WO2000031275A1

WO2000031275A1 - Phosphatase de recombinaison d'acide lysophosphatidique

Info

Publication number: WO2000031275A1
Application number: PCT/JP1999/004509
Authority: WO
Inventors: Tadaomi Takenawa; Masami Hiroyama; Tatsuya Kishimoto; Masahiro Yamaguchi; Mitsuyoshi Toyosato; Kouji Mizuno
Original assignee: Azwell Inc.
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-08-23
Publication date: 2000-06-02
Also published as: DE69933647D1; US20030104600A1; EP1050584B1; DE69933647T2; EP1050584A4; US6472193B1; EP1050584A1; US7109012B2

Description

明細書組換えリゾホスファチジン酸ホスファタ一ゼ技術分野

本発明は、組換えリゾホスファチジン酸ホスファタ一ゼ（LP Aホスファタ一ゼ）に関する。さらに詳しくは、 LPAホスファターゼをコードする DNA、該 DNAからコードされる蛋白質、該 DNAを含有する発現ベクター、該発現べク夕一を含む形質転換体、該蛋白質の製造方法、該蛋白質に対する抗体、該 DNA と相補的なアンチセンス DNAまたは RNA、該 DNAに特異的にハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、組換え LP Aホスファ夕ーゼを用いた LP Aの測定法、測定用試薬および診断用キットに関する。背景技術

リゾホスファチジン酸（LPA) は、天然に存在する化学構造が最も単純なリン脂質であり、繊維芽細胞に対して成長因子様の活性を奏することが知られている (Moolenaar, W. H.ら、 (1992) Rev. Physiol. Bioc em. Pharmacol. 119, 47 -65; Moolenaar, W. H. (1995) J. Biol. Chem. 270, 12949-12952; Moolenaar, W. H.ら、（1997) Curr. Opinion Cell Biol. 9, 168-173) 。 LP Aは、血液の凝固過程の産物として、活性化された血小板から迅速に産生され、放出される。したがって、 LP Aは、傷の治癒や再生においてある種の役割を果たすと示唆されている。また、 LP Aは、神経細胞において、軸索の迅速な退縮や細胞体の一過性の球状化を誘導することが明らかになつている。これらの生理活性は、 G蛋白質に共役した LPAレセプ夕一により起こると考えられており（Moolenaar, W , H.ら、（1997) Curr. Opinion Cell Biol. 9, 168-173) 、 2個の推定 LPAレセプタ一をコードする c DNAが単離されている（Hecht, J. H.ら、（1996) J. Cell Biol. 135, 1071-1083; Guo, Z.ら、 (1996) Pro Natl. Acad. Sci. USA 93: 14367-14372)。

また、 LP Aは、癌細胞浸潤促進、細胞接着、アポトーシスの抑制、走化性等の多様な生理活性を持つ。そして、その血清存在量が卵巣癌その他の婦人特有の癌で高いという報告があり（Xu， Y.ら、 (1998) JAMA 280, 719-723) 、癌の早期発見マーカーとしても期待されている。

L P Aの産生に関しては、モノァシルグリセロールキナーゼによるモノァシルグリセロールからの産生とホスホリパーゼ A 1 (PL A 1 ) またはホスホリパーゼ A 2 (PL A 2) によるホスファチジン酸からの産生により LP Aが合成されること等が知られている。しかしながら、種々の刺激に応答して産生される LP Aは、ホスファチジン酸（PA) の産生よりもやや遅れて起こる（Gait, ら、 (1997) FEBS Lett. 410, 54-58) ことから、後者の経路由来のものが優勢であると考えられている。

し力、し、生合成系での LP Aはすぐにホスファチジン酸になってしまい、生理活性物質として働く場合のほとんどは合成系でなく、リン脂質分解系の産物として作られると考えられている。 LP Aの加水分解経路に関しては、 3つの経路、即ち、？八ホスホリパーゼ八、 LP Aホスファターゼおよび LP Aァシルトランスフヱラーゼによる経路が可能である（Gait, F.ら、（1997) FEBS Lett. 410， 54-58; Eberhardt, C. ら、（1997) J. Biol. Chem. 272, 20299-20305) 。 LP Aは生理活性脂質であるので、前記酵素による LP Aの排除は、シグナルの終結に非常に重要な役割を果していると思われる。

LPAホスホリパ一ゼ Aに関しては、ラット脳から精製されたものが知られており、 8 0 kD aの膜結合型酵素であって、 LP Aを加水分解するが、他のリゾホスホリピドを加水分解しない（Thompson. F. J. と Clark M. A, (1994) Bioc hem. J. 300, 457-461) 。

LPAホスファターゼに関しては、 PAM2 1 2マウスケラチノサイトにおいて、 P Aも加水分解するェクト（リゾ）ホスファチジン酸ホスファターゼの存在が報告されている（Xie, M.と Low, M. G. (1994) Archives Biochemistry Biophy sics 312, 254-259)。これまで、相対的には P A特異的であるが L P Aにも弱い活性を示す膜結合型 P Aホスファタ一ゼがブ夕胸腺から精製されている（ Kanoh,

H. ら、 (1992) J. Biol. Chem. 267, 25309-25314 ; Kai, M. ら、 (1996) J. Bi ol. Chem. 271, 18931-18938) 。また、ラットの肝臓からは、 L P A、セラミド

1一ホスフェートおよびスフインゴシン 1ーホスフヱートも加水分解する膜結合型 P Aホスファターゼ（Waggoner, D. W. ら、（1995) J. Biol. Chem. 270, 194 22-19429 ; Waggoner, D. W. ら、（1996) J. Biol. Chem. 271, 16506-16509) が精製されているが、 L P A特異的なホスファターゼはいまだ知られていないのが現状である。

さらに、 L P Aの測定法に関しては、検体から脂質成分を抽出し、薄層クロマトグラフィ一により L P Aと他の脂質成分とを分離し、ついで得られた L P Aを、メチル基転位反応を介して脂肪酸メチルエステルとしてガスクロマトグラフィ一により測定する方法 (Xu, Y.ら、 (1998) 纖 280, 719-723) が知られている。しかしながら、かかる方法は、煩雑な操作が必要であり、多数の検体の測定には、時間を要するという欠点を有する。発明の開示

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、 L P Aの代謝経路の解明、さらには L P Aが関与する様々な疾患の診断や治療に有用な、 L P Aを特異的に加水分解する組換え L P Aホスファタ一ゼ、様々な疾患に関与する L P Aを、簡易にかつ安価に測定しうる方法、かかる方法に好適な測定用試薬、 L P Aが関与する疾患の診断に好適な診断用キット等を提供することに本発明者らは、 L P Αホスファタ一ゼ活性がゥシの脳に存在することを確認して、ゥシ脳を原料として LPAホスファターゼを精製し、さらに研究を進めた結果、ヒトの LP Aホスファタ一ゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明の要旨は、

〔1〕（a)配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする DNA、

(b)配列番号： 1に記載のアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする DN A、

(c)配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNA、

(d)配列番号： 2に記載の塩基配列において、 1個以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる D N A、および

(e) 前記（a)〜（d) のいずれかの DNAにストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DNA、

からなる群より選択された DNAであって、リゾホスファチジン酸ホスファタ一ゼをコ一ドする DNA、

〔2〕前記〔1〕記載の DNAによりコードされる蛋白質、

〔3〕前記〔1〕記載の DNAを含有してなる発現べクタ一、

〔 4〕前記〔 3〕記載の発現べクタ一を含む形質転換体、

〔5〕前記〔4〕記載の形質転換体を、前記〔3〕記載の発現ベクターからの蛋白質の発現が可能な条件下で培養する工程を含む、組換えリゾホスファチジン酸ホスファ夕一ゼの製造方法、

