DE69133263T2 - Klonierung und expression von biologisch aktiver alpha-n-acetylgalaktosaminidase - Google Patents

Klonierung und expression von biologisch aktiver alpha-n-acetylgalaktosaminidase Download PDF

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Description

  • 1. EINLEITUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung biologisch aktiver humaner α-GalNAc, wobei diese Erzeugung die Klonierung und die stabile Überexprimierung der genetischen codierenden Sequenz der α-GalNAc in eukaryotischen Expressionssystemen, die die korrekten posttranslationalen Modifikationen und die Prozessierung des Expressionsprodukts sicher stellen, beinhaltet.
  • Die so erzeugte α-GalNAc kann für die Enzymersatz-Therapie der Schindler-Krankheit verwendet werden.
  • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In den frühen 1970er-Jahren wiesen verschiedene Forscher die Existenz von zwei Isoenzymen der α-Galactosidase nach, die als A und B bezeichnet wurden und die die α-galaktosidischen Verknüpfungen in 4-MU- und/oder p-NP-α-D-Galactopyranosiden hydrolysieren (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633–644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237–249; Romeo et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161–166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250–255; Ho et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256–266; Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157–171; und Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver C. R., Beaudet A. L., Sly W. S. und Valle D., Hrsg., Seiten 1751–1796, McGraw Hill, New York). In den Geweben beruhten ungefähr 80% – 90% der Gesamtaktivität der α-Galactosidase (α-Gal) auf einem thermolabilen, durch Myoinosit hemmbaren Isoenzym der α-Gal A, wobei ein relativ thermostabiles, die α-Gal B, für den Rest verantwortlich war. Die beiden „Isoenzyme" konnten durch Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Ionenaustauschchromatographie voneinander getrennt werden. Nach einer Behandlung mit Neuraminidase waren die elektrophoretischen Beweglichkeiten und die pl-Werte der α-Gal A und B ähnlich (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633–644), was zunächst nahe legte, dass es sich bei den beiden Enzyme um die unterschiedlich glycosylierten Produkte desselben Gens handelte. Der Befund, dass die gereinigten Glycoprotein-Enzyme ähnliche physikalische Eigenschaften aufwiesen, einschließlich des Molekulargewichts der Untereinheiten (~46 kDa), homodimerer Strukturen und der Aminosäurezusammensetzungen, zeigte ebenfalls ihre strukturelle Verwandtschaft (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195–7200; Callahan et al., 1973, Biochem. Med. 7: 424–431; Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411–1417; Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 482: 138-144; Kusiak et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 184–190; Dean et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001–10005; und Bishop et al., 1980, in Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick R. J., Hrsg., Seiten 17–32, Alan R. Liss Inc., New York). Der nachfolgende Nachweis, dass polyklonale Antikörper gegen die α-Gal A oder B nicht mit dem anderen Enzym kreuzreagierten (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195–7200; und Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 482: 138–144), dass nur die Aktivität der α-Gal A in Hemizygoten mit der Fabry-Krankheit fehlte (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633–644; Beutler & Kuhl, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 237–249; Romeo et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161–166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250–255; Ho et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256–266; Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157–171; Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver C. R., Beaudet A. L., Sly W. S. und Valle, D., Hrsg., Seiten 1751–1796, McGraw Hill, New York; und Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195–7200), und dass die Gene der α-Gal A und B auf verschiedenen Chromosomen liegen (Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver C. R., Beaudet A. L., Sly W. S. und Valle, D., Hrsg., Seiten 1751–1796, McGraw Hill, New York; deGroot et al., 1978, Hum. Genet. 44: 305–312), zeigten eindeutig, dass diese Enzyme genetisch verschieden waren.
  • 2.1. α-GalNAc UND DIE SCHINDLER-KRANKHEIT
  • 1977 wurde gezeigt, dass die α-Gal B eine α-N-Acetylgalactosaminidase (α-GalNAc) ist, ein homodimeres Glycoprotein, das künstliche und natürliche Substrate mit terminalen α-N-Acetylgalactosaminylresten hydrolysiert (Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411–1417; Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144; und Bishop et al., 1980, in Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick R. J., Hrsg., Seiten 17–32, Alan R. Liss Inc., New York), einschließlich verschiedener O- und N-verknüpfter Glycopeptide und Glycoproteine, Glycosphingolipide und des Proteoglycans Keratinsulfat II des Knorpels (Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver C. R., Beaudet A. L., Sly, W. S. und Valle D., Hrsg., Seiten 1751–1796, McGraw Hill, New York).
  • Für die gereinigte α-GalNAc wurden Molekulargewichte von 90 bis 117 kDa bzw. 46 bis 48 kDa für das native Enzym bzw. die Untereinheit berichtet (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195–7200; Callahan et al., 1973, Biochem. Med. 7: 424–431; Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411–1417; Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144; Kusiak et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 184–190; Dean et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001–10005; und Bishop et al., 1980, in Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick R. J., Hrsg., Seiten 17–32, Alan R. Liss Inc., New York). Kinetische Studien zeigten, dass das Enzym durch α-N-Acetylgalactosamin gehemmt wurde (Ki ~2,1 mM) und synthetische Substrate mit entweder terminaler α-N-Acetylgalactosaminid- (Km ~1–2 mM) oder α-D-Galactosidgruppe (Km ~7–10 mM) hydrolysierte (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195–7200; Callahan et al., 1973, Biochem. Med. 7: 424–431; Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411–1417; Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144; Kusiak et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 184–190; Dean et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001–10005; und Bishop et al., 1980, in Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick R. J., Hrsg., Seiten 17–32, Alan R. Liss Inc., New York). Studien zur Biosynthese, die an kultivierten Fibroblasten durchgeführt wurden, zeigten, dass das humane Enzym als ein glycosylierter Vorläufer von 65 kDa synthetisiert wurde, der zu einer reifen, lysosomalen Form von 48 kDa prozessiert wurde. Sowohl die Vorläuferform als auch die reife Form hatte Oligosaccharidketten vom mannosereichen Typ, aber nur die Mannose-Reste des Vorläufers waren phosphoryliert (Sweeley et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 223: 158–165).
  • Das Fehlen der Aktivität der α-GalNAc wurde bei zwei Brüdern mit der Schindler-Krankheit gezeigt (van Diggelen et al., 1988, J. Inher. Met. Dis. 11: 349–357; Schindler et al., 1989, N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740), einer neu erkannten Form der jugendlichen neuroaxonalen Dystrophie (Schindler et al., 1989, N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740). Die betroffenen Brüder schieden erhöhte Mengen an O-verknüpften Glycopeptiden und Oligosacchariden aus, die α-N-Acetylgalactosaminylgruppen enthielten, die in Urin-Screeningprofilen nachweisbar waren (van Diggelen et al., 1988, J. Inher. Met. Dis. 11: 349-357; Schindler et al., 1990, Clin. Chim. Acta 190: 81–92; Schindler et al. 1989, N. Engl. J. Med., 320: 1735–1740). Biochemische und immunologische Studien ergaben, dass weder eine Aktivität noch das Enzymprotein der α-GalNAc in Fibroblastenlysaten der betroffenen Geschwister vorhanden war (Schindler et al., 1989, N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740). Deshalb wurden Bemühungen unternommen, eine vollständige cDNA der α-GalNAc zu isolieren und zu exprimieren, um die Art der molekularen Schäden bei Patienten mit der Schindler-Krankheit zu bestimmen und die genomische Organisation und Expression des humanen Gens, das für diese lysosomale Hydrolase codiert, zu charakterisieren.
  • Yamauchi et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 170, Nr. 1: 231–237) offenbaren die molekulare Klonierung von zwei cDNA-Spezies der humanen α-N-Acetylgalactosaminidase, und sie berichten von der transienten Expression und dem Nachweis niedriger Spiegel der Aktivität eines rekombinanten α-GalNAc-Enzyms in Rohextrakten von Säugerzellen. Die in diesen Extrakten vorliegende Enzymmenge ist bei weitem zu gering, als dass eine Isolierung eines biologisch aktiven Produkts bewerkstelligt werden könnte.
  • Während Studien zur Expression einer hybriden α-GalNAc-Sequenz im Gange waren berichteten Tsuji, S. et al. (1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1498–1504) die Isolierung einer humanen α-GalNAc-cDNA. Im Gegensatz zu der vollständigen α-GalNAccDNA-Sequenz pAGB-3, über die in der vorliegenden Beschreibung berichtet wird, enthielt der Klon von Tsuji et al., pcD-HS1204, eine Insertion von 70 bp nach nt 957 im Klon pAGB-3, was den Leserahmen für die pAGB-3-Reste 330 bis 411 veränderte und zu einem verkürzten Polypeptid von lediglich 358 Resten führte. Obwohl ihre vorhergesagte Aminosäuresequenz nicht das hier beschriebene tryptische Peptid einschloss, das die Reste 335 bis 344 enthält, untersuchten wir, ob die Insertion von 70 bp möglicherweise aus einem alternativen Spleißen resultiert haben könnte. Die hier berichteten Ergebnisse demonstrieren die Isolierung, die Nucleotidsequenz und die transiente Expression einer vollständigen, für die α-GalNAc codierenden cDNA. Die Sequenzierung der genomischen DNA ergab keine Hinweise auf das Vorkommen der vermuteten Insertion von . 70 bp, wodurch bekräftigt wurde, dass das exprimierbare pAGB-3-Transkript authentisch ist. Außerdem wurde eine bemerkenswerte Homologie zwischen den vorhergesagten Aminosäuresequenzen der α-GalNAc und der α-Gal A identifiziert, was die evolutionäre Verwandtschaft des autosomalen und des auf dem X-Chromosom liegenden Gens, die für diese lysosomalen Hydrolasen codieren, nahe legte.
  • 2.2. LYSOSOMALE ENZYME: BIOSYNTHESE UND TARGETING
  • Lysosomale Enzyme werden an membrangebundenen Polysomen im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert. Jedes Protein wird als ein größerer Vorläufer synthetisiert, der ein hydrophobes aminoterminales Signalpeptid enthält. Dieses Peptid interagiert mit einem Signalerkennungsteilchen, einem 11 S-Ribonucleoprotein, und initiiert dadurch den vektoriellen Transport des entstehenden Proteins über die Membran des endoplasmatischen Retikulums in das Lumen (Erickson et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 11224; Erickson et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Commun. 115: 275; Rosenfeld et al., 1982, J. Cell Biol. 93: 135). Lysosomale Enzyme werden durch den En-Block-Trartsfer eines großen vorgeformten 0ligosaccharids, Glucose-3, Mannose-9, N-Acetylclucosamin-2, von einem Lipid-verknüpften Zwischenprodukt auf einen Asn-Rest der Konsensussequenz Asn-X-Ser/Thr im entstehenden Polypeptid cotranslational glycosyliert (Kornfeld R. & Kornfeld S., 1985, Annu. Rev. Biochem. 54: 631). Im endoplasmatischen Retikulum wird das Signalpeptid abgespalten, und die Prozessierung des Asn-verknüpften Oligosaccharids beginnt mit dem Ausschneiden von drei Glucose-Resten und einer Mannose aus der Oligosaccharid-Kette.
  • Die Proteine bewegen sich über vesikulären Transport in den Golgi-Apparat, wo sie eine Reihe von posttranslationalen Modifizierungen durchlaufen und für das richtige Targeting für spezifische Bestimmungsorte sortiert werden: Lysosomen, Sekretion, Plasmamembran.
