, 저장할 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 제형 중 임의의 것을 제조하는 방법은 적어도 1종의 완충액, 적어도 1종의 부형제 및 재조합 산 α-글루코시다제를 물에 첨가하여, 용액을 제공하는 단계; 선택적으로 용액의 pH를 조정하는 단계; 및 선택적으로 추가의 물을 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 이 방법은 용액을 여과하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 이 방법은 용액을 저장하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 제형의 생성을 위한 예시적인 비제한 공정이 하기에 이어진다:
1. 적절한 제조 베슬(vessel)에, 대략 85% 내지 90%의 배치 용적의 주사용수를 첨가한다.
2. 요망되는 부형제 및 완충액(예를 들어, 시트르산나트륨 이수화물, 시트르산 일수화물, 폴리소르베이트 80, 만니톨)을 첨가하여, 용해시키고, 용해될 때까지 혼합한다.
3. ATB200 약제 물질을 첨가하고, 혼합한다.
4. 필요한 바에 따라, 조정제(예를 들어,) 염산 또는 수산화나트륨 용액에 의해, pH를 표적 pH(예를 들어, 6 ± 0.1)로 조정한다.
5. 충분한 주사용수를 최종 용적으로 첨가하여, 혼합한다.
6. 용액을 멸균 필터를 통해, 멸균 저장기 내로 여과한다.
7. 무균 상태에서 약제 산물 용액을 바이알 내에 충전하고, 마개를 삽입한다.
8. 모든 바이알에 뚜껑을 씌우고, 2℃ 내지 8℃에 저장한다.
하나 이상의 구현예에서, 제형은 제조시, 액체 형태이다. 즉, 제형은 물을 포함한다. 이러한 액체 제형은 동결건조(동결하여-건조하는) 공정을 거쳐, 케이크 또는 분말을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 동결건조 후 상기에 기재된 제형 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 동결건조된 혼합물은 ATB200, 시트르산염, 인산염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충액, 및 트레할로스, 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 구성요소(예를 들어, 다른 부형제)를 동결건조된 혼합물에 첨가할 수 있다. 동결건조된 제형을 포함하는 약제학적 조성물을 바이알에 제공한 후, 저장하고, 수송하고, 재구성하고/하거나, 환자에 투여할 수 있다.
치료 및 환자에의 투여 방법
본 발명의 또 다른 양태는 폼페병의 치료 방법 및/또는 폼페병의 치료를 위한, 본 명세서에 기재된 제형의 용도에 관한 것이다. 제형은 제조시 또는 동결건조 및 재구성 후, 투여될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 구현예에서, 이 방법은 상기에 기재된 약제학적 제형 중 임의의 것이 필요한 환자에 이를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 동결건조된 약제학적 조성물을 재구성하는 단계 및 재구성된 약제학적 조성물이 필요한 환자에 이를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 재구성된 약제학적 조성물은 동결건조 전 및/또는 제조시, 약제학적 제형과 유사하거나, 동일한 구성을 갖는다. 어느 경우에나, 약제학적 제형 또는 재구성된 약제학적 조성물은 환자에의 투여 전에 희석될 수 있다. 추가의 구현예에서, 약제학적 제형 또는 재구성된 약제학적 조성물은 정맥내 투여된다.
하나 이상의 구현예에서, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위의 통증을 완화하기 위해, 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 구성요소는, 예를 들어, 활성 제제의 정량이 표시된 앰플 또는 포와 같은 밀폐형 밀봉 용기 내에 동결건조된 건조 분말 또는 물 무함유 농축물로서, 단위 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 약제학적 등급의 멸균수, 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병에 의해, 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 구성요소가 혼합될 수 있도록, 주사용 멸균수 또는 염수 앰플이 제공될 수 있다.
다른 구현예에서, 약제학적 제형 또는 재구성된 약제학적 조성물은 심근 또는 골격근(예를 들어, 근육내) 또는 신경계(예를 들어, 뇌내; 뇌실내; 뇌척수액내로의 직접 주사)와 같은 표적 조직으로의 직접 투여에 의해 투여된다. 요망되는 경우, 1종 초과의 경로가 동시에 사용될 수 있다.
약제학적 제형 또는 재구성된 조성물은 치료 유효량(예를 들어, 정기적 간격으로 투여되는 경우, 질병 관련 증상을 완화하고, 질병의 발병을 억제하거나, 지연시키고/시키거나, 질병 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시킴으로써, 질병을 치료하기에 충분한 투여량)으로 투여된다. 질병의 치료에 치료적으로 유효한 양은 질병의 효과의 성질 및 정도에 따라 다를 것이며, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 최적의 투여량 범위의 확인을 위해, 시험관내 또는 생체내 분석이 선택적으로 사용될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 예컨대 약 5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 통상적으로 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg 또는 약 100 mg/kg의 투여량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 특정 개체를 위한 유효 투여량은 개체의 필요에 의해, 시간 경과에 따라 변화(예를 들어, 증가 또는 저하)할 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 존재하는 때 또는 항-산 α-글루코시다제 항체가 존재하거나, 증가하는 경우 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 양이 증가할 수 있다.
재조합 인간 산 α-글루코시다제(또는, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 함유하는 조성물 또는 의약품)의 치료 유효량이 질병의 효과의 성질과 정도 및 지속적 기준에 따라, 정기적 간격으로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정기적 간격"의 투여는 치료 유효량이 주기적으로(1회 투여와 구별됨) 투여되는 것을 나타낸다. 간격은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 매월, 격월; 매주; 매주 2회; 또는 매일 투여된다. 단일 개체의 투여 간격은 일정한 간격일 필요는 없으며, 개체의 필요에 따라, 시간 경과에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 존재하는 때, 항-재조합 인간 산 α-글루코시다제 항체가 존재하거나, 증가하는 경우 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 투여간의 간격이 저하될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 약제학적 제형 또는 재구성된 조성물은 샤프론의 경구 투여 및 약제학적 제형 또는 재구성된 조성물의 정맥내 투여와 같이, 약리학적 샤프론과 공동 투여된다. 다양한 구현예에서, 약리학적 샤프론은 미글루스타트이다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 400 mg의 경구 투여량 또는 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg 또는 약 400 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 233 mg 내지 약 400 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 250 내지 약 270 mg의 경구 투여량 또는 약 250 mg, 약 255 mg, 약 260 mg, 약 265 mg 또는 약 270 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 260 mg의 경구 투여량으로 투여된다.
적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 동시에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 연속적으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 3시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 2시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 2시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1.5시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 50분 내지 약 70분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 55분 내지 약 65분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 30분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 25분 내지 약 35분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 27분 내지 약 33분 전에 투여된다.
키트
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 약제학적 제형(동결건조 후 포함)을 포함하는 키트에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 약제학적 제형(동결건조 전 또는 후)을 포함하는 용기(예를 들어, 바이알, 튜브, 백 등) 및 재구성, 희석 및 투여를 위한 설명서를 포함한다.
실시예
효소 실시예 1: 기존의 마이오자임® 및 루미자임® rhGAA 제품의 한계
현재 유일하게 승인된 폼페병 치료제인 마이오자임® 및 루미자임®의 rhGAA의 능력을 평가하기 위해, 이들 rhGAA 조제물을 (M6P 기를 갖는 rhGAA와 결합하는) CIMPR 칼럼 상에 주사한 후, 유리 M6 구배에 의해 용리시켰다. 분획을 96-웰 플레이트에 수집하고, GAA 활성을 4MU-α-글루코스 기질에 의해 분석하였다. 결합 및 비결합 rhGAA의 상대량을 GAA 활성을 기반으로 결정하고, 전체 효소의 분획으로서 기록하였다.
도 3a 및 도 3b에는 기존의 ERT(마이오자임® 및 루미자임®)와 관련된 문제가 도시되어 있다: 마이오자임®의 73%의 rhGAA(도 3b) 및 루미자임®의 78%의 rhGAA(도 3a)는 CIMPR과 결합하지 않았으며, 각 도면의 좌측-최대 피크를 참조한다. 단지, 마이오자임®의 27%의 rhGAA 및 루미자임®의 22%의 rhGAA만이, 근육 세포 상의 CIMPR에 생산적으로 표적화할 수 있는 M6P를 함유하였다.
마이오자임® 및 루미자임®의 유효 투여량은, 근육 세포 상의 CIMPR을 표적화하는 M6P를 함유하는 rhGAA의 양에 상응한다. 그러나, 이들 2개의 기존 제품의 대부분의 rhGAA는 표적 근육 세포 상의 CIMPR 수용체를 표적화하지 않는다. 대부분의 rhGAA가 근육 세포로 표적화되지 않는 기존의 rhGAA의 투여는 비표적 rhGAA에 대한 알러지 반응 또는 면역반응 유도의 위험을 증가시킨다.
효소 실시예 2: 단일- 또는 이중-M6P-보유 N-글리칸의 고 함량을 갖는 ATB200 rhGAA를 생성하는 CHO 세포의 제조
CHO 세포를, rhGAA를 발현하는 DNA에 의해 형질감염시킨 후, rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하였다. rhGAA를 인코딩하는 DNA에 의해 CHO 세포를 형질전환시키기 위한 DNA 작제물이 도 4에 도시되어 있다. CHO 세포를, rhGAA를 발현하는 DNA에 의해 형질감염시킨 후, rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하였다.
형질감염 후, 안정하게 혼입된 GAA 유전자를 함유하는 DG44 CHO(DHFR-) 세포를 하이포크산틴/티미딘 결핍(-HT) 배지를 사용하여, 선택하였다.
이들 세포에서의 GAA 발현의 증폭을 메토트렉세이트 처리(MTX, 500 nM)에 의해 유도하였다. 다량의 GAA를 발현하는 세포 풀을 GAA 효소 활성 분석에 의해 확인하고, rhGAA를 생성하는 개별 클론을 확립하는 데 사용하였다. 개별 클론을 반고체 배지 플레이트 상에 생성시키고, ClonePix 시스템에 의해, 발출하였으며, 깊은 24-웰 플레이트로 옮겼다. 개별 클론을 GAA 효소 활성에 대해 분석하여, 고수준의 GAA를 발현하는 클론을 확인하였다. GAA 활성을 결정하기 위한 일정한 조건의 배지에는 4-MU-α-글루코시다제 기질을 사용하였다. GAA 효소 분석에 의해 측정된 바와 같이, 더 고수준의 GAA를 생성하는 클론을 생존, 성장능력, GAA 생산성, N-글리칸 구조 및 안정한 단백질 발현에 대해 추가로 평가하였다. CHO 세포주 GA-ATB-200을 포함하고, 증대된 단일-M6P 또는 이중-M6P N-글리칸을 갖는 rhGAA를 발현하는 CHO 세포주를 이 절차를 사용하여, 단리하였다.
효소 실시예 3: ATB200 rhGAA의 포획 및 정제
본 발명에 따른 rhGAA의 다수의 배치를 CHO 세포주 GA-ATB-200을 사용하여, 진탕 플라스크 및 관류 생물반응기에 생성하였고, CIMPR 결합을 측정하였다. 그와 유사한 CIMPR 수용체 결합(약 70%)은 도 5b에 도시되어 있고, 도 6은 상이한 생성 배치로부터의 정제된 ATB200 rhGAA에 대해 관찰된 것이며, 이는 ATB200 rhGAA가 일관되게 생성될 수 있음을 시사한다. 도 3a, 도 3b, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 마이오자임® 및 루미자임® rhGAA는 ATB200 rhGAA보다 유의하게 적은 CIMPR 결합을 나타내었다.
효소 실시예 4: ATB200과 루미자임®의 분석 비교
약 음이온 교환("WAX") 액체 크로마토그래피를 사용하여, 말단 인산염에 따라 ATB200 rhGAA를 분획화하였다. 염의 양을 증가시키면서, ERT를 용리함으로써, 용리 프로파일을 생성시켰다. 프로파일을 UV(A280 nm)에 의해 모니터링하였다. ATB200 rhGAA를 CHO 세포로부터 얻어서, 정제하였다. 루미자임®을 상업적 공급원으로부터 입수하였다. 루미자임®은 용리 프로파일 좌측 상에 고 피크를 나타내었다. ATB200 rhGAA는 루미자임®의 우측에 4개의 우세한 피크 용리를 나타내었다(도 7). 이는, 이 평가가 CIMPR 친화도가 아닌 말단 전하에 의한 것이므로, ATB200 rhGAA가 루미자임®보다 더 큰 정도로 인산화되었음을 확인시킨다.
