KR20130043166A - 산필리포 증후군 b형의 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무엇보다도 산필리포 증후군 B형 (산필리포 B형)을 예로, Naglu 단백질의 경막내 (IT) 투여에 의해 치료하는 방법들 및 조성물들을 제공한다. 적합한 Naglu 단백질은 재조합, 유전자-활성화 또는 천연의 단백질이다. 일정 구현예들에서, 적합한 Naglu 단백질은 재조합 Naglu 단백질이다. 일정 구현예들에서, 재조합 Naglu 단백질은 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체를 포함하는 융합 단백질이다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 도메인은 IGF-II 분체이다.

Description

산필리포 증후군 B형의 치료{TREATMENT OF SANFILIPPO SYNDROME TYPE B}

관련 출원들에 관한 상호 참조

본 출원은 미국 가특허출원들 2010년 6월 25일자로 제출된 일련번호 제 61/358,857호; 2010년 7월 1일자로 제출된 제61/360,786호; 2010년 9월 29일자로 제출된 제 61/387,862호; 2011년 1월 24일자로 제출된 제 61/435,710호; 2011년 2월 11일자로 제출된 제 61/442,115호; 2011년 4월 15일자로 제출된 제 61/476,210호; 및 2011년 6월 9일자로 제출된 제 61/495,268호에 대한 우선권을 주장하고 있고; 이들 각각은 전부 본 명세서에 의해 참조문헌으로 통합되어 있다.

본 출원은 동일한 날짜에 제출된 "치료제들의 CNS 전달 (CNS Delivery of Therapeutic Agents)"; 동일한 날짜에 제출된 "헤파란 N-설파타제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Heparan N-Sulfatase)" ; 동일한 날짜에 제출된 "이듀로네이트-2-설파타제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase)"; 동일한 날짜에 제출된 "β-갈락토세레브로시다제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of β-Galactocerebrosidase)"; 동일한 날짜에 제출된 "아릴설파타제 A의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Arylsulfatase A)"라는 명칭을 가지는 미국 출원들에 관한 것이고; 이들 각각은 전부 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합되어 있다.

효소 대체 요법 (Enzyme replacement therapy, ERT)은 개체에게 천연 또는 재조합-유래 단백질들 및/또는 효소들의 전신적 투여가 관여한다. 승인된 요법들은 전형적으로 정맥내 투여되고 근간이 되는 효소 결핍의 신체적 증상들을 치료하는 데 일반적으로 효과적이다. 중추신경계 (CNS)의 세포들 및 조직들 내에 정맥내 투여된 단백질 및/또는 효소의 제한된 분배의 결과로서, CNS 병인학 (CNS etiology)을 가지는 질환들의 치료는 정맥내 투여된 단백질들 및/또는 효소들이 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barrier, BBB)을 적당하게 통과하지 못하기 때문에 특히 문제가 되어왔다.

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 박테리아, 거대분자들 (예로, 단백질들) 및 기타 친수성 분자들과 같은 혈류에서 해로운 물질들로부터 중추신경계 (CNS)를 보호하도록 BBB를 거쳐서 근간이 되는 뇌척수액 (CSF) 및 CNS 내로 이러한 물질들의 확산을 제한하는 기능을 하는 내피세포들을 포함하는 구조적 체계이다.

조직 분포를 변경하는 직접적인 두개내 (intra-cranial) 주사, BBB의 일시적 투과화 (transient permeabilization), 및 활성을 가진 제제의 변형을 포함하는, 치료제의 뇌 전달을 증진하도록 BBB를 기만하는 여러 가지의 방식들이 존재한다. 뇌 조직 내로 치료제의 직접 주사는 혈관 구조 (vasculature)를 완전하게 우회하지만, 두개내 주사들 및 투여 부위로부터 적게 확산되는 활성을 가진 제제로 인해 발생되는 합병증들 (감염, 조직 손상, 면역 반응)의 위험을 주로 겪는다. 지금까지, 뇌 물질 내로 단백질들의 직접 투여는 확산 장벽들 및 투여가능한 치료제의 제한된 부피로 인해 유의한 치료 효과를 달성하지 못하였다. 전도-조력 (convection-assisted) 확산은 저속의 장기간 주입 (long-term infusions)을 사용하는 뇌 실질 (parenchyma)에 설치된 카테터들에 의해 연구되어 왔지만 (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), 현재 승인된 요법들은 본 장기 요법의 접근법을 전혀 사용하지 않고 있다. 또한, 뇌내 카테터들의 설치는 매우 침습적이고 임상적 대안으로서 별로 바람직하지 않다.

경막내 (IT) 주사, 또는 뇌척수액 (CSF)으로 단백질들의 투여도 역시 시도되어 왔지만, 치료적 성공은 아직 달성하지 못하였다. 본 치료의 대부분의 도전은 연속적인 확산을 방해하는 뇌실의 뇌실막 내층 (ependymal lining)과 매우 강하게 결합하는 활성을 가진 제제의 경향이 되어왔다. 현재로는, CSF로의 직접 투여에 의해 뇌의 유전적 질환을 치료하는 승인된 제품들이 전혀 없다.

사실상, 많은 사람들이 뇌의 표면에서는 확산에 대한 장벽, 뿐만 아니라 효과적이고 편리한 전달 방법들의 부족이 너무 큰 장애물이 되어 뇌 질환이라면 모두에서 적당한 치료적 효과를 달성할 수 없는 것으로 여겨왔다.

산필리포 증후군 (Sanfilippo syndrome), 또는 점액다당류증 제 III형 (MPS III)은 글리코사미노글리칸들 (GAG)의 분해에 관여하는 효소들의 결핍을 특징으로 하는 희귀한 유전병이다. 효소의 부재 시, 부분적으로 분해된 GAG 분자들은 신체로부터 청소될 수 있고 다양한 조직들의 리소좀들에 축적되어 광범위한 진행성 신체적 기능이상을 유발한다 (Neufeld and Muenzer, 2001).

MPS IIIA, B, C, 및 D라고 명명되는 네 가지의 구별된 형태들의 MPS III가 확인되어 왔다. 각각은 GAG 헤파란 설페이트의 분해에 관여하는 네 가지 효소들의 하나에 결핍을 나타낸다. 모든 형태들은 조잡한 얼굴 특징들, 간비장비대, 각막 혼탁 및 골격 변형들을 포함하는 동일한 임상적 증상들의 다양한 정도들을 포함한다. 그러나 가장 명확하게는, 뉴런들에서 헤파란 설페이트의 축적뿐만 아니라 일차적인 GAG 축적에 의해 초래되는 갱글리오사이드들 GM2, GM3 및 GD2의 이어지는 상승과 관련된 인지 능력의 심각한 진행성 상실이다 (Walkley 1998).

점액다당류증 제 IIIB형 (MPS IIIB; 산필리포 B형 질환)은 효소 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (Naglu)의 결핍을 특징으로 하는 상염색체 열성 장애이다. 본 효소의 부재 시, GAG 헤파란 설페이트가 뇌 외부는 더 적게 축적되면서 뉴런들 및 교아세포들의 리소좀에 축적된다. 지금까지, 산필리포 B형 질환으로부터 유발되는 CNS 증상들은 사용가능한 수단이라면 모두에 의해 전혀 성공적으로 치료되지 못하였다.

따라서, 뇌에 치료제들을 효과적으로 전달해야 하는 강한 필요성이 있다. 보다 상세하게는, 리소좀 축적 장애들을 치료하기 위해 중추신경계로 활성을 가진 제제들의 더욱 효과적인 전달을 위한 강한 필요성이 있다.

본 발명은 산필립포 B형 질환의 효과적인 치료를 위한 조성물들 및 방법들을 제공한다. 본 발명은, 부분적으로 동물 질환 모델에게 재조합 알파-N-아세틸글루코사미니다제 (Naglu) 단백질 (예로, Naglu-IGFII 융합 단백질)의 경막내 투여가 다양한 뇌 조직들에서 대량의 GAG 축적을 포함하는 산필리포 B형 질환의 다양한 증상을 치료 (예로, 개선, 억제, 또는 이의 발생의 지연)하는 데 예기치 않게도 효과적인 점의 발견을 기초로 한다.

본 발명의 이전에도, 재조합으로 생산된 Naglu 단백질이 리소좀 표적화를 위해 전형적으로 요구되는 만노스-6-포스페이트 (M6P)를 부족하게 하는 점이 보고되었다. 따라서, 산필리포 B형 질환을 위한 효소 대체 요법은 CNS에서 우세한 소견 및 M6P 잔기들의 결여 때문에 독특한 문제점을 나타낸다. 하기에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 Naglu-IGFII의 경막내 주사들이 뇌에서 GAG 축적의 놀랍게도 효과적인 감소, 뇌 조직에서 리소좀 축적의 역적, 및 뇌 실질 내로 Naglu-IGFII의 침투를 유도하였던 점을 기술하여 왔다. 상세한 이론들이라면 모두에 집착하려고 않더라도, IGF-II 분체와 같은 리소좀 표적 분체는 만노스-6-포스페이트 (M6P)의 결여를 극복할 수 있어, 표적 조직들에서 M6P-비의존성 리소좀 표적화를 유도하는 것으로 사료된다. 이들 결과는 Naglu-IGFII 융합 단백질과 같은 Naglu 단백질의 IT 투여가 산필리포 B형 질환을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있는 점을 가르킨다. 따라서, 본 발명은 산필리포 B형 효소 대체 요법에서 중요한 돌파구를 제시하고 있다.

IT투여가 하기 실시예들에서 기술되기는 하더라도, 본 발명에 따른 Naglu 융합 단백질이 CNS로, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질내, 대뇌내, 뇌실내의 대뇌 (ICV), 경막내 (예로, IT-요추, IT-대수공) 투여들을 포함하는 다양한 기법들 및 경로들 또한 CNS및/또는 CSF로의 직접 또는 간접 주사를 위한 기타 다른 기법들 및 경로들을 통하여 직접 또는 간접적으로 전달되었던 것으로 사료된다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 재조합 알파-N-아세틸글루코사미니다제 (Naglu) 단백질을 치료가 필요한 개체에게 경막내 투여하는 단계를 포함하는 산필리포 증후군 B형 (San B)을 치료하는 방법들을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 적합한 Naglu 단백질은 합성, 재조합, 유전자-활성화 또는 천연의 단백질이다.

일정 구현예들에서, 적합한 Naglu 단백질은 재조합 Naglu 단백질이다. 일정 구현예들에서, 재조합 Naglu 단백질은 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체를 포함하는 융합 단백질이다. 소정의 구현예들에서, Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 적어도 70% (예로, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.

일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 IGF-II 분체이다. 소정의 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 70% (예로, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 2)과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)의 8 내지 67번 잔기들을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

일정 구현예들에서, 융합 단백질은 상기에 더하여 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체 사이에 링커를 포함한다. 소정의 구현예들에서, 링커는 GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4)의 하나 이상의 아미노산 서열들을 포함한다. 소정의 구현예들에서, GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4)의 아미노산 서열은 일렬 반복서열들로 존재한다.

일정 구현예들에서, 링커는 상기에 더하여 하나 이상의 GAP 서열들을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 링커는

GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함한다.

일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 Naglu 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 링커에 의해 융합된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 Naglu 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 링커에 의해 융합된다.

일정 구현예들에서, 재조합 단백질은 인간 세포들로부터 생산된다. 일정 구현예들에서, 재조합 단백질은 CHO 세포들로부터 생산된다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 하나 이상의 표적 뇌 조직들에서 Naglu 단백질의 전달을 유도한다. 소정의 구현예들에서, 하나 이상의 표적 뇌 조직들은 회색질, 백색질, 뇌실 영역들, 연질-거미막, 뇌척수막, 신생피질, 소뇌, 대뇌 피질의 깊은 조직들, 분자층, 미상엽핵/조가비핵 부위, 중뇌 또는 연수의 깊은 부위들, 및 그들의 조합으로부터 나온 조직들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일정 구현예들에서, Naglu 단백질은 뉴런들, 교아세포들, 혈관주위 세포들 및/또는 뇌척수막 세포들로 전달된다. 일정 구현예들에서, Naglu 단백질은 상기에 더하여 척수에 있는 뉴런들로 전달된다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 상기에 더하여 말초 표적 조직들에서 Naglu 단백질의 전신적 전달을 유도한다. 소정의 구현예들에서, 말초 표적 조직들은 간, 신장, 비장, 및/또는 심장으로부터 선택된다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 리소좀 정착을 유도한다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 리소좀 축적 (예로, 축적된 효소 기질)의 감소를 유도한다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 축적은 LAMP-1 염색에 의해 결정된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 적어도 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 또는 2배로 감소된다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뉴런들에서 감소된 공포화 (vacuolization) 를 유도한다. 일정 구현예들에서, 뉴런들은 퍼킨지 세포들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 증가된 Naglu 효소적 활성을 유도한다. 소정의 구현예들에서, Naglu 효소적 활성은 대조군 (예로, 개체에서 치료전 내인성 효소적 활성)과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가된다. 소정의 구현예들에서, 증가된 Naglu 효소적 활성은 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg이다. 본 명세서에서 사용되는 바, nmol/hr/mg는 mg 효소 당 시간 당 가수분해된 nmol 기질을 측정하는 효소의 특이 활성을 말한다.

일정 구현예들에서, Naglu 효소적 활성은 요추 부위 (lumbar region)에서 증가된다. 소정의 구현예들에서, 요추 부위에서 증가된 Naglu 효소적 활성은 적어도 대략 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg이다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 산필리포 B형 증후군의 감소된 강도, 중증도, 또는 빈도, 또는 적어도 하나의 증상 또는 특징의 지연된 발병을 유도한다. 일정 구현예들에서, 산필리포 B형 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 난청, 지연된 언어 발달, 운동 능력들의 결여, 과다활동, 정신지체, 공격성 및/또는 수면 방해들이다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 2주마다 한 번 시행한다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 매월 한 번 시행한다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 2개월마다 한 번 시행한다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 정맥내 투여와 조합하여 사용된다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 매주 한 번의 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 2주마다 한 번의 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 매월 한 번의 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 2개월마다 한 번의 빈도이다. 소정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 매주 두 번, 매주, 격주, 또는 매월 두 번과 같은 매월 투여 이상의 빈도이다.

일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 동일한 날짜에 수행된다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 적어도 2일 이내, 적어도 3일 이내, 적어도 4일 이내, 적어도 5일 이내, 적어도 6일 이내, 적어도 7일 이내, 또는 적어도 한 주 이내와 같이 서로의 소정의 시간 간격 이내에서 수행되지 않는다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 매주 교대하는 투여들, 2주마다 교대로, 매월 두 번, 또는 매월과 같이 교대하는 스케쥴로 수행된다. 일정의 구현예들에서, 경막내 투여는 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 정맥내 투여의 스케쥴에서 본 스케쥴의 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 투여가 정맥내 투여를 대신하여 경막내 투여로 대체될 수 있는 것과 같은 투여 스케쥴로 정맥내 투여를 대체한다.

일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 먼저 정맥내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) IT 투여들로 이어지는 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 것과 같이 순서적으로 수행된다. 일정 구현예들에서, 먼저 경막내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 정맥내 투여들로 이어진다 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여).

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 정맥내 투여의 부재 시 사용된다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 동시적인 면역억제 요법의 부재 시 사용된다.

일정 구현예들에서, Naglu 융합 단백질은 대략 20 mg/mL 이상의 농도로 투여된다.

일정 구현예들에서, 일단 투여되는 경우 리소좀들로 표적하고 생체내에서 치료적으로 활성을 가지는, Naglu 도메인; 리소좀 표적 분체를 포함하는 치료적 융합 단백질을 제공한다.

일정 구현예들에서, Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 적어도 70% (예로, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 IGF-II 분체이다. 일정 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 70% (예로, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)의 8 내지 67번 잔기들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 융합 단백질은 상기에 더하여 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체 사이에 링커를 포함한다. 일정 구현예들에서, 링커는

GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함한다.

일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 Naglu 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 링커에 의해 융합된다.

보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 일단 투여되는 경우 리소좀들을 표적하고 생체내에서 치료적으로 활성을 가지는, 서열번호 6 (전장의 Naglu-IGFII 융합 단백질)과 적어도 70% (예로, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 융합 단백질을 제공한다.

본 출원에서 사용되는 바, 용어들 "약 (about)" 및 "대략 (approximately)"은 동등한 것들로서 사용된다. 본 출원에서 사용되는 숫자들은 모두 약/대략이 있거나 없이도 당업자라면 인정하는 정상적인 변동들 (fluctuations)이라면 모두를 포괄하도록 의미한다.

본 발명의 기타 다른 특징들, 목적들, 및 장점들은 다음의 자세한 기술내용에서 자명하다. 그러나, 자세한 기술내용이 본 발명의 구현예들을 가르키면서 제한됨이 없이 단지 설명으로 주어지는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화들 및 변형들은 자세한 기술내용으로부터 당업자라면 자명하게 여길 것이다.

