DE69832603T2

DE69832603T2 - An plasmamebranen lokalisierte sialidasen und dafür kodierende dna

Info

Publication number: DE69832603T2
Application number: DE69832603T
Authority: DE
Inventors: Taeko Natori-shi MIYAGI; Tadashi Natori-shi WADA; Yuko Natori-shi YOSHIKAWA
Original assignee: MIYAGI KEN SENDAI
Current assignee: MIYAGI KEN SENDAI
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2018-05-12
Also published as: US6225454B1; ES2253815T3; EP0984061B1; US20010021768A1; JPH10313869A; JP3088681B2; EP0984061A1; EP0984061A4; US6534632B2; WO1998053052A1; DE69832603D1

Description

Technisches Umfeld der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung werden eine neue Sialidase und eine DNA-Kodierung hierfür geschaffen. Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung sieht eine Sialidase vor, die in Plasmamembranen lokalisiert ist und die im besonderen Ganglioside hydrolisiert und eine DNA Kodierung hierfür ist.
Die Sialidase der vorliegenden Erfindung und die DNA-Kodierung hierfür verwendet. Hierbei wird die Sialidase als ein Reagenz benutzt, das in Saccharidkettenstudien und als Medikament für die Gendiagnostik und Gentherapie angewandt wird.
Stand der Technik
Sialidase ist ein glykohydrolytisches Enzym, das in lebenden Körpern vorkommt und Sialinsäurerückstände eli miniert nicht reduzierenden Endgruppen von Saccharidketten der Glykoproteine oder Glykolipide. Es ist bekannt, dass wenn die Sialinsäure von Saccharidkettenmolekülen entfernt wird nicht nur der Abbau dieser Moleküle beginnt sondern auch die molekulare Anpassung und von besonderer Bedeutung die Zellfunktionen welche den Wiedererkennungsmechanismus durch die Rezeptoren, die Zelladhäsion und die Immunmechanismen sind hier von betroffen und können möglicherweise wechseln. Es ist ferner deutlich geworden, dass Sialidase einen erheblichen Aktivitätswechsel zeigt im Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit und der Karzinogenese der Zellen und es ist des Weiteren in der Befähigung von Krebszellen zur Metastasierung beteiligt. Wie auch immer, es gibt sehr wenig Kenntnis darüber, wie Sialinsäure im lebenden Organismus abgebaut wird. Das liegt darin begründet, dass die Studien von Säugetiersialidasen am Molekularlevel rückständig sind. Daher gibt es hier viele unbekannte Punkte, was deren Strukturen, Ausdrucksmechanismen anbelangt. Das liegt daran, dass Säugetiersialidasen nur eine geringe Aktivität anzeigen und diese extrem instabil und deren Isolierung und Reinigung dieser Enzyme als sehr schwierig erwiesen haben.
Sialidase wurde über einen langen Zeitraum häufig als das Enzym betrachtet, dass als bloße Lyosomalenzyme in der Dissimilation und den Abbauprozessen involviert ist. Unter diesen Bedingungen haben wir das Enzym isoliert und gereinigt. Wobei wir hauptsächlich Rattengewebe als eine Quelle dieses Enzyms verwendet haben. Wir haben herausgefunden, dass es vier Typen von Sialidase gibt, die sich von Sialidasen von Bakterien, Viren, Protozonen und ähnlichen Vorkommen (Miyagi, T. und Tsuiki, S., Eur. J. Biochem. 141, 75–81, 1984; Miyagi, T. et al., J. Biochem. 107, 787–793, 1990; Miyagi, T. und Tsuiki, S., J. Biol. Chem. 260, 6710–6716, 1985). Jedes dieser Enzyme wurde in einer Lysosomalmatrix lokalisiert. Ferner in der Lysosommembran, der Plasmamembran (Zelloberflächenmembran) und in dem Zytoplasma innerhalb einer Zelle. Und diese unterscheiden sich von jedem anderen Enzym, nicht nur in den enzymologischen Charakteristika wie Substratspezifisch, sondern auch in den immunologischen Eigenschaften. Unter diesen Sialidasen ist die Sialidase im Zytoplasama lokalisiert und kann als ein homogenes reines Produkt aus der Skelettmuskulatur von Ratten erhalten werden. Das CDNA Klonen gelang zum ersten Mal in der Welt für tierische Sialidasen und ihre primäre Struktur wurde bestimmt (Miyagi T. et al., J. Biol. Chem., 268, 26435–26440, 1993). Ihre genomische Struktur wurde ebenso annullisiert ebenso ihre Funktion. Es wurde erläutert, dass das Enzym in der Differenziation und dem Wachstum von Skelettmuskelzellen durch die Verwendung von CDNA als eine Probe beteiligt ist. Diese Studien können als ein Teil von einer Pionieruntersuchung von Sialidasestudien in der Welt betrachtet werden.
