CN117224659A

CN117224659A - 用于芳基硫酸酯酶a的cns递送的方法和组合物

Info

Publication number: CN117224659A
Application number: CN202311189440.1A
Authority: CN
Inventors: M·瓦西莱夫斯基; A·维伽泰科
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2023-12-15
Also published as: EP3416678A1; BR112018016874A2; MX2018009937A; US20200179492A1; MA44237A; US20210315981A1; CA3014909A1; CN108883162A; JP2019509270A; AU2017220100A1; WO2017143233A1; US11020461B2; JP2023159405A; AU2017220100B2; JP2021169528A

Abstract

提供了治疗异染性脑白质营养不良的方法，其包括给需要治疗的受试者施用治疗有效量的重组芳基硫酸酯酶A酶。

Description

用于芳基硫酸酯酶A的CNS递送的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请是申请号为201780022756.8、申请日为2017年02月17日、发明名称为“用于芳基硫酸酯酶A的CNS递送的方法和组合物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请要求于2016年2月17日提交的美国临时申请62/296,563以及于2017年2月2日提交的美国临时申请62/453,864的优先权；所述美国临时申请在此以引用的方式全文引入。

背景技术

酶替代疗法(ERT)涉及向受试者全身施用天然的或重组衍生的蛋白质和/或酶。批准的疗法通常静脉内施用于受试者，并且一般在治疗潜在的酶缺乏症的躯体症状方面有效。由于静脉内施用的蛋白质和/或酶有限地分布到中枢神经系统(CNS)的细胞和组织内，具有CNS病因的疾病的治疗特别具有挑战性,因为静脉内施用的蛋白质和/或酶无法足够地穿过血脑屏障(BBB)。

血脑屏障(BBB)是由内皮细胞组成的结构系统，其通过限制此类物质扩散穿过BBB并进入下面的脑脊髓液(CSF)和CNS内，作用于保护中枢神经系统(CNS)免受血流中的有害物质，如细菌、大分子(如蛋白质)和其它亲水性分子。

存在绕过BBB以增强治疗剂的脑递送的几种方法，所述方法包括直接颅内注射、BBB的瞬时透化、以及活性剂的修饰以改变组织分布。将治疗剂直接注射到脑组织内完全绕过脉管系统，但主要具有由颅内注射引起的并发症(感染、组织损伤、免疫反应)的风险和活性剂从施用部位的扩散不良的缺点。迄今为止，由于扩散障碍和可施用的治疗剂的有限量，将蛋白质直接施用到脑物质内尚未获得显著的疗效。已经由使用缓慢的长期输注放置在脑实质中的导管研究了对流辅助扩散(Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91,2076-2080(1994)；Nguyen等人，J.Neurosurg.98,584-590(2003))，但目前没有批准的疗法使用这种方法用于长期治疗。另外，脑内导管的放置是非常侵入性的并且作为临床替代方案是较不期望的。

蛋白质对脑脊髓液(CSF)的鞘内(IT)注射或施用，也已进行尝试但尚未取得治疗成功。该治疗中的主要挑战是活性剂非常紧密地结合心室室管膜衬里的趋势，这阻止了随后的扩散。目前，不存在通过直接施用于CSF用于治疗脑遗传疾病的批准产品。

事实上，许多人认为对大脑的表面处的扩散的障碍、以及有效和方便的递送方法的缺乏，对于在任何疾病的大脑中获得足够的疗效都是太大的障碍。

许多溶酶体贮积症影响神经系统，并且因此在用传统疗法治疗这些疾病方面证实独特的挑战。在受影响的个体的神经元和脑膜中通常存在糖胺聚糖(GAG)的大量积累，导致各种形式的CNS症状。迄今为止，没有来源于溶酶体病症的CNS症状已通过任何可用的方法成功地治疗。

因此，仍然存在将治疗剂有效递送到大脑的极大需要。更具体地，存在将活性剂更有效地递送到中枢神经系统用于治疗溶酶体贮积症的极大需要。

发明内容

本发明尤其提供了通过芳基硫酸酯酶A的鞘内递送用于治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的组合物和方法。

在某些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。

在一些实施例中，重组ASA酶的施用还导致一种或多种认知功能、适应功能和/或执行功能的改善、稳定或减少下降。

在一些实施例中，一种或多种运动功能包括粗大运动功能。在一些实施例中，通过粗大运动功能测量(GMFM)测试例如GMFM-88评价粗大运动功能。在一些实施例中，受试者的基线GMFM-88评分大于40％。在一些实施例中，患者的基线GMFM-88评分小于40％。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的下降小于10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的基本稳定。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的改善。

在某些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以降低相对于生物标记物的基线水平在体液中在MLD中累积的生物标记物水平的治疗期，所述体液选自脑脊髓液、尿、血液和血清。在一些实施例中，生物标记物选自硫苷脂、溶血硫苷脂及其组合。在一些实施例中，生物标记物是硫苷脂。在一些实施例中，体液是脑脊髓液。

在一些实施例中，脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于约0.1μg/mL。在一些实施例中，脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于约0.2μg/mL。在一些实施例中，脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于约0.3μg/mL。

在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致脑脊髓液中多于约0.1μg/mL的硫苷脂水平减少。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致脑脊髓液中多于约0.2μg/mL的硫苷脂水平减少。

在某些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以增加相对于生物标记物的基线水平在脑组织中的MLD中降低的生物标记物水平的治疗期。

在一些实施例中，脑组织是脑的深白质。在一些实施例中，生物标记物是代谢产物，例如N-乙酰天冬氨酸。在一些实施例中，通过质子磁共振波谱评价N-乙酰天冬氨酸的水平。

在某些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以稳定或减少相对于基线的脑损伤受累的治疗期。

在一些实施例中，通过MLD MRI(磁共振成像)严重性评分来评价脑损伤受累。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致受试者中的MLD MRI严重性评分相对于基线的减少。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致受试者中的MLD MRI严重性评分相对于基线的稳定。

在一些实施例中，治疗有效剂量是10mg或大于10mg。在一些实施例中，治疗有效剂量是30mg或大于30mg。在一些实施例中，治疗有效剂量是100mg或大于100mg。在一些实施例中，治疗有效剂量小于200mg。

在一些实施例中，施用间隔是每周一次。在一些实施例中，施用间隔是每两周一次。在一些实施例中，施用间隔是每月一次。

在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，受试者是十六岁或更小。在一些实施例中，受试者是十二岁或更小。在一些实施例中，受试者是九岁或更小。在一些实施例中，受试者是六岁或更小。在一些实施例中，受试者是四岁或更小。在一些实施例中，受试者是三岁或更小。在一些实施例中，受试者是两岁或更小。在一些实施例中，受试者是18个月或更小。在一些实施例中，受试者是12个月或更小。

在一些实施例中，受试者是6个月或更小。

在一些实施例中，受试者已显示出异染性脑白质营养不良的至少一种症状。在一些实施例中，受试者未显示出异染性脑白质营养不良的任何症状。在一些实施例中，受试者已被诊断有异染性脑白质营养不良。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定为处于发展异染性脑白质营养不良的风险中。

在一些实施例中，将芳基硫酸酯酶A施用到椎管内。在一些实施例中，将芳基硫酸酯酶A施用到腰区内。在一些实施例中，芳基硫酸酯酶A通过腰椎穿刺进行施用。

在一些实施例中，鞘内施用是通过对植入的鞘内药物递送装置(IDDD)的间歇或连续接近。

在一些实施例中，治疗期为至少6个月。在一些实施例中，治疗期为至少9个月。在一些实施例中，治疗期为至少12个月。在一些实施例中，治疗期为至少24个月。在一些实施例中，治疗期为至少26个月。

在一些实施例中，在受试者中未观察到与重组芳基硫酸酯酶A的施用相关的严重副作用。

在某些实施例中，提供了用于包括以下步骤的方法中的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶：向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。

在某些实施例中，提供了用于包括以下步骤的方法中的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶：向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以降低相对于基线的脑脊髓液(CSF)中的硫苷脂水平的治疗期。

在某些实施例中，提供了用于包括以下步骤的方法中的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶：向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以稳定或减少相对于基线的脑损伤受累的治疗期。

在某些实施例中，提供了重组芳基硫酸酯酶A酶在制造用于治疗或预防异染性脑白质营养不良的药物中的用途，其中所述治疗包括以下步骤：向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。

在某些实施例中，提供了重组芳基硫酸酯酶A酶在制造用于治疗或预防异染性脑白质营养不良的药物中的用途，其中所述治疗包括以下步骤：向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以降低相对于基线的脑脊髓液(CSF)中的硫苷脂水平的治疗期。

在某些实施例中，提供了重组芳基硫酸酯酶A酶在制造用于治疗或预防异染性脑白质营养不良的药物中的用途，其中所述治疗包括以下步骤：向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以稳定或减少相对于基线的脑损伤受累的治疗期。

在一些实施例中，重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组ASA酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一些实施例中，重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于四个错配。在一些实施例中，重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于三个错配。在一些实施例中，重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQID NO:1的氨基酸序列的不多于两个错配。

在一些实施例中，重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于一个错配。

附图说明

图1示出了在患有异染性脑白质营养不良(MLD)的儿童中，鞘内递送的重组人芳基硫酸酯酶A的1/2期、非随机、开放标签、40周、剂量递增临床研究的设计。IDDD：鞘内药物递送装置；rhASA：重组人芳基硫酸酯酶A。

图2显示了在实例1中描述的1/2期临床研究中的第40周时，三个治疗组(10mg、30mg和100mg rhASA)各自中作为百分比的粗大运动功能测量-88(GMFM-88)总分(从基线开始)的变化。所示数据是最小二乘平均值；误差线表示标准误。基线数据呈现为平均值±标准差。通过协方差分析(ANCOVA)分析组间的比较，其中GMFM-88评分中从基线开始的变化作为应变量，并且剂量组和基线值作为协变量。

图3显示了来自实例1中描述的临床研究的患者中的治疗效应(如通过GMFM-88总分(％)中从基线开始的变化测量的)相对于基线GMFM-88总分(％)。圆圈：10mg rhASA；方块：30mg rhASA；菱形：100mg rhASA。

图4显示了实例1中描述的临床研究中的所有治疗组中的GMFM-88总分(％)的变化，其中来自GMFM-88基线总分大于40％的那些患者的值在分开的条中展示。黑色实心条显示了所有患者的数据，而白色实心条显示了仅基线GMFM-88总分大于40％的患者的数据。图中的数据呈现为平均值，其中误差条指示标准差。基线数据呈现为平均值±标准差。

图5显示了实例1中描述的临床研究入选的患者，在第40周时的异染性脑白质营养不良磁共振成像(MRI)严重性评分变化。所示数据是最小二乘平均值；误差线表示标准误。基线数据呈现为平均值±标准差。通过使用最小二乘平均值调整不平衡基线值。

图6显示了实例1中描述的临床研究入选的患者，在第40周时脑脊髓液中的硫苷脂水平。所示数据呈现为平均值；误差线表示标准差。基线数据呈现为平均值±标准差。

图7显示了临床研究中入选的患者中通过群组随着时间推移的脑脊髓液中的硫苷脂水平(以μg/ml计)变化。数据包括来自至少两个同胞对的数据。显示了关于施用10mg、30mg和100mg重组人芳基硫酸酯酶A的患者的数据。

图8示出了在患有异染性脑白质营养不良(MLD)的儿童中，鞘内递送的重组人芳基硫酸酯酶A的1/2期、开放标签、非对照、长期延伸临床研究的设计。

图9A和9B证实了经过104周的治疗，鞘内递送的rhASA对运动功能的作用。图9A显示了通过研究就诊关于每个群组的平均GMFM-88总分。图9B显示了经过104周的治疗，通过患者年龄的各个GMFM-88总分。

图10显示了在104周治疗后，鞘内递送的rhASA对MRI-MLD严重性评分的作用。基线评分显示为在基线时的平均值±标准差总MRI-MLD严重性评分(评分范围为0至34，其中评分越高指示疾病严重性越大)。

图11A和11B显示了经过104周的治疗，鞘内递送的rhASA对脑白质中的平均NAA/肌酸代谢产物比的作用。右额叶白质显示于图11A中，并且右额顶叶白质显示于图11B中。数据显示为平均值±标准误。

图12显示了经过104周的治疗，鞘内递送的rhASA对CSF硫苷脂浓度的作用。数据显示为平均值±标准差。

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其它术语的另外定义在说明书各处阐述。

大约或约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。

改善：如本文使用的，术语“改善”意指状态的预防、减少或缓和，或受试者状态的改进。改善包括但不要求疾病或状况的完全恢复或完全预防。在一些实施例中，改善包括增加在相关疾病组织中缺乏的相关蛋白质或其活性的水平。

基线：如本文使用的，术语“基线”指治疗期开始前，通常在治疗开始时的值、水平、状态、状况等。

生物活性的：如本文使用的，短语“生物活性的”指在生物系统中，且特别是在生物体中具有活性的任何试剂的特征。例如，当施用于生物时，对该生物体具有生物效应的试剂视为生物活性的。在特定实施例中，当蛋白质或多肽是生物活性的时，共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常被称为“生物活性”部分。

填充剂：如本文使用的，术语“填充剂”指对冻干的混合物增加质量，并且促成冻干团块的物理结构(例如，促进基本上均匀的冻干团块的生产，所述冻干团块维持开放的孔隙结构)的化合物。示例性填充剂包括甘露醇、甘氨酸、氯化钠、羟乙基淀粉、乳糖、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇和葡聚糖。

阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)：如本文使用的，术语“阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”指结合高尔基体中的酸性水解酶前体上的甘露糖-6-磷酸(M6P)标签的细胞受体，其预定用于转运至溶酶体。除甘露糖-6-磷酸之外，CI-MPR还结合其它蛋白质，包括IGF-II。CI-MPR也称为“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“IGF-II受体”或“IGF2受体”。这些术语及其缩写在本文中可互换使用。

同时免疫抑制剂疗法：如本文使用的，术语“同时免疫抑制剂疗法”包括用作预处理、预条件化或与处理方法平行的任何免疫抑制剂疗法。

稀释剂：如本文使用的，术语“稀释剂”指可用于制备重构制剂的药学可接受的(例如，对于施用于人安全和无毒的)稀释物质。示例性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸缓冲盐溶液)、无菌盐水溶液、林格溶液或右旋糖溶液。

