DE69933647T2

DE69933647T2 - Rekombinante lysophosphatidsäure - phosphatase.

Info

Publication number: DE69933647T2
Application number: DE69933647T
Authority: DE
Inventors: Tadaomi Takenawa; Masami Kawasaki-shi HIROYAMA; Tatsuya Suita-shi KISHIMOTO; Masahiro Ibaraki-shi YAMAGUCHI; Mitsuyoshi Kyoto-shi TOYOSATO; Kouji Nishikyo-ku Kyoto-shi MIZUNO
Original assignee: Azwell Inc
Current assignee: Azwell Inc
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-08-23
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-08-24
Also published as: EP1050584A4; WO2000031275A1; EP1050584B1; US6472193B1; EP1050584A1; US7109012B2; DE69933647D1; US20030104600A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Lysophosphatidsäure-Phosphatase (LPA-Phosphatase). Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, die eine LPA-Phosphatase codiert, ein Protein, das durch die DNA codiert wird, einen Expressionsvektor, der die DNA enthält, eine Transformante, die den Expressionsvektor enthält, ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, einen Antikörper gegen das Protein, eine Antisense-DNA oder -RNA, die zu der DNA komplementär ist, eine/n Oligonucleotid-Sonde oder -Primer, die/der in der Lage ist, mit der DNA spezifisch zu hybridisieren, ein Verfahren zu Bestimmung der LPA unter Verwendung einer rekombinanten LPA-Phosphatase, ein Bestimmungsreagenz und einen Kit für die Diagnose.
HINTERGRUND DES FACHGEBIETS
Lysophosphatidsäure (LPA) ist ein natürlich vorkommendes Phospholipid mit einer sehr einfachen chemischen Struktur, und von ihr ist bekannt, dass sie eine Wachstumsfaktor-ähnliche Aktivität auf Fibroblasten aufweist [Moolenaar, W.H. et al. (1992) Rev. Physiol. Biochem. Pharmcol. 119, 47–65; Moolenaar, W.H. (1995) J. Biol. Chem. 270, 12949–12952; Moolenaar, W.H. et al. (1997) Curr: Opinion Cell Biol. 9, 168–173]. Die LPA wird als Produkt des Blutgerinnungsprozesses durch die aktivierten Thrombocyten rasch hergestellt und freigesetzt. Daher wurde vorgeschlagen, dass die LPA eine mögliche Rolle bei der Heilung von Wunden und bei der Regeneration spielt. Es wurde auch deutlich, dass die LPA ein schnelles Zurückziehen des Axons und eine vorübergehende Bildung von kugelförmigen Zellkörpern bei Nervenzellen induziert. Man nimmt an, dass diese biologischen Aktivitäten durch den LPA-Rezeptor verursacht werden, der mit einem G-Protein konjugiert ist [Moolenaar, W. H. et al. (1997) Curr: Opinion Cell Biol. 9, 168–173], und es ist eine cDNA isoliert worden, die zwei abgeleitete LPA-Rezeptoren codiert [Hecht, J.H. et al. (1996) J. Cell. Biol. 135, 1071–1083; Guo, Z. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14367–14372].
Darüber hinaus besitzt die LPA verschiedene biologische Aktivitäten wie z. B. die Förderung des Eindringens von Krebszellen, die Zelladhäsion, die Unterdrückung der Apoptose und die Chemotaxis. Des Weiteren wurde berichtet, dass die Menge der LPA, die im Serum vorliegt, bei Eierstockkrebs und anderen bösartigen gynäkologischen Krebsarten hoch ist [Xu, Y. et al. (1998) JAMA 280, 719–723], und man nimmt an, dass sie auch als ein Marker für eine frühe Krebserkennung dienen kann.
Hinsichtlich der Produktion der LPA ist bekannt, dass die LPA durch die Erzeugung aus Monoacylglycerin durch die Monoacylglycerin-Kinase, die Erzeugung aus Phosphatidsäure durch die Phospholipase A1 (PLA1) oder die Phospholipase A2 (PLA2) und ähnliches synthetisiert werden kann. Da jedoch die (Produktion der) LPAs, die als Antwortreaktion auf verschiedene Reize hin produziert werden, in einem leicht verzögerten Stadium verglichen mit der Erzeugung von Phosphatidsäure (PA) stattfindet [Gait, F. et al. (1997) FEBS Lett. 410, 54–58], nimmt man an, dass diejenigen, die letzterem Weg zugeschrieben werden, dominant sind.
Die durch dieses Biosynthese-System erzeugte LPA wird jedoch sofort zu Phosphatidsäure umgewandelt, so dass man annimmt, dass in den meisten Fällen, in denen die LPA als bioaktiver Stoff wirkt, sie nicht durch das Synthese-System hergestellt wird, sondern als Produkt eines Phospholipid-Abbau-Systems. Betrachtet man die hydrolytischen Wege der LPA, gibt es drei mögliche Wege, nämlich einen Weg über LPA-Phospholipase A, einen über LPA-Phosphatase und einen über LPA-Acyltransferase [Gait, F. et al. (1997) FEBS Lett. 410, 54–58; Eberhardt, C. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 20299–20305]. Da die LPA ein bioaktives Lipid ist, nimmt man an, dass der Ausschluss der LPA durch die vorstehenden Enzyme eine äußerst wichtige Rolle bei der Beendigung des Signals darstellt.
Von der LPA-Phospholipase A ist ein aus Rattenhirn gereinigtes Enzym bekannt, das ein membrangebundenes Enzym mit einer Größe von 80 kDa darstellt und das LPA hydrolysiert, andere Lysophospholipide jedoch nicht hydrolysiert [Thompson, F.J. und Clark, M.A. (1994) Biochem. J. 300, 457–461].
Hinsichtlich der LPA-Phosphatase wurde über die Anwesenheit einer ecto-(Lyso)phosphatidsäure-Phosphatase berichtet, die ebenfalls PA in PAM212-Maus-Keratinzellen hydrolysiert [Xie, M. und Low, M.G. (1994) Arch. Biochemistry Biophysics 312, 254–259]. Erst kürzlich wurde eine membrangebundene PA-Phosphatase, die für PA relativ spezifisch ist, aber auch eine schwache Aktivität gegenüber LPA aufweist, aus Schweine-Thymus gereinigt [Kanoh, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 25309–25314; Kai, M. et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 18931–18938]. Des Weiteren wurde eine membrangebundene PA-Phosphatase, die ebenfalls LPA, Ceramid-1-phosphat und Sphingosin-1-phosphat hydrolysiert, aus Rattenleber gereinigt [Waggoner, D.W. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 19422–19429; Waggoner, D.W. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 16506–16509]. Bis heute ist jedoch keine LPA-spezifische Phosphatase bekannt.
Hinsichtlich eines Verfahrens zur Bestimmung der LPA ist weiterhin ein Verfahren bekannt, das die Extraktion der Lipidbestandteile aus einer Probe, die Trennung der LPA von den anderen Lipidbestandteilen durch Dünnschicht-Chromatographie und den anschließenden Nachweis der so erhaltenen LPA durch Gaschromatographie umfasst, und zwar als Methylester einer Fettsäure, der über eine Transmethylierungsreaktion erzeugt wird [Xu, Y. et al. (1988) JAMA 280, 719–723]. Dieses Verfahren erfordert jedoch komplizierte Arbeitsschritte, so dass es den Nachteil aufweist, dass eine lange Zeit für das Austesten einer großen Zahl an Proben erforderlich ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf den vorstehenden Stand der Technik angefertigt, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer rekombinanten LPA-Phosphatase, die in der Lage ist, LPA spezifisch zu hydrolysieren, und die nützlich ist, um den Stoffwechselweg der LPA aufzuklären, sowie für die Diagnose und die Behandlung verschiedener Erkrankungen, mit denen die LPA assoziiert ist; ein Verfahren, das es ermöglicht, die LPA, die mit verschiedenen Erkrankungen assoziiert ist, einfach und kostengünstig zu bestimmen; ein Bestimmungsreagenz, das für das Verfahren geeignet ist; einen Kit, der für die Diagnose einer Krankheit, mit der die LPA assoziiert ist, geeignet ist, und ähnliches.
Die hier genannten Erfinder haben das Vorliegen einer LPA-Phosphatase-Aktivität in Rinderhirn bestätigt, die LPA-Phosphatase unter Verwendung von Rinderhirn als Ausgangsmaterial gereinigt und dann die Untersuchung fortgesetzt. Als Ergebnis haben sie das menschliche LPA-Phosphatase-Gen erfolgreich cloniert, und die vorliegende Erfindung wurde dadurch fertig gestellt.
Die Hauptpunkte der vorliegenden Erfindung betreffen:

[1] eine DNA, die eine Lysophosphatidsäure-Phosphatase codiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst; (b) einer DNA, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 resultiert; (c) einer DNA, umfassend die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2; (d) einer DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Basen in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 resultiert; (e) einer DNA, die in der Lage ist, an eine der DNAs gemäß (a) bis (d) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren;
[2] ein Protein, das durch die DNA gemäß Punkt [1] vorstehend codiert wird;
[3] einen Expressionsvektor, der die DNA gemäß Punkt [1] vorstehend enthält;
[4] eine Transformante, die den Expressionsvektor gemäß Punkt [3] vorstehend enthält;
[5] ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Lysophosphatidsäure-Phosphatase, umfassend den Schritt des Züchtens der Transformante gemäß dem Punkt [4] vorstehend unter Bedingungen, unter denen das Protein von dem Expressionsvektor gemäß Punkt [3] vorstehend exprimiert werden kann;
[6] einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das in der Lage ist, spezifisch an das Protein gemäß Punkt [2] vorstehend zu binden;
[7] eine Antisense-DNA oder Antisense-RNA, umfassend 8 Basen oder mehr, welche eine Sequenz hat, die zu der DNA gemäß Punkt [1] vorstehend komplementär ist;
[8] eine Sonde oder einen Primer, die/der in der Lage ist, an die DNA gemäß Punkt [1] vorstehend spezifisch zu hybridisieren;
[9] ein Verfahren zur Bestimmung der LPA, umfassend den Schritt des Vermischens des Proteins gemäß Punkt [2] vorstehend mit einer Probe, die untersucht werden soll;
[10] das Verfahren für die Bestimmung der LPA gemäß Punkt [9] vorstehend, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Produkts, das aus der Hydrolyse der Lysophosphatidsäure durch das Protein gemäß Punkt [2] vorstehend entsteht, als Anzeige für die Anwesenheit oder die Abwesenheit der Lysophosphatidsäure verwendet wird;
[11] das Verfahren für die Bestimmung der LPA gemäß Punkt [10] vorstehend, wobei Phosphorsäure oder Monoacylglycerin als das Hydrolysat der Lysophosphatidsäure bestimmt wird;
[12] ein Bestimmungsreagenz für die LPA, umfassend das Protein gemäß Punkt [2] vorstehend;
[13] das Bestimmungsreagenz für die LPA gemäß Punkt [12], das weiterhin ein Reagenz für die Bestimmung von Phosphorsäure oder Monoacylglycerin umfasst; und
[14] einen Kit zur Diagnose einer Krankheit, in welche die LPA involviert ist, umfassend das Bestimmungsreagenz für die LPA gemäß Punkt [12] oder [13] vorstehend.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse einer Ionenaustausch-Chromatographie mit Q-Sepharose FF zeigt.
2 ist eine Darstellung die die Ergebnisse einer Ionenaustausch-Chromatographie mit TSK-GEL DEAE-5PW GL zeigt.
3 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse einer Gelfiltration mit Hi-Load 26/60-Superdex 200 zeigt.
4 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse einer Adsorptions-Chromatographie mit einer Hi-Trap-Heparin-Säule zeigt.
5 ist eine Photographie einer Elektrophorese, die die Ergebnisse einer 12,5 %igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen zeigt. Jede der Bahnen 1 bis 6 zeigt eine Probe, die bei jedem Schritt in Beispiel 1 erhalten wurde (die aufgetragenen Proteinmengen betragen 14, 10, 5,5, 4,6, 2,1 bzw. 0,27 μg), und die Zahlen am linken Rand geben die Molekulargewichte von Markerproteinen an.
6 zeigt die Ergebnisse der DC, welche zeigen, dass die Rinder-LPA-Phosphatase in einer Dosis-abhängigen Weise [³H]-LPA zu [³H]-Monooleoylglycerin hydrolysiert. Die Bahnen 1 bis 5 entsprechen Enzymmengen von 0, 15, 37,5, 75 und 150 ng, und MG steht für Monooleoylglycerin.
7 ist eine Darstellung der Bewertung der Reaktivität der Rinder-LPA-Phosphatase mit [³²P]-LPA oder [³²P]-PA, die jeweils vorher über DC gereinigt wurden. Abbildung A zeigt die Ergebnisse, wobei die Menge des Enzyms verändert wurde, und Abbildung B zeigt die Ergebnisse, wobei die Konzentration des Substrats verändert wurde.
8 ist eine Zeichnung, die die Kalibrierungskurve für die LPA-Bestimmung zeigt, die unter Verwendung des Bestimmungsreagenzes der vorliegenden Erfindung erhalten wurde. Die obere Tabelle zeigt die Veränderung in der Extinktion, wenn eine Probe jeder LPA-Konzentration bestimmt wird. Die untere Abbildung ist eine Darstellung der Kalibierungskurve, die mit den erhaltenen Werten für die Extinktionsveränderungen erstellt wurde.
9 ist eine Zeichnung, die die Ergebnisse der Bestimmung verschiedener Arten der LPA zeigt, wobei sich die Fettsäurereste in der Acylgruppe unterscheiden. Die obere Tabelle zeigt die Veränderung in der Extinktion, die für jede Probe bestimmt wurden, und die untere Abbildung zeigt ein Diagramm, das mit den erhaltenen Werten für die Extinktionsveränderung erstellt wurde.
10 ist eine grafische Darstellung, die die Ergebnisse eines Reaktionszeitverlaufs für 1-Oleoyl-LPA zeigt, der unter Verwendung des Bestimmungsreagenz der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden.
11 ist eine Zeichnung, die die Ergebnisse der Bestimmung von Proben, welche LPA, PA, LPE oder LPC enthalten, unter Verwendung des Bestimmungsreagenzes der vorliegenden Erfindung zeigt.
DAS BESTE VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Lysophosphatidsäure-Phosphatase (LPA-Phosphatase) der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, das durch die DNA der vorliegenden Erfindung, die nachstehend beschrieben wird, codiert wird, wobei das Protein eine Aktivität besitzt, die in der Lage ist, Phosphatester der Lysophosphatidsäure spezifisch zu hydrolysieren (hierin nachstehend in einigen Fällen als „LPA-Phosphatase-Aktivität" abgekürzt). Konkret ist ein Peptid mit eingeschlossen, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst. Dieses Peptid ist ein Protein mit 421 Aminosäureresten und stellt die menschliche LPA-Phosphatase dar.
Hinsichtlich der Substratspezifität der LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung ist festzustellen, dass das Enzym die Eigenschaft aufweist, Lysophosphatidsäure spezifisch zu hydrolysieren, dass es aber Phosphatidsäure, Cardiolipin, Bisphosphatidsäure, Glycerinphosphat, Ceramid-1-phosphat und Sphingosin-1-phosphat nicht hydrolysiert.
In der vorliegenden Erfindung umfassen die Substrate der LPA 1-Oleoyl-lysophosphatidsäure (1-Oleoyl-LPA), 1-Palmitoyl-LPA, 1-Stearoyl-LPA, 1-Myristoyl-LPA, 1-Lauroyl-LPA, 1-Linoleoyl-LPA und ähnliche. Wenn in der vorliegenden Beschreibung einfach nur als „LPA" bezeichnet wird, umfasst die technische Idee die vorstehend erwähnte 1-Oleoyl-LPA, 1-Palmitoyl-LPA, 1-Stearoyl-LPA, 1-Myristoyl-LPA, 1-Lauroyl-LPA, 1-Linoleoyl-LPA und ähnliche.
Die Aktivität der LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung kann durch ein herkömmliches Verfahren untersucht werden. So kann zum Beispiel die Aktivität durch das folgende Verfahren ausgetestet werden.
Es wird eine Reaktion bei 37°C über 15 Minuten in 50 mM Tris-Maleat-Puffer (50 μl) bei einem pH-Wert von 7,5 durchgeführt, der 50 μM [³H]-1-Oleoyl-LPA (5 × 10⁴ ZpM (Zerfälle pro Minute)), ein Detergenz und das Enzym enthält. Es werden 250 μl des Dole-Reagenzes (Isopropanol/Heptan/1 N H₂SO₄ = 78/28/2) zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und anschließend werden 125 μl H₂O und 150 μl Heptan dem so erhaltenen Reaktionsprodukt zugefügt. Nach dem Mischen wird das so erhaltene Gemisch zentrifugiert (1.200 × g, 5 Minuten). Es werden 150 μl der oberen Phase in ein anderes Gefäß überführt, und danach werden 150 μl Heptan und eine Mikrospatelmenge an Silicagel 60H zugegeben und vermischt. Das Gemisch wird zentrifugiert (1.200 × g, 5 Minuten), und 200 μl des Überstandes werden zu 2 ml Scintisol EX-H gegeben. Das erzeugte [³H]-Monooleoylglycerin wird in einem Szintillationszähler gemessen, um die Enzymaktivität zu bestimmen.
Die DNA der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die eine LPA-Phosphatase codiert, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einer DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst;
(b) einer DNA, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 resultiert;
(c) einer DNA, umfassend die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2;
(d) einer DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Basen in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 resultiert;
(e) einer DNA, die in der Lage ist, an eine der vorstehend erwähnten DNAs gemäß (a) bis (d) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.