도면들은 제한하려는 것이 아니라, 단지 도시 (illustration)의 목적들을 위한 것이다.
도 1은 대표적인 rhNaglu, Naglu-IGFII, Naglu-TAT 및 Naglu Kif, 또한 개념 연구의 증거의 성과 (POC)를 나타낸 것이다. (aa수/이론적인 mw - 아미노산의 수 및 이론적인 분자량).
도 2는 대표적인 PerT-Naglu 및 Naglu-ApoE를 나타낸 것이다. rhNaglu의 이들 변형들은 BBB를 통한 운반 효소를 조사하기 위하여 생산되었다.
도 3A는 IGF II 수용체 (Hashimoto 1995, 20로부터 변형된 도면)와의 결합 서열로서 아미노산 서열들 8-67번 (녹색)을 보여주는 대표적인 IGFII 분자를 나타낸 것이다. 도 3B는 대표적인 M6P / IGF II 수용체들 및 그의 15개 도메인들을 나타낸 것이다. 도메인들 3 및 9 (녹색)은 만노스-6-포스페이트와 결합하는 한편 도메인 5는 만노스-6-포스페이트 디에스테르와 결합한다. 도메인 11 (노란색)은 IGFII (Bohnsack 2009, 22로부터 변형된 도면)와 결합한다.
도 4는 Naglu-IGFII 클론 47dz2-15의 대표적인 곡선 생산을 나타낸 것이다. Naglu-IGFII의 평균 생산은 0.5 pcd (매일 백만개 세포들 당 피토그램)이었다. GH, 성장 수확; H1 내지 H8, 수확 1 - 8.
도 5는 도 2 내지 5의 곡선 생산으로부터 얻은 수확물들의 대표적인 웨스턴 블럿 분석을 나타낸 것이다. 레인들은 배양 배지의 부피로 정상화되었다.
도 6은 PNGase F로의 탈당화 이전 및 이후에 Naglu-IGFII의 대표적인 웨스턴 블럿 분석을 나타낸 것이다. PNGase F 소화 이전의 분산된 밴드는 당화될 때 전형적인 모양이다. PNGase F 소화 시, 단백질 밴드는 날카롭고 응축되며, 일정한 폴리펩타이드 사슬과 일치하는 모양이 된다. 항-인간 Naglu 및 항-IGFII 항체의 분석은 Naglu-IGFII의 그대로의 분자들만이 클론 47dz2-15에 의해 발현된 점을 입증하였다. "-"는 PNGase F 소화 이전의 수확 물질, "+"는 PNGase F 소화 이후의 수확 물질을 가르킨다.
도 7은 Naglu-IGFII의 대표적인 정제 계획을 나타내고, SDS-PAGE 젤은 조정된 배지로부터 나온 Naglu-IGFII의 단계적 정제를 나타낸 것이다.
도 8은 Naglu-Kif 단백질의 대표적인 결정들을 나타낸 것이다.
도 9는 카툰 모델로서 표현된 Naglu의 대표적인 결정 구조를 나타낸 것이다. 세 가지 도메인들이 도메인 I, 도메인 II 및 도메인 III으로 표시된다. 글리칸들은 막대들로서 보여진다. 촉매적 잔기들은 E316 및 E446이다.
도 10은 Naglu의 대표적인 삼량체 구조를 나타낸 것이다. 세 가지 분자들의 활성 부위들이 표시되어 있다.
도 11은 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 세포성 내재화 연구에 사용되는 정상 인간으로부터 나온 대표적인 일차 섬유모세포들을 나타낸 것이다. rhNaglu의 세포성 흡수는 최소인 한편, Naglu-IGFII의 세포성 흡수는 더 현저하였다. Naglu-IGFII 내재화의 포화 곡선은 수용체 매개성 흡수를 가르켰다. 본 흡수는 IGFII에 의해 저해되었지만, 만노스-6-포스페이트에 의해서는 아니었다.
도 12는 산필리포 B형 환자의 섬유모세포들 (GM01426)을 사용한 대표적인 공초점현미경 연구를 나타낸 것이다. Lamp-1으로 Naglu-IGFII의 광범위한 내재화 및 공동-정착이 관찰되었다.
도 13은 야생형 (WT), Naglu-/- (KO) 및 이형접합 Naglu+/- (Het) 마우스에서 대표적인 Naglu 활성을 나타낸 것이다. 산필리포 B 형 마우스에서 Naglu의 전부 결핍이 뇌, 간, 신장 및 비장에서 관찰되었다.
도 14는 IC 주사 부위를 가르키는 마우스 뇌의 정면 및 측면 또한 조직한 분석들을 위한 단면을 나타낸 것이다. 중간 그래프, 1배로 관찰된 마우스 뇌의 횡단면. 박스친 영역은 아래 그래프의 4배 현미경 영상의 영역을 가르킨다. 아래 그래프, 조직학 슬라이드의 4배 영상. 박스 A 및 B는 도 15 및 도 16에서의 40배 현미경 영상의 영역을 가르킨다.
도 15는 대수공내 주사 (IC)이후 7일에 산필리포 B형 마우스에서 대뇌 피질의 대표적인 면역조직화학을 나타낸 것이다 40배. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 둘 다가 뉴런들 뿐만 아니라 교아세포들에서 광범위한 세포성 흡수를 나타내고, 분포 및 세포성 흡수의 양상들은 두 단백질들 간에 유사하였다 (항-인간 Naglu 모노클론 항체).
도 16은 대뇌 피질의 대표적인 LAMP-1 면역염색을 40배로 나타낸 것이다. 증가된 LAMP-1 면역염색 양성 점들에 의해 도시된 바와 같이, 야생형 마우스의 뇌와 대비하여 증가된 리소좀 축적이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 자명하였다. rhNalgu 및 Naglu-IGFII 둘 다가 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌는 wt 마우스와 매우 유사한 리소좀 축적의 감소를 보여주었다.
도 17A는 Naglu IT 투여된 Naglu-결핍 마우스의 백색질 조직들에서 운반체 투여된 동일한 Naglu-결핍 마우스와 대비한 세포성 공포화의 광범위한 감소를 나타낸 것이다. 도 17B는 Naglu 경막내 투여된 Naglu-결핍 마우스의 백색질 조직들에서 운반체 투여된 동일한 Naglu-결핍 마우스와 대비한 리소좀 연관 막 단백질 1 (LAMP 1) 면역염색의 현저한 감소를 나타낸다.
도 18은 Naglu 투여된 Naglu-결핍 마우스의 대뇌 피질, 미상엽핵 및 조가비핵 (CP), 시상 (TH), 소뇌 (CBL) 및 백색질 (WM)에서 야생형 및 운반체 투여된Naglu-결핍 마우스와 대비하여 측정된 LAMP의 농도를 정량적으로 나타내고 비교한 것이다. 7일의 과정 동안 Naglu의 3번 용량들의 경막내 투여에 이어서 (도 18A) 분석된 뇌 조직의 각 영역에서 LAMP-양성 영역들은 두 주의 과정 동안 Naglu의 두 번 용량들과 대비하여 (도 18B) 좀 더 감소되었다.
도 19는 wt 관삽입된 래트에서 IT 주사 부위를 보여주도록 본 그림의 기준으로서 사용된 인간 CNS의 대표적인 중간시상 해부적 도면을 나타낸 것이다. 청색 화살표는 척수에서 IT 주사의 대략적 해부적 위치를 가르키고, 적색 화살표는 면역조직화학 연구를 위해 조직들을 가져온 대뇌 피질을 가르킨다.
도 20은 IT 주사 이후 뇌에서 대표적인 Naglu 활성을 나타낸 것이다. Naglu 활성은 Naglu-TAT 및 Naglu-IGFII 주사된 wt 래트에서 유의하게 더 높았다.
도 21은 IT 주사 이후 24시간에 rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif 및 PerT-Naglu 치료된 wt 관삽입된 래트의 대뇌 피질의 대표적인 Naglu 면역염색을 나타낸 것이다. 20배. Naglu-IGFII는 뇌의 실질 내로 광범위한 배분을 잘 보여주는 유일한 단백질이었다. 뉴런들 및 교아세포들 내로 세포성 흡수가 Naglu-IGFII 치료된 래트에서도 역시 명백하다. 한편, rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu kif 및 PerT-Naglu 치료된 그룹들에서, 단백질만이 뇌척수막 (M)에 남아있었다.
도 22는 도 21로부터 얻은 선택된 슬라이드들의 대표적인 고해상도 확대를 나타낸 것이다. 상부 패널, rhNaglu 치료된 wt 관삽입된 래트에서 rhNaglu 는 뇌의 실질에서 확인되는 양성이 전혀 없이 단지 뇌척수막 (M)에 남아있었다. 하부 패널, rhNaglu 치료된 wt 관삽입된 래트에서 광범위한 배분이 뇌의 실질 내로 잘 관찰되었고, 세포성 흡수는 뉴런들 및 교아세포들에서 관찰되었다.
도 23은 마지막 IT 주사 이후 24시간에 뇌 및 간에서 대표적인 Naglu 활성을 나타낸 것이다. 세 가지 치료된 그룹들 중에서, 뇌의 Naglu 활성은 유의한 차이들을 보여주지 않았고, 간의 Naglu 활성의 경우도 동일하다. 본 결과는 뇌 및 간에서 검출되는 Naglu 활성이 주로 희생 이전 24시간에 시행되는 마지막 주사로 인한 것을 의미하였다. 본 시점에서 뇌와 대비하여 간에서 유의하게 더 높은 Naglu 활성이 존재하는 이유는 불명확하다. IT 주사 이후 철저한 약물역학적 연구는 차이를 해석하도록 도울 수 있다.
도 24는 Naglu-IGFII 의 IT 주사 이후 뇌 및 간에서 대표적인 전체 GAG 수준을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 전체 GAG는 산필리포 B형 마우스 노화로서 축적 효과를 반영하는 계속적 증가들을 보여주었다. 뇌에서 GAG의 통계적으로 유의한 감소는 3x 주사 그룹에서 관찰되었다 (p<0.05). 간에서도 GAG의 통계적으로 유의한 감소가 역시 2x 및 3x 주사 그룹들에서 관찰되었다 (p<0.05). 뇌보다 간에서 더 빠르고 더 극적인 GAG 변화들은 헌터 증후군를과 같은 다른 리소좀 축적 징환 마우스 모델에서도 역시 관찰되었던 현상이다 (내부적 의견들).
도 25는 IT 주사 이후에 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 대표적인 Naglu 재배분을 나타낸 것이다. Naglu 면역형광 염색은 뇌척수막 (M) 및 뇌 실질 상의 Naglu-IGFII단백질을 나타냈다. 세포성 흡수는 2x 및 3x 주사 그룹들에서 관찰되었다. G: 교아세포들.
도 26은 마우스 뇌의 관상 단편을 나타낸 것이다. 박스들은 LAMP-1 면역염색의 도면들이 만들어진 곳을 가르킨다. 단백질 배분 및 효능의 정도를 보여주기 위하여, 대뇌 피질 또한 미상엽핵, 시상 및 백색질과 같은 피질하 조직들이 LAMP1 면역염색을 위해 선택되었다.
도 27은 대뇌 피질의 대표적인 LAMP1 면역염색을 40배로 나타낸 것이다. 야생형 마우스의 뇌와 비교하여, 증가된 리소좀 축적이 증가된 LAMP1 면역염색에 의해 관찰되는 바와 같이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 관찰되었다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소는 2x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기, 또한 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 28은 미상엽핵, 피질하 핵의 대표적인 LAMP-1 면역염색을 나타낸 것이다 40배. 대뇌 피질에서 관찰된 것과 유사하게, 증가된 리소좀 축적이 증가된 LAMP1 면역염색 양성 점들에 의해 관찰되는 바와 같이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 관찰되었다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소는 2x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기, 또한 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 184는 시상, 간뇌 핵의 대표적인 LAMP-1 면역염색을 나타낸 것이다 40배. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소가 2x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기, 또한 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 30은 백색질의 LAMP-1 면역염색을 보여주는 대표적인 도면을 (40배) 나타낸 것이다. 뉴런 축삭 섬유들의 수평적 추적은 백색질을 도 26 내지 29에 표현된 회색질과 구별시킨다. 그럼에도 불구하고, 동일한 양상의 리소좀 축적 증가들이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 야생형 마우스와 대비하여 관찰될 수 있었다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소가 2x 및 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 31은 소뇌 피질의 대표적인 LAMP-1 면역염색을 나타낸 것이다 40배. 리소좀 축적의 감소의 뇌의 다른 영역들에서와 유사한 효과가 소뇌 피질에서 관찰되었다. 소뇌 피질의 형태는 진하게 군집된 과립 뉴런들, 과소세포성 분자층, 또한 과립 뉴런들 및 분자층 간 퍼킨지 뉴런들의 단일층으로 나타났다. 퍼킨지 뉴런들은 분차층 내로 돌출된 큰 세포질 및 간헐적인 가지세포들에 의해 확인되었다.
도 32는 뇌, 척수 및 간에서 대표적인 Naglu 염색을 나타낸 것이다. 뇌 및 척수에서, 주사된 Naglu는 IHC에 의해서만 뇌척수막 (M)에서 검출되었고 기타 다른 부위들에서는 Naglu 양성 염색이 전혀 검출되지 않았다. 간에서, 시누소이드 세포들 (S)은 Naglu 양성이었고 Naglu 흡수는 간세포들 (H)에서 전혀 확인되지 않았다.
도 33은 간 및 척수의 대표적인 LAMP-1 면역염색 및 H & E 염색을 나타낸 것이다. 운반체 동물들과 비교하여, LAMP 염색은 Naglu로 치료된 간들 및 척수들 둘 다의 전체를 통하여 감소되었다. H & E 염색은 간세포들에서 세포성 공포화가 운반체 동물들과 비교하여 치료된 그룹에서 명백하게 감소되는 점을 보여주었다.
도 34A 및 도 34B은 3개월 동안 lose Naglu의 6번 격주 IT 주사들 이후 뇌의 형태 향상을 보여주는 뇌의 대표적인 H & E 염색을 나타낸 것이다. 치료된 뇌에서, 조사된 부위들 모두의 세포성 공포화 (화살표들)는 운반체 그룹과 비교하여 감소되었다.
도 35A 및 도 35B는 3개월 동안 6번 IT Naglu 주사들 이후 다양한 뇌 부위들에서의 대표적인 LAMP 면역염색을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 그룹과 비교하여, 산필리포 B형 마우스에게 Naglu IT 투여는 LAMP 면역염색이 드러나는 모든 조사된 부위들에서 리소좀 활성의 감소를 가져왔다. 본 감소는 LAMP 양성 세포들의 수 감소, 더 작은 세포 크기 및 더 옅은 염색을 특징으로 하였다. 현저한 감소는 다른 뇌 부위들과 비교하여 척수에 가까운 뇌의 미상엽핵에 위치한 소뇌 및 뇌줄기에서 발견되었다. 명백한 감소도 역시 백색질, 해마 및 시상을 포함하는 깊은 뇌 부위들에서 확인되었다.
도 36A 및 도 36B는 3개월 동안 6번 IT Naglu 주사들 이후 다양한 뇌 부위들에서 미세교아세포들의 활성화를 드러내는 대표적인 Iba IHC를 나타낸 것이다. 운반체 처리된 그룹과 비교하여, 양성 세포들의 수 및 염색 강도의 감소가 Naglu 치료된 그룹에서 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, 양성 미세교아 세포들의 세포 형태는 운반체 그룹에서 큰 공포화된 형태와 대비하여 (삽입) 모든 조사된 뇌 부위들에서 감소된 세포 크기를 가지고 변화하였다.
도 37A 및 도 37B는 3개월 동안 6번 IT Naglu 주사들 이후 다양한 뇌 부위들에서 별아교세포들의 활성화를 드러내는 대표적인 GFAP IHC를 나타낸 것이다. 운반체 처리된 그룹과 비교하여, GFAP 양성 염색은 소뇌 및 뇌줄기에서 감소되었고 다른 조사된 부위들에서도 약간 감소되었다.
도 38은 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 39는 대표적인 PORT-A-CATH? 로우 프로파일 경막내 이식가능한 접근 시스템을 나타낸 것이다.
도 40은 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 41은 CNS 효소 대체 요법 (ERT)을 위한 가정용 투여를 허용하는 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 42는 안전 기작을 가지는 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)의 대표적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 43A는 IDDD 가 장착될 수 있는 환자의 신체 안에 대표적인 위치들을 나타내고; 도 43B는 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)의 다양한 구성요소들을 나타내고; 또한 도 43C는 IT-요추 주사를 위한 환자의 신체 안에 대표적인 삽입 위치를 나타낸 것이다.

정의들

본 발명을 더욱 잘 이해하기 위하여, 소정의 용어들이 먼저 하기에 정의된다. 다음의 용어들 및 기타 다른 용어들에 대한 추가적인 정의들이 본 명세서 전체를 통하여 설명된다.

대략 ( Approximately ) 또는 약 ( about ): 본 명세서에서 사용되는 바, "대략" 또는 "약"은 관심있는 하나 이상의 수치들에 적용되는 바와 같이 진술된 기준 수치와 유사한 수치를 말한다. 소정의 구현예들에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 진술되지 않거나 달리 내용으로부터 분명하지 않는 둘 중 하나의 경우라면 (이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함) 진술된 기준 수치의 방향 (이상 또는 이하)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 말한다.

개선 ( Amelioration ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "개선"은 개체의 상태의 예방 (prevention), 감소 (reduction) 또는 완화 (palliation), 또는 상태의 향상 (improvement)을 의미한다. 개선은 질환 병폐 (예로, 산필리포 B형 증후군)의 완벽한 회복 또는 완벽한 예방을 포함하지만 이들을 요구하지는 않는다. 일정 구현예들에서, 개선은 적절한 질환 조직들에서 결핍되는적절한 단백질 또는 그의 활성 (예로, Naglu)의 증가된 수준들을 포함한다.

생물학적으로 활성을 가진 ( Biologically active ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 (phrase) "생물학적으로 활성을 가진"은 생물학적 체계 (biological system)에서, 상세하게는 생물에서 활성을 가지는 제제라면 모두의 특징을 말한다. 예를 들어, 생물에게 투여될 때 본 생물에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성을 가지는 것으로 고려된다. 상세한 구현예들에서, 단백질 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성을 가지는 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 적어도 하나를 공유하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 부분은 "생물학적으로 활성을 가진" 부분으로서 언급된다.

양이온- 비의존성 만노스 -6- 포스페이트 수용체 (Cation-independent mannose -6- phosphate receptor , CI - MPR ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (CI-MPR)"는 리소좀에 운반될 골지체 (Golgi apparatus)에 있는 산 가수분해효소 전구체들 상에 만노스-6-포스페이트 (M6P) 태그들 (tags)을 결합시키는 세포성 수용체를 말한다. 만노스-6-포스페이트들에 추가하여, CI-MPR는 IGF-II를 포함하는 기타 다른 단백질도 역시 결합시킨다. CI-MPR는 "M6P/IGF-II 수용체," "CI-MPR/IGF-II 수용체," "IGF-II 수용체" 또는 "IGF2 수용체"라고도 역시 알려져 있다. 본 명세서에서 이들 용어들 및 그들의 약어들은 상호교환적으로 사용된다.

동시적인 면역억제 요법 ( Concurrent immunosuppressant therapy ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "동시적인 면역억제 요법"은 전-치료, 전조정 또는 치료 방법과 평등한 것으로서 사용되는 면역억제 요법이라면 모두를 포함한다.

희석제 ( Diluent ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "희석제"는 재구성된 제형물의 제조에 유용한 약제학적으로 허용가능한 (예로, 인간에게 투여 시 안전하고 비-독성) 희석 물질 (diluting substance)을 말한다. 대표적인 희석제들은 무균수 (sterile water), 주사용 정균수 (bacteriostatic water for injection, BWFI), pH 완충액 (예로, 인산염-완충 식염수), 무균 식염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

용량 형태 ( Dosage form ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "용량 형태" 및 "단위 용량 형태 (unit dosage form)"는 치료될 환자를 위한 치료적 단백질의 물리적으로 명확한 단위를 말한다. 각 단위는 원하는 치료적 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 선결정된 정량 (predetermined quantity)을 포함한다. 그러나, 조성물의 전체 용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 참석한 의사가 결정하는 것으로 이해될 것이다.

효소 대체 요법 (효소 replacement therapy , ERT ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "효소 대체 요법 (ERT)"은 소실된 효소를 제공하여 효소 결핍을 교정하는 치료적 전략 (therapeutic strategy)이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 소실된 효소는 경막내 투여에 의해 제공된다. 일정 구현예들에서, 소실된 효소는 혈류 내에 주입하여 제공된다. 일단 투여되면, 효소는 세포들에 의해 흡수되고 리소좀으로 운반되고, 여기에서 효소는 효소 결핍으로 인해 리소좀들에 축적되었던 물질을 제거하도록 작용한다. 전형적으로, 효과적인 리소좀 효소 대체 요법 (lysosomal 효소 replacement therapy)의 경우, 치료적 효소가 축적 결함이 나타나는 표적 조직들에서 적절한 세포들에 있는 리소좀들로 운반된다.

개선하다 ( Improve ), 증가하다 ( increase ) 또는 감소하다 (reduce): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적 동등물들은 본 명세서에서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인 (또는 다수의 대조군 개인들)에서의 측정과 같은 기저선 측정 (baseline measurement)과는 대비되는 수치들을 가르킨다. "대조군 개인 (control individual)"은 치료될 개인과 리소좀 축적병 (예로, 산필리포 B형 증후군)의 동일한 형태로 고생하고, (치료된 개인 및 대조군 개인(들)에서 질환의 단계들이 비교가능한 점을 보장하는) 치료될 개인과 거의 동일한 연령인 개인이다.

개인 ( Individua ), 개체 ( subject ), 환자 ( patien )t: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개체", "개인" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물 개체를 말한다. 치료된 개인 ("환자" 또는 "개체"라도도 말함)은 질환, 예를 들어 산필리포 B형 증후군을 앓는 개인 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 성인 인간)이다.

경막내 투여 ( Intrathecal administration ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "경막내 투여" 또는 "경막내 주사 (intrathecal injection)"는 척수관 (spinal canal) (척수 주위의 경막내 공간) 내로의 주사를 말한다. 다양한 기법들 (techniques)이, 제한되지 않고 천두공 (burrhole) 또는 대수공 (cisternal) 또는 요추 (lumbar) 천자 (puncture) 등을 통한 측뇌실 주사 (lateral cerebroventricular injection)를 포함하여 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달 (intrathecal delivery)"은 요추 IT 투여 또는 전달과 같은 요추 영역 또는 부위를 통한 IT 투여 또는 전달을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위(lumbar region)" 또는 "요추 영역 (lumbar area)"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 더욱 자세하게는 척추 (spine)의 L2-S1 부위를 말한다.

링커 ( Linker ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "링커"는 천연의 단백질에 서, 특정한 위치에서 나타나는 것이 아닌 아미노산 서열을 말하고 일반적으로 단백질 분체들 사이에서 유연하고 알파-나선과 같은 구조를 부여하도록 설계된다.

리소좀 효소 ( Lysosomal 효소): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 효소"는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있고 하나 이상의 리소좀 축적병 증상들을 회복시키거나 개선시킬 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들을 둘 다 포함하고, 재조합 및 합성 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다.

리소좀 효소 결핍 ( Lysosomal enzyme deficiency ): 본 명세서에서 사용되는 바, "리소좀 효소 결핍"은 리소좀들에서 거대분자들 (예로, 효소 기질들)을 펩타이드들, 아미노산들, 모노사카라이드들, 핵산들 및 지방산들로 분해하는 데 요구되는 효소들 적어도 하나의 결핍으로부터 유발되는 유전적 장애들의 그룹을 말한다. 그 결과, 리소좀 효소 결핍들을 앓고 있는 개인들은 다양한 조직들 (예로, CNS, 간, 비장, 장, 혈관 벽들 및 기타 다른 기관들)에서 축적된 물질들을 가지고 있다.

리소좀 축적병 ( lysosomal storage disease ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 축적병"은 천연의 거대분자들을 대사하는 데 필요한 리소좀 효소들 적어도 하나의 결핍으로부터 유발되는 질환이라면 모두를 말한다. 전형적으로, 이들 질환들은 리소좀들에서 분해도지 않은 분자들의 축적을 유도하여, 축적 과립들 (storage granules) (축적 소포들이라고도 명명함)의 수적 증가를 유도한다. 이들 질환들 및 다양한 예들이 보다 자세하게 하기에 기술된다.

폴리펩타이드 ( Polypeptide ): 본 명세서에서 사용되는 바, "폴리펩타이드"는 일반적으로 말하자면 펩타이드 결합에 의해 서로 부착된 적어도 두 개의 아미노산들의 연결 (string)을 말한다. 일정 구현예들에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 펩타이드 결합에 의해 다른 것들에 각각 부착된 적어도 3 내지 5개의 아미노산들을 포함할 수 있다. 당업자라면 폴리펩타이드들이 그럼에도 불구하고 임의적으로 폴리펩타이드 사슬 내에 통합될 수 있는 "비-천연의 (non-natural)" 아미노산들 또는 기타 다른 실체들을 때로 포함할 수 있는 점을 인정할 것이다.

대체 효소 ( Replacement 효소): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "대체 효소"는 치료될 질환에서 적어도 부분적으로 결핍되거나 소실된 효소를 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 용어 "대체 효소"는 치료될 리소좀 축적병에서 적어도 부분적으로 결핍되거나 소실된 효소를 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있거나, 하나 이상의 리소좀 축적병 증상들을 회복시키거나 개선시킬 수 있다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들을 둘 다 포함하고, 재조합 및 합성 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다. 대체 효소는 재조합, 합성, 유전자-활성화 또는천연의 효소일 수 있다.

용해성 ( Soluble ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "용해성 (soluble)"은 균질한 용액을 형성하는 치료제의 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료제가 투여되고 작용의 표적 부위 (예로, 뇌의 세포들 및 조직들) 내로 운반되는 용액에서 치료제의 용해도 (solubility)는 작용의 표적 부위로 치료적 유효량의 치료제의 전달을 허용하는데 충분하다. 여러가지 요인들이 치료제들의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 단백질 용해도에 영향을 줄 수 있는 적절한 요인들은 이온 강도, 아미노산 서열 및 기타 다른 공-용해화 (co-solubilizing) 제제들 또는 염들 (예로, 칼슘 염들)의 존재를 포함한다. 일정 구현예들에서, 약제학적 조성물들은 칼슘 염들이 이러한 조성물들로부터 배제되도록 제형화된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 제제들은 해당하는 그의 약제학적 조성물에서 용해성이다. 일반적으로 등장액들이 비경구 투여 약물들을 위해 선호되는 한편, 등장액들 (isotonic solutions)의 사용은 일정의 치료제들, 상세하게는 일정의 단백질들 및/또는 효소들에 대한 적당한 용해도를 제한할 수 있는 점이 인정될 것이다. 약간 고장액들 (hypertonic solutions) (예로, 175mM까지의 염화나트륨) 및 당-포함 용액들 (예로, pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 2%까지의 슈크로스)는 원숭이들에서 잘 내성화되는 (tolerated) 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 공통적인 CNS 볼루스 제형 조성물은 식염수 (물에 녹인 150mM NaCl)이다.

안정도 ( Stability ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안정한 (stable)"은 연장된 기간 동안 그의 치료적 효능 (예로, 의도된 생물학적 활성 및/또는 물리화학적 본성의 모두 또는 대다수)을 유지하는 치료제 (예로, 재조합 효소)의 능력을 말한다. 치료제의 안정도, 및 이러한 치료제의 안정도를 유지하는 약제학적 조성물의 능력은 연장된 기간 동안 (예로, 적어도 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월 이상 동안) 평가될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 기술된 약제학적 조성물들은 이로 제형화된 하나 이상의 치료제들 (예로, 재조합 단백질들)을 안정화하거나, 임의적으로 그의 분해를 지연시키거나 방지할 수 있도록 제형화되어 왔다. 제형물의 문맥에서, 안정한 제형물은 안에 있는 치료제가 필수적으로 보관 시 및 공정들 (냉동/해동, 기계적인 혼합 및 동결건조와 같음) 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 본성 및 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정도의 경우, 고분자량 (HMW) 응집체들 (aggregates)의 형성, 효소 활성의 상실, 단백질 단편들의 생성 및 전하 프로파일들의 이동 (shift)에 의해 측정될 수 있다.

개체 ( Subject ): 본 명세서에서 사용되는 바, "개체"는 인간을 포함하는 포유동물이라면 모두를 의미한다. 본 발명의 소정의 구현예들에서, 개체는 인간, 청소년 또는 유아이다. 또한 본 발명에 의해 약제학적 조성물들의 투여 및/또는 자궁내 (in - utero) 치료 방법의 성적이 참작된다.

실질적인 상동성 ( Substantial homology ): 본 발명에서 용어구 "실질적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 사용된다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열들은 그들의 해당하는 위치들에서 상동한 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 상동한 (substantially homologous)"인 것으로 고려된다. 상동한 잔기들은 일치하는 잔기들 (identical residues)일 수 있다. 임의적으로, 상동한 잔기들은 대략적으로 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징들을 가지는 비-일치하는 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 잘 숙지하고 있는 바와 같이, 전형적으로 소정의 아미노산들은 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산들로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄들을 가지는 것으로서 분류된다. 하나의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 것으로의 치환은 종종 "상동한" 치환이라고 고려될 수 있다.