〔6〕前記〔2〕記載の蛋白質に特異的に結合しうる抗体またはその断片、

〔7〕前記〔1〕記載の DNAと相補的な配列を有する、 8塩基以上からなるアンチセンス DNAまたはアンチセンス RNA、

〔8〕前記〔1〕記載の DNAに特異的にハイブリダィズしうるプローブまたはプライマー、

〔9〕前記〔2〕記載の蛋白質と被検試料とを混合するステップを含む、 LP Aの測定法、

〔1 0〕前記〔 2〕記載の蛋白質によるリゾホスファチジン酸の加水分解産物の有無を該リゾホスファチジン酸の存在または非存在の指標として用いる、前記〔9〕記載の LP Aの測定法、

〔1 1〕リゾホスファチジン酸の加水分解産物として、リン酸またはモノァシルグリセロールを測定する、前記〔1 0〕記載の LP Aの測定法、

〔1 2〕前記〔2〕記載の蛋白質を含有してなる、 LPAの測定用試薬、

〔1 3〕さらに、リン酸またはモノァシルグリセロールの測定のための試薬を含有してなる、前記〔1 2〕記載の LP Aの測定用試薬、

〔14〕前記〔1 2〕または〔1 3〕記載の LP Aの測定用試薬を含有してなる LP Aが関与する疾患の診断用キット、

に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、 Qセファロース FFによるイオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

第 2図は、 TSK— GEL DEAE- 5 PW G Lによるイオン交換クロマトグラフィ一の結果を示すグラフである。

第 3図は、 Hi Loa d 26 / 60 Sup e r d ex 200によるゲル濾過の結果を示すグラフである。

第 4図は、 H i Tr ap Hep a r i nカラムによる吸着クロマトグラフィ一の結果を示すグラフである。

第 5図は、還元条件下での 1 2. 5 %SDS - PAGEの結果を示す電気泳動の図である。レーン 1〜6は、それぞれ、実施例 1の各工程で得られた試料（

5

差替え用紙（規則 26) 負荷した蛋白質量は、それぞれ、 1 4、 1 0、 5. 5、 4. 6、 2. 1および 0 . 27 /gである）を示し、左端の数字は、マ一カー蛋白質の分子量を示す。第 6図は、ゥシ LPAホスファターゼが用量依存的に [³H] LPAを [³H] モノォレオイルグリセロールに加水分解することを示す T L Cの結果である。レーン 1〜5はそれぞれ、 0、 1 5、 37. 5、 75および 1 5 Ongの酵素量を示し、 MGは、モノォレオイルグリセロールを示す。

第 7図は、ゥシ LPAホスファターゼと、前もって TLCで精製した [ ³²P] LPAまたは [ ³²P] PAとの反応性を調べたグラフである。パネル Aは、酵素量を変え、パネル Bは、基質の濃度を変えた結果を示す。

第 8図は、本発明の測定用試薬を用いて得られた LP A測定のための検量線を示す図である。上段パネルに、それぞれの LP A濃度の試料を測定した際の吸光度変化量の数値を示す。下段パネルに、得られた吸光度変化量の数値を基に作成した検量線のグラフを示す。

第 9図は、本発明の測定用試薬を用いて、ァシル基の脂肪酸部分が異なる種々の LP Aを測定した結果を示す図である。上段のパネルに、各試料について測定した吸光度変化量の数値を示し、下段パネルに、得られた吸光度変化量の数値を基に作成したグラフを示す。

第 1 0図は、本発明の測定用試薬を用いて測定した 1ーォレオイル LP Aの反応タイムコースの結果を示すグラフである。

第 1 1図は、本発明の測定用試薬を用いて、 LPA、 PA、 LPEまたは LP Cを含む試料を測定した結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明のリゾホスファチジン酸ホスファターゼ（LP Aホスファタ一ゼ）とは、後記本発明の DNAによりコードされる蛋白質であって、かつリゾホスファチジン酸のリン酸エステルを特異的に加水分解する活性（以下、 LPAホスファターゼ活性と略す場合がある）を有する蛋白質をいう。具体的には、配列番号： 1 に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。かかるペプチドは、 42 1個のァミノ酸残基を有する蛋白質であり、ヒト LP Aホスファターゼである。本発明の L P Aホスファタ一ゼの基質特異性に関しては、リゾホスファチジン酸を特異的に加水分解するが、ホスファチジン酸、カルジォリピン、ビスホスファチジン酸、グリセロールリン酸、セラミド 1一リン酸およびスフインゴシン 1 -リン酸を加水分解しないという特徴を有する。

本発明において、基質である LP Aとしては、 1—ォレオイルリゾホスファチジン酸（ 1ーォレオイル LPA)、 1一パルミトイル LPA、 1—ステアロイル LPA、 1一ミリストイル LPA、 1一ラウロイル LPA、 1ーリノレオイル L P A等が挙げられる。本明細書においては、単に「LPA」と表示した場合、前記 1ーォレオイル LPA、 1一パルミトイル LPA、 1ーステアロイル LPA、 1一ミリストイル LP A、 1一ラウロイル LPA、 1一リノレオイル L PA等を含む概念である。

本発明の L P Aホスファターゼの活性は、通常の方法で測定することができるが、例えば、下記方法により測定してもよい。

50 Μ [³Η] 1—ォレオイル LPA (5 x i 0⁴ dpm) 、界面活性剤および酵素を含む 50mM Tr i s—マレイン酸塩緩衝液、 pH7. 5中（50 II 1 ) で 37°C 1 5分間反応させる。 250 1の D 01 e試薬（ィソプロパノール /ヘプタン/ Ν H₂ S 0₄ = 78 /28 /2 ) を加えて反応を停止し、続いて、得られた反応物に 1 25 / 1の H₂ 0と 1 50 1のヘプタンとを加える。混合後、遠心分離（ 1 200 xg、 5分）を行い、その上層 1 50〃 1を他のチューブに移し、 1 50 1のヘプタンとマイクロスパーテル一杯のシリカゲル 60Hとを加えて混合する。遠心分離（ 1 200 gx 5分）を行い、その上清 200 1を 2m 1のシンチゾール EX— Hに加え、生成した [³H] モノォレオィルグリセロールをシンチレーシヨン計数により測定し、酵素活性を決定する。本発明の DNAは、

(a) 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする DNA

(b) 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする DN A、

(c)配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNA、

(d)配列番号： 2に記載の塩基配列において、 1個以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる DNA、および

(e)前記（a)〜（d) のいずれかの DNAにストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DNA、

からなる群より選択される DNAであって、 LP Aホスファタ一ゼをコ一ドする DNAである。

本発明の DNAは、具体的には、配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする DNA、より具体的には、配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNAが挙げられ、これは、ヒト LPAホスファターゼ遺伝子である。配列番号： 1に記載のアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたァミノ酸配列からなるぺプチドをコードする DNAも、該ペプチドが LP Aホスファターゼ活性を有する限り、本発明の DNAに含まれる。本明細書における「1個以上」とは、 1個または数個またはそれ以上の個数をいう。

また、配列番号： 2に記載の塩基配列において、 1個以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなる DNAも、該 DNAからコードされるぺプチドが LP Aホスファタ一ゼ活性を有する限り、本発明の DNAに含まれる。ここで「1個以上」とは、前記と同じ意味である。