효소 실시예 5: ATB200 rhGAA의 올리고당류 특성화
정제된 ATB200 rhGAA 및 루미자임® 글리칸을 각각의 ERT 상에서 발견되는 개별 글리칸 구조를 결정하기 위해, MALDI-TOF에 의해 평가하였다(도 8). ATB200 샘플은 루미자임®보다 더 소량의 비인산화된 고-만노스형 N-글리칸을 함유한 것으로 나타났다. 루미자임®에서보다 ATB200에서 더 고 함량의 M6P 글리칸은 더욱 효율적으로 ATB200 rhGAA를 근육 세포로 표적화한다. MALDI에 의해 결정된 고 백분율의 단일-인산화 및 이중-인산화 구조는 ATB200과 CIMPR 수용체의 유의하게 더 큰 결합을 예시하는 CIMPR 프로파일에 일관된다. MALDI-TOF 질량 분광분석을 통한 N-글리칸 분석은 평균적으로 각각의 ATB200 분자가 적어도 하나의 천연 이중-M6P N-글리칸 구조를 함유함을 확인시킨다. ATB200 rhGAA 상의 이러한 더 고 함량의 이중-M6P N-글리칸은 도 10a의 M6P 수용체 플레이트 결합 분석(KD 약 2 nM 내지 4 nM)에서 CIMPR과의 고-친화도 결합과 직접 연관된다.
ATB200 rhGAA를 또한 2개의 상이한 LC-MS/MS 분석 기법을 사용하여, 부위-특이적 N-글리칸 프로파일에 대해 분석하였다. 제1 분석에서, LC-MS/MS 분석 전에, 단백질을 변성시키고, 환원시키고, 알킬화시키고, 분해하였다. 단백질의 변성 및 환원 단계 동안, 200 μg의 단백질 샘플, 5 μL 1 mol/L 트리스-HCl(최종 농도: 50 mM), 75 μL 8 mol/L 구아니딘 HCl(최종 농도: 6 M), 1 μL 0.5 mol/L EDTA(최종 농도: 5 mM), 2 μL 1 mol/L DTT(최종 농도: 20 mM) 및 Milli-Q® 물을 1.5 mL 튜브에 첨가하여, 100 μL의 총 용적을 제공하였다. 샘플을 혼합하고, 건조 조에서 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 알킬화 단계 동안, 변성되고, 환원된 단백질 샘플을 5 μL 1 mol/L 요오도아세트아미드(IAM, 최종 농도: 50 mM)와 혼합한 후, 10℃ 내지 30℃의 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 알킬화 후, 400 μL의 사전 냉각된 아세톤을 샘플에 첨가하고, 혼합물을 -80℃의 냉동고에서 4시간 동안 동결시켰다. 그 후, 샘플을 4℃, 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 분리하였다. 400 μL의 사전 냉각된 아세톤을 펠릿에 첨가한 후, 4℃, 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 분리하였다. 그 후, 샘플을 암소에서 얼음 상에서 대기 건조시켜, 아세톤 잔기를 제거하였다. 40 μL의 8 M 요소 및 160 μL의 100 mM NH4HCO3을 샘플에 첨가하여, 단백질을 용해시켰다. 그 후, 트립신 분해 단계 동안, 50 μg의 단백질을 최종 용적이 100 μL가 되도록 트립신 분해 완충액에 첨가하고, 5 μL 0.5 mg/mL 트립신(20/1 w/w의 단백질 대 효소 비율)을 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고, 37℃에서 밤새(16시간 ± 2시간) 인큐베이션하였다. 2.5 μL의 20% TFA(최종 농도: 0.5%)를 첨가하여, 반응을 퀀칭(quenching)시켰다. 그 후, 샘플을 Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro™ 질량 분광분석기를 사용하여, 분석하였다.
제2 LC-MS/MS 분석에서, 알킬화 시약으로서, IAM 대신에 요오도아세트산(IAA)을 사용하는 것을 제외하고, 유사한 변성, 환원, 알킬화 및 분해 절차에 따라, ATB200 샘플을 제조한 후, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ 질량 분광분석기를 사용하여, 분석하였다.
제1 및 제2 분석의 결과는 도 9a 내지 도 9h에 도시되어 있다. 도 9a 내지 도 9h에서, 제1 분석 결과는 좌측 막대(진회색)에 의해 표시되어 있으며, 제2 분석으로부터의 결과는 우측 막대(연회색)에 의해 표시되어 있다. 도 9b 내지 도 9g에서, 글리칸 표시의 기호명은 문헌[Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009)]에 따른 것이다.
도 9a 내지 도 9g로부터 인식되는 바와 같이, 2개의 분석은, 결과 간에 일부 변동이 있기는 하나, 유사한 결과를 제공하였다. 이러한 변동은 사용된 기기 및 N-글리칸 분석의 완전성을 포함하여, 다양한 인자에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 종류의 인산화 글리칸이 확인되지 않고/않거나, 정량화되지 않은 경우, 인산화 글리칸의 총수가 적게 표시될 수 있고, 그 부위에 인산화 글리칸을 보유하는 rhGAA의 백분율이 적게 표시될 수 있다. 또 다른 예로서, 일부 종류의 비인산화 글리칸이 확인되지 않고/않거나, 정량화되지 않은 경우, 비인산화 글리칸의 총수가 적게 표시될 수 있고, 그 부위에 인산화 글리칸을 보유하는 rhGAA의 백분율이 많게 표시될 수 있다. 도 9a는 ATB200의 N-글리코실화 부위 점유율을 도시한다. 도 9a로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 N-글리코실화 부위는 대부분 점유되어 있으며, 두 분석 모두에서 검출된 90% 이상 및 최대 약 100%의 ATB200 효소가 각각의 잠재적 부위에 글리칸을 갖는 것으로 검출되었다. 그러나, 제7의 잠재적 N-글리코실화 부위는 약 절반의 경우에 글리코실화된다.
도 9b는 제1 부위인 N84의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 9b로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 이중-M6P 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 75% 이상의 ATB200이 제1 부위에 이중-M6P 글리칸을 가졌다.
도 9c는 제2 부위인 N177의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 9c로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 단일-M6P 글리칸 및 비인산화된 고만노스 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 40% 이상의 ATB200이 제2 부위에 단일-M6P 글리칸을 가졌다.
도 9d는 제3 부위인 N334의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 9d로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 비인산화된 고만노스 글리칸, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸, 및 혼성체형 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 20% 이상의 ATB200이 제3 부위에 시알산 잔기를 가졌다.
도 9e는 제4 부위인 N414의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 9e로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 이중-M6P 및 단일-MGP 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 40% 이상의 ATB200이 제4 부위에 이중-M6P 글리칸을 가졌다. 또한, 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 25% 이상의 ATB200이 제4 부위에 단일-M6P 글리칸을 가졌다.
도 9f는 제5 부위인 N596의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 9f로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 푸코실화된 디-안테너리 복합체 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 70% 이상의 ATB200이 제5 부위에 시알산 잔기를 가졌다.
도 9g는 제6 부위인 N826의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 9g로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 80% 이상의 ATB200이 제6 부위에 시알산 잔기를 가졌다.
제7 부위인 N869에서의 글리코실화의 분석은 대략 40% 글리코실화를 나타내었으며, 가장 통상적인 글리칸은 A4S3S3GF(12%), A5S3G2F(10%), A4S2G2F(8%) 및 A6S3G3F(8%)였다.
도 9h는 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위 각각에서의 인산화가 요약된 것을 도시한다. 도 9g로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 제1, 제2 및 제4 부위에서 고 인산화 수준이 검출되었다. 두 분석 모두에서 검출된 80% 이상의 ATB200이 제1 부위에서 단일- 또는 이중-인산화되었고, 40% 이상의 ATB200이 제2 부위에서 단일-인산화되었으며, 80% 이상의 ATB200이 제4 부위에서 단일- 또는 이중-인산화되었다.
ATB200의 또 다른 글리칸 분석을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피-형광 검출-질량 분광분석(HILIC-FLD-MS) 방법에 따라 수행하였다.
HILIC-FLD-MS 분석의 결과는 하기 표 A에 제공되어 있다. 표 A에서, 3자리 숫자 중 첫 번째 숫자는 글리칸 내의 분지쇄의 수를 나타내고, 두 번째 숫자는 코어 푸코스 단위(core fucose unit)의 수를 나타내며, 세 번째 숫자는 말단 시알산 단위의 수를 나타낸다. 이러한 명명법을 사용하는 경우, "303"은 0개의 코어 푸코스(두 번째의 0) 및 3개의 말단 시알산(마지막의 3)을 갖는 트리-안테너리 글리칸(tri-antennary glycan)(첫 번째의 3)을 나타내고, "212"는 1개의 코어 푸코스 및 2개의 말단 시알산을 갖는 바이-안테너리 글리칸을 나타내며, "404"는 0개의 코어 푸코스 및 4개의 말단 시알산을 갖는 테트라-안테터리 글리칸을 나타낸다.
[표 A]
HILIC-FLD-MS 분석을 기반으로 하여, 시험된 ATB200은 평균 ATB200의 mol 당 2 mol 내지 3 mol의 푸코스 함량, ATB200의 mol당 20 mol 내지 25 mol의 GlcNAc 함량, ATB200의 mol 당 8 mol 내지 12 mol의 갈락토스 함량, ATB200의 mol 당 22 mol 내지 27 mol의 만노스 함량, ATB200의 mol 당 3 mol 내지 5 mol의 M6P 함량 및 ATB200 중 4 mol 내지 7 mol의 시알산 함량을 가질 것으로 예상된다.
효소 실시예 6: ATB200의 CIMPR 친화도의 특성화
CIMPR과 결합할 수 있는 rhGAA의 백분율을 더 높이는 것 외에도, 상호작용의 특질을 이해하는 것이 중요하다. 루미자임® 및 ATB200 rhGAA 수용체 결합을 CIMPR 플레이트 결합 분석을 사용하여 결정하였다. 간단히 말해, CIMPR 피복 플레이트를 사용하여, GAA를 포획하였다. 다양한 농도의 rhGAA를 고정된 수용체에 도포하고, 비결합 rhGAA를 세척하였다. rhGAA의 잔류량을 GAA 활동에 의해 결정하였다. 도 10a에 의해 인식된 바와 같이, ATB200 rhGAA는 루미자임®보다 CIMPR과 유의하게 더 잘 결합하였다.
도 10b는 루미자임®, 기존의 rhGAA, 및 본 발명에 따른 ATB200의 이중-M6P 글리칸의 상대 함량을 도시한다. 루미자임®의 경우, 평균적으로 단지 10%의 분자만이 이중-인산화 글리칸을 갖는다. 이는 평균적으로 모든 rhGAA 분자가 적어도 하나의 이중-인산화 글리칸을 가진 ATB200과 대조적이다.
효소 실시예 7: ATB200 rhGAA는 루미자임®보다 섬유아세포에 의해 더욱 효율적으로 내재화되었다
ATB200과 루미자임® rhGAA의 상대 세포 흡수를 정상 및 폼페 섬유아세포 세포주를 사용하여 비교하였다. 비교에는 5 nM 내지 100 nM의 본 발명에 따른 ATB200 rhGAA와 10 nM 내지 500 nM의 기존의 rhGAA 루미자임®이 포함되었다. 16시간의 인큐베이션 후, 외부 rhGAA를 TRIS 염기로 불활성화시키고, 세포를 채취하기 전에 PBS로 3회 세척하였다. 4MU-α-글루코사이드 가수분해에 의해 측정된 내재화된 GAA를 총 세포 단백질에 대해 그래프로 나타냈으며, 결과는 도 11a 및 도 11b에 제시되어 있다.