  • Während der Bewegung durch den Golgi-Apparat wird die Oligosaccharid-Kette auf sekretorischen und Membran-Glycoproteinen zum Sialinsäure-haltigen komplexen Typ prozessiert. Zwar durchlaufen einige der Oligosaccharid-Ketten auf lysosomalen Enzyme eine ähnliche Prozessierung, aber die meisten durchlaufen eine Reihe anderer Modifizierungen. Die wichtigste Modifikation ist der Erwerb von Phosphomannosyl-Resten, die als essentielle Komponente beim Prozess des Targeting dieser Enzyme in die Lysosomen dient (Kaplan et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2026). Dieser Erkennungsmarker wird durch die aufeinanderfolgende Aktivität von zwei Golgi-Enzymen erzeugt. Zuerst überträgt die N-Acetylglucosaminylphosphotransferase N-Acetylglucosamin-1-phosphat vom Nucleotidzucker Uridindiphosphat-N-acetylglucosamin auf bestimmte Mannose-Reste auf lysosomalen Enzymen, wodurch ein Phosphodiester-Intermediat entsteht (Reitman & Kornfeld, 1981, J. Biol. Chem. 256: 4275; Waheed et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 12322). Dann entfernt die N-Acetylglucosamin-1-phosphodiester-α-N-acetylglucosaminidase den N-Acetylglucosamin-Rest, wodurch das Erkennungssignal Mannose-6-phosphat frei gelegt wird (Varki & Kornfeld, 1981, J. Biol. Chem. 256: 9937; Waheed et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 5717).
  • Nach der Erzeugung der Phosphomannosyl-Reste binden die lysosomalen Enzyme an Rezeptoren für Mannose-6-phosphat (M-6-P-Rezeptoren) im Golgi-Apparat. Auf diese Weise bleiben die lysosomalen Enzyme intrazellulär und werden von den Proteinen abgetrennt, die für eine Sekretion bestimmt sind. Der Komplex aus Ligand und Rezeptor verlässt dann über ein überzogenes Vesikel den Golgi-Apparat und wird dann einer prälysosomalen Verarbeitung zugeführt, wo durch die Ansäuerung des Kompartiments der Ligand abdissoziiert (Gonzalez-Noriega et al., 1980, J. Cell. Biol. 85: 839). Der Rezeptor kehrt dann in den Golgi-Apparat zurück, während die lysosomalen Enzyme zu Vesikeln verpackt werden, wobei sie primäre Lysosomen bilden. Ungefähr 5–20% der lysosomalen Enzyme wandern nicht zu den Lysosomen und werden, vermutlich versehentlich, sekretiert. Ein Teil dieser sekretierten Enzyme kann durch den M-6-P-Rezeptor wieder eingefangen werden, der auf der Zelloberfläche vorkommt, und internalisiert und den Lysosomen zugeführt werden (Willingham et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6967).
  • Es wurden zwei Mannose-6-phosphat-Rezeptoren identifiziert. Ein Glycoprotein von 215 kDa wurde aus verschiedenen Geweben gereinigt (Sahagian et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 4289; Steiner & Rome, 1982, Arch. Biochem. Biophys. 214: 681). Die Bindung dieses Rezeptors ist unabhängig von divalenten Kationen. Es wurde noch ein zweiter M-6-P-Rezeptor isoliert, der sich vom Rezeptor von 215 kDa dadurch unterscheidet, dass er divalente Kationen benötigt. Deshalb wird dieser Rezeptor der Kationen-abhängige (M-6-PCD) genannt, während der Rezeptor von 215 kDa der Kationen-unabhängige genannt wird (M-6-PCI). Der M-6-PCD-Rezeptor ist offenbar ein Oligomer aus drei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht der Untereinheit von 46 kDa.
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Erzeugung humaner α-GalNAc über die Klonierung und Exprimierung der für die α-GalNAc codierenden Sequenz in Expressionssystemen mit eukaryotischen Wirtszellen. Die eukaryotischen Expressionssysteme, und insbesondere die hier beschriebenen eukaryotischen Expressionssysteme mit Säugetier-Wirtszellen, gewährleisten ein stabiles und hohes Expressionsniveau der α-GalNAc sowie die korrekten cotranslationalen und posttranslationalen Modifizierungen, die für die korrekte Prozessierung, beispielsweise die Glycosylierung, Phosphorylierung etc., sowie für die Sortierung des Expressionsprodukts benötigt werden, so dass ein aktives Enzym erzeugt wird. Ebenfalls beschrieben wird die gentechnologische Konstruktion von Fusionsproteinen der α-GalNAc, die leicht gereinigt werden können. Diese Fusionsproteine sind so konstruiert, dass die α-GalNAc-Gruppe leicht vom Fusionsprotein abgespalten und gewonnen werden kann.
  • Die gemäß der Erfindung erzeugte α-GalNAc kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu ein, die Behandlung der Schindler-Krankheit; die Hydrolyse von α-N-Acetylgalactosaminylgruppen von Glycoproteinen, Glycopeptiden, Glycolipiden und anderen Glycokonjugaten und die Umwandlung der Determinante der humanen Blutgruppe A auf Erythrozyten in das Antigen der Blutgruppe 0 gehören.
  • Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung humaner α-N-Acetylgalactosaminidase bereit, das umfasst:
    • (a) Kultivieren einer eukaryotischen Zeile, die eine chromosomal integrierte Nucleotidsequenz enthält, die für die α-N-Acetylgalactosaminidase codiert und von einer zweiten Nucleotidsequenz reguliert wird, die die Genexpression so steuert, dass die α-N-Acetylgalactosaminidase-Nucleotidsequenz stabil überexprimiert wird, was zu einer enzymatisch aktiven α-N-Acetylgalactosaminidase führt; und
    • (b) Gewinnen der biologisch aktiven α-N-Acetylgalactosaminidase aus der Kultur, wobei die Nucleotidsequenz, die für die α-N-Acetylgalactosaminidase codiert, die Sequenz umfasst, die in der 2 von der Nucleotid-Nummer 1 bis 1236 dargestellt ist, oder die Sequenz, die in der 2 von der Nucleotid-Nummer 52 bis 1236 dargestellt ist, und wobei die chromosomal integrierte Nucleotidsequenz außerdem eine Nucleotidsequenz einschließt, die für einen selektierbaren Marker codiert.
  • 3.1. DEFINITIONEN Die folgenden Begriffe und Abkürzungen haben, so wie sie hier verwendet werden, die folgenden Bedeutungen:
    α-Galactosidase A α-Gal A
    α-N-Acetylgalactosaminidase α-GalNAc
    Basenpaar(e) bp
    Chinese Hamster Ovary CHO
    komplementäre DNA cDNA
    Zählereignisse pro Minute (counts per minute) cpm
    Desoxyribonucleinsäure DNA
    Dulbeccos Modifiziertes Eagle-Medium DMEM
    fötales Kälberserum FKS
    Kilobasenpaare kb
    Kilodalton kDa
    Mannose-6-phosphat M-6-P
    Methotrexat MTX
    4-Methylumbelliferyl-α-D-galactosid 4-MU-α-Gal
    4-Methylumbelliferyl-α-N-acetylgalactosaminid 4-MU-α-GalNAc
    Mikrogramm μg
    Nanogramm ng
    Nucleotid nt
    p-Nitrophenyl-α-N-acetylgalactosaminid pNP-α-GalNAc
    Polyacrylamid-Gelektrophorese PAGE
    Polymerase-Kettenreaktion PCR
    Ribonucleinsäure RNA
    Ribosonde für α-GalNAc rb-AGB-3
    Natriumdodecylsulfat SDS; NaDodSO4
    Einheiten U
  • 4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 Trennung der tryptischen Peptide der elektroeluierten Spezies mit 117 kDa ( 1A) und 48 kDa (1B) der gereinigten humanen α-GalNAc durch Reversed-Phase-HPLC. Die angegebenen Peptide wurden mikrosequenziert. Insert: NaDodSO4/PAGE gereinigter α-GalNAc.
  • 2 Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenzen des pAGB-3-cDNA-Inserts, das den vollständigen codierenden Bereich der humanen α-GalNAc enthält. Das A des Initiationscodons ATG ist nt 1, und das N-terminale Met des Signalpeptids ist die Aminosäure 1. Dicke Unterstreichungen bezeichnen colineare Aminosäuresequenzen, die durch die Mikrosequenzierung des N-teminalen (N-ter) und der tryptischen Peptide (T) des gereinigten Enzyms erhalten wurden. CHO bezeichnet potenzielle Stellen einer N-Glycosylierung. Hochgesetzte Linien bezeichnen das Polyadenylierungssignal (AATAAA) und die Pentanucleotidsequenz (CACTG), die vom kleinen nucleären Ribonucleoprotein U4 erkannt wird.
  • 3 Immunblot humaner, in COS-1-Zellen exprimierter α-GalNAc. Spuren: 1, Scheintransfektion; 2, Transfektion der p91-AGB-3; 3, gereinigte humane α-GalNAc aus der Lunge.
  • 4 Ausrichtung von Aminosäuresequenzen, die von den vollständigen cDNAs abgeleitet wurden, die für die humane α-GalNAc (α-Gal B), die α-Gal A, die Mel 1 der Hefe und die Mel A von E. coli codieren. Doppelpunkte, identische Reste; einzelne Punkte, isofunktionelle Aminosäuren; und Kästen, identische Reste bei α-GalNAc, α-Gal A, Mel 1 und/oder Mel A. Für die optimale Ausrichtung wurden Lücken eingeführt. Nummerierte senkrechte Linien bezeichnen die Exon-Grenzen für die α-Gal A (Bishop et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3903–3907).
  • 5 Partielle genomische Sequenz der humanen α-GalNAc einschließlich eines Introns zwischen den codierenden Nucleotiden 957 und 958. 5A: rb-AGB-3: partielle RNA-Sequenz der α-GalNAc (nt 909 bis 969), die dem 3'-Ende des Exons 6 der α-Gal A entspricht (Bishop et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3903–3907). Die dargestellte Struktur aus Stamm und Schleife zwischen nt 918 und 937 hat ein ΔG von –11,6 (Zuker, 1989, Methods Enzymol. 180: 262–288). Die fett dargestellten überlappenden Antisense- und Sense-Sequenzen sind umgekehrte und direkte Wiederholungen, die sich von nt 919 bis 957 von pAGB-3 ableiten, die sich in der Insertion von 70 bp des pcD-HS1204 befinden (Tsuji S. et al., 1989; Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1498–1504). Die Deletion von 45 bp im Klon pAGB-13 ist mit schrägen Buchstaben angegeben. 5B: Die genomische Sequenz der α-GalNAc vom codierenden nt 760 bis zum nt 1053 (oberer Kasten) schließt ein Intron von 1754 nt zwischen nt 959 und 958 ein, was hinsichtlich der Position den Grenzen der Exons 6 und 7 der α-Gal A entspricht. Gestrichelte Linie, die 5'-Spleiß-Donor-Sequenz; durchgehende Unterstreichungen, vermutete Sequenzen eines Verzweigungspunktes; gepunktete Unterstreichungen, vermutete Polypyrimidin-Trakte an den 3'-Akzeptorstellen für das normale Gen und die Mutante pAGB-13; und Sterne, Abweichungen von der Konsensus-Sequenz (Reed & Maniatis, 1988, Genes Dev. 2: 1268–1276).
  • 5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung biologisch aktiver humaner α-GalNAc, wobei diese Erzeugung die Klonierung und die stabile Überexprimierung der codierenden Nucleotidsequenzen des Enzyms in eukaryotischen Expressionssystemen beinhaltet. Die erfolgreiche Expression und Erzeugung dieses gereinigten, biologisch aktiven Enzyms, wie sie hier beschrieben und beispielhaft dargestellt werden, ist aus verschiedenen Gründen besonders bedeutsam. Zum Beispiel führten die früheren Bemühungen, die vollständige, für die α-Gal A codierende cDNA unter Verwendung verschiedener prokaryotischer Expressionsvektoren zu exprimieren, zu einer Expression des Enzyms, wie aus Enzymtests an intakten bakteriellen Wirtszellen und dem Wachstum auf Melibiose als Kohlenstoffquelle hervor ging; allerdings wurde das humane Enzym in niedrigen Mengen exprimiert und konnte nicht aus den Bakterien gereinigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das in bakteriellen Systemen exprimierte rekombinante Enzym aufgrund des Fehlens der normalen Glycosylierung und/oder der Gegenwart der endogenen cytoplasmatischen oder periplasmatischen Proteasen instabil war. Diese Studien legen auch nahe, dass das homologe Glycoprotein der α-GalNAc in Bakterien nicht exprimierbar sein dürfte.