本明細書において、「アミノ酸および塩基の欠失、置換、挿入または付加」は、天然に生じたものであってもよく、人為的に導入したものであってもよい。人為的にアミノ酸および塩基の欠失、置換、挿入または付加を行なう手法は、例えぱ、 Sambrook, J. ら著、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989年発行に記載の部位特異的突然変異誘発、 PCR法等により、当業者ならば容易に行なうことができるさらに、本発明の DNAは、前記（a) 〜（d) のいずれかの DNAとストリンジントな条件下でハイプリダイズする DNAによりコードされるぺプチドが L P Aホスファターゼ活性を有する限り、該ハイプリダイズする DN Aも包含する

本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする」とは

、例えば、 6 xSSC (20 xSSCは、 333 mM クェン酸ナトリウム、 3 33mM Na C 1を示す）、 0.5 %SDSおよび 50 %ホルムァミドの溶液中で 42 °Cにて加温した後、 0.1 xSSC、 0.5%SDSの溶液中で 68°Cにて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることをいう。

本発明の DNAは、下記のようにして得られたものである。即ち、ゥシ脳を適当な緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離してサイトゾル画分を得る。次いでこの画分を常法により硫安分画した後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ一等を組み合わせて精製 LPAホスファタ一ゼを得ることができる。このようにして得られたゥシ L P Aホスファタ一ゼについて部分ァミノ酸配列を決定し、決定されたァミノ酸配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマ一を作製し、遺伝子ライブラリーの DNAを铸型として PCR法により cDNA断片を得る。得られた cDNA断片をプローブとして、種々の遺伝子ライブラリ一をスクリ一二ングすることにより、種々の生物および組織由来の L P Aホスファターゼ c DN Aを得ることができる。

本発明の発現べクタ一は、前記 DNAを含有するものであり、本発明に用いられる発現ベクターは、例えば、 PUC誘導体、 pGEX— 2T、 pQE 30, p ET、 pKK223—3、 p MS Gおよび p S V L等の市販の発現べクタ一や公知の発現ベクターが挙げられるが、本発明の D N Aが揷入でき発現可能なベクタ一であれば特に限定されない。

本発明の DNAをべクタ一に挿入する方法としては、前述の Molecular Clonin g等に記載の方法により行なうことができる。

本発明の形質転換体は、前記発現ベクターを所望の宿主細胞に導入することにより得られるものである。宿主細胞としては、大腸菌（HB 1 0 1、 JM 1 09 等）、バチルス属紬菌〔バチルス■ズブチリス（Bacillus subtilis) 等〕等の原核生物細胞またはサッカロミセス属酵母〔サッカロミセス 'セレピシェ（Sacchar omyces serevisiae)等〕、昆虫細胞 CS f 9等のヨガ（Spodoptera frugiperda) 細胞、カイコ（Bombyx mori) 細胞等〕、哺乳動物細胞（C0S 1、 COS 7等のサル細胞、 N I H 3 T 3等のマウス細胞、 He L a細胞等のヒト細胞）等の真核生物細胞のいずれでもよく、用いる発現ベクターに応じて選ばれる。

発現べクタ一を導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リボフェクション法、 DEAEデキストラン法、エレクト口ポレーシヨン法（F.M.Ausu bel らの編纂による Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & S ons (1987)) 等の公知の方法を用いればよい。

本発明は、前記形質転換体を、前記発現ベクターから本発明の蛋白質が発現可能な条件下で培養する工程を含む組換え L P Aホスファターゼの製造方法を提供する。以下、宿主細胞として大腸菌を選択し、発現ベクターとして PGEX— 2 Tを使用した場合について説明する。

大腸菌内で LP Aホスファターゼを GST (グル夕チオン— S—トランスフエラーゼ）との融合蛋白質として発現させるため、 LPAホスファターゼの cDN Aを発現プラスミド pGEX— 2Tに挿入し、 GST— LPAホスファタ一ゼ発現プラスミドを作製する。次いで、該発現プラスミドで大腸菌を形質転換し、形質転換体を通常の条件で培養し、対数増殖期の形質転換体にィソプロピル一 β一 D—チォガラクトシド（ I PTG) を添加して培養を続け、 GST— LPAホスファターゼ融合蛋白質の発現を誘導する。発現した融合蛋白質は、グルタチオンビーズにより精製することが可能である。

また、融合蛋白質ではない組換え LPAホスファターゼは、通常の限外濾過、カラムクロマトグラフィーまたは本発明の抗体を用いたァフィニティ一精製等の方法により精製することができる。

さらに、本発明は、本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体またはその断片を提供する。抗体は、ポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。

本発明の抗体は、例えば、 Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編 ,Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年などに記載の方法により、本発明の蛋白質の全部または一部を用いて適宜動物を免疫することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体またはその活性を中和する抗体を容易に作製することができる。また、得られた抗体をプロテアーゼ等により切断することにより、抗体断片を調製することができる。

抗体またはその断片の用途としては、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 c DNAライブラリ一のスクリーニング、免疫学的診断法、医薬等が挙げられる。免疫学的診断法は、ィムノブロット法、放射免疫測定法（R I A) 、酵素免疫測定法（EL I SA) 、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。

本発明は、本発明の DN Aと相補的な配列を有する、 8塩基以上からなるアンチセンス DN Aまたはアンチセンス RN Aを提供する。アンチセンス DNAまたはアンチセンス RNAは、合成機を用いて人工的に合成したり、通常と逆の向き (すなわちアンチセンスの向き）に DN Aを転写させることなどによって得ることができる。

前記アンチセンス DN Aまたはアンチセンス RN Aは、細胞内に導入されて本発明の蛋白質の発現を抑制することが可能である。かかる観点より、アンチセンス DNAまたはアンチセンス RNAの長さは、通常 8〜1 700塩基であり、 1 5〜30塩基が好ましい。通常の遺伝子の転写によって生産される mRNAはセンス鎖であるが、アンチセンス DNAまたはアンチセンス RNAは、細胞内でセンス鎖 mRNAに結合し、該 mRNAからの翻訳を抑制することにより、本発明の蛋白質である L P Aホスファターゼの産生を制御することができる。このような作用を有することにより、アンチセンス DN Aまたはアンチセンス RN Aは、例えば LPAホスファターゼ活性の調節剤として用いられる。また、アンチセンス DNAまたはアンチセンス RNAは、ィン ·サイチュハイプリダイゼ一ション等の研究用試薬としても利用できる。

作製したアンチセンス DN Aまたはアンチセンス RN Aが、目的の抑制効果を有しているか否かは、例えば以下の二つの方法により容易に見出すことができる。一つは、本発明の LP Aホスファタ一ゼを発現する細胞に、細胞外からアンチセンス DN Aまたはアンチセンス RN Aそのものを直接導入した後、該 L P Aホスファターゼの発現量の変化を指標にする方法であり、もう一つは、該アンチセンス RN Aを転写によって生成することが可能なベクタ一を前記 LP Aホスファターゼ発現細胞に導入した後、該 LPAホスファターゼの発現量の変化を指標にする方法である。

本発明は、本発明の DNAに特異的にハイプリダイズしうるプローブまたはプライマーを提供する。該プローブまたはプライマーの長さは、目的に応じて適宜選択できるが、プローブにおいては、通常 8〜1 700塩基、好ましくは 1 3〜 1 300塩基であり、プライマーにおいては、通常 8〜50塩基、好ましくは 1 5〜35塩基である。該プローブまたはプライマーは、通常、合成機を用いて化学的に合成したり、 DNAポリメラーゼ I (クレノウフラグメント）を甩いて酵素的に合成したり、 P C R法により作製することができる。

本発明のプローブまたはプライマ一がハイブリダィズする条件は、例えば、 S ambrook, J. ら著、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2te ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989年発行等に準じて、目的に応じて容易に設定することができる。