ATB200 rhGAA는 또한 세포 내로 효율적으로 내재화되는 것으로 나타났으며(도 11a 및 도 11b), 이는 각각, ATB200 rhGAA가 정상 및 폼페 섬유아세포 세포 둘 모두 내로 내재화되고, 기존의 루미자임® rhGAA보다 더 큰 정도로 내재화됨을 시사한다. ATB200 rhGAA는 약 20 nM에서 세포 수용체를 포화시키고, 한편, 루미자임®은 약 250 nM이 필요하다. 이러한 결과로부터 추산된 흡수 효율 상수(K흡수)는 도 11c에 도시된 바와 같이, ATB200의 경우 2 nm 내지 3 nm이고, 루미자임®의 경우 56 nM이다. 이들 결과는 ATB200 rhGAA가 폼페병에 대한 양질의 표적 치료제임을 시사한다.
효소 실시예 8: GAA-녹아웃 마우스에서의 글리코겐 감소
도 12a 내지 도 12c는 Gaa 녹아웃 마우스에서 글리코겐 배출률에 대한 알글루코시다제 알파(루미자임®) 및 ATB200의 투여의 효과를 도시한다. 동물에 2회의 IV 볼루스 투여(매격주)를 제공하였고; 최종 투여 2주 후에 조직을 채취하였고, 산 α-글루코시다제 활성 및 글리코겐 함량에 대해 분석하였다.
도 12a 내지 도 12c로부터 인식되는 바와 같이, ATB200은 투여량-의존적 방식으로 산 α-글루코시다제(Gaa) 녹아웃 마우스에서 조직 글리코겐을 고갈시키는 것으로 나타났다. 20 mg/kg 투여량의 ATB200은 Gaa 녹아웃 마우스에서 5 및 10 mg/kg 투여량 수준보다 더 큰 비율의 저장 글리코겐을 일관되게 제거하였다. 그러나, 도 12a 내지 도 12c에 도시된 바와 같이, 5 mg/kg으로 투여된 ATB200은 마우스의 심근 및 골격근(사두근 및 삼두근)에서 20 mg/kg으로 투여된 루미자임®과 유사한 글리코겐 감소를 나타내었으며, 10 mg/kg 및 20 mg/kg으로 투여된 ATB200은 골격근에서 루미자임®보다 유의하게 더 양호한 글리코겐 수준의 감소를 나타내었다.
도 15는 Gaa 녹아웃 마우스에서 글리코겐 배출률에 대한 알글루코시다제 알파(루미자임®) 및 ATB200의 투여 효과를 도시한다. 12주령의 GAA KO 마우스에 루미자임® 또는 ATB200을 20 mg/kg IV로 매격주 4회 주사에 의해 처리하였다. 마지막 효소 투여 후 14일째에 글리코겐 측정을 위해, 조직을 수집하였다. 도 13은 사두 및 삼두 골격근에서 글리코겐의 상대적 감소를 도시하며, ATB200은 루미자임®보다 더 큰 글리코겐 감소를 제공한다
효소 실시예 9: GAA-녹아웃 마우스에서의 근육 생리학 및 형태학
Gaa 녹아웃 마우스에 20 mg/kg의 재조합 인간 산 α-글루코시다제(알글루코시다제 알파 또는 ATB200)의 2회의 IV 볼루스 투여를 매격주 제공하였다. 대조군 마우스는 비히클을 단독으로 처리하였다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 최종 투여 2주 후에, 비장근, 사두근 및 횡경막 조직을 채취한다. 비장근 및 횡경막 조직을 과요오드산 - Schiff 시약(PAS)에 의해 염색함으로써, 글리코겐 수준에 대해 분석하고, 폼페병의 경우, 상향조절되는 리소좀-결합 막 단백질(LAMP1) 마커의 수준을 측정함으로써, 리소좀 증식에 대해 분석하였다. 에폭시 수지(Epon)에 포매된 사두근의 얇은 쪽 단면을 메틸렌 블루로 염색하고, 전자 현미경(1000x)에 의해 관찰하여, 액포의 존재 정도를 결정하였다. 사두근 샘플을 면역조직화학적으로 분석하여, 자식작용 마커 미소관-결합 단백질 1A/1B-경쇄의 3개의 포스파티딜에탄올아민 접합체(LC3A II) 및 p62, 인슐린-의존적 글루코스 수송인자 GLUT4 및 인슐린-비의존적 글루코스 수송인자 GLUT1의 수준을 결정하였다.
유사한 연구에서, Gaa 녹아웃 마우스에 20 mg/kg의 재조합 인간 산 α-글루코시다제(알글루코시다제 알파 또는 ATB200)의 4회의 IV 볼루스 투여를 매격주 제공하였다. 대조군 마우스는 비히클을 단독으로 처리하였다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 최종 투여 2주 후에, 심근 조직을 채취하고, 과요오드산 - Schiff 시약(PAS)에 의해 염색함으로써, 글리코겐 수준에 대해 분석하고, LAMP1의 수준을 측정함으로써, 리소좀 증식에 대해 분석하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, ATB200의 투여는 알글루코시다제 알파에 의한 통상 처리와 비교하여, 심근, 횡경막 근육 및 골격근(비장근) 조직에서 리소좀 증식의 감소를 나타낸다. 추가로, 도 15에 도시된 바와 같이, ATB200의 투여는 알글루코시다제 알파에 의한 통상 처리와 비교하여, 심근 및 골격근(비장근) 조직에서 점상 글리코겐 수준의 감소를 나타낸다.
또한, 도 16에 도시된 바와 같이, ATB200은 미처리된 마우스 및 알글루코시다제 알파에 의해 처리된 마우스와 비교하여, Gaa 녹아웃 마우스의 사두근의 근섬유에서의 액포의 수를 유의하게 감소시킨다. 도 17에 도시된 바와 같이, 야생형 마우스와 비교하여, Gaa 녹아웃 마우스에서 LC3 II 및 p62 둘 모두의 수준이 증가한다. 추가로, 인슐린-의존적 글루코스 수송인자 GLUT4 및 인슐린-비의존적 글루코스 수송인자 GLUT1의 수준은 야생형 마우스와 비교하여, Gaa 녹아웃 마우스에서 증가한다. 산 α-글루코시다제 결핍증과 관련된 증가된 GLUT4 및 GLUT1 수준은 기저 상태 및 식후의 두 경우 모두에서, 근섬유로의 글루코스 흡수의 증가 및 글리코겐 합성의 증가에 기여할 수 있다.
효소 실시예 10: GAA-녹아웃 마우스에서의 근육의 기능
12회의 격주 투여의 더 장기간의 연구에서, 20 mg/kg ATB200 + 10 mg/kg 미글루스타트는 Gaa KO 마우스에서 기준일로부터 기능성 근력을 지속적으로 증가시켰으며, 이는 악력 및 와이어 매달리기 시험 둘 모두에 의해 측정되는 바와 같다(도 18a 및 도 18b). 동일한 ERT 투여량(20 mg/kg)이 제공된 알글루코시다제 알파(루미자임®)-처리 마우스는 대부분의 연구 전반에 걸쳐, 동일한 조건 하에서 저하하는 것으로 관찰되었다(도 18a 및 도 18b). 더 단기간의 연구에 의한 바와 같이, ATB200/미글루스타트는 3 개월(도 19a 내지 도 19c) 및 6 개월(도 19d 내지 도 19g)의 처리 후, 알글루코시다제 알파보다 실질적으로 더 양호한 글리코겐 배출률을 나타내었다. ATB200/미글루스타트는 또한 3 개월의 처리(도 20) 후, 알글루코시다제 알파와 비교하여, LAMP1 및 다이스페린의 자식작용 및 세포내 축적을 감소시켰다. 도 18a에서, *는 루미자임® 단독의 경우와 비교하여, 통계적으로 유의함을 나타낸다(p<0.05, 2-면 t-검정). 도 19a 내지 도 19g에서, *는 루미자임® 단독의 경우와 비교하여, 통계적으로 유의함을 나타낸다(p<0.05, 1-방 ANOVA 분석 하에 Dunnett 방법을 사용한 다중 비교).
종합하자면, 이들 데이터는, ATB200/미글루스타트가 세포 기능이상을 역전시키고, 근육 기능을 개선하기 위해, 근육으로 효율적으로 표적화됨을 시사한다. 중요하게는, 근육 구조물의 명백한 개선 및 LAMP1 및 다이스페린의 감소된 자식작용 및 세포내 축적은 기능성 근력의 개선과 연관된 개선된 근육 생리학의 좋은 대용물이 될 수 있다. 이들 결과는, 자식작용 및 이들 주요 근육 단백질의 모니터링이, Gaa KO 마우스에서 폼페병의 치료적 처리로서의 유효성을 평가하기 위한 합리적이고, 실용적인 방법이 될 수 있음을 시사하며, 이는 임상 연구의 근육 생검에서 유용한 바이오마커라고 할 수 있다.
도 20은, 미글루스타트의 존재 또는 부재 하에, 6개월의 ATB200의 투여가 Gaa KO 마우스에서 디스트로핀의 세포내 축적을 저하시킴을 도시한다. ATB200 ± 미글루스타트의 경우, 루미자임®에 의한 경우보다 디스트로핀 축적이 더 크게 감소하였다.
제형 실시예 1: PH 및 완충액
제형 실시예를 위한 분석 방법
외형, pH, 단백질 농도 등과 관련하여, 본 명세서에 기재된 실시예의 분석을 달리 명시되지 않는 한, 하기의 방법에 따라 수행하였다.
외형
투명도, 색상 및 가시 입자를 포함하는 샘플의 외관을 YB-2 라이트박스(lightbox)를 사용하여, 흑색 및 백색 백그라운드하에 조사하였다.
pH
샘플 pH를 SevenMulti™ pH 측정기에 의해 측정하였다.
단백질 농도
단백질 농도를 NanoDrop™ 2000 분광광도계를 사용하여, UV280 판독에 의해 결정하였다. 모든 측정은 각 시점에 2.5 μL 샘플에 의해 2회 반복하였으며, 평균을 취하였다.
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)
pH 및 완충액, 동결 해동 및 부형제 실시예에서, Agilent 1260 HPLC 시스템에서 TSKgel® G3000 SWXL 칼럼(Tosoh Bioscience, 7.8x300 mm, 5 μm, 25℃)를 사용하여, 단백질 단량체 및 그의 고 분자량 종 및 단편의 분리를 수행하였다. 이동상은 50 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨 및 20 mM 시트르산나트륨(pH 6.0±0.2)으로 이루어졌다. 크로마토그래피 시스템은 1.0 ml/분의 유속, 50 μL의 주사 용적(통상적으로 1 mg/mL) 및 등용매 구배의 20분의 구동 시간을 사용하였다. UV 검출기에 의해 280 nm(참조: 360 nm)에서 신호를 검출하였다.
PS80 실시예에서, Agilent 1260 HPLC 시스템에서 BioSep™-SEC-s3000 칼럼(Phenomenex, 7.8x300 mm, 5 μm, 25℃)을 사용하여, 단백질 단량체 및 그의 고 분자량 종 및 단편의 분리를 수행하였다. 이동상은 50 mM 인산나트륨 및 100 mM 염화나트륨(pH 6.0±0.2)으로 이루어졌다. 크로마토그래피 시스템은 1.15 ml/분의 유속, 50 μL의 주사 용적(통상적으로 1 mg/mL) 및 등용매 구배의 25분의 구동 시간을 사용하였다. UV 검출기에 의해 280 nm에서 신호를 검출하였다.
SDS-PAGE(비 환원)
기록 가능한 값은 비 환원성 SDS-PAGE에서의 단백질의 순도 및 분자량이다. 균일한 음전하를 얻기 위해, 과량의 SDS의 존재하에서 샘플을 비 환원성으로 변성시켰다. 인가된 전기장(165 V)에서, 이들 SDS-피복 종은 폴리아크릴아미드 겔을 통해, 겉보기 분자량을 기반으로 하여, 분리하였다. 분리된 밴드를 쿠마시 블루 염색(Coomassie Blue staining)에 의해 검출하였다.
