JP3088681B2 - 形質膜局在シアリダーゼ及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なシアリダー
ゼ及びそれをコードするＤＮＡに関し、詳しくは、形質
膜に局在しガングリオシドを特異的に水解するシアリダ
ーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供するものであ
る。本発明のシアリダーゼ及びそれをコードするＤＮＡ
は、糖鎖研究試薬や遺伝子治療に用いる薬剤として利用
されることが期待される。

【０００２】

【従来の技術】シアリダーゼは生体内にあって、糖蛋白
や糖脂質糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を除去する
糖分解酵素である。糖鎖分子からシアル酸を除くと、こ
れら分子の異化分解が開始するだけでなく、分子のコン
ホメーションやレセプターによる認識機構、細胞接着、
免疫機構など多くの重要な細胞機能が大きく変化するこ
とが知られている。シアリダーゼはまた、細胞の増殖や
癌化に伴って鋭敏に活性変化を示し、がん細胞の転移能
にも関与することも明らかになってきた。しかしなが
ら、生体内でシアル酸がどのように脱離されるのかにつ
いてはほとんどわかっていない。それは哺乳動物シアリ
ダーゼの分子レベルの研究が遅れており、その構造や発
現機構に不明の点が多いためである。

【０００３】哺乳動物シアリダーゼは活性が低く、極端
に不安定であるため、酵素の分離・精製が困難であっ
た。シアリダーゼは長い間、異化分解に関わる単なるリ
ソゾーム酵素のひとつと考えられがちであった。このよ
うな状況の下で、われわれは主にラット組織を酵素源と
して酵素の分離・精製を進め、細菌やウイルス、原虫な
どのシアリダーゼとは性質の異なる４種のシアリダーゼ
が存在することを見いだしてきた（Miyagi, T. and Tsu
iki, S., Eur. J. Biochem.141,75-81,1984、Miyagi,
T. et al. J. Biochem.107,787-793,1990、Miyagi, T.
and Tsuiki, S., J. Biol. Chem.260,6710-6716,198
5）。これらは、細胞内ではそれぞれリソゾーム内腔、
リソゾーム膜、形質膜（細胞表層膜）、細胞質に局在
し、基質特異性などの酵素学的な性状が異なるだけでな
く、互いに免疫学的にも区別される。これらのシアリダ
ーゼのうち、細胞質に局在するシアリダーゼについて
は、ラット骨格筋から均一精製品を得ることができ、動
物シアリダーゼでは世界で初めてcDNAクローニングに成
功し、一次構造を決定した（Miyagi, T. et al. J. Bio
l. Chem.268,26435-26440,1993）。ゲノム構造の解析を
も行い、機能についてもcDNAをプローブとして、この酵
素が骨格筋細胞の分化や発達に関与していることを明ら
かにした。以上の研究は、これまで世界のシアリダーゼ
研究にひとつの先駆的役割を果たしてきている。

【０００４】これまでの研究により、形質膜局在シアリ
ダーゼは細胞の増殖やがん化に際して活性上昇を示すこ
と、また神経細胞の分化や細胞の情報伝達にも深く関わ
っている可能性が明らかになってきた。しかしながら、
この酵素がどのような構造を持っているのか、どのよう
な機構で活性変化を起こすのかなどについてはこれまで
全くわかっていない。これらの問題解決のために当分野
の多くの研究者が待ち望んでいたのは、そのcDNAのクロ
ーン化であった。たとえば、cDNAを利用して、この酵素
のがん性変化の機構が明らかになれば、その結果をがん
の診断や治療に応用することも可能となる。また、ガン
グリオシドは多くの細胞の表層膜に存在し、細胞接着や
情報伝達など重要な細胞機能に関与する一方、脳の主要
な構成成分でもあるので、それを特異的な基質とするこ
のシアリダーゼはなんらかの重要な脳神経機能にも関わ
っていることが推察される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記現状に鑑
みてなされたものであり、形質膜局在シアリダーゼ及び
それをコードするＤＮＡを提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明者は鋭意研究を行った結果、形質膜局在シアリ
ダーゼを単離し、それをコードするcDNAをクローニング
することに成功した。さらに、前記シアリダーゼは、同
様に形質膜に主局在を示す基質であるガングリオシド
（シアル酸を含む糖脂質）をほぼ特異的に水解する点で
ユニークで、微生物シアリダーゼや他の哺乳動物シアリ
ダーゼとは酵素の基質特異性が全く異なるものであるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、下記の（Ａ）又は
（Ｂ）に示すタンパク質である。 （Ａ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質。 （Ｂ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に
おいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
するタンパク質。

【０００８】また本発明は、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示
すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。このよう
なＤＮＡとして具体的には、配列番号１又は３に示す塩
基配列を有するＤＮＡが挙げられる。

【０００９】以下、上記性質を有するシアリダーゼを
「本発明のシアリダーゼ」、これをコードするＤＮＡを
「本発明のＤＮＡ」ともいう。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】＜１＞本発明のシアリダーゼ 本発明のシアリダーゼは、配列番号２又は配列番号４に
示すアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、本
発明のシアリダーゼには、ガングリオシドの非還元末端
からシアル酸残基を除去する活性を有する限り、配列番
号２又は配列番号４において１若しくは数個のアミノ酸
の置換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列を有
するものも含まれる。

【００１２】上記シアリダーゼのうち、配列番号２に示
すアミノ酸配列を有するシアリダーゼは、下記の理化学
的性質を有する。 （１）作用 ガングリオシドの非還元末端からシアル酸残基を除去す
る。

【００１３】（２）基質特異性 ガングリオシドには作用するが、糖タンパクやオリゴ糖
には作用しない。具体的には、ＧＤ３−ガングリオシ
ド、ＧＤ１ａ−ガングリオシド及びＧＭ３−ガングリオ
シド、合成ガングリオシド（ＧＳＣ−１７(α２−３)及
びＧＳＣ−６１(α２−６)）には作用するが、ＧＭ２−
ガングリオシド、ＧＭ１−ガングリオシド、オロソムコ
イド、フェツイン、グリコフォリン、ヒツジ顎下腺ムチ
ン、ウシ顎下腺ムチンには実質的に作用しない。α２−
３シアリルラクトース、４−ＭＵＮｅｕＡｃ（４−メチ
ルウンベリフェリル Ｎ−アセチルノイラミン酸）には
弱く作用する。

【００１４】（３）至適ｐＨ ４．７〜５．０

【００１５】（４）分子量 ショ糖密度勾配遠心：約６５，０００ 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動：約５２，０００

【００１６】（５）阻害及び活性化 活性には界面活性剤を必要とする。例えば、０．１〜
０．２％ Triton X-100存在下で高い活性を示す。Ｃｕ
²⁺等の重金属イオン、４−ヒドロキシマーキュリー安息
香酸によって強く阻害される。ジチオスライトール、Ne
u5Ac2en(2-デオキシ-2,3-デヒドロ-N-アセチルノイラミ
ン酸)、グリセロールによって安定化する。ただし、Neu
5Ac2enによって弱く阻害される。

【００１７】上記性質を有するシアリダーゼはウシ由来
の酵素であり、本発明のシアリダーゼのうち、配列番号
４に示すアミノ酸配列を有するシアリダーゼはヒト由来
のものであるが、これらはアミノ酸配列において８２％
の相同性を示し、膜貫通領域、糖付加部位、シアリダー
ゼのコンセンサス配列であるAsp-boxが同一の位置に存
在することから、ヒト由来の酵素もウシ由来の酵素と同
様の理化学的性質を有すると考えられる。

【００１８】本発明のシアリダーゼは、例えば、ウシ脳
から次のようにして精製することによって取得すること
ができる。尚、以下の操作はすべて低温で行うことが好
ましい。ウシ脳を、バッファー中でホモジナイズし、10
00×gで10分間遠心し、その上清をさらに30,000×gで１
時間遠心する。遠心後の沈殿画分を、緩衝液に懸濁した
後、５％デオキシコール酸を加えて充分にホモジナイズ
し、100,000×g、１時間遠心後の上清として可溶画分を
得る。バッファー中には、タンパク質分解酵素の阻害
剤、ジチオスライトール、界面活性剤等を添加しておく
ことが好ましい。