本発明のプローブまたはプライマ一は、 LP Aホスファタ一ゼの検出および定量に用いられ、 LPAホスファタ一ゼが関与する疾患の診断または治療に役立つことが期待される。また、該プローブまたはプライマーは、ハイブリダィゼーション、 PCR等に用いられる LPAホスファタ一ゼの研究用試薬としても利用できる。

本発明の LPAホスファタ一ゼは、前記したように、 LPAに特異的に作用し、そのリン酸基を除去し、モノァシルグリセロールを生成せしめる酵素である。 LP Aには細胞増殖促進作用がある他にも、癌細胞浸潤促進、細胞接着、アポト —シスの抑制、血小板凝集、走化性等多様な生理活性を持ち、疾患との関係を示唆する報告もある。したがって、本発明の LPAホスファターゼを用いて LPA を測定することにより、 LP Aが関与する疾患の診断に応用できる。本発明は、かかる L P Aの測定方法を提供する。

ここで、 LP Aまたは LP Aホスファターゼが関与する疾患としては、特に限定されないが、例えば、卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌または子宮頸癌等の癌等が挙げられる。

本発明の LP Aの測定法は、本発明の蛋白質である LP Aホスファタ一ゼと被検試料とを混合するステップを含む。かかる測定法においては、 LP Aの加水分解産物の有無を該リゾホスファチジン酸の存在または非存在の指標として用いる被検試料としては、例えば、血液、血漿、血清、尿などの体液および組織などが挙げられる。被検試料が採取した組織である場合、組織破砕処理、細胞溶解処理などの前処理を適宜行なうことにより、 L P Aを測定することができる。

L P Aホスファターゼと被検試料とを混合する条件は、 L P Aホスファターゼの活性を発現しうる条件であればよく、例えば、反応可能な p H範囲、温度であれぱよい。また後述のように L P Aホスファターゼの反応と加水分解産物の測定のための反応とのカップリング反応により行なう場合、両方の反応を行ないうる条件で、カップリング反応を行なうことができる。

被検試料中に L P Aを含有している場合、本発明の蛋白質と被検試料とを混合するステップにおいて、本発明の蛋白質である L P Aホスファターゼと被検試料中の L P Aとが反応し、 L P Aの加水分解産物を生成する。

L P Aの加水分解産物は、モノァシルグリセロールおよびリン酸である。本発明の L P Aの測定法においては、本発明の蛋白質である L P Aホスファ夕ーゼを用いるため、従来の L P Aの測定法に比べ格段に簡易にかつ安価に行なうことができる。

ついで、生成した加水分解産物（モノアシルグリセロールまたはリン酸）を測定する。モノァシルグリセロールまたはリン酸の測定方法は、それぞれ公知の方法を用いることができる。モノァシルグリセロールまたはリン酸を検出するための反応は、 L P Aホスファターゼの反応と同時に行なってもよい。

モノァシルグリセロールの測定方法としては、例えば、該モノアシルグリセ口 —ルとモノアシルグリセロールリパーゼおよびグリセロールォキシダーゼとを作用させること、あるいはモノァシルグリセロールリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセ口一ルー 3—リン酸ォキシダーゼを作用させることにより生じる過酸化水素を定量する方法（特開昭 6 3— 2 4 5 6 7 2他）等が挙げられる。また、前記方法において、グリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼの代わりにグリセロール— 3—リン酸デヒドロゲナーゼを用いて、ニコチンァミドアデニンジヌクレオチド酸化型（NA D + ) あるいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（NADP+ ) から生成するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH) あるいはニコチンミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH) の変化量を指標としてもよい。あるいは酸化型の変化量を指標としてもよい。

リン酸の測定方法としては、例えば、リンモリブデン酸還元法やリンモリブデン酸直接法などの化学法やより特異的で平易な条件で行える酸素法等が挙げられる。本発明においては、より特異的で平易な条件で行なうことができるという観点より、酵素的リン酸測定法が望ましい。また、 LPAホスファタ一ゼで前処理した後、遊離したリン酸を前記化学法で測定してもよい。

リン酸の酵素的測定法としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの存在下、リン酸とイノシンとを反応させ、生成するヒポキサンチンに更にキサンチンォキシダーゼを作用させることにより生じる過酸化水素を測定する方法（Adam, A. ら、（1984) Clin. C em. 30, 1724)；前記方法におけるキサンチンォキシダーゼの代わりにキサンチンデヒドロゲナ一ゼを用いて、ヒポキサンチンと NAD+ とを反応させ、生成する NADHを測定する方法；ピルビン酸ォキシダーゼの存在下、リン酸とピルビン酸とを反応させ、生じる過酸化水素を測定する方法；シュクロースホスホリラ一ゼの存在下、リン酸とグリコーゲンとを反応させ、次いで生成するグルコース一 1―リン酸とホスホグルコム夕一ゼとを作用させ、生成する NAD+ とグルコース一 6—リン酸デヒドロゲナーゼとを作用させることにより生成する NADHを定量する方法等が挙げられる（伏見了（1987)検査と技術 15, 137-140)。このような酵素的測定法を利用する際にも、 LPAホスファタ一ゼで前処理した後、遊離したリン酸を酵素法で測定してもよく、 LPAホスファ夕一ゼ反応とリン酸の測定のための反応との力ップリング反応により同時に行なってもよレ、。

前記モノァシルグリセロールまたはリン酸の酵素的測定法において、酵素反応により過酸化水素が生成する場合、該過酸化水素は、過酸化水素電極を用いる方法、ペルォキシダーゼ（P O D) やカタラーゼ等を用いる比色定量法などによつて測定することができる。 P O Dを使用する場合には、 4—ァミノアンチピリンやカラーカプラーとの酸化縮合反応により生成する色素を測定する方法が汎用されているが、蛍光反応や発光反応を用レ、ることにより高感度に測定することも可食 £ I：、あ Q ₀

また、前記モノァシルグリセロールまたはリン酸の酵素的測定法において、 N A D HぁるぃはNA D P Hが生成する場合、該 NA D Hあるいは NA D P Hは、吸光度の変化を利用して測定することができる。

本発明の L P Aの測定用試薬は、本発明の蛋白質である L P Aホスファタ一ゼを含有する。さらに L P Aの加水分解産物であるモノアシルグリセロールまたはリン酸の測定に関与する物質を含有してもよい。

本発明の L P Aの測定用試薬において、 L P Aホスファターゼは、安定化を目的として、適宜化学修飾を施して用いてもよく、適当な担体に固定化させて固定化酵素として用いてもよい。

かかる測定用試薬は、酵素を含む各物質が適切な濃度となるように処方された試薬を含有した測定用試薬キットとして通常提供される。その際の試薬形態は、乾燥粉末状、液状など特に制限されるものではなく酵素の活性化剤、安定化剤、防腐剤等が配合されていてもよい。また、試薬キットは、例えば、第 1反応用試薬と第 2反応用試薬との組み合わせのように、反応液中への添加時期が異なる 2 種類以上の試薬を組み合わせたキットであってもよく、 1試薬系であってもよい本発明の診断用キットは、 L P Aが関与する疾患の診断に有用であり、前記測定用試薬を含有する。かかるキットは、さらに、被検試料の採取、該被検試料の処理用試薬、診断を行なう際の対照試料を含有してもよい。

本発明の L P Aホスファタ一ゼを有効成分として含有する医薬は、 L P Aまたは L P Aホスファタ一ゼが関与する疾患に罹つた個体に対して、内在性 L P Aホスファタ一ゼ活性を補足し、病因となる量の LP Aを分解せしめるに足る量のリゾホスファチジン酸ホスファターゼを供給することができる。