剂型：如本文使用的，术语“剂型”和“单位剂型”指用于待治疗患者的治疗性蛋白质的物理上离散的单元。每个单元含有经计算可产生所需疗效的预定数量的活性物质。然而，应理解，组合物的总剂量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。

酶替代疗法(ERT)：如本文使用的，术语“酶替代疗法(ERT)”指通过提供缺失的酶来纠正酶缺乏的任何治疗策略。在一些实施例中，通过鞘内施用提供缺失的酶。在一些实施例中，通过输注到血流内提供缺失的酶。一旦施用，酶就被细胞吸收并转运至溶酶体，在其中酶作用于消除由于酶缺乏已在溶酶体中累积的材料。通常，为了使溶酶体酶替代疗法有效，将治疗性酶递送至靶组织中的适当细胞中的溶酶体，在其中贮存缺陷是明显的。

改进、增加或减少：如本文使用的，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等价物指示相对于基线测量的值，例如在本文所述治疗开始之前在同一个体中的测量，或在不存在本文所述治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。“对照个体”是患有与待治疗个体相同形式的溶酶体贮积病的个体，其与待治疗个体约相同年龄(以确保所治疗的个体和对照个体中的疾病阶段是可比较的)。

个体、受试者、患者：如本文使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”指人或非人哺乳动物受试者。待治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)是患有疾病的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人)。

鞘内施用：如本文使用的，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”指注射到椎管(脊髓周围的鞘内空间)内。可使用各种技术，包括腰椎穿刺。在一些实施例中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”指经由腰部区域或腰区的IT施用或递送，即腰部IT施用或递送。如本文使用的，术语“腰区”或“腰部区域”指第三和第四腰(腰背部)椎骨之间的区域，并且更包含地指脊柱的L2-S1区。

接头：如本文使用的，术语“接头”指在融合蛋白中除在天然蛋白质中的特定位置处出现的氨基酸序列外，并且一般设计为柔性或插入结构的氨基酸序列。接头也被称为间隔物。

冻干保护剂：如本文使用的，术语“冻干保护剂”指在冻干和随后贮存时防止或减少蛋白质或其它物质的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性的冻干保护剂包括糖，例如蔗糖或海藻糖；氨基酸，例如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁：多元醇，例如三羟基或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克；及其组合。在一些实施例中，冻干保护剂是非还原糖，例如海藻糖或蔗糖。

溶酶体酶：如本文使用的，术语“溶酶体酶”指能够减少哺乳动物溶酶体中的累积材料或者可挽救或改善一种或多种溶酶体贮积病症状的任何酶。适合于本发明的溶酶体酶包括野生型或经修饰的溶酶体酶两者，并且可使用重组方法和合成方法产生或者从天然源纯化。示例性溶酶体酶在表1中列出。

溶酶体酶缺乏：如本文使用的，“溶酶体酶缺乏”指来源于溶酶体中的至少一种酶缺乏的一组遗传病症，所述酶是将大分子(例如，酶底物)分解成肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸所需的。结果，患有溶酶体酶缺乏的个体已在各种组织(例如，CNS、肝、脾、肠、血管壁和其它器官)中累积了材料。

溶酶体贮积病：如本文使用的，术语“溶酶体贮积病”指来源于代谢天然大分子所必需的一种或多种溶酶体酶缺乏的任何疾病。这些疾病通常导致溶酶体中未降解的分子的累积，导致贮存颗粒(也称为贮存囊泡)的数目增加。下文更详细地描述了这些疾病和各种例子。

多肽：如本文使用的，“多肽”，一般而言，是通过肽键彼此附着的至少两个氨基酸的串。在一些实施例中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，所述氨基酸各自通过至少一个肽键与其它氨基酸附着。本领域普通技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或任选的其它实体，其仍然能够整合到多肽链内。

替代酶：如本文使用的，术语“替代酶”指可作用于至少部分替代待治疗疾病中缺乏或缺失的酶的任何酶。在一些实施例中，术语“替代酶”指可作用于至少部分替代待治疗的溶酶体贮积病中的缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施例中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中的累积材料、或者可拯救或改善一种或多种溶酶体贮积病症状。适合于本发明的替代酶包括野生型或经修饰的溶酶体酶两者，并且可使用重组方法和合成方法产生或从者天然源纯化。替代酶可为重组的、合成的、基因活化的或天然的酶。

可溶的：如本文使用的，术语“可溶的”指治疗剂形成同质溶液的能力。在一些实施例中，治疗剂在它在其内施用并且通过其将它转运至靶作用部位(例如，脑的细胞和组织)的溶液中的溶解度足以允许治疗有效量的治疗剂对靶作用部位的递送。几种因素可影响治疗剂的溶解度。例如，可影响蛋白质溶解度的相关因素包括离子强度、氨基酸序列和其它共增溶剂或盐(例如钙盐)的存在。在一些实施例中，配制药物组合物使得从这些组合物中排除钙盐。在一些实施例中，根据本发明的治疗剂可溶于其相应的药物组合物中。应了解，虽然等渗溶液一般优选用于肠胃外施用的药物，但等渗溶液的使用可限制某些治疗剂，且特别是一些蛋白质和/或酶的足够溶解度。轻度高渗溶液(例如，在以pH 7.0的5mM磷酸钠中高达175mM氯化钠)和含糖溶液(例如，在以pH 7.0的5mM磷酸钠中高达2％蔗糖)已证实在猴中是良好耐受的。例如，最常见的经批准的CNS推注制剂组合物是盐水(150mM NaCl水溶液)。

稳定性：如本文使用的，术语“稳定的”指治疗剂(例如重组酶)经过延长的时间段维持其治疗功效(例如其预期的生物活性和/或生理化学完整性的全部或大部分)的能力。治疗剂的稳定性和药物组合物维持此类治疗剂稳定性的能力可在延长的时间段内(例如，至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更久)进行评价。一般而言，本文所述的药物组合物已配制成使得它们能够稳定，或者可替代地减缓或预防与其一起配制的一种或多种治疗剂(例如重组蛋白质)的降解。在制剂的情况下，稳定制剂是其中的治疗剂在贮存时和在加工期间(例如冷冻/解冻、机械混合和冻干)基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性的制剂。对于蛋白质稳定性，它可通过高分子量(HMW)聚集体的形成、酶活性的损失、肽片段的生成和电荷分布的转变来测量。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括人。在本发明的某些实施例中，受试者是成人、青少年、儿童或婴儿。本发明还考虑了药物组合物的施用和/或子宫内治疗方法的执行。

基本同源性：短语“基本同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员应了解的，如果两个序列在相应位置含有同源残基，则它们一般视为“基本同源的”。同源残基可以为相同的残基。可替代地，同源残基可以是不相同的残基，具有适当相似的结构和/或功能特征。例如，如本领域普通技术人员众所周知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水”或“亲水”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸取代相同类型的另一种可经常被视为“同源”取代。

如本领域众所周知的，可使用各种算法中的任一种比较氨基酸或核酸序列，所述算法包括可在商业计算机程序中获得的那些算法，例如用于核苷酸序列和BLASTP的BLASTN、缺口BLAST和用于氨基酸序列的PSI-BLAST。示例性的这种程序在以下中描述：Altschul等人，Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:anew generation of protein database search programs”,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；和Misener等人，(编辑)，BioinformaticsMethods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press,1999。除鉴定同源序列之外，上述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施例中，如果其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关残基段上是同源的，则两个序列表示为基本同源。在一些实施例中，相关段是全序列。在一些实施例中，相关段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。

基本同一性：短语“基本同一性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员应了解的，如果两个序列在相应位置含有相同残基，则它们一般视为“基本相同的”。如本领域众所周知的，可使用各种算法中的任一种比较氨基酸或核酸序列，所述算法包括可在商业计算机程序中获得的那些算法，例如用于核苷酸序列和BLASTP的BLASTN、缺口BLAST和用于氨基酸序列的PSI-BLAST。示例性的这种程序在以下中描述：Altschul等人，Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysisof Genes and Proteins,Wiley,1998；和Misener等人，(编辑)，Bioinformatics Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press,1999。除鉴定相同序列之外，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施例中，如果其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关残基段上是相同的，则两个序列表示为基本相同。在一些实施例中，相关段是全序列。在一些实施例中，相关段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。

合成CSF：如本文使用的，术语“合成CSF”指具有与脑脊髓液一致的pH、电解质组成、葡萄糖含量和渗透压的溶液。合成CSF也称为人工CSF。在一些实施例中，合成CSF是Elliott的B溶液。

适合于CNS递送：如本文使用的，当它涉及本发明的药物组合物时，短语“适合于CNS递送”或“适合于鞘内递送”一般指此类组合物的稳定性、耐受性和溶解度性质，以及此类组合物将有效量的其中所含治疗剂递送到靶向递送部位(例如CSF或脑)的能力。

靶组织：如本文使用的，术语“靶组织”指受待治疗的溶酶体贮积病影响的任何组织、或其中正常表达缺陷型溶酶体酶的任何组织。在一些实施例中，靶组织包括在患有或易患溶酶体贮积病的患者中，其中存在例如贮存于组织的细胞溶酶体中的可检测或异常高量的酶底物的那些组织。在一些实施例中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。在一些实施例中，靶组织包括其中缺陷型溶酶体酶通常以升高的水平表达的那些组织。如本文使用的，靶组织可为脑靶组织、脊髓靶组织和/或外周靶组织。下文详细描述了示例性靶组织。

治疗部分：如本文使用的，术语“治疗部分”指赋予分子疗效的分子的一部分。在一些实施例中，治疗部分是具有治疗活性的多肽。

治疗有效量：如本文使用的，术语“治疗有效量”指治疗性蛋白质(例如替代酶)的量，其以可应用于任何医学处理的合理益处/风险比对治疗的受试者赋予疗效。疗效可为客观的(即，可通过一些测试或标记物测量的)或主观的(即，受试者给出效果的指示或感觉到效果)。特别地，“治疗有效量”指例如通过改善与疾病相关的症状、预防或延迟疾病的发作、和/或还减轻疾病症状的严重性或频率，有效治疗、改善或预防所需疾病或状况，或者显示出可检测的治疗或预防效应的治疗性蛋白质或组合物的量。治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如根据施用途径、与其它药物试剂的组合而变。另外，关于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；所采用的特定药学试剂的活性；所采用的具体成分；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所采用的特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域众所周知的相似因素。

可耐受的：如本文使用的，术语“可耐受的”和“耐受性”指本发明的药物组合物在此类组合物施用于其的受试者中不引发不良反应，或者可替代地在此类组合物施用于其的受试者中不引发严重的不良反应的能力。在一些实施例中，药物组合物可由此类组合物施用于其的受试者良好耐受。

治疗：如本文使用的，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟以下的发作、减少以下的严重性和/或减少以下的发生率的治疗性蛋白质(例如，溶酶体酶)的任何施用：特定疾病、病症和/或状况(例如，异染性脑白质营养不良)的一种或多种症状或特征。这种治疗可为并未显示出相关疾病、病症和/或状况的体征的受试者具有的，和/或仅显示出疾病、病症和/或状况的早期体征的受试者具有的。可替代地或另外地，此类治疗可为显示出相关疾病、病症和/或状况的一种或多种确定体征的受试者具有的。

具体实施方式

本发明尤其提供了用于将治疗剂有效直接递送至中枢神经系统(CNS)的改进方法和组合物。本发明基于以下出乎意料的发现：用于溶酶体贮积病(例如，异染性脑白质营养不良疾病)的替代酶(例如，ASA蛋白)可直接以高浓度引入需要治疗的受试者的脑脊髓液(CSF)内，而不在受试者中诱导显著副作用。更令人惊讶的是，本发明人发现替代酶可在简单的盐水或基于缓冲剂的制剂中递送，而无需使用合成的CSF。甚至更出乎意料的是，根据本发明的鞘内递送不在受试者中导致显著副作用，例如严重的免疫应答。因此，在一些实施例中，根据本发明的鞘内递送可在不存在同时的免疫抑制剂治疗的情况下使用(例如，而无通过预处理或预条件化的免疫耐受诱导)。

在一些实施例中，根据本发明的鞘内递送允许跨越各种脑组织的有效扩散，导致替代酶在表面、浅层和/或深层脑区中的各种靶脑组织中的有效递送。在一些实施例中，根据本发明的鞘内递送导致足够量的替代酶进入外周循环。结果，在一些情况下，根据本发明的鞘内递送导致在外周组织(例如肝、心脏、脾和肾)中的替代酶递送。该发现是出乎意料的，并且对于具有CNS和外周组分两者的溶酶体贮积病的治疗可为特别有用的，这通常需要定期鞘内施用和静脉内施用两者。考虑根据本发明的鞘内递送可允许iv注射的减少剂量和/或频率，而不妥协治疗外周症状中的疗效。

本发明提供各种出乎意料和有益的特征，其允许替代酶对各种脑靶组织的有效和方便递送，导致具有CNS适应症的溶酶体贮积病的有效治疗。

下述节段详细描述了本发明的各个方面。节段的使用并不意味着限制本发明。每个节段可适用于本发明的任何方面。在本专利申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。

重组芳基硫酸酯酶A酶

在一些实施例中，由本发明提供的本发明方法和组合物用于将重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶递送至CNS，用于治疗异染性脑白质营养不良疾病。合适的ASA酶可为任何分子或分子的一部分，其可取代天然存在的芳基硫酸酯酶A(ASA)酶活性、或者拯救与ASA缺陷相关的一种或多种表型或症状。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶是具有N末端和C末端以及与成熟的人ASA酶基本上相似或相同的氨基酸序列的多肽。

通常，人ASA作为被加工为成熟形式的前体分子产生。该过程一般通过去除18个氨基酸的信号肽而发生。通常，前体形式也称为全长前体或全长ASA酶，其含有507个氨基酸。N末端18个氨基酸被切割，导致长度489个氨基酸的成熟形式。因此，考虑N末端18个氨基酸一般不是ASA酶活性所需要的。表1中显示了典型野生型或天然存在的人ASA酶的成熟形式(SEQ ID NO:1)和全长前体(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