【００１９】上記可溶画分を、DEAE-セルロースカラム
にかけ、カラムを洗滌した後、0.2MNaClを含むバッファ
ーで溶出し、分画する。シアリダーゼ活性を有する画分
をバッファーに対して透析した後、オクチル−セファロ
ースにかけ、0.1〜0.4% TritonX-100の直線濃度勾配で
溶出分取する。

【００２０】つぎに、活性画分をヘパリン−セファロー
ス(ファルマシア社)にかけて、0.25M NaClを含むバッフ
ァーで洗った後、0.2〜1M NaCl直線濃度勾配で溶出し、
活性画分を濃縮する。 上記濃縮酵素液をセファクリル
S-200(ファルマシア社)に乗せ、0.02mM NeuAc2en(2-デ
オキシ-2,3-デヒドロ-N-アセチルノイラミン酸)を含む
バッファーで溶出分取する。

【００２１】得られた活性画分を、0.02% TritonX-100
濃度になるように希釈し、RCA-レクチンアガロース(フ
ァルマシア社)に添加し、0.02% TritonX-100を含むバッ
ファーで洗浄した後、0.2M ラクトースを含むバッファ
ーで溶出する。この活性画分をMonoQ(ファルマシア社)
カラムに乗せ、0〜0.5MNaCl直線濃度勾配で溶出する。

【００２２】活性画分を、活性化チオールセファロース
(ファルマシア社)カラムに乗せ、0.15M NaCl、10%グリ
セロールを含むバッファー、次いで0.5M NaCl、10%グリ
セロールを含むバッファーで洗浄後、0.05M NaCl、0.05
Mジチオスライトールを含むバッファーで溶出する。活
性画分をMonoQカラムで濃縮する。

【００２３】上記濃縮液を、合成ガングリオシドGM３[G
SC-211, NeuAc-Gal-Glc-O(CH₂)₈NH₂]( Hasegawa A.et a
l. J. Carbohydr. Chem., 9, 201-214, 1990 )をリガン
ドとしたアフィニティカラムに乗せ、0〜0.5M NaCl濃度
勾配で溶出分取する。アフィニティカラムは、ECH-セフ
ァロース(ファルマシア社)に、GSC-211をN-エチル-N'-
(3'-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩存
在下でカップルすることにより得られる。

【００２４】上記のようにして、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分子量５２ｋＤのタンパク質とし
て、シアリダーゼ酵素が精製される。また、本発明のシ
アリダーゼは、これをコードするＤＮＡが得られたの
で、このＤＮＡを適当な宿主−ベクター系を用いて発現
させることによっても取得することができる。宿主−ベ
クター系は培養細胞を宿主とし、及びこの宿主に好適な
ベクターを用いればよく、材料及び方法は、異種タンパ
ク質の遺伝子組換え技術を利用した生産に通常用いられ
ているものを採用することができる。ベクターに本発明
のシアリダーゼをコードするＤＮＡを連結する際に、必
要に応じて、宿主内で発現が可能なプロモーター、ター
ミネーター等、遺伝子発現制御に必要な配列を含むベク
ターを用いればよい。

【００２５】＜２＞本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡは、これがコードするタンパク質のアミ
ノ酸配列が明らかになったので、このアミノ酸配列に基
づいて合成することによって取得することができる。後
述の実施例では、本発明のＤＮＡは、本発明のシアリダ
ーゼの部分アミノ酸配列を決定し、その配列に基づいて
作成された合成オリゴヌクレオチドプライマーとするＰ
ＣＲ(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)によっ
て、ウシ脳ｃＤＮＡライブラリーから得られたものであ
る。

【００２６】本発明のＤＮＡは、配列番号２又は４に示
すアミノ酸配列をコードする限り、その配列は問わない
が、具体的には配列番号１又は３に示す塩基配列が挙げ
られる。また、動物種、個体差、品種間差により、配列
番号２又は４に示すアミノ酸において１若しくは数個の
アミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸
配列を有するシアリダーゼ及びこれをコードする遺伝子
の存在が予想されるが、そのような本発明のシアリダー
ゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも、
本発明のＤＮＡに含まれる。このようなＤＮＡは、それ
を保持する細胞から、配列番号１又は３に記載の塩基配
列又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつ、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡを単離することによっても、得られ
る。また、上記のような変異を有するシアリダーゼをコ
ードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、
あるいは突然変異処理によって取得され得る。

【００２７】尚、「１若しくは数個」とは、１〜８０
個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個を
いう。

【００２８】＜３＞本発明のシアリダーゼ及びそれをコ
ードするＤＮＡの発展的用途 (１)本発明のシアリダーゼはガングリオシドをほぼ特異
的に水解する点でユニークな基質特異性を示すので、該
酵素及びこれをコードするＤＮＡを保持する組み換え体
は、糖鎖研究試薬として利用される可能性が少なくな
い。

【００２９】(２)がん細胞でみられるこの酵素異常を正
常化するためのひとつの方法として、将来、遺伝子治療
の一種であるアンチセンス療法などが期待されるが、本
発明により明らかにされた遺伝子構造は、このための大
切な情報である。また、cDNAをプローブとしたゲノム構
造の解析により、この酵素の発現機構が明らかになれ
ば、がんなどにおける該酵素の発現異常を正常化するこ
とも可能となる。

【００３０】(３)脳の主要な構成成分であるガングリオ
シドを特異的に分解するという性質、及び神経細胞の分
化に関与しているという２つの観点から、なんらかの脳
疾患でこの酵素の異常が見い出される可能性があり、そ
の場合には、遺伝子治療や薬剤の開発に、この遺伝子に
ついての情報が大いに利用され得る。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３２】＜１＞形質膜局在シアリダーゼの精製 （１）シアリダーゼ活性の測定法 本実施例において、シアリダーゼ活性は以下のようにし
て測定した。反応系（0.2ml）は、50〜100nmolシアル酸
結合糖質基質、0.2mgウシ血清アルブミン、15mmol酢酸
ナトリウムバッファー（pH4.6）、0.2mg Triton X-100
および酵素画分から成っており、基質としては主にウシ
脳混合ガングリオシド（Sigma，タイプII）を用いた。

【００３３】上記組成を有する反応液を、37℃、15〜60
分間インキュベートした後、急速冷凍により反応停止し
た。Warren (Warren L .J. Biol.Chem.234,1971-1975,
1959)のチオバルビツール酸法によって、遊離したシア
ル酸を549nmおよび 532nmで定量した。但し後述のステ
ップ１、２および７においては、反応産物をAGX-2イオ
ン交換ミニカラムに通した後、同法によって定量した。
１時間当りの遊離したシアル酸量 ( nmol) を１unit
（単位）とした。シアル酸結合糖質基質として合成基質
４−メチルウンベリフェリル Ｎ−アセチルノイラミン
酸（4-methylumbelliferyl N-acetylneuraminic acid：
4MU-NeuAc) を用いる場合は、反応系からTriton X-100
を除き、遊離した４−メチルウンベリフェロン（4-meth
ylumbelliferone）を蛍光分光光度計で定量した。

【００３４】また、本実施例において、酵素蛋白量はBr
adford法（Biorad社のキットを使用) あるいはBCA法 (P
iece Chemical社) によって測定した。より詳細な測定
法については既報（Miyagi and Tsuiki, J. Biol. Che
m.260,6710-6716,1985) に記述している。

【００３５】（２）ウシ膜結合シアリダーゼの可溶化と
精製 以下の操作はすべて４℃で行った。屠畜場から得たウシ
脳は使用するまで-80℃に凍結保存した。200gのウシ脳
に、９容量の0.32M スクロース、1mM DTT(ジチオスライ
トール)、1mM EDTA、0.1mM PMSF(フェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド)を加え、ガラス・テフロンホモジ
ナイザーでホモジナイズ後、1000×gで10分間遠心し、
その上清をさらに30,000×gで１時間遠心した。遠心後
の沈殿画分（ステップ１）を180mlの0.1mM PMSFを含む
バッファーＡ(20mM リン酸カリウム、pH6.8、0.1% Trit
on X-100、1mM EDTA、1mM DTT)に懸濁した後、５％デオ
キシコール酸を加えて充分にホモジナイズし、100,000
×g、１時間遠心後の上清を可溶画分とした（ステップ
２）。