前記医薬に含有される LPAホスファターゼは、蛋白質として、または個体の体内で LPAホスファタ一ゼが発現して活性を奏するように発現べクタ一の型として存在することができる。

前記医薬を、 LPAもしくは LPAホスファターゼが関与すると思われる癌が疑われるかまたはかかる癌に罹患している個体に使用する場合、癌を治療することが可能であり、さらには癌の転移を防ぐことも可能である。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等により限定されるものではなレ、。

製造例 1

ゥシ LP Aホスファターゼの精製

以下のすべての工程は、 0〜4°Cで行なった。

(1) ホモジナイズ工程

ゥシ脳（1 600 g) に、緩衝液〔20mM Tr i s _HC l (pH 7. 5 ) , 1 mM EDTA, 0. 1 mM フエ二ルメチルスルホニルフルオリド、 1 mgZm 1ァプロチニン、 1 mgZm 1ロイぺプチン〕を 1. 5ml/gとなるように加えて Nationalミキサー MX- V100でホモジナイズした。ホモジネートを 1 2， 000 xgで 30分間遠心分離し、得られた上清をさらに 1 00, 000 X gで 1時間遠心分離して、上清のサイトゾル画分（蛋白質量として 9, 600 m g) を得た。

(2) 硫安分画

前記サイトゾル画分に 35%飽和になるように硫酸アンモニゥムを加え、 4°C で 1時間攪拌してから遠心分離（1 2， 000 xg, 30分）を行い、得られた上清に 45 %飽和になるようにさらに硫酸アンモニゥムを加えた後、同様の操作を行った。得られた沈澱物を 7 Om 1の 2 OmM Tr i s— HC 1 (pH 7. 5) に懸濁し、同緩衝液で透析した。

(3) Qセファロ一ス FFを用いるイオン交換クロマトグラフィー

前記透析物を 1 00, 000 X gで 1時間遠心分離して不溶物を除いた後、 2 OmM Tr i s -HC 1 (pH7. 5 ) で平衡化した Qセファロース F F (ァマーシャムバイオテック社、カラムサイズ： 600 ml) に載せた。同緩衝液で洗った後、 2リットルの同緩衝液中での N a C 1の直線濃度勾配（0〜1M) により LPAホスファタ一ゼを溶出させた（第 1図）。次いで、 0. 52〜0. 5 7M Na C 1に相応する活性画分を集めて 2 OmM Tr i s— HC 1 (pH 7. 5) で透析した。

(4) TSK-GEL DEAE- 5 PW G Lを用いるイオン交換クロマトグラフィー

前記イオン交換クロマトグラフィーで得た活性画分を、 2 OmM Tr i s— HC 1 (pH7. 5) で平衡化した TSK— GEL DEAE- 5 PW GL ( 東ソ一、カラムサイズ： 2 0 X 1 5 Omm) に載せた。 240 mlの同緩衝液中での NaC 1の直線濃度勾配（0〜0. 5M) により L P Aホスファタ一ゼを溶出させた（第 2図）。活性画分（0. 1 6〜0. 22M NaC lに相応）を 6 0 %硫酸アンモニゥム飽和にして沈澱させた。

(5) Hi Load 26/60 Sup e r d ex 200を用いるゲル濾過

前記沈澱物を 3m 1の緩衝液〔2 OmM Tr i s— HC 1 (pH7. 5) 、 2 0 OmM NaC K 0. 1 % コール酸ナトリウム〕に溶解し、同緩衝液で平衡化した Hi Load 26 / 60 Sup e r d ex 200カラム（フアルマシアバイオテック）を用いてゲル濾過を行った（第 3図）。主な活性画分を集めて 2 OmM MES-NaOH (pH5. 8 ) で透析し、コール酸ナトリゥムを除いた。 (6) H i Tr a p H e p a r i nカラムを用いる吸着クロマトグラフィ前記ゲル濾過で得られた活性画分を、 20mM MES-NaOH (pH5. 8) で平衡化した H i Tr a p H e p a r i nカラム（フアルマシアバイオテツク、カラムサイズ： 1 m l ) に載せた。同緩衝液で洗った後、 3 Om 1の同緩衝液中での N a C 1直線濃度勾配（0〜1 M) で LP Aホスファタ一ゼを溶出させた（第 4図）。その結果、 2 O ^ gの精製酵素が得られた。

各精製工程での LP Aホスファターゼの収率と活性を表 1に示す。酵素活性は、試験例 1に記載の方法により行なった。表 1より、 LP Aホスファタ一ゼが約 3, 30 0倍に精製されたことがわかる。

表 1

精紅程蛋白質全雕収率精製饊

mg ュ―ット · % ュニット /mg

1.サイトゾル 9600 3.23 100 0.00034 1

2.鶴 5% 800 1.16 36.0 0.00145 4.3

3. Q-FF 65.57 2.30 71.3 0.0351 104.4

4.DEAE 9.25 1.60 49.7 0.1735 516.0

5.ゲル濾過 1.46 0.374 11.6 0.2558 761.0

6.~ リン 0.02 0.022 0.69 1.1118 3306.9

* 1ュニットは、 1分間に 1マイクロモル C ^解雄の^^を謹する酵 mi

として ^する。試験例 1

L P Aホスファタ一ゼの活性測定

LP Aホスファタ一ゼの活性は、 5 0 1の反応混合液（ 5 OmM Tr i s —マレイン酸（pH 7. 5) 、 5 0〃Mモノォレオイル一 [ 9， 1 0— ³H ]リゾホスファチジン酸（ 5 X 1 0⁴ d pm) 、基質の 4倍モル濃度の T r i t ο η ™-Χ 1 0 0および種々の濃度の酵素）中で行なった。前記混合物を 37°Cで 1 5分間インキュベートし、生成した [³H ]モノォレオイルグリセロールを測定して酵素活性を決定した。

製造例 1の各精製工程における酵素活性の測定は、簡便法を用いた。即ち、前記酵素反応物（5 0 / 1の混合液）を 25 0 1の D 0 1 e試薬（イソプロパノールヘプタン/ 1 N H₂ S0₄ = 78/28/2) の添加により反応停止した後、 1 25 1の H₂ 〇と 1 5 0 1のヘプタンを添加した。当該混合液を混合後、 1, 20 0 xgで 5分間の遠心分離により二層を分離した。上層（ 1 5 0 H 1 ) を別のチューブに入れ、次いで、 1 5 0 / 1のヘプタンとのマイクロスパ —テル一杯のシリカゲル 6 0 H (メルク製）を添加した。混合後、 1, 2 0 0 X gで 5分間遠心分離し、 20 0〃 1の上清を 2m 1のシンチソール EX— H (DO JIND0製）と混合し、放射能を測定した。

比活性や反応速度実験等には、以下の分離法を用いて行なった。即ち、前記酵素反応物（5 0 / 1の混合液）を凍結乾燥させ、担体としてモノォレオイルグリセロ一ルを添加後、 n—ブタノール/酢酸/水（30. 4/4. 8/4. 8) の溶媒系を用いる薄層クロマトグラフィー（TLC) により分析した。当該 TLC プレートをヨウ素蒸気に曝露させ、モノォレオイルグリセロールのスポットを搔き取り、放射能を測定した。試験例 2

SDS-PAGE 製造例 1の各工程で得られた酵素含有試料および蛋白質の標準マーカ一（SD S— PAGEスタンダード L ow、バイオラッド製）を、還元条件下で、 1 2. 5 %ポリアクリルァミドゲルを用いる S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) に付した（第 5図）。