表1

因此，在一些实施例中，本发明中的重组芳基硫酸酯酶A是成熟的人ASA蛋白(SEQID NO:1)。在一些实施例中，合适的重组芳基硫酸酯酶A可为成熟的人ASA蛋白的同源物或类似物。例如，成熟的人ASA蛋白的同源物或类似物可为与野生型或天然存在的ASA蛋白(例如，SEQ ID NO:1)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留基本的ASA蛋白活性的经修饰的成熟的人ASA蛋白。因此，在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A与成熟的人ASA蛋白(SEQ ID NO:1)基本上同源。在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A具有与SEQ ID NO:1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的氨基酸序列。在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A与成熟的人ASA蛋白(SEQ ID NO:1)基本上相同。在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A具有与SEQ ID NO:1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。例如，在一些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有一些错配，例如与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个错配。

在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A含有成熟的人ASA蛋白的片段或部分。在一些实施例中，片段或部分是催化活性的。

另外或可替代地，适合于本发明的替代酶是全长ASA蛋白。在一些实施例中，合适的替代酶可为全长人ASA蛋白的同源物或类似物。例如，全长人ASA蛋白的同源物或类似物可为与野生型或天然存在的全长ASA蛋白(例如，SEQ ID NO:2)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留基本ASA蛋白活性的经修饰的全长人ASA蛋白。因此，在一些实施例中，适合于本发明的替代酶与全长人ASA蛋白(SEQ ID NO:2)基本上同源。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶具有与SEQ ID NO:2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的氨基酸序列。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶与SEQ ID NO:2基本上相同。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶具有与SEQ ID NO:2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶含有全长人ASA蛋白的片段或部分。如本文使用的，全长ASA蛋白通常含有信号肽序列。

在一些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶包括靶向部分(例如，溶酶体靶向序列)和/或膜穿透肽。在一些实施例中，靶向序列和/或膜穿透肽是重组芳基硫酸酯酶A的固有部分(例如，经由化学连接，经由融合蛋白)。在一些实施例中，靶向序列含有甘露糖-6-磷酸部分。在一些实施例中，靶向序列含有IGF-I部分。在一些实施例中，靶向序列含有IGF-II部分。

在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A酶可具有野生型或天然存在的序列。在一些实施例中，适合于本发明的重组芳基硫酸酯酶A酶可具有经修饰的序列，其与野生型或天然存在的序列具有基本同源性或同一性(例如，与野生型或天然存在的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的序列同一性)。

例如，通过利用经改造为表达编码重组酶的核酸的宿主细胞系统，可重组产生适合于本发明的替代酶(例如，重组芳基硫酸酯酶A酶)。可替代地或另外地，可通过化学合成部分或完全制备替代酶。

当替代酶重组产生时，可使用任何表达系统。仅举几个例子，已知的表达系统包括例如卵、杆状病毒、昆虫、植物、酵母或哺乳动物细胞。

在一些实施例中，适合于本发明的酶在哺乳动物细胞中产生。根据本发明可使用的哺乳动物细胞的非限制性例子包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC编号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell，Leiden，荷兰)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。

在一些实施例中，根据本发明的发明方法用于递送由人细胞产生的替代酶。在一些实施例中，根据本发明的发明方法用于递送由CHO细胞产生的替代酶。

在一些实施例中，使用本发明的方法递送的替代酶含有与脑细胞的表面上的受体结合的部分，以促进细胞摄取和/或溶酶体靶向。例如，此类受体可为与阳离子不依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)，其结合甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。另外，CI-MPR还结合其它蛋白质，包括IGF-II。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶在蛋白质的表面上含有M6P残基。在一些实施例中，适合于本发明的替代酶可含有双磷酸化寡糖，其对CI-MPR具有更高的结合亲和力。在一些实施例中，合适的酶含有至多约平均约至少20％的双磷酸化寡糖/酶。在其它实施例中，合适的酶可含有约10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％的双磷酸化寡糖/酶。尽管此类双-磷酸化的寡糖可天然存在于酶上，但应该注意可修饰酶以具有这种寡糖。例如，合适的替代酶可被某些酶修饰，所述酶能够催化N-乙酰葡糖胺-L-磷酸从UDP-GlcNAc转移到溶酶体酶上的α-1,2-连接的甘露糖的6'位置。用于生产和使用此类酶的方法和组合物由例如Canfield等人在美国专利号6,537,785和美国专利号6,534,300中描述，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。

在一些实施例中，用于本发明的替代酶可与溶酶体靶向部分缀合或融合，所述溶酶体靶向部分能够结合脑细胞的表面上的受体。合适的溶酶体靶向部分可为IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段(例如，包括具有与野生型成熟的人IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的序列的那些肽)。

在一些实施例中，适合于本发明的替代酶仍未进行修饰，以增强此类药剂跨越BBB且进入CNS内的递送或转运。

在一些实施例中，治疗性蛋白质包括靶向部分(例如，溶酶体靶向序列)和/或膜穿透肽。在一些实施例中，靶向序列和/或膜穿透肽是重组芳基硫酸酯酶A的固有部分(例如，经由化学连接，经由融合蛋白)。在一些实施例中，靶向序列含有甘露糖-6-磷酸部分。在一些实施例中，靶向序列含有IGF-I部分。在一些实施例中，靶向序列含有IGF-II部分。

制剂

传统上用于将治疗剂递送至受试者的CNS的水性药物溶液和组合物(即制剂)包括未缓冲的等渗盐水和Elliott的B溶液，其是人造CSF。描述CSF相对于Elliott的B溶液的组成的比较包括在下表2中。如表2所示，Elliott的B溶液的浓度紧密平行CSF的浓度。然而，Elliott的B溶液含有非常低的缓冲剂浓度，并且相应地可能无法提供稳定治疗剂(例如蛋白质)所需的足够缓冲能力，尤其是经过延长的时间段(例如，在贮存条件下)。此外，Elliott的B溶液含有某些盐，所述盐可与预期递送某些治疗剂，且特别是蛋白质或酶的制剂不相容。例如，Elliott的B溶液中存在的钙盐能够介导蛋白质沉淀，并且从而降低制剂的稳定性。

表2

本发明提供了以水性、冻干前、冻干或重构形式的制剂，用于已配制为使得它们能够稳定、或者可替代地减缓或防止与其一起配制的一种或多种治疗剂(例如，重组蛋白质)的降解的治疗剂。在一些实施例中，本制剂提供了用于治疗剂的冻干制剂。在一些实施例中，本制剂提供了用于治疗剂的水性制剂。在一些实施例中，制剂是稳定制剂。

稳定制剂

如本文使用的，术语“稳定的”指治疗剂(例如重组酶)经过延长的时间段维持其治疗功效(例如，其预期的生物活性和/或生理化学完整性的全部或大部分)的能力。经过延长的时间段(例如，优选至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更长时间)，可评价治疗剂的稳定性和药物组合物维持此类治疗剂的稳定性的能力。在制剂的情况下，稳定制剂是其中的治疗剂在贮存时和在加工期间(例如冷冻/解冻、机械混合和冻干)基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性的制剂。对于蛋白质稳定性，它可通过高分子量(HMW)聚集体的形成、酶活性的损失、肽片段的生成和电荷分布的转变来测量。

治疗剂的稳定性就维持特定范围的治疗剂浓度而言具有特别重要性，所述治疗剂浓度是允许试剂发挥其预期治疗功能所必需的。经过延长的时间段，可相对于治疗剂的生物活性或生理化学完整性进一步评价治疗剂的稳定性。例如，在给定时间点时的稳定性可针对在较早时间点时(例如，在配制第0天时)的稳定性、或针对未配制的治疗剂进行比较，并且将该比较的结果表示为百分比。优选地，经过延长的时间段(例如，在室温或加速贮存条件下，经过至少约6-12个月测量的)，本发明的药物组合物维持至少100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％的治疗剂的生物活性或生理化学完整性。

治疗剂优选可溶于本发明的药物组合物中。当它涉及本发明的治疗剂时，术语“可溶的”指此类治疗剂形成同质溶液的能力。优选地，治疗剂在它在其内施用并且通过其将它转运至靶作用部位(例如，脑的细胞和组织)的溶液中的溶解度足以允许治疗有效量的治疗剂对靶作用部位的递送。几种因素可影响治疗剂的溶解度。例如，可影响蛋白质溶解度的相关因素包括离子强度、氨基酸序列和其它共增溶剂或盐(例如钙盐)的存在。在一些实施例中，配制药物组合物使得从这些组合物中排除钙盐。

以水性、冻干前、冻干或重构形式的合适制剂可含有以各种浓度的目的治疗剂(例如重组人芳基硫酸酯酶A)。在一些实施例中，制剂可含有目的蛋白质或治疗剂，其浓度范围为约0.1mg/ml至100mg/ml(例如，约0.1mg/ml至80mg/ml、约0.1mg/ml至60mg/ml、约0.1mg/ml至50mg/ml、约0.1mg/ml至40mg/ml、约0.1mg/ml至30mg/ml、约0.1mg/ml至25mg/ml、约0.1mg/ml至20mg/ml、约0.1mg/ml至60mg/ml、约0.1mg/ml至50mg/ml、约0.1mg/ml至40mg/ml、约0.1mg/ml至30mg/ml、约0.1mg/ml至25mg/ml、约0.1mg/ml至20mg/ml、约0.1mg/ml至15mg/ml、约0.1mg/ml至10mg/ml、约0.1mg/ml至5mg/ml、约1mg/ml至10mg/ml、约1mg/ml至20mg/ml、约1mg/ml至40mg/ml、约5mg/ml至100mg/ml、约5mg/ml至50mg/ml、或约5mg/ml至25mg/ml)。在一些实施例中，根据本发明的制剂可含有以至少或大约1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、或100mg/ml浓度的治疗剂。在一些实施例中，制剂含有以至少或大约25mg/ml浓度的治疗剂。在一些实施例中，制剂含有以至少或大约30mg/ml浓度的治疗剂。

本发明的制剂的特征在于它们作为水溶液或重构的冻干溶液的耐受性。如本文使用的，术语“可耐受的”和“耐受性”指本发明的药物组合物在此类组合物施用于其的受试者中不引发不良反应，或者可替代地在此类组合物施用于其的受试者中不引发严重的不良反应的能力。在一些实施例中，药物组合物可由此类组合物施用于其的受试者良好耐受。

许多治疗剂，且特别是本发明的蛋白质和酶，需要受控的pH和特定的赋形剂，以维持其在本发明的药物组合物中的溶解度和稳定性。下表3鉴定了视为维持本发明蛋白质治疗剂的溶解度和稳定性的蛋白质制剂的典型方面。

表3

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缓冲剂

制剂的pH是能够改变治疗剂(例如酶或蛋白质)在水性制剂或冻干前制剂中的溶解度的另外因素。相应地，本发明的制剂优选包含一种或多种缓冲剂。在一些实施例中，水性制剂包含足以将所述组合物的最佳pH维持在约4.0-8.0之间(例如，约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.2、6.4、6.5、6.6、6.8、7.0、7.5或8.0)的缓冲剂的量。在一些实施例中，制剂的pH在约5.0-7.5、约5.5-7.0、约6.0-7.0、约5.5-6.0、约5.5-6.5、约5.0-6.0、约5.0-6.5和约6.0-7.5之间。合适的缓冲剂包括例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、琥珀酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(“Tris”)和其它有机酸。在一些实施例中，缓冲剂是磷酸盐。

本发明的药物组合物的缓冲剂浓度和pH范围是控制或调节制剂耐受性的因素。在一些实施例中，缓冲剂以范围约1mM至约150mM、或约10mM至约50mM、或约15mM至约50mM、或约20mM至约50mM、或约25mM至约50mM的浓度存在。在一些实施例中，合适的缓冲剂以大约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM 50mM、75mM、100mM、125mM或150mM的浓度存在。

在一些实施例中，缓冲剂以不大于上限的浓度存在，例如，大约100mM、90mM、80mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或5mM。在一些实施例中，缓冲剂以不大于大约50mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲剂以不大于大约25mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲剂以不大于大约20mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲剂以不大于大约10mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲剂以不大于大约5mM的浓度存在。

张力

在一些实施例中，以水性、冻干前、冻干或重构形式的制剂含有等渗剂以使制剂保持等渗。通常，“等渗”意指目的制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂一般具有约240mOsm/kg至约350mOsm/kg的渗透压。等渗性可使用例如蒸气压或凝固点型渗透压计来测量。示例性等渗剂包括但不限于甘氨酸、山梨糖醇、甘露醇、氯化钠和精氨酸。在一些实施例中，合适的等渗剂可以按重量计约0.01-5％(例如，0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0或5.0％)的浓度存在于水性和/或冻干前制剂中。在一些实施例中，用于冻干的制剂含有等渗剂以保持冻干前制剂或重构制剂等渗。

虽然一般地等渗溶液对于肠胃外施用的药物是优选的，但等渗溶液的使用可改变一些治疗剂，且特别是一些蛋白质和/或酶的溶解度。轻度高渗溶液(例如，在以pH 7.0的5mM磷酸钠中高达175mM氯化钠)和含糖溶液(例如，在以pH 7.0的5mM磷酸钠中高达2％蔗糖)已证实是良好耐受的。最常见的经批准的CNS推注制剂组合物是盐水(约150mM NaCl水溶液)。

稳定剂

在一些实施例中，制剂可含有稳定剂或冻干保护剂，以保护蛋白质。通常，合适的稳定剂是糖、非还原糖和/或氨基酸。示例性的糖包括但不限于葡聚糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、山梨糖醇、棉子糖、蔗糖和海藻糖。示例性的氨基酸包括但不限于精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。另外的稳定剂可包括氯化钠、羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。冻干制剂中稳定剂的量一般使得制剂是等渗的。然而，高渗重构制剂也可为合适的。另外，稳定剂的量必须不能太低，使得发生不可接受量的治疗剂降解/聚集。制剂中的示例性稳定剂浓度范围可为约1mM至约400mM(例如，约30mM至约300mM、以及约50mM至约100mM)，或者可替代地，按重量计0.1％至15％(例如，1％至10％、5％至15％、5％至10％)。在一些实施例中，稳定剂和治疗剂的质量比为约1:1。在其它实施例中，稳定剂和治疗剂的质量比可为约0.1:1、0.2:1、0.25:1、0.4:1、0.5:1、1:1、2:1、2.6:1、3:1、4:1、5:1、10:1或20:1。在一些适合于冻干的实施例中，稳定剂也是冻干保护剂。