당해 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 뉴클레오타이드 서열들의 경우 BLASTN, 아미노산 서열들의 경우 BLASTP, 갭 (gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램들에서 입수가능한 것들을 포함하는 다양한 알고리즘들이라면 모두를 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins , Wiley , 1998; and Misener , et al ., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology , Vol . 132), Humana Press , 1999에 기술되어 있다. 상동한 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성의 정도 표시를 제공한다. 일정 구현예들에서, 두 개의 서열들은 잔기들의 적절한 연장길이 (stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 상동한 경우라면 실질적으로 상동한 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는500개 이상의 잔기들이다.

실질적인 일치도 ( Substantial identity ): 본 명세서에서 용어구 "실질적인 일치도"는 은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 사용된다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열들은 그들의 해당하는 위치들에서 일치하는 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 일치하는 (substantially identical)" 것으로 고려된다. 당해 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 뉴클레오타이드 서열들의 경우 BLASTN, 아미노산 서열들의 경우 BLASTP, 갭 (gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램들에서 입수가능한 것들을 포함하는 다양한 알고리즘들이라면 모두를 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins , Wiley , 1998; and Misener , et al ., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology , Vol . 132), Humana Press , 1999에 기술되어 있다. 일치하는 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 일치도의 정도 표시를 제공한다. 일정 구현예들에서, 두 개의 서열들은 잔기들의 적절한 연장길이 (stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 일치하는 경우라면 실질적으로 일치하는 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는500개 이상의 잔기들이다.

합성 CSF ( Synthetic CSF ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "합성CSF"는 척수액과 합치되는 pH, 전해질 조성, 포도당 함량 및 삼투도를 가지는 용액을 말한다. 합성 CSF는 인공 CSF (artifical CSF)라고도 역시 말한다. 일정 구현예들에서, 합성 CSF는 엘리어트 B 용액 (Elliott? B solution)이다.

CNS 전달에 적합한 ( Suitable for CNS delivery ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어구 본 발명의 약제학적 조성물들에 관한 "CNS 전달에 적합한" 또는 "경막내 전달에 적합한 (suitable for intrathecal delivery)"은 일반적으로 이러한 조성물들의 안정도, 내성 (tolerability), 및 용해도 성질들 뿐만 아니라 이에 포함되는 치료제의 유효량을 전달의 표적 부위 (예로, CSF 또는 뇌)로 전달하는 이러한 조성물들의 능력을 말한다.

표적 조직들 ( Target tissues ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직들"은 치료될 리소좀 축적병에 의해 영향을 받는 조직이라면 모두 또는 결핍 리소좀 효소가 정상적으로 발현되는 조직이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 환자들에서 예를 들어 조직의 세포성 리소좀들에 축적된 효소 기질의 검출가능하거나 비정상적으로 많은 양이 존재하는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 질환-연관된 병리학, 증상, 또는 특징을 나타내는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 결핍 리소좀 효소가 올라간 수준으로 정상적으로 발현되는 이들 조직들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 표적 조직은 뇌 표적 조직, 척수 표적 조직 및/또는 말초 표적 조직일 수 있다. 대표적인 표적 조직들은 하기에 상술되고 있다.

치료적 분체 ( Therapeutic moiety ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 분체"는 분자의 치료적 효과를 가져오는 분자의 일부를 말한다. 일정 구현예들에서, 치료적 분체는 치료적 활성을 가지는 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 치료적 분체는 자연적 Naglu 단백질을 대체하는 폴리펩타이드일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 분체는 Naglu 결핍과 연관된 하나 이상의 표현형들을 복구시킬 수 있는 폴리펩타이드일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 분체는 산필리포 B형 증후군 환자에서 하나 이상의 증상들을 치료할 수 있다.

치료적 유효량 ( therapeutically effective amount ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 유효량"은 의학적 치료라면 모두에 적용가능한 합리적인 유익/위험 비율로 치료되는 개체에 미치는 치료적 효과를 부여하는 치료적 단백질 (예로, Naglu)의 양을 말한다. 치료적 효과는 주관적 (예로, 일정의 테스트 또는 마커에 의해 측정가능) 또는 객관적 (예로, 개체가 효과의 표시를 주거나 느낌)일 수 있다. 상세하게, "치료적 유효량"은 질환과 연관된 증상들을 개선하거나 질환의 발병을 예방하거나 지연시키는 것, 및/또는 질환의 증상들의 중증도 또는 빈도도 역시 감소시키는 것에 의해서와 같이 원하는 질환 또는 병폐를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 데, 또는 검출가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 효과적인 치료적 단백질 또는 조성물의 양을 말한다. 치료적 유효량은 공통적으로 다수의 단위 용량들을 포함할 수 있는 용량 요법 (dosing regimen)으로 투여된다. 특정한 치료적 단백질이라면 모두의 경우, 치료적 유효량 (및/또는 효과적인 용량 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여의 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 의존하여 변화될 수 있다. 또한, 특정한 환자를 위한 치료적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 치료제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 적용되는 특이적 융합 단백질의 대사; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 요인들 등을 포함하는 다양한 요인들에 의존할 수 있다.

내성 ( Tolerable ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "내성" 및 "내성도 (tolerability)"는 본 발명의 약제학적 조성물들이 이러한 조성물이 투여된 개체에서 역효과를 발현하지 않도록, 임의적으로 이러한 조성물이 투여된 개체에서 심각한 역효과를 발현하지 않도록 하는 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 이러한 조성물들이 투여된 개체에 의해 내성화된다.

치료 ( Treatment ): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료" (또한 "치료하다 (treat)" 또는 "치료하는 (treating)")은 부분적으로 또는 완벽하게 특정한 질환, 장애, 및/또는 병폐 (예로, 산필리포 B형 증후군)의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 완화시키고, 개선시키고, 안정시키고, 억제하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고 및/또는 이의 빈도를 감소시키는 치료적 단백질 (예로, 리소좀 효소)의 투여라면 모두를 말한다. 이러한 치료는 적절한 질환, 장애 및/또는 병폐의 징후들을 발현하지 않는 개체 및/또는 단지 질환, 장애 및/또는 병폐의 초기 징후들만을 나타내는 개체에게 할 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 적절한 질환, 장애 및/또는 병폐의 하나 이상의 확립된 징후들을 발현하는 개체에게 할 수 있다.

발명의 상세한 설명

무엇보다도, 본 발명은 예로 Naglu 단백질의 경막내 (IT) 투여에 의해 산필리포 증후군 B형 (산필리포 B형)을 치료하는 방법들 및 조성물들을 제공한다. 적합한 Naglu 단백질은 재조합, 유전자-활성화 또는 자연적 단백질일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 Naglu 단백질은 재조합 Naglu 단백질이다. 일정 구현예들에서, 재조합 Naglu 단백질은 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분제를 포함하는 융합 단백질이다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 도메인은 IGF-II 분체이다.

본 발명의 다양한 관점들은 다음의 섹션들에서 자세하세 기술된다. 섹션들의 사용이 본 발명을 제한하도록 의미하지 않는다. 각 섹션은 본 발명의 관점이라면 모두에 적용될 수 있다. 본 출원에서, "또는 (or)"의 사용은 달리 진술되지 않는 경우라면 "및/또는 (and/or)"를 의미한다.

치료적 융합 단백질들

본 발명에 따르면, 산필리포 B형 질환의 치료에 적합한 치료적 융합 단백질들은 Naglu 도메인 (치료적 분체라고도 역시 말함) 및 리소좀 표적 분체를 포함할 수 있다.

Naglu 도메인

본 발명에 따른 적합한 Naglu 도메인은 자연적으로-발생하는 Naglu 단백질 활성을 대체하거나 Naglu-결핍과 연관된 하나 이상의 표현형들 또는 증상들을 복구할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이라면 모두일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 치료적 분체는 성숙한 인간 Naglu 단백질과 실질적으로 유사하거나 일치하는 N-말단 및 C-말단 또한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드이다.

전형적으로, 인간 Naglu는 성숙한 형태로부터 프로세싱되는 전구체 분자로서 생산된다. 본 프로세싱은 일반적으로 단백질이 세포질 세망으로 들어가면서 23개 아미노산 신호 펩타이드를 제거하여 일어난다. 전형적으로, 전구체 형태는 743개 아미노산들을 포함하는 전장의 전구체 또는 전장의 Naglu 단백질이라고도 말한다. N-말단 23개 아미노산들은 전구체 단백질이 세포질 세망을 들어가면서 절단되어 성숙한 형태가 된다. 따라서, N-말단 23개 아미노산들은 일반적으로 Naglu 단백질 활성에 필요하지 않다. 전형적인 야생형 또는 자연적으로-발생하는 인간 Naglu 단백질의 성숙한 형태 (서열번호 1) 및 전장의 전구체 (서열번호 2)의 아미노산 서열들은 표 1에 나타나 있다. 하기 표 1은 인간 Naglu를 나타낸다.

따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 치료적 분체는 성숙한 인간 Naglu 단백질 (서열번호 1)이다. 일정 구현예들에서, 적합한 치료적 분체는 성숙한 인간 Naglu 단백질의 상동체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 성숙한 인간 Naglu 단백질의 상동체 또는 유사체는 야생형 또는 자연적으로-발생하는 Naglu 단백질과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는삽입들을 포함하면서 실질적인 Naglu 단백질 활성을 보유하는 변형된 성숙한 인간 Naglu 단백질일 수 있다. 따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 성숙한 인간 Naglu 단백질 (서열번호 1)과 실질적으로 상동적이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 서열번호 1과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 성숙한 인간 Naglu 단백질 (서열번호 1)과 실질적으로 일치한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 서열번호 1과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 일치하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 성숙한 인간 Naglu 단백질의 단편 또는 일부분을 포함한다.

임의적으로, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 전장의 Naglu 단백질이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 전장의 인간 Naglu 단백질의 상동체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 전장의 인간 Naglu 단백질의 상동체 또는 유사체는 야생형 또는 자연적으로-발생하는 Naglu 단백질과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는삽입들을 포함하면서 실질적인 Naglu 단백질 활성을 보유하는 변형된 전장의 인간 Naglu 단백질일 수 있다. 따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 전장의 인간 Naglu 단백질 (서열번호 2)과 실질적으로 상동적이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 서열번호 2와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 전장의 인간 Naglu 단백질 (서열번호 2)과 실질적으로 일치한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 서열번호 2와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 일치하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적한한 치료적 분체는 전장의 인간 Naglu 단백질의 단편 또는 일부분을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 전장의 Naglu 단백질은 전형적으로 신호 펩타이드 서열을 포함한다.

일정 구현예들에서, 치료적 단백질은 표적 분체 (예로, 리소좀 표적 서열) 및/또는 막-침투 펩타이드를 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 서열 및/또는 막-침투 펩타이드는 치료적 분체의 내재적 부분 (예로, 화학적 결합에 의해, 융합 단백질에 의해)이다. 일정 구현예들에서, 표적 서열은 만노스-6-포스페이트 분체를 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 서열은 IGF-I 분체를 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 서열은 IGF-II 분체를 포함한다.

리소좀 표적 도메인

일정 구현예들에서, 치료적 도메인 (예로, Naglu 도메인)은 리소좀 표적화를 용이하게 하도록 변형된다. 예를 들어, 적합한 Naglu 도메인은 리소좀 표적화 분체에 융합될 수 있고, 이는 만노스-6-포스페이트-비의존성 방식으로 Naglu 도메인을 리소좀들에 표적화시킬 수 있다. 적합한 리소좀 표적 도메인들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 IGF-II, IGF-I, Kif, ApoE, TAT, RAP, 및 p97 펩타이들를 포함하는 펩타이드들로부터 유래할 수 있다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 IGF-II 수용체라고도 역시 말하는 CI-MPR과 만노스-6-포스페이트-비의존성 방식으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 또는 기타 다른 분체이다.

일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 인간 인슐린-유사 성장인자 II (IGF-II)로부터 유래한다. 일정 구현예들에서, GILT 태그는 야생형 또는 자연적으로-발생하는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)이다.

성숙한 인간 IGF - II (서열번호 3)

AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE

일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 아미노산 치환들, 삽입들 또는 결실들을 포함하는 변형된 성숙한 인간 IGF-II이다. 일정 구현예들에서, GILT 태그는 성숙한 인간 IGFII (서열번호 3)의 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 일치하는 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 성숙한 인간 IGF-II의 단편이다. 상세한 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)의 아미노산들 8-67번을 포함한다. 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 N-말단, C-말단 또는 내부적 결실을 포함한다. 예를 들어, 리소좀 표적 분체는 성숙한 인간 IGFII (서열번호 3)의 N-말단에서 아미노산들의 결실을 포함한다 (예로, △2-7). 일정 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 자연적으로-발생하는 인간 IGFII와 대비하여 IGF-I 수용체와 같은 다른 수용체들에 대한 결합 친화도를 감소시키는 변형된 인간 IGF-II 펩타이드이다.

다양한 추가적인 리소좀 표적 분체들이 당해 기술분야에 알려져 있고 본 발명을 시행하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 소정의 펩타이드-기초한 리소좀 표적 분체들이 미국 특허들 제 7,396,811호, 제7,560,424호, 및 제 7,629,309호; 미국 출원 공고들 제 2003-0082176호, 제 2004-0006008호, 제 2003-0072761호, 제 20040005309호, 제 2005-0281805호, 제 2005-0244400호, 또한 국제특허출원 제 WO 03/032913호, 제 WO 03/032727호, 제 WO 02/087510호, 제 WO 03/102583호, 제 WO 2005/078077호, 제 WO/2009/137721호에 기술되어 있고, 본 명세서에서 그들의 기재 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

링커 또는 스페이서

리소좀 표적 분체는 리소좀 효소를 인코딩하는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합되거나, 내부적으로 삽입될 수 있다. 리소좀 표적 분체는 리소좀 효소 폴리펩타이드에 직접 융합될 수 있거나 링커 또는 스페이서에 의해 리소좀 효소 펩타이드로부터 분리될 수 있다. 아미노산 링커 또는 스페이서는 일반적으로 유연하도록 또는 두 가지 단백질 분체들 사이에 알파-나선과 같은 구조를 삽입하도록 설계된다. 링커 또는 스페이서는 서열 GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4), GAP (서열번호 5), GGGGGP (서열번호 6)와 같이 비교적 짧을 수 있거나, 예를 들어 10-50개 (예로, 10-20개, 10-25개, 10-30개, 10-35개, 10-40개, 10-45개, 10-50개) 아미노산들 길이와 같이 더 길어질 수 있다. 일정 구현예들에서, 다양한 짧은 링커 서열들이 일렬 반복서열들 (tandem repeats)로 존재할 수 있다. 예를 들어, 적합한 링커는 일렬 반복서열들로 존재하는 GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, 이러한 링커는 좀 더 나아가 GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4) 서열을 구성하는 하나 이상의 GAP 서열들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 링커는

GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (서열번호 5)

의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일정 구현예들에서, 적합한 링커 또는 스페이서는 서열번호 5의 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 일치하는 서열을 포함할 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 치료적 단백질은 M6P 잔기들을 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 치료적 단백질은 CI-MPR에 더 높은 결합 친화도를 가지는 비스-인산화 올리고사카라이드들 (bis-phosphorylated oligosaccharides)를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 효소는 효소 당 약 적어도 20%까지의 비스-인산화 올리고사카라이드들 를 포함한다. 다른 구현예들에서, 적합한 효소는 효소 당 약 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%의 비스-인산화 올리고사카라이드들을 포함할 수 있다. 이러한 비스-인산화 올리고사카라이드들은 효소 상에 자연적으로 존재할 수 있으면서도, 효소들은 이러한 올리고사카라이드들을 소유하도록 변형될 수 있는 점을 주목해야 한다. 예를 들어, 적합한 대체 효소들은 리소좀 효소들 상에서 UDP-GlcNAc 로부터 α-1,2-연결된 만노스들의 6' 위치로 N-아세틸글루코사민-L-포스페이트의 이동을 촉매할 수 있는 소정의 효소들에 의해 변형될 수 있다. 이러한 효소들을 생산하고 사용하는 방법들 및 조성물들은, 예를 들어 캔필드 등 (Canfield et al.)에 의해 미국 특허 제 6,537,785호 및 미국 특허 제 6,534,300호에서 기술되고 있고, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 치료적 단백질은 저당화 된다. 본 발명에서 사용되는 바, "저당화 (underglycosylated)"는 정상적으로 자연적으로-발생하는 효소 상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 구조들 (예로, M6P 잔기들)이 생략되거나, 제거되거나, 변형되거나, 차단되었던 단백질 또는 효소를 말한다. 저당화된 리소좀 효소들은 통상적인 포유동물 세포들 (예로, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들)이 하는 것과 같이 단백질들을 당화하지 못하는 숙주 (예로, 박테리아 또는 효모)에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 숙주에 의해 생산되는 단백질들은 만노스 수용체에 의해 인식되는 말단 만노스, 퓨코스, 및/또는 N-아세틸글루코사민 잔기들이 결여될 수 있거나, 완벽하게 비당화될 수 있다. 일정 구현예들에서, 저당화된 리소좀 효소들은 포유동물 세포들 또는 기타 다른 숙주들에서 생산될 수 있지만, 하나 이상의 탄수화물 잔기들 (예로, 하나 이상의 M6P 잔기들)을 제거하도록 또는 하나 이상의 탄수화물 잔기들을 변형하거나 차단하도록 화학적으로 또는 효소적으로 처리될 수 있다. 이러한 화학적으로 또는 효소적으로 처리된 효소들은 탈당화된 리소좀 효소들이라고도 역시 말한다. 일정 구현예들에서, 하나 이상의 잠재적인 당화 부위들은 리소좀 효소를 인코딩하는 핵산의 돌연변이에 의해 제거되고, 이에 의해 포유동물 세포 또는 단백질들을 당화하는 다른 세포에서 합성될 때 효소의 당화를 감소시킨다. 일정 구현예들에서, 리소좀 효소들은 분비 신호 펩타이드 (secretory signal peptide) (예로, IGF-II 신호 펩타이드)를 사용하여 생산될 수 있어 효소들의 당화 수준들이 감소되고 및/또는 변형된다. 저당화 또는 탈당화된 리소좀 효소들의 예들이 미국 특허 제 7,629,309호 및 미국 특허 공고 제 20090041741호 및 제 20040248262호에 기술되고, 본 명세서에서 이들 기재의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

단백질 생산

본 발명에 적합한 치료적 단백질들은 세포 배양 및 폴리펩타이드들의 발현이 잘 되는, 예를 들어 인간 배아 신장 (HEK) 293, 중국 햄스터 난소 (CHO), 원숭이 신장 (COS), HT1080, C10, HeLa, 새끼 햄스터 신장 (BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/O, 및 L-929 세포들과 같은 포유동물 세포들 또는 세포 유형들이라면 모두에서 생산될 수 있다. 상세한 비-제한적인 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 BALB/c 마우스 마이엘로마 세포주 (NSO/l, ECACC No: 85110503); 인간 망막모세포들 (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); SV40로 형질전환되 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포들 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 계대된 293 세포들) (Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포들 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포들 +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포들 (TM4, Mather, Biol . Reprod ., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포들 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포들 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부암 세포들 (HeLa, ATCC CCL 2); 고양이 신장 세포들 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포들 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포들 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포들 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들 (Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci ., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포들; FS4 세포들; 인간 간암 세포주 (Hep G2)을 포함한다. 일정 구현예들에서, 효소들은 CHO 세포들에서 생산된다. 일정 구현예들에서, 효소들은 엔도좀 산성화-결핍 세포주와 같은 CHO-유래 세포들 (예로, CHO-K1 유래한 END3 상보성 그룹)에서 생산된다.

효소들은, 예를 들어 곤충 (예로, Sf-9, Sf-21, Hi5), 식물 (예로, 레구미노사 (Leguminosa), 곡물 또는 담배), 효모 (예로, S. cerivisae, P. pastoris), 원생동물 (예로, E. Coli , B. subtilis 및 기타 Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp), 또는 곰팡이와 같은 다양한 비-포유동물 숙주 세포들에서도 역시 발현될 수 있다.

다른 구현예들에서, 형질전환 비인간 포유동물들이 그들의 젖에서 리소좀 효소들을 생산하는 것이 확인되어 왔다. 이러한 형질전환 비인간 포유동물들은 마우스, 또끼들, 염소들, 양들, 돼지들 또는 소들을 포함할 수 있다. 미국 특허들 제 6,118,045호 및 제 7,351,410호를 참조하고, 본 명세서에서 이들 각각은 참고문헌으로 통합되어 있다.

경막내 전달

본 발명에 따르면, Naglu 도메인을 포함하는 치료적 단백질 예로 대체 효소는 CNS로 전달된다. 다양한 기법들 및 경로들이, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질내, 대뇌내, 측실내 대뇌 (ICV), 경막내 (예로, IT-요추, IT-대수공) 투여들, 또한 CNS 및/또는 CSF로 직접 또는 간접 주사를 위한 기타 다른 기법들 및 경로들을 포함하여 CNS 전달에 사용될 수 있다.

일정 구현예들에서, 대체 효소는 치료의 필요가 있는 개체의 뇌척수액 (CSF) 내로 투여하여 CNS로 전달된다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 원하는 대체효소를 CSF 내로 전달하는 데 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 경막내 투여 (경막내 주사라고도 말함)는 척수관 (척수 주위의 경막내 공간) 내로의 주사를 말한다. 다양한 기법들 (techniques)이, 제한되지 않고 천두공 또는 대수공 또는 요추 (lumbar) 천자 (puncture) 등을 통한 측뇌실 주사를 포함하여 사용될 수 있다. 대표적인 방법들이 Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 and Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179에 기술되고, 그들의 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

본 발명에 따르면, 효소는 척수관 주위의 부위라면 모두에 주사될 수 있다. 일정 구현예들에서, 효소는 요추 영역 또는 대수공 내로 또는 뇌실 공간 내로 뇌실내 주사된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위" 또는 "요추 영역"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 자세하게는 척추의 L2-S1 부위를 말한다. 전형적으로, 요추 부위 또는 요추 영역을 통한 경막내 주사도 역시 "요추 IT 전달" 또는 "요추 IT 투여" 라고 말한다. 용어 "대수공 (cisterna magna)"는 두개골 및 척추의 첨단 사이의 구멍을 통한 소뇌 주위 및 아래의 공간을 말한다. 전형적으로, 대수공을 통한 경막내 투여도 역시 "대수공 전달"이라고 말한다. 용어 "뇌실 (cerebral ventricle)"은 척수의 중앙관과 연속되는 뇌의 공동들 (cavities)을 말한다. 전형적으로, 뇌실을 통한 주사들은 뇌실내 뇌 (ICV) 전달이라고도 말한다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달"은 예를 들어 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이, 보다 자세하게는 척추의 L2-S1 부위 사이에 전달되는 요추 IT 투여를 말한다. 요추 IT 투여 또는 전달은 전형적으로 다른 것들보다 대수공 전달이 말단 척추관으로 잘 전달되지 못하는 반면, 우리의 발명에 따른 요추 IT 투여 또는 전달은 말단 척추관으로 더 나은 또한 더 효과적인 전달을 제공하는 점에서 대수공 전달과는 구별되는 것으로 참작된다.