第 5図より、最終工程で得られた精製酵素は、還元条件下での SDS— PAG Eで約 44 kD aの単一バンドを示した。試験例 3

基質特異性

種々の基質を含有する酵素反応液を試験例 1 と同様に反応させ、 25 1の過塩素酸を加えて反応を停止し、さらに 75 1の H₂ 〇、 25 1の 1 0 %モリブデン酸アンモニゥムおよび 50〃 1の 1 0 %ァスコルビン酸を加えた。混合液を 9 5°Cで 5分間煮沸後、 7 9 5 nmの吸光度を測定し、遊離のホスフェートを疋里した。

その結果、ゥシ LPAホスファターゼは、用量依存的に、 1ーォレオイル LP Aを強く加水分解したが、ホスファチジン酸、カルジォリピン、ビスホスファチジン酸、グリセ口一ルリン酸、セラミド 1—リン酸およびスフィンゴシン 1—リン酸を加水分解しなかった。

次に、 1ーォレオイル LPAとの反応性を詳しく確かめるために、 [³H] 1— ォレオイル— LPA (5 nmo l、 1 x 1 0⁵ d pm) を基質として用いて試験例 2と同様に酵素反応を行ない、 TLCにより調べた（第 6図）。

第 6図より、ゥシ LPAホスファタ一ゼは、用量依存的に [³H] 1—ォレオイルー LPAを [³H] 1—ォレオイルグリセロールに加水分解した。このことより、当該酵素は、ホスファターゼであって、ホスホリパーゼ Aではないことがわかな。

1ーォレオイル L PAとジォレオイル PAを基質にした場合の反応性をさらに詳しく確かめるために、 [ 7— ³²P] ATPと大腸菌 DGキナーゼを用いて標識し（Waggoner, D. W.ら、 (1996) J. Biol. C em. 271, 16506-16509) 、前もって TLCで精製した [ ³²P] LPAと [ ³²P] PAを基質として用いた。酵素量（ 0〜1 75 ng) を変えて、または基質の濃度（0〜1 00〃M) を変えて反応を行ない、酵素反応を 0. 1N塩酸のメタノール溶液 1 0 Q 1で停止し、各々 200 ^ 1のクロ口ホルムと 1 M塩化マグネシウムを加えた。激しく混合した後、 1, 000 xgで 5分間遠心分離した。水層の 1 75 1の放射能を測定し、酵素反応を調べた（第 7図）。

第 7図の Aおよび Bに示すように、ゥシ LPAホスファターゼは、極めて LP Aに対する反応性が高かつた。実施例 1

ゥシ LP Aホスファターゼの部分ァミノ酸配列の決定

製造例 1で得られたゥシ LPAホスファターゼ（20 U g) を、 7. 5 %SD S— PAGEに付し、 PVDF膜（アト一製）に、トランス一ブロット SDセミドライトランスファ一セル（Bio-Rad製）により転写した。当該膜を色素（Pone eau R、東京化成製）にて染色し、目的のバンドを切り出した後、リジルエンドぺプチダーゼで蛋白質を切断し、ァセトニトリルで抽出した。この抽出物を HP LC C 1 8カラムで分画し、 6つのピークをペプチドシークェンサ一（PPSQ - 1 0 Protein シークェンサ一、 SHIMADZU製）にてエドマン分解法により解析した。その結果、前記 6つのペプチドは、下記配列：

ピーク 1 ： MVQVVFRHGARSPL (配列番号： 3)

ピーク 2 ： FLNT I SVYTLSPEK (配列番号： 4)

ピーク 3 : EGP IV I STDEAK (配列番号： 5)

ピーク 4 ： EWFVQLYYRGK (配列番号： 6)

ピーク 5 ： VGMEQ FALGERLR I (配列番号： 7) およびピーク 6 ： SQLLEVPPQTQLEYTVTNLA (配列番号： 8) を有することがわかった。

前記配列の中で、配列番号： 3と 6が前立腺酸性ホスファタ一ゼとホモロジ一が高かったので、これらのアミノ酸配列を基に、縮重オリゴヌクレオチドプライマー：

5' -atggtica(a/g)gtigtitt(t/c)(c/a)gica(t/c)gg-3' (配列番号： 9) および 5' -cci c(g/t) (a/g) ta(a/g) taia(a/g) (t/c) tgiac(a/g)aacca-3' (配列番号： 1 0 ) を作製した。

λ ZAP^R IIライブラリ一（ヒト脳 c DNA由来、 STRATAGENE製）の DNAを铸型として、前記縮重プライマーを用いて PCRを行なった。温度条件は、 95°C、 3分を 1サイクル、

95°C、 30秒、 55°C、 1分、 72で、 2分を 40サイクル、および

72°C、 1 0分を 1サイクル、

であった。

得られた PCR産物を、 1 %ァガロースゲル電気泳動に付し、臭化工チジゥムで染色後、 UV下でバンドを切り出し、ジーンクリーンキット II (BI0 101 製）で DNAを精製した。精製した DNAを、 T 4ポリヌクレオチドキナーゼ（NEW ENGLAND Biolabs製）と DNAポリメラーゼ Iのクレノウフラグメント（TAKARA 製）で平滑末端化し、 Sma I制限酵素 (TAKARA製）で切断した pB 1 u e s c r i p t^R II KS (—）（STRATAGENE社製）にサブクローニングした。

サブクローニングした DNAを含む p B 1 u e s c r i p t^R II KS (-) を、 JMl 09コンビテント細胞に形質転換し、得られた形質転換体から DNA を単離し、 7—デァザ一 dGTPを有するサ一モシ一クェナーゼ蛍光標識プライマーサイクルシークェンスキット（Amersham製）、 Ml 3フォヮ一ドプライマ一および Ml 3リバースプライマ一（LI- COR製）を用いて、 DNAシークェンサ一 (dNAシークェンサ一ロングリーダー 4200、 Aloka製）にて配列を決疋した。

その結果、 987 bpの cDN A断片がクロ一ニングされたことがわかった。次に、前記 987 bpの断片をプローブとして、前記; IZAP^R IIライブラリ一をコロニーハイブリダィゼ一シヨン法にてスクリーニングした。即ち、一次スクリーニングとして、 1 5 cmの寒天培養プレート 20枚に、合計で 1 X 1 0⁶ 個のコロニー（宿主細胞： XL— 1— B 1 u e) を播種した。生育したコロニーを、コロニー /プラークスクリーンハイブリダイゼーショントランスファ一メンブラン（NEN製）に転写した。 DNAポリメラーゼ Iのクレノウフラグメントを用いて³² Pで標識した前記 987 b pの断片をプローブとして、当該メンブランを 65 °Cで通常のハイプリダイゼ一ション条件下でハイプリダイズした。

ォートラジオグラフィーにより陽性のクローンを 24個ピックアップし、前記一次スクリーニングと同様の操作を繰り返す二次スクリ一ニングを行なった。ォートラジオグラフィーにより陽性のクローンを 20個ピックアップし、 AP^R IIライブラリーの説明書にしたがって、ヘルパーファージを用いるイン ' ビボ切り出し操作を行ない、 pB l u e s c r i p t^R II SK (一）にクローニングされた c D N Aを得た。

得られた 20個のクローン由来の cDNAを、前記と同様に配列を決定し、最長の 1 731 b pの c DNAを含むクローンを得た。この塩基配列を配列番号： 2に示す。当該塩基配列は、 1 263 b pのコード領域を含むものであり、それからコードされるアミノ酸配列を配列番号： 1に示す。クローニングされたヒト由来の LPAホスファターゼは、 N末端に 40個のアミノ酸残基からなるシグナルペプチドを含み、 421個のアミノ酸残基を有する新規のホスファターゼであつた。本発明のヒト L P Aホスファタ一ゼのァミノ酸配列を公知のホスファタ一ゼと比較すると、酸性ホスファタ一ゼと相同性があり、特に活性領域では高い相同性を示した。実施例 2