  • Die Expression dieser Enzyme in eukaryotischen Expressionssystemen ist aus verschiedenen Gründen genau so schwierig. Die α-Gal A und die α-GalNAc sind lysosomale Enzyme, die durch „Housekeeping"-Gene codiert werden. Das primäre Translationsprodukt wird stark modifiziert und prozessiert, was eine komplexe Folge von Ereignissen beinhaltet, zu denen eine Abspaltung der Signalsequenz, eine Glycosylierung und eine Phosphorylierung gehören, die nur von geeigneten Wirtszellen korrekt durchgeführt werden können. Außerdem ist es, da das Expressionsprodukt für das Lysosom bestimmt ist, das intrazellulär bleibt, ziemlich überraschend, dass die hier beschriebenen Verfahren die Sekretion eines korrekt prozessierten, biologisch aktiven Moleküls ermöglichen.
  • Die gemäß der Erfindung erzeugte, biologisch aktive α-GalNAc hat verschiedene Anwendungen, wobei die wahrscheinlich wichtigste ihre Verwendung in der Enzymersatz- Therapie bei der Schindler-Krankheit, einer lysosomalen Speicherkrankheit, ist. Allerdings werden große Mengen biologisch aktiver α-GalNAc, die keine Immunreaktion auslösen, für die Ersatz-Therapie benötigt. Derartige Mengen an aktivem Enzym wurden bisher nicht erhalten.
  • Die Erfindung ist, und zwar nur für diese Beschreibung, in die folgenden Abschnitte unterteilt: (a) die für die α-GalNAc codierende Sequenz; (b) Konstruktion eines Expressionsvektors, der die Expression der für das Enzym codierenden Sequenzen steuert; (c) Transfektion geeigneter Wirtszellen, die zur Replikation, Translation und korrekten Prozessierung der primären Transkripte fähig sind, damit ein biologisch aktives Genprodukt exprimiert wird; und (d) Identifizierung und/oder Reinigung des so erzeugten Enzyms. Sobald ein Transformant identifiziert worden ist, der große Mengen des biologisch aktiven Enzyms exprimiert, beinhaltet die Durchführung der Erfindung die Vermehrung und die Verwendung dieses Klons bei der Erzeugung gereinigter, biologisch aktiver α-GalNAc.
  • Die Erfindung wird hier anhand von Beispielen demonstriert, bei denen cDNAs der α-GalNAc in einem Expressionssystem mit Säugerzellen kloniert und exprimiert wurden. Modifikationen der codierenden Sequenzen der cDNA, die die Ausbeute verbessern und die Reinigung vereinfachen, ohne dass sie die biologische Aktivität vermindern, werden ebenfalls beschrieben.
  • Verschiedene Aspekte der Erfindung werden detaillierter in den folgenden Unterabschnitten und in den folgenden Beispielen beschrieben.
  • 5.1. DIE FÜR DIE α-GalNAc CODIERENDE SEQUENZ
  • Die codierende Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der α-GalNAc sind in der 2 wiedergegeben. Diese Nucleotidsequenz, oder Fragmente oder funktionelle Äquivalente von ihr, kann bzw. können dazu verwendet werden, rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression der Enzymprodukte, oder funktionell aktiver Peptide oder funktioneller Äquivalente davon, in geeigneten Wirtszellen steuern.
  • Aufgrund der degenerierten Natur der codierenden Nucleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen für die gleiche Aminosäuresequenz, wie sie in der 2 wiedergegeben ist, codieren, bei der Durchführung der Erfindung zur Klonierung und Expression der α-GalNAc verwendet werden. Zu derartigen Veränderungen gehören Deletionen, Additionen oder Substitutionen verschiedener Nucleotidreste, die zu einer Sequenz führen, die für das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt codiert. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der Sequenz enthalten, die zu einer stummen Änderung führen, wodurch ein biologisch aktives Produkt erzeugt wird. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis einer Ähnlichkeit bezüglich der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie oder der amphipathischen Natur der involvierten Reste und/oder auf der Basis kristallographischer Daten erfolgen. Zum Beispiel gehören zu negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; zu den positiv geladenen Aminosäuren gehören Lysin und Arginin; zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen und ähnlichen Hydrophilie-Werten gehören die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; und Phenylalanin, Tyrosin.
  • Die für die α-GalNAc codierende Sequenz kann auf bequeme Weise von gentechnologisch konstruierten Mikroorganismen oder Zelllinien, wie den hier beschriebenen hinterlegten Ausführungsformen, die die für das Enzym codierenden Sequenzen enthalten, erhalten werden. Alternativ können genomische Sequenzen oder codierende cDNA-Sequenzen für diese Enzyme aus humanen genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken erhalten werden. Entweder genomische Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken können aus DNA-Fragmenten hergestellt werden, die aus Zellen menschlicher Herkunft erzeugt wurden. Die Fragmente, die für die α-GalNAc codieren, können durch das Screenen derartiger Bibliotheken mit einer Nucleotidsonde identifiziert werden, die im Wesentlichen komplementär zu einem beliebigen Abschnitt der in der 2 wiedergegeben Sequenzen ist. Tatsächlich können Sequenzen, die mittels der Polymerase-Kettenreaktion erzeugt wurden, zur Bildung der vollständigen Sequenz ligiert werden. Es können zwar Abschnitte der codierenden Sequenzen eingesetzt werden, aber vollständige Klone, d. h. solche, die den gesamten codierenden Bereich für die α-GalNAc enthalten, können für die Expression bevorzugt sein. Alternativ können die in der 2 wiedergegeben codierenden Sequenzen durch die Anfügung von Sequenzen verändert werden, um das Expressionsionsniveau zu erhöhen und/oder die Reinigung zu erleichtern. Zum Beispiel könnte die für die α-GalNAc codierende Sequenz durch die Anfügung der für die Spaltstelle von Collagenase codierenden Nucleotidsequenz, gefolgt von der Sequenz des Proteins A von Staphylococcus, modifiziert werden. Die Expression dieses schimärischen Genkonstrukts würde zu einem Fusionsprotein führen, das aus α-GalNAc, dem Collagenasesubstrat und Protein A bestehen würde. Dieses Fusionsprotein kann mittels einer IgG-Säule, die die Protein-A-Gruppe bindet, leicht gereinigt werden. Nichtfusionierte α-GalNAc kann von der Säule durch eine Behandlung mit Collagenase frei gesetzt werden, die das α-GalNAc von der an die Säule gebundenen Protein-A-Gruppe abspaltet. Andere Substrate für eine enzymatische Spaltung und Bindungsproteine können gentechnologisch zu ähnlichen Konstrukten für die Erzeugung der α-GalNAc konstruiert werden, die leicht gereinigt und in ihrer biologisch aktiven Form frei gesetzt werden kann.
  • Es können Techniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, für die Isolierung der DNA, die Erzeugung der geeigneten Restriktionsfragmente, die Konstruktion von Klonen und Bibliotheken und für das Screenen von Rekombinanten verwendet werden. Bezüglich einer Übersicht über derartige Techniken siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, New York, Kapitel 1–18.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung könnte die codierende Sequenz der 2 als ganzes oder zum Teil unter Verwendung chemischer Verfahren, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden; siehe beispielsweise Carruthers et al., 1980, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215–233; Crea & Horn, 1980, Nucl. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucchi & Carruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; und Chow und Kempe, 1981, Nucl. Acids Res. 9(12): 2807–2817.
  • Alternativ könnte das Protein mittels chemischer Verfahren zur Synthese der in 2 wiedergegebenen Aminosäuresequenz als ganzes oder als Teil erzeugt werden. Zum Beispiel können Peptide mittels Festphasentechniken synthetisiert werden, vom Harz abgespalten und durch präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt werden (siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., New York, Seiten 50–60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch eine Aminosäureanalyse oder eine Sequenzierung bestätigt werden (beispielsweise das Abbauverfahren nach Edman; siehe Creighton, 1983, Proteins, Structures und Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., New York, Seiten 34–49).
  • Die humane α-GalNAc ist ein homodimeres Glycoprotein. Die vollständige cDNA der α-GalNAc sagt eine reife Untereinheit von 394 Aminosäuren voraus. Homologiesuchen in Computer-Datenbanken identifizierten kurze Abschnitte einer Homologie der α-GalNAc mit den Aminosäure-Sequenzen der Mel-1 der Hefe und der Mel-A von E. coli (siehe 4). Es ist wahrscheinlich, dass diese konservierten Regionen für die Enzymkonformation, die Stabilität, die Assoziation der Untereinheiten und/oder die Katalyse wichtig sind. Es wird deshalb bevorzugt, solche konservierten Bereiche nicht abzuändern. Es können jedoch bestimmte Modifikationen in der codierenden Sequenz vorteilhaft sein. Beispielsweise, könnten die sechs Konsensussequenzen für die N-verknüpfte Glycosylierung selektiv weg gelassen werden, wodurch die Glycosylierung des Enzyms verändert und die Phosphorylierung, Sialylierung, Sulfatierung usw. betroffen würde. Derartige modifizierte Enzyme können veränderte Eigenschaften hinsichtlich der Clearance und des Targeting haben, wenn sie Patienten injiziert werden. Oligosaccharid-Modifikationen können nützlich für das Targeting der α-GalNAc für eine effektive Enzymtherapie sein.
  • Es könnten auch die 5'-untranslatierten und die codierenden Bereiche der Nucleotidsequenz verändert werden, um die Translationseffizienz der mRNA der α-GalNAc zu verbessern. Beispielsweise könnte der Ersatz des Guanosins in der Position +4 der cDNA der α-Gal A durch ein Cytosin die Translationseffizienz der mRNA der α-GalNAc 5- bis 10-fach erhöhen (Kozak, 1987, J. Mol. Biol. 196: 947–950).
  • Außerdem könnten, basierend auf röntgenkristallographischen Daten, Sequenzveränderungen vorgenommen werden, um die Stabilität des Proteins zu verbessern, beispielsweise durch das Einführen von Disulfid-Brücken in den geeigneten Positionen und/oder das Deletieren oder Ersetzen von Aminosäuren, von denen vorhergesagt werden kann, dass sie eine Instabilität des Proteins verursachen. Das sind nur Beispiele für Modifikationen, die gentechnologisch durchgeführt werden können, um ein aktiveres oder stabileres Protein oder mehr Enzymprotein zu erzeugen oder sogar um die katalytische Spezifität des Enzyms zu verändern.
  • 5.2. EXPRESSION DER α-GalNAc
  • Zur Expression einer biologisch aktiven α-GalNAc wird die für das Enzym codierende Sequenz, ein funktionelles Äquivalent oder eine modifizierte Sequenz, wie es im Abschnitt 5.1. oben beschrieben wurde, in einen geeigneten Säugetier-Expressionsvektor eingefügt, d. h. einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für eine Transkription und Translation der insertierten codierenden Sequenz in geeigneten Säugetier-Wirtszellen enthält, d. h. Zellen, die die zelluläre Maschinerie und die Elemente für die richtige Prozessierung, d. h. Signalpeptid-Abspaltung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Sialylierung und Protein-Sortierung, enthalten. Wenn sie Menschen verabreicht werden sollten diese Expressionsprodukte in den richtigen Geweben wirken und keine schädlichen immunologischen Reaktionen hervorrufen.