Durch vorausgehende Studien wurde deutlich, dass hier die Möglichkeit, dass die Sialidase in Plasmamembranen lokalisiert ist und eine erhöhte Aktivität anzeigt, die im Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit und der Karzinogenese von Zellen aufzeigt. Ferner ist die Sialidase auch zum großen Teil an der Diffenziation von Nervenzellen und die Signalweitergabe an Zellen beteiligt. Bis zum heutigen Tage wurde nicht bis im Einzelnen die Struktur dieses Enzymes, der Mechanismus der diesen Aktivitätswechsel und dergleichen auslöst verstanden. Um diese Fragen zu beantworten, was viele Wissenschaftler auf diesem Gebiet für lange erwünscht haben, ist das Klonen ihrer CDNA. Beispielsweise könnte der Krebsaus lösende Mechanismus aufgrund dieses Enzyms erläutert werden; es wäre möglich diese Ergebnisse in der Diagnose und Therapie von Krebs zu verwenden. Ferner existieren Ganglioside in den Oberflächenmembranen vieler Zellen und sind an vielen wichtigen Zellfunktionen beteiligt; so wie die Zelladhäsion und die Informationelle Kommunikation der Zellen untereinander. Ferner bilden diese einen Hauptbestandteil der zellebralen Komponenten. Die Sialidase benutzt diese als ein spezifisches Substrat und es wird vermutet, dass es an gewissen wichtigen Granialen Nervenfunktionen beteiligt ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde in Hinblick auf die vorgenannten gegenwärtigen Bedingungen ausgebildet. Ein gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es die Sialidase, die in Plasmamembranen lokalisiert ist und deren DNA, die sie verschlüsselt bereit zu stellen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ernsthafte Studien durchgeführt, um das vorgenannte Ziel zu erreichen. Als ein Ergebnis dieser Bemühungen ist das erfolgreiche Isolieren der Sialidase, die in Plasmamembranen lokalisiert ist und ein Klonen der CDNA, die diese kodiert. Des weiteren fanden die Erfinder heraus, dass die vorgenannte Sialidase einzigartig in ihrer wesentlichen spezifischen hydrolisierten Gangliosiden ist (Glykolipide enthalten Sialinsäure), die ein Substrat ist, dass ähnlich lokalisiert ist, nämlich hauptsächlich in Plasmamembranen und diese war vollständig unterschiedlich von anderen Säugetiersialidasen und von mikrobiellen Sialidasen in enzymischen Substratspezifitäten. Darauf bezieht sich die vorliegende Erfindung. Die vorliegende Erfindung stellt ein Protein zur Verfü gung, dass im Folgenden (auf A) oder (auf B) beschrieben ist:

(A) ein Protein, dass eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, oder
(B) ein Protein, dass eine Aminosäuresequenz einschließlich Austausch, Löschung, Einfügung oder Wechsel von 1 bis 80 Aminosäurerückständen in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 und die eine Aktivität anzeigt, die Sialinsäurerückstände von nicht nichtreduzierenden Endgruppen der Ganglioside aufweist.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine DNA-Kodierung für das Protein, wie es oben unter (A) oder (B) definiert ist. Insbesondere so eine DNA, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweisen. Die Sialidase, die die oben erwähnten Charakteristika aufweist, wird als Sialidase der vorliegenden Erfindung bezeichnet. Die DNA-Kodierung dafür wird hinfort als die DNA der vorliegenden Erfindung bezeichnet. Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detailliert erklärt werden.
<1> Die Sialidase der vorliegenden Erfindung
Die Sialidase der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, dass die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist. Darüber hinaus weist die Sialidase der vorliegenden Erfindung ein Protein auf, dass die Aminosäuresequenz einschließlich Auswechslung, Löschung, Einfügung oder Wechsel von 1 bis 80 Aminosäurerückständen in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, solange sie eine Aktivität zum Abbau von Sialinsäurerückständen von nicht reduzierenden Endgruppen der Ganglioside aufweist.
Unter den vorgenannten Sialidasen hat die Sialidase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 folgende physikalisch-chemische Eigenschaften:
(1) Aktivität
Sie beseitigt Sialinsäurerückstände von nicht reduzierenden Endgruppen der Ganglioside.
(2) Die spezifische Wirksamkeit des Substrats
Es wirkt auf die Ganglioside, aber es wirkt nicht auf die Glykoproteine und Oligosaccharide. Insbesondere wirkt sie auf GD3-Ganglioside, GD1a-Ganglioside, GM3-Ganglioside und synthetische Ganglioside (GSC-17, α2-3) und GSC-61, (α2-6)) aber sie wirkt im Wesentlichen nicht an GM2-Ganglioside, GM1-Ganglioside, Orosomucoiden, Fetuinen, Glykophorin, Drüsenmucin von Schafen und Drüsenmucin von Rindern, es wirkt schwach auf α2-3 Sialyllaktose und 4-MUNeuAc (4-Methylumbellyferyl N-Acetylneuraminicinsäure).
(3) Das pH-Optimum

4,7 bis 5,0

(4) Molekulargewicht
Um 605,00 bei der Bestimmung des Saccharosedichtegradients durch Zentrifugieren, um 52,000 durch die Bestimmung durch SDS-Polyacrylmidgel bei der Elektroforensis unter reduzierenden Bedingungen.
(5) Hemmung und Aktivierung
Für die Aktivierung wird ein Oberflächenaktiver Wirkstoff benötigt. Beispielsweise ist sie hochaktiv in der Gegenwart von 0,1 bis 0,2% von Trizium X-100.
Sie ist stark gehemmt durch Schwermetallionen, wie Cu²⁺ und 4-Hydroxyquecksilberbenzoate.
Sie ist stabil bei Dithiothreitol, Neu5Ac2en (2-deoxy-2,3-dehydro-N-Acethylneuraminicsäure) und Glycerin. Ferner ist es schwach gehemmt durch Neu5Ac2en.
Unter den Sialidasen der vorliegenden Erfindung, weist die Sialidase, welche die vorgenannten Charakteristika aufweist ein Enzym, dass aus Rindern abgeleitet worden ist, wohingegen die Sialidase, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 aufweist vom Menschen abgeleitet wurde. Das spiegelt sich auch in den 82% der Aminosäuresequenzen wieder, die homolog sind. Ferner weisen diese einen transmembranen Bereich auf, eine Glykosylationsseite, eine Asp-Box, die eine übereinstimmende Sequenz der Sialidase ist und die gleich lokalisiert ist. Daher wurde das Enzym von Menschen abgeleitet, um die gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften zu erhalten, wie das Enzym, das vom Rind abgeleitet wurde. Die Sialidase der vorliegenden Erfindung kann von einem Rinderhirn, wie beispielsweise im Folgenden beschrieben wird bezogen werden. Die nun folgenden Arbeitsschritte wurden unter vorzugsweise niedrigen Temperaturen durchgeführt.
Ein Rinderhirn wird in einem Mörser homogenisiert und anschließend bei 1000 × g für 10 Minuten zentrifugiert; der Überstand wird bei 30,000 × g für eine Stunde weiter zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der fraktionierte Niederschlag in einen Mörser gefüllt und 5% Deoxycholinsäure hinzugefügt, dann ausreichend ho mogenisiert und bei 100,000 × g für eine Stunde zentrifugiert um eine lösliche Fraktion des Überstands zu erhalten. Der Mörser enthält bevorzugterweise einen Hemmstoff für die Proteasen, Dithiothreitol, Oberflächenaktive Wirkstoffe und dergleichen.