Die DNA der vorliegenden Erfindung ist konkret eine DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst, und noch konkreter eine DNA, die die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 umfasst, welche das menschliche LPA-Phosphatase-Gen darstellt.
Die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine DNA, die Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 resultiert, so lange das Peptid eine LPA-Phosphatase-Aktivität aufweist. Der Ausdruck „ein oder mehrere" in der vorliegenden Beschreibung bedeutet eine Anzahl von eins oder einigen oder mehreren.
Darüber hinaus umfasst die DNA der vorliegenden Erfindung auch eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Basen der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 resultiert, so lange das Peptid, das durch die DNA codiert wird, eine LPA-Phosphatase-Aktivität aufweist. Auch hier besitzt der Ausdruck „ein oder mehrere" die gleiche Bedeutung, wie vorstehend beschrieben.
In der vorliegenden Beschreibung können eine „Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von Aminosäuren und Basen" solche darstellen, die natürlich auftreten, oder solche, die künstlich eingebracht werden. Verfahren zur Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von Aminosäuren und Basen, die vorstehend erwähnt wurden, können durch Fachleute mittels ortsgerichteter Mutagenese, PCR-Verfahren oder ähnlichem einfach vorgenommen werden; diese werden zum Beispiel in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, veröffentlicht in 1989, beschrieben.
Weiterhin umfasst die DNA der vorliegenden Erfindung ebenfalls eine DNA, die in der Lage ist, mit einer DNA gemäß einem der vorstehend erwähnten Punkte (a) bis (d) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, so lange das durch die DNA codierte Peptid eine LPA-Phosphatase-Aktivität aufweist.
In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck „in der Lage, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren" auf einen Zustand, in dem positive Hybridisierungssignale sogar noch unter den folgenden Bedingungen beobachtet werden, wie zum Beispiel: Erhitzen bei 42°C in einer Lösung, die 6 × SSC (20 × SSC entspricht 333 mM Natriumcitrat und 333 mM NaCl), 0,5% SDS und 50% Formamid enthält, und anschließendes Waschen bei 68°C mit einer Lösung, die 0,1 × SSC und 0,5% SDS enthält.
Die DNA der vorliegenden Erfindung wird wie folgt erhalten. Konkret wird Rinderhirn in einem geeigneten Puffer homogenisiert und das so erhaltene Homogenat wird zentrifugiert, um die Cytosolfraktion zu erhalten. Als Nächstes wird diese Fraktion mit Ammoniumsulfat durch das übliche Verfahren fraktioniert, und danach werden eine Ionenaustausch-Chromatographie, eine Gelfiltration, eine Adsorptionschromatographie und ähnliches in Kombination angewendet, wodurch die gereinigte LPA-Phosphatase erhalten werden kann. Von der auf die vorstehende Weise erhaltenen Rinder-LPA-Phosphatase wird eine Teil-Aminosäuresequenz bestimmt, und auf Grundlage der bestimmten Aminosäuresequenz wird ein synthetischer Oligonucleotid-Primer hergestellt. Dann wird unter Verwendung der DNA aus einer Genbank als Matrize das PCR-Verfahren durchgeführt, um ein cDNA-Fragment zu erhalten. LPA-Phosphatase-cDNAs, die aus verschiedenen Organismen und Geweben stammen, können durch die Durchmusterung verschiedener Genbanken unter Verwendung des so erhaltenen cDNA-Fragments als Sonde erhalten werden.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält die vorstehend erwähnte DNA. Die Expressionsvektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen zum Beispiel kommerziell erhältliche Expressionsvektoren oder bekannte Expressionsvektoren wie z. B. pUC-Derivate, pGEX-2T, pQE30, pET, pKK223-3, pMSG und pSVL, und der Expressionsvektor ist nicht besonders beschränkt, so lang es sich bei dem Expressionsvektor um einen Vektor handelt, der in der Lage ist, die DNA der vorliegenden Erfindung in sich einzubauen und die DNA zu exprimieren.
Als Verfahren zur Insertion der DNA der vorliegenden Erfindung in einen Vektor können ein Verfahren, wie es z. B. in Molecular Cloning beschrieben ist, das vorstehend erwähnt wurde, und ähnliche Verfahren, durchgeführt werden.
Die Transformante der vorliegenden Erfindung ist diejenige, die durch die Einbringung des vorstehenden Expressionsvektors in eine gewünschte Wirtszelle erhalten wird. Bei den Wirtszellen kann es sich um beliebige prokaryontische Zellen handeln, wie z. B. um Escherichia coli [HB101, JM109 und ähnliche] und um Bakterien der Gattung Bacillus [Bacillus subtilis und ähnliche] oder um eukaryontische Zellen wie z. B. Hefen der Gattung Saccharomyces [Saccharomyces cerevisiae und ähnliche], Insektenzellen [Spodoptera frugiperda-Zellen wie z. B. Sf9, Bombyx mori-Zellen und ähnliche], Säugerzellen (Affenzellen wie z. B. COS1 und COS7, murine Zellen wie z. B. NIH-3T3 und menschliche Zellen wie z. B. HeLa-Zellen], die in Abhängigkeit davon ausgewählt werden, welcher Expressionsvektor verwendet wird.
Als Verfahren zur Einbringung des Expressionsvektors kann ein bekanntes Verfahren angewendet werden, einschließlich zum Beispiel das Calciumphosphat-Verfahren, das Lipofektions-Verfahren, das DEAE-Dextran-Verfahren, das Elektroporations-Verfahren oder ähnliche [Current Protocols in Molecular Biology, herausgegeben von Ausubel, F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc. (1987)].
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung einer rekombinanten LPA-Phosphatase bereit, das den Schritt der Anzucht unter Bedingungen umfasst, unter denen das Protein der vorliegenden Erfindung durch den vorstehenden Expressionsvektor exprimiert werden kann. Der Fall, in dem E. coli als Wirtszelle gewählt und pGEX-2T als Expressionsvektor verwendet wird, wird im Folgenden beschrieben.
Um die LPA-Phosphatase als ein Fusionsprotein mit der GST (Glutathion-S-Transferase) in E. coli zu exprimieren, wird ein GST-LPA-Phosphatase-Expressionsplasmid hergestellt, indem die cDNA der LPA-Phosphatase in das Expressionsplasmid pGEX-2T inseriert wird. Als Nächstes wird E. coli mit dem Expressionsplasmid transformiert und die so erhaltene Transformante wird unter den üblichen Bedingungen angezogen. Anschließend wird der so erhaltenen Transformante Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) während der logarithmischen Wachstumsphase zugegeben und die Anzucht weiter fortgesetzt, wodurch die Expression des GST-LPA-Phosphatase-Fusionsproteins induziert wird. Das exprimierte Fusionsprotein kann mit Glutathion-Kügelchen gereinigt werden.
Darüber hinaus kann die rekombinante LPA-Phosphatase, wenn sie nicht als Fusionsprotein vorliegt, durch Verfahren gereinigt werden, wie z. B. ein übliches Ultrafiltationsverfahren, eine Säulenchromatographie oder eine Affinitäts-Reinigung, unter Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Antikörper oder ein Fragment davon bereit, der/das in der Lage ist, das Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch zu binden. Bei dem Antikörper kann es sich um einen polyclonalen oder um einen monoclonalen Antikörper handeln.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann rasch hergestellt werden, dies erfolgt durch die entsprechende Immunisierung eines Tiers unter Verwendung des vollständigen oder eines Teils des Proteins der Erfindung gemäß einem Verfahren, das zum Beispiel in Antibodies: A Laboratory Manual, herausgegeben von Lane, H.D. et al., veröffentlich durch Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, beschrieben wird, oder ähnlichen Verfahren, wodurch leicht ein Antikörper, der in der Lage ist, an das Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch zu binden, oder ein Antikörper erhalten werden kann, der seine Aktivität neutralisiert. Des Weiteren kann ein Antikörperfragment hergestellt werden, indem der so erhaltene Antikörper durch eine Protease oder ähnliches gespalten wird.
Die Anwendung des Antikörpers oder des Fragments davon umfasst die Affinitäts-Chromatographie, die Durchmusterung einer cDNA-Genbank, ein immunologisches diagnostisches Verfahren, Arzneimittel und ähnliches. Das immunologische diagnostische Verfahren kann in geeigneter Weise aus einem Immunblot-Verfahren, einem Radioimmun-Test (RIA), einem Enzym-Immun-Test (ELISA), Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Testansätzen oder ähnlichen ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Antisense-DNA oder eine Antisense-RNA bereit, die 8 Basen oder mehr umfasst und die eine Sequenzkomplementarität zu der DNA der vorliegenden Erfindung aufweist. Die Antisense-DNA oder die Antisense-RNA kann durch künstliche Synthese unter Verwendung eines Synthesegeräts, durch Transkription einer DNA in entgegengesetzter Richtung zu der üblichen Richtung (nämlich der Antisense-Richtung) oder ähnliches erhalten werden.
Die vorstehende Antisense-DNA oder Antisense-RNA kann in eine Zelle eingebracht werden, wodurch die Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung unterdrückt werden kann. Im Hinblick auf das Vorstehende beträgt die Länge der Antisense-DNA oder der Antisense-RNA gewöhnlich 8 bis 1700 Basen, bevorzugt werden 15 bis 30 Basen. Da die mRNA, die durch die normale Transkription eines Gens hergestellt wird, den Sinn-Strang darstellt, bindet die Antisense-DNA oder die Antisense-RNA intrazellulär an die Sinn-Strang-mRNA, so dass die Translation der mRNA unterdrückt wird, wodurch die Produktion der LPA-Phosphatase, des Proteins der vorliegenden Erfindung, kontrolliert werden kann. Da sie diese Wirkung aufweist, kann die Antisense-DNA oder die Antisense-RNA zum Beispiel als ein regulierendes Agenz für die Aktivität der LPA-Phosphatase verwendet werden. Darüber hinaus kann die Antisense-DNA oder die Antisense-RNA als Reagenz in der Forschung für die in situ-Hybridisierung oder ähnliches verwendet werden.
Ob die hergestellte Antisense-DNA oder die Antisense-RNA die gewünschte unterdrückende Wirkung aufweist oder auch nicht, kann zum Beispiel leicht durch die beiden folgenden Verfahren herausgefunden werden. Eines ist ein Verfahren, bei dem die Antisense-DNA oder die Antisense-RNA direkt von außen in die Zellen eingebracht wird, die die LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung exprimieren, und danach wird die Veränderung des Expressionsspiegels der LPA-Phosphatase als Anzeige bewertet; und das andere ist ein Verfahren, bei dem ein Vektor, der in der Lage ist, die Antisense-RNA durch Transkription herzustellen, in die vorstehend erwähnten LPA-Phosphatase exprimierenden Zellen eingebracht wird, wobei anschließend die Veränderung des Expressionsspiegels der LPA-Phosphatase als Anzeige bewertet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Sonde oder einen Primer bereit, die/der in der Lage ist, an die DNA der vorliegenden Erfindung spezifisch zu hybridisieren. Die Länge der Sonde oder des Primers kann entsprechend ihres/seines Zweckes gewählt werden. Die Länge der Sonde beträgt gewöhnlich 8 bis 1700 Basen, bevorzugt werden 13 bis 1300 Basen, und die Länge des Primers beträgt üblicherweise 8 bis 50 Basen, bevorzugt werden 15 bis 35 Basen. Die Sonde oder der Primer wird in der Regel durch chemische Synthese unter Verwendung eines Synthesegeräts oder durch enzymatische Synthese unter Verwendung der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) oder über ein PCR-Verfahren hergestellt.
Die Hybridisierungsbedingungen für die Sonde oder den Primer der vorliegenden Erfindung können leicht in Abhängigkeit von dem Zweck gemäß eines Verfahrens, das zum Beispiel in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, veröffentlicht in 1989, beschrieben wird festgelegt werden.
Von der Sonde oder dem Primer der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass sie/er für den Nachweis und die Quantifizierung der LPA-Phosphatase verwendet werden kann, damit sie/er eine Funktion bei der Diagnose oder der Behandlung der Erkrankungen haben, die mit der LPA-Phosphatase assoziiert sind. Darüber hinaus kann die Sonde oder der Primer auch als Forschungsreagenz für die LPA-Phosphatase bei einer Hybridisierung, einer PCR oder ähnlichem verwendet werden.
Die LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, ist ein Enzym, das in der Lage ist, spezifisch auf LPA zu wirken und einen Phosphatrest zu entfernen, wodurch ein Monoacylglycerin gebildet wird. Neben der Wirkung der Förderung der Zellproliferation weist die LPA verschiedene biologische Aktivitäten auf, wie z. B. die Förderung der Invasion von Krebszellen, der Zelladhäsion, der Unterdrückung der Apoptose, der Agglutination von Blutplättchen und der Chemotaxis, und es gibt Berichte, die nahe legen, dass sie mit Erkrankungen in Beziehung steht. Daher kann sie für die Diagnose einer Krankheit, mit der die LPA assoziiert ist, verwendet werden, und zwar, indem LPA unter Verwendung der LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung bestimmt wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Bestimmung einer solchen LPA bereit.
Hierbei sind die Erkrankungen, die mit der LPA oder der LPA-Phosphatase assoziiert sind, in keiner bestimmten Weise eingeschränkt, und sie umfassen zum Beispiel Krebs wie z. B. Eierstock-Krebs, Bauchfell-Krebs, Krebs des Endometriums oder Krebs des Endocervix.
Das Verfahren für die Bestimmung der LPA der vorliegenden Erfindung umfasst den Schritt der Vermischung der LPA-Phosphatase, die das Protein der vorliegenden Erfindung darstellt, mit einer Probe, die untersucht werden soll. Bei dem Verfahren zur Bestimmung wird die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Hydrolysats der LPA als Anzeige für die Anwesenheit oder die Abwesenheit der Lysophosphatidsäure verwendet.