IT 전달을 위한 안정한 제형물들

일정 구현예들에서, 원하는 효소는 경막내 전달을 위해 안정 제형물들로 전달된다. 본 발명의 소정의 구현예들은 적어도 부분적으로는 본 명세서에서 기재된 다양한 제형물들이 CNS의 표적된 조직들, 세포들 및/또는 소기관들로 하나 이상의 치료제들 (예로, 효소들)의 효과적인 전달 및 분배를 용이하게 하는 점의 발견을 기초로 한다. 다른 것들 중에서, 본 명세서에서 기술된 제형물들은 치료제들 (예로, 단백질들 또는 효소들)의 높은 농도들을 용해화할 수 있고 CNS 성분 및/또는 병인학을 가지는 질환들의 치료를 위해 개체들의 CNS로 이러한 치료제들의 전달에 적합하다. 본 명세서에서 기술된 조성물들은 좀 더 나아가 그의 필요가 있는 개체의 CNS로 (예로, 경막내) 투여될 때 향상된 안정도 및 향상된 내성도를 특징으로 한다.

본 발명 이전에, 통상적인 비완충된 등장성 식염수 및 인공 CSF인 엘리어트 B 용액이 전형적으로 경막내 전달에 사용되었다. 엘리어트 B 용액에 대비하여 CSF의 조성들을 보여주는 비교가 하기 표 2에 포함되어 있다. 표 2에서 나타난 바와 같이, 엘리어트 B 용액의 농도는 CSF의 농도와 매우 유사하다. 그러나 엘리어트 B 용액은 매우 낮은 완충액 농도를 포함하고 따라서 특히 연장된 기간 동안 (예로, 축적 조건들 동안) 치료제들 (예로, 단백질들)을 안정화하는 데 필요한 적당한 완충화 능력을 제공할 수 없다. 또한, 엘리어트 B 용액은 일정 치료제들, 상게하게는 단백질들 또는 효소들을 전달하도록 의도된 제형물들과 부적합할 수 있는 소정의 염들을 포함한다. 예를 들어, 엘리어트 B 용액에 존재하는 칼슘 염들은 단백질 침전을 매개할 수 있고 이에 의해 제형물의 안정도를 감소시킬 수 있다.

따라서, 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달에 적합한 제형물들은 합성 또는 인공 CSF가 아니다.

일정 구현예들에서, 경막내 전달용 제형물들은 이로 제형화된 하나 이상의 치료제들 (예로, 재조합 단백질들)을 안정화하거나, 임의적으로 그의 분해를 지연시키거나 방지할 수 있도록 제형화되어 왔다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안정한"은 연장된 기간 동안 그의 치료적 효능 (예로, 의도된 생물학적 활성 및/또는 물리화학적 본성의 모두 또는 대다수)을 유지하는 치료제 (예로, 재조합 효소)의 능력을 말한다. 치료제의 안정도, 및 이러한 치료제의 안정도를 유지하는 약제학적 조성물의 능력은 연장된 기간 동안 (예로, 적어도 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월 이상 동안) 평가될 수 있다. 제형물의 문맥에서, 안정한 제형물은 안에 있는 치료제가 필수적으로 보관 시 및 공정들 (냉동/해동, 기계적인 혼합 및 동결건조와 같음) 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 본성 및 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정도의 경우, 고분자량 (HMW) 응집체들의 형성, 효소 활성의 상실, 단백질 단편들의 생성 및 전하 프로파일들의 이동 (shift)에 의해 측정될 수 있다.

치료제의 안정도를 특히 중요하다. 치료제의 안정도는 좀 더 나아가 연장된 기간 동안 치료제의 생물학적 활성 또는 물리화학적 본성과 대비하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 주어진 시점에서의 안정도는 이전 시점 (예로, 제형화0일)에서의 안정도와 대비하여 또는 비제형화된 치료제 및 백분율로서 표시되는 본 비교의 결과들과 대비하여 비교될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 약제학적 조성물들은 연장된 기간 동안 치료제의 생물학적 활성 또는 물리화학적 본성의 적어도 100%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 또는 적어도 50%를 유지한다 (예로, 적어도 약 6 내지 12개월 동안 상온에서 또는 가속된 보관 조건들 하에서 측정된 바와 같음).

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 원하는 효소들)은 본 발명의 제형물들에서 용해가능하다. 용어 "용해성 (soluble)"은 이것이 본 발명의 치료제들에 관한 바 균질한 용액을 형성하는 이러한 치료제들의 능력을 말한다. 바람직하게, 치료제가 투여되고 작용의 표적 부위 (예로, 뇌의 세포들 및 조직들) 내로 운반되는 용액에서 치료제의 용해도는 작용의 표적 부위로 치료적 유효량의 치료제의 전달을 허용하는데 충분하다. 여러가지 요인들이 치료제들의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 단백질 용해도에 영향을 줄 수 있는 적절한 요인들은 이온 강도, 아미노산 서열 및 기타 다른 공-용해화 제제들 또는 염들 (예로, 칼슘 염들)의 존재를 포함한다. 일정 구현예들에서, 약제학적 조성물들은 칼슘 염들이 이러한 조성물들로부터 배제되도록 제형화된다.

따라서, 경막내 투여에 적합한 제형물들은 다양한 농도들로 관심있는 치료제 (예로, 효소)를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 제형물들은 약 300 mg/ml까지 (예로, 약 250 mg/ml까지, 200 mg/ml까지, 150 mg/ml까지, 100 mg/ml까지, 90 mg/ml까지, 80 mg/ml까지, 70 mg/ml까지, 60 mg/ml까지, 50 mg/ml까지, 40 mg/ml까지, 30 mg/ml까지, 25 mg/ml까지, 20 mg/ml까지, 10 mg/ml까지)의 농도로 관심있는 단백질 또는 효소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 제형물들은 약 0 내지 300 mg/ml (예로, 약 1 내지 250 mg/ml, 약 1 내지 200 mg/ml, 약 1 내지 150 mg/ml, 약 1 내지 100 mg/ml, 약 10 내지 100 mg/ml, 약 10 내지 80 mg/ml, 약 10 내지 70 mg/ml, 약 1 내지 60 mg/ml, 약 1 내지 50 mg/ml, 약 10 내지 150 mg/ml, 약 1 내지 30 mg/ml) 사이 범위의 농도로 관심있는 단백질 또는 효소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 경막내 전달에 적합한 제형물들은 대략 1 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml 또는 300 mg/ml의 농도로 관심있는 단백질을 포함할 수 있다.

일정 구현예들에서, 등장성 용액들이 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 약간 고장성 용액들 (예로, 300 mM까지 (예로, 250 mM, 200 mM, 175mM, 150 mM, 125 mM까지) pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 염화나트륨) 및 당-포함 용액들 (예로, 3%까지 (예로, 2.4%, 2.0%, 1.5%, 1.0%까지) pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 슈크로스)는 원숭이들에서 잘 내성화되는 것으로 나타났다. 일정 구현예들에서, 적합한 CNS 볼루스 제형 조성물은 식염수 (예로, 물에 녹인 150mM NaCl)이다.

많은 치료제들, 상세하게는 본 발명의 단백질들 및 효소들은 본 발명의 약제학적 조성물들에서 그들의 용해도 및 안정도를 유지하도록 조절된pH 및 특이적 운반체들을 요구한다. 하기 표 3은 본 발명의 단백질 치료제들의 용해도 및 안정도를 유지하는 데 중요한 것으로 고려되는 단백질 제형물들의 소정의 대표적인 관점들을 확인시켜주고 있다.

약제학적 조성물의 pH는 수성의 약제학적 조성물에서 치료제 (예로, 효소 또는 단백질)의 용해도를 변경시킬 수 있는 추가적인 요인이다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 하나 이상의 완충액들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 조성물들은 상기 조성물의 최적의 pH를 약 4.0 내지 8.0 사이, 약 5.0 내지 7.5 사이, 약 5.5 내지 7.0 사이, 약 6.0 내지 7.0 사이, 및 약 6.0 내지 7.5 사이로 유지하도록 충분량의 완충액을 포함한다. 다른 구현예들에서, 완충액은 약 50 mM까지 (예로, 약 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM까지)의 소듐 포스페이트를 포함한다. 예를 들어, 적합한 완충액들로는 아세테이트 (acetate), 숙시네이트 (succinate), 시트레이트 (citrate), 포스페이트 (phosphate), 기타 다른 유기산들 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 ("트리스 (Tris)")를 포함한다. 적합한 완충액 농도들은, 예를 들어 완충액 및 제형물의 원하는 등장도 (isotonicity)에 의존하여 약 1 mM 로부터 약 100 mM까지, 또는 약 3 mM으로부터 약 20 mM까지일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 완충제 (완충액ing agent)는 대략 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 또는 100 mM의 농도로 존재한다.

일정 구현예들에서, 제형물들은 등장성으로 제형물들을 유지하도록 등장성 제제 (isotonicity agent)를 포함한다. IT 전달과 연결하여 사용되는 바, "등장성"에 의하여 관심있는 제형물이 필수적으로 인간 CSF와 동일한 삼투도를 가지는 것을 의미한다. 일반적으로, 등장성 제형물들은 약 240 mOsm/kg 으로부터 약 350 mOsm/kg까지의 삼투도를 가질 것이다. 등장도는, 예를 들어 증기압 또는 어는점 유형의 삼투 측정기 (osmometers)를 사용하여 측정될 수 있다. 대표적인 등장성 제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 글리신, 소비톨, 만니톨, 염화나트륩 및 아르기닌을 포함한다. 일정 구현예들에서, 적합한 등장성 제제들은 무게로 약 0.01내지 5 % (예로, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 또는 5.0%)로부터 나온 동도로 제형물들에 존재할 수 있다.

일정 구현예들에서, 제형물들은 단백질을 보호하도록 안정화제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 적합한 안정화제는 슈크로스, 라피노스, 트레할로스와 같은 비-환원 당, 또는 글리신, 아르기닌 및 메티오닌과 같은 아미노산들이다. 일반적으로 제형물에서 안정화제의 양은 제형물이 등장성이 될 양이다. 그러나, 고장성 제형물들도 역시 적합할 수 있다. 또한, 안정화제의 양은 너무 낮아서 치료제의 분해/응집이 허용가능하지 않은 양으로 발생해서는 안된다. 제형물에서 대표적인 안정화제 농도들은 약 1 mM 로부터 약 400 mM까지 (예로, 약 30 mM 로부터 약 300 mM까지, 및 약 50 mM 로부터 약 100 mM까지)의 범위, 또는 임의적으로 무게로 0.1% 로부터 15%까지 (예로, 1% 로부터 10%까지, 5% 로부터 15%까지, 5% 로부터 10%까지)의 범위일 수 있다. 일정 구현예들에서, 안정화제 및 치료제의 질량의 비율은 약 1:1이다. 다른 구현예들에서, 안정화제 및 치료제의 질량의 비율은 약 0.1:1, 0.2:1, 0.25:1, 0.4:1, 0.5:1, 1:1, 2:1, 2.6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10;1, 또는 20:1이다. 일정 구현예들에서, 동결건조에 적합한 안정화제는 역시 동결보호제들 (lyoprotectants)이다.

본 발명의 약제학적 조성물들, 제형물들 및 관련 방법들은 개체의 CNS로 다양한 치료제들을 전달하는데 (예로, 경막내로, 뇌실내로 (intraventricularly) 또는 대수공내로 (intracisternally)) 또한 연관된 질환들의 치료에 유용하다. 본 발명의 약제학적 조성물들은 특히 리소좀 축적 장애들을 앓는 개체에게 단백질들 및 효소들을 전달하는 데 유용하다.

일정 구현예들에서, 제형물들에 표면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. 대표적인 표면활성제들로는 폴리솔베이트들 (Polysorbates) (예로, 폴리솔베이트 20 또는 80); 폴록사머들 (poloxamers) (예로, 폴록사머 188); 트리톤 (Triton); 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥실 글리코사이드; 로릴-, 미리스틸-, 리노레일-, 또는 스테아릴-설포베타인 (sulfobetaine); 미리스틸-, 리노레일-, 또는 스테아릴-사르코신 (sarcosine); 리노레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필 (lauroamidopropyl)-, 코크아미도프로필 (cocamidopropyl)-, 리노레아미도프로필 (linoleamidopropyl)-, 미리스트아미도프로필 (myristamidopropyl)-, 팔미도프로필 (palmidopropyl)-, 또는 이소스테아르아미도프로필 (isostearamidopropyl)-베타인 (예로, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 오페일-타우레이트; 또한 MONAQUAT^TM 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체들 (예로, 플루로닉스 (Pluronics), PF68 등)와 같은 비이온성 표면활성제들을 포함한다. 전형적으로, 첨가된 표면활성제의 양은 이것이 단백질의 응집을 감소시키고 미립자들 또는 포기들 (effervescences)의 형성을 최소화하는 양이다. 예를 들어, 표면활성제는 약 0.001 내지 0.5% (예로, 약 0.005 내지 0.05%, 또는 0.005 내지 0.01%)로부터 나온 농도로 제형물에 존재할 수 있다. 상세하게, 표면활성제는 대략 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5% 등의 농도로 제형물에 존재할 수 있다.

일정 구현예들에서, 적합한 제형물은 좀 더 나아가 하나 이상의 충전제들, 상세하게는 동결건조된 제형물들을 위한 것을 포함할 수 있다. "충전제 (bulking agents)"는 동결건조된 혼합물에 질량을 첨가하고 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여한다. 예를 들어, 충전제는 동결건조된 케이크 (예로, 필수적으로 일정한 동결건조된 케이크)의 모을 개선시킬 수 있다. 적합한 충전제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 염화나트륨, 락토스, 만니톨, 글리신, 슈크로스, 트레할로스, 하이드록시에틸 전분을 포함한다. 대표적인 충전제들의 농도들은 약 1% 로부터 약 10%까지 (예로, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 및 10.0%)이다.

본 발명에 따른 제형물들은 제품 품질 분석, 재구성 시간 (동결건조된 경우), 재구성의 품질 (동결건조된 경우), 고분자량, 수분, 및 유리 전이 온도를 기초로 하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 단백질 품질 및 제품 분석은, 이에 제한되는 것은 아니지만 크기 배제 HPLC (SE-HPLC), 양이온 교환-HPLC (CEX-HPLC), X-선 회절 (XRD), 조정된 차별 스캐닝 열량측정법 (modulated differential scanning calorimetry, mDSC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 다각도 광 분산 (MALS), 형광, 자외선 흡수, 혼탁측정법 (nephelometry), 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis, CE), SDS-PAGE, 및 그들의 조합을 포함하는 방법들을 사용하는 제품 분해율 분석을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 제품의 평가는 모양 (액체 또는 케이크 모양)을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.

일반적으로, (동결건조된 또는 수성의) 제형물들은 상온에서 연장된 기간들 동안 보관될 수 있다. 보관 온도는 전형적으로 0 ?로부터 45 ?까지의 범위 (예로, 4?, 20 ?, 25 ?, 45 ? 등)일 수 있다. 제형물들은 개월 단위 기간 내지 연 단위 기간 동안 보관될 수 있다. 일반적으로 보관 시간은 24개월, 12개월, 6개월, 4.5개월, 3개월, 2개월 또는 1개월일 것이다. 제형물들은 이동 단계들을 없애려고 투여에 사용되는 용기에 직접 보관될 수 있다.

제형물들은 이동 단계들을 없애려고 재구성 관 (reconstitution vessel)로서도 역시 기능할 수 있는 동결건조 용기에 직접 보관될 수 있다. 임의적으로, 동결건조된 제품 제형물들은 보관을 위해 더 작은 증분들 (increments) 내로 측정될 수 있다. 일반적으로 보관은 단백질의 분해를 유발하는, 이에 제한되는 것은 아니지만 태양광 노출, UV 조사, 다른 형태들의 전자기 조사, 과도한 열 또는 추위, 급속한 열적 충격, 및 기계적인 충격을 포함하는 환경들을 피해야 한다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 제형물들은 액체 또는 수성의 형태로 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 제형물은 동결건조된다. 이러한 동결건조된 제형물들은 개체에게 투여 이전에 하나 이상의 희석제들을 이에 첨가하여 재구성될 수 있다. 적합한 희석제들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 무균수, 주사용 정균수 및 무균 식염수를 포함한다. 바람직하게, 재구성 시, 여기에 포함되는 치료제는 안정하고 용해성이며 개체에게 투여 시 내성 (tolerability )을 나타낸다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그들의 내성을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "내성 (tolerable)" 및 "내성도 (tolerability)"은 본 발명의 약제학적 조성물들이 이러한 조성물이 투여된 개체에서 역효과를 발현하지 않도록, 임의적으로 이러한 조성물이 투여된 개체에서 심각한 역효과를 발현하지 않도록 하는 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 이러한 조성물들이 투여된 개체에 의해 내성화된다.

경막내 전달을 위한 장치

다양한 장치들이 본 발명에 따른 경막내 전달에 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여장치는 체액 유입 포트; 체액 유입 포트와 액체 소통하는 첫 번째 유동 입구 및 척수 내로의 삽입을 위해 형성된 두 번째 유동 입구를 가지는 공동체; 또한 척수에서 공동체의 삽입을 보장하는 안전 기작:을 포함한다. 도 1에 나타난 비-제한적인 예로서, 적합한 안전 기작은 공동체가 척수로부터 벗어나는 것을 막도록 공동체의 표면 위에 올려진 하나 이상의 돌기들 및 하나 이상의 돌기들 위로 조절가능한 연결된 고리를 포함한다. 다양한 구현예들에서, 체액 유입 포트는 저장조를 포함한다. 일정의 구현예들에서, 체액 유입 포트는 기계적인 펌프 (예로, 주입 펌프)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 이식된 카테터는 저장조 (예로, 일시 주사용), 또는 주입 펌프 둘 중 하나로 연결된다. 액체 유입 포트는 이식되어 있거나 외부에 있을 수 있다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 요추 천자 (예로, 저속 볼루스)에 의해 또는 포트-카테터 전달 시스템 (예로, 주입 또는 볼루스)를 통해 수행될 수 있다. 일정 구현예들에서, 카테터는 요추 판들 (laminae) 사이에 삽입되고 말단은 원하는 수준 (일반적으로 L3-L4)까지 경막 공간 위로 올려진다 (threaded up) (도 43A 내지 C).

전형적으로 정맥내 투여와 대비하여, 경막내 투여에 적합한 단일 용량 부피는 적다. 전형적으로, 본 발명에 따른 경막내 전달은 CSF조성물의 균형뿐만 아니라 개체의 구개골내 압력을 유지시킨다. 일정 구현예들에서, 경막내 전달은 개체로부터 해당하는 CSF 제거 없이 수행된다. 일정 구현예들에서, 적합한 단일 용량은, 예로 약 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1.5 ml, 1 ml, 또는 0.5 ml 이라일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 단일 용량 부피는 약 0.5-5 ml, 0.5-4 ml, 0.5-3 ml, 0.5-2 ml, 0.5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1.5-3 ml, 1-4 ml, 또는 0.5-1.5 ml일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 투여는 먼저 원하는 양의 CSF를 제거하는 단계가 관여한다. 일정 구현예들에서, 약 10 ml 이하 (예로, 약 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml 이하)의 CSF가 IT 투여 이전에 먼저 제거된다. 이들 경우들에서, 적합한 단일 용량 부피는, 예로 약 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 또는 20 ml 이상이다.

다양한 다른 장치들이 치료적 조성물의 경막내 투여에 효과를 주도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 효소들을 포함하는 제형물들이 수막성 암종증 (meningeal carcinomatosis)을 위한 약물들을 경막내 투여하는 데 공통적으로 사용되는 오마야 저장조 (Ommaya reservoir)를 사용하여 주어질 수 있다 (Lancet 2: 983-84, 1963). 보다 상세하게, 본 방법에서는 뇌실 튜브가 전방각 (anterior horn)에 형성되는 구멍를 통해 삽입되고 두피 하에 설치된 오마야 저장조로 연결되며, 저장조는 들어있는 특정한 효소를 경막내 전달하도록 피하적으로 천자된다. 개인에게 치료적 조성물들 또는 제형물들의 경막내 투여를 위한 다른 장치들이 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 특허 제 6,217,552호에 기술되어 있다. 임의적으로, 약물은 예를 들어 단입 주사 또는 연속식 주입에 의해 경막내로 주어질 수 있다. 투여량 치료 (dosage treatment)는 단일 용량 투여 또는 다중 용량들의 형태일 수 있다.

주사의 경우, 본 발명의 제형물들은 액체 용액들로 제형화될 수 있다. 또한, 효소는 고형으로 제형화되어 사용 바로 직전에 재-용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태들도 역시 포함된다. 예를 들어, 주사는 효소의 일시 주사 또는 연속식 주입 (예로, 주입 펌프들을 사용함)의 형태일 수 있다.

본 발명의 한 가지 구현예에서, 효소는 개체의 뇌 내로 측뇌실 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 주사는 개체의 두개골 내에 만들어진 천두공을 통하여 이루어진다. 또 다른 구현예들에서, 효소 및/또는 다른 약제학적 제형물은 개체의 뇌실 내로 외과적으로 삽입된 지름길 (shunt)을 통하여 투여된다. 예를 들어, 주사는 더 큰 뇌실들 내로 이루어진다. 일정 구현예들에서, 세 번째 및 네 번째로 작은 뇌실들 내로의 주사도 역시 이루어진다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명에 사용되는 약제학적 조성물은 개체의 대수공 또는 요추 영역 내로의 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 제형물은 지속적인 전달, 예로 본 발명에 사용되는 효소 또는 다른 약제학적 조성물의 "저속 방출 (slow release)"을 개체에게 약제학적으로 허용가능한 제형물이 개체에게 투여된 이후 적어도 1, 2, 3, 4주 이상의 기간 동안 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "지속적인 전달 (sustained delivery)"은 투여에 이어지는 초과기간, 바람직하게 적어도 수 일, 한 주 또는 수 주 동안 생체내 (in vivo)에서 본 발명의 약제학적 제형물의 연속적인 전달을 말한다. 조성물의 지속적인 전달은 예를 들어 초과기간 동안 효소의 계속되는 치료적 효과에 의해 확인될 수 있다 (예로, 효소의 지속적인 전달은 개체에서 축적 과립들의 계속적인 감소량에 의해 확인될 수 있다). 임의적으로, 효소의 지속적인 전달은 초과기간 동안 생체내 효소의 존재를 검출하여 확인될 수 있다.

표적 조직들로의 전달

상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 놀랍고도 중요한 특징들의 하나는 치료제들, 상세하게는 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물을 사용하여 투여된 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)이 뇌 표면을 거쳐서 효과적으로 또는 광범위하게 확산되고 깊은 뇌의 부위들을 포함하는 뇌의 다양한 층들 또는 부위들을 침투하는 점이다. 또한, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)을 ICV 주사와 같은 기존의 CNS 전달 방법들에 의해 표적하는 것이 어려운 다양한 조직들, 뉴런들 또는 요추 부위를 포함하는 뇌척수의 세포들로 효과적으로 전달시킨다. 또한, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 혈류 및 다양한 말초 기관들 및 조직들로 충분량의 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)을 전달시킨다.