4-MUG 효소 활성
10 μl의 샘플을 희석하고, 가수분해(GAA, 37℃, 60분)하여, 형광 산물 4-MU를 생성하였다. 반응을 중단시키기 위해, 반응 내에 125 μl의 1 M 글리신 또는 0.1 M NaOH를 첨가하였다.
일련의 4-MU 표준을 샘플로 분석하여, 형광 신호를 기반으로 한 표준 검정 곡선을 생성하였다. 4개의 파라미터 로지스틱 회귀 모델(parameter logistic regression model)에 따라 회귀된 표준 곡선과의 소프트웨어 매개 비교에 의해 4-MU 양으로의 RFU의 전환을 달성하였다. 그 후, 샘플 중의 GAA 효소 활성(nmol 4-MU 방출/hr/ml GAA)을 4-MU 표준 곡선을 기반으로 하여, 계산하였다.
4-MUG 효소 농도
10 μl의 샘플 및 GAA 참조 표준을 희석하고, 가수분해(GAA, 37℃, 60분)하여, 형광 산물 4-MU를 생성하였다. 반응을 중단시키기 위해, 반응 내에 125 μl의 1 M NaOH를 첨가하였다.
일련의 GAA 참조 표준을 샘플로 분석하여, 형광 신호를 기반으로 한 표준 검정 곡선을 생성하였다. 4개의 파라미터 로지스틱 회귀 모델에 따라 회귀된 표준 곡선과의 소프트웨어 매개 비교에 의해 4-MU 양으로의 RFU의 전환을 달성하였다. 그 후, 샘플 중의 GAA 효소 활성(nmol 4-MU 방출/hr/ml GAA)을 GAA 표준 곡선을 기반으로 하여, 계산하였다.
동적 광산란(DLS)
마이크로피펫을 사용하여, 희석되지 않은 샘플의 40 μL의 분취량을 40 μL 일회용 큐벳으로 운반하였다. 각각의 샘플에 대해, 3회 반복 측정을 수행하였다.
입자: HIAC
여과된 참조 완충액으로 각 샘플의 200 μl를 2000 μl로 희석하였다. 샘플을 3회 시험하였으며, 각각의 시험에서 450 μl를 사용하였다. ml 당, 1μm, 3 μm, 5 μm, 10 μm, 및 25 μm의 각각의 크기의 입자의 평균 수를 기록하였다.
MicroCal 시차 주사 열량계(DSC)
모세관 세포 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여, 온도의 함수로서 샘플 및 참조의 온도를 증가시키기 위해 요구되는 열량의 차이를 검출함으로써, 단백질의 열 안정성을 측정한다. 특히, 이는, 용액 중 단백질의 상대적 안정성의 지표인 열전도 중점(Tm)을 측정하기 위해, 사용된다.
참조 완충액으로 샘플을 약 1 mg/mL로 희석하였다. 96 웰 플레이트의 각각의 홀수 웰에는 참조 완충액의 400 μL의 분취량을 첨가하였으며, 상응하는 짝수 웰에는 각 샘플의 400 μL의 분취량을 첨가하였다. 주사 온도(scanning temperature)는 10℃ 내지 110℃의 범위이다.
변조 시차 주사 열량계(mDSC)
Netzsch 시차 주사 열량계(DSC 204 F1)를 사용하여, 유리 전이온도(Tg') 및 공융 온도(Te)를 시험하였다. 시험을 위해, 로딩 디스크에 15 μL의 샘플을 로딩하였다. 우선, 10 ℃/분의 속도로 20℃로부터 -60℃까지 온도를 저하시키고, 이 단계 동안, 냉각 곡선으로부터 Te 값을 얻었다. 두 번째로, 10 ℃/분의 속도로 -60℃로부터 40℃까지 온도를 증가시키고, 가열 곡선으로부터 Tg' 값을 분석하였다.
M6P
M6P를 가수분해(4 M TFA, 100℃, 4h)에 의해, 샘플로부터 방출시키고, 원심력 진공 증발기로 건조하였다. 건조된 M6P 및 참조 표준을 분석하기 전에 정제수 중에 현탁시켰다. CarboPac PA10 BioLCTM 분석 칼럼(4 mm x 250 mm, 3.5 μm, 100 Å, 30℃) 및 CarboPac PA10 BioLCGuard 칼럼(4 mm x 50 mm, 3.5 μm, 100 Å, 30℃)을 사용하였다. 이동상은 상 A(100 mM NaOH) 및 상 B(1M NaOAc, 100 mM NaOH)로 이루어졌다. 크로마토그래피 시스템은 1 ml/분의 유속, 25 μL의 주사 용적 및 구배의 30분의 구동 시간을 사용하였다. 펄스 전류 검출에 의해 신호를 검출하였다. 샘플 중 M6P 함량을 표준 곡선을 기반으로 하여 계산하였다.
시알산
가수분해(2 M HAc, 80℃, 2h)에 의해 약제 분자로부터 시알산을 방출시킨 후, 모든 샘플을 표지하고, 표준 용액과 DMB를 혼합(50℃, 17±0.5 h, 암소)한 다음, Agilent 1260 HPLC 시스템에서 Zorbax Eclipse Plus C18 칼럼(Agilent, 4.6 mmx100 mm, 3.5 μm, 45℃)을 사용하여, 분리시켰다. 이동상은 상 A(9% ACN, 7% MeOH) 및 상 B(100% ACN)로 이루어졌다. 크로마토그래피 시스템은 0.5 ml/분의 유속, 20 μL의 주사 용적 및 구배의 20분의 구동 시간을 사용하였다. 형광 검출기(λex=373 nm, λem=448 nm)에 의해 신호를 검출하였다. 샘플 중 Neu5Gc 및 Neu5Ac 함량을 표준 곡선을 기반으로 하여 계산하였다.
표 1에 제시된 바와 같이, 50 mM NaCl의 존재 또는 부재하의 25 mM 인산나트륨 또는 25 mM 시트르산나트륨을 함유하고, 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 갖는 10개의 완충액 제형을 제조하였다. ATB200 4-MUG 효소 농도는 1 mg/mL이었다.
[표 1]
샘플 제조
pH 및 완충액 평가 연구에 사용된 재료는 하기의 표 2에 기재된 바와 같다.
[표 2]
pH 4.0(P40), 5.0(P50), 6.0(P60), 7.0(P70), 및 8.0(P80)의 50 mM NaCl을 함유하는 25 mM 인산나트륨 완충액, pH 6.0(NaCl 부재하의 P60)의 25 mM 인산나트륨 완충액, 및 pH 5.0(C50), pH 5.5(C55), pH 6.0(C60) 및 pH 6.5(C65)의 50 mM NaCl을 함유하는 25 mM 시트르산나트륨 완충액을 제조하였다. pH 4.0의 경우, HCl을 사용하여, 인산나트륨 완충액 중 pH(pH 4.0)를 조정하였다.
우선, 15℃ 및 3500 rpm의 조건하에서 40분 동안 한외 여과 원심분리 장치를 사용하여, ATB200 효소 용액을 농축시켰다. 그 후, 농축된 효소 용액을 15℃ 및 3500 rpm에서 50분 및 55분 동안 2회의 한외 여과에 의해, 상기에 기재된 3개의 상이한 완충액으로 완충액 교환하였다. 후속하여, 완충액 교환 효소 용액을 단백질 농도 및 4-MUG 효소 농도에 대해 분석하였다.
마지막으로, 적절한 용적의 각각의 완충액을 첨가하여, 최종 ATB200 효소 농도를 1.0 mg/mL로 조정하였다. UV_A280 흡광도 및 4-MUG 효소 농도 둘 모두에 의해 최종 ATB200 농도를 확인하였다.
무균 상태에서 용액을 0.22 μm 폴리에테르술폰(PES) 필터로 여과하였다.
무균 상태에서, 각각의 제형을 분석 시험의 샘플 요구량에 따라 500 μL 내지 1000 μL의 충전 용적으로 생물 안전 후드(bio-safety hood)에서 2 mL 유리 바이알 내에 충전하였다. 바이알을 마개로 막은 후, 충전 직후에 크림프-오버실링(crimp-oversealing)하였다.
샘플 시험
각각의 제형의 바이알을 5℃ 및 40℃에서 최대 8주 동안 저장하고, 회전 진탕기에서 25℃에서 최대 5일 동안 100 rpm으로 교반하였다(표 3 참조). 표 3에 기재된 바와 같이, 외관, pH, UV 농도, 4-MUG 효소 농도, SEC, HIAC, DLS, 4-MUG 효소 활성, 및 DSC의 시험을 위해, 첫날(T0), 5일(5D), 2주(2W), 4주(4W) 및 8주(8W)에 제형을 샘플링하였다.
[표 3]
결과
열 안정성 결과 - MicroCal DSC
열 안정성 측정 결과가 하기의 표 4에 제시되어 있다:
[표 4]
더 높은 Tm개시는 특정 제형에서 단백질의 더 양호한 열 안정성을 나타낸다. 따라서, 가장 높은 열 안정성을 나타내는 제형은 P50, C55, C50, NaCl 부재하의 P60, P60 및 C60이었다. 이들 결과는 ATB200 효소가 염기성 조건에서보다 약산성 완충액에서 열 안정성이 더 양호함을 시사한다.
외관 - 교반
교반 연구의 외관 결과가 하기의 표 5에 제시되어 있다:
[표 5]
표로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 5일의 교반 후, NaCl 부재하의 P60, C50, C55, C60, 및 C65는 무색의 투명하고, 가시 입자를 무함유한 채 유지되었으나, P40, P50, P60, P70, 및 P80에서는 가시 입자가 관찰되었다. 이 데이터는 시트르산나트륨 완충액이 교반 후, 인산나트륨 완충액보다 제형을 더 안정화시켰다는 것을 보여준다.
pH
pH 측정 결과가 하기의 표 6에 제시되어 있다:
[표 6]
데이터로부터 인식되는 바와 같이, pH 5.0 내지 pH 6.5 범위의 50 mM NaCl을 갖는 인산염 및 시트르산염 완충액은 둘 모두 전체적으로 지정된 pH를 유지할 수 있었다. 완충액 교환, 농도 조정, 5℃ 및 40℃에서 8주 저장 및 교반 동안, 샘플의 pH에서 유의한 변화는 존재하지 않았다.
이와 달리, 5℃ 및 40℃ 둘 모두에서 8주 저장 후, NaCl 부재하의 P60에서 pH는 저하되었고, 완충액 교환 및 두 온도 모두에서 8주 저장 후, P40에서 pH는 증가하였다. 그러나, 교반은 P40 및 NaCl 부재하의 P60 둘 모두에서 pH의 임의의 변화를 야기하지 않았다.
단백질 농도
단백질 농도 측정의 결과가 하기의 표 7에 제시되어 있다:
[표 7]
5℃에서 8주 저장 및 5일 동안의 교반은 단백질 농도에 영향을 미치지 않았다. 모든 제형간에 유의한 변이는 관찰되지 않았다.
이와 달리, 40℃에서의 저장 동안, 단백질 농도는 P50, P60, NaCl 부재하의 P60, C60, 및 C65에서 약간 증가하였고, C50에서 약간 저하하였으며, P40, P70, P80, C55에서는 유지되었다. 40℃ 샘플에서 가시 입자가 형성되었으므로, 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한 후, 40℃/ 8주 샘플을 재시험하였다. 결과는 입자를 함유하는 샘플에서 원심분리 후, 단백질 농도가 하락한 것을 나타내며, 이는 샘플 내에 존재하는 입자가 280 nm에서의 흡착에 영향을 미친다는 것을 시사하였다.
4-MUG 효소 농도
4-MUG 효소 농도 측정의 결과가 하기의 표 8에 제시되어 있다:
[표 8]
완충액 교환 후, P80의 4-MUG 효소 농도는 즉시 0.27 mg/mL까지 하락하였다. 이는 pH 8.0이 효소 활성에 유의한 영향을 미친다는 것을 시사하였다. 5℃ 및 40℃ 둘 모두에서 2주 저장 후에는 효소 농도가 0까지 하락하였다. 5℃에서 8주 저장 후, P80을 제외하고, 대부분의 제형의 효소 농도는 안정적이었고, P40에서는 약간 하락하였다.