ヒト LPAホスファタ一ゼの大腸菌における発現

実施例 1で得られたヒト L P Aホスファターゼは、 N末端にシグナルぺプチドを含んでいる。かかる蛋白質を大腸菌で発現させた場合に、シグナルペプチドが切断される可能性があり、ヒト LP Aホスファターゼの N末端を他の蛋白質と融合させた蛋白質を大腸菌で発現 ·精製する場合に、シグナルべプチドの切断による精製の困難さとホスファタ一ゼ活性の低下が予想される。そこで、本実施例においては、シグナルべプチドをコ一ドする配列を含む構築物と含まない構築物とを作製した。

実施例 1の二次スクリ一ニングで得られた p B l u e s c r i p t ^R II SK (一）にクロ一ニングされた LPAホスファターゼ cDNAを鐯型とし、下記プライマー：

( 1 ) シグナルべプチドなし

フォワード： 5' -(cgcggatcc)ctgaagttgaaaatggtgcag-3' (配列番号： 1 1 ) リバース： 5' - (cgcggatcc)agttactcttcatttccaacttc- 3' (配列番号： 1 2)

(2) シグナルペプチドあり

フォワード： 5' -(cgcggatcc)atgcgcttgtggaccccag-3' (配列番号： 1 3) リバース： 5' -(cgcggatcc)agttactcttcatttccaacttc- 3' (配列番号： 1 2) (ここで、カツコ内の ggatccは B amH I部位を示す）

を用いて PCRを行なった。

温度サイクルは、

9 5 °C、 3分

9 5°C、 30秒、 5 5°C、 1分、 72 °C、 2分を 1 0サイクル

9 5°C、 3 0秒、 72°C、 2分を 3 0サイクル

72 °C、 1 0分

であった。得られた 2種類の PCR増幅物を BamH I制限酵素（NEW ENGLAND Biolabs 製）で切断し、 1 %ァガロースゲル電気泳動に付した。当該ゲルを臭化工チジゥムで染色後、 UV下でバンドを切り出し、ジーンクリーンキット II (BI0 101 製 ) で DNA断片を精製し、 BamH I制限酵素 (TAKARA製）で切断した pB 1 υ e s c r i p t^R II KS (―) (STRATAGENE社製）にサブクローニングした。クローニングした DNA断片の配列を実施例 1と同様に決定し、確認した後、 BamH I制限酵素で切り出した DNA断片を、 BamH I制限酵素で切断した pGEX- 2T (フアルマシアバイオテク社製）と連結させた。

得られた 2種類の発現構築物を、 JM1 09コンビテント細胞に形質転換し、形質転換体を得た。対数増殖期の当該形質転換体（ 200 mlの L培地）を、 2 5°Cで、 4時間培養した後、 400〃 1の1!\^ I PTGを添加し、さらに 2時間培養した。 4°C、 8000 r pmで 1 5分間遠心分離して菌体を回収した。 5 mlの緩衝液〔50mM Tr i s - HC 1 (pH 7. 6) 、 1 mM EDTA 〕を加えて、超音波処理により菌体を破砕し、 4°C、 1 5000 r pmで 30分間超遠心分離して上清を得た。

得られた上清を、前記緩衝液で平衡化しておいたグルタチオンビーズ（Glutat ione Sepharose ^R 4B、フアルマシアバイオテク社製）と混合し、 4°Cでー晚攪拌した。当該ビーズを 0. 5M NaC lを含むダルベッコリン酸バッファー PBS (一）で洗浄した後、 200 1のグル夕チオン液で 3回溶出した。

溶出物の 1 0 1を 1 2. 5%SDS— PAGEに付して、クーマシ一プリリアントブルーで染色したところ、目的のサイズ（約 71 kDa) の GST— LP Aホスファタ一ゼが確認された。また、シグナルペプチドの有無による発現量の差はなかった。

前記溶出物の 5 1を用いて、試験例 1に記載の方法にしたがって、 LP Aホスファタ一ゼ活性を測定した。その結果、 GST— LPAホスファタ一ゼは、シグナルぺプチドの有無に関わらず、同等の LP Aホスファタ一ゼ活性を示した。実施例 3

6 x Hisタグ標識 LP A Pの調製

宿主細胞として大腸菌を選択し、発現ベクターとして pQE— 30 (Q I AG EN) を使用した。

実施例 1の二次スクリーニングで得られた pB l u e s c r i p t^R II SK (―) にクローニングされた LPAホスファタ一ゼ cDNAを铸型とし、下記プライマー：

フォワード： 5' -(cgcggatcc)ctgaagttgaaaatggtgcag-3' (配列番号 : 1 1) リバース： 5' - (cgcggatcc)agttactcttcatttccaacttc-3' (配列番号： 1 2) (ここで、カツコ内の ggatccは B amH I部位を示す）

を用いて PCRを行なった。

温度サイクルは、

95 °C、 3分

95°C、 30秒、 55°C、 1分、 72°C、 2分を 1 0サイクル

95°C、 30秒、 72°C、 2分を 30サイクル

72 °C、 1 0分

である。

得られた PCR増幅物を B amH I制限酵素（NEW ENGLAND Biolabs製）で切断し、 1 %ァガロースゲル電気泳動に付した。当該ゲルを臭化工チジゥムで染色後、 UV下でバンドを切り出し、ジーンクリーンキット II (BI0 101 製）で DN A断片を精製し、 B amH I制限酵素 (TAKARA製）で切断した p B 1 υ e s c r i p t^R I〖 KS (—）（STRATAGENE社製）にサブクローニングした。

サブクローニングした DNA断片の塩基配列を決定し、同一であること確認した後、 B amH I制限酵素で切り出したインサート部分の DNA断片を、 Bam H Iで切断された pQE— 30 (Q IAGEN) と連結させた。得られた発現構築物で JM1 09コンビテント細胞を形質転換し、形質転換体を得た。対数増殖期の当該形質転換体（ 200 mlの L培地）を、 25でで、 4 時間培養した後、 400 lの 1M I PTGを添加し、さらに 2時間培養した。 4°C、 8000 r pmで 1 5分間遠心分離して菌体を回収した。 5 m 1の緩衝液〔50mM NaH₂ P〇₄ 30 OmM NaC l (pH 8. 0) 〕を加えて、超音波処理により菌体を破砕し、 4°C、 1 5000 r pmで 30分間超遠心分離して上清を得た。

得られた上清を前記緩衝液で平衡化しておいた N i—NTAァガロース（Q I AGEN) と混合し、 4 °Cで一晩攪拌した。当該ァガロースを洗浄用緩衝液〔5 OmM NaH₂ P 0₄ 30 OmM Na C 1 1 0 %グリセロール（ p H 6 . 0 ) 〕で洗浄した後、 200 1の溶出液（洗浄用緩衝液に 250 mMイミダゾ一ルを加える）で 3回溶出した。

溶出物を 1 2. 5 %SDS— PAGEに付して、クマシ一ブリリアントブル一で染色したところ、目的のサイズ（約 44 kDa) の 6 x Hisタグ標識 LPAP が確認された。

発現した 6 X Hisタグ標識 LPAPは 6 X Hisタグ標識蛋白質と非常に高い親和性を持つ N i -NTA (ニッケルニトリ口三酢酸）マトリックスにより精製することができた。

実施例 4

測定用試薬の調製

以下の測定用試薬（試薬 A、試薬 B) を調製した。

試薬 A

緩衝成分（O. lM Tr i s) 1 0 Ommo 1/1 非イオン性界面活性剤（Tr i t on X- 1 00)