따라서, 일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)는 개체의 중추신경계로 전달된다. 일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)는 뇌, 척수 및/또는 말초 기관들의 하나 이상의 표적 조직들로 전달된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직들 (target tissues)"은 치료될 리소좀 축적병에 의해 영향을 받는 조직이라면 모두 또는 결핍 리소좀 효소가 정상적으로 발현되는 조직이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 리소좀 축적병을 앓거나 이에 취약한 환자들에서 효소 기질, 예를 들어 조직의 세포성 리소좀들에 축적된 것의 검출가능하거나 비정상적으로 많은 양이 존재하는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 질환-연관된 병리학, 증상 또는 특징을 나타내는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 결핍 리소좀 효소가 올라간 수준으로 정상적으로 발현되는 이들 조직들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 표적 조직인 뇌 표적 조직, 척수 표적 조직 및/또는 말초 표적 조직일 수 있다. 대표적인 표적 조직들은 하기에 상술되고 있다.

뇌 표적 조직들

일반적으로, 뇌는 서로 다른 부위들, 층들 및 조직들로 구분될 수 있다. 예를 들어, 뇌척수막 조직은 뇌를 포함하는 중추신경계를 감싸는 막들의 시스템이다. 뇌척수막들은 경질막, 거미막 및 연질막을 포함하는 세 가지의 층들을 포함한다. 일반적으로, 뇌척수막 및 뇌척수액의 일차적인 기능은 중추신경계를 보호하는 것이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 단백질은 뇌척수막들의 하나 이상의 층들로 전달된다.

뇌는 대뇌 (cerebrum), 소뇌 (cerebellum), 및 뇌줄기 (brain stem)를 포함하는 세 가지의 일차 소구분들을 가진다. 대뇌 반구들 (cerebral hemispheres)는 뇌 구조들의 가장 위에 위치하고 피질층 (cortical layer)으로 덮혀있다. 뇌줄기는 대뇌가 부착되는 줄기와 유사하고 대뇌 아래에 놓여있다. 뇌의 후반구에는, 소뇌가 대뇌 아래 및 뇌줄기 뒤에 있다.

뇌의 중간선 근처에 또한 중뇌 (mesencephalon) 위에 위치하는 간뇌 (diencephalon)는 시상 (thalamus), 시상 후부 (metathalamus), 시상 하부 (hypothalamus), 시상 상부 (epithalamus), 시상 전부 (prethalamus), 및 덮개 전부 (pretectum)를 포함한다. 중간뇌라고도 불리는 중뇌는 덮개 (tectum), 뒷판 (tegumentum), 뇌실 중배강 (ventricular mesocoelia), 및 대뇌다리 (cerebral peduncels), 적색핵, 및 뇌신경 the red nucleus, III 핵을 포함한다. 중뇌는 시각, 청각, 운동 조절, 수면/기상, 각성 및 온도 조절과 연관되어 있다.

뇌를 포함하는 중추신경계의 조직들의 부위들은 조직의 깊이를 기초로 하여 특징지어진다. 예를 들어, CNS (예로, 뇌) 조직들은 표면 또는 얕은 조직들, 중간-깊이 조직들, 및/또는 깊은 조직들로서 특징지어진다.

본 발명에 따르면, 치료제 (예로, 대체 효소)는 개체에서 치료될 특정한 질환과 연관된 적절한 뇌 표적 조직(들)이라면 모두로 전달될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제 (예로, 대체 효소)는 표면 또는 얕은 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 중간-깊이 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 깊은 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 표면 또는 얕은 뇌 표적 조직, 중간-깊이 뇌 표적 조직, 및/또는 깊은 뇌 표적 조직의 조합으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 뇌의 외부 표면 아래로 (또는 내부로) 적어도 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm 이상의 깊은 뇌 표적 조직으로 전달된다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 대뇌의 표면 또는 얕은 조직들의 하나 이상으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 대뇌의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 연질막 조직들, 대뇌 피질 리본 조직들, 해마, 버코우 로빈 공간 (Virchow Robin space), VR 공간 내의 혈관들, 해마, 뇌의 하부 표면 상의 시상하부의 일부들, 시신경들 및 관들, 후각 망울 및 돌출부들, 또한 그들의 조합으로부터 선택된다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 하나 이상의 대뇌의 깊은 조직들로 전달된다. 일정의 구현예들에서, 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 대뇌의 표면 아래로 (또는 내부로) 4 mm (예로, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm)에 위치한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 깊은 조직들은 대뇌 피질 리본을 포함한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 깊은 조직들은 하나 이상의 간뇌 (예로, 시상하부, 시상, 시상 전부, 시상 아래부 등), 후뇌, 렌즈핵 (lentiform nuclei), 기저 신경절 (basal ganglia), 미상엽 (caudate), 조가비핵 (putamen), 편도핵 (amygdale), 창백핵 (globus pallidus), 및 그들의 조합을 포함한다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 소뇌의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 소정의 구현예들에서, 소뇌의 표적된 하나 이상의 조직들은 분자층 의 조직들, 퍼킨지 세포층 (Purkinje cell layer), 과립 세포층 (granular cell layer)의 조직들, 대뇌다리, 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 퍼킨지 세포층의 조직들, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌 백색질 조직 (예로, 과립 세포층에 대비하여 깊음), 및 깊은 소뇌 핵 조직을 포함하는 소뇌의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 뇌줄기의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 일정의 구현예들에서, 뇌줄기의 표적된 하나 이상의 조직들은 뇌 줄기 백색질 조직 및/또는 뇌줄기 핵 조직을 포함한다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 회색질, 백색질, 뇌실주위 영역들, 연질-거미막, 뇌척수막, 신생피질 (neocortex), 소뇌, 대뇌 피질에서의 깊은 조직들, 분자층, 미상엽/조가비핵 부위, 중간뇌, 교뇌 (pons) 또는 연수 (medulla)의 깊은 부위들, 및 그들의 조합을 포함하는 다양한 뇌 조직들로 전달된다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 뉴런들. 아교세포들, 혈관주위 세포들 및/또는 뇌척수막 세포들을 포함하는 다양한 세포들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질은 깊은 백색질의 희소돌기아교세포들 (oligodendrocytes)로 전달된다.

척수

일반적으로, 척수의 부위들 또는 조직들은 조직들의 깊이를 기초로 하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 척수 조직들은 표면 또는 얕은 조직들, 중간-깊이 조직들, 및/또는 깊은 조직들로서 특징지어질 수 있다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 척수의 하나 이상의 표면 또는 얕은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 표면 또는 얕은 조직은 척수의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 표면 또는 얕은 조직은 연질막 및/또는 백색질의 관들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 척수의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 깊은 조직은 척수의 표면으로부터 4 mm 내부에 위치한다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 깊은 조직은 척수 회색질 및/또는 뇌실막 세포들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 치 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 척수의 뉴런들로 전달된다.

말초 표적 조직들

본 명세서에서 사용되는 바, 말초 기관들 또는 조직들은 중추신경계 (CNS)의 일부가 아닌 기관들 또는 조직들이라면 모두를 말한다. 말초 표적 조직들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 간, 신장, 및/또는 심장, 내피세포, 골수 및 세포들로부터 유래한 골수, 비장, 폐, 림프절, 뼈 및 연골, 난소 및 정소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 하나 이상의 말초 표적 조직들로 전달된다.

생체분배 및 생물 유용성

다양한 구현예들에서, 일단 표적 조직으로 전달되면 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 세포내에 정착된다. 예를 들어, 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 표적 세포 (예로, 퍼킨지 세포들과 같은 뉴런들)의 엑손들, 축삭들, 리소좀들, 미토콘드리아 또는 소포들에 정착될 수 있다. 예를 들어, 일정 구현예들에서 경막내-투여된 효소들은 전위 역학 (translocation dynamics)을 나타내어 효소는 혈관 주위 공간 내에서 움직인다 (예로, 박동성 전도 기작들 (pulsation-assisted convective mechanisms)에 의함). 또한, 투여된 단백질 또는 효소의 신경섬유 (neurofilaments)와 연결과 관련된 활동성 축삭 전달기작들도 역시 중축신경계의 심부 조직들 내로 경막내-투여된 단백질들 또는 효소들의 분배에 기여하거나 다른 경우라면 이를 용이하게 할 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달된 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 본 명세서에서 기술된 다양한 표적 조직들에서 치료적 또는 임상적 유효 수준들 또는 활성들을 달성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 치료적 또는 임상적 유효 수준 또는 활성은 표적 조직에서 치료적 효과를 부여하는 데 충분한 수준 또는 활성이다. 치료적 효과는 객관적 (예로, 일정 테스트 또는 마커에 의해 측정가능함) 또는 주관적 (예로, 개체가 효과의 표시를 주거나 느낌)일 수 있다. 예를 들어, 치료적 또는 임상적 유효 수준 또는 활성은 표적 조직에서 질환과 연관된 증상들 (예로, GAG 축적)을 개선시키는 데 충분한 효소적 수준 또는 활성일 수 있다

일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 표적 조직에서 해당하는 리소좀 효소의 정상적인 수준 또는 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%가 되는 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 대조군 (예로, 치료가 없는 내인성 수준들 또는 활성들)과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가되는 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 표적 조직에서 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg로 증가된 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 상세하게 요추 부위를 표적하는 데 유용하다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 요추 부위에서 적어도 대략 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg로 증가된 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 CSF 또한 뇌, 척수, 및 말초 기관들의 표적 조직들에서 충분하게 긴 반감기를 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 적어도 대략 30분, 45분, 60분, 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 3일까지, 7일까지, 14일까지, 21일까지 또는 한 달까지의 반감기를 가질 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 투여에 이어서12시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간, 78시간, 84시간, 90시간, 96시간, 102시간 또는 한 주 이후에 CSF 또는 혈류에서 검출가능한 수준 또는 활성을 보유할 수 있다. 검출가능한 수준 또는 활성은 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 결정될 수 있다.

소정의 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 투여에 이어서 (예로, 개체에게 약제학적 조성물의 경막내 투여에 이어서 한 주, 3일, 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하) 개체의 CNS 조직들 및 세포들에서 적어도 30?/ml의 농도를 달성하고 있다. 소정의 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)는 이러한 개체로의 투여에 이어서 (예로, 개체에게 약제학적 조성물의 경막내 투여에 이어서 한 주, 3일, 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하) 개체의 표적된 조직들 또는 세포들 (예로, 뇌 조직들 또는 뉴런들)에서 적어도 20?/ml, 적어도 15?/ml, 적어도 10?/ml, 적어도 7.5?/ml, 적어도 5?/ml, 적어도 2.5?/ml, 적어도 1.0?/ml, 또는 적어도0.5?/ml의 농도를 달성하고 있다.

경막내 투여에 의한 산필리포 증후군의 치료

산필리포 증후군 (Sanfilippo syndrome), 또는 점액다당류증 제 III형 (MPS III)은 글리코사미노글리칸들 (GAG)의 분해에 관여하는 효소들의 결핍을 특징으로 하는 희귀한 유전병이다. 효소의 부재 시, 부분적으로 분해된 GAG 분자들은 신체로부터 청소될 수 있고 다양한 조직들의 리소좀들에 축적되어 광범위한 진행성 신체적 기능이상을 유발한다 (Neufeld and Muenzer, 2001).

MPS IIIA, B, C, 및 D라고 명명되는 네 가지의 구별된 형태들의 MPS III가 확인되어 왔다. 각각은 GAG 헤파란 설페이트의 분해에 관여하는 네 가지 효소들의 하나에 결핍을 나타낸다. 모든 형태들은 조잡한 얼굴 특징들, 간비장비대, 각막 혼탁 및 골격 변형들을 포함하는 동일한 임상적 증상들의 다양한 정도들을 포함한다. 그러나 가장 명확하게는, 뉴런들에서 헤파란 설페이트의 축적뿐만 아니라 일차적인 GAG 축적에 의해 초래되는 갱글리오사이드들 GM2, GM3 및 GD2의 이어지는 상승과 관련된 인지 능력의 심각한 진행성 상실이다 (Walkley 1998).

점액다당류증 제 IIIB형 (MPS IIIB; 산필리포 증후군 B형 질환)은 알파-N-아세틸-글루코스아미니다제 (Naglu)의 결핍을 특징으로 하는 상염색체 열성 장애이다. 본 효소의 부재 시, GAG 헤파란 설페이트가 뇌의 외부에는 더 적게 축적되면서 뉴런들 및 아교세포들의 리소좀에 축적된다.

본 장애의 명확한 임상적 특징은 중추신경계 (CNS)의 퇴화이고, 이는 주요 발단 지표들의 소실, 또는 이를 획득하는 데 부전을 유발한다. 진행성 인지 감소는 치매 및 조기 사망으로 이어진다. 전형적으로 질환은 어린 아동들에서 소견을 나타내고 침범된 개인의 수명은 일반적으로 십대 후반 내지 이십대 초반을 넘지 못한다.

본 발명의 조성물들 및 방법들은 SanB를 앓고 있거나 이에 취약한 개인들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "치료하다" 또는 "치료"는 질환과 연관된 하나 이상의 증상들의 개선, 질환의 하나 이상 증상들의 발병 예방 또는 지연, 및/또는 질환의 하나 이상 증상들의 중증도 또는 빈도의 감소를 말한다.

일정 구현예들에서, 치료는 SanB 환자에서 신경학적 손상의 부분적 또는 완벽한 완화, 개선, 안정, 억제, 발병의 지연, 중증도 및/또는 발생의 감소를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "신경학적 손상 (neurological impairment)"은 중추신경계 (예로, 뇌 및 척수)의 손상과 연관된 다양한 증상들을 포함한다. 예를 들어, 신경학적 손상의 증상들은 발달 지연, 진행성 정신지체, 청력 상실, 손상된 언어 발달, 운동 능력들의 결여, 과다활동, 공격성 및/또는 수면 방해들을 포함할 수 있다.

따라서 일정 구현예들에서, 치료는 다양한 조직들에서 감소된 리소좀 축적 (예로, GAG)을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들, 및/또는 말단 표적 조직들에서 감소된 리소좀 축적을 말한다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 감소된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 LAMP-1 염색에 의해 결정된다.

일정 구현예들에서, 치료는 뉴런들 (예로, 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들)에서 감소된 공포화 (vacuolization)를 말한다. 소정의 구현예들에서, 공포화는 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 공포화는 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 감소된다.

일정 구현예들에서, 치료는 다양한 조직들에서 증가된 Naglu 효소 활성을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 증가된 Naglu 효소 활성을 말한다. 일정 구현예들에서, Naglu 효소 활성은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 이상 증가된다. 일정 구현예들에서, Naglu 효소 활성은 대조군과 대비하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가된다. 일정 구현예들에서, 증가된 Naglu 효소적 활성은 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg, 또는 600 nmol/hr/mg 이상이다. 일정 구현예들에서, Naglu 효소적 활성은 요추 부위에서 증가된다. 일정 구현예들에서, 요추 부위에서 증가된 Naglu 효소적 활성은 적어도 대략 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg이상이다.

소정의 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료는 리소좀 축적병들과 연관된 병리학적 또는 생물학적 마커들 하나 이상의 존재, 또는 임의적으로 축적의 감소 (예로, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 또는 99% 이상의 감소) 또는 완벽한 제거를 가져온다. 상세하게 이러한 감소 또는 제거는 CNS의 세포들 및 조직들 (예로, 뉴런들 및 희소돌기아교세포들)에서 입증될 수 있다. 예를 들어, 일정 구현예들에서, 개체에게 투여 시 본 발명의 약제학적 조성물들은 개체의 CNS 세포들 및 조직들에서 (예로, 대뇌 피질, 쇠뇌, 미상엽 핵 및 조가비핵, 백색질 및/또는 시상에서) 막 단백질 1 (LAMP1) 연관된 리소좀 바이오마커의 축적에서의 감소를 나타내거나 성취한다. LAMP1은 리소좀 막들에서 높게 발현되는 당단백질이고 그의 존재는 리소좀 축적 장애를 가지는 많은 환자들에서 올라간다 (Meikle, et al. Clin. Chem. (1997)43:1325-1335.). 따라서, 리소좀 축적병을 가진 환자들에서 LAMP1의 존재 또는 부재 (예로, LAMP 염색에 의해 결정되는 바와 같음)는 리소좀 활성의 유용한 표시자 및 리소좀 축적병들의 진단 및 감시 둘 다를 위한 마커를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일정 구현예들은 질환 (예로, 리소좀 축적병)과 연관된 하나 이상의 병리학적 또는 생물학적 마커들의 존재 또는 축적을 감소시키거나 다른 경우라면 제거하는방법들에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명의 일정 구현예들은 리소좀 축적병들과 연관된 하나 이상의 병리학적 또는 생물학적 마커들 (예로, LAMP1)의 분해 (또는 분해율)을 증가시키는 방법들에 관한 것이다.

일정 구현예들에서, 치료는 인지 능력 상실의 진행 감소를 말한다. 소정의 구현예들에서, 인지 능력 상실의 진행은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 치료는 감소된발달 지연을 말한다. 소정의 구현예들에서, 발달 지연은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다.

일정 구현예들에서, 치료는 증가된 생존 (예로, 생존 시간)을 말한다. 예를 들어, 치료는 환자의 증가된 수명 기대치를 가져올 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 한 명 이상의 유사한 질환을 가진 대조군 개인들의 치료가 없는 평균 수명 기대치와 대비하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 105%, 약 110%, 약 115%, 약 120%, 약 125%, 약 130%, 약 135%, 약 140%, 약 145%, 약 150%, 약 155%, 약 160%, 약 165%, 약 170%, 약 175%, 약 180%, 약 185%, 약 190%, 약 195%, 또는 약 200% 이상으로 증가된 수명 기대치를 가져온다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 한 명 이상의 유사한 질환을 가진 대조군 개인들의 치료가 없는 평균 수명 기대치와 대비하여 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 또는 약 10년 이상으로 증가된 수명 기대치를 가져온다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 환자의 강기 생존을 가져온다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "장기 생존 (long term survival)"은 40년, 45년, 50년, 55년, 또는 60년 이상보다 긴 수명 기대치의 생존 시간을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다"는 대조군과 대비한 수치들을 가르킨다. 일정 구현예들에서, 적합한 대조군은 본 명세서에서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인에서의 측정과 같은 기저선 측정이다. "대조군 개인 (control individual)"은 (치료된 개인 및 대조군 개인(들)에서 질환의 단계들이 비교가능한 점을 입증하도록) 치료될 개인과 거의 동일한 연령 및/또는 성별인 SanB를 앓고 있는 개인이다.

치료된 개인 ("환자" 또는 "개체"라고도 말함)은 SanB를 가지거나 SanB가 생길 잠재력을 가지는 개인 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 어른 인간)이다. 개인은 남아있는 내인성 Naglu 발현 및/또는 활성을 가지거나, 측정가능한 활성을 전혀 가지지 않을 수 있다. 예를 들어, SanB를 가지는 개인은 약 30 내지 50% 이하, 약 25 내지 50% 이하, 약 20 내지 25% 이하, 약 15 내지 20% 이하, 약 10 내지 15% 이하, 약 5 내지 10% 이하, 약 0.1 내지 5% 이하의 정상적인 Naglu 발현 수준들인 Naglu 발현을 가질 수 있다.

일정 구현예들에서, 개인은 최근에 질환으로 진단되었던 개인이다. 전형적으로, 조기 치료 (진단 이후 가능한 신속하게 시작된 치료)는 질환의 효과들을 최소화하고 치료의 유익들을 극대화하는 데 중요하다.

면역 내성

일반적으로, 본 발명에 따른 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)의 경막내 투여는 개체에서 심각한 역효과들을 유발하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바, 심각한 역효과들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질적인 면역 반응, 독성, 또는 사망을 유도한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "실질적인 면역 반응 (substantial immune response)"은 적응성 T-세포 면역 반응과 같은 중증 또는 심각한 면역 반응들을 말한다.

따라서, 많은 구현예들에서 본 발명에 따른 발명적 방법들은 동시적인 면역억제 요법 (예로, 전-치료/전-조정 또는 본 방법과 평등한 것으로서 사용되는 면역억제 요법이라면 모두)이 관여하지 않는다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 치료될 개인에서 면역 내성 유도가 관여하지 않는다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 T-세포 면역억제제를 사용하는 개체의 전-치료 또는 전조정이 관여하지 않는다.

일정 구현예들에서, 치료제들의 경막내 투여는 이들 제제들에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 따라서, 일정 구현예들에서, 개체가 효소 대체 요법에 내성을 가지는 대체 효소를 수여하도록 하는 것이 유용할 수 있다. 면역 내성은 당해 기술분야에서 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 사이클로스포린 A (CsA)와 같은 T-세포 면역억제제 또한 아자티오프린 (azathioprine, Aza)와 같은 항증식제의 초기 30 내지 60일 섭생이 원하는 대체 효소의 저용량들의 매주 경막내 주입들과 조합하여 사용될 수 있다.

당업자라면 숙지하고 있는 면역억제제라면 모두가 본 발명의 조합 요법과 함께 적용될 수 있다. 이러한 면역억제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 사이클로스포린 (cyclosporine), FK506, 라파마이신 (rapamycin), CTLA4-Ig, 및 에타너셉트 (etanercept)와 같은 항-TNF 제제들 (예로, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51, 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283 참조)를 포함한다. 이식 환자들에서 효과적인 것으로 확인되었던 항-IL2 수용체 (알파-단위체) 항체 다크리주마브 (daclizumab) (예로, 제나팍스 TM (Zenapax.TM.))도 역시 면역억제제로서 사용될 수 있다 (예로, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1, 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159 참조). 추가적인 면역억제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 항-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152), 및 항-CD40 리간드 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235)를 포함한다.

투여

본 발명의 발명적 방법들은 본 명세서에서 기술된 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)의 치료적 유효량의 단일 뿐만 아니라 다중 투여들을 고려하고 있다. 대체 효소들 (예로, Naglu 융합 단백질)은 개체의 조건 (예로, 리소좀 축적병)의 본성, 중증도 및 정도에 의존하여 규칙적인 간격들로 투여될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)의 치료적 유효량은 규칙적인 간격들 (예로, 매년 한 번, 6개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 격월 (2개월마다 한 번), 매월 (매월 한 번), 격주 (2주마다 한 번), 매주)로 경막내 투여될 수 있다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 다른 경로들의 투여와 결합하여 사용될 수 있다 (예로, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 경피적, 또는 경점막 (예로, 경구적 또는 비강내)). 일정 구현예들에서, 이들 다른 경로들의 투여 (예로, 정맥내 투여)는 격주, 매월, 2개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 4개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 6개월마다 한 번, 매년의 투여의 빈도로 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 주로 본 발명의 약제학적 조성물들에 포함되는 치료제의 전체량을 기초로 하여 결정된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 개체에게 의미있는 유익을 주는 데 (예로, 내재된 질환 또는 병폐를 치료하고, 조정하고, 치유하고, 예방하고 및/또는 개선하는 데) 충분하다. 예를 들어, 치료적 유효량은 리소좀 효소 수용체들 또는 그들의 활성을 조정하여 이러한 리소좀 축적병 또는 그의 증상들을 치료 (예로, 개체에게 본발명의 조성물들의 투여에 이어지는 "얼룩무늬체들 (zebra bodies)"의 존재 또는 출현 또는 세포성 공포화에서의 감소 또는 이의 제거)하는 데 충분량과 같은 원하는 치료적 및/또는 예방적 효과를 달성하는 데 충분량일 수 있다. 일반적으로, 필요로 하는 개체에게 투여되는 치료제 (예로, 재조합 리소좀 효소)의 양은 개체의 특징들에 의존할 것이다. 이러한 특징들은 개체의 병폐, 질환의 중증도, 일반적인 건강, 연령, 성별 및 체중을 포함한다. 당업자라면 이들 및 기타 다른 관련 요인들에 의존하여 적절한 용량들을 바로 결정할 것이다. 또한, 임의적으로 객관적 및 주관적인 검정법들 둘 다가 최적의 용량 범위들을 확인하도록 적용될 수 있다.