이와 달리, 40℃에서의 저장은 효소 농도에 명백하게 영향을 미쳤다. 2주 후에, 효소 농도는 P70에서 소진되었고, P40 및 C65에서는 급격히 하락하였으며, P50에서는 명백하게 저하하였다. 4주 후, 효소 농도는 계속 저하하였다. 마지막으로, 8주 후, 효소 농도는 P40 및 C65에서 거의 0이었고, pH 5.0 완충액(P50 및 C50)에서는 0.33 mg/mL까지 하락하였으며, pH 5.5 내지 pH 6.0 완충액(P60, NaCl 부재하의 P60, C55, 및 C60)에서는 0.5 mg/mL 내지 0.7 mg/mL까지 하락하였다. 그 중, NaCl 부재하의 P60이 최종적으로 가장 높은 효소 농도(0.73 mg/mL)를 가졌다. 결과는 효소 농도가 pH 5.5 내지 pH 6.0의 범위에서 4-MUG 효소 농도에 대해 가장 보존되었으나, 인산나트륨 완충액과 시트르산나트륨 완충액 사이에는 유의한 차이가 존재하지 않았음을 시사한다.
교반 연구 동안, P80을 제외하고, 효소 농도는 유의하게 변화하지 않았다.
4-MUG 효소 활성
4-MUG 효소 활성 측정의 결과가 하기의 표 9에 제시되어 있다:
[표 9]
4-MUG 효소 활성 변화 경향은 4-MUG 효소 농도의 변화 경향과 근사하였다.
P80은 시험 조건하에서 4-MUG 효소 활성에서 최저의 안정성을 나타내었다. P80의 효소 활성은 완충액 교환 후, 약 70% 저하하였다. 그 후, 효소 활성은 5℃ 및 40℃에서 2주 저장 후, 거의 완전히 소실되었다. 염기성 조건은 효소 활성에 유의한 영향을 미쳤다.
5℃에서 8주 저장 후, PS80의 효소 활성은 거의 완전히 소실되었고; P40에서는 20%의 저하가 나타났으며; 다른 제형에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
이와 달리, 40℃에서의 저장은 모든 제형에서 효소 활성의 명백한 저하를 야기하였다. 2주 후, 효소 활성은 P70에서 거의 완전히 소실되었고, P40 및 C65에서는 급격히 저하하였으며, P50에서는 명백하게 하락하였다. 효소 활성은 2주에서 4주까지 상이한 정도로 계속 저하하였다. 연구의 종결시, 효소 활성은 C65에서 거의 완전히 소실되었고, P40에서는 211.5 U/L로, P50 및 C50에서는 약 1550 U/L로, C60, P60 및 C55에서는 2500 U/L 내지 3000 U/L까지 하락하였다. 제형 중, NaCl 부재하의 P60은 3549.7 U/L의 가장 높은 활성을 유지하였다.
4-MUG 효소 활성의 시험 결과를 기반으로 하여, 효소는 pH 5.5 내지 pH 6.0 범위의 pH에서 가장 안정화되었으나, 인산나트륨 완충액과 시트르산나트륨 완충액 사이는 차별성이 나타나지 않았다.
순도: SEC-HPLC
SEC 측정의 결과가 하기의 표 10에 제시되어 있다:
[표 10]
완충액 교환 후, 일부 제형의 SEC 순도는 출발 물질(SEC 단량체: 98.9%)과 비교하여, 유의하게 저하하였다. P80에서, SEC의 순도는 44.9%까지 하락하였고, 54.5%의 응집체가 형성되었고; P40에서는, 교환 전 DS와 비교하여, 단량체 백분율이 4.9% 저하하였고, LMW 단편이 HMW 분자보다 더 많이 형성되었고(4.7% VS 1.3%); P70에서는, 단량체 백분율에서 약간의 저하(1.2%)가 나타났고, 이는 응집체의 증가에 상응하며; NaCl 부재하의 P60에서는 단량체 백분율이 2.3% 저하하였다.
5℃에서 8주 저장 후, 제형 P60, NaCl 부재하의 P60, 및 C65의 SEC 순도는 잘 유지되었으나, 다른 제형의 SEC 순도는 T0와 비교하여, 유의하게 저하하였다. P40에서, SEC의 순도는 74.3%(T0: 94.0%)까지 급격하게 하락하였고, 23.4%의 LMW 단편이 형성되었고; P50 및 C50에서는 단량체가 약간 저하(5% 내지 7%)하였으며, LMW 단편은 증가(5% 내지 7%)하였다. P80에서, 18.2%의 저하가 나타났으며, 이는 주로 응집으로 전이되었다(14.8 %). P70에서 역시, 단량체가 10.7% 저하하였고, HMW 단편이 9.2% 증가하였다. C55에서는 단량체, HMW 및 LMW 백분율이 약간 변화하였다.
40℃에서의 저장은 모든 제형에서 급격한 단량체 백분율 변화를 야기하였다. P70 및 P80에서, SEC 단량체는 2주 후에 0% 내지 0.5%까지 하락하였고, C65에서는 22.4%가 잔류하였으며, 이들 대부분은 8주 후에 응집체로 변하였다. P40, P50 및 C50에서, 주로 LMW 단편의 형성에 기인한 것으로, 단량체가 유의하게 하락(50% 내지 90%)하였다. P60, NaCl 부재하의 P60, 및 C60에서, 8주 후에 SEC 단량체 백분율은 각각 80.8%, 83.6% 및 77.5%까지 저하하였다.
SEC 결과는 pH 6.0이 ATB200 안정성을 위해, 가장 적격으로 수행되었고, 인산나트륨 완충액과 시트르산나트륨 완충액 사이에는 유의한 차이가 나타나지 않았음을 시사하였다. 추가로, 제형 내 염화나트륨의 부재는 ATB200 안정성에 영향을 미치지 않았다.
교반 연구 동안, SEC 순도는 P60 및 NaCl 부재하의 P60에서 약간 저하하였다. P40, P50, P70, P80, C50, C60 및 C65에서, 단량체 퍼센트가 명백하게 저하하였다.
다분산성: DLS
DLS 측정의 결과가 하기의 표 11에 제시되어 있다:
[표 11]
DLS 데이터는 단백질 분자의 유체역학적 반경 및 입자의 다분산성을 반영하였다. 일부 샘플에서는 유백광이 관찰되었으므로, DLS를 사용하여, 가시 이하 입자를 분석하였다. DLS 결과는 일반적으로 외관으로부터 나타난 것과 일치하였다.
5℃에서 8주 저장 동안, 단백질 분자의 유체역학적 반경 및 다분산 지수(PDI)는 둘 모두 P60, P70, P80, NaCl 부재하의 P60 및 C60에서 안정하였으며, 근사하였다. 유체역학적 반경은 8주 후, 다른 모든 5개의 제형에서, 특히 P40에서 약 10 nm로부터 수백 nm까지 변하였다.
40℃에서 8주 저장 동안, 모든 제형에서 유체역학적 반경 및 PDI가 급격하게 변화하였다. 그러나, 응집체의 복합 프로파일로 인해, 결과를 기반으로 하여, 이들 제형을 비교하는 것은 어렵다.
교반 연구에서, P80의 유체역학적 반경 및 PDI는 급격하게 증가하였고; P40, P50 및 C50에서는 유체역학적 반경 및 PDI가 약간 증가하였으며; P60, P70, NaCl 부재하의 P60, C55, C60, 및 C65에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
상기 모든 DLS 데이터에 따르면, P60, P70, NaCl 부재하의 P60, C55, C60, 및 C65가 P40, P50, P80, 및 C50보다 더 양호하였다.
입자: HIAC
교반 연구의 HIAC 측정의 결과가 하기의 표 12에 제시되어 있다:
[표 12]
교반 연구 동안, P70은 25℃에서 5일 동안 교반 후에 입자 수가 유의하게 증가하였으며, 다른 모든 제형은 입자 수가 근사하였다.
요약
전체적으로, P60 및 C60은 다른 것들과 비교하여, 가장 안정한 제형으로 현격하였다. 따라서, ATB200은 5.0 내지 6.0의 범위에서 가장 안정한 것으로 결론지었다. 그러나, 인산염 완충액과 시트르산염 완충액 사이에 차별성을 식별할 수 없었다. 추가로, 제형 내의 염화나트륨의 부재는 ATB200 안정성에 유의한 영향을 나타내지 않았다.
제형 실시예 2: 동결-해동
3개의 제형을 동결-해동 공정 동안 안정성에 대해 평가하였다. 3개의 제형은 하기의 표 13에 요약되어 있다. ATB200 효소의 표적 농도는 5 mg/mL였다.
[표 13]
샘플 제조
투석 카세트(20000 MWCO)를 사용하여, ATB200 DS를 3개의 제형 완충액으로 완충액 교환하였다. 5℃에서 부드럽게 교반하면서, 투석을 수행하였으며, 각각 6시간 내지 10 시간마다 1회씩 3회의 완충액 교환을 사용하였다.
각 투석 후, 적절한 용적의 제형 완충액을 첨가하여, 최종 UV 농도를 5 mg/mL로 조정하였다. 그 후, 용액을 무균 상태에서 0.22 μm PES 필터로 여과하였다. 그 후, 각 제형을 분석 시험의 샘플 요구량에 따라 500 μL 내지 1000 μL의 충전 용적으로 생물 안전 후드에서 2 mL 유리 바이알 내에 충전하였다. 바이알을 마개로 막은 후, 충전 직후에 크림프-오버실링하였다.
동결-해동 전에, 각 제형에 대해 바이알을 취하고, 잔여 샘플 바이알을 설계된 동결-해동 주기에 적용하였다. 동결-해동 후, 소정의 샘플링 시점에 샘플 바이알을 취하였다.
샘플 시험
3회의 동결-해동 공정을 하기에 열거된 바와 같이 시험하였다:
공정 1: 비 제어 동결 및 해동. 샘플을 -80℃ 냉동고에서 동결시키고, 25℃ 챔버에서 해동시켰다.
공정 2: 제어 동결 및 비 제어 해동. 샘플을 Frosty 용기 내에 배치하고, -80℃ 냉동고에서 동결시켰다. Frosty 용기는 1 ℃/분의 제어 동결 속도를 달성하기 위해, 이소프로판올을 사용하였다. Frosty 용기를 25℃ 챔버에 배치하여, 샘플을 해동시켰다. 온도 증가 속도는 대략 1 ℃/분이었다.
공정 3: 제어 동결 및 해동. 동결건조기를 사용하여, 샘플을 동결하고, 해동시켰다. 동결 동안 달성된 최저 샘플 온도는 -47℃였다. 샘플 온도는 최대 25℃까지 도달하였다. 동결 및 해동 둘 모두의 경우, 온도 변화 속도를 약 0.5 ℃/분으로 제어하였다. 반복 실험에 의해, 결과를 확인하였다.
5회 또는 3회의 동결-해동 주기를 각각의 공정을 사용하여, 수행하였다. 동결-해동 전 및 후의 샘플에 대해 하기의 시험을 수행하였다: 외관, 농도(UV & 효소) 및 SEC-HPLC. 시험 파라미터의 요약이 하기의 표 14에 이어진다:
[표 14]
결과
외관 - 제1회
제1회의 외관 측정의 결과가 하기의 표 15A 및 표 15B에 제시되어 있다:
[표 15A]
[표 15B]
T0(동결-해동 전)에서, 참조로서 상응하는 제형 완충액을 사용한 경우, 모든 제형은 무색이고, 약간 유백광이며, 가시 입자를 무함유하는 것으로 나타났다.
5 주기의 고속 동결-해동(공정 1) 후, 모든 제형은 그의 T0와 비교하여, 더 많은 가시 입자를 함유하는 것으로 나타났다. CP60은 5 FT 후에, 3개 중 가장 적은 입자를 함유하였다.