【００３６】可溶画分をバッファーAで平衡化したDEAE-
セルロース(DEAE-cellulose、4.5×20 cm)カラムにか
け、洗った後、0.2M NaClを含むバッファーAで溶出し、
15mlずつ分取した（ステップ３）。活性画分をバッファ
ーAで透析後、同バッファーで平衡化したオクチル−セ
ファロース(Octyl-Sepharose、2.5×7cm)にかけ、0.1〜
0.4% TritonX-100の直線濃度勾配(400ml)で10mlずつ溶
出分取した（ステップ４）。

【００３７】つぎに、活性画分をヘパリン−セファロー
ス(Heparin-Sepharose、1.5×1cm)にかけて、0.25M NaC
lを含むバッファーAで洗った後、バッファーAの0.2〜1M
NaCl直線濃度勾配(200ml)で溶出し、活性画分をYM-10
メンブランによる限外ろ過で濃縮した（ステップ５）。

【００３８】ヘパリン−セファロースカラム３回分の濃
縮酵素液をセファクリルS-200(Sephacryl S-200、ファ
ルマシア社、1.5×2.5cm)に乗せ、バッファーB [20mM
リン酸カリウム pH6.8、0.04% TritonX-100、1mM EDT
A、1mM DTT、0.02mM NeuAc2en(2-デオキシ-2,3-デヒド
ロ-N-アセチルノイラミン酸)]で10ml/hの速度で2mlずつ
溶出分取した（ステップ６）。

【００３９】RCA-レクチンアガロース(RCA-lectin agar
ose、1.5×2.5cm)を、TritonX-100の濃度のみを0.02%に
代えたバッファーBで平衡化し、0.02% TritonX-100濃度
になるように希釈したステップ６活性画分をカラムに添
加した。同バッファーで洗った後、0.2M ラクトースを
含むバッファーBで溶出した（ステップ７）。この活性
画分をMonoQ (HR5/5)(ファルマシア社)カラムに乗せ、
バッファーBの0〜0.5MNaCl直線濃度勾配で溶出、-20℃
で保存した（ステップ８）。

【００４０】３カラム分のステップ８画分（出発材料1.
8kg分に相当）を、活性化チオールセファロース(activa
ted thiol-Sepharose、ファルマシア社、1.5×2cm) に
乗せ、0.15M NaCl、10%グリセロールを含むバッファー
B、次いで0.5M NaCl、10%グリセロールを含む同バッフ
ァーで洗浄後、DTT濃度を50mMに上げた0.05M NaClを含
むバッファーBで溶出した。活性画分をステップ８と同
様にMonoQカラムにより濃縮した（ステップ９）。

【００４１】最後に、合成ガングリオシドGM３[GSC-21
1, NeuAc-Gal-Glc-O(CH₂)₈NH₂]( Hasegawa A.et al. J.
Carbohydr. Chem., 9, 201-214, 1990 )をリガンドと
したアフィニティカラムクロマトグラフィを行った。ア
フィニティカラム(0.7×3cm)は、ECH-セファロース(ECH
-Sepharose、ファルマシア社)に製造元の使用説明書に
従って、GSC-211をN-エチル-N'-(3'-ジメチル-アミノプ
ロピル)カルボジイミド塩酸塩存在下でカップルするこ
とにより作成した。バッファーC（10mM リン酸カリウ
ム、pH6.8、 0.04% TritonX-100、1mM EDTA、1mM DTT、
20%グリセロール)で平衡化したカラムにステップ８酵素
画分を乗せ、バッファーCの0〜0.5M NaCl濃度勾配で1.5
mlずつ溶出分取した（ステップ１０）。

【００４２】ウシ脳3.5kgを出発材料とした精製過程を
表１にまとめた。上記操作により、シアリダーゼ活性
は、ウシ脳顆粒画分から１０万倍以上に精製された。最
終標品をLaemmliの方法（Laemmli,U. K. Nature 227,68
0-685,1970) によって、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、純度検定を行った。その結果、主要な
５２k蛋白バンドの他に、淡い５０kのバンドが認められ
たが、５２k蛋白の染色濃度がアフィニティカラムから
の溶出活性パタンと平行しており、しかもこのバンドは
ステップ９から１０へと濃縮されていたのでシアリダー
ゼ酵素蛋白と考えられた。

【００４３】

【表１】

【００４４】（３）ウシ膜結合シアリダーゼの理化学的
性質 上記の精製酵素を用いて調べた該酵素の理化学的性質を
示す。

【００４５】（ｉ）基質特異性 種々の基質に対する本発明の酵素の活性を調べた結果
を、表２に示す。数値は、ＧＤ３−ガングリオシドに対
する活性を１００としたときの相対活性を示す。

【００４６】

【表２】

【００４７】ＧＳＣ−１７(α２−３)の分解はＧＳＣ−
６１(α２−６)の分解の２．５倍の速度であり、α２−
６結合よりもα２−３結合に作用しやすいと考えられ
る。また、ＧＭ３ガングリオシドの糖部分に相当するα
２−３シアリルラクトースには作用しないことから、基
質としてセラミド部分が不可欠である。

【００４８】（ii）至適ｐＨ ４．７〜５．０ （iii）分子量 ショ糖密度勾配遠心：約６５，０００ 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動：約５２，０００ （iv）阻害及び活性化等 活性には界面活性剤を必要とする。例えば、０．１〜
０．２％ Triton X-100存在下で高い活性を示す。各阻
害剤存在下での残存活性を表３に示す。数値は、１００
−（阻害剤存在下における残存活性％）を示す。

【００４９】

【表３】

【００５０】（３）ペプチドシークエンシング 上記で得られた最終標品が低収量のため、ウシ脳６kgを
出発材料として、上記と同様にしてステップ９の酵素画
分を調製し、ペプチド分析に供した。酵素画分を0.1% P
VP-40 (Sigma) 存在下に透析脱塩し、セントリコン（Mi
llipore)で濃縮後、前述のようにSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、PVDF膜（Problott, Applied
Biosystems) にトランスファーした。Ponceau S染色に
より、酵素蛋白の位置を確認し、該当するメンブラン部
分を切り出して、リシルエンドペプチダーゼ(lysyl end
opeptidase)消化を行い、 引き続いてエンドプロテイナ
ーゼ(endoproteinase)Asp-Nにより消化し、その産物を
高速液体クロマトグラフィで分離した。

【００５１】ペプチドシークエンサ(Shimazu PSQ-1)を
用いて、分画されたペプチドのアミノ酸シークエンシン
グを行った。以上のマイクロシークエンシングはIwamat
suらの方法( Iwamatsu A. and Yoshida-kubomura N., .
J. Biochem. 120,29-34,1996) に従った。得られた配列
を図１及び配列番号５〜９に示す。配列番号５〜７はエ
ンドプロテイナーゼ消化により得られたフラグメントの
アミノ酸配列であり、配列番号８、９はリシルエンドペ
プチダーゼ消化により得られたフラグメントのアミノ酸
配列である。尚、配列番号５において、２〜５番目のア
ミノ酸は未確定であり、２番目のアミノ酸はAla又はAr
g、３番目はGlu又はGly、４番目はIle又はTyr、５番目
はLeu又はSerのいずれかである可能性が高い。

【００５２】＜２＞ウシ脳シアリダーゼのｃＤＮＡクロ
ーニング 上記のようにして決定された精製酵素のペプチドのアミ
ノ酸配列に基づいて、配列番号１０（DN1-1S）、１１
（DN1-1A）、１２（DN1-2S）、１３（DN1-2A）、１４
（DN2S）、１５（DN2A）、１６（DN3A）、１７（AP1
A）、１８（AP3S）及び１９（AP3A）に示すセンス、ア
ンチセンスのデジェネレートプライマーを１０個作成し
た（図１参照）。尚、DN1、DN2、DN-3、AP-1及びAP-3
は、図１に示すペプチド名を、Sはセンス、Aはアンチセ
ンスを示す。また、DN1-1は、DN-1の未確定のアミノ酸
（２〜５番目のアミノ酸）が順にAla、Glu、Ile、Leuで
あるとした場合の塩基配列を、DN1-2は、DN-1の未確定
のアミノ酸が順にArg、Gly、Tyr、Serであるとした場合
の塩基配列を示す。