Die Proben, die untersucht werden können, umfassen Körperflüssigkeiten und Gewebe wie z. B. Blut, Plasma, Serum und Urin. Wenn die zu untersuchende Probe als Gewebe entnommen wird, kann die LPA bestimmt werden, indem geeignete Vorbehandlungen durchgeführt werden, wie z. B. eine Gewebehomogenisierung und eine Zelllyse.
Die Bedingungen, unter denen die LPA-Phosphatase mit der zu untersuchenden Probe vermischt wird, können Bedingungen sein, unter denen die LPA-Phosphatase aktiv ist, diese umfassen zum Beispiel pH-Werte und Temperaturen, bei denen das Enzym reaktionsfähig ist. Darüber hinaus kann, wie nachstehend beschrieben wird, wenn eine Kopplungsreaktion der Reaktion der LPA-Phosphatase mit der Reaktion zur Bestimmung des Hydrolysats durchgeführt wird, diese Kopplungsreaktion unter Bedingungen durchgeführt werden, so dass beide Reaktionen ablaufen können.
Wenn die LPA in der Probe, die untersucht werden soll, vorhanden ist, wird bei dem Schritt der Vermischung des Proteins der vorliegenden Erfindung mit der zu untersuchenden Probe, die LPA-Phosphatase, die das Protein der vorliegenden Erfindung darstellt, mit der LPA in der zu untersuchenden Probe reagieren, wodurch ein Hydrolysat der LPA gebildet wird.
Die Hydrolysate der LPA sind Monoacylglycerin und Phosphat.
Da bei dem Verfahren zur Bestimmung der LPA der vorliegenden Erfindung die LPA-Phosphatase, welche das Protein der vorliegenden Erfindung ist, verwendet wird, kann das Verfahren auf bemerkenswert einfache und kostengünstige Weise im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren für die Bestimmung der LPA durchgeführt werden.
Als Nächstes wird das gebildete Hydrolysat (Monoacylglycerin oder Phosphat) bestimmt. Als Verfahren zur Bestimmung von Monoacylglycerin beziehungsweise von Phosphat können bekannte Verfahren verwendet werden. Die Reaktionen zum Nachweis von Monoacylglycerin oder von Phosphat können gleichzeitig mit der LPA-Phosphatase-Reaktion durchgeführt werden.
Das Verfahren für die Bestimmung von Monoacylglycerin umfasst zum Beispiel ein Verfahren zur Quantifizierung von Wasserstoffperoxid, welches durch die Umsetzung von Monoacylglycerin mit Monoacylglycerin-Lipase und Glycerin-Oxidase oder durch die Umsetzung von Monoacylglycerin mit Monoacylglycerin-Lipase, Glycerin-Kinase und Glycerin-3-phosphat-Oxidase erzeugt wird (offengelegtes Japanisches Patent Nr. Sho 63-245672 und ähnliche). Darüber hinaus kann bei der Verwendung von Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase anstelle der Glycerin-3-phosphat-Oxidase bei dem vorstehend erwähnten Verfahren eine Veränderung der Menge an reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) oder an reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADPH), das aus oxidiertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD⁺) oder aus oxidiertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP⁺) erzeugt wird, eine Anzeige darstellen. Alternativ können die Veränderungen der Mengen der oxidierten Formen als Anzeige verwendet werden.
Das Verfahren für die Bestimmung von Phosphat umfasst zum Beispiel chemische Verfahren wie z. B. das Phosphormolybdat-Reduktions-Verfahren und ein direktes Phosphormolybdat-Verfahren; sowie ein enzymatisches Verfahren, das unter spezifischeren und einfacheren Bedingungen durchgeführt werden kann. In der vorliegenden Erfindung ist im Hinblick auf eine Durchführung unter spezifischeren und einfacheren Bedingungen das enzymatische Verfahren für die Phosphat-Bestimmung wünschenswert. Alternativ kann die zu untersuchende Probe mit der LPA-Phosphatase vorbehandelt werden, und anschließend wird das freie Phosphat durch das vorstehend erwähnte chemische Verfahren bestimmt.
Das enzymatische Verfahren zur Phosphatbestimmung umfasst ein Verfahren für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das durch die Umsetzung von Phosphorsäure mit Inosin in Gegenwart einer Purinnucleosid-Phosphorylase erzeugt wird, um Hypoxanthin zu erzeugen, wobei anschließend das so erzeugte Hypoxanthin mit Xanthin-Oxidase umgesetzt wird [Adam, A. et al. (1984) Clin. Chem. 30, 1724]; ein Verfahren zur Bestimmung von NADH, das durch die Umsetzung von Hypoxanthin mit NAD⁺ unter Verwendung der Xanthin-Dehydrogenase anstelle der Xanthin-Oxidase bei dem vorstehenden Verfahren erzeugt wird; ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das durch die Umsetzung von Phosphorsäure mit Brenztraubensäure in Gegenwart der Pyruvat-Oxidase erzeugt wird; ein Verfahren zur Quantifizierung von NADH, das durch die Umsetzung von Phosphorsäure mit Glycogen in Gegenwart der Saccharose-Phosphorylase erzeugt wird, wobei anschließend ermöglicht wird, dass das so erzeugte Glucose-1-phosphat mit Phosphoglucomutase und das so erzeugte NAD⁺ mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase umgesetzt wird [Ryo Fushimi (1987) Kensa to Gijutsu 15, 137-140]. Sogar wenn solche enzymatischen Bestimmungsverfahren verwendet werden, kann die Probe mit der LPA-Phosphatase vorbehandelt werden, und danach wird das freie Phosphat durch ein enzymatisches Verfahren bestimmt. Alternativ kann das Verfahren durch eine gleichzeitige Durchführung einer Kopplungsreaktion aus einer LPA-Phosphatase-Reaktion mit einer Reaktion zur Bestimmung des Phosphats durchgeführt werden.
Bei dem vorstehenden enzymatischen Verfahren zur Bestimmung von Monoacylglycerin oder Phosphat kann, wenn Wasserstoffperoxid durch eine enzymatische Reaktion erzeugt wird, das Wasserstoffperoxid durch solche Verfahren wie z. B. ein Verfahren, das Wasserstoffperoxid-Elektroden verwendet, oder ein colorimetrisches Quantifizierungsverfahren, das Peroxidase (POD), Katalase oder ähnliches verwendet, bestimmt werden. Wenn die POD verwendet wird, wird meistens ein Verfahren zur Bestimmung eines Farbstoffs verwendet, der durch die Oxidations-Kondensierungs-Reaktion von 4-Aminoantipyrin mit einem Farbstoff-Koppler erzeugt wird, und die Bestimmung kann mit einer hohen Empfindlichkeit unter Verwendung einer Fluoreszenzreaktion und einer Lumineszenzreaktion vorgenommen werden.
Darüber hinaus kann bei dem vorstehenden enzymatischen Verfahren zur Bestimmung von Monoacylglycerin oder Phosphat, das vorstehend erwähnt wurde, wenn NADH oder NADPH erzeugt wird, das NADH oder das NADPH unter Verwendung der Extinktionsveränderung bestimmt werden.
Das Bestimmungsreagenz für die LPA der vorliegenden Erfindung umfasst die LPA-Phosphatase, die das Protein der vorliegenden Erfindung darstellt. Das Reagenz kann weiterhin einen Stoff umfassen, der mit der Bestimmung von Monoacylglycerin oder Phosphat assoziiert ist, das das Hydrolysat der LPA darstellt.
In dem Bestimmungsreagenz für die LPA der vorliegenden Erfindung kann die LPA-Phosphatase verwendet werden, indem sie geeigneten chemischen Modifizierungen zum Zwecke der Stabilisierung unterworfen wird, oder sie kann als ein immobilisiertes Enzym verwendet werden, das durch die Immoblisierung des Enzyms an einen geeigneten Träger hergestellt wird.
Das vorstehende Bestimmungsreagenz wird gewöhnlich als ein Reagenzien-Kit zur Bestimmung bereitgestellt, das vorgegebene Reagenzien umfasst, so dass jeder Stoff einschließlich des Enzyms die geeignete Konzentration aufweist. Bei der Form des Reagenzes kann es sich in diesem Fall ohne besondere Einschränkung um ein Trockenpulver oder um eine Flüssigkeit handeln, und ein Aktivator, ein Stabilisator für ein Enzym, ein Antiseptikum oder ähnliches können ebenfalls hinzugefügt werden. Darüber hinaus kann es sich bei dem Reagenzien-Kit um ein Kit handeln, der zwei oder mehrere Arten von Reagenzien umfasst, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten dem Reaktionsgemisch hinzu gegeben werden, wie z. B. im Falle der Kombination eines Reagenzes für eine erste Reaktion und eines Reagenzes für eine zweite Reaktion, und der Kit kann auch ein System mit einem einzelnen Reagenz sein.
Der Kit der vorliegenden Erfindung für die Diagnose ist bei der Diagnose einer Erkrankung nützlich, mit der die LPA assoziiert ist, und er umfasst das vorstehend erwähnte Bestimmungsreagenz. Der vorstehende Kit kann weiterhin ein Reagenz für die Sammlung einer Probe, die untersucht werden soll, ein Reagenz für die Behandlung der zu untersuchenden Probe sowie eine Kontrollprobe für die Diagnose enthalten.
Das Arzneimittel, das die LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung als aktiven Bestandteil umfasst, komplementiert die intrinsische LPA-Phosphatase-Aktivität bei einem Individuum, das unter einer mit der LPA oder der LPA-Phosphatase assoziierten Erkrankung leidet, wobei die Lysophosphatidsäure-Phosphatase in einer Menge verabreicht werden kann, die für den Abbau der LPA auf den Spiegel ausreicht, durch den solche Erkrankungen verursacht werden.
Die LPA-Phosphatase, die in dem vorstehenden Arzneimittel enthalten ist, kann als Protein vorliegen, oder sie kann in Form eines Expressionsvektors vorliegen, so dass nach der Expression der LPA-Phosphatase im Körper eines Individuums sie eine Aktivität zeigt.
Wenn das vorstehende Arzneimittel bei einem Individuum, das im Verdacht steht, eine Krebsform zu haben, von der man annimmt, dass sie mit der LPA oder mit der LPA-Phosphatase assoziiert ist, oder einem Individuum verwendet wird, das unter einer solchen Krankheit leidet, kann der Krebs behandelt werden und weitere Krebsmetastasen können verhindert werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun in Einzelheiten weiter erklärt, dies erfolgt in Form von Arbeitsbeispielen, ohne dass dabei beabsichtigt wird, die Erfindung auf diese Beispiele einzuschränken.
Präparation – Beispiel 1
Reinigung der Rinder-LPA-Phosphatase
Alle der folgenden Schritte wurden bei 0 bis 4°C durchgeführt.
(1) Homogenisierungsschritt
Es wurde ein Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mg/ml Aprotinin, 1 mg/ml Leupeptin] zu Rinderhirn (1600 g) zugegeben, so dass eine Konzentration von 1,5 ml/g erhalten wurde, und das Gemisch wurde mit dem National-Mixer MX-V100 homogenisiert. Das Homogenat wurde 30 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert und der so erhaltene Überstand wurde erneut 1 Stunde bei 100.000 × g zentrifugiert, um eine Cytosol-Fraktion im Überstand zu erhalten (die Menge an Protein betrug 9.600 mg).
(2) Ammoniumsulfatfraktionierung
Der vorstehenden Cytosol-Fraktion wurde Ammoniumsulfat zugegeben, bis eine zu 35% gesättigte Lösung erhalten wurde, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 4°C gerührt und anschließend zentrifugiert (30 Minuten bei 12.000 × g). Dem so erhaltenen Überstand wurde weiter Ammoniumsulfat zugegeben, bis eine zu 45% gesättigte Lösung erhalten wurde, und anschließend wurden ähnliche Verfahren durchgeführt. Das so erhaltene Präzipitat wurde in 70 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert.
(3) Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose FF
Das vorstehende Dialysat wurde 1 Stunde bei 100.000 × g zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen, und danach auf eine Q-Sepharose FF-Säule (Amersham Biotech, Säulenvolumen: 600 ml) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) äquilibriert worden war. Nach einer Waschung mit dem gleichen Puffer wurde die LPA-Phosphatase mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten (0–1 M) in 2 Litern des gleichen Puffers eluiert (1). Anschließend wurden die aktiven Fraktionen, die 0,52–0,57 M NaCl entsprachen, gesammelt und gegen 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) dialysiert.
(4) Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von TSK-GEL DEAE-5PW GL
Die aktiven Fraktionen, die durch die vorstehende Ionenaustausch-Chromatographie erhalten worden waren, wurden auf eine TSK-GEL-DEAE-5PW GL (Tosoh Corporation, Säulengröße: 20 × 150 mm) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) äquilibriert worden war. Die LPA-Phosphatase wurde mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten (0–0,5 M) in 240 ml des gleichen Puffers eluiert (2). Die aktiven Fraktionen (entsprechend 0,16–0,22 M NaCl) wurden mit Ammoniumsulfat auf eine zu 60% gesättigte Lösung eingestellt, wodurch eine Präzipitation erfolgte.
(5) Gelfiltration unter Verwendung von Hi-Load 26/60-Superdex 200
Das vorstehende Präzipitat wurde in 3 ml Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 0,1% Natriumcholat] gelöst, und dann wurde eine Gelfiltration unter Verwendung einer Hi-Load 26/60-Superdex 200-Säule (Pharmacia Biotech) durchgeführt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war (3). Die aktiven Hauptfraktionen wurden gesammelt und gegen 20 mM MES-NaOH (pH 5,8) dialysiert, um das Natriumcholat zu entfernen.
(6) Adsorptions-Chromatographie unter Verwendung einer Hi-Trap-Heparin-Säule
Die durch die vorstehende Gelfiltration erhaltenen aktiven Fraktionen wurden auf eine Hi-Trap-Heparin-Säule (Pharmacia Biotech, Säulenvolumen: 1 ml) aufgetragen, die mit 20 mM MES-NaOH (pH 5,8) äquilibriert worden war. Nach einer Waschung mit dem gleichen Puffer wurde die LPA-Phosphatase mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten (0–1 M) in 30 ml des gleichen Puffers eluiert ( 4). Als Ergebnis wurden 20 μg des gereinigten Enzyms erhalten.
Die Ausbeute und die Aktivität der LPA-Phosphatase bei jedem Reinigungsschritt werden in der Tabelle 1 gezeigt. Die Enzymaktivität wurde durch das in dem Test-Beispiel 1 beschriebene Verfahren bestimmt. Tabelle 1 zeigt, dass die LPA-Phosphatase etwa 3.300-fach aufgereinigt wurde. Tabelle 1