5 주기의 저속 동결-해동(공정 2) 후, 모든 제형은 T0보다 더 많은 가시 입자를 함유하는 것으로 나타났으나, 공정 1에 의해 처리된 것보다 더 적었다. 1 FT 주기 후 P60 및 C60 샘플에서 보다 5 FT 주기 후 CP60 샘플에서 더 적은 입자가 관찰되었다.
3 주기의 저속 동결-해동(공정 3) 후, 모든 제형은 T0보다 더 많은 가시 입자를 갖는 것으로 나타났다. 3개의 제형 간에 차이는 존재하지 않았다.
외관 - 제2회
제2회의 외관 측정의 결과가 하기의 표 23에 제시되어 있다:
[표 16]
제2회의 저속 동결-해동(공정 3) 후, 제1회보다 더 많은 FT 주기를 수행하였다. 5 FT 후 P60에서 T0와 비교하여, 다수의 가시 입자가 나타났으나, C60 및 CP60 둘 모두에서는 소수의 입자가 관찰되었다.
4-MUG 효소 농도 및 활성
4-MUG 효소 농도 및 활성 측정의 결과가 표 17(공정 1 및 2 및 제1회의 공정 3) 및 표 18(제2회의 공정 3)에 제시되어 있다:
[표 17]
[표 18]
5 주기의 고속 동결-해동(공정 1) 후, P60에서, T0 샘플과 비교하여, 4-MUG 효소 농도가 약간 저하된 것으로 관찰되었으나, C60 및 CP60에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
Frosty 용기를 사용한 5 주기의 저속 동결-해동(공정 2) 후, 3개의 제형 중 어느 것에서도 T0 샘플과 비교하여, 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
동결건조기를 사용한 3 주기의 저속 동결-해동(공정 3) 후, T0와 비교하여, P60 및 CP60 둘 모두에서 분명한 효소 농도 저하가 존재하였으나, C60에서는 유의한 변화가 없었다. 공정 3에 의한 동결-해동을 5 주기로 반복하였으며, 동일한 경향이 관찰되었다. 1 주기의 F/T 후, P60 샘플의 효소 농도는 18.8% 하락하였으며, 3 주기(53.1% 저하) 및 5 주기(68.9% 저하) 후에는 더 악화되었다. CP60에서, 3 주기 후, 효소 농도가 하락하기 시작하였으며, 최종적으로, 5 주기 후, P60과 동일한 수준까지 저하하였다. C60에서, 5 주기의 저속 동결-해동 후, 거의 변화하지 않았다.
4-MUG 효소 농도 결과는, 동결/가열 속도, F/T 주기 횟수 및 및 완충액 유형이 ATB200 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 시트르산염 완충액 시스템(C60)은 사용된 동결-해동 공정에 상관없이, 양호한 안정화 효과를 제공하였다.
4-MUG 효소 활성 변화 경향은 4-MUG 효소 농도와 동일하였다.
고속 동결-해동 연구(공정 1) 동안, 5 주기 후 P60에서 효소 활성에서의 약간의 저하가 발생했으며, C60 및 CP60에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
1 ℃/분 온도 변화에 의한 저속 동결-해동 연구(공정 2) 동안 어느 샘플에서도 분명한 변화가 관찰되지 않았다.
동결건조기에 의한 저속 동결-해동 연구(공정 3)에서, P60에서 효소 활성이 분명하게 저하하였으며, CP60에서는 약간 저하하였다. 그러나, C60에서는 거의 변화하지 않았다. 제2회의 공정 3 저속 동결-해동 연구 동안, P60의 효소 활성은 1 주기 후 19.1%, 3 주기 후 54.1% 및 5 주기 후 71.2% 저하하였다. CP60에서, 효소 활성은 3 주기 후 하락하기 시작하였으며, 5 주기 후, P60과 유사한 수준까지 하락하였다. C60에서는 5 주기 후 극히 적은 정도로 변화하였다.
순도: SEC-HPLC
순도 측정의 결과가 하기의 표 20(공정 1 및 2 및 제1회의 공정 3) 및 표 21(제2회의 공정 3)에 제시되어 있다:
[표 20]
[표 21]
최대 5 주기의 고속 F/T(공정 1) 또는 저속 F/T(공정 2) 후, 어느 샘플에서도 SEC 단량체 백분율 변화가 검출되지 않았다.
제1 저속 F/T 연구(공정 3)에서, P60 샘플은 3 주기 후 분명한 SEC 단량체 백분율 저감(주로, HMW 종의 형성으로 인함)을 나타냈다. C60 및 CP60에서는 분명한 변화가 발생하지 않았다. 제2 공정 3 저속 F/T 연구(0.5 ℃/분)에서, 1 주기 후, P60 샘플의 단량체가 하락하기 시작하였으며, 최종적으로 5 주기 후, 68.1% 하락하였다. 그리고, CP60에서, 단량체 백분율은 3 주기 후 하락하기 시작하였으나, 이는 P60보다 훨씬 더 적은 정도였으나; 5 주기 후, P60과 동일한 수준에 도달하였다. C60에서는 최대 5 주기 후 단량체 백분율이 변화하지 않았다.
SEC 순도 결과는 효소 농도 및 활성에서의 성능과 일치하였고, 이는 동결/가열 속도, F/T 주기 횟수 및 완충액 유형이 동결-해동 공정 동안 ATB200 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. SEC 결과를 기반으로 하여, 인산나트륨을 함유하는 완충액은 또한 동결-해동 주기 동안 ATB200을 보호하지 못했다.
요약
시트르산염 완충액(C60) 중에 제형화된 ATB200은 다수의 동결-해동 주기를 다른 2개의 완충액(P60 및 CP60)보다 더 잘 견뎌냈다. 동결-해동 공정에 상관없이, ATB200은 시트르산염 완충액 중에서 안정하게 유지되었다.
제형 실시예 3: 부형제
8개의 제형(E1-8)을 다양한 부형제로 제조하였다. 부형제 평가 연구에서, ATB200 효소 농도는 5 mg/mL였다. 하기의 표 22에 기재된 제형 중 단백질 안정성을 평가하기 위해, 3개의 완충액, 2개의 안정화제 및 하나의 계면활성제를 선택하였다.
[표 22]
샘플 제조
pH 6.0의 50 mM NaCl을 함유하는 25 mM 인산나트륨 완충액, pH 6.0의 50 mM NaCl을 함유하는 25 mM 시트르산나트륨 완충액, 및 pH 6.0의 50 mM NaCl을 함유하는 25 mM 인산나트륨-시트르산나트륨 조합 완충액을 별도로 제조하였다. ATB200 효소 용액을 투석 카세트를 사용하여, 3개의 완충액 내로 교환하였다. 각각 6시간 내지 10시간 마다 1회씩 3개의 완충액을 변화시키고, 부드럽게 교반하면서, 5℃에서 투석을 수행하였다.
투석 후, 트레할로스, 만니톨 또는 PS80을 투석물에 첨가하여, 표 22에 열거된 바와 같은 제형을 제조하였다. 최종적으로, 적절한 용적의 제형 완충액을 첨가하여, 최종 ATB200 농도를 5 mg/mL로 조정하였다. 용액을 무균 상태에서 0.22 μm PES 필터로 여과하였다.
각 제형을 무균 상태에서 약 1 mL 충전 용적으로 생물 안전 후드에서 2 mL 유리 바이알 내에 충전하였다.
샘플 시험
제형 E1-8을 4개의 상이한 조건하에서 시험하였다. 각 제형의 바이알을 5℃에서 12주(12W) 동안, 40℃에서 8주(8W) 동안 저장하고, 5 주기 동안 동결-해동(0.5 ℃/분)시키고, 25℃에서 5일 동안 100 rpm으로 교반하였다. 샘플링 및 시험 계획이 표 23에 기재되어 있다. 첫날(T0), 2주(2W), 4주(4W), 8주(8W) 및 12주(12W)에 샘플을 시험하였다.
[표 23]
결과
외관
동결-해동 연구 측정의 외관 결과가 하기의 표 24(냉장고 사용) 및 표 25(동결건조기 사용)에 제시되어 있다:
[표 24]
[표 25]
동결-해동 연구 동안, PS80을 함유하지 않는 E5 및 E6에서 동결-해동 주기의 증가에 따라, 가시 입자가 약간 증가하였다. 다른 제형에서는 차이가 관찰되지 않았다.
요약
동결-해동 연구에서, PS80을 함유하는 제형뿐만 아니라, PS80을 무함유하는 제형(E5 및 E6)은 성능을 발휘하지 못했으며, 이는 다수의 동결-해동 주기 후, 가시 입자의 형성에 의해 입증되었다.
제형 실시예 4: 인간 전혈에서의 용혈
인간 공여체로부터의 혈액의 연속 희석(1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 및 1:10)을 식염수 중에서 제조하였다. 탈이온수와 혼합하는 경우, 0.8 내지 1.2의 540 nm에서의 OD를 야기하는 희석을 분석에 사용하였으며, 이는 혈액 기질로 지칭된다. 시험 품목, 위약, 양성 대조군 및 음성 대조군의 4개의 유형의 샘플을 시험하였다. 시험 품목을 pH 6.0에서 25mM 시트르산나트륨, 2% 만니톨 및 0.05 % 폴리소르베이트 80을 함유하는 제형 중 ATB200 rhGAA를 특징으로 하였다. 위약은 ATB200 rhGAA가 부재하는 것을 제외하고는 시험 품목과 동일하였다. 양성 대조군 품목은 주사용 멸균 수이고, pH는 5였다. 음성 대조군은 식염수(0.9 NaCl)이었고, pH는 5였다.
식염수를 함유하는 300, 600 및 1000 μg/ml의 시험 품목(ATB200), 식염수를 함유하는 위약, 음성 대조군(식염수) 및 양성 대조군(물)을 인간 공여체로부터의 혈액 기질과 혼합하였다. 샘플을 37℃에서 1시간 동안 교반 부재하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 대략 100x g로 10분 동안 원심분리하였다. 각 샘플의 상청액 중 헤모글로빈의 양을 540 nm에서 분광광도계로 분석하였다.
시험 품목의 용혈 퍼센트를 하기 식에 의해 결정하였다:
물 + 혈액의 용혈 퍼센트는 100%이다. 음성 대조군은 식염수였다. 10% 이하의 용혈은 유의하지 않은 것으로 간주하였다. 각 시험 품목의 농도 및 위약의 용혈 퍼센트를 계산하였다.
하기의 표 26은 시험된 샘플의 결과를 제시한다.
[표 26]
3개의 시험 품목 투여량과 동일한 비율로 식염수 중에 희석한 위약의 3개의 샘플과 인간 혈액 기질의 인큐베이션은 인간 혈액의 임의의 유의한 용혈을 야기하지 않았다. 위약-희석 샘플의 용혈 퍼센트는 각각 -1.3%, -1.3% 및 0.9%로 계산되었다. 300, 600 및 1000 μg/ml의 ATB200과 인간 혈액 기질의 인큐베이션은 인간 혈액의 임의의 유의한 용혈을 야기하지 않았다. 시험 품목 샘플의 용혈 퍼센트는 각각 -0.1%, -1.5% 및 -1.5%로 계산되었다.
결론적으로, ATB200 제형은 모든 희석에서 인간 혈액과 상용성이었다.
제형 실시예 5: 인간 혈장 및 혈청에서의 엉김
시험 품목 투여 용액(3가지 농도) 및 위약(3가지 농도)을 공여체로부터의 인간 혈장 및 혈청의 동일한 용적과 혼합하였다. 시험 품목은 pH 6.0에서 25mM 시트르산나트륨, 2% 만니톨 및 0.05 % 폴리소르베이트 80을 함유하는 제형 중 ATB200 rhGAA를 특징으로 하였다. 위약은 ATB200 rhGAA가 부재하는 것을 제외하고는 시험 품목과 동일하였다.