【００５３】ウシ脳全RNAを、酸グアニジム−フェノー
ル−クロロホルム法（Chomczynski P.and Sacchi N., A
nal. Biochem. 162, 156-159, 1987) によって調製し、
poly(A)⁺RNA はoligo(dT)-セルロースカラムクロマトグ
ラフィによって精製した。poly(A)⁺RNA (1mg) および逆
転写酵素（Molony murine leukemia virus 由来、BRL)
を用いて、既報（Miyagi T. et al .J. Biol. Chem. 26
8,26435-26440, 1993)の如くcDＮＡを合成し、これを鋳
型としてＰＣＲ法による増幅を試みた。

【００５４】ＰＣＲ反応液（50ml) の構成は、50mM KC
l, 10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgCl₂, 0.01% ゼラチ
ン, 0.2mM dNTPs（dATP、dGTP、dCTP及びdTTPを各々0.2
mM）,0.5 mg cDNA, 1.5 nuits Taq polymerase (Ex Ta
q, Takara) であった。94℃(0.5分), 50℃(１分), 72℃
(２分) の４０サイクルの後、72℃ 10分間反応延長して
DＮＡ増幅を行った。得られた１２個の ＤＮＡ増幅断片
をBluescriptベクター（Stratagene）のSmaI サイトに
サブクローニングし、ジデオキシ法（Sanger F.et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977) に
よってＤＮＡシークエンシングを行った。

【００５５】増幅されたＤＮＡ断片のうちプライマーに
相当する部分の塩基配列から推定されるアミノ酸配列の
妥当性や、終止コドンの有無などについて検討した結
果、プライマーAP3S および DN2Aによる0.5kb のPCR産
物のみがこれらの条件を満たしていた。しかもこの断片
には、シアリダーゼのコンセンサス配列であるAsp-box
(-Ser-Xaa-Asp-Xaa-Gly-Xaa-Thr-Trp-(配列番号２０))
が２個見い出され（配列番号２においてアミノ酸番号１
３１〜１３８及び２０５〜２１２）、推定されるアミノ
酸配列はわれわれが先に単離した細胞質性シアリダーゼ
のそれと３８％の相同性を示した。しかしそれ以外の他
のどの蛋白とも有意の相同性は認められなかった。

【００５６】次に、この0.5kbｃＤＮＡをプローブとし
て、ウシ脳λgt10ライブラリー（Clontech) をスクリー
ニングした。ｃＤＮＡをrandom primer DNA ラベリング
キット(Takara) を用いて[α-³²P] dCTPでアイソトープ
標識し、プラークハイブリダイゼーションによってファ
ージ(2×10⁶個) をスクリーニングした。ハイブリダイ
ゼーションはナイロンメンブレン(Hybond N⁺, Amersha
m) を用い、製造元の使用説明書に従って実施した。１
５個の陽性クローンのうち、pBB121(1.45kb) およびpBB
321(2.8kb) の２個に全翻訳領域が含まれることが推察
された。

【００５７】pBB321(2.8kb)のインサートの塩基配列と
それから推定されるアミノ酸配列を、配列番号１及び２
に示す。そこには精製品のペプチドから得られた４種の
アミノ酸配列が含まれており、DN-1についてはDN1-1の
２番目のアミノ酸がA→Rであることがわかった。また、
AP-1配列については見い出せなかったが、蛋白データベ
ースによってウシのケラチンに同じ配列が含まれること
がわかったので、ペプチドシークエンシングに供した酵
素画分へのケラチンの混在に由来する可能性が高い。

【００５８】Asp-boxは上述の２個に加えて、より３’
側にさらに１個見い出された（配列番号２においてアミ
ノ酸番号２５６〜２６３）。２個のAsp-boxの間に膜貫
通領域と考えられる疎水性配列が認められ（配列番号２
においてアミノ酸番号１７４〜１９４）、それより３’
側に糖付加部位（配列番号２においてアミノ酸番号３４
９）が見い出された。精製法に採用したように、この酵
素はRCAレクチンに結合する性質を持つので、この部位
には実際に糖鎖が付いているものと考えられる。４２８
個のアミノ酸から算定された蛋白の分子量は48,000であ
って、一本の糖鎖が加わると実際の値は50,000前後とな
り、前述の精製標品のSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による値と矛盾しない。

【００５９】＜３＞シアリダーゼｃＤＮＡのCOS 細胞に
おける一過性発現 pBB121(1.45kb)の翻訳領域について、EcoRIサイトを付
加した５’センスプライマー(配列番号２１)および３’
アンチセンスプライマー(配列番号２２)を用いてPCR法
により増幅し、得られたDNA断片をアガロース電気泳動
により精製した。これをSV40複製起点を持つSRαプロモ
ーター高発現ベクターpME18S(東京医科歯科大学、医学
部、丸山和夫博士より供与)のEcoRIサイトに連結し（pM
E18S-mSD)、COS-7細胞にエレクトロポレーションによる
一過性発現を試みた。10%FBS(ウシ胎児血清)を含むDMEM
で培養した対数増殖期にあるCOS-7細胞(10⁶)に、40μg
のpME18SあるいはpME18S-mSDを加え、室温に10分間放置
した後、250V, 950μFDの条件下で電気パルスをかけ、
再び室温に10分間放置後、培養に戻した。

【００６０】48時間後の細胞を集め、PBSで血清成分を
除いた後、９容量のPBSを添加して10秒間の超音波処理
により細胞破砕を行った。1,000×で10分間冷却遠心
し、その上清をホモジネートとした。ガングリオシドを
基質としてTritonx-100 (0.1%)存在下でトランスフェク
タントのホモジネートについてシアリダーゼ活性を測定
した。

【００６１】ベクターのみの対照細胞およびpME18S-mSD
を導入した細胞の比活性値はそれぞれ23.4、844.5 unit
s/mgタンパクとなり、対照細胞に比べ、pME18S-mSDを導
入細胞では３６倍の高活性が得られた。しかし、4MU-シ
アル酸を水解する活性の上昇は全く見られなかった。こ
の結果は、発現したシアリダーゼがガングリオシドにほ
ぼ特異的に働き、4MU-シアル酸などの合成基質にはほと
んど作用しないという先のウシ脳酵素精製標品における
性状検索の結果を確認するものとなった。

【００６２】さらに、発現したシアリダーゼが形質膜に
局在するかどうかについて、パーコール(Percoll、Phar
macia)濃度勾配遠心法によって調べた。既報（Sagawa
J. etal. J. Biochem. 107, 452-456, 1990) の如く、
ホモジネートを0.25Mスクロースを含む40% Percollの上
に重層し、48,000×gで40分遠心後、分画してシアリダ
ーゼ活性を測定した。形質膜のマーカー酵素である5'-
ヌクレオチダーゼやアルカリホスファターゼの活性分布
と同様な位置にガングリオシド・シアリダーゼ活性が検
出され、発現シアリダーゼは形質膜に局在していること
が確認された。

【００６３】＜４＞ヒト由来ガングリオシド・シアリダ
ーゼのｃＤＮＡクローニング ウシ脳シアリダーゼの一次構造を、先に単離した細胞質
性シアリダーゼ（Miyagi, T. et al. J. Biol. Chem.26
8,26435-26440,1993）のそれと比較したところ、両者で
よく保存されている配列があることがわかったので（図
２）、このアミノ酸配列に基づいて１組のプライマーを
作成した（配列番号２３、２４）。尚、図２に示すアミ
ノ酸配列のうち、ウシ脳シアリダーゼのｃＤＮＡの部分
配列（BBmSD）は、配列番号２のアミノ酸番号４９〜２
０９に相当する。また、ラット骨格筋細胞質性シアリダ
ーゼ（RMcSD）は、該シアリダーゼのアミノ酸配列のう
ち、アミノ酸番号１〜２４０に相当する。