공통적으로 치료적 유효량은 다수의 단위 용량들을 포함할 수 있는 투여량 요법으로 투여된다. 특정한 치료적 단백질이라면 모두의 경우, 치료적 유효량 (및/또는 효과적인 투여량 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여의 경로, 다른 약제학적 제제들과의 조합에 의존하여 다양해질 수 있다. 또한, 특정한 환자라면 모두를 위한 특이적 치료적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약제학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 적용되는 특이적 융합 단백질의 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 대사율; 치료의 지속기간; 등의 의학적 기술분야들에 잘 알려져 있는 바와 같은 요인들을 포함하는 다양한 요인들에 의존할 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 500 mg/kg 뇌 무게까지의 범위, 예로, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 400 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 300 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 200 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 100 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 90 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 80 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 70 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 60 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 50 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 40 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 30 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 25 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 20 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 15 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 10 mg/kg 뇌 무게까지의 범위이다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 약 0.1 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 0.5 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 1.0 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 3 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 5 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 10 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 15 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 20 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 30 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 40 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 50 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 50 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 60 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 70 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 80 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 90 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 100 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 150 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 200 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 250 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 300 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 350 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 400 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 450 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 500 mg/kg 뇌 무게 이상이다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량도 역시 mg/kg 체중으로 정의될 수 있다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 뇌 무게들 및 체중들은 교정될 수 있다. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights," Ann Neurol 1978; 4:345-56. 따라서, 일정 구현예들에서, 투여량은 표 4에 나타난 바와 같이 전환될 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 또한 mg/15 cc CSF로 정의될 수 있다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 뇌 무게들 및 체중들을 기초로 하는 치료적 유효 용량은 mg/15 cc CSF로 전환될 수 있다. 예를 들어, 어른 인간들에서 CSF의 부피는 대략 150 mL이다 (Johanson CE, et al. "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease," Cerebrospinal Fluid Res. 2008 May 14;5:10). 따라서, 어른들에게 0.1 mg 내지 50 mg 단백질의 단일 용량 주사들은 어른들에서 대략 0.01 mg/15 cc CSF (0.1 mg) 내지 5.0 mg/15 cc CSF (50 mg) 용량들일 것이다.

좀 더 나아가, 특정한 개체라면 모두를 위해 특이적 투여량 요법들이 필요한 개인 및 투여하고 효소 대체 요법의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 조절되어야 하고 또한 본 명세서에서 설명된 투여량 범위들이 대표적인 것일뿐이고 청구된 발명의 범위 또는 관행을 제한하도록 의도하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.

키트들

본 발명은 좀 더 나아가 본 발명의 제형물을 포함하는 키트들 또는 기타 다른 제조 물품들을 제공하고 그의 재구성 (동결건조된 경우) 및/또는 사용을 위한 지침들을 제공한다. 키트들 또는 기타 다른 제조 물품들은 용기, IDDD, 카테터 및 기타 다른 물품들, 경막간 (interthecal) 투여 및 연관된 수술에 유용한 장치들 또는 장비를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용기들은 병들, 바이알들, 주사기들 (예로, 미리-충전된 주사기들), 앰풀들, 카트리지들, 저장조들, 또는 동결건조-용기 (lyo-jects)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질들로 만들어질 수 있다. 적합한 미리-충전된 주사기들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 구운 실리콘 코팅을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 분사된 실리콘을 가진 부터 보로실리케이트 유리 주사기들, 또는 실리콘이 없는 플라스틱 레진 주사기들을 포함한다.

전형적으로, 용기들은 제형물을 보유할 수 있고, 재구성 및/또는 사용을 위한 안내들을 표시할 수 있는 라벨이 용기 위에 연결되어 있다. 예를 들어, 라벨은 제형물이 상기에 기술된 바와 같이 단백질 농도들로 재구성되는 것을 표시할 수 있다. 좀 더 나아가 라벨은 제형물이 예를 들어 IT 투여에 유용하거나 이를 의도하는 점을 표시할 수 있다. 일정 구현예들에서, 용기는 대체 효소 (예로, Naglu 융합 단백질)를 포함하는 안정한 제형물의 단일 용량을 포함할 수 있다. 다양한 구현예들에서, 안정한 제형물의 단일 용량은 약 15 ml, 10 ml, 5.0 ml, 4.0 ml, 3.5 ml, 3.0 ml, 2.5 ml, 2.0 ml, 1.5 ml, 1.0 ml, 또는 0.5 ml 이하의 부피로 존재한다. 임의적으로, 제형물을 보유하는 용기는 제형물의 반복적 투여들 (예로, 2 내지 6회 투여들로부터)을 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 키트들 및 기타 다른 제조 물품들은 좀 더 나아가 적합한 희석제 (예로, BWFI, 식염수, 완충된 식염수)를 포함하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 희석제 및 제형물의 혼합 시, 일반적으로 재구성된 제형물에서 최종 단백질 농도는 적어도 1 mg/ml (예로, 적어도 5 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml)일 것이다. 키트들 및 기타 다른 제조 물품들은 좀 더 나아가 시판 및 사용자의 관점으로부터 바람직한, 다른 완충액들, 희석제들, 필터들, 바늘들, IDDD들, 카테터들, 주사기들 및 사용 시 지침들을 가진 포장 삽입물들을 포함하는 기타 다른 물질들을 포함할 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예들을 참조하여 보다 완벽하게 이해될 것이다. 그러나, 그들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다. 모든 인용 문헌들은 참고문헌으로 통합되어 있다.

실시예들

실시예 1. rhNaglu 및 Naglu 융합 단백질들의 발현

본 실시예는 경막내 주사들을 통해 산필리포 B형 환자들의 중추신경계 내로 직접적인 투여를 의도하는 재조합 인간 Naglu 단백질의 개발을 기술하고 있다.

산필리포 B형 (산필리포 B)은 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (Naglu)의 결핍에 의해 초래되는 상염색체 열성 장애이다. Naglu는 헤파란 설페이트 분해 경로에서 올리고다당류의 비-환원 말단으로부터 알파-N-아세틸-글루코사민을 제거하는 효소이다. Naglu를 코딩하는 인간 유전자는 염색체 17q21.1 상에 8.2 kb 길이로 나열된 6개의 엑손들을 가진다. 인간 Naglu은 신호 펩타이드를 포함하는 743개 아미노산 전구체로서 세포들에서 합성된다. Naglu의 전장의 아미노산 서열은 하기 표 5에 제공된다.

23개 아미노산 신호 펩타이드는 단백질이 세포질 세망으로 들어가면서 제거된다. 그 결과 나온 성숙한 Naglu 단백질은 헤파란 설페이트의 효소적 분해가 일어나는 리소좀으로 선별되거나 세포외 공간 내로 분비된다. 성숙한 재조합 인간 Naglu의 분자량은 당화 없이 80.2 kDa이고 당화의 첨가된 무게를 가진 대략 93.4 kDa이다. 아미노산 잔기들 1-23번이 절단된 성숙한 Naglu 단백질 서열은 하기 표 6에 제공된다.

재조합 인간 Naglu (rhNaglu)를 생성하기 위하여, 인간Naglu cDNA가 발현 벡터 내로 삽입되었고 HT1080 세포주 내로 형질전환되었다. Naglu 효소적 활성 검정법이 높은 발현 HT1080 클론들을 검색하는 데 사용되었다. Naglu 발현 HT1080 세포들에 의해 생성된 분비된 단백질은 인간 Naglu의 성숙한 형태이다. HT1080에 의해 생산된 재조합 인간 Naglu은 당화되어 있었다. rhNaglu는 합성 기질인 4-MU-N-아세틸 알파-D-글루코사민에 대해 완벽한 활성을 가진다.

재조합 Naglu, 또한 오줌, 태반 및 간 Naglu와 같은 천연의 출처들로부터 분리된 것 사이의 가장 유의한 차이는 만노스-6-포스페이트 글리칸 (M6P)의 결여이다. 재조합 Naglu에서 M6P의 결여는 CHO 및 HEK 293 세포-유래 rhNaglu의 연구에서 여러 연구자들에 의해 보고되어 왔다. HT1080 발현된 rhNaglu도 역시 M6P 글리칸이 고갈되는 것으로 확인되었다. 본 발명자들은 재조합 Naglu의 세포성 전달의 경우 M6P의 의존성을 극복하려는 노력으로 여러 가지의 융합 단백질들 및 글리칸 변형들을 개발하여 왔다 (도 1 내지 도 3).

Naglu - TAT

Naglu 및 HIV로부터 나온 단백질 전달 (transduction) 도메인의 융합 단백질은 Naglu-TAT라고 명명되었다. Naglu-TAT은 설계되고 생산되어 정제되었다. TAT 펩타이드는 세포막을 통하여 세포질 내로 단백질 전달을 용이하게 하는 것으로 확인되어왔다. 이전에 리소좀 효소 베타-글루쿠로니다제 (GUS-TAT)와 융합된 TAT 펩타이드가 MPSVII 마우스 내로 IV 주사 이후에 GUS보다 간에서 더 많은 리소좀 축적을 유도한 점이 기술되었다 (Grubb JH et al., Rejuvenation Research 13:2, 2010). 별도의 실험들은 rhNaglu와 대비하여 산필리포 B형 환자 섬유모세포들에서 Naglu-TAT의 향상된 세포성 흡수를 보여주었다 (결과 미도시). 그러나 생체내 생체배분 연구들은 IT 주사 시 Naglu-TAT는 rhNaglu와 유사한 생체배분을 보여주었고 세포성 흡수는 약간만 향상시키는 점을 가르켰다. 본 연구에서, 대부분의 단백질은 뇌의 실질로 매우 제한된 침투만을 가지고 뇌척수막에 남아있었다. 본 결과는 TAT 펩타이드-매개성 전달이 수용체 매개된 Naglu의 세포성 흡수를 대체하는 데 충분하지 않은 점을 가르켰다.

Naglu Kif

Naglu-Kif는 키푸넨신 (Kifunensine)을 배지에 첨가하는 변형된 세포 배양 공정을 사용하여 생산되었다. Naglu-Kif는 제안되고 생산되어 정제되었다. 키푸넨신의 첨가는 고차 만노스 글리칸의 생산을 증진하고 복잡한 탄수화물들의 첨가를 억제하도록 rhNaglu의 당화 경로를 변경시켰다. 키푸넨신은 골지 알파-만노시다제 I 활성을 저해하고, 이에 의해 고차 만노스 글리칸의 제거를 저해하여 복잡한 글리칸들의 결합의 저해를 유도한다. 그 결과, Naglu-Kif 는 주로 고차 만노스 글리칸들을 포함한다. 대식세포 유래한 세포주들을 사용한 세포송 흡수는 만노스 의존성 Naglu-Kif의 흡수를 검증하였다. 그러나, 생체내 실험은 야생형 관삽입된 래트들의 뇌척수액 내로 경막내 주사 시, Naglu-Kif가 rhNaglu를 능가하는 뇌의 실질 내로의 향상된 배분을 보여주는 데 실패하는 것을 가르켰다. Naglu-Kif의 만노스 수용체 매개성 흡수는 CNS에서 rhNaglu 전달을 용이하게 하지 못할 것으로 판단하였다.

Naglu - ApoE

ApoE (아포지질단백질E)의 수용체 결합 도메인이 Naglu의 세포성 흡수를 위해 저밀도 지질단백질 (LDLR)을 사용하도록 Naglu의 C-말단에 융합되었다. 본 접근법은 BBB에서 LDLR의 존재를 지지하는 연구들에 기초를 하였다 (Begley DJ et al., Current Pharmaceutical Design, 2008, 14, 1566-1580). 생체내 연구에서 예비적인 마우스는 산필리포 B형 마우스 내로 정맥내 투여된 Naglu-ApoE가 뇌 내로 전달되지 못하는 것을 가르켰다.

rhNaglu 의 IV 투여

생체내 실험들이 BBB를 통해 전달되는 rhNaglu 및 Naglu-IGFII를 조사하도록 시행되었다. 연구는 산필리포 B형 마우스에서 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 IV 투여가 뇌에서 효소라면 모두를 가져오지 못하고 조직병리학적 향상도 치료된 마우스의 뇌에서 전혀 확인되지 않는 점을 가르켰다.

Naglu - IGFII

Naglu-IGFII는 Naglu 서열의 C-말단에 인슐린-유사 성장인자 II 서열 (aa 8 내지 67번, 8-67번 IGFII)의 일부분을 융합하여 제작되었다. 전장의 IGFII 분자와 대비하여, 8-67번IGFII는 2 내지 10배 더 높은 친화도로 M6P/IGF II 수용체에 결합하는 한편 IGFI 수용체에 결합하는 그의 능력은 30배 감소되는 것으로 보고되어 있다 (Hashimoto R, JBC 1995 270(30):18013-18018).

Naglu-IGFII 분자들은 Naglu 및 8-67번IGFII 사이에 삽입되었던 링커 서열을 포함한다. 본 링커 서열은 "GGGGGAAAAGGGG"의 3개의 일렬 반복서열들로 구성되고, 각 말단 사이에 낀 두 개의 "GAP" 서열들 및 각 반복서열 사이에 있는 하나의 "GAP"서열을 가진다. 링커의 실제 서열은 하기 표 7에 제공된다. 하기 표 7은 링커 서열을 나타낸다.

재조합 Naglu-IGFII 융합을 생성하기 위하여, cDNA가 발현 벡터 pXD671, 내로 삽입되었고 인간 섬유모세포주 내에 형질전환되었다. 재조합 Naglu-IGFII 융합 단백질의 단백질 서열은 하기 표 8에 제공된다. 하기 표 8은 재조합 Naglu-IGFII 융합 단백질의 단백질 서열을 나타낸다.

Naglu 효소적 활성 검정법은 높은 발현 HT1080 클론들을 검색하는 데 사용되었다. Naglu-IGFII의 발현을 좀 더 증가시키기 위하여, 선택된 세포주는 다시 동일한 전사 유닛을 보유하는 추가적인 발현 플라스미드로 형질전환되었다. 단일 형질전환 및 이중 형질전환 세포주들 둘 다에서, 분비된 Naglu-IGFII은 전장의 성숙한 Naglu 서열 및 전장의 8-67번IGFII를 포함한다. Naglu-IGFII 융합 단백질은 동일한 합성 기질인 4-MU-N-아세틸 알파-D-글루코사마이드에 대한 효소적 활성을 보여주었다. 도 4 내지 도 6은 이중 형질전환 Naglu-IGFII 세포주를 사용하여 대표적인 곡선 생산의 전개를 도시한다. 도 4에서 표현된 본 Naglu-IGFII 세포주의 곡선 생산은 0.5 pcd (매일 백만개 세포 당 피토그램)의 Naglu-IGFII를 달성하였다.

rhNaglu 및 Naglu - IGFII 의 정제

유사한 정제 공정이 rhNaglu, Naglu-IGFII, Naglu-ApoE 및 Naglu Kif의 경우 적용되었다. Naglu-TAT의 경우에 변형된 정제 공정이 적용되었다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 단백질의 정제가 하기에 정리되어 있다.

rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 정제를 위해, 세 단계 공정이 사용되었다 (도 7). 먼저, 조정된 배지가 초여과 (UF) 장치를 사용하여 농축되었다. 다음으로 농축된 배지가 부틸 세파로스 크로마토그래피 컬럼 (부틸)에 적용된 다음, Q 세파로스 크로마토그래피 컬럼 (Q)으로 이어졌다. 정제된 단백질은 보관을 위해 PBS (11.9 mM 소듐 포스페이트, 2.7 mM 포타슘 포스페이트, 137 mM 염화나트륨, pH 7.4)의 제형물 내로 완충액 교환되었다. 정제된 rhNaglu 및 Naglu-IGFII는 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의해 평가된 바와 같이 각각 99% 및 95%의 순도를 가졌다 (결과 미도시).

rhNaglu 및 Naglu - IGFII 의 생화학적 성질

모든 Naglu 변이체들, rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-Kif 및 Naglu-ApoE은 합성 기질인 4-메틸엄벨리페릴-N-아세틸 알파-D-글루코사민에 대해 유사한 생물학적 활성을 나타내었다. 모든 변이체들은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 글리칸 분석 및 단당류 분석에 의해 결정된 바와 같이 인산화된 당화물들에 대해 음성이었다.

다음의 섹션은 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 생화학적 성질들만을 정리하고 있다 (표 3). 표 9에서 관찰될 수 있는 바와 같이, rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 생화학적 비교는 두 가지 단백질들 간 유사한 효소적 활성 및 안정도를 가르킨다. rhNaglu의 경우 차별 스캐닝 열량측정법에 의해 측정된 열적 안정도의 최적의 pH는 pH 5내지 pH 6.5, 또한 Naglu-IGFII의 경우 pH 6 내지 pH 6.5이었다. 본 결과는 리소좀들의 산성 환경에서 최적의 안정도를 나타내기 위한 리소좀 가수분해효소의 요구와 부합된다. 하기 표 9는 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 생화학적 비교를 나타낸다.

추가적으로, Naglu-IGFII은 브래드포드 단백질 검정법에 의해 결정된 바와 같이 26 mg/ml까지 성공적으로 농축되었고, 4°C에서 3개월까지 보관된 이후에도 응집 또는 활성 상실의 징후가 없었다. 5 mM 소듐 포스페이트 pH 6.5, 150 mM 염화나트륨, 0.005% 폴리솔베이트 20의 제형물 (예로, IT 투여용)도 역시 Naglu-IGFII 제형물에 대해 테스트되었다. 유사한 안정도 및 용해도가 PBS 제형물 및 IT 제형물들에서의 Naglu-IGFII 간 관찰되었다 (결과 미도시).

Naglu 의 결정 구조

rhNaglu의 개발에서 돌파구의 하나는 PERR에 의해 Naglu의 결정 구조의 판단이었다. 본 성과는 Naglu 구조에 관한 식견을 제공하였고, 단백질 안정도 및 제형물 요구사항을 예측하는 데 도움을 주었다. Naglu의 3D 구조 상의 산필리포 B형 환자 돌연변이들의 정렬은 약물 개발을 위한 식견 및 도구를 제공할 것으로 사료된다.

결정들 (도 8)은 만노시다제-I 저해제인 키푸넨신으로 처리된 배양 배지로부터 정제된 rhNaglu 단백질로부터 획득되었다. Naglu Kif 는 rhNaglu와 일치하는 단백질 서열들을, 그러나 서로 다른 당화 양식을 포함한다. Naglu Kif의 획득된 결정들은 pH=7.5에서 성장하였고 Naglu Kif의 구조는 X-선 결정학의 의해 2.4Å해상도로 분석되었다. Naglu 구조 (도 9)는 세 가지의 구별된 도메인들, N-말단 도메인 (도메인-I, aa 24-126번), 이어지는 촉매적 글루타메이트들을 포함하는 (α/β)8 배럴 도메인 (도메인 n-II, aa 127-467번) 및 모두 나선형 C-말단 도메인 (도메인-III, aa 468-743번)을 가지는 것으로 확인된다. 유사한 도메인 구조가 Naglu 의 박테리아 상동체인 또 다른 글리코사이드 가수분해효소 패밀리-89 (Glycoside Hydrolase family-89) 단백질, cpGH89의 경우에 관찰되어 왔다 (Ficko-Blean E, et al., PNAS May 6, 2008 vol. 105 no.18 6560-6565). 활성 부위는 도메인들 II 및 III 사이의 틈에 있고 촉매적 잔기들은 도메인 II 상에 위치하는 E316 및 E446로서 확인된다.

Naglu 분자들의 치밀하게 포장된 대칭형 삼량체 배열이 결정 구조에서 관찰될 수 있고 (도 10), 이는 선 다각도 광분산 (SEC-MALS) 실험들과 함께 분석적 초원심분리법 (AUC) 및 크기 배제 크로마토그래피로부터 관찰되는 자연적 연관 상태와 부합된다. 도메인 II에서 소수성 상호작용 및 수소 결합들은 단백질의 삼량체적 입체형태를 유지한다. H227는 삼중합 (trimerization) 동안 인접한 분자 R297과 농축 (stacking) 상호작용을 형성하는 것으로 보인다. 추가적으로, E302는 K301과 분자간 수소 결합 상호작용을 형성한다.

Naglu는 6개의 잠재적인 N-당화 부위들 (N261, N272, N435, N503, N526 및 N532)을 가지고 6개 부위들 모두가 결정 구조에서 당화된다. N272 및 N435 각각체 부착된 두 개의 NAG 분자들 또한 각각 N261, N503, N526 및 N532에 부착된 하나의 NAG 분자에 대한 명확한 전자 밀도들이 2.4Å 해상도로 전자 밀도 맵에서 관찰되었다. 글리칸 구조들의 나머지는 용매 노출된 당 분체들의 유연한 성질로 인해 전자 밀도 맵에서는 명확하게 볼 수 없었다.

Naglu의 구조적 정보는 Naglu의 안정도 분석 및 분자적 수준 특성분석에 도움을 준다. Naglu에는 8개의 시스테인들이 존재하고, 이들의 네 개는 두 개의 디설파이드 연결다리들 (Cys273-Cys277 및 Cys504-Cys509)을 형성한다. 나머지 네 개인 C97, C99, C136 및 C405은 정제 및 결정화 공정들 동안 환원제들이 사용되지 않았더라도 결정 구존에서 환원된 시스테인들로서 보인다. C97 및 C99은 서로 밀접하고 표면 근처에 부분적으로 노출되어 있다. 그러나 C136 및 C405는 묻혀있고 구조를 기초로 한 분자간 디설파이드 결합들을 형성하지 않는 것 같다.

현재까지 입수가능한 구조적 정보를 기초로 하여, 산필리포 B형 환자 돌연변이들의 맵핑은 소분자 샤퍼론 (chaperones)의 합리적 설계와 같은 본 질환에 대한 미래 약물 개발 가능성들을 밝혀줄 것으로 사료된다. 문헌으로부터 보고된 심한 San B 돌연변이들 (Yogalingam 2001)은 결정 구조 상에 맵핑되었다. 돌연변이들의 소수 집합들은 활성 부위, 도메인 III에서 세 개의 당화 부위들을 포함하는 루프, 및 세 가지 도메인들 간의 간격과 같은 구조적 또는 기능적 부위들과 관련될 수 있다 (도 10). 또한, 돌연변이들의 집합들이 N-말단 도메인 I 및 C-말단 나선형 번들 도메인 III에서 관찰될 수 있다. 돌연변이된 이들 잔기들의 대부분은 수소 결합 및 기타 다른 비-공유 상호작용들의 일부이고 Naglu의 구조적 안정화에 관여한다.