Die obere lösliche Fraktion wird für die DEAE Zellulosespalte verwendet und nachdem die Spalte gewaschen wurde, wird diese zur Eluierung mit einem Puffer, der 0,2 M NaCl als Fraktionierungsmittel enthält, weiterverarbeitet. Eine Fraktion zeigt die Sialidaseaktivität, die gegen einen Puffer dialyziert ist und an Octyl-Sepharose angewendet wird und durch Eluierung einem linearen Gradienten von 0,1 bis 0,4% Trizium x-100 separiert ist.
Danach wird die aktive Fraktion für die Heparin-Sepharose (Pharmazia) verwendet. Diese fraktion wird mit einem Puffer, der 0,25 M NaCl enthält, gewaschen und mit einem 0,2 bis 1 M NaCl linearen Gradienten elluiert um die aktive Fraktion zu konzentrieren. Die obige konzentrierte Enzymlösung ist an Sephacryl 5-200 (Pharmacia) angereichert und durch die Elluierung mit einem Puffer, der 0,02 mM NeuAc2en (2-deoxy-2,3-dehydro-N-Acetylneuraminicinsäure) enthält, abgesondert.
Die erhaltene aktive Fraktion ist verdünnt, um eine Trizium X-100 Konzentration von 0,02% zu erhalten, hierfür wird RCA Lektinagarose (Pharmacia) hinzugefügt, mit dem Puffer gewaschen, der 0,02% Trizium X-100 enthält und mit einem Puffer eluiert, der 0,2 M Laktose enthält. Diese aktive Fraktion wird an einem MonoQ (Pharmacia) Spalte angereichert und mit 0 bis 0,5 M NaCl linearen Gradienten eluiert.
Die aktive Fraktion ist an eine aktivierte Thiolsepharose (Pharmacia) Spalte angelagert. Diese wird mit einem 0,15 M NaCl Puffer gewaschen, der 10% Glycerol enthält und anschließend mit 0,5 M NaCl Puffer gewaschen, der 10% Glycerol enthält und mit 0,05 M NaCl Puffer eluiert, der 0,05 M Dithiothreitol enthält. Die aktive Fraktion ist in einer MonoQ-Spalte konzentriert.
Das obige Konzentrat ist an einer Affinitätenspalte angereichert, die eine synthetische Gangliosid GM3 [GSC-211, NeuAc-Gal-Glc-O (CH₂)₈NH₂] als ein Ligand (Hasegawa A. et al. J. Carbohydro. Chem., 9, 201–214, 1990), anschließend wird es durch Auswaschung mit einer 0 bis 0,5 M NaCl Gradienten ausgewaschen. Die Anreicherungsspalte kann durch das Ankoppeln von GSC-211 mit ECH-Sepharose (Pharmacia) erhalten werden; in der Gegenwart von N-Ethyl-N'-(3'-Dimethyl-Aminopropyl) Carbodiimide Hydrochloride.
Das Sialidase Enzym ist wie oben beschrieben gereinigt. Das Protein hat ein molekulares Gewicht von 52KD, dass durch SDS Polyacrylamidgel Electrophorensis bestimmt worden ist. Seitdem das DNA-Kodieren für die Sialidase für die vorliegende Erfindung erhalten wurde, kann die Sialidase der vorliegenden Erfindung auch durch die DNA, die in einen passenden Host-Vektor-System angegeben wird, ausgedrückt werden. Für das Host-Vektor-System kann eine kultivierte Zelle als ein Wirt verwendet werden und ein passender Vektor kann für diesen Wirt verwendet werden. Materialien und Methoden hierfür können gewöhnlich solche sein, die auch für die Produktion von heterogenen Proteinen und bei der genetische Rekombinationstechniken verwendet werden. Sobald das DNA-Kodieren für die Sialidase der vorliegenden Erfindung an einen Vektor gebunden ist, einen Vektor der Se quenzen enthält, die für die Regulierung des Genausdrucks benötigt wird, sowie ein Katalysator und ein Abschluss, der in einem Wirt der erforderlich ist, verwendet werden kann.
<2> Die DNA der vorliegenden Erfindung
Aufgrund der Aminosäuresequenzen des entschlüsselten Proteins durch die DNA der vorliegenden Erfindung (wie erläutert) kann die DNA der vorliegenden Erfindung geklont werden, was auf den Aminosäuresequenzen beruht. In den Beispielen, die unten erwähnt sind, ist ein teil der Aminosäuresequenzen der Sialidase von der vorliegenden Erfindung bestimmt. Oligonukleotidstarter wurden synthetisiert der auf die teilweisen Aminosäuresequenzen basierten und die DNA der vorliegenden Erfindung wurde vom Rinderhirn cDNA Sammlung erhalten, dabei wurden PCR (Polymerase Kettenreaktionen) durch die Verwendung von Oligonukleotiden Startern verwendet.
Die Sequenz der DNA der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt, solange ihre Kodierung für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweisen und die Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 können hierbei im Besonderen erwähnt werden. Weitere existierende Sialidasen haben die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 einschließlich der Auswechslung, der Löschung, Einfügung und Überleitung von einer oder mehreren Aminosäureresten. Und von den Genen, die diese kodieren, wird erwartet, dass diese unterschiedlich sind von denen von tierischen Arten sowie von Individuen oder Abarten. Ein derartiges DNA Kodieren für ein im Wesentliches gleiches Protein wie es die Sialidase der vorliegenden Erfindung ist, fällt auch innerhalb der Abgrenzung der DNA der vorliegenden Erfindung. Eine derartige DNA kann auch aus einer Zelle erhalten werden, die durch Hydridisierung mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 3 oder Teilen hiervon unter strikten Bedingungen und durch Isolation der DNA-Kodierung für ein Protein, welches eine Sialidaseaktivität anzeigt. Die DNA-Kodierung für die Sialidase zeigt eine derartige Mutation wie oben erwähnt, sie kann auch beispielsweise durch Site Specific Mutagenese oder eine mutagenetische Behandlung erhalten werden. Die Bezeichnung ein oder mehrere Aminosäurereste bedeutet 1 bis 80, bevorzugt 1 bis 30 und mehr bevorzugt 1 bis 5 Aminosäurereste.