  • 5.2.1. KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN UND HERSTELLUNG VON TRANSFEKTANTEN
  • Es können Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die codierende Sequenz der α-GalNAc sowie geeignete Steuersignale für die Transkription und die Translation enthalten. Zu diesen Verfahren gehören eine Rekombination in vitro und eine genetische Rekombination; siehe z. B. die Techniken, die bei Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, New York, Kapitel 12, beschrieben wurden.
  • Es können verschiedene eukaryotische Expressionssysteme eingesetzt werden, um die für die α-GalNAc codierende Sequenz zu exprimieren. Prokaryotische Systeme bieten zwar den klaren Vorteil, dass sie leicht zu manipulieren sind und ohne große Kosten in großem Umfang eingesetzt werden können, aber ihr großer Nachteil bezüglich der Expression der α-GalNAc liegt in ihrer Unfähigkeit, die exprimierten Säugetier-Proteine korrekt posttranslational modifizieren zu können. Eukaryotische Systeme, und vorzugsweise Säugetier-Expressionssysteme, ermöglichen eine korrekte Modifizierung. Eukaryotische Zellen, die die zelluläre Maschinerie für das richtige Prozessieren des primären Transkripts, die Glycosylierung, die Phosphorylierung und vorteilhafterweise die Sekretion des Genproduktes besitzen, sollten als Wirtszellen für die Expression der α-GalNAc verwendet werden. Säugetier-Zelllinien werden bevorzugt. Zu solchen Wirtszelllinien können, ohne auf sie beschränkt zu sein, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38 etc. gehören.
  • Es sollten geeignete eukaryotische Expressionsvektoren verwendet werden, um die Expression der α-GalNAc in der gewählten Wirtszelle zu steuern. Beispielsweise könnten wenigstens zwei grundsätzliche Ansätze für das Design derartiger Vektoren auf der Basis des SV40-Systems verfolgt werden. Der erste besteht darin, den frühen Bereich des SV40 durch das interessierende Gen zu ersetzen, während der zweite darin besteht, den späten Bereich zu ersetzen (Hammarskjold et al., 1986, Gerte 43: 41). Vektoren, bei denen der frühe oder der späte Bereich ersetzt sind, können auch in vitro mit der geeigneten SV40-Mutante komplementiert werden, die den frühen oder den späten Bereich nicht aufweist. Eine derartige Komplementierung führt zu Rekombinanten, die in infektiöse Capside verpackt werden und die das interessierende Gen enthalten. Dann kann eine permissive Zelllinie infiziert werden und das rekombinante Protein erzeugen. Vektoren auf der Basis des SV40 können auch in Studien zur transienten Expression verwendet werden, wobei die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn die Vektoren in COS-Zellen (CV-1, Origin von SV40), Abkömmlinge der CV-1-Zellen (Nierenzellen der Grünen Meerkatze) eingeführt werden, die eine einzige Kopie eines SV40-Genoms mit defektem Origin, das in das Chromosom integriert ist, enthalten. Diese Zellen synthetisieren aktiv das große T-Antigen (SV40), wodurch sie die Replikation eines beliebigen Plasmids, das den Replikationsursprung des SV40 enthält, initiieren.
  • Zusätzlich zum SV40 kann fast jedes molekular klonierte Virus oder Retrovirus als Klonierungs- oder Expressionsvehikel verwendet werden. Virale Vektoren, die auf verschiedenen Retroviren (von Vögeln oder der Maus), Adenoviren, dem Vaccinia-Virus (Cochran et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 19) und dem Polyoma-Virus basieren, können für die Expression verwendet werden. Andere klonierte Viren, wie JC (Howley et al., 1980,.J. Virol. 36: 878), BK und die humanen Papillomviren (Heilman et al., 1980, J. Virol. 36: 395) bieten das Potenzial, als eukaryotische Expressionsvektoren eingesetzt zu werden. Beispielsweise kann, wenn Adenovirus-Expressionsvektoren verwendet werden, die für die α-GalNAc codierende Sequenz mit einem Komplex ligiert werden, der die Transkription/Translation des Adenovirus steuert, beispielsweise der späten Promotorsequenz und der dreiteiligen Leader-Sequenz. Dieses schimärische Gen kann dann mittels In-vitro- oder In-vivo-Rekombination in das Genom des Adenovirus eingefügt werden. Die Insertion in einen nicht-essentiellen Bereich des viralen Genoms (beispielsweise den Bereich E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und imstande ist, das humane Enzym in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe z. B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659). Alternativ kann der 7,5-K-Promotor des Vaccinia-Virus verwendet werden (siehe beispielsweise Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415–7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927–4931). Besonders interessant sind Vektoren, die auf dem Rinderpapillomvirus basierert (Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 486). Diese Vektoren besitzen die Fähigkeit, als extrachromosomale Elemente zu replizieren. Kurz nach dem Eindringen dieser DNA in Mauszellen vermehrt sich das Plasmid auf ungefähr 100 bis 200 Kopien pro Zelle. Die Transkription der insertierten cDNA erfordert nicht die Integration des Plasmids in das Chromosom des Wirts, wodurch eine hohe Expression erhalten wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression verwendet werden, indem dem Plasmid ein selektiver Marker eingefügt wird, beispielsweise das neo-Gen. Eine hohe Expression kann auch durch die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie des Metallothionein-IIA-Promotors, der Heat-Shock-Promotoren etc. erzielt werden.
  • Für eine langfristige Produktion rekombinanter Proteine in hoher Ausbeute wird eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise kann man gentechnologisch konstruierte Zellen nach der Einführung der fremden DNA 1 bis 2 Tage lang in einem Anreicherungsmedium wachsen lassen und sie dann auf ein selektives Medium umstellen. Statt Expressionsvektoren zu verwenden, die den viralen Replikationsursprung enthalten, können die Wirtszellen mit der α-GalNAc-DNA transformiert werden, die durch geeignete Steuerelemente der Expression gesteuert wird (beispielsweise Promotor, Enhancer, Sequenzen, Terminatoren der Transkription, Polyadenylierungsstellen etc.) sowie einen selektierbaren Marker enthält. Der selektierbare Marker im rekombinanten Plasmid bewirkt eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und unter Ausbildung von Foci zu wachsen, die wiederum kloniert und zu Zelllinien vermehrt werden können. Es können verschiedene Selektionssysteme verwendet werden, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, die Gene der Thymidinkinase des Herpes-Simplex-Virus (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und der Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) gehören, die in tk–-, hgprt–- bzw.
  • aprt–-Zellen eingesetzt werden können. Ebenso kann eine Resistenz gegen Antimetaboliten als Basis der Selektion für dhfr, die eine Resistenz gegen Methotrexat bewirkt, eingesetzt werden (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, das eine Resistenz gegen Mycophenolsäure bewirkt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072; neo, das eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 bewirkt (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); sowie hygro, das eine Resistenz gegen Hygromycin bewirkt (Santerre et al., 1982, Gene 30: 147). Vor einiger Zeit wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das es Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, hisD, das es Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047), und ODC (Ornithindecarboxylase), die eine Resistenz gegen den Ornithindecarboxylase-Hemmstoff 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO, bewirkt (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.).
  • Alternative eukaryotische Expressionssysteme, die zur Expression der α-GalNAc-Enzyme verwendet werden können, sind Hefen, die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, die die für die α-GalNAc codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Systeme aus Insektenzellen, die mit rekombinanten viralen Expressionsvektoren (beispielsweise dem Baculovirus), die die für die α-GalNAc codierende Sequenz enthalten, infiziert sind; oder Systeme aus Pflanzenzellen, die mit rekombinanten viralen Expressionsvektoren (beispielsweise dem Blumenkohl-Mosaik-Virus, CaMV; dem Tabak-Mosaik-Virus, TMV) infiziert sind oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (beispielsweise dem Ti-Plasmid) transformiert sind, die die für die α-GalNAc codierende Sequenz enthalten.
  • Bei der Hefe können verschiedene Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, verwendet werden. Bezüglich eines Reviews siehe Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, 1988, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley, Interscience, Kapitel 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Hrsg. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, New York, Band 153, Seiten 516–544; Glover, 1986, DNA Cloning, Band II, IRL Press, Washington, D. C., Kapitel 3; und Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Hrsg. Berger & Kimmel, Acad. Press, New York, Band 152, Seiten 673–684; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Hrsg. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Band 1 und II. Für Komplementierungstests mit Hefe können cDNAs für die α-GalNAc in episomale Plasmide der Hefe (YEp) kloniert werden, die in der Hefe aufgrund der Anwesenheit des 2μ-Plasmidrings der Hefe autonom replizieren. Die cDNA kann entweder hinter einen konstitutiven Hefe-Promotor, wie ADN oder LEU2, oder einen induzierbaren Promotor, wie GAL, kloniert werden (Cloning in Yeast, Kapitel 3, R. Rothstein, in: DNA Cloning Band 11, A Practical Approach, Hrsg. D. M. Glover, 1986, IRL Press, Washington, D. C.). Die Konstrukte können die 5'- und die 3'-untranslatierten Bereiche der mRNA der verwandten α-GalNAc oder diejenigen, die einem Hefegen entsprechen, enthalten. Yep-Plasmide transformieren mit hoher Effizienz, und die Plasmide sind extrem stabil. Alternativ können Vektoren verwendet werden, die die Integration fremder DNA-Sequenzen in das Hefe-Chromosom fördern.
  • In Fällen, in denen pflanzliche Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression der für die α-GalNAc codierenden Sequenz durch einen, beliebigen von mehreren Promotoren angetrieben werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie die 35S-RNA und 19S-RNA RNA-Promotoren des CaM (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511–514) oder der Promotor des Hüllproteins des TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307–311) dazu verwendet werden; alternativ können pflanzliche Promotoren, wie die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838-843), oder Heat-Shock-Promotoren, beispielsweise hsp17.5-E oder hsp17.3-B der Sojabohne (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559–565) verwendet werden. Diese Konstrukte können In Pflanzenzellen eingeführt werden unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirus-Vektoren; direkter DNA-Transformation; Mikroinjektion, Elektroporation etc. Bezüglich Reviews derartiger Techniken siehe z. B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods für Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, Abschnitt VIII, Seiten 421–463; und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2. Auflage, Blackie, London, Kapitel 7–9.
  • Ein alternatives Expressionssystem, dass zur Expression der α-GalNAc verwendet werden könnte, ist ein Insektensystem. In einem derartigen System wird das Autographa californica nuclear polyhedrosis Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Zellen von Spodoptera frugiperda. Die für die α-GalNAc codierende Sequenz kann in nicht-essentielle Bereiche (beispielsweise das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des Polyhedrin-Promotors) gebracht werden. Die erfolgreiche Insertion der codierenden Sequenz führt zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Erzeugung von nicht occludiertem, rekombinantem Virus (d. h. eines Virus, dem die proteinhaltige Hülle fehlt, für die das Polyhedrin-Gen codiert). Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infizierung von Zeilen von Spodoptera frugiperda verwendet, in denen das insertierte Gen exprimiert wird (siehe z. B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, U.S. Patent Nr. 4 215 051).
  • 5.2.2. IDENTIFIZIERUNG VON TRANSFEKTANTEN ODER TRANSFORMANTEN, DIE DAS PRODUKT DES α-GalNAc-GENS EXPRIMIEREN
  • Die Wirtszellen, die die für die α-GalNAc codierende Sequenz enthalten und die das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können über wenigstens vier generelle Ansätze identifiziert werden: a) eine DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung; b) die Anwesenheit oder Abwesenheit von „Marker"-Genfunktionen; c) die Bestimmung des Ausmaßes der Transkription, wie sie anhand der Expression der mRNA-Transkripte der α-GalNAc in der Wirtszelle bestimmt wird, und d) den Nachweis des Genprodukts, das mittels eines Immunoassays oder über seine biologische Aktivität gemessen wird.