실시예 2. rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 시험관내 연구

Naglu 변형체들 각각에 의한 세포성 흡수의 기작은 산필리포 B형 환자 섬유모세포들의 두 가지 세포주들 GM02391 (P359L) 및 GM 01426 (E153K), 또한 정상적 인간 섬유모세포 세포주를 사용하여 연구되었다. 세포주 상의 M6P 수용체의 발현 덕분에, 섬유모세포들은 통상적으로 리소좀 효소들의 세포성 흡수의 연구를 위하여 연구자들이 사용하고 있다.

세포성 흡수 연구들은 rhNaglu 또는 Naglu-IGFII를 가지는 섬유모세포들을 37?에서 4시간 동안 배양하여 시행되었다. 세포들은 배양 이후에 세척되었고 용해되었으며, 세포 용출물들에서 Naglu 효소적 활성이 측정되었다. 섬유모세포들를 사용한 rhNaglu의 배양은 세포내에서 효소의 검출가능한 양을 유도하지 못했다. 대조적으로, 섬유모세포들를 사용한 Naglu-IGFII의 배양은 세포내에서 효소의 현저한 수준을 유도하였다 (도 11). 내재화된 Naglu-IGFII의 양은 배양에 사용되는 효소의 양이 증가하면서 포화 상태에 도달하였다. 용량 의존적 포화 흡수가 수용체 매개된 세포성 흡수에 관한 전형적인 발견이다. 또한, Naglu-IGFII의 내재화는 외인성 M6P에 의해 저해되지 않지만, 외인성 IGFII에 의해서는 완벽하게 저해되었다 (도 11). 본 결과는 섬유모세포 내로 Naglu-IGFII 내재화가 당화 비의존적 방식으로 M6P/IGFII 수용체에 의존하는 점을 가르켰다.

또한 실험은 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 리소좀들로의 이동 (trafficking)을 연구하도록 시행되었다. 산필리포 B형 환자 섬유모세포들 (GM01426)이 본 연구를 위해 사용되었다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 검출은 세포들로 단백질들의 초기 배양 이후에 세포들을 항-인간 Naglu 폴리클론 항체로 염색하여 조사되었다. LAMP-1 (리소좀 연관된 막 단백질 1)의 면역형광 염색이 리소좀들의 검출에 사용되었다. 리소좀들과 rhNaglu 및 Naglu-IGFII 의 공동-정착은 공초점 현미경관찰에 의해 영상화되었다 (도 12).

Naglu-IGFII의 강한 내재화는 세포들을 사용한 단백질의 배양 4시간 이후에 관찰되었고, 리소좀들과 Naglu-IGFII의 공동-정착이 나타났다. 반대로, rhNaglu는 동일한 시간대에서 내재화를 보여주는 데 실패했고 리소좀들과의 공동-정착도 전혀 관찰되지 않았다. 본 결과는 좀 더 나아가 Naglu-IGFII가 세포들 내로 내재화되고 정확한 세포성 구획인 리소좀들로 운반되는 증거를 제공하였다. 산필리포 B형 환자 섬유모세포들에서 내재화된 Naglu-IGFII의 반감기는 1.5일인 것으로 결정되었다 (결과 미도시).

실시예 3. 마우스 모델들에서 생체내 연구들

야생형 ( wt ) 관삽입 래트

산필리포 B형 마우스 모델과 추가하여, 비결함 동물 모델인 wt 관삽입 (cannulated) 래트가 생체내 분자 검색에 역시 사용되었다. wt 관삽입 래트들은 척수의 상부 요추 및 하부 흉추에 외과적으로 이식된 삽입관 (cannula)을 가지고, CSF로 35ul의 단일 주사가 삽입관을 통해 시행되었다. 본 동물 모델을 사용한 분자 검색을 위해 접근하는 판단기준은 Naglu 활성 검정법 또한 뇌 및 척수의 면역조직화학이다.

산필리포 B형 마우스 모델

산필리포 B형의 마우스 모델 (Naglu-/- 마우스, 산필리포 B형 마우스)은 뉴펠드 (E. Neufeld) 등에 의해 생성되었다 (Li HH, et al., PNAS 96(25):14505-14510; 1999). 마우스 Naglu 유전자의 6번 엑손이 선별 마커인 네오마이신 저항성 유전자의 삽입에 의해 파괴된다. 그 결과 나온 동형접합체 Naglu-/- 마우스는 완벽하게 Naglu 결함성이고 (도 13), 간 및 신장에서 GAG 축적 전부를 가진다. Naglu의 완전한 결함에도 불구하고, 이들 마우스는 일반적으로 건강하고, 8-12개월의 수명을 가진다. 다른 리소좀 효소들의 발현 변화들은 5개월령 주변에서 일어나고, 이들 발현들은 간에서 β-갈락토시다제, β-글루코시다제, β-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase), 및 β-헥소아미다제 (β-hexosaminidase)의 보상적 증가를 포함하고, 뇌를 제외한 간에서 β-L-이듀로니다제 (α-L-iduronidase)의 상승 또한 간 및 뇌에서 뉴라미다제 (neuraminidase)의 감소를 포함한다. 때로는 사망이 소변 정체 및 요로 감염의 결과로서 발생한다. 산필리포 B형 마우스 모델이 산필리포 B형의 병리학적 변화들을 나타내도록 문헌에서 광범위하게 연구되어 있다. Naglu-/- 마우스의 CNS 병리학과 관련된 표현형은 4.5개월령에서 과소-활동성이라고 보고되어 있지만, 다른 연령들에서는 과다 활동성도 역시 관찰되어 왔다.

Naglu-/- 마우스에서 신경-병리학적 변화들은 EM (전자현미경)에 의해 관찰된 바와 같이 뉴런들, 대식세포들 및 표피세포들에서 공포들 (vacuoles) 및 봉입체들로서 기술된다. 이들 병리학적 변화들은 33일령에 시작하고, 동물들이 나이가 들면서 점차 악화된다. 활성화된 별아교세포 및 미세교아세포들도 역시 조직-병리학적 분석에 의해 나타난다. 두 가지의 갱글리오사이드들 GM2 및 GM3의 생화학적 분석은 뇌에서 5배 및 9배 증가를 보여주었다. (GM2 및 GM3가 Naglu의 직접적 기질들이 아니기 때문에, ERT 이후 짧은 시간 동안 유의한 감소를 보여주는 것이 문제가 될 수 있고, 그들은 POC에 대한 최종 생물마커로서는 사용될 수 없다.

생화학적 분석은 Naglu 효소 활성들 및GAG 수준들의 측정에 의해 시행되었다. 조직학적 분석은 항-인간 Naglu 항체, 항-LAMP-1 항체, 항-Iba-1 항체 및 항-GFAP 항체 면역조직화학에 의해 시행되었다. 본 연구에 사용되는 항-인간 Naglu 항체는 wt 마우스에서 내인성 마우스 Naglu 또는 산필리포 B 형 마우스에서 돌연변이 Naglu와 결합하지 않는 마우스 모노클론 항체이었다. LAMP-1 면역염색은 리소좀 막 단백질, 리소좀 연관된 막 단백질-1과 결합하는 항체를 사용하였다. Iba-1 염색은 미세교아세포들 및 대식세포들에 특이적인 이온화된 칼슘-결합 어댑터 단백질과 결합하는 항체를 사용하였다. GFAP 염색은 별아교세포에 특이적인 신경교 원섬유 산성 단백질 (glial fibrillary acidic protein)과 결합하는 항체를 사용하였다.

산필리포 B형 마우스 내 경막내 ( IC ) 주사에 의해 생체내 생물학적 활성 검색

본 연구의 목적은 생체내 Naglu 효소들의 생물학적 활성을 평가하는 것이었다. 본 연구에서, 단백질들은 산필리포 B형 마우스의 뇌 내 IC 주사를 통해 투여되었다. 본 연구를 위한 산필리포 B형 마우스의 연령은 8주령이 되도록 잘 맞추었다. IC 주사 경로는 분자들의 효능을 평가하는 데 최고의 사례 시나리오를 제공하였다. Naglu 단백질들은 리소좀 축적을 감소시키도록 신경세포들 내로 흡수되는 능력에 의해 평가되었다. 면역조직화학이 생체배분을 평가하는 데 사용되었다. 또한 리소좀 축적은 LAMP-1 면역염색을 사용하여 양성 염색의 숫자 및 크기로 특성분석되었다.

IC 주사는 산필립포 B형 마우스의 두개골을 통하여 우대뇌 피질 내로 직접 주사에 의해 시행되었다. 2마이크로리터, 또는 35ug의 Naglu 단백질이 각 동물 내로 주사되었다. 동물들의 희생은 주사 이후 7일에 일어났다. 희생 시간은 동물의 희생들이 주사 이후 3, 7, 및 14일에 일어나는 파일럿 연구에서 선-결정되었다. 파일럿 연구로부터, 주사 이후 7일이 면역조직학적 연구를 위해 최적 시간인 점이 결정되었다. 뇌 절편들은 대각선으로 절단되었고 (도 14), Naglu 및 Lamp-1 면역염색이 수행되었다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 산필리포 B형 마우스에서 뉴런들 및 교아세포들 둘 다 내로 세포성 흡수가 항-인간 Naglu 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 나타났다 (도 14 내지 도 16). 세포성 흡수에 관하여 rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 산필리포 B형 마우스 간 유의한 차이가 전혀 없었다. 추가적으로, rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 마우스 둘 다의 뇌 조직의 LAMP-1 면역염색은 리소좀 축적의 유의한 감소 수준을 가르키고 있다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 그룹들 둘 다에서 리소좀 축적 감소의 수준은 정상 wt 마우스의 수준과 거의 동일하였다.

리소좀 축적의 감소는IC 주사 이후에 Naglu-TAT, Naglu-Kif 및 PerT-Naglu 테스트된 산필리포 B형 마우스에서도 역시 관찰되었다 (결과 미도시). 본 연구는 Naglu의 변형체들 모두의 생체내 생물학적 활성을 보여주었다.

별도의 연구에서, Naglu-결함성 마우스는 운반체 또는 임의적으로 PBS에 넣은 재조합 Naglu-IgF-II 융합 단백질 제작물 (Naglu)의 매주 1, 2 또는 3번 용량들이 IT 투여되었다. 미치료된 야생형 마우스 그룹이 미치료 야생형 대조군으로서 제공되었고 Naglu 없이 운반체가 투여되었다. 마우스는 최종 주사에 이어서24시간에 희생되었고 면역조직화학 (IHC) 및 조직병리학적 분석을 위해 조직 준비가 이어졌다.

Naglu-결함성 마우스의 뇌 조직들로 Naglu의 배분은 재조합 Naglu의 IT 투여에 이어서 명백하였다. 도 17A에 도시된 바와 같이, Naglu-결함성 마우스로 재조합 Naglu의 IT-투여는 운반체를 IT-투여한 Naglu-결함성 마우스와 대비하여 백색질에서 세포성 공포화의 광범위한 감소를 가져왔다. 유사하게, 또한 도 17B에 도시된 바와 같이 형태측정 분석은 미치료된 Naglu-결함성 마우스와 대비하여 치료된 마우스의 백색질 조직들에서 LAMP1 면역염색의 현저한 감소를 보여주었고, 질환 병리학에서 햐상을 반영하였다.

도 18A-B에서 도시된 바와 같이, 평가된 뇌 조직의 각 영역에서 (피질, 미상엽 및 조가비핵 (CP), 시상 (TH), 소뇌 (CBL) 및 백색질 (WM)) LAMP-양성 영역은 미치료된 Naglu-결함성 마우스와 대비하여 Naglu-치료된 마우스에서 감소되었고, 야생형 마우스의 LAMP-양성 영역과 근접하였다. 상세하게, 분석된 뇌 조직의 각 영역에서 LAMP-양성 영역들이 Naglu 의 단일 용량과 대비하여 (도 18A) 두 번 또는 세 번 용량의 IT 투여 (도 18B)에 이어서 좀 더 감소되었던 점이 주목가능하다.

이들 결과들도 역시 IT-투여된 Naglu가 Naglu-결함성 마우스 모델에서 산필립포 증후군 B형과 같은 리소좀 축적병들의 진행을 변경시킬 수 있는 점을 입증하고 좀 더 나아가 산필립포 증후군 B형과 같은 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들을 치료하는 Naglu와 같은 IT-투여된 효소들의 능력을 입증하고 있다.

야생형 ( wt ) 관삽입 래트 내 경막내 ( IT ) 주사에 의한 분자 검색

본 연구는 약물 투여를 위한 포트-매개 접근법을 직접적으로 모방하고 있다.

Naglu 단백질은 뇌의 실질 내로 생체배분을 결정하도록 wt 관삽입 래트들 내 IT 주사들을 통해 투여되었다.

이들 동물들에서 삽입관은 척수의 상부요추 및 하부 흉부에 두었다 (도 19). 동물들은 35ul, 또는 385 ug의 rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII 및 PerT-Naglu로 삽입관을 통해 주사되었다 (용해도 제한으로 인해, Naglu Kif는 나머지 Naglu 보다 10배 이하인 단지 38.5 ug만 주사되었다). 희생들은 주사들 이후 4시간 및 24시간에 시행되었다.

뇌 및 척수 조직들이 수집되었고 Naglu 활성 검정법에 의해 측정되었다. 치료된 동물들의 뇌에서, Naglu-TAT 및 Naglu-IGFII 치료된 동물들은 rhNaglu 및 다른 모든 Naglu 변형체들 치료된 동물들보다 높은 활성을 나타냈다 (도 20). 일반적인 경향으로서, Naglu 활성은 모든 치료된 동물들의 경우 뇌에서보다 척수에서 유의하게 더 높았다 (결과 미도시). 본 현상은 단백질들이 IT 주사에 가까운 부위에서 더 많이 흡수되는 점을 가르킬 수 있다.

면역조직화학 분석은 IT 주사들 이후 24시간에 Naglu-IGFII 치료된 그룹의 생체배분이 뇌에서 다른 모든 Naglu 변이체들 치료된 그룹보다 더욱 광범위한 점을 가르켰다 (도 21 및 도 22). rhNaglu 치료된 동물들에서, 단백질은 뇌의 척수막에서만 관찰되었다. 척수 절편에서는, IHC가 회색질의 뉴런들에서 rhNaglu의 세포성 흡수를 가르켰지만, 척수의 뉴런들에서 Naglu-IGFII 흡수보다 훨씬 더 적은 정도이었다 (결과 미도시).

Naglu-TAT IT 주사된 그룹에서, 최고의 Naglu 활성이 생화학적 분석에 의해 뇌 조직에서 관찰되었더라도, IHC는 뇌척수막 상에 남아있는 것이 아닌 뇌의 실질 내로 Naglu-TAT침투를 가르키는 데는 실패하였다. Naglu-IGFII이외에 기타 다른 Naglu 변이체들 모두는 뇌척수막을 초과하는 생체배분을 보여주는 데 실패하였고, 이는 IT 주사 이후 뇌에서 Naglu의 세포성 흡수를 위해 M6P/IGFII 수용체들 의존성의 강한 증거이다. 본 연구는 산필리포 B형에 대한 약물 개발을 위한 선도적 분자로서 Naglu-IGFII를 지적하였다.

실시예 4. Naglu-IGFII를 사용한 개념 연구의 증거

실험적 설계

개념 연구의 증거는 산필리포 B형 마우스에서 Naglu-IGFII의 IT 투여 이후에 생체배분 및 리소좀 축적의 역전 둘 다를 보여주도록 설계되었다. 본 연구를 위해, 8주령의 산필리포 B형 마우스의 세 가지 그룹들이 Naglu-IGFII의 IT 주사로 치료되었다. 각 IT 주사는 Naglu-IGFII의 10ul 부피 또는 260 ug으로 구성되었다. 세 가지의 치료된 그룹들, 1x 주사, 2x 주사, 및 3x 주사 그룹이 있었다. 1x 주사 그룹의 경우, 단백질의 단일 용량이 0일에 투여되었다. 주사 이후 24시간에 동물들은 희생되었다. 2x 주사 그룹의 경우, 두 번의 IT 주사들이 0일 및 7일에 투여되었고, 마지막 주사 이후 24시간에 동물들은 희생되었다. 3x 주사 그룹의 경우, 세 번의 IT 주사들이 0일, 7일 및 14일에 투여되었고, 마지막 주사 이후 24시간에 동물들은 희생되었다. 운반체 처리된 마우스의 세 가지 그룹들도 역시 포함되었다. 운반체 대조군 그룹들의 경우, 산필리포 B형 마우스는 치료된 그룹들과 동일한 시간 간격으로 주사되었고 치료된 그룹과 동일한 방식으로 희생되었다.

생화학적 및 조직학적 분석들 둘 다가 본 연구의 성과를 평가하는 데 적용되었다. 생화학적 분석은 조직에서 효소들의 양을 측정하는 Naglu 활성 검정법 및 리소좀 축적의 감소를 평가하는 전체 GAG 거멍법을 포함한다. 간 및 뇌는 생화학적 분석들을 위한 두 가지의 조직이었다 (도 23 및 도 24). 조직학적 분석들은 형태학적 평가를 위한 조직들의 H&E 염색 (결과 미도시), 또한 항-인간 Naglu 항체, LAMP, Iba 및 GFAP로의 면역조직화학적 염색을 포함한다 (Iba 및 GFAP 염색 결과는 미도시).

본 연구에 사용되는 항-인간 Naglu 항체는 wt 마우스에서 내인성 마우스 Naglu 또는 산필리포 B 형 마우스에서 돌연변이 Naglu와 결합하지 않는 마우스 모노클론 항체이었다. LAMP-1 면역염색은 리소좀 막 단백질, 리소좀 연관된 막 단백질-1과 결합하는 항체를 사용하였다. Iba-1 염색은 미세교아세포들 및 대식세포들에 특이적인 이온화된 칼슘-결합 어댑터 단백질과 결합하는 항체를 사용하였다. GFAP 염색은 별아교세포에 특이적인 신경교 원섬유 산성 단백질과 결합하는 항체를 사용하였다.

Naglu 면역형광의 대표적인 현미경적 도면들은 도 25에 나타낸다. 뇌의 대표적인 영역들은 도 26에 나타낸다. Naglu-IGFII가 뇌척수막에 가까운 대뇌 피질 내에 검출되더라도, 미상엽핵, 시상, 및 백색질과 같은 피질하 부위에서 발견되지 않았다 (결과 미도시). 동일한 피질하 영역들의 LAMP-1, Iba-1 및 GFAP 면역염색이 리소좀 축적의 역전을 보여주기 때문에, 깊은 뇌 영역들에서 Naglu의 음성 면역염색은 아마도 Naglu 면역형광의 민감도로 인한 것이라고 여겨졌다.

Lamp-1 면역염색의 대표적인 현미경적 도면들은 도27 내지 도 31에 나타낸다. 단백질 분포 및 효능의 정도를 기술하기 위하여, 미상엽핵, 시상 및 백색질과 같은 대뇌 피질 및 피질하 부위들 또한 소뇌 피질이 면역조직학적 분석을 위해 선택되었다. Iba-1 및 GFAP 면역염색으로부터 나온 결과 (결과 미도시)는 LAMP-1 면역염색에서 관찰되는 것이 뉴런들에 추가하여 산필리포 B형 마우스 모델 (Li 2002, Ohmi 2002)에서 영향받는 것으로 보고된 두 가지 세포 유형들인 미세교아세포들 및 별아교세포들의 변화들의 조합된 효과인 점을 가르켰다. 기술적인 한계들로 인해, LAMP-1 면역염색은 뉴런들에서 리소좀 축적을 드러낼 수 없었다. 뉴런들에서 공포들 및 봉입들과 같은 리소좀 축적을 가장 잘 관찰하기 위하여, 전자현미경법이 보통 사용된다 (EM은 현 연구에는 포함되지 않았다).

세포 유형들의 동정이 뉴런들 및 교아세포들에 제한되는 점을 이해할 것이다. 전형적으로 뉴런들은 진하게 염색된 하나 이상의 핵인을 포함하는 비교적 크고 창백한 핵, 및 빈번하게 검출가능한 세포질에 의해 확인되었다. 일반적으로 교아세포들은 작고 진한 핵 및 불명확한 세포질에 의해 확인되었다. 별아교세포들, 미세교아세포들, 뇌실막 세포들 및 희소돌기교아세포들과 같은 교아세포들의 서로 다른 유형들 간 구별은 전형적으로 세포 유형 특이적 마커들을 가진 염색에 의해 최고로 잘 시행된다.

LAMP-1 면역염색에 의해 나타나는 리소좀 축적의 감소에 추가하여, Iba-1 면역염색은 Naglu-IGFII 의 IT 주사들 이후에 교아세포들에서 세포 크기 및 공정들 (processes)의 수의 감소를 가르켰고, 또한 GFAP 면역염색은 별아교세포들, 대뇌 피질, 미상엽핵, 시강, 백색질 및 소뇌에서 세포 크기 및 공정들의 길이/수의 감소를 가르켰다. (결과 미도시). 또한 면역조직화학의 경우 조사된 것과 동일한 영역들로부터 나온 뇌 조직의 H&E 염색 (헤마톡실린 및 에오신)에 의한 조직병리학적 분석은 Naglu-IGFII의 3x IT 주사 이후 교아세포들에서 공포들의 감소를 보여주었다. 상기 언급된 모든 결과는 Naglu-IGFII IT 주사들의 용량-관련 효과도 역시 제시하였다.

Naglu-IGFII 의 IT 주사 이후에 산필리포 B형 마우스의 생화학적 분석들은 뇌 및 간에서 Naglu 활성을 검출하였다. Naglu-IGFII 의 효능은 뇌 및 간에서 전체 GAG 감소에 의해 나타났다. 면역조직화학은 뇌의 실질에서 Naglu-IGFII의 생체배분을 보여주었다. LAMP-1, Iba-1, GFAP의 면역염색 및 H&E 염색에 의한 조직병리학적 분석은 뇌의 대뇌 피질 영역뿐만 아니라 피질하 영역들, 백색질 및 뇌의 소뇌 피질에서 리소좀 축적의 감소, 미세교아세포들 및 별아교세포들에 의한 크기 및 공정의 감소를 나타냈다.

결론들

다른 것보다, 융합 단백질인 Naglu-IGFII는 Naglu의 원래 기질과 유사한 구조를 가지는 기질에 대한 시험관내 효소적 활성을 나타냈다. 시험관내 세포성 흡수 연구는 분자가 M6P 당화에 비의존적인 방식으로 M6P/IGFII 수용체에 의해 세포들로 흡수되는 점을 보여주었다. 내재화된 Naglu-IGFII는 리소좀들과 공동-정착하는 것으로 관찰되었다. Naglu-IGFII는 산필리포 B형 마우스 내로 IC 주사 이후에 생체내에서 리소좀 축적을 감소시키는 것으로 관찰되었다. rhNaglu 및 기타 다른 Naglu 융합들 및 변형들과 비교하여, Naglu-IGFII는 IT 투여 이후에 wt 관삽입된 래트의 뇌 실질 내로 침투하는 데 그들을 모두 능가하였다. 마지막으로, 산필리포 B형 마우스 내로 Naglu-IGFII 융합의 IT 주사는 뇌척수막을 넘어 광범위한 배분 또한 대뇌 피질 뿐만 아니라 피질하 부위들에서 리소좀 축적의 관찰된 역전을 잘 보여주었다. 종합하면, 이들 결과는 Naglu-IGFII가 산필리포 B형 질환의 치료를 위한 후보 약물인 점을 가르킨다.