0. 0 1重量％

NAD+ 2mm o 1 / 1 イノシン 5 mm 01 / 1 プリンヌクレオシドホスホリラーゼ 1 U/m 1

キサンチンデヒドロゲナーゼ 2UZml

pH8. 2 試薬 B

緩衝成分（O. lM Tr i s) 1 0 Ommo 1 /1 非イオン性界面活性剤（Tr i t on X- 1 00)

0. 0 1重量％組換え L PAホスファターゼ 0. 08mgZml ( 6mU/m 1 ) pH8. 2

1ーォレオイル LP Aを、界面活性剤（Tr i t on X- 1 00) を含む生理食塩水に溶解し、終濃度約 0. 1、 0. 2、 0. 3mmo 1ノ1になるように試料を調製した。

試料 8 1に試薬 A 240 1を加え、 37 °Cで 5分間反応させた後、試薬 B 80 / 1を加えて更に 37°C、 5分間反応させ、試薬盲検を対照に、試薬 B添加後 5分間の波長 340 nmにおける吸光度変化量を測定した。試薬盲検は、試料として精製水を用いて行なった。第 8図に示されるように、原点を通る検量線が得られた。実施例 5

測定用試薬の調製

以下の測定用試薬（試薬 a、試薬 b) を調製した。

s^ a

緩衝成分（0. 1 M HE PES) 1 00 mm o 1 / 1 非ィォン性界面活性剤（Tr i t on X— 1 00)

0. 0 1重量％ペルォキシダーゼ 1 0 U/m 1

プリンヌクレオシドホスホリラーゼ 0. 5 U/m 1 キサンチンォキシダーゼ 3 U/m 1

イノシン 3 mm o ϊ / \

N—ェチルー N— ( 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）一3—メチルァ, リン 5 mm 0 \ / \

pH 7. 7 試薬 b

緩衝成分（0. 1M HEPES) 1 0 Ommo 1/1 非ィォン性界面活性剤（Tr i t on X— 1 00)

0. 0 1重量％

4—ァミノアンチピリン l Ommo lZl 組換え LPAホスファターゼ 0. 08mg/ml ( 6mU/m 1 ) pH 7. 7 1一パルミトイル LPA、 1ーステアロイル LPA、 1ーォレオイル LPA、 2—ォレオイル LPA、 1—リノレオイル LPA、 1一ァラキドノィル LPA等の各種 LP Aを、界面活性剤を含む生理食塩水に溶解し、 0. 2mmo lZlの試料を調製した。試料 8 1に試薬 a 240 1を加え、 37でで 5分間反応させた後、試薬 80^ 1を加えて更に 37°C、 5分間反応させ、試薬盲検を対照に、試薬 b添加後 5分間の波長 570 nmにおける吸光度変化量を測定した。第 9図に示すように、本測定用試薬を用いると、ァシル基の脂肪酸種が異なる種々の LP Aを測定することが可能である。 1—ォレオイル L P Aの反応タイムコースを第 1 0図に示す。このように試薬 b添加後に吸光度は急速に上昇し、数分でピークに達した。また、 1, 2—ジパルミトイルホスファチジン酸（ 1 , 2 —ジパルミトイル PA) 、 1—パルミトイルホスファチジルエタノールァミン（ 1—パルミトイル LP E) 、 1一パルミトイルホスファチジルコリン（ 1一パルミトイル LPC) などの各種リン脂質を界面活性剤を含む生理食塩水に溶解し、 0. 2mmo 1/1の試料を調製し、同様の操作にて吸光度を測定した。

第 1 1図に示すように、本測定用試薬を用いた場合、 LPAを特異的に測定し、 PA、 LPE、 LPCなどの他のリン脂質はほとんど測定されえない。

さらに市販管理血清、 0. 2mMの 1—ォレオイル L P Aならびに市販管理血清に 1—ォレオイル L PAを 0. 2 mMになるように添加した試料について、同様の操作にて吸光度変化量を測定した。それぞれ得られた吸光度変化量から、下 g己式：

[市販管理血清と 1-ォレオイル LPAの混合物の吸光度変化量]

測定精度 = X100

[市販管理血清の吸光度変化量] + [1-ォレオイル LPAの吸光度変化量]

に従って、 LP Aの測定精度（％) を算出した。なお、測定精度は、値が 1 00 に近いほど精度が高いことを示す。その結果を表 2に示す。表 2

測定精度 ( % ) = 100. 3

表 2の結果より、測定精度は 1 0 0 . 3 %であり、試料が血清中の L P Aであつても、他の血清成分の影響を受けることなく、測定することができることが示される。均等物

本発明は、その精神または主要な特徴から逸脱することなく、他のいろいろな形で実施することができる。そのため、前述の実施例はあらゆる点で単なる例示にすぎず、限定的に解釈してはならない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によつて示すものであり、明細書本文には、なんら拘束されない。さらに特許請求の範囲の均等範囲に属する変形や変更は、すべて本発明の範囲内である。

産業上の利用可能性

本発明により、 L P Aを特異的に加水分解する組換え L P Aホスファターゼ等が提供される。また、本発明により、 L P Aの代謝経路が解明し、さらには、 L P Aまたは L P Aホスファタ一ゼが関与する様々な疾患の診断や治療が可能となる。さらに、本発明により、臨床検査分野において疾患等の指標として有望な L P Aの測定を、従来法のような煩雑な操作を必要とせず、より簡易に行なうことができ、かつ多数の被検試料について行なうことができるため、汎用型生化学自動分析装置への適用も可能であり有用性が高い。

Claims

請求の範囲

1. (a) 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする DNA、

(c)配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNA、

(d) 配列番号： 2に記載の塩基配列において、 1個以上の塩基が欠失、置換、揷入または付加された塩基配列からなる D N A、および

(e) 前記（a)〜（d) のいずれかの DN Aにストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DNA、

からなる群より選択された DN Aであって、リゾホスファチジン酸ホスファタ一ゼをコ一ドする DNA。

2. 請求項 1記載の DNAによりコードされる蛋白質。

3. 請求項 1記載の D N Aを含有してなる発現べクタ一。

4. 請求項 3記載の発現べクタ一を含む形質転換体。

5. 請求項 4記載の形質転換体を、請求項 3記載の発現ベクターからの蛋白質の発現が可能な条件下で培養する工程を含む、組換えリゾホスファチジン酸ホスファターゼの製造方法。

6. 請求項 2記載の蛋白質に特異的に結合しうる抗体またはその断片。

7. 請求項 1記載の DN Aと相補的な配列を有する、 8塩基以上からなるアンチセンス DNAまたはアンチセンス RNA。

8. 請求項 1記載の D N Aに特異的にハイブリダィズしうるプローブまたはプライマー。

9. 請求項 2記載の蛋白質と被検試料とを混合するステップを含む、 LP Aの測定法。

1 0. 請求項 2記載の蛋白質によるリゾホスファチジン酸の加水分解産物の有無を該リゾホスファチジン酸の存在または非存在の指標として用いる、請求項 9 記載の LP Aの測定法。

1 1. リゾホスファチジン酸の加水分解産物として、リン酸またはモノァシルグリセロールを測定する、請求項 1 0記載の LP Aの測定法。

1 2. 請求項 2記載の蛋白質を含有してなる、 LPAの測定用試薬。

1 3. さらに、リン酸またはモノァシルグリセロールの測定のための試薬を含有してなる、請求項 1 2記載の LP Aの測定用試薬。

1 4. 請求項 1 2または 1 3記載の LPAの測定用試薬を含有してなる LPA が関与する疾患の診断用キット。