  • Beim ersten Ansatz wird die Anwesenheit der für die α-GalNAc codierenden Sequenz im Expressionsvektor durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen, die Nucleotidsequenzen enthalten, die der für die α-GalNAc codierenden Sequenz homolog sind, wie sie im wesentlich in der 2 gezeigt ist, oder Teilen. oder Derivaten davon.
  • Beim zweiten Ansatz kann das rekombinante System aus Expressionsvektor/Wirt basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter „Markergen"-Funktionen identifiziert werden (beispielsweise der Aktivität der Thymidinkinase, der Resistenz gegenüber Antibiotika, der Resistenz gegenüber Methotrexat, des Transformations-Phänotyps, der Bildung von Einschlusskörpern im Baculovirus etc.). Beispielsweise können, wenn die für die α-GalNAc codierende Sequenz in eine Sequenz eines Marker-Gens des Vektors insertiert ist, Rekombinanten, die die für die α-GalNAc codierende Sequenz enthalten, über das Fehlen der Markergen-Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen tandemartig zusammen mit der Sequenz der α-GalNAc unter die Kontrolle des gleichen oder eines anderen Promotors gebracht werden, der verwendet wird, um die Expression der für die α-GalNAc codierenden Sequenz zu steuern. Die Expression des Markers als Reaktion auf eine Induktion oder Selektion zeigt die Expression der für die α-GalNAc codierenden Sequenz an.
  • Beim dritten Ansatz kann die transkriptionelle Aktivität der für die α-GalNAc codierenden Region mittels Hybridisierungsassays bestimmt werden. Beispielsweise kann RNA isoliert und durch eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Sonde analysiert werden, die homolog zu einer für die α-GalNAc codierenden Sequenz oder speziellen Abschnitte von ihr ist, wie sie im Wesentlichen in 2 gezeigt ist. Alternativ können die gesamten Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und mit derartigen Sonden bezüglich einer Hybridisierung getestet werden.
  • Beim vierten Ansatz kann die Expression des α-GalNAc-Proteinprodukts immunologisch untersucht werden, beispielsweise mittels Western-Blots, Immunoassays wie Radioimmun-Präzipitierung, Enzyme-linked Immunoassays und dergleichen. Der letztendliche Test bezüglich eines Erfolges von Expressionssystemen beinhaltet jedoch den Nachweis des biologisch aktiven Produkts des α-GalNAc-Gens. Wenn die Wirtszelle das Genprodukt sekretiert, kann das zellfreie Medium, das von den kultivierten transfizierten Wirtszellen erhalten wird, bezüglich einer α-GalNAc-Aktivität untersucht werden. Wenn das Genprodukt nicht sekretiert wird, dann können Zelllysate auf eine derartige Aktivität getestet werden. In beiden Fällen können verschiedene Tests verwendet werden, um eine α-GalNAc-Aktivität nachzuweisen, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, gehören: a) Aktivität gegenüber 4-Methylumbelliferyl-α-N-acetylgalactosaminylpyranosid, wie es von Sweda et al., 1989, Can. J. Chem. 67: 1388–1391 beschrieben und von Schindler et al., 1989, N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740 angewendet wurde; und/oder (b) Aktivität gegenüber p-Nitrophenyl-α-N-acetylgalactosaminylpyranosid (Van Diggelen et al., 1988, J. Inherit. Metab. Dis. 11: 349-357); und dergleichen.
  • 5.2.3. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES PRODUKTS DES GENS DER α-GalNAc
  • Nachdem ein Klon identifiziert worden ist, der hohe Spiegel der biologisch aktiven α-GalNAc produziert, kann der Klon vermehrt und zur Erzeugung großer Mengen des Enzyms verwendet werden, das unter Verwendung von Techniken gereinigt werden kann, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind und zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, eine Immunaffinitätsreinigung, chromatographische Verfahren einschließlich einer Hochleistungsflüssigchromatographie und dergleichen gehören. Da das Enzym durch die kultivierten Zellen sekretiert wird, kann die α-GalNAc leicht aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
  • Wenn die für die α-GalNAc codierende Sequenz so konstruiert ist, dass sie für ein spaltbares Fusionsprotein codiert, dann kann die Reinigung der α-GalNAc leicht mittels Techniken einer Affinitätsreinigung erzielt werden. Zum Beispiel kann eine Konsensus-Erkennungssequenz für eine Spaltung durch Collagenase zwischen den Carboxyterminus der α-GalNAc und dem Protein A eingebaut werden. Das resultierende Fusionsprotein kann leicht über eine IgG-Säule, die die Protein-A-Gruppe bindet, gereinigt werden. Unfusionierte α-GalNAc kann leicht durch eine Behandlung mit Collagenase von der Säule frei gesetzt werden. Bei diesem Aspekt der Erfindung kann jede beliebige Spaltstelle oder jedes beliebige Substrat für eine enzymatische Spaltung zwischen die Sequenz der α-GalNAc und ein zweites Peptid oder Protein eingefügt werden, das einen Bindungspartner hat, der für die Reinigung verwendet werden könnte, beispielsweise jedes beliebige Antigen, für das eine Immunaffinitätssäule hergestellt werden kann.
  • 5.2.4. MODIFIZIERTE GLYCOFORMEN DER REKOMBINANTEN α-GalNAc
  • Modifikationen der rekombinanten α-GalNAc können aus verschiedenen Gründen erwünscht sein; beispielsweise für ein verändertes Gewebe-Targeting in vivo, eine veränderte biologische Aktivität etc. Insbesondere schließt die Erfindung die selektive Deglycosylierung der komplexen Kohlenhydratgruppen mit hohem Mannoseanteil ein, die kovalent. am rekombinanten Enzym befestigt sind, um verschiedene Glycoformen der rekombinanten α-GalNAc zu erzeugen. Zu derartigen Modifizierungen gehören, ohne auf sie beschränkt zu sein, die sequenzielle Deglycosylierung durch Neuraminidase zur Freilegung terminaler Galactose, β-Galactose; die Behandlung mit β-Galactosidase zur Freilegung von N-β-Acetylglucosaminyl-Resten; und die Behandlung mit N-β-Acetylglucosaminidase zur Freilegung von Mannose-Resten.
  • Die Deglycosylierung der rekombinanten α-GalNAc kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Die generellen Verfahren der sequenziellen Behandlung mit Exoglycosidasen sind im Wesentlichen diejenigen, die vor kurzem beschrieben wurden (1987, Meth. Enzymol. 149: 25). Es können, um das Ganze kurz zusammen zu fassen, terminale Sialinsäurereste durch eine Behandlung mit Neuraminidase, die kovalent an Agarose gebunden ist, entfernt werden. Für diesen Zweck kann Neuraminidase vom Typ VI (SIGMA Chemical Co., St. Louis, Missouri), die in einer Aktivität von 40 U/g an Agarose befestigt ist, zur Behandlung von α-GalNAc verwendet werden; beispielsweise können 100 mg α-GalNAc mit 8 Einheiten Neuraminidase-Konjugat bei pH 5,0 vier Stunden lang bei 37°C behandelt werden. Die konjugierte Neuraminidase kann durch Zentrifugation entfernt werden. Ähnlich kann aus Streptococcus pneumoniae gereinigte β-Galactosidase (3 Einheiten pro 100 mg α-GalNAc) zur Entfernung terminaler Galactosereste verwendet werden. Schließlich kann N-β-Acetylglucosaminidase aus der Schwertbohne (SIGMA Chemical Co., St. Louis, Missouri) eingesetzt werden; beispielsweise können 3 × 106 Einheiten mit Aliquots von jeweils 100 mg der rekombinanten α-GalNAc vier Stunden bei 37°C vermischt werden Bei jedem Schritt kann das rekombinante Enzym durch eine Reinigung der α-GalNAc, wie sie früher beschrieben wurde (Schindler et al., 1989, N. Eng. J. Med. 320: 1735–1740), schnell von deglycosylierendem Enzym und von Kohlenhydraten befreit werden.
  • 5.3. VERWENDUNGEN DER REKOMBINANTEN α-GalNAc
  • Die gemäß der Erfindung erhaltenen gereinigten Produkte können auf vorteilhafte Weise für eine Enzymersatz-Therapie bei Patienten mit der Schindler-Krankheit (α-GalNAc), einer lysosomalen Speicherkrankheit, eingesetzt werden. Die Schindler-Krankheit ist eine vor kurzem identifizierte, angeborene Störung des Glycokonjugat-Metabolismus, bei der die fehlende Aktivität der α-GalNAc zur Akkumulation von Glycokonjugaten führt. Die Krankheit vom Typ 1 wurde als eine neuroaxonale Dystrophie charakterisiert, und die Krankheit vom Typ II hat einen milderen Phänotyp, der durch Angiokeratome und eine minimale bis mäßige geistige Retardierung gekennzeichnet ist (Schindler et al., 1989, N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740; Kanzaki et al., 1989, Lancet 1: 875–877).
  • 6. BEISPIEL: KLONIERUNG UND EXPRESSION BIOLOGISCH AKTIVER α-GalNAc (zu Vergleichszwecken)
  • Die folgenden Unterabschnitte beschreiben die Erzeugung aktiver, humaner, rekombinanter α-Galactosidase B (α-GalNAc). Zur Isolierung einer vollständigen cDNA wurde das Enzym aus menschlicher Lunge bis zur Homogenität gereinigt, es wurden 129 nicht überlappende Aminosäuren durch die Mikrosequenzierung des N-Terminus und sieben tryptischer Peptide bestimmt, und vier Mischungen synthetischer Oligonucleotide wurden zum Screenen einer humanen cDNA-Bibliothek von Fibroblasten verwendet. Eine vollständige, aus einer plazentaren λgt11-cDNA-Bibliothek isolierte cDNA, pAGB-3, hatte ein Insert von 2158 bp mit einem offenen Leserahmen, der eine Aminosäuresequenz vorher sagte, die mit allen 129 mikrosequenzierten Resten des gereinigten Enzyms colinear war. Das pAGB-3-Insert hatte einen 5'-untranslatierten Bereich von 344 bp, einen offenen Leserahmen von 1236 bp, der für 411 Aminosäuren codierte, einen 3'-untranslatierten Bereich von 514 bp und einen Poly(A)-Trakt von 64 bp. Es wurden eine Signalpeptidsequenz von 17 Aminosäuren sowie sechs N-Glycosylierungsstellen vorhergesagt. Die pAGB-3-cDNA wurde in den Säugetier-Expressionsvektor p91023(B) subkloniert, und die Aktivität der humanen α-GalNAc wurde transient in COS-1-Zellen exprimiert, was die funktionelle Intaktheit der vollständigen cDNA demonstrierte. Eine Analyse der mRNA durch eine Northern-Hybridisierung ließ zwei Transkripte von ungefähr 3,6 und 2,2 kb erkennen, und Studien zur Primerextension zeigten eine Cap-Stelle beim Nucleotid -347 für die cDNA von 2,2 kb. Die Isolierung eines genomischen Klons, gAGB-1, und die Sequenzierung des Bereichs von 2048 bp, der pAGB-3 einschloss, zeigte ein Intron von 1754 bp zwischen den Codons 319 und 320, was auch der Ort einer Insertion von 70 bp (Tsuji et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 163: 1498–1504) und einer Deletion von 45 bp in anderen cDNA-Klonen war. Bemerkenswerterweise hatte die α-GalNAc-cDNA eine auffällige Aminosäurehomologie mit der cDNA der humanen α-Gal A, was die evolutionäre Verwandtschaft dieser Gene nahe legte. Die α-GalNAc-cDNA zeigte eine Übereinstimmung von 46,9% bis 64,7% bezüglich der Aminosäuren in Sequenzen (Codons 1-319), die den Exons 1 bis 6 der α-Gal A entsprachen, während die vergleichbare Sequenz des Exons 7 (pAGB-3-Codons 320–411) lediglich eine Homologie von 15,8% mit zahlreichen Lücken zeigte. Diese Befunde deuten darauf hin, dass der genomische Bereich beim Codon 319 und darum herum eine potenzielle Stelle für die abnormale Prozessierung von α-GalNAc-Transkripten sowie für ein Rekombinationsereignis in der Evolution und Auseinanderentwicklung der α-Gal A und der α-GalNAc ist. Die Verfügbarkeit der vollständigen cDNA der humanen α-GalNAc wird Studien über die, genomische Organisation und die Evolution dieses lysosomalen Gens sowie die Charakterisierung der molekularen Schäden, die die Schindler-Krankheit verursachen, möglich machen.