在一些实施例中，适合于本发明的液体制剂含有无定形材料。在一些实施例中，适合于本发明的液体制剂含有大量无定形材料(例如，基于蔗糖的制剂)。在一些实施例中，适合于本发明的液体制剂含有部分结晶/部分无定形的材料。

填充剂

在一些实施例中，用于冻干的合适制剂还可包括一种或多种填充剂。“填充剂”是对冻干混合物增加质量且促成冻干团块的物理结构的化合物。例如，填充剂可改善冻干团块的外观(例如，基本上均匀的冻干团块)。合适的填充剂包括但不限于氯化钠、乳糖、甘露醇、甘氨酸、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉。填充剂的示例性浓度为约1％至约10％(例如，1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％和10.0％)。

表面活性剂

在一些实施例中，期望将表面活性剂添加到制剂中。示例性的表面活性剂包括非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻酰基-、亚油酰基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻酰基-、亚油酰基-或硬脂基-肌氨酸；亚油酰基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；和MONAQUAT^TM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。通常，添加的表面活性剂的量使得它减少蛋白质的聚集，并且最小化微粒或泡腾的形成。例如，表面活性剂可以约0.001-0.5％(例如，约0.005-0.05％、或0.005-0.01％)的浓度存在于制剂中。特别地，表面活性剂可以大约0.005％、0.01％、0.02％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等的浓度存在于制剂中。可替代地或另外，可将表面活性剂加入冻干制剂、冻干前制剂和/或重构制剂中。

其它药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如Remington's PharmaceuticalSciences第16版，Osol,A.编辑(1980)中所述的那些，可包括在制剂(和/或冻干制剂和/或重构制剂)中，条件是它们不会不利地影响制剂的所需特性。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于另外的缓冲试剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂如EDTA；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；可生物降解的聚合物如聚酯；和/或成盐抗衡离子如钠。

根据本发明，以水性、冻干前、冻干或重构形式的制剂可基于产物质量分析、重构时间(如果冻干的话)、重构质量(如果冻干的话)、高分子量、湿度和玻璃化转变温度来评价。通常，蛋白质质量和产物分析包括使用方法的产物降解速率分析，所述方法包括但不限于尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)、阳离子交换-HPLC(CEX-HPLC)、X射线衍射(XRD)、调制示差扫描量热法(mDSC)、反相HPLC(RP-HPLC)、多角度光散射(MALS)、荧光、紫外吸收、比浊法、毛细管电泳(CE)、SDS-PAGE及其组合。在一些实施例中，根据本发明的产物评估可包括评估外观(液体或团块外观)的步骤。

一般地，制剂(冻干的或水性的)可在室温下贮存延长的时间段。贮存温度通常范围可为0℃至45℃(例如，4℃、20℃、25℃、45℃等)。制剂可贮存数月的时期至数年的时期。贮存时间一般为24个月、12个月、6个月、4.5个月、3个月、2个月或1个月。制剂可直接贮存在用于施用的容器中，消除转移步骤。

制剂可直接贮存在冻干容器中(如果是冻干的话)，所述冻干容器也可充当重构容器，消除转移步骤。可替代地，可将冻干产物制剂测量为较小的增量用于贮存。贮存一般应当避免导致蛋白质降解的环境，包括但不限于暴露于日光、UV辐射、其它形式的电磁辐射、过热或过冷、快速热冲击和机械冲击。

冻干

根据本发明的发明方法可用于冻干任何材料，特别是治疗剂。通常，冻干前制剂还含有适当选择的赋形剂或其它组分，例如稳定剂、缓冲剂、填充剂和表面活性剂，以防止目的化合物在冷冻干燥和贮存期间降解(例如，蛋白质聚集、脱酰胺和/或氧化)。用于冻干的制剂可包括一种或多种另外的成分，包括冻干保护剂或稳定剂、缓冲剂、填充剂、等渗剂和表面活性剂。

在将目的物质和任何另外组分混合在一起后，将制剂冻干。冻干一般包括三个主要阶段：冷冻、初次干燥和二次干燥。冷冻是将水转换为冰或将一些无定形制剂组分转换为结晶形式所必需的。初次干燥是通过在低压和低温下的直接升华从冷冻产物中去除冰的工艺步骤。二次干燥是利用残留水扩散到蒸发表面从产物基质中去除有结合水的工艺步骤。在二次干燥期间的产物温度通常高于在初次干燥期间的产物温度。参见，Tang X.等人(2004)“Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals:Practicaladvice,”Pharm.Res.,21:191-200；Nail S.L.等人(2002)“Fundamentals of freeze-drying,”in Development and manufacture of protein pharmaceuticals.Nail S.L.编辑New York:Kluwer Academic/Plenum Publishers，第281-353页；Wang等人(2000)“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals,”Int.J.Pharm.,203:1-60；Williams N.A.等人(1984)“The lyophilization ofpharmaceuticals；A literature review.”J.Parenteral Sci.Technol.,38:48-59。一般地，任何冻干工艺都可与本发明结合使用。

在一些实施例中，可在产物的初始冷冻期间引入退火步骤。退火步骤可减少总体循环时间。不希望受任何理论的束缚，考虑退火步骤可帮助促进赋形剂结晶和由于在过冷期间形成的小晶体的重结晶形成更大的冰晶，这依次又改进重构。通常，退火步骤包括在冷冻期间温度的间隔或振荡。例如，冷冻温度可为-40℃，并且退火步骤将温度升高到例如-10℃，并且将该温度维持设定的时间段。退火步骤时间范围可为0.5小时至8小时(例如，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、4、6和8小时)。^o退火温度可在冷冻温度和0℃之间。

冻干可在容器中执行，所述容器例如管、袋、瓶、托盘、小瓶(例如玻璃小瓶)、注射器或任何其它合适的容器。容器可为一次性的。冻干也可以大规模或小规模执行。在一些情况下，可能期望将在其中要进行蛋白质重构的容器中的蛋白质制剂冻干，以便避免转移步骤。在这种情况下，容器可为例如3、4、5、10、20、50或100cc的小瓶。

许多不同的冷冻干燥器可用于此目的，例如Hull中试规模干燥器(SPIndustries,USA)、Genesis(SP Industries)实验室冷冻干燥器、或能够控制给定冻干工艺参数的任何冷冻干燥器。通过冷冻制剂并随后在适合于初次干燥的温度下从冰冻内容物中升华冰来完成冷冻干燥。初始冷冻在通常不多于约4小时(例如，不多于约3小时、不多于约2.5小时、不多于约2小时)内使制剂达到低于约-20℃(例如，-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃等)的温度。在这种条件下，产物温度通常低于制剂的共晶点或坍塌温度。^°通常，在通常范围为约20至250mTorr的合适压力下，用于初次干燥的搁板温度范围为约-30至25℃(条件是产物在初次干燥期间保持低于熔点)。制剂、容纳样品的容器(例如玻璃小瓶)的大小和类型、以及液体的体积将主要决定干燥所需的时间，其范围可从几小时到几天。二次干燥阶段在约0-60℃下进行，主要取决于容器的类型和大小、以及所采用的治疗性蛋白质的类型。再次，液体的体积将主要决定干燥所需的时间，其范围可从几小时到几天。

作为一般提议，冻干将导致其中其含湿量小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％且小于约0.5％的冻干制剂。

重构

虽然本发明的药物组合物在施用于受试者后一般为水性形式，但在一些实施例中，本发明的药物组合物是冻干的。在施用于受试者之前，必须通过向其中加入一种或多种稀释剂来重构这些组合物。在所需阶段，通常在施用于患者之前的适当时间，冻干制剂可用稀释剂重构，使得重构制剂中的蛋白质浓度是期望的。

根据本发明可使用各种稀释剂。在一些实施例中，用于重构的合适稀释剂是水。用作稀释剂的水可以各种方式处理，包括反渗透、蒸馏、去离子、过滤(例如活性炭、微量过滤、纳米过滤)和这些处理方法的组合。一般而言，水应该适合于注射，包括但不限于无菌水或抑菌性注射用水。

另外的示例性稀释剂包括pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、Elliot’s溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。合适的稀释剂可任选含有防腐剂。示例性防腐剂包括芳族醇，例如苯甲醇或酚醇。通过评价不同的防腐剂浓度与蛋白质的相容性和防腐功效测试来确定所采用的防腐剂的量。例如，如果防腐剂是芳族醇(例如苯甲醇)，它可以约0.1-2.0％、约0.5-1.5％或约1.0-1.2％的量存在。

适合于本发明的稀释剂可包括各种添加剂，包括但不限于pH缓冲剂(例如Tris、组氨酸)、盐(例如氯化钠)和其它添加剂(例如蔗糖)，包括上文所述的那些(例如稳定剂、等渗剂)。

根据本发明，冻干物质(例如蛋白质，例如重组人芳基硫酸酯酶A)可重构为至少25mg/ml(例如，至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/)的浓度，以及在其间的任何范围内。在一些实施例中，冻干物质(例如蛋白质)可重构至范围为约以下的浓度：1mg/ml至100mg/ml(例如，约1mg/ml to 50mg/ml、1mg/ml至100mg/ml、约1mg/ml至约5mg/ml、约1mg/ml至约10mg/ml、约1mg/ml至约25mg/ml、约1mg/ml至约75mg/ml、约10mg/ml至约30mg/ml、约10mg/ml至约50mg/ml、约10mg/ml至约75mg/ml、约10mg/ml至约100mg/ml、约25mg/ml至约50mg/ml、约25mg/ml至约75mg/ml、约25mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约75mg/ml、约50mg/ml至约100mg/ml)。在一些实施例中，重构制剂中的蛋白质浓度可高于冻干前制剂中的浓度。在一些实施例中，将冻干物质重构为至少25mg/mL，例如30mg/mL的浓度。当预期皮下或肌内递送重构制剂时，重构制剂中的高蛋白质浓度被认为是特别有用的。在一些实施例中，重构制剂中的蛋白质浓度可为冻干前制剂的约2-50倍(例如约2-20倍、约2-10倍、或约2-5倍)。在一些实施例中，重构制剂中的蛋白质浓度可为冻干前制剂的至少约2倍(例如至少约3、4、5、10、20、40倍)。

根据本发明的重构可在任何容器中执行。适合于本发明的示例性容器包括但不限于例如管、小瓶、注射器(例如单室或双室)、袋、瓶和托盘。合适的容器可由任何材料例如玻璃、塑料、金属制成。容器可为一次性的或可重复使用的。重构也可以大规模或小规模执行。

在一些情况下，可能期望将在其中要进行蛋白质重构的容器中的蛋白质制剂冻干，以便避免转移步骤。在这种情况下，容器可为例如3、4、5、10、20、50或100cc的小瓶。在一些实施例中，用于冻干和重构的合适容器是双室注射器(例如，Lyo-Ject,(Vetter)注射器)。例如，双室注射器可含有冻干物质和稀释剂两者，各自在分开的室中，由塞子隔开(参见实例5)。为了重构，可在稀释剂侧将活塞连接到塞子上并按压，以将稀释剂移动到产物室内，使得稀释剂可与冻干物质接触并且可如重构本文所述发生(参见实例5)。

本发明的药物组合物、制剂和相关方法可用于将各种治疗剂递送至受试者的CNS(例如，鞘内、心室内或脑池内)，并且用于治疗相关疾病。本发明的药物组合物特别适用于向患有溶酶体贮积症的受试者递送蛋白质和酶(例如酶替代疗法)。溶酶体贮积病代表来源于溶酶体功能缺陷的一组相对罕见的遗传性代谢病症。溶酶体疾病的特征在于溶酶体内未消化的大分子的累积，这导致这种溶酶体的大小和数量的增加，并且最终导致细胞功能障碍和临床异常。

CNS递送

考虑本文所述的各种稳定制剂一般适合于治疗剂的CNS递送。根据本发明的稳定制剂可经由各种技术和途径(径包括但不限于实质内、脑内、脑室内(ICV)、鞘内(例如、IT-腰椎、IT-小脑延髓池)施用)用于CNS递送，以及用于直接或间接注射到CNS和/或CSF的任何其它技术和途径。术语“小脑延髓池”指经由头骨和脊柱顶部之间的开口在小脑周围和下方的空间。通常，经由小脑延髓池的注射也称为“小脑延髓池递送”。

鞘内递送

在一些实施例中，将替代酶以本文所述的制剂递送至CNS。在一些实施例中，通过施用于需要治疗的受试者的脑脊髓液(CSF)内，将替代酶递送至CNS。在一些实施例中，鞘内施用用于将所需替代酶(例如ASA蛋白)递送到CSF内。如本文使用的，鞘内施用(也称为鞘内注射)指注射到椎管(脊髓周围的鞘内空间)内。可使用各种技术，包括但不限于腰椎穿刺。示例性方法在Lazorthes等人Advances in Drug Delivery Systems and Applicationsin Neurosurgery,143-192中描述，所述参考文献的内容以引用的方式并入本文。

根据本发明，可在椎管周围的任何区域处注射酶。在一些实施例中，将酶注射到腰部区域内。如本文使用的，术语“腰区”或“腰部区域”指第三和第四腰(腰背部)椎骨之间的区域，并且更包含地指脊柱的L2-S1区。通常，经由腰区或腰部区域的鞘内注射也称为“腰部鞘内递送”或“腰部鞘内施用”。

在一些实施例中，治疗性蛋白质，例如重组芳基硫酸酯酶A通过腰部鞘内施用递送，例如在第三腰椎和第四腰椎(下背部)椎骨之间递送，并且更包含脊柱的L2-S1区在内。考虑腰部鞘内施用或递送区别于小脑延髓池递送之处在于根据本发明的腰部鞘内施用或递送向远端椎管提供对远端椎管更好和更有效的递送，而尤其地，小脑延髓池递送通常不能很好地递送到远端椎管。