【００６４】ウシ酵素の場合と同じ条件下で、ヒト脳お
よびヒト腎cDNAを調製、これを鋳型としてPCRを行っ
た。増幅されたDNA断片0.25kbをサブクローニングし、D
NA配列を決定した。このcDNAにはひとつのAsp-boxが認
められた。これをプローブとして、ヒト脳およびヒト腎
λgt10 cDNAライブラリー(Clontech) をスクリーニング
した。ヒト脳およびヒト腎でそれぞれ8×10⁵、1×10⁶プ
ラークをスクリーニングすることにより、前者から３個
(pHB82, pHB85, pHB95)、後者から１個(pHK65)の陽性ク
ローンが得られた。

【００６５】サブクローニングの後、これらのDNA配列
を調べると、すべてが重複した部分約１kbを有してい
た。ほぼ全翻訳領域を含むpHB95と３’側非翻訳領域１k
bを含むpHK65から、得られた塩基配列と推定されるアミ
ノ酸配列を配列番号３、４に示す。ウシ脳酵素の配列と
塩基レベルでは８１％（翻訳領域のみでは８７％）、ア
ミノ酸では８２％の高い相同性を示した配列番号４にお
いて、膜貫通領域はアミノ酸番号１７４〜１９４、糖付
加部位はアミノ酸番号３４８、Asp-boxはアミノ酸番号
１３１〜１３８、２０５〜２１２及び２５６〜２６３に
相当する。次に、pHB95のインサート1.5kbをプローブと
してヒト各組織の発現状態をノザンブロット解析する
と、約４kbのmRNAの高い発現が骨格筋に認められ、脳、
肝などにも同じサイズのmRNAが検出された。

【００６６】

【発明の効果】本発明により、形質膜局在シアリダーゼ
及びそれをコードするＤＮＡが提供される。本発明のシ
アリダーゼは、形質膜に主局在を示し、ガングリオシド
を特異的に水解する点で、従来知られているシアリダー
ゼと異なる。

【００６７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：3003 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mDNA 起源 生物名：ウシ（Bos primigenius taurus） 組織の種類：脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：259..1542 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GGAGCTTCCT GGACTTCCTT TCCTAACGGC TGTTTTCGGC TTCCCCAATC TGTCAGCCCC 60 GCCGCCAGCC TCTCGATGTC TCTGTCGCCG TGTTTCTTCA CTTTTCGTGG TTTGTGTCCG 120 CGTCCGCAGT TTCTCTCCTG CCCTCGTCTC CAGGGCTTGA TCATTCTCCA GGGCTTCAGT 180 GTCGGAGACG TGAGTGCTTG ACCCAGCGCC CAGATCAGCC CGAGAGAGAT GGAGGAGCCG 240 GGGTTCCCTG CAGAGGTC ATG GAA GAA GTG ACA TCA TGC TCC TTC AGC AGC 291 Met Glu Glu Val Thr Ser Cys Ser Phe Ser Ser 1 5 10 CCT CTG TTC CAG CAG GAG GAC AAG AGA GGG GTC ACC TAC CGG ATC CCA 339 Pro Leu Phe Gln Gln Glu Asp Lys Arg Gly Val Thr Tyr Arg Ile Pro 15 20 25 GCC CTG ATC TAC GTG CCC CCT GCC CAC ACC TTC CTG GCC TTT GCA GAG 387 Ala Leu Ile Tyr Val Pro Pro Ala His Thr Phe Leu Ala Phe Ala Glu 30 35 40 AAG CGC TCC TCG AGC AAG GAT GAG GAT GCT CTC CAC CTG GTG CTG AGG 435 Lys Arg Ser Ser Ser Lys Asp Glu Asp Ala Leu His Leu Val Leu Arg 45 50 55 CGA GGA TTA AGG ACT GGG CAA TCA GTA CAG TGG GAA CCC CTG AAG TCC 483 Arg Gly Leu Arg Thr Gly Gln Ser Val Gln Trp Glu Pro Leu Lys Ser 60 65 70 75 CTG ATG AAA GCC ACG TTA CCT GGA CAC CGG ACC ATG AAC CCC TGT CCT 531 Leu Met Lys Ala Thr Leu Pro Gly His Arg Thr Met Asn Pro Cys Pro 80 85 90 GTG TGG GAG CGG AAG AGT GGC TAC GTG TAC CTG TTC TTC ATC TGT GTG 579 Val Trp Glu Arg Lys Ser Gly Tyr Val Tyr Leu Phe Phe Ile Cys Val 95 100 105 CAA GGC CAT GTC ACC GAG CGT CAA CAG ATT ATG TCA GGC AGG AAC CCT 627 Gln Gly His Val Thr Glu Arg Gln Gln Ile Met Ser Gly Arg Asn Pro 110 115 120 GCA CGC CTC TGC TTC ATA TGC AGC CAG GAT GCT GGC TAT TCA TGG AGT 675 Ala Arg Leu Cys Phe Ile Cys Ser Gln Asp Ala Gly Tyr Ser Trp Ser 125 130 135 GAT GTG AGG GAC CTG ACT GAG GAG GTC ATT GGC CCA GAG GTG ACA CAC 723 Asp Val Arg Asp Leu Thr Glu Glu Val Ile Gly Pro Glu Val Thr His 140 145 150 155 TGG GCC ACT TTT GCT GTG GGG CCA GGT CAT GGC ATC CAG CTG CAG TCG 771 Trp Ala Thr Phe Ala Val Gly Pro Gly His Gly Ile Gln Leu Gln Ser 160 165 170 GGG AGG CTC ATC ATC CCT GCA TAT GCC TAC TAC ATC CCG TTC TGG TTC 819 Gly Arg Leu Ile Ile Pro Ala Tyr Ala Tyr Tyr Ile Pro Phe Trp Phe 175 180 185 TTT TGC TTT CGG CTG CCA TAT AGA GCT AGG CCT CAT TCC CTG ATG ATC 867 Phe Cys Phe Arg Leu Pro Tyr Arg Ala Arg Pro His Ser Leu Met Ile 190 195 200 TAT AGC GAT GAC CTA GGA GCC ACA TGG CAC CAT GGC AGG CTT ATC AAG 915 Tyr Ser Asp Asp Leu Gly Ala Thr Trp His His Gly Arg Leu Ile Lys 205 210 215 CCC ATG GTG ACA GTG GAA TGT GAA GTG GCA GAG GTG ATC GGG AAG GCC 963 Pro Met Val Thr Val Glu Cys Glu Val Ala Glu Val Ile Gly Lys Ala 220 225 230 235 GGC CAC CCT GTG CTG TAT TGC AGT GCC CGG ACA CCA AAC AGG CAC CGG 1011 Gly His Pro Val Leu Tyr Cys Ser Ala Arg Thr Pro Asn Arg His Arg 240 245 250 GCA GAG GCC CTC AGC ATT GAC CAT GGT GAA TGC TTT CAG AAA CCA GTC 1059 Ala Glu Ala Leu Ser Ile Asp His Gly Glu Cys Phe Gln Lys Pro Val 255 260 265 CTG AGC CAT CAG CTC TGT GAG CCC CCT CAT GGC TGT CAA GGC AGT GTG 1107 Leu Ser His Gln Leu Cys Glu Pro Pro His Gly Cys Gln Gly Ser Val 270 275 280 GTG AGT TTC TGT CCC CTG GAG ATC CCA GGT GGA TGC CAG GAT CTT GCT 1155 Val Ser Phe Cys Pro Leu Glu Ile Pro Gly Gly Cys Gln Asp Leu Ala 285 290 295 GGC GAA GAT GCA CCT GCC ATT CAG CAG AGT CCT CTG CTG TGC AGC TCA 1203 Gly Glu Asp Ala Pro Ala Ile Gln Gln Ser Pro Leu Leu Cys Ser Ser 300 305 310 315 GTG AGA CCA GAG CCG GAA GCT GGA ACC CTG TCA GAA TCA TGG CTC TTG 1251 Val Arg Pro Glu Pro Glu Ala Gly Thr Leu Ser Glu Ser Trp Leu Leu 320 325 330 TAC TCA CAC CCA ACC AAT AAG AAA CGG AGG GTC GAT CTA GGC ATC TAC 1299 Tyr Ser His Pro Thr Asn Lys Lys Arg Arg Val Asp Leu Gly Ile Tyr 335 340 345 CTC AAC CAG AGC CCC TTG GAG GCT GCC TGC TGG TCC CGC CCC TGG ATC 1347 Leu Asn Gln Ser Pro Leu Glu Ala Ala Cys Trp Ser Arg Pro Trp Ile 350 355 360 TTG CAC TGC GGG CCC TGT GGG TAC TCT GAT TTG GCT GCT CTG GAG AAT 1395 Leu His Cys Gly Pro Cys Gly Tyr Ser Asp Leu Ala Ala Leu Glu Asn 365 370 375 GAG GGC TTG TTT GGG TGT TTG TTT GAA TGT GGG ACC AAG CAG GAG TGT 1443 Glu Gly Leu Phe Gly Cys Leu Phe Glu Cys Gly Thr Lys Gln Glu Cys 380 385 390 395 GAG CAG ATT GCC TTC CGC CTG TTT ACA GAC CGA GAG ATC CTG AGC CAC 1491 Glu Gln Ile Ala Phe Arg Leu Phe Thr Asp Arg Glu Ile Leu Ser His 400 405 410 GTG CAA GGG GAC TGC TCC ACC CCT GGT ATG AAC TCT GAG CCA AGT AAA 1539 Val Gln Gly Asp Cys Ser Thr Pro Gly Met Asn Ser Glu Pro Ser Lys 415 420 425 AAG TAATTCGCTT AGGACCCAAC TTTGCATAGA AGGCTACCGT AGAAGGCAGT 1592 Lys CACAGCCAGG ACAGTGGAGG CCAGGATAAC AGAGGTTACT GAAGTCTGCA GAGAAACAAA 1652 ACACCTAATA TTCTGCTCCC TACCTGTTTT CACTTCTCAT TCTCCAGAGA ACAAAATGAA 1712 CATCTTGCCA TAGCTACTGC ATTCAAAAGA GCACTGAACG GTGAGCTGAG AGACTATGAT 1772 GTCATCTTGG CTCTTCCACT GGCTTGCTTT GGGACCTTGG ACATGTCACC TGTACTCTCT 1832 GGGCCTCAGG TCTCCATCTG TAAAAGGAGA GGGTCGGATC TCTGATTTCT CTTCTTCCCA 1892 TCCCTAGGAA AGGCAGTGTG CCTGCATGCC CCCTGATCAG CAAGTCCTGG CTGTATGTAG 1952 GACTCTTATC TCAAAGGCAG GCTCCGCTTT TCAAATGACT TGCCACTCAT CCAAGTATAA 2012 GGTTACAAGC AGGTGTCATA GCACAAAGGA AGATGTAGGT GGCCTGTTTT GTTTTTAATA 2072 ACAAAAGCAC TTACATCCTT CTGATTATGC ACGAAGCTCT ACAGACTCAC TGTTCTAGAG 2132 GAATCGGGCC AAGCAGCAGA ATTATAGGTC ACTTACCTTC TCCAGCTTTA CAGCTCTGCT 2192 CCACCTTTCC TTCCTTGTCC AGAAAGCATT ACCTCTGAAG GAGAAAATGA GATGCTCAAT 2252 GTCAGTGATC TTCAATAATG GTACTTAATG TTTCTGCTGG CATGACTCCT ATGAGAGATG 2312 AACTTGAAGT TCATTTATTA GGATAGTTAT TGATGAGAAA TGAACATGGG TTAGGACTTC 2372 AAAGCATCGG ACAAAACTTT CTGCTATTGC TGCTCTCAAG GAGTTCACAG TTTAGGGGGC 2432 TAGAAGAGGG ATAAAATTGA AGAAAATAAA TGTAGCTGGG GGGATAGTTT ATAGATATTG 2492 GGCTCTAAGT GGGAGTGATA GTAGCTGCTG ATGGTATTAT TTTAATTGTA TCTTAATTGT 2552 GCCTGGAGTC ATCTGCCCCA GAACTTGTCC AAGCTGCTGT TTGTTTTTCT CAGAATGTTG 2612 TTTTCACTCA GCCTTCTTTA ATGGAGACAG TCGTCACCAT TCAGAAGGTC TCTGGACTCA 2672 AAAACCTCTG AATCAAGCAT ATTTGTTCAG ACCTACTGAA ATTTGGACCA TCTCTACTAT 2732 TAGTGAAGTG TAGAGATGCT TCTTTATCTA ATAGATTTGG GATAAACTTT GACATTGCTG 2792 GTTCTCAGAT GATAGCAGAT GGTTGCTCTT ATTTTAGATC ATTTCCTCCA TAAGCCTTTT 2852 ACTGTGACAG ATACTCTTAT TGTGAGAGCT ACCTTTTTTG TCCCTATTTT TGGAGGATAA 2912 TGCCTTAAAC AGGCAGCAGG TAAATATATT TGGTGCTGAG TAATGACCCT GGAGAGTAAG 2972 TCGTTGTCGT GGAACACAGC CTAGAAAGTG G 3003

【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：428 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Val Thr Ser Cys Ser Phe Ser Ser Pro Leu Phe Gln Gln 1 5 10 15 Glu Asp Lys Arg Gly Val Thr Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Ile Tyr Val 20 25 30 Pro Pro Ala His Thr Phe Leu Ala Phe Ala Glu Lys Arg Ser Ser Ser 35 40 45 Lys Asp Glu Asp Ala Leu His Leu Val Leu Arg Arg Gly Leu Arg Thr 50 55 60 Gly Gln Ser Val Gln Trp Glu Pro Leu Lys Ser Leu Met Lys Ala Thr 65 70 75 80 Leu Pro Gly His Arg Thr Met Asn Pro Cys Pro Val Trp Glu Arg Lys 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Tyr Leu Phe Phe Ile Cys Val Gln Gly His Val Thr 100 105 110 Glu Arg Gln Gln Ile Met Ser Gly Arg Asn Pro Ala Arg Leu Cys Phe 115 120 125 Ile Cys Ser Gln Asp Ala Gly Tyr Ser Trp Ser Asp Val Arg Asp Leu 130 135 140 Thr Glu Glu Val Ile Gly Pro Glu Val Thr His Trp Ala Thr Phe Ala 145 150 155 160 Val Gly Pro Gly His Gly Ile Gln Leu Gln Ser Gly Arg Leu Ile Ile 165 170 175 Pro Ala Tyr Ala Tyr Tyr Ile Pro Phe Trp Phe Phe Cys Phe Arg Leu 180 185 190 Pro Tyr Arg Ala Arg Pro His Ser Leu Met Ile Tyr Ser Asp Asp Leu 195 200 205 Gly Ala Thr Trp His His Gly Arg Leu Ile Lys Pro Met Val Thr Val 210 215 220 Glu Cys Glu Val Ala Glu Val Ile Gly Lys Ala Gly His Pro Val Leu 225 230 235 240 Tyr Cys Ser Ala Arg Thr Pro Asn Arg His Arg Ala Glu Ala Leu Ser 245 250 255 Ile Asp His Gly Glu Cys Phe Gln Lys Pro Val Leu Ser His Gln Leu 260 265 270 Cys Glu Pro Pro His Gly Cys Gln Gly Ser Val Val Ser Phe Cys Pro 275 280 285 Leu Glu Ile Pro Gly Gly Cys Gln Asp Leu Ala Gly Glu Asp Ala Pro 290 295 300 Ala Ile Gln Gln Ser Pro Leu Leu Cys Ser Ser Val Arg Pro Glu Pro 305 310 315 320 Glu Ala Gly Thr Leu Ser Glu Ser Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Thr 325 330 335 Asn Lys Lys Arg Arg Val Asp Leu Gly Ile Tyr Leu Asn Gln Ser Pro 340 345 350 Leu Glu Ala Ala Cys Trp Ser Arg Pro Trp Ile Leu His Cys Gly Pro 355 360 365 Cys Gly Tyr Ser Asp Leu Ala Ala Leu Glu Asn Glu Gly Leu Phe Gly 370 375 380 Cys Leu Phe Glu Cys Gly Thr Lys Gln Glu Cys Glu Gln Ile Ala Phe 385 390 395 400 Arg Leu Phe Thr Asp Arg Glu Ile Leu Ser His Val Gln Gly Asp Cys 405 410 415 Ser Thr Pro Gly Met Asn Ser Glu Pro Ser Lys Lys 420 425

【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：2083 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mDNA 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens） 組織の種類：脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：202..1485 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 CGGGGTCTGT AGCTCGGGGC TGTGGCACTG AAGAGAGGAG GCGGCCGTTG GGAACTGAGT 60 CTCCCCAGCC TTGGGGCCGG TGCCTCTTCC GGGCTTCGGC GAATGAGACC TGCGGACCTG 120 CCCCCGCGCC CCATGGAAGA ATCCCCGGCG TCCAGCTCTG CCCCGACAGA GACGGAGGAG 180 CCGGGGTCCA GTGCAGAGGT C ATG GAA GAA GTG ACA ACA TGC TCC TTC AAC 231 Met Glu Glu Val Thr Thr Cys Ser Phe Asn 1 5 10 AGC CCT CTG TTC CGG CAG GAA GAT GAC AGA GGG ATT ACC TAC CGG ATC 279 Ser Pro Leu Phe Arg Gln Glu Asp Asp Arg Gly Ile Thr Tyr Arg Ile 15 20 25 CCA GCC CTG CTC TAC ATA CCC CCC ACC CAC ACC TTC CTG GCC TTT GCA 327 Pro Ala Leu Leu Tyr Ile Pro Pro Thr His Thr Phe Leu Ala Phe Ala 30 35 40 GAG AAG CGT TCC ACG AGG AGA GAT GAG GAT GCT CTC CAC CTG GTG CTG 375 Glu Lys Arg Ser Thr Arg Arg Asp Glu Asp Ala Leu His Leu Val Leu 45 50 55 AGG CGA GGG TTG AGG ATT GGG CAG TTG GTA CAG TGG GGG CCC CTG AAG 423 Arg Arg Gly Leu Arg Ile Gly Gln Leu Val Gln Trp Gly Pro Leu Lys 60 65 70 CCA CTG ATG GAA GCC ACA CTA CCG GGG CAT CGG ACC ATG AAC CCC TGT 471 Pro Leu Met Glu Ala Thr Leu Pro Gly His Arg Thr Met Asn Pro Cys 75 80 85 90 CCT GTA TGG GAG CAG AAG AGT GGT TGT GTG TTC CTG TTC TTC ATC TGT 519 Pro Val Trp Glu Gln Lys Ser Gly Cys Val Phe Leu Phe Phe Ile Cys 95 100 105 GTG CGG GGC CAT GTC ACA GAG CGT CAA CAG ATT GTG TCA GGC AGG AAT 567 Val Arg Gly His Val Thr Glu Arg Gln Gln Ile Val Ser Gly Arg Asn 110 115 120 GCT GCC CGC CTT TGC TTC ATC TAC AGT CAG GAT GCT GGA TGT TCA TGG 615 Ala Ala Arg Leu Cys Phe Ile Tyr Ser Gln Asp Ala Gly Cys Ser Trp 125 130 135 AGT GAG GTG AGG GAC TTG ACT GAG GAG GTC ATT GGC TCA GAG CTG AAG 663 Ser Glu Val Arg Asp Leu Thr Glu Glu Val Ile Gly Ser Glu Leu Lys 140 145 150 CAC TGG GCC ACA TTT GCT GTG GGC CCA GGT CAT GGC ATC CAG CTG CAG 711 His Trp Ala Thr Phe Ala Val Gly Pro Gly His Gly Ile Gln Leu Gln 155 160 165 170 TCA GGG AGA CTG GTC ATC CCT GCG TAT ACC TAC TAC ATC CCT TCC TGG 759 Ser Gly Arg Leu Val Ile Pro Ala Tyr Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Trp 175 180 185 TTC TTT TGC TTC CAG CTA CCA TGT AAA ACC AGG CCT CAT TCT CTG ATG 807 Phe Phe Cys Phe Gln Leu Pro Cys Lys Thr Arg Pro His Ser Leu Met 190 195 200 ATC TAC AGT GAT GAC CTA GGG GTC ACA TGG CAC CAT GGT AGA CTC ATT 855 Ile Tyr Ser Asp Asp Leu Gly Val Thr Trp His His Gly Arg Leu Ile 205 210 215 AGG CCC ATG GTT ACA GTA GAA TGT GAA GTG GCA GAG GTG ACT GGG AGG 903 Arg Pro Met Val Thr Val Glu Cys Glu Val Ala Glu Val Thr Gly Arg 220 225 230 GCT GGC CAC CCT GTG CTA TAT TGC AGT GCC CGG ACA CCA AAC AGG TGC 951 Ala Gly His Pro Val Leu Tyr Cys Ser Ala Arg Thr Pro Asn Arg Cys 235 240 245 250 CGG GCA GAG GCG CTC AGC ACT GAC CAT GGT GAA GGC TTT CAG AGA CTG 999 Arg Ala Glu Ala Leu Ser Thr Asp His Gly Glu Gly Phe Gln Arg Leu 255 260 265 GCC CTG AGT CGA CAG CTC TGT GAG CCC CCA CAT GGT TGC CAA GGG AGT 1047 Ala Leu Ser Arg Gln Leu Cys Glu Pro Pro His Gly Cys Gln Gly Ser 270 275 280 GTG GTA AGT TTC CGG CCC CTG GAG ATC CCA CAT AGG TGC CAG GAC TCT 1095 Val Val Ser Phe Arg Pro Leu Glu Ile Pro His Arg Cys Gln Asp Ser 285 290 295 AGC AGC AAA GAT GCA CCC ACC ATT CAG CAG AGC TCT CCA GGC AGT TCA 1143 Ser Ser Lys Asp Ala Pro Thr Ile Gln Gln Ser Ser Pro Gly Ser Ser 300 305 310 CTG AGG CTG GAG GAG GAA GCT GGA ACA CCG TCA GAA TCA TGG CTC TTG 1191 Leu Arg Leu Glu Glu Glu Ala Gly Thr Pro Ser Glu Ser Trp Leu Leu 315 320 325 330 TAC TCA CAC CCA ACC AGT AGG AAA CAG AGG GTT GAC CTA GGT ATC TAT 1239 Tyr Ser His Pro Thr Ser Arg Lys Gln Arg Val Asp Leu Gly Ile Tyr 335 340 345 CTC AAC CAG ACC CCC TTG GAG GCT GCC TGC TGG TCC CGC CCC TGG ATC 1287 Leu Asn Gln Thr Pro Leu Glu Ala Ala Cys Trp Ser Arg Pro Trp Ile 350 355 360 TTG CAC TGT GGG CCC TGT GGC TAC TCT GAT CTG GCT GCT CTG GAG GAG 1335 Leu His Cys Gly Pro Cys Gly Tyr Ser Asp Leu Ala Ala Leu Glu Glu 365 370 375 GAG GGC TTG TTT GGG TGT TTG TTT GAA TGT GGG ACC AAG CAA GAG TGT 1383 Glu Gly Leu Phe Gly Cys Leu Phe Glu Cys Gly Thr Lys Gln Glu Cys 380 385 390 GAG CAG ATT GCC TTC CGC CTG TTT ACA CAC CGG GAG ATC CTG AGT CAC 1431 Glu Gln Ile Ala Phe Arg Leu Phe Thr His Arg Glu Ile Leu Ser His 395 400 405 410 CTG CAG GGG GAC TGC ACC AGC CCT GGT AGG AAC CCA AGC CAA TTC AAA 1479 Leu Gln Gly Asp Cys Thr Ser Pro Gly Arg Asn Pro Ser Gln Phe Lys 415 420 425 AGC AAT TAATTGGCTT AGGACCCAAT TTCCATAGAT GCAAATGGCA GTTACAGACA 1535 Ser Asn GGTTAACAGA AGCTACTGAA GTCTACAGAT AATCAAAAAA CTTAATATTC TGTTCCCTAC 1595 CTTTTTTCAC TTTTCCTCCT CCAAAGAGCA AAATGAAAAT TTTGCCTTAG CTACTGCAGT 1655 GGAAAGAGCA CTGAACTAGG AGTTGGAAGA CAAGGATGTG GTCCTGGCTC TGCACTGGCT 1715 TGCTTTTGGA CCTTGGATGT GTCACCTGAA CTCTCTGGAC CTCAGGTTTC CATCTGTAAA 1775 ATGAGAGTAT TGGTTCTAAG ATTTCTCATC TTCTCATCCC TAGGACAAGC ATAGTGCCTG 1835 CATGCTTCAT GATCAGTAAG TCCTGGCTGC ATAAAGGACT CTGATGTCAA AATGGAAACC 1895 AGGGGACTTA CCTTTTCACA TGACTTACCC CTCATCCGAG TGTGAGGTTA CAAGCAGGTG 1955 TCATGGCAGG AAGGAAGACC AGATCTGTAT GATTTGTTCC ATTTTTAATA ACAAAAATAT 2015 CCACACCCTT TTAATAATGC TCAGAGTTCT GTAGGCTCTC TATCCTAGAG GAATTGAGCA 2075 AAACAGCC 2083

【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：428 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Val Thr Thr Cys Ser Phe Asn Ser Pro Leu Phe Arg Gln 1 5 10 15 Glu Asp Asp Arg Gly Ile Thr Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Tyr Ile 20 25 30 Pro Pro Thr His Thr Phe Leu Ala Phe Ala Glu Lys Arg Ser Thr Arg 35 40 45 Arg Asp Glu Asp Ala Leu His Leu Val Leu Arg Arg Gly Leu Arg Ile 50 55 60 Gly Gln Leu Val Gln Trp Gly Pro Leu Lys Pro Leu Met Glu Ala Thr 65 70 75 80 Leu Pro Gly His Arg Thr Met Asn Pro Cys Pro Val Trp Glu Gln Lys 85 90 95 Ser Gly Cys Val Phe Leu Phe Phe Ile Cys Val Arg Gly His Val Thr 100 105 110 Glu Arg Gln Gln Ile Val Ser Gly Arg Asn Ala Ala Arg Leu Cys Phe 115 120 125 Ile Tyr Ser Gln Asp Ala Gly Cys Ser Trp Ser Glu Val Arg Asp Leu 130 135 140 Thr Glu Glu Val Ile Gly Ser Glu Leu Lys His Trp Ala Thr Phe Ala 145 150 155 160 Val Gly Pro Gly His Gly Ile Gln Leu Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile 165 170 175 Pro Ala Tyr Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Trp Phe Phe Cys Phe Gln Leu 180 185 190 Pro Cys Lys Thr Arg Pro His Ser Leu Met Ile Tyr Ser Asp Asp Leu 195 200 205 Gly Val Thr Trp His His Gly Arg Leu Ile Arg Pro Met Val Thr Val 210 215 220 Glu Cys Glu Val Ala Glu Val Thr Gly Arg Ala Gly His Pro Val Leu 225 230 235 240 Tyr Cys Ser Ala Arg Thr Pro Asn Arg Cys Arg Ala Glu Ala Leu Ser 245 250 255 Thr Asp His Gly Glu Gly Phe Gln Arg Leu Ala Leu Ser Arg Gln Leu 260 265 270 Cys Glu Pro Pro His Gly Cys Gln Gly Ser Val Val Ser Phe Arg Pro 275 280 285 Leu Glu Ile Pro His Arg Cys Gln Asp Ser Ser Ser Lys Asp Ala Pro 290 295 300 Thr Ile Gln Gln Ser Ser Pro Gly Ser Ser Leu Arg Leu Glu Glu Glu 305 310 315 320 Ala Gly Thr Pro Ser Glu Ser Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Thr Ser 325 330 335 Arg Lys Gln Arg Val Asp Leu Gly Ile Tyr Leu Asn Gln Thr Pro Leu 340 345 350 Glu Ala Ala Cys Trp Ser Arg Pro Trp Ile Leu His Cys Gly Pro Cys 355 360 365 Gly Tyr Ser Asp Leu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Gly Leu Phe Gly Cys 370 375 380 Leu Phe Glu Cys Gly Thr Lys Gln Glu Cys Glu Gln Ile Ala Phe Arg 385 390 395 400 Leu Phe Thr His Arg Glu Ile Leu Ser His Leu Gln Gly Asp Cys Thr 405 410 415 Ser Pro Gly Arg Asn Pro Ser Gln Phe Lys Ser Asn 420 425

【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Xaaは、Ｎ末端から順にAla又はArg、Glu
又はGly、Ile又はTyr、Leu又はSerを表す

【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００７３】配列番号：７ 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００７４】配列番号：８ 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００７５】配列番号：９ 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００７６】配列番号：１０ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 GAYGCNGARA TYCTNWNNCA YGTNCA 26

【００７７】配列番号：１１ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 CCCTGNACRT GNNWNAGRAT TYCNGCRTC 29

【００７８】配列番号：１２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 GAYNGNGGNT AYNSNWNNCA YGTNCAGGG 29

【００７９】配列番号：１３ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 CCCTGNACRT GNNWNSNRTA NCCNCNRTC 29

【００８０】配列番号：１４ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 GAYGAYCTNG GNGC 14

【００８１】配列番号：１５ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 GCNCCNAGRT CRTC 14

【００８２】配列番号：１６ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 NSNNGTNACY TCYTC 15

【００８３】配列番号：１７ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 NANYTCYTCR TAYTT 15

【００８４】配列番号：１８ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 AARGAYGARG AYGCNCTNCA YCTNGT 26

【００８５】配列番号：１９ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 ACNAGRTGNA GNGCRTCYTC RTC 23

【００８６】配列番号：２０ 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Xaaは任意のアミノ酸を表す

【００８７】配列番号：２１ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CCCGAATTCG TCATGGAAGA AGTGACATCA 30

【００８８】配列番号：２２ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CCCGAATTCT TACTTTTTAC TTGGCTCAGA 30

【００８９】配列番号：２３ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 GGACACCGGA CCATGAACCC CTGTCCT 27

【００９０】配列番号：２４ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CCTGGCCCCA CAGCAAAAGT GGCCCA 26

【図面の簡単な説明】

【図１】 エンドプロテイナーゼ消化又はリシルエンド
ペプチダーゼ消化により得られたペプチドのアミノ酸配
列を示す図。なお、図中小文字で表記されたアミノ酸は
確度の低いアミノ酸である。また、Ｎ末端アミノ酸に接
続していたと推定されるLysを(K)で示した。

【図２】 ウシ脳ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ産物（BB
mSD）とラット骨格筋細胞質性シアリダーゼ（RMcSD）の
推定アミノ酸配列の比較を示す図。共通するアミノ酸を
「＊」印で、類似するアミノ酸を「．」印で示した。ま
た、プローブに作製に用いた相同性の高い領域に下線を
付した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 宮城妙子他「ガングリオシドを水解す るシアリダーゼの性状と機能の解析」脂 質生化学研究（1994）第36巻 ｐ．259 −262 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．107（1990）ｐ. 787−793 宮城妙子「動物シアリダーゼの多様性 とその意義」生化学（1990）第62巻 第 12号 ｐ．1506−1512 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．268 35 （1993）ｐ．26435−26440 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
   質。 （Ａ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を
   有するタンパク質。 （Ｂ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に
   おいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
   又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
   シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
   するタンパク質。
2. 【請求項２】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
   質をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を
   有するタンパク質。 （Ｂ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に
   おいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
   又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
   シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
   するタンパク質。
3. 【請求項３】 配列番号１又は３に示す塩基配列を有す
   る請求項２記載のＤＮＡ。