  • 6.1. MATERIALEN UND METHODEN
  • 6.1.1. AFFINITÄTSREINIGUNG, MIKROSEQUENZIERUNG UND ANTIKÖRPERHERSTELLUNG
  • Es wurde die α-GalNAc aus menschlicher Lunge zur Homogenität gereinigt, es wurden polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen die humane α-GalNAc erzeugt und gereinigt, und Zellüberstände wurden wie früher beschrieben einem Immunblotting unterzogen (Schindler et al., 1989, N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740; Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307-1316; Calhoun et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7364–7368). Zur Isolierung der tryptischen Peptide wurde die konzentrierte Fraktion nach der Hydroxyapatitreinigung einer präparativen 10% NaDodSO4/PAGE unterzogen, und die Spezies der α-GalNAc von 48 und 117 kDa wurden getrennt elektroeluiert (Hunkapillar et al., 1973, Methods Enzymol. 91: 227-236), mit Tosylphenylalaninchlormethylketon-behandeltem Trypsin verdaut, und die resultierenden tryptischen Peptide der beiden Spezies wurden über eine C8-Reversed-Phase-HPLC getrennt (Tsai et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 7049–7053). Die N-teminalen Aminosäuresequenzen sowohl der beiden Spezies mit 48 und 117 kDa und die Sequenzen der ausgewählten tryptischen Peptide der Spezies mit 48 kDa wurden über eine automatisierte Gasphasen-Mikrosequenzierung und eine HPLC-Identifizierung von Phenylthiohydantoin-Aminosäurederivaten bestimmt (Hunkapillar & Hood, 1983, Science 219: 650–654, 659).
  • 6.1.2. KONSTRUKTION SYNTHETISCHER OLIGONUCLEOTIDSONDEN
  • Gemischte und einzigartige Oligonucleotide wurden mittels eines Oligonucleotid-Syntheseapparates Model 380B von Applied Biosystems synthetisiert. Vier Oligonucleotidmischungen wurden für Bereiche minimaler Codon-Redundanz für die folgenden Sequenzen N-terminaler und tryptischen Peptide konstruiert:
    Figure 00220001
    von Bibliotheken wurden mit [γ-32P]ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase 5'-endmarkiert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 309–328, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, New York). Es wurden Oligonucleotide (17-mers) mit einmalig vorkommender Sequenz synthetisiert und als Primer in Sequenzierungsreaktionen verwendet. Zur Bestimmung der Cap-Site wurden zwei einmalig vorkommende, überlappende 30-mers, 5'-TCGGGACTCCCAGCACTGCAGAGGGTGTGA-3' und 5'-CTGCAGAGGGTGTGAGGTCTGACATCCAGG-3', für die Primerextension synthetisiert. Für den Nachweis alternativ gespleißter Transkripte hatten die PCR-Sense- und -Antisense-Primer für den Exonbereich, der die vermutete Insertion von 70 bp flankierte, die Sequenzen 5'-AGTCGAATTCTGATGTCCACAGACCTGCGT-3', bzw.
  • 5'-AGTCGTCGAGCATATCGGTCCTGCAGCTGA-3'. Die vier PCR-Primersequenzen für die Konstruktion der hybriden cDNA von α-Gal A und α-GalNAc waren
    Figure 00230001
  • 6.1.3. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER cDNA UND GENOMISCHER KLONE
  • Die humane pcD-Fibroblasten-cDNA-Bibliothek, die freundlicherweise von Dr. Hiroto Okayama (NIH) zur Verfügung gestellt wurde, wurde mit der Mischung der radioaktiv markierten 26-mer-Oligonucleotide, die dem tryptischen Peptid T-106A entsprachen, durch Kolonie-Hybridisierung gescreent (Tsai et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 7049–7053). Die Isolierung von Plasmid-DNA und die Analysen positiver Klone durch Southern Hybridisierung wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 309–328, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, New York). Zur Isolierung einer vollständigen cDNA wurde dann ein BamHI-Fragment von 0,9 kb, das dem 5'-Abschnitt des pAGB-1-Inserts entsprach, isoliert, nicktranslatiert und für das Screenen von Rekombinanten aus einer humanen plazentaren λgt11-Bibliothek (Clontech Laboratories, Palo Alto, Kalifornien) durch Plaque-Hybridisierung (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 309–328, Gold Spring Harbor Laboratories, New York, New York) verwendet. Zur Isolierung genomischer Klone, die die gesamte α-GalNAc-Sequenz enthielten, wurden 1 × 106 Rekombinanten aus einer humanen genomischen Cosmid-Bibliothek mit dem radioaktiv markierten pAGB-3-cDNA-Insert unter Einsatz der oben für das Screenen der cDNA-Bibliothek beschriebenen Bedingungen gescreent. Die genomische Bibliothek wurde aus größenabhängig ausgewählter DNA humaner Lymphoblasten-DNA hergestellt und freundlicherweise von Dr. Henrik Vissing (Mount Sinai School of Medicine) zur Verfügung gestellt.
  • 6.1.4. DNA-SEQUENZIERUNG UND COMPUTERUNTERSTÜTZTE ANALYSEN
  • Die BamHI-Inserts von pAGB-1 und ein EcoRl-BamHI-Restriktionsfragment von pAGB-3 wurden in M13 mp18 und mp19 subkloniert. Alle DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden über eine Primerextension unter Verwendung von entweder universellen M13-Primern oder von α-GalNAc-spezifischen Oligonucleotidprimern mittels des Didesoxyverfahrens in beiden Orientierungen durchgeführt (Sanger et al., 1980, J. Mol. Biol. 143: 161–178). Suchen nach Ähnlichkeit hinsichtlich der Nucleotid- und Aminosäuresequenz wurden mittels der Software der Genetics Computer Group der Universität von Wisconsin durchgeführt (Wolf et al., 1988, CABIOS. 4: 187–191). Eine computerunterstützte RNA-Faltung wurde mittels des PCFOLD-Programms durchgeführt (Zuker, 1989, Methods Enzymol. 180: 262–288).
  • 6.1.5. TESTS AUF TRANSIENTE EXPRESSION
  • Das Insert mit der vollständigen pAGB-3-cDNA der humanen α-GalNAc wurde in den eukaryotischen Expressionsvektor p91023(B) subkloniert. (Wong et al., 1985, Science 228: 810–813), der freundlicherweise von Dr. R. J. Kaufmann (Genetics Institute, Boston, Massachusetts) zur Verfügung gestellt wurde. Es wurde Plasmid-DNA dieses Konstrukts (genannt p91-AGB-3) gereinigt, und COS-1-Affennierenzellen wurden mit 10 μg der p91-AGB-3-Plasmid-DNA über eine Calciumphosphatfällung transfiziert (Chen & Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752). Die Zellen wurden nach der Transfektion in Abständen von 24 Stunden geerntet und wie früher beschrieben bezüglich der Aktivität der α-GalNAc getestet (Schindler et al., 1989., N. Engl. J. Med. 320: 1735–1740). Eine Einheit (U) der enzymatischen Aktivität ist gleich derjenigen Enzymmenge, die zur Hydrolyse von 1 nmol 4-MU-α-GalNAc pro Stunde benötigt wird. Proteinkonzentrationen wurden mittels des Fluorescamin-Verfahrens bestimmt (Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307-1316).
  • 6.1.6. NORTHERN-HYBRIDISIERUNG UND CAP-SITE-ANALYSEN
  • Gesamt-RNA wurde aus humanen Lymphoblasten, Fibroblasten und Plazenten isoliert, und die Northern-Hybridisierung wurde unter Verwendung des nicktranslatierten pAGB-3-Inserts als Sonde durchgeführt (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 309–328, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, New York). Alternativ wurde das pAGB-3-Insert in pGEM-4Z (Promega, Madison, Wisconsin) subkloniert, und eine radioaktiv markierte α-GalNAc-Ribosonde, rbAGB-3, wurde mittels des Riboprobe-Systems von Promega erzeugt und für die Northern-Hybridisierung verwendet. Zur Identifizierung der Cap-Stelle der α-GalNAc wurden zwei einmal vorkommende, überlappende 30-mer Oligonucleotid-Primen synthetisiert, die den Bereichen entsprachen, die 60 und 75 bp vom 5'-Ende der pAGB-3-cDNA entfernt waren, und endmarkiert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 309–328, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, New York). Jeder Primen (100 ng) wurde dazu verwendet, 10 μg der Gesamt-RNA der Plazenta mit dem cDNA-Synthese-Kit von BRL (BRL, Gaithersburg, Maryland) zu verlängern. Die Synthese des ersten Stranges wurde durch eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung gestoppt. Das Pellet wurde dreimal mit 70.% Ethanol gewaschen, in 6 μl H2O resuspendiert und dann mit 6 μl Beladungsfarbstoff gemischt (0,3% Xylolcyanol, 0,3% Bromphenolblau, 0,37% EDTA, pH 7,0). Die RNA/DNA-Heteroduplexe wurden bei 65°C 3 Minuten denaturiert, und ein Aliquot wurde auf einem Standard-Sequenzierungsgel (8 M Harnstoff, 8% Polyacrylamid) einer Elektrophorese unterzogen.
  • 6.1.7. KONSTRUKTION VON p91-α-GalA6/α-GalNAc7
  • Ein Plasmid, das die α-Gal-A-Exons 1 bis 6 von pcDAG-126 enthielt (Bishop et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3903–3907), wurde an den 3'-Bereich des α-GalNAc-Inserts von pAGB-3 ligiert, was bezüglich der Position dem Exon 7 der α-Gal A entsprach. Die hybride cDNA, die α-GalA6/α-GalNAc7 genannt wurde, wurde mittels der oben angegebenen Sense- und Antisense-Primen unter Verwendung eines PCR-basierten Verfahrens konstruiert (Ho et al., 1989, Gene 77: 51–59) und sequenziert. Das α-GalA6/α-GalNAc7-Insert wurde in den Expressionsvektor p91023(B) subkloniert, und das Konstrukt wurde wie oben beschrieben transient in COS-1-Zellen exprimiert. Die enzymatischen Aktivitäten der α-Gal A und der α-GalNAc und die Enzymproteine wurden mit 4-MU-Substraten bzw. durch Immunblotting mit dem jeweiligen polyklonalen Antikörper wie oben beschrieben nachgewiesen.