用于鞘内递送的装置

根据本发明，各种装置可用于鞘内递送。在一些实施例中，用于鞘内施用的装置含有流体进入端口(例如，可注射端口)；空心主体(例如导管)，其具有与流体进入端口流体连通的第一流动孔和配置用于插入脊髓内的第二流动孔；以及固定机构，用于固定空心主体在脊髓中的插入。作为非限制性示例，合适的固定机构包含安装在空心主体的表面上的一个或多个小块和在一个或多个小块上可调节的缝合环，以防止空心主体(例如，导管)滑出脊髓。在各种实施例中，流体进入端口包括储库。在一些实施例中，流体进入端口包括机械泵(例如，输注泵)。在一些实施例中，植入的导管连接到储库(例如，用于推注递送)或输注泵。流体进入端口可为植入的或外部的。

在一些实施例中，鞘内施用可通过腰椎穿刺(即，缓慢推注)或经由端口-导管递送系统(即输注或推注)来执行。在一些实施例中，将导管插入腰椎骨的椎板之间，并且将尖端向上螺旋穿过囊空间至所需水平(一般为L3-L4)。

相对于静脉内施用，适合于鞘内施用的单次剂量体积通常很小。通常，根据本发明的鞘内递送维持CSF的组成以及受试者的颅内压的平衡。在一些实施例中，在不存在从受试者中相应去除CSF的情况下执行鞘内递送。在一些实施例中，合适的单次剂量体积可为例如小于约10ml、8ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1.5ml、1ml或0.5ml。在一些实施例中，合适的单次剂量体积可为约0.5-5ml、0.5-4ml、0.5-3ml、0.5-2ml、0.5-1ml、1-3ml、1-5ml、1.5-3ml、1-4ml或0.5-1.5ml。在一些实施例中，根据本发明的鞘内递送涉及首先去除所需量的CSF的步骤。在一些实施例中，在鞘内施用之前首先去除小于约10ml(例如，少于约9ml、8ml、7ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1ml)的CSF。在那些情况下，合适的单次剂量体积可为例如多于约3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml。

用于向个体鞘内施用治疗组合物或制剂的其它装置在美国专利号6,217,552中描述，所述美国专利以引用的方式并入本文。可替代地，药物可例如通过单次注射或连续输注鞘内给予。应当理解，剂量治疗可为单次剂量施用或多剂量的形式。

对于注射，可将本发明的制剂配制在液体溶液中。另外，酶可配制成固体形式，并且在使用前立即重新溶解或悬浮。还包括冻干形式。注射可为例如酶的推注注射或连续输注(例如，使用输注泵)的形式。

非鞘内递送方法

治疗酶，例如重组芳基硫酸酯酶A，可通过非鞘内手段例如通过侧脑室注射施用到受试者的脑内。例如，可通过在受试者的头骨中制造的钻孔来进行注射。在另一个实施例中，酶和/或其它药物制剂通过手术插入的分流器施用到受试者的脑室内。例如，注射可在更大的侧脑室内进行。在一些实施例中，注射还可在第三和第四较小的心室内进行。

可替代地，药物组合物可通过注射到受试者的小脑延髓池或腰部区域内施用。

某些装置可用于实现治疗组合物的施用。例如，含有所需酶的制剂可使用Ommaya储库给予，所述储库通常用于鞘内施用用于脑膜癌病的药物(Lancet 2:983-84,1963)。更具体地，在该方法中，心室管穿过在前角中形成的洞插入，并且连接到安装在头皮下的Ommaya储库，并且将储库皮下穿刺以鞘内递送待替换的特定酶，其被注射到储库内。

缓慢释放/持续递送

在本发明的方法的另一个实施例中，在药学可接受的制剂施用于受试者后，药学可接受的制剂提供了本发明中使用的酶或其它药物组合物持续递送，例如“缓慢释放”至受试者至少一、二、三、四周或更长时间段。

如本文使用的，术语“持续递送”指经过施用后的一段时间，优选至少几天、一周或几周，在体内连续递送本发明的药物制剂。组合物的持续递送可通过例如随着时间推移的酶的持续疗效来证实(例如，酶的持续递送可通过受试者中持续减少量的贮存颗粒来证实)。可替代地，酶的持续递送可通过随着时间推移而检测体内酶的存在来证实。

对靶组织的递送

如上文讨论的，本发明的令人惊讶和重要的特征之一是治疗剂，特别是使用本发明的发明方法和组合物施用的替代酶能够有效且广泛地扩散穿过脑表面，并且穿透脑的各个层或区域，包括深层脑区。另外，本发明的发明方法和组合物有效地将治疗剂(例如ASA酶)递送至脊髓的各种组织、神经元或细胞，包括腰区，其通过现有的CNS递送方法例如ICV注射难以靶向。此外，本发明的发明方法和组合物将足够量的治疗剂(例如ASA酶)递送至血流以及各种外周器官和组织。

因此，在一些实施例中，将治疗性蛋白质(例如ASA酶)递送至受试者的中枢神经系统。在一些实施例中，将治疗性蛋白质(例如ASA酶)递送至脑、脊髓和/或外周器官的一种或多种靶组织。如本文使用的，术语“靶组织”指受待治疗的溶酶体贮积病影响的任何组织、或其中正常表达缺陷型溶酶体酶的任何组织。在一些实施例中，靶组织包括在患有或易患溶酶体贮积病的患者中，其中存在例如贮存于组织的细胞溶酶体中的可检测或异常高量的酶底物的那些组织。在一些实施例中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。在一些实施例中，靶组织包括其中缺陷型溶酶体酶通常以升高的水平表达的那些组织。如本文使用的，靶组织可为脑靶组织、脊髓靶组织和/或外周靶组织。下文详细描述了示例性靶组织。

脑靶组织

一般而言，脑可分为不同的区域、层和组织。例如，脑膜组织是包裹中枢神经系统包括脑的膜系统。脑膜包含三层，包括硬脑膜、蛛网膜物质和软脑膜。一般而言，脑膜和脑脊髓液的主要功能是保护中枢神经系统。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至脑膜的一个或多个层。

脑有三个主要分区，包括大脑、小脑和脑干。脑半球位于大多数其它脑结构上方，并且覆盖有皮质层。大脑下面是脑干，其类似大脑与之附着的茎。在脑后部处、在大脑下方和在脑干后面是小脑。

间脑位于脑中线附近和中脑上方，包含丘脑、后丘脑、下丘脑、上丘脑、前丘脑(prethalamus)和前顶盖。中脑(mesencephalon)也称为中脑(midbrain)，包含顶盖、被盖、心室中隔腔、以及大脑脚、红核和颅神经III核。中脑与视力、听力、运动控制、睡眠/觉醒、警觉和温度调节有关。

可基于组织的深度来表征中枢神经系统包括脑的组织区域。例如，CNS(例如，脑)组织可表征为表面或浅层组织、中深层组织和/或深层组织。

根据本发明，可将治疗性蛋白质(例如替代酶)递送至与受试者中待治疗的特定疾病相关的任何适当的脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质(例如替代酶)递送至表面或浅层脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至中深层脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至深层脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至表面或浅层脑靶组织、中深层脑靶组织和/或深层脑靶组织的组合。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送到脑的外表面下方(或内部)至少4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更多的深层脑组织。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至大脑的一个或多个表面或浅层组织。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅层组织位于距大脑表面4mm内。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅层组织选自软脑膜组织、大脑皮质带组织、海马、Virchow Robin空间、VR空间内的血管、海马体、脑的内表面上的下丘脑部分、视神经和束、嗅球和突起及其组合。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至大脑的一个或多个深层组织。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅层组织位于大脑表面下方(或内部)4mm(例如，5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm)。在一些实施例中，大脑的靶向深层组织包括大脑皮质带。在一些实施例中，大脑的靶向深层组织包括间脑(例如下丘脑、丘脑、前丘脑、丘脑底部等)、后脑、豆状核、基底神经节、尾状核、壳核、杏仁核、苍白球及其组合中的一种或多种。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至小脑的一种或多种组织。在某些实施例中，小脑的靶向的一种或多种组织选自分子层的组织、浦肯野细胞层的组织、颗粒细胞层的组织、小脑脚及其组合。在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至小脑的一种或多种深层组织，包括但不限于浦肯野细胞层的组织、颗粒细胞层的组织、深层小脑白质组织(例如，相对于颗粒细胞层的深层)和深层小脑核组织。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脑干的一种或多种组织。在一些实施例中，脑干的靶向的一种或多种组织包括脑干白质组织和/或脑干核组织。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至各种脑组织，包括但不限于灰质、白质、室周区、柔脑膜、脑膜、新皮质、小脑、大脑皮质中的深层组织、分子层、尾状核/壳核区、中脑、脑桥或髓质的深层区域及其组合。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脑中的各种细胞，包括但不限于神经元、神经胶质细胞、血管周细胞和/或脑膜细胞。在一些实施例中，将治疗性蛋白质递送至深白质的少突胶质细胞。

脊髓

一般而言，脊髓的区域或组织可基于组织的深度来表征。例如，脊髓组织可表征为表面或浅层组织、中深层组织和/或深层组织。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脊髓的一个或多个表面或浅层组织。在一些实施例中，脊髓的靶向表面或浅层组织位于距脊髓表面4mm内。在一些实施例中，脊髓的靶向表面或浅层组织包含软脑膜和/或白质束。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脊髓的一种或多种深层组织。在一些实施例中，脊髓的靶向深层组织位于距脊髓表面4mm的内部。在一些实施例中，脊髓的靶向深层组织含有脊髓灰质和/或室管膜细胞。

在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脊髓的神经元。

外周靶组织

如本文使用的，外周器官或组织指并非中枢神经系统(CNS)的部分的任何器官或组织。外周靶组织可包括但不限于血液系统、肝、肾、心脏、内皮、骨髓和骨髓衍生细胞、脾、肺、淋巴结、骨、软骨、卵巢和睾丸。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质(例如替代酶)递送至外周靶组织中的一种或多种。

生物分布和生物利用度

在各种实施例中，一旦递送至靶组织，治疗剂(例如ASA酶)就在细胞内定位。例如，治疗剂(例如酶)可定位至靶细胞的外显子、轴突、溶酶体、线粒体或液泡(例如神经元，例如浦肯野细胞)。例如，在一些实施例中，鞘内施用的酶证实易位动力学，使得酶在血管周间隙内移动(例如，通过脉动辅助的对流机制)。另外，与施用的蛋白质或酶与神经丝的结合有关的活性轴突运输机制也可促成或以其他方式促进鞘内施用的蛋白质或酶分布到中枢神经系统的更深层组织内。

在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如ASA酶)可在本文所述的各种靶组织中达到治疗或临床有效水平或活性。如本文使用的，治疗或临床有效水平或活性是足以在靶组织中赋予疗效的水平或活性。疗效可为客观的(即，可通过一些测试或标记物测量的)或主观的(即，受试者给出效果的指示或感觉到效果)。例如，治疗或临床有效水平或活性可为足以改善与靶组织中的疾病相关的症状(例如，GAG贮存)的酶促水平或活性。

在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可实现的酶促水平或活性为靶组织中相应溶酶体酶的正常水平或活性的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。在一些实施例中，与对照或基线(例如，没有治疗的内源水平或活性)相比，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可实现增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的酶水平或活性。在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可在靶组织中实现至少大约10nmol/hr/mg、20nmol/hr/mg、40nmol/hr/mg、50nmol/hr/mg、60nmol/hr/mg、70nmol/hr/mg、80nmol/hr/mg、90nmol/hr/mg、100nmol/hr/mg、150nmol/hr/mg、200nmol/hr/mg、250nmol/hr/mg、300nmol/hr/mg、350nmol/hr/mg、400nmol/hr/mg、450nmol/hr/mg、500nmol/hr/mg、550nmol/hr/mg或600nmol/hr/mg的酶水平或活性增加。

在一些实施例中，根据本发明的发明方法可特别用于靶向腰区。在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可在腰区中实现至少大约500nmol/hr/mg、600nmol/hr/mg、700nmol/hr/mg、800nmol/hr/mg、900nmol/hr/mg、1000nmol/hr/mg、1500nmol/hr/mg、2000nmol/hr/mg、3000nmol/hr/mg、4000nmol/hr/mg、5000nmol/hr/mg、6000nmol/hr/mg、7000nmol/hr/mg、8000nmol/hr/mg、9000nmol/hr/mg或10,000nmol/hr/mg的酶水平或活性增加。

一般而言，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)在CSF以及脑、脊髓和外周器官的靶组织中具有足够长的半衰期。在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可具有至少大约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、最多3天、最多7天、最多14天、最多21天或最长一个月的半衰期。在一些实施例中，在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可在施用后12小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时、96小时、102小时或一周后在CSF或血流中保持可检测的水平或活性。可使用本领域已知的各种方法确定可检测水平或活性。

在某些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)在施用后(例如，在药物组合物鞘内施用于受试者后一周、3天、48小时、36小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更短时间)在受试者的CNS组织和细胞中达到至少30μg/ml的浓度。在某些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)在施用于此类受试者后(例如，在此类药物组合物鞘内施用于受试者后一周、3天、48小时、36小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更短时间)在受试者的靶向组织或细胞(例如脑组织或神经元)中达到至少20μg/ml、至少15μg/ml、至少10μg/ml、至少7.5μg/ml、至少5μg/ml、至少2.5μg/ml、至少1.0μg/ml或至少0.5μg/ml的浓度。

异染性脑白质营养不良疾病(MLD)的治疗

异染性脑白质营养不良疾病(MLD)，也称为MLD综合征，是来源于酶芳基硫酸酯酶A(ASA)缺乏的常染色体隐性遗传病症。由人中的ARSA基因编码的ASA是将脑苷脂3-硫酸盐或鞘脂3-O-磺基半乳糖苷神经酰胺(硫苷脂)分解为脑苷脂和硫酸盐的酶。在不存在酶的情况下，硫苷脂在神经系统(例如髓鞘、神经元和神经胶质细胞)中累积，并且在内脏器官中累积至较低程度。这些分子和细胞事件的后果是CNS和PNS内的进行性脱髓鞘和轴突丧失，其在临床上伴有严重的运动和认知功能障碍。

该病症的确定临床特征是中枢神经系统(CNS)变性，其导致认知损害(例如尤其是智力低下、神经病症和失明)。

MLD可在幼儿(婴儿晚期形式)中显示出来，其中受累儿童通常仅在出生后的第一年(例如，在约15-24个月时)开始显示症状，并且一般不存活超过5岁。MLD可在儿童(青少年形式)中显示出来，其中受累儿童通常在约3-10岁时显示认知损害，并且寿命可变化(例如，在症状发作后10-15年的范围内)。MLD可在成人(成人发病形式)中显示出来，并且可出现在任何年龄的个体中(例如，通常在16岁及以后)。疾病的进展可极大不同。