<3> Schrittweise Anmeldungen der Sialidase der vorliegenden Erfindung und deren DNA-Kodierung hierfür beruht darauf, dass

(1) weil die Sialidase der vorliegenden Erfindung substratspezifische Eigenschaften zeigt, die substantiell und spezifisch die Gangliosiden hydrolisieren, die Rekombinierung des Enzyms oder der DNA-Kodierung für ein derartiges Enzym eröffnet die Möglichkeit, diese als Reagenz für die Saccharidkettenstudien zu verwenden.
(2) als eine Möglichkeit zur Normalisierung von Abnormalitäten dieses Enzyms, die in Krebszellen beobachtet worden sind, zum Beispiel zur Antisensestrangtherapie, die eine Art der Gentherapie darstellt, wird für die Zukunft erwartet. Die Genstrukturen wurden durch die vorliegende Erfindung klargestellt. Dies ist im Hinblick auf die vorliegende Erfindung eine sehr wichtige Information. Mehr noch, wenn der Mechanismus dieses Enzyms klar darstellbar ist durch die Kinomstrukturanalysen wie sie bei der CDNA als Probe verwendet worden ist, ist es zukünftig auch möglich Abnormalitäten dieses Enzyms, die sich durch Krebs und dergleichen manifestieren, zu normalisieren.
(3) Wegen zwei Gründen, das heißt, die Eigenschaften dieses Enzyms im Besonderen wie es die Ganglioside abbaut und das noch mehr Komponenten des Gehirns davon betroffen sind und die Beteiligung in der Differenziation von Nervenzellen, die Abnormalitäten von diesem Enzym manifestieren sich in manchen Hirnkrankheiten. In einem solchen Fall könnten die Informationen über das Gen für die Entwicklung einer Gentherapie und einem Medikament verwendet werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Aminosäuresequenz der Peptide dar, die durch Endoproteinasen Aufschluss und durch Lysyl Endopeptidasen Aufschluss erhalten werden. Die Aminosäuren stellen Nebenfiguren dar. Von einem Lysylrest wird vermutet, dass er an den N-Terminus der Aminosäure gebunden ist und wird mit (K) dargestellt.
2 zeigt die Anordnung der Ableitung der Rminosäuresequenz für ein PCR-Produkt (BBmSD), dass durch die Verwendung von Rinderhirn CDNA als eine Matrix und zytoplasmische Sialidase (RMcSD) von Skelettmuskeln der Ratte verwendet wird. Gemeinsame Aminosäuren werden mit „." dargestellt und analoge Aminosäuren werden mit „*" dargestellt. Die gleichwertigen Regionen, die für die Vorbereitung der Proben verwendet wurden, sind unterstrichen.
Die beste Verfahrensweise zur Ausführung der Erfindung
Nachstehend soll die vorliegende Erfindung genauer beschrieben werden, wobei ein Bezug zu den folgenden Beispielen gemacht wird.
<1> Reinigung der Sialidase, die in der Plasmamembran vorkommt.
(1) Verfahren zum Messen der Sialidaseaktivität.
In diesem Beispiel wurde die Sialidaseaktivität wie folgt gemessen. An Reaktionssystem (0,2 ml) beinhaltete 50 bis 100 nmol der Sialinsäure die an Saccharidesubstrate gebunden ist und 0,2 mg des Rinderserums Albumin, 15 mmol des Natriumacetatpuffers (pH 4,6) und 0,2 mg von Triton X-100 und eine Enzymfraktion und ein Substrat bestehend hauptsächlich aus Rinderhirn, das mit Gangliosiden (Sigma, Type II) vermischt war, verwendet wurde.
Eine Reaktionsmischung der vorab erwähnten Zusammensetzung wurde bei 37°C für 15 bis 60 Minuten inkubiert, die Reaktion wurde durch Schnellgefrierung gestoppt. Die Zurückgebliebene Sialinsäure wurde quantitativ angereicht durch die thiobarbiturische Säuremethode von Warren (Warren L., J. Biol. Chem. 234, 1971–1975, 1959) bei 549 nm und 532 nm. In den Schritten 1, 2 und 7, die weiter unten beschrieben sind, wurde die quantitative Anreicherung durch dieselbe Methode ausgeführt nachdem das Reaktionsprodukt durch den AGX-2 Ionenaustausch der Minimumspalte geführt worden ist. Die Menge der Sialinsäure (nmol), die pro Stunde freigegeben wurde, wurde als Einheit 1 definiert. Wenn ein synthetisches Substrat wie 4-Methylumbelliferyl N-Acetylneuraminische Säure (4MU-NeuAc) als der Sialinsäurebinder im Saccharidischen Substrat verwendet wurde, wurde Triton X-100 aus dem Reaktionssystem ausgeschlossen und 4-Methylumbelliferone freigegeben, was quantitativ durch ein Fluorospectrophotometer gemessen wurde.
In diesem Beispiel war die Anzahl der Enzymproteine über die Bradford-Methode (ein Biorad Co. Satz wurde verwendet) oder über die BCA-Methode (Piece Chemical Co.) verwendet. Weitere Einzelheiten der Messmethoden sind in den vorhergehenden Berichten (Miyagi und Tsuiki, J. Biol. Chem. 260, 6710–6716, 1985) aufgeführt.
(2) Das Löslichmachen und die Reinigung der Rindermembran gebundenen Sialidase
Die ganze Verfahrensweise, die nachfolgend unten beschrieben ist, wurde bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt. Rinderhirne wurden von einem Schlachthaus bezogen und waren bei –80°C tief gefroren solange bis sie für das weitere Verfahren verwendet wurden.
200g des Rinderhirns wurden mit 9 Volumenanteilen von einer 0,32 M Sucroselösung, 1 mM DTT (Dithiothreitol), 1 mM EDTA und 0,1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) versetzt und durch einen Glasteflonhomogenisierer homogenisiert. Anschließend bei 100 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der so erzeugte Überstand wurde des Weiteren für eine stunde bei 30,000 × g zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die so entstandene Überstandsfraktion mit einem Puffer abgepuffert (20 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) ferner wurden 180 ml einer 0,1 mM PMSF-Lösung hinzugefügt, ferner eine 5%ige Deoxycholicsäure hinzugefügt, dann ausreichend homogenisiert und bei 100,000 × g für eine Stunde zentrifugiert, um eine lösliche Fraktion als Überstand (Schritt 2) zu erhalten.