시험 품목 또는 위약의 각 투여량 1 ml를 동일한 용적의 혈장, 혈청 및 식염수와 혼합하였다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 튜브를 거시적으로 및 현미경으로 침전 또는 응고에 대해 육안으로 및 현미경으로 조사하였다. 각 튜브의 분취량을 10분 동안 미세원심분리기에서 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 각 튜브를 펠릿의 존재 또는 부재에 대해 조사하였다. 침전/응고 및 펠릿을 하기와 같이 점수화하였다:
0 = 음성
1 = 매우 약간의 침전 또는 펠릿
2 = 최소 침전 또는 펠릿
3 = 중간 정도의 침전 또는 펠릿
4 = 유의한 침전 또는 펠릿
하기의 표 27은 시험된 샘플의 결과를 제시한다.
[표 27]
각각의 ATB200 농도와 혼합하는 경우, 인간 혈장 또는 혈청에서 육안으로 또는 현미경으로 침전이 관찰되지 않았다. 위약 샘플에는 침전이 나타나지 않았다. 모든 위약 또는 ATB200 샘플을 원심분리한 경우, 펠렛은 관찰되지 않았다.
이 연구의 결과를 기반으로 하여, ATB200 제형은 1000 μg/ml의 최종 농도까지 및 이를 포함하여, 인간 혈장 및 혈청과 상용성인 것으로 나타났다.
실시예: 폼페병이 있는 ERT-체험 환자 및 ERT-나이브(naive) 환자에서 미글루스타트와 공동 투여된 재조합 산 A-글루코시다제 ATB200에 대한 약동학 및 안전성 데이터
이 연구는 미글루스타트와 공동 투여된 ATB200의 안전성, 내성 및 약동학(PK)을 주로 평가하기 위해 설계되었다. Gaa 녹아웃 마우스로부터의 PK/약역학(PD) 판독 모델은 인간에서 고 투여량(예를 들어, 260 mg)의 미글루스타트와 ATB200 20 mg/kg의 조합이 최적의 글리코겐 감소를 제공할 것으로 예측하였다.
하기의 기재내용에서, "고 투여량"의 미글루스타트는 약 260 mg의 투여량을 지칭하고, "저 투여량"의 미글루스타트는 약 130 mg의 투여량을 지칭한다.
이 단계 1/2 연구의 목적은 이 단계에서 10명의 환자로부터의 총 예비 GAA 단백질, ATB200 및 미글루스타트 PK 데이터 및 안전성 마커를 평가하기 위한 것이었다.
이는 폼페병을 갖는 성인에서, 경구용 미글루스타트와 공동 투여된 ATB200의 정맥내 주입의 안전성, 내성, PK, PD, 및 효능을 평가하기 위한 공개-표지 일정-순서 상승-투여량 최초 인체 단계 1/2 연구이다(도 21). 9회차 방문을 통해, 처음 8명의 코호트 1 환자 및 처음 2명의 코호트 3 환자로부터 평균 총 GAA 단백질 및 미글루스타트 PK 결과를 평가하였다.
a코호트 2 및 3에서 투여 전에 각각의 투여량 수준에서 코호트 1로부터의 2명의 센티넬 환자(sentinel patient)로부터의 안전성 데이터를 검토하였다.
b2기 및 3기 동안, ATB200 정맥내 주입의 개시 전에, 미글루스타트를 경구 투여하였다. 모든 투여량에서, ATB200을 4시간의 지속기간 동안 정맥내 주입하였다.
c코호트 2 및 3에서 처음 2명의 환자가 그들 각각의 코호트에 대해 센티넬 환자로서 수행한다.
주요 포함 기준:
·GAA 유전자형 분석에 의하거나, 기록된 GAA 효소 활성 결핍증을 기반으로 하여, 폼페병으로 진단된 18세 내지 65세의 남성 및 여성.
·시험 개시 전에 2년 내지 6년(또는 코호트 2의 경우, 2년 이상) 동안 알글루코시다제 알파와 ERT를 받았다(코호트 1).
·현재 매격주의 빈도로 알글루코시다제 알파를 받고 있으며, 투여 중지를 야기하는 약제 관련 부작용 없이 최종 2회의 주입을 완료하였다(코호트 1 및 2).
·6분 보행 시험에서 200 미터 내지 500 미터의 보행이 가능하여야 한다(코호트 1 및 3).
·직립 노력성폐활량(upright forced vital capacity)은 예측된 정상 값의 30% 내지 80%여야 한다(코호트 1 및 3).
·휠체어 의존적이고, 보조없이 보행이 불가능하여야 한다(코호트 2).
PK 분석:
·혈장의 총 GAA 단백질 및 활성 농도용 혈액 샘플을 채혈하였다.
·1기: ATB200 주입 개시 전 및 주입 개시 후 1, 2, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 8, 10, 12, 및 24시간(들)째.
·2기 및 3기: 미글루스타트 경구 투여 후 1, 2, 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 및 25시간(들)째.
·미글루스타트 경구 투여 직전(0시간) 및 미글루스타트 경구 투여 후 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 9, 11, 및 25시간(들)째에 혈장 미글루스타트 농도용 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈장 미글루스타트를 검증된 LC-MS/MS 분석에 의해 결정한다.
·ATB200 5, 10, 및 20 mg/kg의 경우, 혈장 중 총 GAA 단백질 농도를 rhGAA-특이적 "특징" 펩티드(들)의 검증된 LC-MS/MS 정량화에 의해 결정하였다.
1기 및 2기를 완료한 코호트 1의 8명의 환자 및 3기가 개시된 코호트 3의 2명의 환자에서 예비 분석을 완료하였다.
·첫 번째 ERT-교체 환자가 폼페병 집단의 대표 예이며, 평균 5.02년 동안 ERT를 받았다(표 28).
[표 28]
총 GAA 단백질
단독으로 제공되는 경우, ATB200은 투여량 비례보다 다소 더 큰 방식으로 증가한다(표 29 및 도 22a 내지 도 22d). 변동성은 미글루스타트 투여량에 따라 증가하는 것으로 나타난다(도 22C). 고 투여량의 미글루스타트(260 mg)와 ATB200 20 mg/kg의 공동 투여는 20 mg/kg의 ATB200 단독의 경우에 대비하여, 총 GAA 단백질 노출(AUC)을 대략 25%만큼 증가시켰다. 분포 반감기(α-단계)는 45%만큼 증가하였으며, 이는 고 투여량의 미글루스타트가 혈장 중 ATB200을 안정화시킨다는 것을 시사한다. 분포 반감기의 증가는 최대 혈장 농도 시간에서 투여 후 대략 12시간째까지의 AUC에서의 증가를 수반한다. AUC 및 반감기에서의 증가는 말단 제거 단계 동안 로그 척도로 관찰할 수 있다(도 22b). ATB200은 상대적으로 고 용적의 분포를 나타내었다. 혈장의 총 GAA 단백질의 배열은 ERT-나이브(코호트 3) 환자와 ERT-채험 환자(코호트 1) 사이에서 유사하게 나타난다(도 22a 및 도 22d).
[표 29]
미글루스타트 PK
미글루스타트는 투여량-비례 속도론이 입증되었다(표 30 및 도 23). 혈장 미글루스타트는 단일 투여량과 다회 투여량 사이에 유사한 것으로 나타난다.
[표 30]
약역학
코호트 1로부터의 ERT-채험 환자의 11회차 방문시(도 24a 및 도 24b):
·알라닌 아미노기 전달효소(ALT)는 8명의 환자 중 5명에서 저하하였고; 증가된 기준일 수준을 가진 4/4의 환자를 정규화하였다.
·아스파르트산염 아미노기 전달효소(AST)는 8명의 환자 중 6명에서 저하하였고; 증가된 기준일 수준을 가진 3/4의 환자를 정규화하였다.
·크레아티닌 포스포키나제(CPK)는 8명의 환자 중 6명에서 저하하였고; 증가된 기준일 수준을 가진 2/6의 환자를 정규화하였다.
· 소변 글루코스 사당류(HEX4) 수준은 8명의 환자 중 8명에서 저하하였다.
4주차에, 4개의 바이오마커 수준 모두가 처리-나이브 코호트(코호트 3)의 2명의 환자에서 저하하였다(도 24c 및 도 24d).
도 24a 내지 도 24d에서, 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 표시된다.
안전성
·모든 환자에서 155+ 총 주입 후, 중증 부작용(AE) 또는 주입-관련 반응이 보고된 바 없다.
·11/13(84%)의 환자에서 보고된 치료-응급 AE는 일반적으로 경미하고, 일시적인 것이었다.
·7/13(53%)의 환자에서 보고된 치료-관련 AE: 메스꺼움(n=1), 피로(n=1), 두통(n=1), 떨림(n=2), 여드름(n=1), 빈맥(n=1), 및 저혈압(n=1).
결론
·ATB200 단독의 경우 및 미글루스타트와 조합된 경우는 안전하고, 잘 내약되었으며, 현재까지 주입-관련 반응은 존재하지 않았다.
·ATB200 단독의 경우는 노출시 투여량 비례보다 더 큰 증가를 나타내었고, 미글루스타트에 의해 추가로 증대되었으며, 이는 ATB200에 대한 샤프론의 안정화 효과를 시사한다.
·표준 치료에서 ATB200/미글루스타트로 교체한 후, 환자들은 일반적으로 근육 손상의 바이오마커가 개선된 것으로 나타났으며, 많은 환자들이 18주까지 정상화된 것으로 나타났다.
·ATB200/미글루스타트로 처리된 처음 2명의 치료-나이브 환자는 근육 손상 바이오마커 모두에서 강력한 감소를 나타내었다.
서열
SEQUENCE LISTING <110> Amicus Therapeutics, Inc. <120> FORMULATIONS COMPRISING RECOMBINANT ACID ALPHA-GLUCOSIDASE <130> AT-P8700-PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 952 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val 465 470 475 480 Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe 500 505 510 Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly 515 520 525 Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile 740 745 750 Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro 755 760 765 Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly 770 775 780 Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser 785 790 795 800 Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val 805 810 815 His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr 820 825 830 Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr 835 840 845 Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala 865 870 875 880 Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly 885 890 895 Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala 900 905 910 Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950 <210> 2 <211> 896 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser 20 25 30 Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu 35 40 45 Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala 50 55 60 Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg 100 105 110 Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys 115 120 125 Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val 130 135 140 His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu 165 170 175 Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn 210 215 220 Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro 225 230 235 240 Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu 245 250 255 Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu 260 265 270 Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly 275 280 285 Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr 290 295 300 Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr 325 330 335 Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met 340 345 350 Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe 355 360 365 Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met 370 375 380 Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg 385 390 395 400 Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr 405 410 415 Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro 420 425 430 Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala 435 440 445 Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn 450 455 460 Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn 465 470 475 480 Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu 485 490 495 Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His 500 505 510 Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His 515 520 525 Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg 530 535 540 Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp 545 550 555 560 Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu 565 570 575 Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly 580 585 590 Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu 595 600 605 Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu 610 615 620 Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg 625 630 635 640 Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu 645 650 655 Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe 660 665 670 Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu 675 680 685 Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys 690 695 700 Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln 705 710 715 720 Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala 725 730 735 Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro 740 745 750 Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile 755 760 765 Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro 770 775 780 Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu 785 790 795 800 Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala 805 810 815 Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu 820 825 830 Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val 835 840 845 Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly 850 855 860 Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp 865 870 875 880 Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 885 890 895

Claims (1)

  1. (a) 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA) 분자의 집단으로서, 상기 rhGAA 분자는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, rhGAA 분자가 각각 SEQ ID NO: 2의 N84, N177, N334, N414, N596, N826, 및 N869에 상응하는 아미노산에서 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 50%가 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 이중-만노스-6-인산염(이중-M6P)을 보유하는 글리칸을 포함하는 것인, rhGAA 분자의 집단;
    (b) 시트르산염 완충액, 인산염 완충액, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 1종의 완충액; 및
    (c) 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 부형제
    를 포함하고, pH 5.0 내지 pH 7.0을 갖는 약제학적 제형을 사용하여 인간을 치료하는 방법.