本发明的组合物和方法可用于有效治疗患有或易患MLD的个体。用于治疗MLD的本发明的某些方法一般包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以在受试者中观察到治疗功效的至少一种指标的治疗期。根据本公开内容提供的许多方法，在受试者中未观察到与重组芳基硫酸酯酶A施用相关的严重副作用。

如本文使用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”指改善与疾病相关的一种或多种症状，预防或延迟疾病的一种或多种症状的发作，减轻疾病的一种或多种症状的严重性或频率，和/或减缓、稳定或减少一种或多种功能中的疾病相关衰退的进展。示例性症状包括但不限于颅内压、脑外积水、中枢神经系统和外周神经系统中的髓鞘以及内脏器官中累积的硫酸化糖脂、CNS和PNS内的进行性脱髓鞘和轴突丧失、和/或运动功能障碍和认知功能障碍。

在一些实施例中，治疗指在MLD患者中的部分或完全缓解、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重性和/或发病率、减缓进展、稳定或逆转神经损害。如本文使用的，术语“神经损害”包括与中枢神经系统(例如脑和脊髓)的损害相关的各种症状。在一些实施例中，MLD的各种症状与外周神经系统(PNS)的损害相关。

运动功能

在一些实施例中，MLD患者的神经损害的特征在于运动功能例如粗大运动功能的下降。在一些实施例中，治疗功效包括涉及一种或多种运动功能的测量。

在一些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。在一些实施例中，重组ASA酶的施用还导致一种或多种认知功能、适应功能和/或执行功能的改善、稳定或减少下降。

一种或多种运动功能可包括例如粗大运动功能。应了解，可通过任何适当的方法评价粗大运动功能。例如，在一些实施例中，粗大运动功能被测量为使用粗大运动功能测量在运动功能中从基线的变化，例如粗大运动功能测量-88(GMFM-88)或粗大运动功能测量-66(GMFM-66)总原始评分或百分比。在一些实施例中，待治疗的受试者具有大于40％的基线GMFM-88评分。在一些实施例中，待治疗的受试者具有小于40％的基线GMFM-88评分。

在一些实施例中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶导致运动功能中比没有施用时通常观察到的更小下降。例如，在一些实施例中，根据本发明的方法施用重组ASA酶导致GMFM-88评分的下降小于10％、20％、30％、40％或50％。

在一些实施例中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶导致运动功能的基本稳定，例如评分例如GMFM-88评分的基本稳定。“基本稳定”意指经过一段时间，例如经过治疗期和/或经过在期间不存在治疗的情况下通常预期下降或恶化的时期，没有下降或恶化。

在一些实施例中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶导致运动功能的改善，例如评分例如GMFM-88评分的改善。

生物标记物

在某些实施例中，治疗功效包括例如在MLD患者中累积或降低的一种或多种生物标记物水平中的改变。

在一些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以将MLD中累积的生物标记物水平降低至生物标记物的基线水平的治疗期。

在MLD中累积的生物标记物可为例如硫苷脂、溶血硫苷脂或两者。在一些实施例中，生物标记物是硫苷脂。生物标记物可为在MLD患者的一种或多种身体组织和/或一种或多种体液中累积的生物标记物。例如，在一些实施例中，生物标记物在选自脑脊髓液、尿、血液和血清的体液中累积。在一些实施例中，体液是脑脊髓液。

在某些实施例中，待治疗的受试者的脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于某一水平，例如大于约0.1μg/mL、大于约0.2μg/mL、或大于约0.3μg/mL。在一些实施例中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶导致脑脊髓液中例如多于约0.1μg/mL或多于约0.2μg/mL的硫苷脂水平降低。

在一些实施例中，治疗导致各种组织或体液中的硫苷脂累积降低。在一些实施例中，治疗导致脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中的硫苷脂累积降低。在某些实施例中，与对照或基线水平相比，硫苷脂累积降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。在一些实施例中，与对照或基线水平相比，硫苷脂累积降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。应了解可通过任何适当的方法评价硫苷脂贮存。例如，在一些实施例中，通过阿辛蓝染色测量硫苷脂贮存。在一些实施例中，通过LAMP-1染色测量硫苷脂贮存。

在一些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以增加相对于生物标记物的基线水平在脑组织中的MLD中降低的生物标记物水平的治疗期。

脑组织可为任何脑组织，其中生物标记物的水平通常在MLD患者中降低，例如脑的深白质。可能有用的生物标记物包括某些代谢产物，例如N-乙酰天冬氨酸。例如通过质子磁共振波谱，可在脑组织中评价N-乙酰天冬氨酸水平。

脑损伤受累

在某些实施例中，治疗功效包括与脑损伤受累相关的测量。在某些实施例中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以稳定或减少相对于基线的脑损伤受累的治疗期。

例如，可通过非侵入性方法例如成像方法来评价脑损伤受累。合适的评价方法包括定性、定量和半定量方法。例如，用于评价MLD患者中的脑损伤受累的非侵入性成像方法是MLD MRI(磁共振成像)严重性评分。(参见例如，Eichler等人AJNR Am JNeuroradiol.2009Nov；30(10):1893-7，其全部内容以引用的方式并入本文。)在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致受试者中的MLD MRI严重性评分相对于基线的减少。在一些实施例中，重组ASA酶的施用导致受试者中的MLD MRI严重性评分相对于基线的稳定。

治疗功效的另外测量

发明方法可以可替代地或另外地导致如本文讨论的治疗功效的一种或多种其它测量。在一些实施例中，治疗导致神经元(例如，含有浦肯野细胞的神经元)中的空泡形成减少。在某些实施例中，与对照或基线相比，神经元中的空泡形成降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。在一些实施例中，与对照或基线相比，空泡形成降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

在一些实施例中，治疗导致各种组织中的ASA酶活性增加。在一些实施例中，治疗导致脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中的ASA酶活性增加。在一些实施例中，与对照或基线相比，ASA酶活性增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。在一些实施例中，与对照或基线相比，ASA酶活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施例中，增加的ASA酶活性为至少大约10nmol/hr/mg、20nmol/hr/mg、40nmol/hr/mg、50nmol/hr/mg、60nmol/hr/mg、70nmol/hr/mg、80nmol/hr/mg、90nmol/hr/mg、100nmol/hr/mg、150nmol/hr/mg、200nmol/hr/mg、250nmol/hr/mg、300nmol/hr/mg、350nmol/hr/mg、400nmol/hr/mg、450nmol/hr/mg、500nmol/hr/mg、550nmol/hr/mg、600nmol/hr/mg或更多。在一些实施例中，ASA酶促活性在腰区中增加。在一些实施例中，腰区中的ASA酶促活性增加为至少大约2000nmol/hr/mg、3000nmol/hr/mg、4000nmol/hr/mg、5000nmol/hr/mg、6000nmol/hr/mg、7000nmol/hr/mg、8000nmol/hr/mg、9000nmol/hr/mg、10,000nmol/hr/mg或更多。

在一些实施例中，治疗导致认知能力丧失的进展降低。在某些实施例中，与对照或基线相比，认知能力丧失的进展降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。在一些实施例中，治疗指发育延迟降低。某些实施例中，与对照或基线相比，发育延迟降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。

在一些实施例中，治疗指存活(例如存活时间)增加。例如，治疗可导致患者的预期寿命增加。在一些实施例中，与患有没有治疗的相似疾病的一个或多个对照个体的平均预期寿命相比，根据本发明的治疗导致患者的预期寿命增加多于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％、约120％、约125％、约130％、约135％、约140％、约145％、约150％、约155％、约160％、约165％、约170％、约175％、约180％、约185％、约190％、约195％、约200％或更多。在一些实施例中，与患有没有治疗的相似疾病的一个或多个对照个体的平均预期寿命相比，根据本发明的治疗导致患者的预期寿命增加多于约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年或更长。在一些实施例中，根据本发明的治疗导致患者的长期存活。如本文使用的，术语“长期存活”指存活时间或预期寿命长于约40年、45年、50年、55年、60年或更长。

如本文使用的，术语“改善”、“增加”或“减少”指示相对于对照的值。在一些实施例中，合适的对照是基线测量，例如在本文所述的治疗起始之前在同一个体中的测量、或在不存在本文所述治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。“对照个体”是患有相同形式MLD(例如，晚期婴儿、青少年或成人发病形式)的个体，其与待治疗个体的年龄和/或性别大致相同(以确保治疗个体和对照个体中的疾病阶段是可比较的)。

受试者

待治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)是患有MLD或具有发展MLD的潜力(即，处于发展MLD的风险中)的个体(例如，胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人)。

在许多实施例中，受试者是哺乳动物，例如人。

在一些实施例中，受试者是十六岁或更小，例如十二岁或更小、九岁或更小、六岁或更小、四岁或更小、三岁或更小、两岁或更小、18个月或更小、12个月或更小、或者6个月或更小。

受试者可患有任何形式的MLD-例如成人形式、青少年形式或晚期婴儿形式。

受试者在治疗开始时可能或可能不显示出如本文所讨论的MLD的至少一种症状。

受试者在治疗开始时可能或可能未被诊断有MLD。例如，在一些实施例中，受试者仍未被鉴定为处于发展MLD的风险中。因此，治疗方法可

个体可具有残留的内源ASA表达和/或活性，或不可测量的活性。例如，患有MLD的个体可具有的ASA表达水平小于约30-50％、小于约25-30％、小于约20-25％、小于约15-20％、小于约10-15％、小于约5-10％、小于约0.1-5％的正常ASA表达水平。

在一些实施例中，个体是最近已被诊断有该疾病的个体。通常，早期治疗(诊断后尽快开始治疗)对于使疾病的效应最小化并使治疗的益处最大化是重要的。

免疫耐受性

一般地，根据本发明的治疗剂(例如替代酶)的鞘内施用不在受试者中导致严重副作用。如本文使用的，严重副作用诱导但不限于基本免疫应答、毒性或死亡。如本文使用的，术语“基本免疫应答”指重度或严重的免疫应答，例如适应性T细胞免疫应答。

因此，在许多实施例中，根据本发明的发明方法不涉及同时的免疫抑制剂疗法(即，用作预处理/预条件化或与该方法平行的任何免疫抑制剂疗法)。在一些实施例中，根据本发明的发明方法不涉及待治疗的受试者中的免疫耐受诱导。在一些实施例中，根据本发明的发明方法不涉及使用T细胞免疫抑制剂对受试者的预处理或预条件化。

在一些实施例中，治疗剂的鞘内施用可产生针对这些试剂的免疫应答。因此，在一些实施例中，致使接受替代酶的受试者耐受酶替代疗法可能是有用的。可使用本领域已知的各种方法诱导免疫耐受。例如，可使用与低剂量的所需替代酶的每周鞘内输注组合的、T细胞免疫抑制剂如环孢菌素A(CsA)和抗增殖剂如硫唑嘌呤(Aza)的最初30-60天方案。

技术人员已知的任何免疫抑制剂可与本发明的组合疗法一起采用。这些免疫抑制剂包括但不限于环孢菌素、FK506、雷帕霉素、CTLA4-Ig和抗TNF剂如依那西普(参见例如Moder,2000,Ann.Allergy Asthma Immunol.84,280-284；Nevins,2000,Curr.Opin.Pediatr.12,146-150；Kurlberg等人，2000,Scand.J.Immunol.51,224-230；Ideguchi等人，2000,Neuroscience 95,217-226；Potter等人，1999,Ann.N.Y.Acad.Sci.875,159-174；Slavik等人，1999,Immunol.Res.19,1-24；Gaziev等人，1999,Bone Marrow Transplant.25,689-696；Henry,1999,Clin.Transplant.13,209-220；Gummert等人，1999,J.Am.Soc.Nephrol.10,1366-1380；Qi等人，2000,Transplantation69,1275-1283)。已在移植患者中证实有效的抗IL2受体(α亚基)抗体达克珠单抗(例如Zenapax.TM.)也可用作免疫抑制剂(参见例如Wiseman等人，1999,Drugs 58,1029-1042；Beniaminovitz等人，2000,N.Engl J.Med.342,613-619；Ponticelli等人，1999,DrugsR.D.1,55-60；Berard等人，1999,Pharmacotherapy 19,1127-1137；Eckhoff等人，2000,Transplantation 69,1867-1872；Ekberg等人，2000,Transpl.Int.13,151-159)。另外的免疫抑制剂包括但不限于抗CD2(Branco等人，1999,Transplantation 68,1588-1596；Przepiorka等人，1998,Blood 92,4066-4071)、抗CD4(Marinova-Mutafchieva等人，2000,Arthritis Rheum.43,638-644；Fishwild等人，1999,Clin.Immunol.92,138-152)、以及抗CD40配体(Hong等人，2000,Semin.Nephrol.20,108-125；Chirmule等人，2000,J.Virol.74,3345-3352；Ito等人，2000,J.Immunol.164,1230-1235)。

施用

本发明的发明方法考虑了本文所述治疗剂(例如替代酶)的治疗有效量的单次以及多次施用。治疗剂(例如替代酶)可每隔一定间隔施用，取决于受试者的状况(例如，溶酶体贮积病)的性质、严重性和程度。在一些实施例中，本发明的治疗剂(例如替代酶)的治疗有效量可每隔一定间隔(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三月一次、双月(每两个月一次)、每月(每月一次)、每两周(每两周一次)、每周一次)定期鞘内施用。

在一些实施例中，鞘内施用可与其它施用途径(例如静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如经口或经鼻))联合使用。在一些实施例中，那些其它施用途径(例如静脉内施用)可比每两周、每月、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每年施用更频繁地执行。

如本文使用的，术语“治疗有效量”在很大程度上基于本发明药物组合物中包含的治疗剂的总量来确定。一般地，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处(例如治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在的疾病或状况)。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量，例如足以调节溶酶体酶受体或其活性从而治疗此类溶酶体贮积病或其症状的量(例如，在将本发明的组合物施用于受试者后，“斑马体”或细胞空泡形成的存在或发生率的减少或消除)。一般地，施用于有此需要的受试者的治疗剂(例如，重组溶酶体酶)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够容易地根据这些和其它相关因素确定适当剂量。另外，可任选地采用客观和主观测定来确定最佳剂量范围。