Die lösliche Fraktion wurde für die DEAE Zellulosespalte (4,5 × 20 cm) verwendet und mit einem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. Anschließend gewaschen und eluiert mit einem Puffer, der 0,2 M NaCl enthält, um eine 15 ml-Fraktion zu sammeln (Schritt 3). Die aktive Fraktion wurde gegen einen Puffer dialysiert und dann für die Octyl Sepharosespalte (2,5 × 7 cm) verwendet und mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht. An schließend wurde die Spalte mit einem linearen Gradienten (400 ml) einer 0,1 bis 0,4 Triton X-100-Lösung eluiert, um eine 10-ml-Fraktion (Schritt 4) zu erhalten.
Anschließend wurde die aktive Fraktion für die Heparin Sepharosespalte (1,5 × 1 cm) verwendet, mit einem Puffer, der 0,25 M NaCl enthält, gewaschen und mit einer 0,2 bis 1 M NaCl mit dem linearen Gradienten (200 ml) in den Puffer A eluiert, anschließend wurde die aktive Fraktion durch Ultrafiltration durch die Verwendung einer YM-10 Membran konzentriert (Schritt 5).
Die konzentrierte Enzymlösung wurde drei Mal durch das Eluieren der Heparinsepharosespalte erhalten und wurde an die Sephacryl 5-200 Spalte (Pharmacia, 1,5 × 2,5 cm) geladen und mit dem Puffer B (2 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, 0,04% Triton X-100), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,02 mM Neu Ac2en [2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminsäure]) bei einer Durchsatzrate von 10 ml/h, um 2 ml der Fraktionen zu sammeln (Schritt 6).
Die aktive Fraktion aus dem Schritt 6 wurde verdünnt, so dass eine Trizium X-100 Konzentration von 0,02 entstand, die dann an die RCa-Lecitin Agarosespalte (1,5 × 2,5 cm) verwendet wurde. Diese spalte wurde ins Gleichgewicht mit dem Puffer B, der nur eine Konzentrationswechsel von 0,02% aufweist und mit dem selben Puffer ausgewaschen wurde und mit dem Puffer B, der 0,2 M Laktose (Schritt 7) enthielt, verdünnt. Diese aktive Fraktion wurde an die MonoQ (HR 5/5) Spalte (Pharmacia) angewandt, und mit einer 0 bis 0,5 M NaCl linearen Gradienten verdünnt und im Puffer B bei –20°C eingelagert (Schritt 8).
Die Fraktion wurde dreimal durch die Verdünnung nach Schritt 8 erhalten (dies korrespondiert mit 1,8 kg des Ausgangsmaterials) und wurde an die aktivierte Thiol-Sepharosespalte (Pharmacia, 1,5 × 2 cm) geladen und wiederum mit dem Puffer B der 0,15 M NaCl und 10% Glycerol enthält, verdünnt und dann mit dem Puffer B, der 0,5 M NaCl und 10% Glycerol enthält mit dem Puffer B, der 0,5 M NaCl und DDT mit einer Konzentration, die ansteigend bis zu 50 mM enthält, verdünnt. Diese aktive Fraktion wurde mit einer MonoQ Spalte nach Schritt 8 (Schritt 9) konzentriert.
Letztendlich wurde für die Spalte eine Affinitätschromatografie durchgeführt, wobei synthetische Ganglioside GM3 [GSC-211, Neu Ac-Gal-Glc-O(CH2)8NH2] (Hasegara A. et al., J. Carbohydr. Chem., 9, 201–214, 1990) als ein Ligand ausgeführt. Eine Affinitätsspalte (0,7 × 3 cm) wurde vorbereitet, indem die GSC-211 zu einem Paar mit der ECH Sepharose (Pharmacia) verbunden wurde in der Gegenwart von N-ethyl-N'(3'-dimethyl-aminopropyl) Carbodiimide Hydrochloride nach der Anweisung des Herstellers verwendet wurde. Die Enzymfraktion, die nach dem Schritt 8 erhalten wurde, wurde an die Spalte geladen und ins Gleichgewicht mit dem Puffer C (10 mM Caliumphosphat, pH 6,8, 0,04% Trizium X-100, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% Glycerol) und mit einem 0 bis 0,5 M Nacl Konzentrationsgradienten im Puffer C verdünnt, um eine 1,5 ml-Fraktion (Schritt 10) zu erhalten.
Für den Reinigungsprozess wurden 3,5 kg Rinderhirn als Startermaterial verwendet, was in Tabelle 1 zusammengefasst wurde. Bei der oben beschriebenen Vorgehensweise wurde die Sialidaseaktivität mehr als 100,000 Mal von der Rinderhirnpartikelfraktion gereinigt. Die finale Probe wurde dann der SDS Polyacrylamidgel Electrophorese nach der Methode von Laemmli (Laemmli, U. K. Nature, 227, 680–685, 1970) zugeführt, um ihre Reinheit zu bestimmen. Ein Ergebnis, warum ein schwaches Band bei 50 k beobachtet wurde im Gegensatz zum Hauptband des 52 k Proteinbandes die Verschmutzungsdichte des 52 k Eiweißproteins lief parallel mit den aktiven Verdünnungsausfallmustern von der Affinitätsspalte und zusätzlich wurde dieses Bank in Schritt 9 nach Schritt 10 konzentriert. Deswegen wurde angemerkt, dass es ein Sialidaseenzymprotein war.
Tabelle 1
(3) Physikalisch-chemische Eigenschaften der Rindermembran gebundenen Sialidase
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Enzyms wurden durch die Verwendung der vorgenannten angereicherten Enzyme untersucht und werden folgenden unten weiter dargestellt.
(i) Substratanforderung
Die Ergebnisse der Untersuchung zu dem aktiven Enzym der vorliegenden Erfindung für verschiedene Substrate sind in Tabelle 2 dargestellt. Die numerischen Werte stellen eine relative Aktivität, wenn die Aktivität für die GD3-Ganglioside definiert sind, dar.