  • 6.1.8. PRIMEREXTENSION UND PCR-AMPLIFIZIERUNG VON cDNA UND GENOMISCHEN SEQUENZEN
  • Für die PCR-Amplifizierung des vermuteten alternativ gespleißten Bereichs wurden die oben beschriebenen 30-mer-Sense- und -Antisense-Primer verwendet, um (a) revers transkribierte mRNA aus verschiedenen humanen Quellen, (b) cDNA-Inserts von den Klonen pAGB-4 bis -34; und (c) die genomische gAGB-1-Sequenz zu amplifizieren. DNAs der pAGB-4 bis -34 cDNA-Klone und des genomischen gAGB-1-Klons wurden wie beschrieben isoliert (Tsai et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 7049–7053; und Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboraton Manual, Seiten 309–328, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, New York). cDNA wurde von 10 μg der Gesamt-RNA von Lymphoblasten, Fibroblasten und der Plazenta oder 2,5 μg einer Poly(A)+-mRNA (Clontech, Palo Alto, Kalifornien) mittels des cDNA-Synthese-Kits von BRL synthetisiert. Bakteriophagen-DNA (~0,1 μg) und revers transkribierte mRNA (~0,1 μg) oder genomische Cosmid-DNA (~1 μg) wurde unter Einsatz von 20 μM eines jeden Primers und des GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) PCR-amplifiziert. Jeder PCR-Zyklus bestand aus 1 Minute Denaturierung bei 94°C; 2 Minuten Hybridisieren bei 37°C und 7-minütigem Verlängern bei 60°C. Die PCR-Produkte wurden phenolextrahiert, ethanolgefällt und in 20 μl H2O resuspendiert. Ein Aliquot (2 μl) aus jeder PCR-Reaktion wurde über eine Elektrophorese auf Agarosegelen unter Verwendung HindIII-verdauter Lambda- und HaeIII-verdauter φX174-DNA als Größenstandards analysiert. Zur Identifizierung potenzieller Stops während der reversen Transkription des Bereichs, der die pcD-HS1204-Insertion umgab, wurde ein einmalig vorkommendes 32-mer, 5'-AGTAGTAAGCTTTCATATATCACAGACCCGGT-3', verwendet, um 10 μg der Gesamt-RNA der Plazenta oder 1 μg rbAGB-3, wie oben beschrieben in vitro mittels des Riboprobe-Systems von Promega erzeugt, zu verlängern.
  • 6.2. ERGEBNISSE
  • 6.2.1. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER HUMANEN α-GalNAc
  • Die humane α-GalNAc wurde zur Homogenität gereinigt (spezifische Aktivität = 370 000 U/mg Protein), wie über das Vorkommen lediglich der 48- und 117-kDα-Spezies auf der NaDodSO4/PAGE (1, Insert) geschlossen wurde. Die Spezies mit 117 kDa wurde durch Kochen oder eine Dialyse gegen 8 M Harnstoff in Anwesenheit von (3-Mercaptoethanol nicht reduziert. Die 27 mikrosequenzierten N-terminalen Reste der elektroeluierten Spezies von 117 kDa waren mit denjenigen der Spezies mit 48 kDa identisch. Ein weiterer Hinweis darauf, dass die Spezies von 117 kDa ein Homodimer der Glycoproteinuntereinheit von 48 kDa war, war der Befund, dass die tryptischen Verdaus (und die chymotryptischen Verdaus) beider Spezies praktisch identische HPLC-Profile lieferten (1). Eine Mikrosequenzierung des N-Teminus und von sieben tryptischen Peptiden der Spezies von 48 kDa identifizierte insgesamt 129 nicht überlappende α-GalNAc-Reste. Für das Screenen von Bibliotheken wurden synthetische Oligonucleotidmischungen (17- bis 26-mers) so konstruiert, dass sie alle möglichen Codons für ausgewählte Aminosäuresequenzen vom N-Terminus und drei internen tryptischen Peptiden (1 und 2) enthielten.
  • 6.2.2. ISOLIERUNG, CHARAKTERISIERUNG UND EXPRESSION EINER VOLLSTÄNDIGEN cDNA
  • Ein Screening von 2 × 106 Rekombinanten der pcD-cDNA-Bibliothek aus humanen Fibroblasten mit einer 26-mer-Oligonucleotidmischung aus 576 . Spezies, die dem internen Peptid T-106A entsprachen, erkannte zwei vermutlich positive Klone. pAGB-1, das mit allen vier Oligonucleotidmischungen hybridisierte, hatte ein Insert von 1,8 kb mit einem offenen Leserahmen von 1242 bp, einen 3'-untranslatierten Bereich von 514 bp und einen Poly(A)- Trakt, aber offenbar keine 5'-untranslatierte Sequenz. Die Authentizität wurde über die Colinearität der für das pAGB-1-Insert vorhergesagten Aminosäuresequenz mit 129 mikrosequenzierten Resten des gereinigten Proteins sicher gestellt. Zur Isolierung einer vollständigen cDNA wurde das 5'-BamHI-Fragment von 0,9 kb des pAGB-1-Inserts radioaktiv markiert und zum Screenen einer humanen cDNA-Bibliothek aus der Plazenta verwendet. Von 32 vermutlich positiven Klonen (pAGB-3 bis -34) enthielt pAGB-3 das längste Insert und wurde in beiden Orientierungen sequenziert. Wie in der 2 gezeigt ist, hatte das pAGB-3-Insert von 2158 bp einen 5'-untranslatierten Bereich von 344 bp, einen offenen Leserahmen von 1236 bp, der für 411 Aminosäuren codierte, einen 3'-untranslatierten Bereich von 514 bp und einen Poly(A)-Trakt von 64 bp. Ein stromaufwärts befindliches, im Leserahmen liegendes ATG kam bei nt -192 vor, aber es gab im Leserahmen liegende Terminationscodons bei nt -14.1, -135, und -120, was anzeigte, dass das ATG bei -192 nicht funktionell war. Ein einziges Konsensus-Polyadenylierungssignal (AATAAA) und eine Konsensus-Erkennungssequenz (CACTG) für das kleine nucleäre Ribonucleoprotein U4 (Berget, 1984, Nature (London) 309: 179–182) lagen 16 bzw. 65 bp vom Poly(A)-Trakt entfernt vor. Im Rückblick enthielt die partielle cDNA, pAGB-1, den gesamten codierenden Bereich von 1236 bp sowie 6 bp der 5'-untranslatierten Sequenz.
  • Eine Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz von pAGB-3 lieferte Hinweise auf eine Signalpeptid-Sequenz mit 17 Resten, da Leu-18 der N-teminale Rest des mikrosequenzierten reifen Enzyms war. Wenn die „weight matrix method" von von Heijne (von Heijne, 1986, Nucleic Acids Res. 14: 4683–4960) zur Vorhersage der Peptidase-Spaltstelle verwendet wurde, hatte die bevorzugte Stelle, zwischen Ala-13 und Gln-14, eine Punktzahl von 4,34, während die Spaltung nach Met-17 eine Punktzahl von 2,38 hatte. Die vorhergesagte Molekülmasse der reifen, nicht glycosylierten Enzymuntereinheit (M = 44 700) mit 394 Resten stimmte mit derjenigen (48 kDa) überein, die über die NaDodSO4/PAGE des gereinigten glycosylierten Enzyms abgeschätzt worden war. Diese Befunde legen nahe, dass die reife Glycoproteinuntereinheit wenigstens zwei N-verknüpfte Oligosaccharidketten aufwies, auch wenn es sechs vermutete N-Glycosylierungsstellen bei den Asn-Resten 124, 177, 201, 359, 385 und 391 gab (2).
  • Für die transiente Expression wurde das vollständige pAGB-3-cDNA-Insert in den eukaryotischen Expressionsvektor p91023(b) subkloniert, und das Konstrukt, p91-AGB-3, wurde in COS-1-Affennierenzellen transfiziert. Im Vergleich zur endogenen mittleren Aktivität der α-GalNAc in scheintransfizierten COS-1-Zellen (35 U/mg; Bereich: 23–50 U/mg; n = 6), enthielten die transfizierten Zellen 72 Stunden nach der Transfektion eine mittlere Aktivität von 600 U/mg (Bereich: 104–2400 U/mg; n = 6) oder ungefähr das 17-fache der endogenen Aktivität. Das exprimierte humane Enzymprotein wurde auch mittels einer Immunblot-Analyse unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern gegen die humane α-GalNAc nachgewiesen, während das endogene Enzym des Affen in unterschiedlichem Ausmaß, entweder als schwach sichtbare Bande bei ~40 kDa oder gar nicht, nachweisbar war (3). Die exprimierte humane Enzymuntereinheit hatte ein Molekulargewicht von ~48 kDa, was anzeigte, dass sie glycosyliert wa r.
  • 6.2.3. NORTHERN-HYBRIDISIERUNG UND CAP-SITE-ANALYSEN
  • Die Northern-Hybridisierungsanalysen zeigten insgesamt zwei Transkripte, cytoplasmatische oder Poly(A)+-RNA von ungefähr 2,2 und 3,6 kb, die in ähnlichen Mengen. Vorlagen. Für die Cap-Site wurde ermittelt, dass sie sich bei einer Primerextension der Gesamt-RNA aus der Plazenta und Verwendung von zwei überlappende Oligonucleotid-Sonden bei -347, oder 3 nt jenseits des 5'-Endes des pAGB-3-cDNA-Inserts, befand. Das Transkript von 3,6 kb war das Ergebnis eines stromabwärts liegenden Polyadenylierungssignals.
  • 6.2.4. SEQUENZHOMOLOGIE ZWISCHEN DER α-GalNAc UND DER α-Gal A
  • Computerunterstützte Suchen in Nucleinsäure- und Protein-Datenbanken zeigten keine signifikanten Ähnlichkeiten zwischen der Aminosäuresequenz der α-GalNAc und denjenigen beliebiger anderer DNA- oder Proteinsequenzen, mit Ausnahme derjenigen der humanen α-Gal A (Bishop et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3903–3907). Ein Vergleich der Nucleinsäuresequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz der vollständigen cDNAs der α-GalNAc und der α-Gal A zeigten eine Gesamt-Homologie von 55,8% bzw. 46,9%. Da die Intron/Exon-Übergänge und die gesamte, für die humane α-Gal A codierende genomische Sequenz bestimmt worden waren (Bishop et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3903-3907; und Kornreich et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 3301–3302), war es möglich, die Aminosäuresequenz der α-GalNAc mit denjenigen, die aus den sieben α-Gal-A-Exons abgeleitet wurden, zu vergleichen (4). Interessanterweise wurde eine bemerkenswerte Übereinstimmung (56,4%) der α-GalNAc-Sequenzen, die denjenigen der α-Gal-A-Exons 1 bis 6 entsprachen, gefunden. Zum Beispiel kamen alle acht Cystein-Reste in der α-GalNAc in identischen Positionen in der α-Gal A vor. Von den 14 Prolin- und 23 Glycin-Resten in der α-Gal A waren 10 bzw. 20 in identischen Positionen in der α-GalNAc konserviert. Außerdem waren alle vier N-Glycosylierungsstellen der α-Gal A in der α-Gal B konserviert. Vermutliche funktionelle Domänen wurden durch kürzere Abschnitte von Aminosäurehomologien in den Exons 1 bis 6 der α-Gal A nahe gelegt, die in der α-GalNAc, der α-Gal A, der α-Galactosidase (Mel 1) der Hefe (Liljestrom, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 7257–7268) und/oder der α-Galactosidase von E. coli (Mel A) (Liljestrom und Liljestrom, 1987, Nucleic Acids Res. 15: 2213–2220) vorkamen. Im Gegensatz dazu lag nur eine geringe, wenn überhaupt eine, Ähnlichkeit der vorhergesagten carboxyterminalen Aminosäuresequenz nachdem Rest 319 der α-GalNAc vor, die dem Exon 7 der α-Gal A entsprach (15,8% Homologie mit zahlreichen Lücken). Außerdem gab es keine signifikanten Ähnlichkeiten mit den cDNAs, die für andere humane lysosomale Polypeptide codieren, mit Ausnahme einer kurzen α-GalNAc-Sequenz (Reste 365 bis 371), bei der sechs von sieben Aminosäuren mit den Resten 194 bis 200 der α-Kette der (β-Hexosaminidase, einem lysosomalen Polypeptid mit N-Acetylgalactosaminidase-Spezifität (Proia, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1883–1887), identisch waren. Diese Befunde legten nahe, dass ein cDNA-Konstrukt, das die Exons 1–6 der α-Gal A, verknüpft mit dem Exon 7 der α-GalNAc, enthielt, ein hybrides Protein mit den Aktivitäten der α-Gal-A und -B exprimieren könnte. Deshalb wurde eine hybride cDNA konstruiert, die die Exons 1 bis 6 (nt 60-1029) der α-Gal A und das Exon 7 (nt 958–1258) der α-GalNAc enthielt, und in COS-1-Zellen exprimiert. Es wurde zwar ein immunreaktives Protein nachgewiesen, aber das Protein zeigte weder die Enzymaktivität der α-Gal A noch der α-GalNAc.