* Eine Einheit ist als die Menge an Enzym definiert, die die Bildung von 1 Mikromol des Abbauprodukts in 1 Minute katalysiert.

Test – Beispiel 1
Bestimmung der Aktivität der LPA-Phosphatase
Die Aktivität der LPA-Phosphatase wurde in 50 μl eines Reaktionsgemisches [50 mM Tris-Maleinsäure (pH 7,5), 50 μM Monooleoyl-[9,10-³H]-lysophosphatidsäure (5 × 10⁴ ZpM), Triton^TM-X100 in 4-fach molarer Konzentration wie das Substrat und das Enzym in verschiedenen Konzentrationen] bestimmt. Das vorstehende Gemisch wurde 15 Minuten bei 37°C inkubiert, und die Enzymaktivität wurde durch die Messung des erzeugten [³H]-Monooleoylglycerins bestimmt.
Die Bestimmung der Enzymaktivität bei jedem Reinigungsschritt des Präparations-Beispiels 1 wurde durch die Anwendung eines einfachen Verfahrens durchgeführt. Konkret wurden 250 μl des Dole-Reagenzes (Isopropanol/Heptan/1 N H₂SO₄ = 78/28/2) dem vorstehenden Enzymreaktionsprodukt (50 μl des Gemisches) hinzu gegeben, um die Reaktion zu beenden, und danach wurden 125 μl H₂O und 150 μl Heptan dazu gegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde gemischt und anschließend wurde es durch 5 Minuten Zentrifugation bei 1.200 × g in zwei Phasen getrennt. Die obere Phase (150 μl) wurde in ein anderes Reaktionsgefäß überführt, dem dann 150 μl Heptan und eine Mikrospatelmenge Silicagel 60H (hergestellt durch Merck) hinzu gegeben wurden. Nach dem Mischen wurde das Gemisch 5 Minuten bei 1.200 × g zentrifugiert, und 200 μl des Überstandes wurden mit 2 ml Scintisol EX-H (hergestellt durch DOJINDO) vermischt und die Radioaktivität wurde bestimmt.
Die Experimente für die spezifische Aktivität und Reaktionsrate und ähnliches wurden unter Verwendung des folgenden Trennverfahrens durchgeführt. Konkret wurde das vorstehende Produkt der Enzymreaktion (50 μl des Gemisches) gefriergetrocknet, wobei Monooleoylglycerin als Träger hinzugefügt wurde. Danach wurde das Gemisch mittels Dünnschicht-Chromatographie (DC) unter Verwendung eines Lösemittelsystems aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser (30,4/4,8/4,8) analysiert. Die DC-Platte wurde gegenüber Joddampf exponiert und die Flecken mit Monooleoylglycerin wurden abgekratzt, und dann wurde die Radioaktivität bestimmt.
Test – Beispiel 2
SDS-PAGE
Die das Enzym enthaltenden Proben, die bei jedem Schritt des Präparations-Beispiels 1 erhalten wurden, und ein Standard-Marker für Proteine (SDS-PAGE Standard Low, hergestellt durch Bio-Rad) wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unter Verwendung eines 12,5 %igen Polyacrylamidgels unter reduzierenden Bedingungen unterworfen (5).
Wie in 5 gezeigt, zeigte das gereinigte Enzym, das bei dem abschließenden Schritt erhalten worden war, eine einzelne Bande von etwa 44 kDa bei der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen.
Test – Beispiel 3
Substratspezifität
Jede der Enzymreaktionslösungen, die verschiedene Substrate enthielten, wurde auf die gleiche Weise wie in Test-Beispiel 1 zur Reaktion gebracht, und dann wurden 25 μl Perchlorsäure hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Weiterhin wurden dann 75 μl H₂O, 25 μl 10 %iges Ammoniummolybdat und 50 μl 10 %ige Ascorbinsäure dazu gegeben. Die vermischte Lösung wurde 5 Minuten bei 95°C aufgekocht und anschließend wurde die Extinktion bei 795 nm bestimmt, um das freie Phosphat zu quantifizieren.
Das Ergebnis war, dass die Rinder-LPA-Phosphatase 1-Oleoyl-LPA in einer Dosis-abhängigen Weise stark hydrolysierte, aber Phosphatidsäure, Cardiolipin, Bisphosphatidsäure, Glycerinphosphat, Ceramid-1-phosphat und Sphingosin-1-phosphat nicht hydrolysierte.
Um die Reaktivität mit 1-Oleoyl-LPA im Detail zu bestätigen, wurde die Enzymreaktion in der gleichen Weise wie in dem Test-Beispiel 2 unter Verwendung von [³H]-1-Oleoyl-LPA (5 nMol, 1 × 10⁵ ZpM) als Substrat durchgeführt und durch eine DC bewertet (6).
Wie in 6 gezeigt, hydrolysierte die Rinder-LPA-Phosphatase [³H]-1-Oleoyl-LPA zu [³H]-1-Oleoylglycerin in einer Dosis-abhängigen Weise. Durch diesen Befund wurde herausgefunden, dass es sich bei dem Enzym um die Phosphatase handelt und nicht um die Phospholipase A.
Um die Reaktivität weiter im Detail zu bestätigen, wurden, wenn 1-Oleoyl-LPA und Dioleoly-PA als Substrate verwendet wurden, [³²P]-LPA und [³²P]-PA als Substrate verwendet; diese waren unter Verwendung von [γ-³²P]-ATP und der DG-Kinase aus E. coli markiert [Waggoner, D.W. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 16506–16509] und über DC vorher gereinigt worden. Jede der Reaktionen wurde durch Variation der Enzymmenge (0–175 ng) oder Variation der Substratkonzentration (0–100 μM) durchgeführt. Die Enzymreaktion wurde mit 100 μl 0,1 N Salzsäure in methanolischer Lösung beendet, und es wurden 200 μl Chloroform und 1 M Magnesiumchlorid hinzugefügt. Das Gemisch wurde kräftig durchmischt und danach 5 Minuten bei 1.000 × g zentrifugiert. Die Menge an Radioaktivität in 175 μl der wässrigen Phase wurde bestimmt, um die Enzymreaktion auszuwerten (7).
Wie in A und B in der 7 gezeigt, wies die Rinder-LPA-Phosphatase eine extrem hohe Reaktivität mit der LPA auf.
Beispiel 1
Bestimmung einer partiellen Aminosäureseguenz der Rinder-LPA-Phosphatase
Die Rinder-LPA-Phosphatase (20 μg), die in dem Präparations-Beispiel 1 erhalten worden war, wurde einer 7,5 %igen SDS-PAGE unterworfen und auf eine PVDF-Membran (hergestellt durch ATTO) unter Verwendung einer TRANS-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELL (hergestellt von Bio-Rad) übertragen. Die Membran wurde mit einem Farbstoff (Ponceau^®, hergestellt durch Tokyo Kasei) angefärbt, und die gewünschte Bande wurde ausgeschnitten. Danach wurde das Protein mit Lysylendopeptidase gespalten und mit Acetonitril extrahiert. Dieser Extrakt wurde über eine HPLC-C18-Säule fraktioniert, und 6 Peaks wurden durch das Edman-Abbau-Verfahren unter Verwendung eines Peptid-Sequenziergeräts (PPSQ-10 Protein Sequencer, hergestellt durch SHIMADZU) analysiert.
Als Ergebnis wurde gefunden, dass die sechs Peptide die folgenden Sequenzen aufwiesen:

Peak 1: MVQVVFRHGARSPL (SEQ ID NO: 3);
Peak 2: FLNTISVYTLSPEK (SEQ ID NO: 4);
Peak 3: EGPIVISTDEAK (SEQ ID NO: 5);
Peak 4: EWFVQLYYRGK (SEQ ID NO: 6);
Peak 5: VGMEQMFALGERLRI (SEQ ID NO: 7); und
Peak 6: SQLLEVPPQTQLEYTVTNLA (SEQ ID NO: 8).

Unter den vorstehenden Sequenzen wiesen die SEQ ID NO: 3 und 6 eine hohe Homologie mit der sauren Phosphatase aus der Prostata auf. Daher wurden auf Grundlage dieser Aminosäuresequenzen die folgenden degenerierten Oligonucleotid-Primer hergestellt:

5'-atggtica(a/g)gtigtitt(t/c)(c/a)gica(t/c)gg-3' (SEQ ID NO: 9) und
5'-ccic(g/t)(a/g)ta(a/g)taia(a/g)(t/c)tgiac(a/g)aacca-3' (SEQ ID NO: 10).

Unter Verwendung der vorstehenden degenerierten Primer wurde mit der DNA aus einer λZAP^® II-Genbank (abgeleitet aus menschlicher Hirn-cDNA, hergestellt durch STRATAGENE) als Matrize eine PCR durchgeführt. Die Temperaturbedingungen waren:

– ein Zyklus bei 95°C über 3 Minuten;
– 40 Zyklen bei 95°C über 30 Sekunden, bei 55°C über 1 Minute und bei 72°C über 2 Minuten; und
– ein Zyklus bei 72°C über 10 Minuten.

Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer 1 %igen Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und mit Ethidiumbromid angefärbt, dann wurde unter UV-Licht eine Bande ausgeschnitten. Die DNA wurde mit dem GENE CLEAN Kit II (hergestellt durch BIO 101) gereinigt. Die gereinigte DNA wurde mit Hilfe der T4-Polynucleotid-Kinase (hergestellt durch NEW ENGLAND Biolabs) und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (hergestellt durch TAKARA) mit glatten Enden versehen. Das Fragment mit den glatten Enden wurde in pBluescript^® II KS(–) (hergestellt durch STRATAGENE) subcloniert, der mit der Restriktionsendonuclease SmaI (hergestellt durch TAKARA) vorher gespalten worden war.
Der pBluescript^® II KS(–), der die subclonierte DNA enthielt, wurde in kompetente JM109-Zellen transformiert, und aus der so erhaltenen Transformante wurde die DNA isoliert und mit einem DNA-Sequenziergerät (DNA Sequencer LONG READIR 4200, hergestellt durch Aloka) unter Verwendung des Thermo Sequenase fluorescence labeled primer cycle sequence-Kits (hergestellt durch Amersham), das 7-Deaza-dGTP, den M13-Vorwärts-Primer und den M13-Rückwärts-Primer (hergestellt durch LI-COR) umfasste, sequenziert.
Als Ergebnis wurde gefunden, dass ein cDNA-Fragment von 987 Bp cloniert worden war.
Als Nächstes wurde die vorstehende λZAP^® II-Genbank über das Koloniehybridisierungsverfahren mit dem vorstehenden Fragment von 987 Bp als Sonde durchmustert. Konkret wurden für die primäre Durchmusterung insgesamt 1 × 10⁶ Kolonien (Wirtszellen: XL-1-Blue) auf 20 Lagen Agar in 15 cm-Kulturplatten ausplattiert. Die angezogenen Kolonien wurden auf Kolonie/Plaque Screen Hybridization Transfer Membrane (hergestellt durch NEN) übertragen. Die Membranen wurden einer Hybridisierung unter den üblichen Hybridisierungsbedingungen bei 65°C unterworfen, wobei das vorstehende 987 Bp-Fragment, das mit ³²P unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I markiert worden war, als Sonde verwendet wurde.
Nach der Autoradiographie wurden 24 positive Clone isoliert, und durch eine Wiederholung der gleichen Verfahren wie bei der vorstehenden primären Durchmusterung wurde eine sekundäre Durchmusterung durchgeführt.
Nach der Autoradiographie wurden 20 positive Clone isoliert, und dann wurde eine in vivo-Excision unter Verwendung eines Helferphagen gemäß des Handbuchs zur λZAP^® II-Genbank durchgeführt, um die cDNAs zu erhalten, die in pBluescript^® II SK(–) cloniert vorlagen.
Die so erhaltenen cDNAs, die aus den 20 Clonen stammten, wurden in der gleichen Weise wie vorstehend sequenziert, und es wurde ein Clon erhalten, der die cDNA mit der größten Länge von 1731 Bp enthielt. Diese Nucleotidsequenz wird in der SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die Nucleotidsequenz enthält eine codierende Region von 1263 Bp, und die durch sie codierte Aminosäuresequenz wird in der SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die clonierte, aus dem Menschen stammende LPA-Phosphatase umfasst ein Signalpeptid, das aus 40 Aminosäureresten am N-Terminus besteht, und stellt eine neuartige Phosphatase dar, die 421 Aminosäurereste besitzt. Beim Vergleich der Aminosäuresequenz der menschlichen LPA-Phosphatase der vorliegenden Erfindung mit bekannten Phosphatasen fand sich eine Homologie zu der sauren Phosphatase, wobei sich eine besonders hohe Homologie in der aktiven Region zeigte.
Beispiel 2
Expression der menschlichen LPA-Phosphatase in E. coli
Die menschliche LPA-Phosphatase, die in Beispiel 1 erhalten wurde, umfasst ein Signalpeptid am N-Terminus. Wenn das Protein in E. coli exprimiert wird, besteht die Möglichkeit, dass das Signalpeptid abgespalten wird. Wenn ein Protein, das durch die Fusion des N-Terminus der menschlichen LPA-Phosphatase mit einem anderen Protein entsteht, in E. coli exprimiert und gereinigt wird, ergeben sich Schwierigkeiten bei der Reinigung, die durch die Abspaltung des Signalpeptids und die Verminderung der Phosphatase-Aktivität verursacht werden. Daher wurden in diesem Beispiel ein Konstrukt, das eine Sequenz, die ein Signalpeptid codiert, und ein Konstrukt ohne eine solche Sequenz hergestellt.
Mit der in pBluescript^® II SK(–) clonierten LPA-Phosphatase-cDNA, die durch die zweite Durchmusterung in Beispiel 1 erhalten worden war, als Matrize wurde unter Verwendung der folgenden Primer eine PCR durchgeführt:

(1) ohne Signalpeptid Vorwärts: 5'-(cgcggatcc)ctgaagttgaaaatggtgcag-3' (SEQ ID NO: 11) Revers: 5'-(cgcggatcc)agttactcttcatttccaacttc-3' (SEQ ID NO: 12)
(2) mit Signalpeptid Vorwärts: 5'-(cgcggatcc)atgcgcttgtggaccccag-3' (SEQ ID NO: 13) Revers: 5'-(cgcggatcc)agttactcttcatttccaacttc-3' (SEQ ID NO: 12)

Die Temperaturzyklen bestanden aus:

– 95°C über 3 Minuten;
– 10 Zyklen bei 95°C über 30 Sekunden, bei 55°C über 1 Minute und bei 72°C über 2 Minuten;
– 30 Zyklen bei 95°C über 30 Sekunden und bei 72°C über 2 Minuten; und
– 72°C über 10 Minuten.

Die beiden Arten der durch die PCR amplifizierten Produkte wurden mit der Restriktionsendonuclease BamHI (hergestellt durch NEW ENGLAND Biolabs) geschnitten und einer 1 %igen Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und danach wurde eine Bande unter UV-Licht ausgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde mittels dem GENE CLEAN-Kit II (hergestellt durch BIO 101) gereinigt und das gereinigte Fragment wurde in pBluescript^® II KS(–) (hergestellt durch STRATAGENE) subcloniert, der mit der Restriktionsendonuclease BamHI (hergestellt durch TAKARA) geschnitten worden war.
Das clonierte DNA-Fragment wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 sequenziert und bestätigt, und anschließend wurde das DNA-Fragment, das mit der Restriktionsendonuclease BamHI herausgeschnitten worden war, mit pGEX-2T (hergestellt durch Pharmacia Biotech) ligiert, das zuvor mit der Restriktionsendonuclease BamHI geschnitten worden war.
Die beiden Arten der so erhaltenen Expressionskonstrukte wurden in kompetente JM109-Zellen transformiert, um Transformanten zu erhalten. Die Transformante (in 200 ml L-Medium) in der logarithmischen Wachstumsphase wurde 4 Stunden bei 25°C angezogen. Dann wurden 400 μl 1 M IPTG zugegeben und das Gemisch wurde über weitere 2 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde 15 Minuten bei 4°C und 8.000 UpM zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu ernten. Dann wurden 5 ml Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA] zugegeben, und die Bakterienzellen wurden durch eine Behandlung mit Ultraschall aufgebrochen, danach erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C und 15.000 UpM über 30 Minuten, um den Überstand zu erhalten.
Der so erhaltene Überstand wurde mit Glutathion-Kügelchen (Glutathion-Sepharose^® 4B, hergestellt durch Pharmacia Biotech) vermischt, die zuvor in dem vorstehenden Puffer äquilibriert worden waren, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Die Kügelchen wurden mit Dulbecco-Phosphatpuffer, PBS(–), der 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen, und danach dreimal mit 200 μl Glutathionlösung eluiert.
Zehn Mikroliter des Eluats wurden einer 12,5 %igen SDS-PAGE unterworfen, mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt, und als Ergebnis wurde die GST-LPA- Phosphatase mit der gewünschten/erwarteten Größe (etwa 71 kDa) bestätigt. Darüber hinaus gab es keine Unterschiede in den Expressionsspiegeln in Gegenwart oder bei Abwesenheit des Signalpeptids.
Fünf Mikroliter des vorstehenden Eluats wurden auf LPA-Phosphatase-Aktivität gemäß dem Verfahren untersucht, das in dem Test-Beispiel 1 beschrieben wurde. Als Ergebnis zeigte sich, dass die GST-LPA-Phosphatase den gleichen Grad an LPA-Phosphatase-Aktivität aufwies, d. h. unabhängig von der Anwesenheit oder der Abwesenheit des Signalpeptids.
Beispiel 3
Herstellung der mit 6 × His markierten LPAP
Als Wirtszelle wurde E. coli gewählt und pQE-30 (QIAGEN) wurde als Expressionsvektor verwendet.
Die PCR wurde mit der in pBluescript^® II SK(–) clonierten LPA-Phosphatase-cDNA als Matrize durchgeführt, die durch die sekundäre Durchmusterung in Beispiel 1 erhalten worden war, dies erfolgte unter Verwendung der folgenden Primer:

Vorwärts: 5'-(cgcggatcc)ctgaagttgaaaatggtgcag-3' (SEQ ID NO: 11)
Rückwärts 5'-(cgcggatcc)agttactcttcatttccaacttc-3' (SEQ ID NO: 12)

Die Temperaturzyklen bestanden aus:

Das so erhaltene, durch PCR amplifizierte Produkt wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI (hergestellt durch NEW ENGLAND Biolabs) geschnitten und einer 1 %igen Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und danach wurde eine Bande unter UV-Licht ausgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde mit dem GENE CLEAN Kit II (hergestellt durch BIO 101) gereinigt und das gereinigte Fragment wurde in pBluescript^® II KS(–) (hergestellt durch STRATAGENE) subcloniert, der mit der Restriktionsendonuclease BamHI (hergestellt durch TAKARA) geschnitten worden war.
Das subclonierte DNA-Fragment wurde sequenziert und es wurde bestätigt, dass es identisch war, und danach wurde die mit der Restriktionsendonuclease BamHI herausgeschnittene DNA-Insertion mit pQE-30 (QIAGEN) ligiert, das mit BamHI geschnitten worden war.
Kompetente JM109-Zellen wurden mit dem so erhaltenen Expressionskonstrukt transformiert, um eine Transformante zu erhalten. Die Transformante (in 200 ml L-Medium) in der logarithmischen Wachstumsphase wurde 4 Stunden bei 25°C angezogen. Dannach wurden 400 μl 1 M IPTG zugegeben und das Gemisch wurde 2 weitere Stunden kultiviert. Die Kultur wurde 15 Minuten bei 4°C und 8.000 UpM zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu ernten. Dann wurden 5 ml Puffer [50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl (pH 8,0)] zugegeben, und die Bakterienzellen wurden durch eine Behandlung mit Ultraschall aufgebrochen, danach erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C und 15.000 UpM über 30 Minuten, um den Überstand zu erhalten.
Der so erhaltene Überstand wurde mit Ni-NTA-Agarose (QIAGEN) vermischt, die zuvor mit dem vorstehenden Puffer äquilibriert worden war, und das Gemisch wurde bei 4°C über Nacht gerührt. Die Agarose wurde mit Waschpuffer [50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10% Glycerin (pH 6,0)] gewaschen und anschließend dreimal mit 200 μl eines Elutionsmittels (hergestellt durch Zugabe von 250 mM Imidazol zu dem Waschpuffer) eluiert.
Das Elutionsmittel wurde einer 12,5 %igen SDS-PAGE unterworfen und mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt, und als Ergebnis wurde die mit 6 × His markierte LPAP mit der gewünschten Größe (etwa 44 kDa) bestätigt.
Die exprimierte und mit 6 × His markierte LPAP konnte durch die Ni-NTA-(Nickel-nitriltriacetat) Matrix gereinigt werden, die eine sehr hohe Affinität für mit 6 × His markierte Proteine aufweist.
Beispiel 4
Herstellung des Bestimmungsreagenzes

Die folgenden Bestimmungsreagenzien (Reagenz A, Reagenz B) wurden hergestellt. Reagenz A

Puffer (0,1 M Tris)	100 mMol/l
Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel (Triton X-100)	0,01 Gew.-%
NAD⁺	2 mMol/l
Inosin	5 mMol/l
Purinnucleosid-Phosphorylase	1 E/ml
Xanthin-Dehydrogenase	2 E/ml
pH-Wert 8,2

Reagenz B

Puffer (0,1 M Tris)	100 mMol/l
Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel (Triton X-100)	0,01 Gew.-%
Rekombinante LPA-Phosphatase	0,08 mg/ml
	(6 mU/ml)
pH-Wert 8,2

1-Oleoyl-LPA wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, die ein grenzflächenaktives Mittel (Triton X-100) enthielt, um Proben mit Endkonzentrationen von etwa 0,1, 0,2 oder 0,3 mMol/l zu erhalten.
240 μl des Reagenzes A wurden zu 8 μl einer Probe hinzu gegeben und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Danach wurden 80 μl Reagenz B zugegeben und das Gemisch wurde weitere 5 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Die Veränderung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 340 nm wurde 5 Minuten nach Zugabe des Reagenz B unter Verwendung einer Reagenz-Leerprobe als Kontrolle bestimmt. Für die Reagenz-Leerprobe wurde gereinigtes Wasser als Probe verwendet. Wie in 8 gezeigt, wurde eine Kalibrierungskurve erhalten, die durch den Ursprung verlief.
Beispiel 5
Herstellung des Bestimmungsreagenzes

Die folgende Bestimmungsreagenzien (Reagenz a, Reagenz b) wurden hergestellt. Reagenz a

Puffer (0,1 M HEPES)	100 mMol/l
Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel (Triton X-100)	0,01 Gew.-%
Peroxidase	10 E/ml
Purinnucleosid-Phosphorylase	0,5 E/ml
Xanthin-Oxidase	3 E/ml
Inosin	3 mMol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylanilin	5 mMol/l
pH-Wert 7,7

Reagenz b

Puffer (0,1 M HEPES)	100 mMol/l
Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel (Triton X-100)	0,01 Gew.-%
4-Aminoantipyrin	10 mMol/l
Rekombinante LPA-Phosphatase	0,08 mg/ml
	(6 mU/ml)
pH-Wert 7,7

Jede der verschiedenen LPAs wie z. B. 1-Palmitoyl-LPA, 1-Stearoyl-LPA, 1-Oleoyl-LPA, 2-Oleoyl-LPA, 1-Lineoyl-LPA und 1-Arachidonoyl-LPA wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, die ein grenzflächenaktives Mittel enthielt, um Proben mit einer Konzentration von 0,2 mMol/l herzustellen. 240 μl Reagenz a wurden 8 μl Probe zugegeben und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Danach wurden 80 μl Reagenz b dazu gegeben und das Gemisch wurde weitere 5 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Die Veränderung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 570 nm wurde 5 Minuten nach Zugabe des Reagenzes b unter Verwendung einer Reagenz-Leerprobe als Kontrolle bestimmt.
Wie in 9 gezeigt, ist es unter Verwendung des vorliegenden Bestimmungsreagenzes möglich, verschiedene LPAs zu untersuchen, die unterschiedliche Arten von Fettsäuren in der Acylgruppe enthalten. Der Reaktionszeitverlauf für 1-Oleoyl-LPA wird in 10 gezeigt. Die Extinktion erhöht sich nach der Zugabe des Reagenzes b rasch und erreicht nach einigen Minuten ein Maximum. Zusätzlich wurden verschiedene Phospholipide wie z. B. 1,2-Dipalmitoylphosphatidsäure (1,2-Dipalmitoyl-PA), 1-Palmitoylphosphatidylethanolamin (1-Palmitoyl-LPE) und 1-Palmitoylphosphatidylcholin (1-Palmitoyl-LPC) in physiologischer Kochsalzlösung, die ein grenzflächenaktives Mittel enthielt, gelöst, um Proben mit einer Konzentration von 0,2 mMol/l herzustellen. Die Extinktion wurde durch die gleichen Verfahren bestimmt.
Wie in 11 gezeigt, wird die LPA spezifisch getestet, wenn das vorliegende Bestimmungsreagenz verwendet wird, und andere Phospholipide wie z. B. PA, LPA und LPC können in wesentlichem Umfang nicht getestet werden.
Des Weiteren wurde die Veränderung der Extinktion durch die gleichen Verfahren jeweils mit einem kommerziell erhältlichen Kontrollserum, mit 0,2 mM 1-Oleoly-LPA und mit einer Probe, die durch Zugabe von 1-Oleoyl-LPA in einer Konzentration von 0,2 mM zu dem kommerziell erhältlichen Kontrollserum hergestellt wurde, bestimmt. Die Bestimmungsgenauigkeit (%) für die LPA wurde für jede erhaltene Extinktionsveränderung mittels der folgenden Gleichung berechnet:
Hierbei ist die Bestimmungsgenauigkeit umso höher, je mehr sich der Wert 100 annähert. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Bestimmungsgenauigkeit (%) = 100,3

Die Ergebnisse der Tabelle 2 zeigen, dass die Bestimmungsgenauigkeit 100,3% beträgt, so dass sogar, wenn die Probe als LPA in Serum vorliegt, sie ohne Beeinträchtigung durch andere Serumbestandteile untersucht werden kann.
ÄQUIVALENTE
Die vorliegende Erfindung kann eine Ausführungsform in beliebigen anderen Formen darstellen, ohne von dem Geist oder den wesentlichen Charakteristika der Erfindung abzuweichen. Daher sind die vorstehend beschriebenen Beispiele in allen Aspekten nur Erläuterungen und sollten nicht als darauf einschränkend angesehen werden. Der Rahmen der vorliegenden Erfindung ist in den Ansprüchen dargestellt und ist nicht an die Beschreibung in der Spezifizierung gebunden. Weiterhin wird beabsichtigt, dass alle Modifizierungen und Veränderungen, die in den Rahmen einer Äquivalenz mit den Ansprüchen fallen, in den Rahmen der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen sind.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine rekombinante LPA-Phosphatase bereitgestellt, die in der Lage ist, LPA spezifisch zu hydrolysieren, und ähnliches. Darüber hinaus wurde gemäß der vorliegenden Erfindung der Stoffwechselweg der LPA aufgeklärt, und des Weiteren können verschiedene Erkrankungen, an denen die LPA oder die LPA-Phosphatase beteiligt ist, diagnostiziert und behandelt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann darüber hinaus die Bestimmung der LPA, eine vielversprechende Anzeige für Krankheiten und ähnliches im Gebiet klinischer Untersuchungen, auf eine einfachere Weise durchgeführt werden, ohne dass dazu die komplizierten Verfahren wie in den herkömmlichen Verfahren nötig sind, und die Bestimmung kann für eine große Zahl an zu untersuchenden Proben durchgeführt werden, so dass sie bei einem üblichen biochemischen automatischen Analysegerät angewendet werden kann, wodurch sie sehr nützlich ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, die eine Lysophosphatidsäure-Phosphatase codiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 umfasst; (b) DNA, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 resultiert; (c) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2; (d) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Basen in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 resultiert; (e) DNA; die fähig ist, unter stringenten Bedingungen an eine der DNAs gemäß (a) bis (d) zu hybridisieren; (f) DNA die komplementär zu einer von (a) bis (e) ist, wobei das Polypeptid, welches durch die DNA codiert wird, die Merkmale hat, spezifisch Lysophosphatidsäure zu hydrolysieren, aber Phosphatidsäure, Cardiolipin, Bisphosphatidsäure, Glycerophosphat, Ceramid-1-phosphat und Sphingosin-1-phosphat nicht zu hydrolysieren.
Expressionsvektor, der die DNA gemäß Anspruch 1 beinhaltet.
Transformante, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 2 beinhaltet, wobei die Transformante erhalten wird durch das Einbringen des Expressionsvektors gemäß Anspruch 2 in eine Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus prokaryontischen Zellen, Hefezellen, Insektenzellen, Affenzellen, murinen Zellen und menschlichen Zellen.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Lysophosphatidsäure-Phosphatase, umfassend den Schritt des Züchtens der Transformante gemäß Anspruch 3 unter Bedingungen, unter denen das Protein von dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 2 exprimiert werden kann.
Protein, das durch die DNA gemäß Anspruch 1 codiert wird, welches von der Transformante gemäß Anspruch 3 erhalten werden kann oder welche durch das Verfahren gemäß Anspruch 4 erhältlich ist.
Antikörper oder Fragment davon, der/das in der Lage ist, spezifisch an das Protein gemäß Anspruch 5 zu binden.
Antisense-DNA oder Antisense-RNA, umfassend 8 Basen oder mehr, welche eine Sequenz hat, die komplementär zu der DNA gemäß Anspruch 1 ist.
Verwendung einer Sonde oder eines Primers, welcher) in der Lage ist, spezifisch an eine DNA zu hybridisieren, die Lysophosphatidsäure-Phosphatase codiert, zum Nachweis und zur Quantifizierung von LPA-Phosphatase, wobei die DNA eine DNA ist, welche ein Peptid codiert, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst, und wobei die Länge der Sonde 8 bis 1700 Basen ist und die Länge des Primers 8 bis 50 Basen ist.
Verfahren zur Bestimmung von LPA, umfassend den Schritt des Mischens des Proteins gemäß Anspruch 5 mit einer zu testenden Probe.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Produktes, welches aus der Hydrolyse von Lysophosphatidsäure durch das Protein gemäß Anspruch 5 resultiert, als Anzeige für die Anwesenheit oder Abwesenheit der Lysophosphatidsäure verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei Phosphorsäure oder Monoacylglycerin als das Hydrolysat der Lysophosphatidsäure bestimmt wird.
Bestimmungsreagens für LPA, umfassend das Protein gemäß Anspruch 5.
Bestimmungsreagens für LPA gemäß Anspruch 12, weiter umfassend ein Reagens zum Nachweis von Phosphorsäure oder Monoacylglycerin.
Kit zur Diagnose einer Krankheit, in welche LPA involviert ist, umfassend das Bestimmungsreagens für LPA gemäß Anspruch 12 oder 13.
Arzneimittel, umfassend das Protein gemäß Anspruch 5, den Vektor gemäß Anspruch 2 oder den Antikörper gemäß Anspruch 6.
Verwendung des Proteins nach Anspruch 5, des Vektors nach Anspruch 2 oder des Antikörpers nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Komplementierung intrinsischer LPA-Phosphatase-Aktivität.
Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 5, des Vektors gemäß Anspruch 2 oder des Antikörpers gemäß Anspruch 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.