Tabelle 2
Die Hydrolyse der GSC-17 (α2-3) trat bei einer Rate, die 2,5 Mal höher war, als bei der Hydrolyse der GSC-61 (α2-6) und wird daher als das Enzym betrachtet, dass wahrscheinlich an dem α2-3 Bindung beteiligt ist, vergleichbar mit der α2-6 Anbindung. Wenn das Enzym des Weiteren nicht an der α2-3 Syalyllactose einwirkt ent sprechend zu dem Saccharidsegment des GM3 Gangliosids ist das Ceramidsegment unentbehrlich für das Substrat.
(ii) pH-Optimum

4,7 bis 5,0

(iii) Molekulargewicht
Rund 65,000 bestimmt durch die Sucrosedichtegradientzentrifugation.
Ungefähr 52,000 bestimmt durch die SDS Polyacrylamidgel Elektrophorese unter reduzierten Bedingungen.
(iv) Hemmung und Aktivierung und dergleichen
Ein Detergent wird für die Aktivierung benötigt, beispielsweise ist es hochaktiv in der Gegenwart von 0,1 bis 0,2% von Trizium X-100.
Restaktivitäten sind in der Tabelle 3 in der Gegenwart von verschiedenen Hemmern aufgezeigt. Jeder der numerischen Werte repräsentiert 100-(restaktivität (%) in der Gegenwart eines Hemmers).
Tabelle 3
(3) Peptidsequenzierung
Das oben erhaltene Endprodukt wurde in einer geringen Ausbeute erhalten. Die Enzymfraktion nach Schritt 9 wurde in der gleichen Art und Weise präpariert eben durch die Verwendung von 6 kg Rinderhirn als Ausgangsmaterial und war den Peptidanalysen unterworfen. Die Enzymfraktion wurde durch die Dialyse entsalzen in der Gegenwart von 0,1% PVP-40 (Sigma), konzentriert mit Centricon (Millipore) und der SDS Polyacrylamidgel electrophorese unterworfen so wie oben beschrieben, anschließend zu der PVDF Membran überführt (Problott, Applied Biosystems). Die Lokalisierung des enzymatischen Proteins wurde durch Ponceau S Einfärbung bestätigt, anschließend wurden die korrespondierenden Teile von der Membran entfernt und anschließend mit Lysyl Endopeptidase und dann mit Endoproteinase Asp-N digestiert. Das Produkt wurde in einem Hochleistungsflüssigchromatographen getrennt.
Die fraktionierten Peptide wurden der Aminosäuresequenz unterzogen. Hierbei wurde ein Peptidsequenzer (Shimazu PSQ-1) verwendet. Die oben erwähnte Mikrosequenzierung wurde nach der Methode von Iwamatsu et al. (Iwamatsu A. and Yoshida-Kunomura N., J. Biochem. 120, 29–34, 1996) ausgeführt. Die so erhaltenen Sequenzen sind in 1 und in der Sequenz SEQ ID NOS: 5–9 wiedergegeben. Die SEQ ID NOS: 5–7 sind Aminosäuresequenzen der Fragmente die durch die Endoproteinase Digestion erhalten wurden und die SEQ ID NOS: 8 und 9 sind Aminosäuresequenzen der Fragmente, die durch die Lysyl Endopeptidase Degestierung erhalten wurden. Die Sequenzen SEQ ID NO: 5, und 2-5tens sind Aminosäure, die die zweiten Aminosäuren Ala oder Arg sein sollten. Die dritte Aminosäure ist Glu oder Gly und die vierte Aminosäure ist Ile oder Tyr und die fünfte Aminosäure ist Leu oder Ser.
<2> Das CDNR-Klonen der Rinderhirnsialidase
Basierend auf der Aminosäuresequenz der Peptide des gereinigten Enzyms, welches wie oben beschrieben bestimmt worden ist, wurden 10 Bedeutungen oder Gegenbedeutungen degeneriert, hauptsächlich von der Sequenz SEQ ID NOS: 10 (DN1-1S), 11 (DN1-1A), 12 (DN1-2S), 13 (DN1-2A), 14 (DN2S), 15 (DN2A), 16 (DN3A), 17 (AP1A), 18 (AP3S) und 19 (AP3A) wurden präpariert (siehe 1). DN1, DN2, DN-3, AP-1 und AP-3 sind Auszüge der Peptide, wie sie in 1 gezeigt sind, S bedeutet „sense" und A bedeutet „antisense". DN-1 repräsentiert eine Nukleotidsequenz, dadurch bestimmt, dass angenommen wurde, dass die undefinierten Aminosäuren der von DN-1 jeweils Arg, Gly, Tyr und Ser sein sollen.
Die absolute Rinderhirn RNS wurde mit der Säure Guanidium Phenol Chloroform Methode (Chomczyndki P. and Sacchi N., Anal. Biochem. 162, 156–159, 1987) hergestellt. Die poly(A)⁺RNS wurde durch die Oligo(dT) Zellulosespaltenchromatographie gereinigt. Die CDNA wurde in Übereinstimmung mit dem vorausgehenden Bericht (Miyagi T. et al., J. Biol. Chem., 268, 26435–26440, 1993) durch die Verwendung von poly(A)⁺RNS (1 mg) und reservierter Transcriptase präpariert (abgeleitet von den Molony murine leukemia Viren, BRL). Die Verstärkung der PCR wurde durch die CDNA, die als eine Maske fungierte, zumindest versucht.
Die PCR Reaktionsmischung (50 ml) hatte eine Zusammensetzung von 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8, 3) , 1, 5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 0,2 mM dNTPs (2 mM jeweils von DATP, dGTP, dCTP und dTTP), 0,5 mg von CDNA und 1,5 Einheiten von Taq Polymerase (Ex Taq, Takara). Die DNA-Verstärkung wurde durch 40 Reaktionszyklen bei 94°C (für 0,5 Minuten), bei 50°C (für eine Minute) und bei 72°C (für 2 Minuten) durchgeführt; gefolgt von Extensionsreaktion bei 72°C für 10 Minuten. Die so erhaltenen 12 DNA-Verstärkungsfragmente wurden jeweils subkloniert in der SmaI des Bluescript Vektors (Stratagene) und den DNA Sequenzierungen durch die Dideoxy-Methode (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463–5467, 1977) unterworfen.
Als ein Ergebnis der Stichhaltigkeit der Untersuchung der Aminosäuresequenzen, die mit den Segmenten mit den primären, verstärkten DNA Fragmenten korrespondieren, abgeleitet worden sind, zeigten die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Stoppkodons und/oder dergleichen. Es wurde herausgefunden, dass nur ein PCR-Produkt von 0,5 kb mit einem Primär AP3S und einem DN2A derartige Anforderungen erfüllt haben und erhalten wurden. Zusätzlich wurden 2Asp-Boxen (Ser-Xaa-Asp-Xaa-Gly-Xaa-Thr-Trp-(SEQ ID NO: 20)), welche eine Konsenssequenz der Sialidase darstellt in diesem Fragment gefunden (Aminosäurenummern 131–138 und 205–212 in der Frequenz SEQ ID NO: 2) und die abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte eine 38%ige Homologie bezüglich der Aminosäuresequenz der zytoplasmischen Sialidase, die vorher isoliert worden ist. Es wurden wie auch immer keine anderen signifikanten Homologien mit anderen Proteinen angezeigt.
Dann wurde ein Rinderhirn λgt10 library (Clontech) gescreened durch die Verwendung der oben genannten 0,5 kb CDNA als eine Probe. Die CDNA wurde isotopemarkiert mit [α-³²P]dCTP unter Verwendung der Random Primär DNA Markierungskit (Takara), es würden auch Phagen (2 × 10⁶) gescreened durch Plaque Hybridisation. Die Hybridisierung wurde durch die Verwendung von Nylonmembranen (Hybond N⁺, Amersham) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach 15 positiven Klonen, zwei davon pBB121 (1,45 kb) und pBB321 (2,8 kb) wurden für die gesamte die volle Kodierungsregion enthaltende Region bestimmt.
Die Nukleotidsequenz der inserten pBB321 (2,8 kb) und der Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet ist, zeigt sich als SEQ ID NOS: 1 und 2. Es wurde herausgefunden, dass vier Typen von Aminosäuresequenzen durch die Peptide des gereinigten Produkts, die sie enthielten, erhalten sind und für die DN-1, die 2. Aminosäure von DN1-1 war A R. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die selbe Sequenz in Rinderkreatinen, die auf der Proteindatenbank database search enthalten war nicht für die AP-1 Sequenz enthalten war. Es ist sehr wahrscheinlich, dass dies durch die Kontamination des Kreatin in der Enzymfraktionierung durch Verwendung der Peptidsequenzierung entstanden ist.
Zusätzlich zu den oben erwähnten zwei ASP Boxen wurde eine andere ASP Box an ihrer dritten Seite gefunden (die Aminosäurenummern 256–263 in SEQ ID NO: 2). Eine hydrophobische Sequenz wurde bei der Transmembranen Domain zwischen den zwei ASP Boxen gefunden und in Betracht gezogen (die Aminosäurenummern 174–194 in SEQ ID NO: 2) ferner wurde eine Glycolysationsseite an ihrer 3' Seite gefunden (die Aminosäurenummer 349 in der Sequenz SEQ ID NO: 2). Dieses Enzym hat eine charakteristische Bindung an dem RCA Lecitin, dass für die Reinigungsprozedur verwendet worden ist. Es wird überlegt, dass eine Saccharidkette tatsächlich an dieser Seite angeheftet ist. Das Molekulargewicht des Proteins wurde von 428 Aminosäuren berechnet und beträgt 48,000 und sobald eine Saccharidkette daran angeheftet ist, wird der aktuelle Wert auf rund 50,000 ansteigen, das stellt keinen Widerspruch zu dem bestimmten Wert, der oben für das gereinigte Produkt durch die SDS-polyacrylamidgel Electrophorese bestimmt worden ist.
<3> Vorübergehende Erscheinungsform der Sialidase CDNA in der COS Zelle
Die kodierende Region in der pBB121 (1,45 kb) wurde durch die Verwendung des PCR 5' erweitert der Sense Primer (SEQ ID NO: 21), dem ein EcoRI und eine 3' Antisense Primer (SEQ ID NO: 22) hinzugefügt worden ist, das dadurch erhaltene DNA-Fragment wurde durch Agarose Electrophorese gereinigt. Dieses Produkt war an die Eco-RI Seite des SR α Promoter, dem High expression Vektor pME18S (zur Verfügung gestellt durch Dr. Kazuo Maruyama, Medical Department, Tokyo Medical and Dental University) gebunden. Durch die SV40 Kopieherkunft (pME18S-mSD) und eingeführt in COS-7 Zellen durch die Elektroporation wurde der Versuch unternommen, die vorübergehenden Erscheinungsformen festzustellen. 40 μg der pME18S oder pME18S-mSD wurden zu COS-7 Zellen (10⁶) gegeben und in DMEM, die eine 10%ige FBS (fetal bovine serum) in der logarithmischen Wachstumsphase enthalten, hinzu gegeben und bei Zimmertemperatur für 10 Minuten elektrischen Impulsen mit 250 Volt und 950 μFD ausgesetzt; anschließend für weitere 10 Minuten bei Zimmertemperatur schmoren gelassen und anschließend wieder zu den Kulturen zurückgegeben.
Nach der Kultivierung für 48 Stunden wurden die Zellen eingesammelt. Nachdem die Blutserumkomponenten mit PBS entfernt worden sind, wurden den Zellen 9 Volumen des PBS hinzu gegeben und durch eine Ultraschallbehandlung für 10 Sekunden zum Platzen gebracht. Die Suspension mit den zerplatzten Zellen wurde unter ständiger Kühlung bei 1,000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der daraus resultierende Überstand wurde als Homogenat verwendet. Die Sialidaseaktivität in dem Homogenat wurde durch Messung durch die Verwendung der Ganglioside in dem Substrat und in der Gegenwart von Trizium X-100 (0,1%) gemessen.
Die spezifische Aktivität der Kontrollzellen hat lediglich den Weckturm und die Zellen wurden mit pME18S-mSD, was 23,4 Einheiten/mg Protein und 844,5 Einheiten/mg Protein entspricht miteinander vermengt. Diejenigen zellen, die mit pME 18S-mSD vermengt worden sind, zeigten eine Aktivität, die 36 Mal höher war als die der Kontrollzellen. Wie dem auch sei, ein Anstieg der Aktivität für die hydrolisierende 4MU-sialische Säure wurde nicht beobachtet. Dieses Ergebnis bestätigt die Ergebnisse der vorangegangenen Charakterisierung des gereinigten Produkts der Rinderhirnenzyme, das heißt die vorgestellte Sialidase wirkt im Wesentlichen besonders an den Gangliosiden ein und wirkt nur schwer auf synthetische Substrate wie der 4MU-sialischen Säure.