KR1020237044402A 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형 KR20240001291A (ko)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662315436P 2016-03-30 2016-03-30
US62/315,436 2016-03-30
US201762457588P 2017-02-10 2017-02-10
US62/457,588 2017-02-10
US15/473,999 US10512676B2 (en) 2016-03-30 2017-03-30 Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
KR1020227031739A KR102618519B1 (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형
PCT/US2017/024982 WO2017173060A1 (en) 2016-03-30 2017-03-30 Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
US15/473,999 2017-03-30

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227031739A Division KR102618519B1 (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240001291A true KR20240001291A (ko) 2024-01-03

Family

ID=58632586

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227031739A KR102618519B1 (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형
KR1020237044402A KR20240001291A (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형
KR1020187030850A KR102444612B1 (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227031739A KR102618519B1 (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187030850A KR102444612B1 (ko) 2016-03-30 2017-03-30 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형

Country Status (13)

Country Link
US (3) US10512676B2 (ko)
JP (2) JP7510743B2 (ko)
KR (3) KR102618519B1 (ko)
AU (2) AU2017239641A1 (ko)
BR (1) BR112018069965A2 (ko)
CA (1) CA3019128A1 (ko)
CL (1) CL2018002768A1 (ko)
CO (1) CO2018011349A2 (ko)
IL (4) IL283430B (ko)
MX (2) MX2023003051A (ko)
SG (1) SG11201808455VA (ko)
WO (1) WO2017173060A1 (ko)
ZA (2) ZA201807183B (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3019128A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Amicus Therapeutics, Inc. Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
BR112019025888A2 (pt) 2017-06-07 2020-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio, vetor de terapia gênica, proteína terapêutica multidomínio recombinante, método de expressão, métodos para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade, para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade epara tratar a deficiência enzimática em um paciente em necessidade e/ou tolerar o paciente à enzima para a qual é deficiente, anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação a antígeno, e, composição farmacêutica
WO2021046443A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Amicus Therapeutics, Inc. Method for capturing and purification of biologics
WO2023215865A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Amicus Therapeutics, Inc. Methods for treating pompe disease
WO2024119091A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Amicus Therapeutics, Inc. Fexamethods for treating infantile-onset pompe disease in pediatric patients
WO2024119070A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Amicus Therapeutics, Inc. Methods for treating late onset pompe disease in pediatric patients

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837237A (en) 1985-07-09 1989-06-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Therapy using glucosidase processing inhibitors
US5879680A (en) 1987-12-23 1999-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cloned DNA for synthesizing unique glucocerebrosidase
US4985445A (en) 1988-02-12 1991-01-15 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Cancer cell metastasis inhibitors and novel compounds
US6451600B1 (en) 1989-12-22 2002-09-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5236838A (en) 1988-12-23 1993-08-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5179023A (en) 1989-03-24 1993-01-12 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant α-galactosidase a therapy for Fabry disease
US5011829A (en) 1989-06-02 1991-04-30 G. D. Searle & Co. Pharmaceutical composition and method of inhibiting virus
US5103008A (en) 1989-08-17 1992-04-07 Monsanto Company Compound, N-butyl-deoxynojirimycin-6-phosphate
US5401650A (en) 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US5399567A (en) 1993-05-13 1995-03-21 Monsanto Company Method of treating cholera
US6118045A (en) 1995-08-02 2000-09-12 Pharming B.V. Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
US20020073438A1 (en) * 1995-08-02 2002-06-13 Reuser Arnold J. Methods of purifying human acid alpha-glucosidase
US6458574B1 (en) 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
US6210666B1 (en) 1997-10-21 2001-04-03 Orphan Medical, Inc. Truncated α-galactosidase A to treat fabry disease
MY122499A (en) 1997-11-10 2006-04-29 Searle & Co Use of alkylated iminosugars to treat multidrug resistance
US6465488B1 (en) 1997-12-11 2002-10-15 Chancellor, Masters & Scholars Of The University Of Oxford Inhibition of glycolipid biosynthesis
US6274597B1 (en) 1998-06-01 2001-08-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Method of enhancing lysosomal α-Galactosidase A
KR20010101131A (ko) 1998-12-07 2001-11-14 추후기재 폼페병의 치료 방법
US6545021B1 (en) 1999-02-12 2003-04-08 G.D. Searle & Co. Use of substituted-1,5-dideoxy-1,5-imino-D-glucitol compounds for treating hepatitis virus infections
ATE234626T1 (de) 1999-07-26 2003-04-15 Searle & Co Verwendung von langkettigen n-alkyl derivaten von deoxynojirimycin mit glucocerebrosidase enzyme zur herstellung eines medikaments zur behandlung von mit glykolipiden akkumulation zusammenhängenden krankheiten
US6534300B1 (en) 1999-09-14 2003-03-18 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases
WO2001097829A2 (en) 2000-06-19 2001-12-27 Genzyme Corporation Combination enzyme replacement, gene therapy and small molecule therapy for lysosomal storage diseases
US20040204379A1 (en) 2000-06-19 2004-10-14 Cheng Seng H. Combination enzyme replacement, gene therapy and small molecule therapy for lysosomal storage diseases
ES2799882T3 (es) 2000-07-18 2020-12-22 Univ Duke Tratamiento de glucogenosis de tipo II
CN1638739A (zh) 2000-08-18 2005-07-13 法玛西雅厄普约翰美国公司 治疗成瘾性障碍的化合物
US7001994B2 (en) 2001-01-18 2006-02-21 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose 6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins
US7723296B2 (en) 2001-01-18 2010-05-25 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
CA2445577C (en) 2001-04-30 2012-07-03 Symbiontics, Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
BR0213298A (pt) 2001-10-16 2006-11-07 Rxkinetix Inc formulações com alta concentração de proteìna e processo de fabricação
WO2003086452A2 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Genzyme Corporation Methods of enhancing lysosomal storage disease therapy
ES2619353T3 (es) 2003-01-31 2017-06-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Terapia de combinación para tratar trastornos de deficiencia de proteínas
FR2861991B1 (fr) 2003-11-07 2008-01-18 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'inhibiteurs de glucosidase pour une therapie de la mucoviscidose
EP1720405A4 (en) 2004-02-06 2008-08-27 Biomarin Pharm Inc MANUFACTURE OF HIGHLY PHOSPHORYLATED LYSOSOMAL ENZYMES AND USES THEREOF
WO2005078077A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Zystor Therapeutics, Inc. Acid alpha-glucosidase and fragments thereof
US20060142234A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Guohua Chen Injectable non-aqueous suspension
ES2572148T3 (es) 2005-05-17 2016-05-30 Amicus Therapeutics Inc Un método para el tratamiento de la enfermedad de Pompe usando 1-desoxinojirimicina y derivados
MXPA05010977A (es) * 2005-10-12 2007-04-11 Abdala Leopoldo Espinosa Composiciones farmaceuticas que comprenden sustancias antidiabeticas combinadas para su uso en diabetes mellitus.
JP2010509344A (ja) 2006-11-13 2010-03-25 ザイストール セラピューティクス， インコーポレイテッド ポンペ病を治療するための方法
US20100184803A1 (en) 2007-03-09 2010-07-22 Link Medicine Corporation Treatment of Lysosomal Storage Diseases
WO2008134628A2 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the treatment of lysosomal storage diseases using pharmacological chaperones
WO2009066069A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Summit Corporation Plc Treatment of protein folding disorders
WO2009075815A1 (en) 2007-12-07 2009-06-18 Duke University Immunomodulating gene therapy
DK2252313T3 (en) 2008-02-12 2015-07-13 Amicus Therapeutics Inc METHOD TO PREDICT response to Pharmacological chaperone TREATMENT OF DISEASES
MX2010009875A (es) 2008-03-12 2010-11-26 Amicus Therapeutics Inc Ensayos para diagnosticar y evaluar opciones de tratamiento para enfermedad de pompe.
US20110189710A1 (en) 2008-03-12 2011-08-04 Amicus Therapeutics, Inc. TREATMENT OF POMPE DISEASE WITH SPECIFIC PHARMACOLOGICAL CHAPERONES AND MONITORING TREATMENT USING SURROGATE MARkERS
WO2010015816A2 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Summit Corporation Plc Treatment of lysosomal storage disorders and other proteostatic diseases
US20100119502A1 (en) 2008-11-11 2010-05-13 Amicus Therapeutics, Inc. Therapy regimens, dosing regimens and stable medicaments for the treatment of pompe disease
SI2889043T1 (sl) 2008-12-16 2019-08-30 Genzyme Corporation Sintetične vmesne spojine za pripravo konjugatov oligosaharid-protein
WO2010118283A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Amicus Therapeutics, Inc. Methods for preventing and/or treating lysosomal storage disorders
ES2569514T3 (es) 2009-06-17 2016-05-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Formulaciones para enzimas lisosómicas
US20130196410A1 (en) 2010-03-05 2013-08-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for modifying the glycosylation pattern of a polypeptide
WO2012145644A1 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Genzyme Corporation Modified acid alpha glucosidase with accelerated processing
WO2013013017A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modifying the glycosylation of lysosomal storage disorder therapeutics
ES2864774T3 (es) 2011-12-22 2021-10-14 Centogene Ip Gmbh Combinación de un compuesto que tiene la capacidad de reorganizar una enzima lisosomal y Ambroxol y/o un derivado de Ambroxol
KR20230066482A (ko) * 2012-03-07 2023-05-15 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 폼페병의 치료를 위한 고농도 알파-글루코시다제 조성물
AU2013234042B2 (en) * 2012-03-15 2017-11-02 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for treatment of Pompe's disease
EP3871688B1 (en) 2012-05-03 2024-03-06 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the treatment of pompe disease
CA2915127A1 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Giancarlo PARENTI Allosteric chaperones and uses thereof
FI3201320T3 (fi) 2014-09-30 2024-01-08 Amicus Therapeutics Inc Erittäin tehokas hapan alfa-glukosidaasi parannetuilla hiilihydraateilla
KR102510941B1 (ko) * 2015-12-30 2023-03-20 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 폼페병 치료용의 강화된 산 알파-글루코시다제
CA3019128A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Amicus Therapeutics, Inc. Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
KR20220145918A (ko) * 2016-03-30 2022-10-31 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201808455VA (en) 2018-10-30
US20170333534A1 (en) 2017-11-23
BR112018069965A2 (pt) 2019-01-29
WO2017173060A1 (en) 2017-10-05
IL294012B1 (en) 2023-04-01
IL283430B (en) 2022-07-01
ZA201807183B (en) 2020-01-29
IL283430A (en) 2021-06-30
CO2018011349A2 (es) 2019-02-08
JP2019510068A (ja) 2019-04-11
IL294012A (en) 2022-08-01
KR20220130258A (ko) 2022-09-26
JP2022105010A (ja) 2022-07-12
KR102618519B1 (ko) 2023-12-28
IL261995A (en) 2018-10-31
AU2024203333A1 (en) 2024-06-20
CA3019128A1 (en) 2017-10-05
JP7510743B2 (ja) 2024-07-04
AU2017239641A1 (en) 2018-10-18
CL2018002768A1 (es) 2019-01-11
MX2023003052A (es) 2023-04-05
US10512676B2 (en) 2019-12-24
IL294012B2 (en) 2023-08-01
US20240066104A1 (en) 2024-02-29
MX2023003051A (es) 2023-04-05
US11491211B2 (en) 2022-11-08
US20200171133A1 (en) 2020-06-04
ZA201906938B (en) 2024-02-28
IL301319A (en) 2023-05-01
IL261995B (en) 2021-06-30
KR102444612B1 (ko) 2022-09-21
KR20180124120A (ko) 2018-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102618519B1 (ko) 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형
JP7436545B2 (ja) 高ｍ６ｐ組換えタンパク質の選択方法
JP7193476B2 (ja) 組換えヒト酸性アルファグリコシダーゼ
TWI820564B (zh) 包含重組酸性α-葡萄糖苷酶之調配物
EA043224B1 (ru) Составы, содержащие рекомбинантную кислую альфа-глюкозидазу
NZ786386A (en) Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
CN109196097B (zh) 用于选择高m6p重组蛋白的方法
NZ786723A (en) Method for selection of high m6p recombinant proteins

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal