JPH10313869A - 形質膜局在シアリダーゼ及びそれをコードするdna - Google Patents
形質膜局在シアリダーゼ及びそれをコードするdnaInfo
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- JPH10313869A JPH10313869A JP9132174A JP13217497A JPH10313869A JP H10313869 A JPH10313869 A JP H10313869A JP 9132174 A JP9132174 A JP 9132174A JP 13217497 A JP13217497 A JP 13217497A JP H10313869 A JPH10313869 A JP H10313869A
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Abstract
るDNAを提供する。 【解決手段】 下記の(A)又は(B)に示すタンパク
質及びこれをコードするDNA。 (A)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質。 (B)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列に
おいて、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
するタンパク質。
Description
ゼ及びそれをコードするDNAに関し、詳しくは、形質
膜に局在しガングリオシドを特異的に水解するシアリダ
ーゼ及びそれをコードするDNAを提供するものであ
る。本発明のシアリダーゼ及びそれをコードするDNA
は、糖鎖研究試薬や遺伝子治療に用いる薬剤として利用
されることが期待される。
や糖脂質糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を除去する
糖分解酵素である。糖鎖分子からシアル酸を除くと、こ
れら分子の異化分解が開始するだけでなく、分子のコン
ホメーションやレセプターによる認識機構、細胞接着、
免疫機構など多くの重要な細胞機能が大きく変化するこ
とが知られている。シアリダーゼはまた、細胞の増殖や
癌化に伴って鋭敏に活性変化を示し、がん細胞の転移能
にも関与することも明らかになってきた。しかしなが
ら、生体内でシアル酸がどのように脱離されるのかにつ
いてはほとんどわかっていない。それは哺乳動物シアリ
ダーゼの分子レベルの研究が遅れており、その構造や発
現機構に不明の点が多いためである。
に不安定であるため、酵素の分離・精製が困難であっ
た。シアリダーゼは長い間、異化分解に関わる単なるリ
ソゾーム酵素のひとつと考えられがちであった。このよ
うな状況の下で、われわれは主にラット組織を酵素源と
して酵素の分離・精製を進め、細菌やウイルス、原虫な
どのシアリダーゼとは性質の異なる4種のシアリダーゼ
が存在することを見いだしてきた(Miyagi, T. and Tsu
iki, S., Eur. J. Biochem.141,75-81,1984、Miyagi,
T. et al. J. Biochem.107,787-793,1990、Miyagi, T.
and Tsuiki, S., J. Biol. Chem.260,6710-6716,198
5)。これらは、細胞内ではそれぞれリソゾーム内腔、
リソゾーム膜、形質膜(細胞表層膜)、細胞質に局在
し、基質特異性などの酵素学的な性状が異なるだけでな
く、互いに免疫学的にも区別される。これらのシアリダ
ーゼのうち、細胞質に局在するシアリダーゼについて
は、ラット骨格筋から均一精製品を得ることができ、動
物シアリダーゼでは世界で初めてcDNAクローニングに成
功し、一次構造を決定した(Miyagi, T. et al. J. Bio
l. Chem.268,26435-26440,1993)。ゲノム構造の解析を
も行い、機能についてもcDNAをプローブとして、この酵
素が骨格筋細胞の分化や発達に関与していることを明ら
かにした。以上の研究は、これまで世界のシアリダーゼ
研究にひとつの先駆的役割を果たしてきている。
ダーゼは細胞の増殖やがん化に際して活性上昇を示すこ
と、また神経細胞の分化や細胞の情報伝達にも深く関わ
っている可能性が明らかになってきた。しかしながら、
この酵素がどのような構造を持っているのか、どのよう
な機構で活性変化を起こすのかなどについてはこれまで
全くわかっていない。これらの問題解決のために当分野
の多くの研究者が待ち望んでいたのは、そのcDNAのクロ
ーン化であった。たとえば、cDNAを利用して、この酵素
のがん性変化の機構が明らかになれば、その結果をがん
の診断や治療に応用することも可能となる。また、ガン
グリオシドは多くの細胞の表層膜に存在し、細胞接着や
情報伝達など重要な細胞機能に関与する一方、脳の主要
な構成成分でもあるので、それを特異的な基質とするこ
のシアリダーゼはなんらかの重要な脳神経機能にも関わ
っていることが推察される。
みてなされたものであり、形質膜局在シアリダーゼ及び
それをコードするDNAを提供することを課題とする。
に本発明者は鋭意研究を行った結果、形質膜局在シアリ
ダーゼを単離し、それをコードするcDNAをクローニング
することに成功した。さらに、前記シアリダーゼは、同
様に形質膜に主局在を示す基質であるガングリオシド
(シアル酸を含む糖脂質)をほぼ特異的に水解する点で
ユニークで、微生物シアリダーゼや他の哺乳動物シアリ
ダーゼとは酵素の基質特異性が全く異なるものであるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
(B)に示すタンパク質である。 (A)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質。 (B)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列に
おいて、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
するタンパク質。
すタンパク質をコードするDNAを提供する。このよう
なDNAとして具体的には、配列番号1又は3に示す塩
基配列を有するDNAが挙げられる。
「本発明のシアリダーゼ」、これをコードするDNAを
「本発明のDNA」ともいう。
示すアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、本
発明のシアリダーゼには、ガングリオシドの非還元末端
からシアル酸残基を除去する活性を有する限り、配列番
号2又は配列番号4において1若しくは数個のアミノ酸
の置換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列を有
するものも含まれる。
すアミノ酸配列を有するシアリダーゼは、下記の理化学
的性質を有する。 (1)作用 ガングリオシドの非還元末端からシアル酸残基を除去す
る。
には作用しない。具体的には、GD3−ガングリオシ
ド、GD1a−ガングリオシド及びGM3−ガングリオ
シド、合成ガングリオシド(GSC−17(α2−3)及
びGSC−61(α2−6))には作用するが、GM2−
ガングリオシド、GM1−ガングリオシド、オロソムコ
イド、フェツイン、グリコフォリン、ヒツジ顎下腺ムチ
ン、ウシ顎下腺ムチンには実質的に作用しない。α2−
3シアリルラクトース、4−MUNeuAc(4−メチ
ルウンベリフェリル N−アセチルノイラミン酸)には
弱く作用する。
動:約52,000
0.2% Triton X-100存在下で高い活性を示す。Cu
2+等の重金属イオン、4−ヒドロキシマーキュリー安息
香酸によって強く阻害される。ジチオスライトール、Ne
u5Ac2en(2-デオキシ-2,3-デヒドロ-N-アセチルノイラミ
ン酸)、グリセロールによって安定化する。ただし、Neu
5Ac2enによって弱く阻害される。
の酵素であり、本発明のシアリダーゼのうち、配列番号
4に示すアミノ酸配列を有するシアリダーゼはヒト由来
のものであるが、これらはアミノ酸配列において82%
の相同性を示し、膜貫通領域、糖付加部位、シアリダー
ゼのコンセンサス配列であるAsp-boxが同一の位置に存
在することから、ヒト由来の酵素もウシ由来の酵素と同
様の理化学的性質を有すると考えられる。
から次のようにして精製することによって取得すること
ができる。尚、以下の操作はすべて低温で行うことが好
ましい。ウシ脳を、バッファー中でホモジナイズし、10
00×gで10分間遠心し、その上清をさらに30,000×gで1
時間遠心する。遠心後の沈殿画分を、緩衝液に懸濁した
後、5%デオキシコール酸を加えて充分にホモジナイズ
し、100,000×g、1時間遠心後の上清として可溶画分を
得る。バッファー中には、タンパク質分解酵素の阻害
剤、ジチオスライトール、界面活性剤等を添加しておく
ことが好ましい。
にかけ、カラムを洗滌した後、0.2MNaClを含むバッファ
ーで溶出し、分画する。シアリダーゼ活性を有する画分
をバッファーに対して透析した後、オクチル−セファロ
ースにかけ、0.1〜0.4% TritonX-100の直線濃度勾配で
溶出分取する。
ス(ファルマシア社)にかけて、0.25M NaClを含むバッフ
ァーで洗った後、0.2〜1M NaCl直線濃度勾配で溶出し、
活性画分を濃縮する。 上記濃縮酵素液をセファクリル
S-200(ファルマシア社)に乗せ、0.02mM NeuAc2en(2-デ
オキシ-2,3-デヒドロ-N-アセチルノイラミン酸)を含む
バッファーで溶出分取する。
濃度になるように希釈し、RCA-レクチンアガロース(フ
ァルマシア社)に添加し、0.02% TritonX-100を含むバッ
ファーで洗浄した後、0.2M ラクトースを含むバッファ
ーで溶出する。この活性画分をMonoQ(ファルマシア社)
カラムに乗せ、0〜0.5MNaCl直線濃度勾配で溶出する。
(ファルマシア社)カラムに乗せ、0.15M NaCl、10%グリ
セロールを含むバッファー、次いで0.5M NaCl、10%グリ
セロールを含むバッファーで洗浄後、0.05M NaCl、0.05
Mジチオスライトールを含むバッファーで溶出する。活
性画分をMonoQカラムで濃縮する。
SC-211, NeuAc-Gal-Glc-O(CH2)8NH2]( Hasegawa A.et a
l. J. Carbohydr. Chem., 9, 201-214, 1990 )をリガン
ドとしたアフィニティカラムに乗せ、0〜0.5M NaCl濃度
勾配で溶出分取する。アフィニティカラムは、ECH-セフ
ァロース(ファルマシア社)に、GSC-211をN-エチル-N'-
(3'-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩存
在下でカップルすることにより得られる。
ミドゲル電気泳動で分子量52kDのタンパク質とし
て、シアリダーゼ酵素が精製される。また、本発明のシ
アリダーゼは、これをコードするDNAが得られたの
で、このDNAを適当な宿主−ベクター系を用いて発現
させることによっても取得することができる。宿主−ベ
クター系は培養細胞を宿主とし、及びこの宿主に好適な
ベクターを用いればよく、材料及び方法は、異種タンパ
ク質の遺伝子組換え技術を利用した生産に通常用いられ
ているものを採用することができる。ベクターに本発明
のシアリダーゼをコードするDNAを連結する際に、必
要に応じて、宿主内で発現が可能なプロモーター、ター
ミネーター等、遺伝子発現制御に必要な配列を含むベク
ターを用いればよい。
ノ酸配列が明らかになったので、このアミノ酸配列に基
づいて合成することによって取得することができる。後
述の実施例では、本発明のDNAは、本発明のシアリダ
ーゼの部分アミノ酸配列を決定し、その配列に基づいて
作成された合成オリゴヌクレオチドプライマーとするP
CR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)によっ
て、ウシ脳cDNAライブラリーから得られたものであ
る。
すアミノ酸配列をコードする限り、その配列は問わない
が、具体的には配列番号1又は3に示す塩基配列が挙げ
られる。また、動物種、個体差、品種間差により、配列
番号2又は4に示すアミノ酸において1若しくは数個の
アミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸
配列を有するシアリダーゼ及びこれをコードする遺伝子
の存在が予想されるが、そのような本発明のシアリダー
ゼと実質的に同一のタンパク質をコードするDNAも、
本発明のDNAに含まれる。このようなDNAは、それ
を保持する細胞から、配列番号1又は3に記載の塩基配
列又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつ、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
をコードするDNAを単離することによっても、得られ
る。また、上記のような変異を有するシアリダーゼをコ
ードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、
あるいは突然変異処理によって取得され得る。
個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜5個を
いう。
ードするDNAの発展的用途 (1)本発明のシアリダーゼはガングリオシドをほぼ特異
的に水解する点でユニークな基質特異性を示すので、該
酵素及びこれをコードするDNAを保持する組み換え体
は、糖鎖研究試薬として利用される可能性が少なくな
い。
常化するためのひとつの方法として、将来、遺伝子治療
の一種であるアンチセンス療法などが期待されるが、本
発明により明らかにされた遺伝子構造は、このための大
切な情報である。また、cDNAをプローブとしたゲノム構
造の解析により、この酵素の発現機構が明らかになれ
ば、がんなどにおける該酵素の発現異常を正常化するこ
とも可能となる。
シドを特異的に分解するという性質、及び神経細胞の分
化に関与しているという2つの観点から、なんらかの脳
疾患でこの酵素の異常が見い出される可能性があり、そ
の場合には、遺伝子治療や薬剤の開発に、この遺伝子に
ついての情報が大いに利用され得る。
説明する。
て測定した。反応系(0.2ml)は、50〜100nmolシアル酸
結合糖質基質、0.2mgウシ血清アルブミン、15mmol酢酸
ナトリウムバッファー(pH4.6)、0.2mg Triton X-100
および酵素画分から成っており、基質としては主にウシ
脳混合ガングリオシド(Sigma,タイプII)を用いた。
分間インキュベートした後、急速冷凍により反応停止し
た。Warren (Warren L .J. Biol.Chem.234,1971-1975,
1959)のチオバルビツール酸法によって、遊離したシア
ル酸を549nmおよび 532nmで定量した。但し後述のステ
ップ1、2および7においては、反応産物をAGX-2イオ
ン交換ミニカラムに通した後、同法によって定量した。
1時間当りの遊離したシアル酸量 ( nmol) を1unit
(単位)とした。シアル酸結合糖質基質として合成基質
4−メチルウンベリフェリル N−アセチルノイラミン
酸(4-methylumbelliferyl N-acetylneuraminic acid:
4MU-NeuAc) を用いる場合は、反応系からTriton X-100
を除き、遊離した4−メチルウンベリフェロン(4-meth
ylumbelliferone)を蛍光分光光度計で定量した。
adford法(Biorad社のキットを使用) あるいはBCA法 (P
iece Chemical社) によって測定した。より詳細な測定
法については既報(Miyagi and Tsuiki, J. Biol. Che
m.260,6710-6716,1985) に記述している。
精製 以下の操作はすべて4℃で行った。屠畜場から得たウシ
脳は使用するまで-80℃に凍結保存した。200gのウシ脳
に、9容量の0.32M スクロース、1mM DTT(ジチオスライ
トール)、1mM EDTA、0.1mM PMSF(フェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド)を加え、ガラス・テフロンホモジ
ナイザーでホモジナイズ後、1000×gで10分間遠心し、
その上清をさらに30,000×gで1時間遠心した。遠心後
の沈殿画分(ステップ1)を180mlの0.1mM PMSFを含む
バッファーA(20mM リン酸カリウム、pH6.8、0.1% Trit
on X-100、1mM EDTA、1mM DTT)に懸濁した後、5%デオ
キシコール酸を加えて充分にホモジナイズし、100,000
×g、1時間遠心後の上清を可溶画分とした(ステップ
2)。
セルロース(DEAE-cellulose、4.5×20 cm)カラムにか
け、洗った後、0.2M NaClを含むバッファーAで溶出し、
15mlずつ分取した(ステップ3)。活性画分をバッファ
ーAで透析後、同バッファーで平衡化したオクチル−セ
ファロース(Octyl-Sepharose、2.5×7cm)にかけ、0.1〜
0.4% TritonX-100の直線濃度勾配(400ml)で10mlずつ溶
出分取した(ステップ4)。
ス(Heparin-Sepharose、1.5×1cm)にかけて、0.25M NaC
lを含むバッファーAで洗った後、バッファーAの0.2〜1M
NaCl直線濃度勾配(200ml)で溶出し、活性画分をYM-10
メンブランによる限外ろ過で濃縮した(ステップ5)。
縮酵素液をセファクリルS-200(Sephacryl S-200、ファ
ルマシア社、1.5×2.5cm)に乗せ、バッファーB [20mM
リン酸カリウム pH6.8、0.04% TritonX-100、1mM EDT
A、1mM DTT、0.02mM NeuAc2en(2-デオキシ-2,3-デヒド
ロ-N-アセチルノイラミン酸)]で10ml/hの速度で2mlずつ
溶出分取した(ステップ6)。
ose、1.5×2.5cm)を、TritonX-100の濃度のみを0.02%に
代えたバッファーBで平衡化し、0.02% TritonX-100濃度
になるように希釈したステップ6活性画分をカラムに添
加した。同バッファーで洗った後、0.2M ラクトースを
含むバッファーBで溶出した(ステップ7)。この活性
画分をMonoQ (HR5/5)(ファルマシア社)カラムに乗せ、
バッファーBの0〜0.5MNaCl直線濃度勾配で溶出、-20℃
で保存した(ステップ8)。
8kg分に相当)を、活性化チオールセファロース(activa
ted thiol-Sepharose、ファルマシア社、1.5×2cm) に
乗せ、0.15M NaCl、10%グリセロールを含むバッファー
B、次いで0.5M NaCl、10%グリセロールを含む同バッフ
ァーで洗浄後、DTT濃度を50mMに上げた0.05M NaClを含
むバッファーBで溶出した。活性画分をステップ8と同
様にMonoQカラムにより濃縮した(ステップ9)。
1, NeuAc-Gal-Glc-O(CH2)8NH2]( Hasegawa A.et al. J.
Carbohydr. Chem., 9, 201-214, 1990 )をリガンドと
したアフィニティカラムクロマトグラフィを行った。ア
フィニティカラム(0.7×3cm)は、ECH-セファロース(ECH
-Sepharose、ファルマシア社)に製造元の使用説明書に
従って、GSC-211をN-エチル-N'-(3'-ジメチル-アミノプ
ロピル)カルボジイミド塩酸塩存在下でカップルするこ
とにより作成した。バッファーC(10mM リン酸カリウ
ム、pH6.8、 0.04% TritonX-100、1mM EDTA、1mM DTT、
20%グリセロール)で平衡化したカラムにステップ8酵素
画分を乗せ、バッファーCの0〜0.5M NaCl濃度勾配で1.5
mlずつ溶出分取した(ステップ10)。
表1にまとめた。上記操作により、シアリダーゼ活性
は、ウシ脳顆粒画分から10万倍以上に精製された。最
終標品をLaemmliの方法(Laemmli,U. K. Nature 227,68
0-685,1970) によって、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、純度検定を行った。その結果、主要な
52k蛋白バンドの他に、淡い50kのバンドが認められ
たが、52k蛋白の染色濃度がアフィニティカラムから
の溶出活性パタンと平行しており、しかもこのバンドは
ステップ9から10へと濃縮されていたのでシアリダー
ゼ酵素蛋白と考えられた。
性質 上記の精製酵素を用いて調べた該酵素の理化学的性質を
示す。
を、表2に示す。数値は、GD3−ガングリオシドに対
する活性を100としたときの相対活性を示す。
61(α2−6)の分解の2.5倍の速度であり、α2−
6結合よりもα2−3結合に作用しやすいと考えられ
る。また、GM3ガングリオシドの糖部分に相当するα
2−3シアリルラクトースには作用しないことから、基
質としてセラミド部分が不可欠である。
動:約52,000 (iv)阻害及び活性化等 活性には界面活性剤を必要とする。例えば、0.1〜
0.2% Triton X-100存在下で高い活性を示す。各阻
害剤存在下での残存活性を表3に示す。数値は、100
−(阻害剤存在下における残存活性%)を示す。
出発材料として、上記と同様にしてステップ9の酵素画
分を調製し、ペプチド分析に供した。酵素画分を0.1% P
VP-40 (Sigma) 存在下に透析脱塩し、セントリコン(Mi
llipore)で濃縮後、前述のようにSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、PVDF膜(Problott, Applied
Biosystems) にトランスファーした。Ponceau S染色に
より、酵素蛋白の位置を確認し、該当するメンブラン部
分を切り出して、リシルエンドペプチダーゼ(lysyl end
opeptidase)消化を行い、 引き続いてエンドプロテイナ
ーゼ(endoproteinase)Asp-Nにより消化し、その産物を
高速液体クロマトグラフィで分離した。
用いて、分画されたペプチドのアミノ酸シークエンシン
グを行った。以上のマイクロシークエンシングはIwamat
suらの方法( Iwamatsu A. and Yoshida-kubomura N., .
J. Biochem. 120,29-34,1996) に従った。得られた配列
を図1及び配列番号5〜9に示す。配列番号5〜7はエ
ンドプロテイナーゼ消化により得られたフラグメントの
アミノ酸配列であり、配列番号8、9はリシルエンドペ
プチダーゼ消化により得られたフラグメントのアミノ酸
配列である。尚、配列番号5において、2〜5番目のア
ミノ酸は未確定であり、2番目のアミノ酸はAla又はAr
g、3番目はGlu又はGly、4番目はIle又はTyr、5番目
はLeu又はSerのいずれかである可能性が高い。
ーニング 上記のようにして決定された精製酵素のペプチドのアミ
ノ酸配列に基づいて、配列番号10(DN1-1S)、11
(DN1-1A)、12(DN1-2S)、13(DN1-2A)、14
(DN2S)、15(DN2A)、16(DN3A)、17(AP1
A)、18(AP3S)及び19(AP3A)に示すセンス、ア
ンチセンスのデジェネレートプライマーを10個作成し
た(図1参照)。尚、DN1、DN2、DN-3、AP-1及びAP-3
は、図1に示すペプチド名を、Sはセンス、Aはアンチセ
ンスを示す。また、DN1-1は、DN-1の未確定のアミノ酸
(2〜5番目のアミノ酸)が順にAla、Glu、Ile、Leuで
あるとした場合の塩基配列を、DN1-2は、DN-1の未確定
のアミノ酸が順にArg、Gly、Tyr、Serであるとした場合
の塩基配列を示す。
ル−クロロホルム法(Chomczynski P.and Sacchi N., A
nal. Biochem. 162, 156-159, 1987) によって調製し、
poly(A)+RNA はoligo(dT)-セルロースカラムクロマトグ
ラフィによって精製した。poly(A)+RNA (1mg) および逆
転写酵素(Molony murine leukemia virus 由来、BRL)
を用いて、既報(Miyagi T. et al .J. Biol. Chem. 26
8,26435-26440, 1993)の如くcDNAを合成し、これを鋳
型としてPCR法による増幅を試みた。
l, 10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgCl2, 0.01% ゼラチ
ン, 0.2mM dNTPs(dATP、dGTP、dCTP及びdTTPを各々0.2
mM),0.5 mg cDNA, 1.5 nuits Taq polymerase (Ex Ta
q, Takara) であった。94℃(0.5分), 50℃(1分), 72℃
(2分) の40サイクルの後、72℃ 10分間反応延長して
DNA増幅を行った。得られた12個の DNA増幅断片
をBluescriptベクター(Stratagene)のSmaI サイトに
サブクローニングし、ジデオキシ法(Sanger F.et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977) に
よってDNAシークエンシングを行った。
相当する部分の塩基配列から推定されるアミノ酸配列の
妥当性や、終止コドンの有無などについて検討した結
果、プライマーAP3S および DN2Aによる0.5kb のPCR産
物のみがこれらの条件を満たしていた。しかもこの断片
には、シアリダーゼのコンセンサス配列であるAsp-box
(-Ser-Xaa-Asp-Xaa-Gly-Xaa-Thr-Trp-(配列番号20))
が2個見い出され(配列番号2においてアミノ酸番号1
31〜138及び205〜212)、推定されるアミノ
酸配列はわれわれが先に単離した細胞質性シアリダーゼ
のそれと38%の相同性を示した。しかしそれ以外の他
のどの蛋白とも有意の相同性は認められなかった。
て、ウシ脳λgt10ライブラリー(Clontech) をスクリー
ニングした。cDNAをrandom primer DNA ラベリング
キット(Takara) を用いて[α-32P] dCTPでアイソトープ
標識し、プラークハイブリダイゼーションによってファ
ージ(2×106個) をスクリーニングした。ハイブリダイ
ゼーションはナイロンメンブレン(Hybond N+, Amersha
m) を用い、製造元の使用説明書に従って実施した。1
5個の陽性クローンのうち、pBB121(1.45kb) およびpBB
321(2.8kb) の2個に全翻訳領域が含まれることが推察
された。
それから推定されるアミノ酸配列を、配列番号1及び2
に示す。そこには精製品のペプチドから得られた4種の
アミノ酸配列が含まれており、DN-1についてはDN1-1の
2番目のアミノ酸がA→Rであることがわかった。また、
AP-1配列については見い出せなかったが、蛋白データベ
ースによってウシのケラチンに同じ配列が含まれること
がわかったので、ペプチドシークエンシングに供した酵
素画分へのケラチンの混在に由来する可能性が高い。
側にさらに1個見い出された(配列番号2においてアミ
ノ酸番号256〜263)。2個のAsp-boxの間に膜貫
通領域と考えられる疎水性配列が認められ(配列番号2
においてアミノ酸番号174〜194)、それより3’
側に糖付加部位(配列番号2においてアミノ酸番号34
9)が見い出された。精製法に採用したように、この酵
素はRCAレクチンに結合する性質を持つので、この部位
には実際に糖鎖が付いているものと考えられる。428
個のアミノ酸から算定された蛋白の分子量は48,000であ
って、一本の糖鎖が加わると実際の値は50,000前後とな
り、前述の精製標品のSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による値と矛盾しない。
おける一過性発現 pBB121(1.45kb)の翻訳領域について、EcoRIサイトを付
加した5’センスプライマー(配列番号21)および3’
アンチセンスプライマー(配列番号22)を用いてPCR法
により増幅し、得られたDNA断片をアガロース電気泳動
により精製した。これをSV40複製起点を持つSRαプロモ
ーター高発現ベクターpME18S(東京医科歯科大学、医学
部、丸山和夫博士より供与)のEcoRIサイトに連結し(pM
E18S-mSD)、COS-7細胞にエレクトロポレーションによる
一過性発現を試みた。10%FBS(ウシ胎児血清)を含むDMEM
で培養した対数増殖期にあるCOS-7細胞(106)に、40μg
のpME18SあるいはpME18S-mSDを加え、室温に10分間放置
した後、250V, 950μFDの条件下で電気パルスをかけ、
再び室温に10分間放置後、培養に戻した。
除いた後、9容量のPBSを添加して10秒間の超音波処理
により細胞破砕を行った。1,000×で10分間冷却遠心
し、その上清をホモジネートとした。ガングリオシドを
基質としてTritonx-100 (0.1%)存在下でトランスフェク
タントのホモジネートについてシアリダーゼ活性を測定
した。
を導入した細胞の比活性値はそれぞれ23.4、844.5 unit
s/mgタンパクとなり、対照細胞に比べ、pME18S-mSDを導
入細胞では36倍の高活性が得られた。しかし、4MU-シ
アル酸を水解する活性の上昇は全く見られなかった。こ
の結果は、発現したシアリダーゼがガングリオシドにほ
ぼ特異的に働き、4MU-シアル酸などの合成基質にはほと
んど作用しないという先のウシ脳酵素精製標品における
性状検索の結果を確認するものとなった。
局在するかどうかについて、パーコール(Percoll、Phar
macia)濃度勾配遠心法によって調べた。既報(Sagawa
J. etal. J. Biochem. 107, 452-456, 1990) の如く、
ホモジネートを0.25Mスクロースを含む40% Percollの上
に重層し、48,000×gで40分遠心後、分画してシアリダ
ーゼ活性を測定した。形質膜のマーカー酵素である5'-
ヌクレオチダーゼやアルカリホスファターゼの活性分布
と同様な位置にガングリオシド・シアリダーゼ活性が検
出され、発現シアリダーゼは形質膜に局在していること
が確認された。
ーゼのcDNAクローニング ウシ脳シアリダーゼの一次構造を、先に単離した細胞質
性シアリダーゼ(Miyagi, T. et al. J. Biol. Chem.26
8,26435-26440,1993)のそれと比較したところ、両者で
よく保存されている配列があることがわかったので(図
2)、このアミノ酸配列に基づいて1組のプライマーを
作成した(配列番号23、24)。尚、図2に示すアミ
ノ酸配列のうち、ウシ脳シアリダーゼのcDNAの部分
配列(BBmSD)は、配列番号2のアミノ酸番号49〜2
09に相当する。また、ラット骨格筋細胞質性シアリダ
ーゼ(RMcSD)は、該シアリダーゼのアミノ酸配列のう
ち、アミノ酸番号1〜240に相当する。
よびヒト腎cDNAを調製、これを鋳型としてPCRを行っ
た。増幅されたDNA断片0.25kbをサブクローニングし、D
NA配列を決定した。このcDNAにはひとつのAsp-boxが認
められた。これをプローブとして、ヒト脳およびヒト腎
λgt10 cDNAライブラリー(Clontech) をスクリーニング
した。ヒト脳およびヒト腎でそれぞれ8×105、1×106プ
ラークをスクリーニングすることにより、前者から3個
(pHB82, pHB85, pHB95)、後者から1個(pHK65)の陽性ク
ローンが得られた。
を調べると、すべてが重複した部分約1kbを有してい
た。ほぼ全翻訳領域を含むpHB95と3’側非翻訳領域1k
bを含むpHK65から、得られた塩基配列と推定されるアミ
ノ酸配列を配列番号3、4に示す。ウシ脳酵素の配列と
塩基レベルでは81%(翻訳領域のみでは87%)、ア
ミノ酸では82%の高い相同性を示した配列番号4にお
いて、膜貫通領域はアミノ酸番号174〜194、糖付
加部位はアミノ酸番号348、Asp-boxはアミノ酸番号
131〜138、205〜212及び256〜263に
相当する。次に、pHB95のインサート1.5kbをプローブと
してヒト各組織の発現状態をノザンブロット解析する
と、約4kbのmRNAの高い発現が骨格筋に認められ、脳、
肝などにも同じサイズのmRNAが検出された。
及びそれをコードするDNAが提供される。本発明のシ
アリダーゼは、形質膜に主局在を示し、ガングリオシド
を特異的に水解する点で、従来知られているシアリダー
ゼと異なる。
又はGly、Ile又はTyr、Leu又はSerを表す
ペプチダーゼ消化により得られたペプチドのアミノ酸配
列を示す図。なお、図中小文字で表記されたアミノ酸は
確度の低いアミノ酸である。また、N末端アミノ酸に接
続していたと推定されるLysを(K)で示した。
mSD)とラット骨格筋細胞質性シアリダーゼ(RMcSD)の
推定アミノ酸配列の比較を示す図。共通するアミノ酸を
「*」印で、類似するアミノ酸を「.」印で示した。ま
た、プローブに作製に用いた相同性の高い領域に下線を
付した。
Claims (3)
- 【請求項1】 下記の(A)又は(B)に示すタンパク
質。 (A)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質。 (B)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列に
おいて、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
するタンパク質。 - 【請求項2】 下記の(A)又は(B)に示すタンパク
質をコードするDNA。 (A)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質。 (B)配列番号2又は配列番号4に示すアミノ酸配列に
おいて、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつガングリオ
シドの非還元末端からシアル酸残基を除去する活性を有
するタンパク質。 - 【請求項3】 配列番号1又は3に示す塩基配列を有す
る請求項2記載のDNA。
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