Ferner wurde untersucht, ob die so ausgedrückte Sialidase in Plasmamembranen lokalisiert ist oder nicht. Dies wurde festgestellt durch die Percoll (Pharmacia) Konzentrationsgradienten Zentrifugierung. In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht (Sagawa J. et al., J. Biochem. 107, 452–456, 1990). Das Homogenat war zu 40% mit dem Percoll beinhaltenden 0,25 M Sucrose überlagert, zentrifugiert bei 48,000 × g für 40 Minuten und fraktioniert. Danach wurde die Sialidaseaktivität gemessen. Die Gangliosidsialidaseaktivität war an der selben Örtlichkeit gemessen wie die Aktivitätsverteilung der 5'-nucleotidase oder Alkali-Phosphatase, die Markerenzyme der Plasmamembran sind gemessen worden. Dadurch konnte die Örtlichkeit der Sialidase in der Plasmamembran bestätigt werden.
<4> das CDNA-Klonen von humanabgeleiteten Gangliosidsialidase
Als die Primärstruktur der Rinderhirnsialidase mit der vorhergehend isolierten Zytoplasmischen Sialidase verglichen worden ist, stellte sich heraus, dass diese eine gut konservierte Sequenz beinhaltete (2). Aus diesem Grund wurde ein Satz primärer auf der Basis dieser Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 23 und 24) vorbereitet. In der 2 gezeigten Aminosäuresequenz weist die partielle Sequenz der CDNA für die Rinderhirnsialidase (BBmSD) eine Korrespondenz eine Übereinstimmung mit der Aminosäurenummer 49–209 der Sequenz SEQ ID NO: 2 auf. Die Rattenskelettmuskel cytoplamische Sialidase (RMcSD) korrespondiert mit den Aminosäurenummern 1–240 in der Aminosäuresequenz der Sialidase.
Humanhirn CDNA und Humannieren CDNA wurden unter den selben Bedingungen vorbereitet, wie es mit den Rinderenzymen geschehen ist, das PCR wurde ausgeführt durch die Verwendung als ein Templett. Das erweiterte DNA-Fragment von 0,25 kb war subgeklont worden und die DNA-Sequenz wurde bestimmt. Eine Asp-Box wurde in dieser cDNA gefunden. Ein Humanhirn λgt10 cDNA Library und Humannieren λgt10 cDNA Library (Clontech) wurden gescreened durch die Verwendung der obigen DNA als eine Probe. Durch das Screenen 8 × 10⁵ Plaques für das Humanhirn und 1 × 10⁶ Plaques für die menschlichen Nieren wurden drei positive Klone (pHB82, pHB85 und pHB95) und ein positiver Klon (pHK65) erhalten.
Als diese DNA-Sequenzen nach dem Subklonen untersucht worden sind, fand man an allen einen Überlappungsanteil von 1 kb. Nukleotidsequenzen, die durch pHB95 erhalten worden sind, enthielten im Wesentlichen die ganze Kodierungsregion und pHK65 enthielt 3' End non-coding Regionen von 1 kb und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen wurden folglich als SEQ ID NOS: 3 und 4 gezeigt.
Die dargestellte hohe Homologie mit den Sequenzen für das Rinderhirnenzym, das heißt 81% (87% für nur eine Kodierungsregion) an dem Nukleotidlevel und 82% an dem Aminosäurelevel.
In der SEQ ID NO: 4 korrespondiert die Transmembran Domain mit den Aminosäurenummern 174–194 und die Glykolisationsseite der Aminosäurenummern 348 und die ASP Boxen für die Aminosäurenummern 131–138, 205–212 und 256–263 korrespondierten ebenfalls.
Als der Ausdrucksstatus in verschiedenen Humangeweben durch die Northern blotting Methode durch die Verwendung von 1,5 kb als Einfügung von pHB95 aus der Probe untersucht worden ist, wurde ein hoher Ausdruck des mRNA über 4 kb beobachtet, und zwar in den skelettalen Muskeln. MRNA der selben Größe wurde auch im Gehirn, in der Leber und dergleichen detektiert.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt die Sialidaselokalisierung in der Plasmamembran und die DNA-Kodierung dafür zur Verfügung. Die Sialidase der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von den Sialidasen, die bisher bekannt waren, hauptsächlich in der Plasmamembran und im Wesentlichen im hydrolisierten Gangliosiden lokalisiert ist.

Claims

Ein Protein, das im Folgenden durch (A) oder (B) bestimmt: (A) ein Protein, dass die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist oder (B) ein Protein, dass die Aminosäuresequenz einschließlich Austausch, Streichung, Einfügung oder Wechsel von 1 bis 80 der Aminosäurerückstände von der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder der Sequenz SEQ ID NO: 4 umfasst, und welches eine Aktivität aufweist, die den Salinsäurerückstand von der nicht reduzierten endständigen Endgruppe der Ganglioside eliminiert.
Das Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das unter (B) definierte Protein durch die DNA kodiert ist und die DNA unter (a) oder (b) wie folgt definiert ist: (a) eine DNA, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist, oder (b) eine DNA, die hydridisierbar mit der DNA ist die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 unter stringenten Bedingungen aufweist.
Eine DNA, die für ein Protein kodiert ist und unter (A) oder (B) wie folgt definiert ist: (A) ein Protein, dass die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, oder (B) ein Protein, dass die Aminosäuresequenz einschließlich Austausch, Streichung, Einfügung oder Insertion von 1 bis 80 Aminosäurerückständen in den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist und das eine Aktivität aufweist die einen Sialinsäurerückstand von den nicht reduzierten endständigen Endgruppe der Ganglioside eliminiert.
Die DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA durch (a) oder (b) wie folgt definiert ist: (a) eine DNA die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist, oder (b) eine DNA die hydridisierbar mit der DNA ist die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 unter stringenten Bedingungen aufweist.