  • Der Nachweis einer extensiven Homologie zwischen der α-GalNAc und der α-Gal A legte nahe, dass sie sich aus über eine Duplizierung und Auseinanderentwicklung ausgehend von einer Vorläufersequenz für die Exons 1 bis 6 der α-Gal A entwickelten. Es gibt zwar nur eine geringe, wenn überhaupt eine Homologie unter den anderen lysosomalen Aminosäuresequenzen (d. h. keine „lysosomalen Domänen"), aber es gibt bemerkenswerte Beispiele für lysosomale Enzymuntereinheiten, Pseudogene oder Genfamilien, die sich vermutlich über eine Duplizierung und Auseinanderentwicklung entwickelten; (beispielsweise Proia, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1883–1887; Horowitz et al., 1989, Genomics 4: 87-96; und Schuchman et al., 1990, Genomics 6: 149–158). Ein zukünftiger Vergleich der Intron/Exon-Grenzen der α-GalNAc und der α-Gal A sollte weitere Informationen über die Evolution dieser lysosomalen Gene liefern, die für strukturverwandte, aber funktionell spezifische Glycohydrolasen codieren.
  • 6.2.5. PRIMEREXTENSION UND PCR- UND SEQUENZANALYSEN DER cDNA UND GENOMISCHER SEQUENZEN
  • Während diese Studien im Gange waren berichteten Tsuji et al. eine ähnliche humane cDNA-Sequenz der α-GalNAc (Tsuji S. et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1498-1504), die sich von pAGB-3 durch eine Insertion von 70 bp nach nt 957 (5A) und durch mehrere Substitutionen (nt 493, 494, 524, 614 und 667) unterschied. Die Insertion von 70 bp bestand aus drei umgekehrten Wiederholungen (nt 919–926, 919–936 und 919–944) und einer direkten Wiederholung (nt 940–957) der Nucleotide 919 bis 957 der für pAGB-3 codierenden Sequenz. Die Analyse der cDNA-Sequenz von pAGB-3 für nt 760–1053 mittels eines Programms zur Analyse der RNA-Faltung (Zuker, 1989, Methods Enzymol. 180: 262–288) sagte eine Struktur aus Stamm und Schleife für nt 918 bis 937 voraus (5A), die die reverse Transkription der mRNA der α-GalNAc während der Synthese der cDNA verzögern oder stoppen könnte. Um zu bestimmen, ob diese Sekundärstruktur zu Fehlern bei der Synthese der cDNA bei der Konstruktion der Bibliothek führen könnte, wurde ein 32-mer-Oligonucleotidprimer verwendet, um die gesamte plazentare RNA und die α-GalNAc-Transkripte, die in vitro mit dem Ribosonden-Konstrukt rbAGB-3 erzeugt wurden, zu verlängern. Es wurden Stopps unterschiedlicher Intensität von nt 903 bis 1009 beobachtet, einschließlich von zwei schwachen Stopps an der 3'-Basis (nt 940) und dem 5'-Ende (nt 921) der Struktur aus Stamm und Schleife (5A). Es kam allerdings nicht zu effektiven Stopps in diesem Bereich. Auch wenn der tatsächliche Mechanismus unbekannt ist, waren diese Befunde konsistent mit der Annahme, dass die Insertion von 70 bp von einer komplexen Abnormalität herrührt, an der ein RNA-DNA-Duplex bei der Konstruktion der cDNA-Bibliothek beteiligt ist (Roberts et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 468–476). Eine andere Möglichkeit wäre eine Insertion aufgrund eines komplexen „strand-switching" Ereignisses unter Beteiligung der DNA-Polymerase I (Papanicolaou & Ripley, 1989, J. Mol. Biol. 207: 335–353).
  • Alternativ kann diese Insertion von 70 bp aus einem alternativen Spleißen herrühren, obwohl die Insertion ein verkürztes α-GalNAc-Polypeptid mit 358 Resten vorhersagt. Um das mögliche Vorkommen von α-GalNAc-Transkripten mit einer Insertion von 70 bp nach dem nt 957 von pAGB-3 zu untersuchen wurde die PCR eingesetzt für eine Amplifizierung dieses Bereichs in (a) revers transkribierter mRNA aus verschiedenen Quellen, (b) den cDNA-Inserts der Klone pAGB-4 bis -34 und (c) dem genomischen Klon gAGB-1. Wenn die cDNA-Inserts oder die revers transkribierten RNAs das Insert von 70 bp enthielten, würde ein PCR-Produkt von 290 bp beobachtet werden, während die Abwesenheit des Inserts zu einem PCR-Produkt von 220 bp führen würde. Es wurde lediglich das Produkt mit 220 bp in PCR-amplifizierter, revers transkribierter Gesamt-RNA aus humanen Lymphoblasten, Fibroblasten und Plazenta oder in der Poly(A)+-mRNA aus dem Gehirn beobachtet. Somit fanden diese Analysen keine kürzeren oder längeren Transkripte. Alle cDNA-Inserts von pAGB-4 bis -34 zeigten lediglich das PCR-Produkt mit 220 bp, mit Ausnahme von pAGB-13, das eine im Leserahmen liegende Deletion von 45 bp nach dem nt 957 des pAGB-3 enthielt (d. h., nt 958 bis 993 fehlten). Eine kurze direkte Wiederholung (ACAAG) kam an beiden Bruchpunkt-Verbindungen vor. Interessanterweise kam die Deletion an der gleichen 5'-Stelle der Insertion von 70 bp in pcD-HS1204 vor (Tsuji et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 163: 1498–1504; 5A).
  • Die nachfolgende Sequenzierung des Bereichs, der die pAGB-3-Codons 254 bis 351 im genomischen Klon gAGB-1 einschloss, zeigte eine Sequenz von 2048 bp, die ein Intron von 1754 bp zwischen den pAGB-3-Nucleotiden 957 und 958 enthielt. Die Intron-Sequenz hatte keine Homologie mit dem Intron 6 der α-Gal A, enthielt zwei repetitive Alu-Sequenzen in umgekehrter Orientierung und enthielt nicht die Insertion von 70 bp in irgendeiner Orientierung (5B). Es erschien bemerkenswert, dass sowohl die pAGB-13-Deletion als auch die pcD-HS1204-Insertion an der gleichen 5'-Donor-Spleißstelle, dem nt 957 dieses Introns, vorkam. Möglicherweise kann die Lokalisation der Konsensus-Sequenzen des Lariat-Verzweigungspunkts im Intron weit stromaufwärts (94 und 199 bp) der 3'-Spleißstelle das Spleißen beeinträchtigen (Reed & Maniatis, 1988, Genes Dev. 2: 1268–1276). Dieses Konzept wird durch die pAGB-13-Deletion unterstützt, bei der der näher liegende kryptische Lariat-Verzweigungspunkt und die 3'-Spleißstelle verwendet wurden. Somit kann dieses Intron oder der umgebende Bereich eine besondere Struktur und/oder eine Sekundärstruktur haben, die die Genauigkeit der Prozessierung der hnRNA beeinträchtigt bzw. beeinträchtigen. Da der Intron/Exon-Übergang nach dem codierenden nt 957 auch die Stelle der Auseinanderentwicklung der Sequenzen der α-Gal A und B ist, könnte dieser Bereich auch in der Evolution der humanen α-GalNAc mechanistisch bedeutsam sein.
  • 7. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
  • Die folgenden E.-coli-Stämme, die die aufgeführten Plasmide tragen, wurden bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, hinterlegt und erhielten die folgenden Zugangsnummern:
    Figure 00310001
    Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Umfang nicht durch die hinterlegten Mikroorganismen eingeschränkt sein, da die niedergelegten Ausführungsformen als Veranschaulichung individueller Aspekte der Erfindung gedacht sind, und im Umfang dieser Erfindung sind beliebige Mikroorganismen oder Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, mit eingeschlossen. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen aus der obigen Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen für Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein. Derartige Modifikationen sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche mit eingeschlossen sein.

Claims (14)

  1. Verfahren zur Herstellung von humaner α-N-Acetylgalactosaminidase, das umfaßt: (a) Kultivieren einer eukaryotischen Zelle, die eine chromosomal integrierte Nucleotidsequenz enthält, die für α-N-Acetylgalactosaminidase codiert und von einer zweiten Nucleotidsequenz reguliert wird, die die Genexpression so steuert, daß die α-N-Acetylgalactosaminidase-Nucleotidsequenz stabil überexprimiert wird, was zu einer enzymatisch aktiven α-N-Acetylgalactosaminidase führt; und (b) Gewinnen der biologisch aktiven α-N-Acetylgalactosaminidase aus der Kultur, wobei die Nucleotidsequenz, die für die α-N-Acetylgalactosaminidase codiert, die Sequenz umfaßt, die in 2 von Nucleotid Nummer 1 bis 1236 dargestellt ist, oder die Sequenz, die in 2 von Nucleotid Nummer 52 bis 1236 dargestellt ist, und wobei die chromosomal integrierte Nucleotidsequenz außerdem eine Nucleotidsequenz einschließt, die für einen selektierbaren Marker codiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Nucleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen viralen Promotor umfaßt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Nucleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen induzierbaren Promotor umfaßt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die exprimierte α-N-Acetylgalactosaminidase aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
  5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die eukaryotischen Zelle eine Säugetierzelle ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Säugetierzelle eine Zellinie aus dem Ovarium des chinesischen Hamsters ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, das umfaßt: (a) Kultivieren einer eukaryotischen Zelle, die eine chromosomal integrierte Nucleotidsequenz enthält, die für eine Spaltstelle codiert, die zwischen einer für α-N-Acetylgalactosaminidase codierenden Sequenz und einer für ein Bindungsprotein codierenden Sequenz angeordnet ist, die im gleichen Translations-Leseraster angeordnet sind und von einer zweiten Nucleotidsequenz kontrolliert werden, die die Genexpression so reguliert, daß die Nucleotidsequenz des Fusionsproteins überexprimiert wird; (b) Gewinnen des Fusionsproteins aus der Kultur; (c) Behandeln des Fusionsproteins mit einer Substanz, die die Spaltstelle spaltet, so daß die α-N-Acetylgalactosaminidase von dem Bindungsprotein getrennt wird; und (d) Gewinnen der abgetrennten α-N-Acetylgalactosaminidase.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Fusionsprotein durch Reaktion mit einem Bindungspartner für das Bindungs- Protein aus der Kultur gewonnen wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Bindungspartner immobilisiert ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem das Bindungsprotein die Protein-A-Domäne E ist und der Bindungspartner ein Immunglobulin ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Substanz, die die Spaltstelle spaltet, ein Enzym ist, und die Spaltstelle für das Enzym substratspezifisch ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Enzym Kollagenase ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 11, bei dem die eukaryotische Zelle eine Säugetierzellinie ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die chromosomal integretierte Nucleotidsequenz sich von dem rekombinanten Vektor pAGB-3 ableitet, wie er bei der Agricultural Research Culture Collection unter Zugangsnummer B-18724 hinterlegt ist.
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