治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如根据施用途径、与其它药物试剂的组合而变。另外，关于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；所采用的特定药学试剂的活性；所采用的具体成分；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所采用的特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域众所周知的相似因素。

在一些实施例中，治疗有效剂量为约1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，或大于约1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg。在特定实施例中，治疗有效剂量为约10mg或大于约10mg。在特定实施例中，治疗有效剂量为约30mg或大于约30mg。在特定实施例中，治疗有效剂量为100mg或大于约100mg。在一些实施例中，治疗有效剂量小于约500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg或200mg。在特定实施例中，治疗有效剂量小于约200mg。在一些实施例中，治疗有效剂量范围为约1-100mg、约5-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约5-70mg、约5-60mg、约5-60mg、约10-100mg、约10-90mg、约10-80mg、约10-70mg、约10-60mg或约10-50mg。在一些实施例中，治疗有效剂量的范围在约100mg和约200mg之间。

在一些实施例中，治疗有效剂量范围为约0.005mg/kg脑重量至500mg/kg脑重量，例如约0.005mg/kg脑重量至400mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至300mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至200mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至100mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至90mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至80mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至70mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至60mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至50mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至40mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至30mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至25mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至20mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至15mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至10mg/kg脑重量。

在一些实施例中，治疗有效剂量大于约0.1mg/kg脑重量、大于约0.5mg/kg脑重量、大于约1.0mg/kg脑重量、大于约3mg/kg脑重量、大于约5mg/kg脑重量、大于约10mg/kg脑重量、大于约15mg/kg脑重量、大于约20mg/kg脑重量、大于约30mg/kg脑重量、大于约40mg/kg脑重量、大于约50mg/kg脑重量、大于约60mg/kg脑重量、大于约70mg/kg脑重量、大于约80mg/kg脑重量、大于约90mg/kg脑重量、大于约100mg/kg脑重量、大于约150mg/kg脑重量、大于约200mg/kg脑重量、大于约250mg/kg脑重量、大于约300mg/kg脑重量、大于约350mg/kg脑重量、大于约400mg/kg脑重量、大于约450mg/kg脑重量、大于约500mg/kg脑重量。

在一些实施例中，治疗有效剂量还可通过mg/kg体重来定义。如本领域技术人员将了解的，脑重量和体重可为相关联的。Dekaban AS.“Changes in brain weights duringthe span of human life:relation of brain weights to body heights and bodyweights,”Ann Neurol 1978；4:345-56。因此，在一些实施例中，剂量可如表4中所示转换。

表4

在一些实施例中，治疗有效剂量还可由mg/15cc的CSF来定义。如本领域技术人员将了解的，基于脑重量和体重的治疗有效剂量可转换为mg/15cc的CSF。例如，成年人中的CSF体积为大约150mL(Johanson CE等人，“Multiplicity of cerebrospinal fluidfunctions:New challenges in health and disease,”Cerebrospinal Fluid Res.2008年5月14日；5:10)。因此，0.1mg至50mg蛋白质对成人的单次剂量注射将是在成人中大约0.01mg/15cc的CSF(0.1mg)至5.0mg/15cc的CSF(50mg)剂量。

应进一步理解，对于任何特定受试者，应该根据个体需要和施用酶替代疗法或监督施用酶替代疗法的人的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅为示例性的，并不预期限制本发明的范围或实践。

在某些实施例中，重组芳基硫酸酯酶A酶以施用间隔施用例如规则间隔施用。例如，施用间隔可为每周一次、每两周一次、或每月一次。

在某些实施例中，施用重组芳基硫酸酯酶A酶达到治疗期。治疗期可为预先确定的，或者可根据患者对治疗的应答进行调整，包括但不限于如本文讨论的可能的不良症状和/或治疗功效的证据。例如，治疗期可为至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少24个月、或甚至更大。

考虑在一些实施例中，受试者将经历经过某一治疗期的治疗，经历某一时期，在此期间他们不接受治疗或替代治疗，然后再次经历另一治疗期。

试剂盒

本发明还提供了含有本发明的制剂的试剂盒或其它制造物品，并且提供关于其重构(如果冻干的话)和/或使用的说明。试剂盒或其它制造物品可包括容器、IDDD、导管以及可用于鞘内施用和相关手术的任何其它物品、装置或设备。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器(例如预填充注射器)、安瓿、药筒、储库或lyo-ject。容器可由各种材料例如玻璃或塑料形成。在一些实施例中，容器是预填充注射器。合适的预填充注射器包括但不限于具有烘焙硅酮涂层的硼硅酸盐玻璃注射器、具有喷涂硅酮的硼硅酸盐玻璃注射器、或不含硅酮的塑料树脂注射器。

通常，容器可容纳制剂和在容器上或与容器结合的标签，其可指示关于重构和/或使用的说明书。例如，标签可指示制剂如上所述重构为蛋白质浓度。标签还可指示该制剂可用于或预期用于例如IT施用。在一些实施例中，容器可含有含有治疗剂(例如替代酶)的稳定制剂的单次剂量。在各种实施例中，稳定制剂的单次剂量以小于约15ml、10ml、5.0ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml、1.5ml、1.0ml或0.5ml的体积存在。可替代地，容纳制剂的容器可为多次使用的小瓶，其允许制剂的重复施用(例如，2-6次施用)。试剂盒或其它制造物品还可包括第二容器，其包含合适的稀释剂(例如BWFI、盐水、缓冲盐水)。在稀释剂和制剂混合时，重构制剂中的最终蛋白质浓度一般为至少1mg/ml(例如，至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml)。在一些实施例中，最终蛋白质浓度为至少25mg/mL，例如30mg/mL。试剂盒或其它制造物品还可包括从商业和用户角度来看期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针、IDDD、导管、注射器和具有使用说明书的包装插页。

通过参考下述实例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。虽然已根据某些实施例特异性描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但下述实例仅作用于示出本发明的化合物，而不是预期限制其。所有文献引用都以引用的方式并入。

项目1.一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。

项目2.根据项目1所述的方法，其中重组ASA酶的施用还导致一种或多种认知功能、适应功能和/或执行功能的改善、稳定或减少下降。

项目3.根据项目1或2所述的方法，其中所述一种或多种运动功能包括粗大运动功能。

项目4.根据项目3所述的方法，其中所述粗大运动功能通过粗大运动功能测量(GMFM)测试加以评价。

项目5.根据项目4所述的方法，其中GMFM测试是GMFM-88。

项目6.根据项目5所述的方法，其中基线GMFM-88评分大于40％。

项目7.根据项目5所述的方法，其中基线GMFM-88评分小于40％。

项目8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的下降小于10％、20％、30％、40％或50％。

项目9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的基本稳定。

项目10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的改善。

项目11.一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：

向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以降低相对于生物标记物的基线水平在体液中在MLD中累积的生物标记物的水平的治疗期，所述体液选自脑脊髓液、尿、血液和血清。

项目12.根据项目11所述的方法，其中所述生物标记物选自硫苷脂、溶血硫苷脂及其组合。

项目13.根据项目12所述的方法，其中所述生物标记物是硫苷脂。

项目14.根据项目11、12或13所述的方法，其中所述体液是脑脊髓液。

项目15.根据项目14所述的方法，其中所述脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于约0.1μg/mL。

项目16.根据项目14所述的方法，其中所述脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于约0.2μg/mL。

项目17.根据项目14所述的方法，其中所述脑脊髓液中的基线硫苷脂水平大于约0.3μg/mL。

项目18.根据项目14-17中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致所述脑脊髓液中多于约0.1μg/mL的硫苷脂水平的减少。

项目19.根据项目14-17中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致所述脑脊髓液中多于约0.2μg/mL的硫苷脂水平的减少。

项目20.一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：

向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以增加相对于生物标记物的基线水平在脑组织中的MLD中降低的生物标记物的水平的治疗期。

项目21.根据项目20所述的方法，其中所述脑组织是脑的深白质。

项目22.根据项目20或21所述的方法，其中所述生物标记物是代谢产物。

项目23.根据项目22所述的方法，其中所述代谢产物是N-乙酰天冬氨酸。

项目24.根据项目23所述的方法，其中通过质子磁共振波谱评价N-乙酰天冬氨酸的水平。

项目25.一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：

向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以稳定或减少相对于基线的脑损伤受累的治疗期。

项目26.根据项目25所述的方法，其中通过MLD MRI(磁共振成像)严重性评分来评价脑损伤受累。

项目27.根据项目26所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致所述受试者中的MLDMRI严重性评分相对于基线的减少。

项目28.根据项目26所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致所述受试者中的MLDMRI严重性评分相对于基线的稳定。

项目29.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量为10mg或大于10mg。

项目30.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量为30mg或大于30mg。

项目31.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量为100mg或大于100mg。

项目32.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量小于200mg。

项目33.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述施用间隔是每周一次。

项目34.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述施用间隔是每两周一次。

项目35.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述施用间隔是每月一次。

项目36.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

项目37.根据项目36所述的方法，其中所述受试者是人。

项目38.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是十六岁或更小。

项目39.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是十二岁或更小。

项目40.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是九岁或更小。

项目41.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是六岁或更小。

项目42.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是四岁或更小。

项目43.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是三岁或更小。

项目44.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是两岁或更小。

项目45.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是18个月或更小。

项目46.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是12个月或更小。

项目47.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者是6个月或更小。

项目48.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者已显示出异染性脑白质营养不良的至少一种症状。

项目49.根据项目1-47中任一项所述的方法，其中所述受试者未显示出异染性脑白质营养不良的任何症状。

项目50.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断有异染性脑白质营养不良。

项目51.根据项目1-49中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为处于发展异染性脑白质营养不良的风险中。

项目52.根据前述项目中任一项所述的方法，其中将芳基硫酸酯酶A施用到椎管内。

项目53.根据项目52所述的方法，其中将芳基硫酸酯酶A施用到腰区内。

项目54.根据项目53所述的方法，其中所述芳基硫酸酯酶A通过腰椎穿刺进行施用。

项目55.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述鞘内施用是通过对植入的鞘内药物递送装置(IDDD)的间歇或连续接近。

项目56.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述治疗期为至少6个月。

项目57.根据项目56所述的方法，其中所述治疗期为至少9个月。

项目58.根据项目56所述的方法，其中所述治疗期为至少12个月。

项目59.根据项目56所述的方法，其中所述治疗期为至少24个月。

项目60.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在所述受试者中未观察到与重组芳基硫酸酯酶A的施用相关的严重副作用。

项目61.一种重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，其用于包括以下步骤的方法中：

向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线下降的治疗期。

项目62.一种重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，其用于包括以下步骤的方法中：

向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以降低相对于基线的脑脊髓液(CSF)中的硫苷脂水平的治疗期。

项目63.一种重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，其用于包括以下步骤的方法中：

向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以稳定或减少相对于基线的脑损伤受累的治疗期。

项目64.重组芳基硫酸酯酶A酶在制造用于治疗或预防异染性脑白质营养不良的药物中的用途，其中所述治疗包括以下步骤：

向处于异染性脑白质营养不良的风险中或患有异染性脑白质营养不良的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。

项目65.重组芳基硫酸酯酶A酶在制造用于治疗或预防异染性脑白质营养不良的药物中的用途，其中所述治疗包括以下步骤：

项目66.重组芳基硫酸酯酶A酶在制造用于治疗或预防异染性脑白质营养不良的药物中的用途，其中所述治疗包括以下步骤：

项目67.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少85％相同的氨基酸序列。

项目68.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。

项目69.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列。

项目70.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含在氨基酸水平上与SEQ ID NO:1至少98％相同的氨基酸序列。

项目71.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

项目72.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于四个错配。

项目73.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于三个错配。

项目74.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于两个错配。

项目75.根据前述项目中任一项所述的方法或重组芳基硫酸酯酶A酶，其中重组ASA酶包含的氨基酸序列含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的不多于一个错配。

实例

实例1：重组芳基硫酸酯酶A的鞘内施用是安全的，并且改善了人晚期婴儿和青少年异染性脑白质营养不良患者中的症状

异染性脑白质营养不良的临床形式通常通过发病年龄分开，其中晚期婴儿异染性脑白质营养不良与三岁或更小的发病年龄相关，青少年异染性脑白质营养不良与四至十六岁之间的发病年龄相关，并且成人异染性脑白质营养不良与大于十六岁的发病年龄有关。

患有异染性脑白质营养不良的儿童通常经历运动功能下降，并且患有晚期婴儿异染性脑白质营养不良的儿童仅具有大致52％的五年存活率(Mahmood A等人J ChildNeurol.2010；25:572-80)。目前不存在经批准的药理学治疗。

本实例描述了在患有异染性脑白质营养不良(MLD)，例如患有晚期婴儿或青少年异染性脑白质营养不良的儿童中的1/2期、非随机、开放标签的剂量递增临床研究，以评估重组人芳基硫酸酯酶A(ASA)的安全性和功效。为了评估功效，分析了重组人ASA治疗对粗大运动功能、脑损伤受累和CSF中的硫苷脂水平的作用。

十八个男性或女性患者入选该研究，并且符合所有下述筛选标准：f通过ASA缺乏(通过白细胞中的测定)和患者尿中升高的硫苷脂水平确认MLD诊断；在30个月时或30个月之前出现第一次疾病症状；在筛选时走动(例如，所需的最低功能水平，定义为单手举起站立和前进10步的能力)；在入选时小于十二岁；以及在筛选检查时存在MLD的神经体征。

排除标准包括：造血干细胞移植史；任何已知或疑似的麻醉超敏反应或者由于气道受损或其它状况的无法接受的高麻醉风险；任何其它医学状况、严重的并发病或排除研究参与的情有可原的情况。研究设计显示于图1中。

在入选时，筛选患者以基于上述标准评价他们的资格以及获得知情同意书。还对于IDDD的手术植入进行了术前安全性评价。遵循标准的医院手术程序。

患者入选鞘内施用的重组人ASA的三个递增剂量群组(n＝6个患者/群组，以10mg、30mg或100mg/剂量)之一。患者依据施用者的判断根据需要接受镇静剂。新近包括的患者对下一个剂量水平的任何升级都基于通过独立数据安全监测委员会和来自Shire HumanGenetic Therapies的代表对于较低剂量群组中的患者获得的安全性数据的审查，并且仅在患者接受至少两次剂量后。表5显示了该研究的患者人口统计学。

简言之，将一个端口皮下放置在肋骨上，其中导管在腰椎水平处至脊柱通道。如果装置随时变得无功能，则将其取出且更换。使用PORT-A-CATH或/>Mini S，后者看起来是更好耐受的。(参见表6。)在基线时进行一系列CSF评价，并且每次研究就诊以剂量前方式。每隔一周经由植入的IDDD给药重组人ASA，共38周(从第0周开始)，总共20次注射。IDDD用于CSF取样和重组人ASA注射两者。在给药前每隔一周获取用于测量的样品，以评价安全性/功效。

安全性

表6列出了研究中报告的不良事件，其中显示的数目代表患者的数目。如表6中所示，在三个群组(10mg、30mg或100mg给药)的任一个中不存在严重的治疗相关的不良事件、死亡或停药。

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^a在任何组中的至少两个患者中出现时，显示通过系统器官类别的事件。^b包括增加的丙氨酸氨基转移酶，血压，嗜酸性粒细胞计数和γ-谷氨酰转移酶。AE＝不良事件；IDDD＝鞘内药物递送装置；rhASA＝重组人芳基硫酸酯酶A

^a＝一个患者在研究开始时具有植入的Mini S。AE＝不良事件；IDDD＝鞘内药物递送装置；rhASA＝重组人芳基硫酸酯酶A

运动功能

运动功能通过粗大运动功能测量-88(GMFM-88)进行评价，这是设计为定量儿童中的粗大运动功能变化的临床工具。GMFM-88上的项目包括涉及躺卧、滚动、行走、跑步和跳跃技能的活动。

在第40周时，跨越所有治疗组的GMFM-88总分变化显示于图2中。在第40周时，运动功能下降在施用100mg的患者组中在数值上低于其它治疗组(较低剂量)，尽管在组间未检测到统计学显著差异。

然而，检测到基线GMFM-88总分与治疗效应(如通过GMFM-88评分从基线的变化评价的)之间的统计学显著相互作用(通过ANCOVA(协方差分析)p＝0.0067；参见图3)。在第40周时，在GMFM-88基线总分大于40％的儿童中，用100mg rhASA治疗的儿童存在比其它组更少的运动功能下降。(参见图4)

脑损伤受累

异染性脑白质营养不良磁共振成像(MLD MRI)严重性评分是脑损伤受累的定量测量。(参见例如，Eichler等人AJNR Am J Neuroradiol.2009 Nov；30(10):1893-7.)MRI数据由一名研究者以不知情方式在第40周时在患者中进行评价。

如图5所示，在第40周时，MLD MRI严重性评分在100mg群组中看起来稳定，其显示出评分中的略微降低。100mg群组中的MLD MRI严重性评分变化显著不同于10mg和30mg群组中观察到的变化，其经过疗程显示出MLD MRI严重性评分中的增加。

脑脊髓液中的硫苷脂水平

在患者的脑脊髓液中研究了硫苷脂(在异染性脑白质营养不良患者中积累的代谢产物)的浓度。如图6所示，在第40周时，在所有群组中观察到硫苷脂浓度中的少量降低。

讨论

本实例中描述的结果证实，在患有MLD的患者中鞘内施用重组人ASA具有可接受的安全性特征，并且稳定和/或减缓疾病的进展。由于目前不存在可用于这种进行性和最终致命的疾病的治疗，因此重组人ASA的鞘内施用代表了用于治疗MLD的有希望的方法。

实例2：重组芳基硫酸酯酶A用于治疗异染性脑白质营养不良的另外安全性和功效评价

患有晚期婴儿或青少年异染性脑白质营养不良的患者入选临床研究，其设计以及纳入和排除标准类似于实例1中描述的那种。为了进一步评价重组人ASA在特定剂量下的安全性，对患者进行身体和神经学检查，并且检测其生命体征。另外，执行一系列分析，包括尿分析、血清化学、血清硫苷脂水平、全血细胞计数、脑脊髓液的常规和生物标记物分析、以及心电学。此外，在各种流体例如脑脊髓液、尿和血液中测量抗rhASA抗体浓度和/或代谢产物(例如，硫苷脂、溶血硫苷脂和/或N-乙酰天冬氨酸)水平。也可通过质子磁共振波谱在脑的深白质中评价代谢产物水平。

为了评价功效，评价了GMFM-88评分中从基线的一种或多种变化、运动神经传导指标(如神经传导速度、复合运动动作电位和远端潜伏期)、感觉神经传导指标(如神经传导速度、振幅和远端潜伏期)、磁共振成像和/或磁共振波谱以检测MLD相关异常、躯体感觉诱发电位、肿胀的功能内镜评估和脑干听觉诱发反应。

实例3：随着时间推移的脑脊髓液硫苷脂水平的降低

儿童入选临床研究，并且每隔一周通过鞘内施用来施用10mg、30mg或100mg重组人芳基硫酸酯酶A，共40周。图7呈现了通过群组来自一些儿童的数据，并且包括来自两个同胞对的数据(一对以30mg剂量，并且另一对以100mg剂量)。如图7所示，存在在给予30mg和100mg剂量的儿童中尤其明显的脑脊髓液中的硫苷脂水平降低的随着时间推移的普遍趋势。此外，在施用100mg重组人芳基硫酸酯酶A的儿童中，硫苷脂水平最终下降，使得它们在正常范围的上限内。

实例4：鞘内递送的rhASA对于超过104周是良好耐受的

实例1-3中描述的三个群组有资格进行长期扩展研究，其包括直至第104周的安全性分析和其它结果评价(包括最初的40周剂量递增研究(图8))。如果患有MLD的儿童小于12岁，则他们有资格入选最初的40周研究；他们的第一个MLD症状出现在30个月时或30个月之前；并且在筛选时，他们可伴随一只手举起走10步。将合格患者序贯入选到三个递增剂量群组之一(群组1，rhASA 10mg；群组2，rhASA 30mg；群组3，rhASA 100mg)内。在接受其第一个剂量之前，每个患者被手术植入鞘内药物递送装置(IDDD)。在研究早期的十一个患者植入PORT-A-CATH II(Smiths Medical ASD,Inc.,St Paul,MN,USA)，并且八个患者植入SOPH-A-PORT MiniS(Sophysa，Orsay，法国)(包括在最初植入PORT-A-CATH II后转变为该装置的一个患者)。

儿童每2周接受rhASA的鞘内注射。在最初的40周研究之后，rhASA剂量在群组1和2(群组1，逐步)中个别增加，其中所有患者在正在进行的研究中最终接受rhASA 100mg。在患者已接受先前剂量的至少两个剂量后，升级至更高剂量的决定基于数据安全监测委员会的审查。主要结果评价是rhASA和IDDD的安全性。在104周时评价的其它关键结果包括运动功能中的变化，使用粗大运动功能测量-88(GMFM-88)总分(范围0-100％)评估；MLD严重性中的变化，使用磁共振成像(MRI)和给予Eichler等人的类似评分方法(范围0-34，其中更高的评分指示更大的疾病严重性)(参见例如，Eichler等人AJNR Am J Neuroradiol.2009Nov；30(10):1893-7))评估；通过磁共振波谱评估的脑白质中的N-乙酰天冬氨酸(NAA)水平中的变化，以及脑脊髓液(CSF)中的硫苷脂浓度中的变化。表8显示了该研究的患者人口统计学。

表8：患者人口统计学

入选时的年龄、症状发作的年龄和暴露持续时间的数据显示为平均值±标准差(中值，范围)。

^a儿童在五个国家中入选：法国(n＝7)、丹麦(n＝4)、澳大利亚(n＝3)、德国(n＝2)和巴西(n＝2)。来自澳大利亚的两个患者在扩展研究期间搬迁到日本。^b从第一个剂量施用到施用的最后一个剂量rhASA施用的时间。^c由于功效的缺乏，在40周的剂量递增研究期间，一个儿童退出。MLD，异染性脑白质营养不良；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A。

安全性

表9中呈现了直到104周的记录不良事件(AE)概括。十一个患者经历至少一次IDDD相关AE；并且14个患者经历至少一次严重AE(SAE)。六个患者经历至少一次IDDD相关的SAE。十三个患者经历由研究者判断为与研究治疗有关的至少一次AE，最常见的是发热(n＝6)。

表9：直至104周的不良事件概括

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数据显示为患者数目。

^a当在研究中的至少三个患者中出现时，给出通过优选项的SAE。所有SAE判断为与治疗无关；^b群组1和群组2中的五个患者在研究开始时接受PORT-A-CATH II。群组3中的所有患者和群组2组中的一个患者接受SOPH-A-PORT Mini S；^c当在任何组中的至少两个患者中出现时，显示了通过系统器官类别的AE。对于每个系统器官类别显示了优选项。AE，不良事件；IDDD，鞘内药物递送装置；SAE，严重不良事件

运动功能

在图9A中显示了从基线到第104周的所有群组中的平均GMFM-88总分降低。群组3中的两个儿童(在治疗开始时年龄为23和107个月)显示其运动功能稳定的证据，其中绝对GMFM-88总分直至第104周高于40％，如图9B中的星号所示。在第104周时，这些儿童之一(开始治疗时年龄为23个月)具有94.3％的GMFM-88总分。该患者的年龄较大的同胞(也来自群组3)在年龄为42个月时开始治疗，在大约相同年龄时具有12.2％的GMFM-88总分以及在第104周时13.7％的评分。基于年龄0-6岁的34个健康儿童的评分，大于30个月的健康儿童中的平均GMFM-88总分估计为>90％(参见例如，Sessa M等人Lancet 2016；388:476-87)。从基线到第104周的GMFM-88总分中的平均变化±标准差。在第40周后，群组1和2中的患者具有其剂量的个别增加(组1，逐步)，其中所有患者最终接受rhASA100mg。

MLD严重性的测量

从基线到第104周，平均总MRI-MLD严重性评分在群组1和2中增加；然而，它看起来在群组3经过相同时期保持稳定(图10)。在基线时的平均±标准差总MRI-MLD严重性评分(评分范围为0至34，其中评分越高指示疾病严重性越大)评价经过104周的治疗，鞘内递送的rhASA对脑白质中的平均NAA/肌酸代谢产物比的作用。在群组2和3中，额叶(图11A)和额-顶叶(图11B)白质的平均NAA/肌酸代谢产物比经过104周看起来稳定，但在群组1中趋于降低。NAA/肌酸比中的降低指示神经元丢失和MLD疾病进展。在年龄为2.5-6岁的四个健康儿童中，脑室周白质NAA/肌酸比为1.51-2.30(参见例如，Assadi M等人J Cent Nerv SystDis 2013；5:25-30)。

CSF硫苷脂浓度

所有群组中的平均CSF硫苷脂浓度从基线到第104周降低，其中群组3从第15周开始处于正常范围内(≤0.11μg/mL，基于来自60个儿科患者的CSF样品)(图12)。基线CSF硫苷脂水平在群组3中低于其它两个群组。

扩展研究概括

鞘内递送的rhASA在患有MLD的儿童中是良好耐受的。虽然经过104周的治疗存在运动功能中的普遍下降，但存在从研究开始时接受rhASA 100mg的患者中的治疗应答的证据(群组3)。对于群组3，存在平均MRI-MLD严重性评分和白质NAA水平中的最小变化。群组3中的两个患者显示运动功能的稳定。治疗应答在群组1和2中不明显。研究中的一个儿童对于晚期婴儿MLD可能不典型，并且更具代表性的青少年MLD。这些发现支持鞘内递送rhASA的持续发展，作为用于患有晚期MLD的患者的潜在治疗方法。另外六个儿童(群组4)随后入选该研究，并且目前每隔一周接受rhASA 100mg。

除非明确指出相反，否则如本文说明书和权利要求书中使用的冠词“一个”和“一种”应理解为包括复数指示物。如果组成员中的一个、多于一个或全部存在于给定产物或过程中、用于给定产物或过程中、或者以其它方式与给定产物或过程相关，则包括组中一个或多个成员之间的“或”的声明或描述视为满足的，除非另有相反说明或从上下文中显而易见。本发明包括这样的实施例，其中该组的恰好一个成员存在于给定产物或过程中、用于给定产物或过程中、或者以其它方式与给定产物或过程相关。本发明还包括这样的实施例，其中多于一个或整体组成员存在于给定产物或过程中、用于给定产物或过程中、或者以其它方式与给定产物或过程相关。此外，应理解本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中来自所列权利要求中的一个或多个的一个或多个限制、元素、条款、描述性术语等被引入另一个权利要求，取决于相同的基本权利要求(或如相关的、任何其它权利要求)，除非另有说明或除非对于本领域普通技术人员显而易见的是将出现矛盾或不一致。当元素呈现为列表时(例如，以马库什组或类似格式)，应理解还公开了元素的每个子组，并且可从组中去除任何元素。应当理解，一般而言，当本发明或本发明的方面被称为包括特定元件、特征等时，本发明的某些实施例或本发明的方面由此类元素等组成或基本上由此类元素等组成。为了简单起见，这些实施例在本文中并非在每一种情况下都以如此多的词语具体阐述。还应当理解，无论是否在说明书中叙述了特定排除，本发明的任何实施例或方面都可明确地从权利要求中排除。描述本发明的背景并提供关于其实践的另外细节的本文引用的出版物、网站和其它参考材料在此以引用的方式并入。

Claims

1.一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，其包括以下步骤：向需要治疗的受试者鞘内施用以治疗有效剂量和施用间隔的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)酶，达到足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。

2.根据权利要求1所述的方法，其中重组ASA酶的施用还导致一种或多种认知功能、适应功能和/或执行功能的改善、稳定或减少下降。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种运动功能包括粗大运动功能。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述粗大运动功能通过粗大运动功能测量(GMFM)测试加以评价。

5.根据权利要求4所述的方法，其中GMFM测试是GMFM-88。

6.根据权利要求5所述的方法，其中基线GMFM-88评分大于40％。

7.根据权利要求5所述的方法，其中基线GMFM-88评分小于40％。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的下降小于10％、20％、30％、40％或50％。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的基本稳定。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中重组ASA酶的施用导致GMFM-88评分的改善。