실시예 5. Naglu-IGFII의 독성, 약물역학 (PK) 및 조직 생체배분 연구들

마우스에서 개념 연구들의 증거

Naglu (-/-) 마우스의 세 가지 그룹들 (n=3)은 단일 IT 요추 일시 주사로서 주어진 260 ug의 Naglu-IGFII를 포함하는 1uL로 주사되었다. 260 ug 용량은 520 mg/kg 노 무게 용량으로 변환된다 (마우스 뇌 = 0.0005 kg). 한 그룹은 0일에 주사되었고 주사 이후 24시간에 희생되었다. 두 번째 그룹은 0및 7일에 주사되었고 마지막 주사 이후 24시간에 희생되었다. 세 번째 그룹은 0, 7, 및 17일에 주사되었고 마지막 주사 이후 24시간에 희생되었다. 각 Naglu-IGFII-투여 그룹은 연령/질환 중등도를 조절하도록 운반체 대조군 그룹과 쌍이 되었다.

뇌 및 간에서 Naglu 효소 활성은 세 가지의 Naglu-IGFII-투여 그룹들의 경우 유사하였다. 간 및 뇌에서 rhNaglu 효소 활성을 비교하면, 간에서 10배 이상의 rhNaglu 효소 활성이 확인되었다. rhNAGLU 효소 활성의 수준들이 래트들 및 어린 원숭이들에서의 중추적 독성 연구들에서 1-, 3-, 및 6-개월 투여 이후 뇌 및 간에서 비교가능하기 때문에, Naglu (-/-) 마우스에게 주어진 rhNaglu 용량의 일정 부분이 IT로 전달되지 않았을 수 있고 오히려 전신적으로 전달된 것으로 파악된다. 그럼에도 불구하고, 뇌에서 GAG 수준은 3번 IT 주사들 이후 통계적으로-유의한 감소 (p < 0.05)를 나타냈다. 전체 GAG 수준의 용량-관련 경향은 간들에서 관찰되고, 이는 2번 또는 3번 용량들을 받은 그룹들에서 통계적으로 유의하였다 (p < 0.05).

IT 주사 이후 Naglu-IGFII의 생체배분은 뇌척수막을 넘어 뇌의 실질 내에서 잘 관찰되었지만, 깊은 피질하 부위들은 항-Naglu 항체 면역염색에 대해 음성이었다. 리소좀-연관 막 단백질 (LAMP) 면역염색에 의해 리소좀 활성의 감소가 2 또는 3번 용량들만을 준 그룹들에서 관찰되었다. 리소좀 활성 감소의 영역들로는 대뇌 피질 및 미상엽핵, 시상, 및 백색질의 깊은 피질하 부위들을 포함하였다. 따라서, Naglu-IGFII-투여된 동물들에서 다양한 면역염색 변수들의 감소는 NAGLU의 치료적 수준들이 항-NAGLU 면역염색의 부재에도 불구하고 존재할 수 있는 점을 제시하였다. 약화된 염증 반응은 별아교세포들의 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP) 면역염색 또한 미세교아세포/대식세포들의 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 (Iba) 염색의 감소에 의해 2 또는 3번 용량만이 주어진 그룹들에서 입증되었다. 분석의 영역들은 대뇌 피질 및 미상엽핵, 시상, 및 백색질의 깊은 피질하 부위들을 포함하였다.

래트에서 연구들

S-D 래트는 IT-투여된 Naglu-IGFII의 독성학적 평가를 위한 설치류 종으로서 선택되었다. 그 결과, 16마리 래트들 (성별 당 8마리)이 재조합 Naglu-IGFII 을 최대 실행가능한 용량 (MFD), 및 대략 1/4 및 1/2 MFD (각각 저- 및 중간-용량 수준들)으로 전부 8번 용량을 4일마다 투여받았다.

S-D 래트들에서 단일-용량 PK/생체배분 연구가 수컷 및 암컷 동물들에게 IT-L 투여를 이어서 CSF 및 혈청 농도, 또는 조직 배분을 각각 결정하도록 수행되었다.

독성학 연구들은 수컷 및 암컷 동물들에서 독성학 및 안전성 약물학 (신경학적, 호흡, 및 심혈관 안전성) 관점으로부터 Naglu-IGFII의 IT-L 투여를 평가하도록 설계된다. 이들 연구들에서 독성학적 평가는 임상적 관찰들, 체중들, 음식 소비, 임상적 병리학, 적정한 안전성 약물학 접근법들 (신체 검사 또는 심전도에 의함), 총 조직 및 현미경적 평가를 포함한다. 제한된 수의 CSF 및 혈청 시료들이 채취되었고 Naglu-IGFII 및 테스트 항목에 대한 항체들에 대해 분석되었다. Naglu-IGFII 조직 배분 및 세포하 정착은 효소 활성 검정법 및 면역조직화학에 의해 각각 정량된다. 추가적으로, 선택된 연구들은 주목된 유의한 독성학적 결과들이라면 모두의 전환 능력을 획득하는 회복 기간 또는 가능성있는 지연된 출현 (appearance)을 포함한다.

원숭이들에서 연구들

사이노몰 원숭이는 인간들과 유전적 및 해부학적 유사성으로 인해 IT-투여된 Naglu-IGFII의 독성학적 평가들을 위한 비설치류 종으로서 선택되었고 따라서 더욱 적절한 종이라고 생각된다. 산필리포 B형 임상시험들을 위한 계획된 환자 집단은 소아 환자가 주어졌기 때문에, Naglu-IGFII의 경막내 약물 전달 장치 (IDDD) 투여를 특징으로 하는 어린 사이노몰 원숭이들에서 만성적 6개월 동성학 연구가 수행된다. 어린 사이노몰 원숭이들은 일반적으로 연구 시작시 1년 이하의 연령이고 (대략 7-9개월) 무게는 연구 시작시 900 g 내지 1,500 g이다. 1개월 반복-용량 어린 사이노몰 원숭이 독성 연구로부터 획득된 데이타는 용량 수준 선택 및 6개월 어린 원숭이 연구의 설계를 안내한다. 반복-용량 독성한 연구들은 1 내지 6개월의 기간 동안 기대된 임상적 경로 (IT-L 볼루스) 및 투여의 빈도 (격주; EOW)를 모방하도록 설계된다.

상기에 기술된 바와 같이, 독성학 연구들은 수컷 및 암컷 동물들에서 독성학 및 안전성 약물학 (신경학적, 호흡, 및 심혈관 안전성) 관점으로부터 Naglu-IGFII의 IT-L 투여를 평가하도록 설계된다. 이들 연구들에서 독성학적 평가는 임상적 관찰들, 체중들, 음식 소비, 임상적 병리학, 적정한 안전성 약물학 접근법들 (신체 검사 또는 심전도에 의함), 총 조직 및 현미경적 평가를 포함한다. 제한된 수의 CSF 및 혈청 시료들이 채취되었고 Naglu-IGFII 및 테스트 항목에 대한 항체들에 대해 분석되었다. Naglu-IGFII 조직 배분 및 세포하 정착은 효소 활성 검정법 및 면역조직화학에 의해 각각 정량된다. 추가적으로, 선택된 연구들은 주목된 유의한 독성학적 결과들이라면 모두의 전환 능력을 획득하는 회복 기간 또는 가능성있는 지연된 출현을 포함한다.

실시예 6. Naglu-IGFII 의 EOW 경막내 투여

본 실시예는 Naglu -/- 마우스 모델에서 IT-요추 투여EOW의 실행가능성을 6번 주사들 동안 (3개월 연구) 결정하도록 설계되었다. 본 투여 요법은 매주 투여와 대비하여 임상적으로 더욱 적절할 수 있다.

다음의 실험적 설계를 따라서 8주령의 Naglu -/- 수컷 및 암컷 마우스가 연구되었다: 하기 표 10는 Naglu-IGFI의 EOW IT 전달을 위한 실험적 설계를 나타낸다.

간, 뇌 및 혈청 상의 Naglu 활성 검정, 혈청 상의 항-Naglu 항체 검정, 또한 간 및 뇌 상의 BCA 검정을 포함하는 생리학적 연구들이 수행되었다. 뇌, 척수 및 간 상의 Naglu IHC 또한 뇌 및 척수 상의 Lamp 염색을 포함하는 조직학적 연구들이 수행되었다.

뇌, 척수 및 간이 수집되었고 10% NBF로 고정되었다. 5 um 파라핀 절편들이 조직학적 염색을 위해 준비되었다. Naglu의 면역조직화학적 (IHC) 염색이 주사된 단백질의 세포성 흡수를 검출하는 데 사용되었다. H&E 염색이 형태학적 변화들을 관찰하는 데 사용되었다. 리소좀 활성 및 질환 상태의 표시인자인 LAMP, 활성화된 별아교세포들 및 미세교아세포들에 대한 두 가지 CNS 병리학적 마커들인 GFAP 및 Iba-1는 조직병리학적 개선 평가에 사용되었다.

운반체 및 Naglu-IGFII 치료된 마우스의 뇌, 척수 및 간의 Naglu 면역염색은 뇌 및 척수에서 주사된 Naglu가 IHC에 의해서만 뇌척수막 (M)에서 검출되고, Naglu 양성 염색이 기타 다른 부위들에서는 전혀 검출되지 않는 점을 보여주었다 (도 32). 간에서, 시누노이드 세포들 (S)은 Naglu 양성이었고 Naglu 흡수가 간세포들 (H)에서는 전혀 확인되지 않았다.

운반체 및 Naglu-IGFII 치료된 마우스의 뇌, 척수 및 간의 LAMP 면역염색 및 H & E 염색은 운반체 동물들과 비교하여, LAMP 염색이 Naglu로 치료된 간들 및 척수들 둘 다에서 전체적으로 감소되는 점을 보여주었다. H&E 염색은 간세포들에서의 세포성 공포화가 운반체 처리된 동물들과 비교하여 치료된 그룹에서 명백하게 감소되는 점을 나타냈다 (도 33 및 도 34).

운반체 및 Naglu-IGFII 치료된 마우스의 뇌의 H & E 염색은 3개월 동안 격주로 6번 Naglu-IGFII의 IT 주사 이후에 뇌에서 형태적 향상을 보여주었다. 치료된 뇌에서는, 모든 조사된 부위들에서 세포성 공포화 (화살표)가 운반체 그룹과 비교하여 감소되었다 (도 35)

3개월 동안 6번 Naglu-IGFII IT 주사들 이후에, 다양한 뇌 부위들에서 LAMP IHC는 운반체 처리된 그룹과 비교하여, SFB 마우스에게 Naglu IT 투여가 LAMP 면역염색에 의해 드러나는 모든 조사된 부위들에서 리소좀 활성의 감소를 유도하는 점을 보여주었다 (도 35). 본 감소는 LAMP 양성 세포들의 수의 감소, 더 작은 세포 크기 및 더 옅은 염색을 특징으로 한다. 현저한 감소가 다른 뇌 부위들과 비교하여 척수에 가까운 뇌의 미상엽핵 부분에 위치하는 소뇌 및 뇌줄기에서 확인되었다. 또한 명백한 감소가 백색질, 해마 및 시상을 포함하는 깊은 뇌 부위들에서도 확인되었다.

3개월 동안 6번 Naglu-IGFII IT 주사들 이후에, 다양한 뇌 부위들에서 Iba IHC는 미세교아세포들의 활성화를 드러냈다 (도 36). 운반체 처리된 그룹과 비교하여, 양성 세포들의 수 및 염색 강도에서 감소는 Naglu 치료된 그룹에서 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, 양성 미세교아세포들의 세포 형태는 모든 조사된 뇌 부위들에서 운반체 그룹에서 크고 공포화된 것과 대비하여 (삽입) 감소된 세포 크기를 가지면서 변화하였다.

3개월 동안 6번 Naglu-IGFII IT 주사들 이후에, 다양한 뇌 부위들에서 GFAP IHC는 별아교세포 활성화를 드러냈다 (도 37). 운반체 처리된 그룹과 비교하여, GFAP 양성 염색은 소뇌 및 뇌줄기에서 감소되었고, 다른 조사된 부위들에서는 약간 감소되었다.

세포성 흡수에 관하여, 이들 데이타는 뇌 및 척수에서 Naglu가 3개월 동안 격주로 6번 Naglu-IGFII IT 주사 이후에 뇌척수막 세포들에서 검출되었다. Naglu는 뇌 및 척수의 기타 다른 부위들에서는 IHC에 의해 미검출되었다. 간에서, Naglu 양성 염색이 시누소이드 세포들에서 발견되었다.

뇌 및 척수에서 3개월 동안 격주로 6번 Naglu-IGFII의 IT 주사 이후에, 조직병리학적 향상이 주사된 Naglu가 IHC에 의해 미검출 가능하더라도 뇌 및 척수를 전체를 통하여 관찰되었다. H&E 염색은 모든 조사된 뇌 부위들에서 세포성 공포화 감소를 보여주었다. LAMP 염색은 처리된 척수들 전체를 통하여 또한 깊은 뇌 영역들인 백색질, 해마 및시강을 포함하는 모든 평가된 조직 부위들에서, Naglu-IGFII 치료된 그룹에서 소뇌 및 뇌줄기에서 현저한 감소를 보이면서 감소되었다. 별아교세포들의 경우 GFAP 염색의 감소된 염색 양상은 LAMP 염색과 일치한 한편 LAMP와 같이 극적으로 감소되지는 않았다. Iba-1 염색은 모든 조사된 뇌 부위들에서 미세교아세포들의 세포 크기의 감소를 나타냈다. 간에서, H&E 염색은 Naglu 치료된 그룹에서 LAMP 염색에서 현저한 감소와 함께 세포성 공포화 감소를 보여주었다.

실시예 7. 산필리포 B형 환자들의 치료

예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 산필리포 증후군 B형 (산필리포 B형) 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 산필리포 B형을 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 Naglu-IGFII의 전부 40주 동안 격주로 (EOW) 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 38 내지 도 41에 나타나있다.

20명까지의 환자들이 참가할 것이다:

집단1: 5명 환자들 (최저 용량)

집단 2: 5 명 환자들 (중간 용량)

집단3: 5 명 환자들 (최고 용량)

5명 환자들이 무작위로 미치료될 것이다.

환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다.

SanA를 가진 환자들에서 40주 동안 IT 주사에 의해 투여된 Naglu의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일, 반복-용량 약물역학에 미치는 Naglu-IGFII의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.

본 명세서에서 기술된 소정의 화합물들, 조성물들 및 방법들이 소정의 구현예들에 따른 특이성을 가지고 기술되어 왔으며, 다음의 실시예들은 본 발명의 화합물을 단지 기술하기 위해서만 제공되고 이들을 제한하려고 의도하지 않는다.

여기에서 사용되는 바, 용어 표현들 "하나 (a)" 및 "하나 (an)"는 본 명세서에서, 및 청구항들에서 복수의 형태들을 포함하도록 분명하게 반대로 가르키지 않는 경우라면 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 간 "또는"을 포함하는 청구항들 또는 기술내용들은, 하나, 하나 이상, 또는 모두가 존재하거나 적용되는 경우, 또는 달리 정반대로 표시되지 않는다면 주어진 산물 또는 방법에 적절한 경우, 또는 달리 문맥으로부터 명백한 경우라면 만족되는 것으로 고려된다. 본 발명은 정확히 그룹의 한 구성원이 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들을 포함한다. 또한 본 발명은 그룹의 하나 이상 또는 구성원 전부가 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들도 포함한다. 또한, 본 발명은 달리 표시되지 않는 경우 또는 반박이나 불일치가 나올 수 있는 기술분야의 당업자에게 자명한 경우라면 나열된 청구항들로부터 나온 하나 이상의 제한들, 요소들, 조항들, 기술적 용어들 등이 동일한 기초 청구항 (또는 적절한 다른 청구항)에 의존하는 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형들, 조합들, 및 순열들을 포괄하는 것으로 이해된다. 요소들이 리스트로서 표현되는 곳에서는 (예로, 마쿠쉬 (Markush) 그룹 또는 유사한 형식), 요소들의 각 소그룹도 역시 기재되고 또한 요소(들)이라면 모두가 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 관점은 특정한 요소들, 특징들 등을 포함하는 것으로서 언급되는 곳에서는, 본 발명의 소정의 구현예들 또는 본 발명의 관점들은 이러한 요소들, 특징들 등으로 구성되거나 이들로 필수적으로 구성되는 것으로 이해되어야 한다. 간략하게 기술하기 위해, 이들 구현예들은 모든 경우에 본 명세서에서 매우 많은 단어들로 상세하게 설명되지 않았다. 또한 본 발명의 구현예 또는 관점이라면 모두는 상세한 배제가 본 명세서에 재인용되는지 여부와는 상관없이, 청구항들로부터 명확하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본 명세서에서 참조된 출판물들, 웹사이트들, 및 기타 다른 참고물들은 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다.

SEQUENCE LISTING <110> Shire Human Genetic Therapies, Inc. <120> TREATMENT OF SANFILIPPO SYNDROME TYPE B <130> 2006685-0030 <140> PCT/US2011/041928 <141> 2011-06-25 <150> 61/358,857 <151> 2010-06-25 <150> 61/360,786 <151> 2010-07-01 <150> 61/387,862 <151> 2010-09-29 <150> 61/435,710 <151> 2011-01-24 <150> 61/442,115 <151> 2011-02-11 <150> 61/476,210 <151> 2011-04-15 <150> 61/495,268 <151> 2011-06-09 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 720 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe Ser Val Ser Val Glu Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe Cys Gly Cys His Val Ala Trp 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly 85 90 95 Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val 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Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr 210 215 220 Leu Gln His Arg Val Leu Asp Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro 225 230 235 240 Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val 245 250 255 Phe Pro Gln Val Asn Val Thr Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn 260 265 270 Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe 275 280 285 Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly 290 295 300 Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro 305 310 315 320 Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu 325 330 335 Ala Met Thr Ala Val Asp Thr Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp 340 345 350 Leu Phe Gln His Gln Pro Gln Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala 355 360 365 Val Leu Gly Ala Val Pro Arg Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe 370 375 380 Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln 385 390 395 400 Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu 405 410 415 Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu 420 425 430 Phe Pro Asn Ser Thr Met Val Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile 435 440 445 Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg 450 455 460 Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala 465 470 475 480 Arg Arg Tyr Gly Val Ser His Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu 485 490 495 Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His 500 505 510 Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser 515 520 525 Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu 530 535 540 Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu 545 550 555 560 Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr 565 570 575 Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu 580 585 590 Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu 595 600 605 Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln 610 615 620 Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln 625 630 635 640 Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu 645 650 655 Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr 660 665 670 Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln 675 680 685 Gly Ile Pro Phe Gln Gln His Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu 690 695 700 Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg 705 710 715 720 Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro 725 730 735 Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp 740 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 5 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Pro 50 <210> 6 <211> 837 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence of Recombinant Naglu-IGFII Fusion Protein <400> 6 Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe Ser Val Ser Val Glu Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe Cys Gly Cys His Val Ala Trp 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly 85 90 95 Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val 100 105 110 Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu 115 120 125 Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala 130 135 140 Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly 145 150 155 160 Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu 165 170 175 Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro 180 185 190 Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr Leu Gln His Arg Val Leu Asp 195 200 205 Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly 210 215 220 His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val Phe Pro Gln Val Asn Val Thr 225 230 235 240 Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe 245 250 255 Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe 260 265 270 Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala 275 280 285 Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu 290 295 300 Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu Ala Met Thr Ala Val Asp Thr 305 310 315 320 Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp Leu Phe Gln His Gln Pro Gln 325 330 335 Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala Val Leu Gly Ala Val Pro Arg 340 345 350 Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr 355 360 365 Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu 370 375 380 His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val 385 390 395 400 Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu Phe Pro Asn Ser Thr Met Val 405 410 415 Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr 420 425 430 Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu 435 440 445 Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala Arg Arg Tyr Gly Val Ser His 450 455 460 Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn 465 470 475 480 Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg 485 490 495 Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp 500 505 510 Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala 515 520 525 Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala 530 535 540 Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr 545 550 555 560 Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala 565 570 575 Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg 580 585 590 Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser 595 600 605 Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr 610 615 620 Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu 625 630 635 640 Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu 645 650 655 Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln Gly Ile Pro Phe Gln Gln His 660 665 670 Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser 675 680 685 Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala 690 695 700 Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp 705 710 715 720 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly 725 730 735 Gly Gly Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly 740 745 750 Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala 755 760 765 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val 770 775 780 Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg 785 790 795 800 Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys 805 810 815 Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr 820 825 830 Pro Ala Lys Ser Glu 835 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 7 Gly Gly Gly Gly Gly Pro 1 5

Claims (57)

1. 재조합 알파-N-아세틸글루코사미니다제 (Naglu) 단백질을 치료가 필요한 개체에게 경막내 투여하는 단계를 포함하는 산필리포 증후군 B형 (San B)을 치료하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 Naglu 단백질은 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체를 포함하는 융합 단백질인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
4. 제 2항에 있어서, 상기 Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
5. 제 2항에 있어서, 상기 Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
6. 제 2항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 표적 분체는 IGF-II 분체인, 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 70% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
9. 제 6항에 있어서, 상기 IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
10. 제 6항에 있어서, 상기 IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)의 8 내지 67번 잔기들을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
11. 제 2항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기에 더하여 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체 사이에 링커를 포함하는, 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 링커는 GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4)의 하나 이상의 아미노산 서열들을 포함하는, 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 GGGGGAAAAGGGG (서열번호 4)의 아미노산 서열은 일렬 반복서열들로 존재하는, 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 링커는 상기에 더하여 하나 이상의 GAP 서열들을 포함하는, 방법.
15. 제 14항에 있어서, 상기 링커는
    GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
16. 제 2항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 표적 분체는 Naglu 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 링커에 의해 융합되는, 방법.
17. 제 2항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 표적 분체는 Naglu 도메인의 N-말단에 직접적으로 또는 링커에 의해 융합되는, 방법.
18. 제 1항 내지 제 17항의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 인간 세포들로부터 생산되는, 방법.
19. 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 CHO 세포들로부터 생산되는, 방법.
20. 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 하나 이상의 표적 뇌 조직들에서 Naglu 단백질의 전달을 유도하는, 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적 뇌 조직들은 회색질, 백색질, 뇌실 영역들, 연질-거미막, 뇌척수막, 신생피질, 소뇌, 대뇌 피질의 깊은 조직들, 분자층, 미상엽핵/조가비핵 부위, 중뇌 또는 연수의 깊은 부위들, 및 그들의 조합으로부터 나온 조직들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 Naglu 단백질은 뉴런들, 아교세포들, 혈관주위 세포들 및/또는 뇌척수막 세포들로 전달되는, 방법.
23. 제 1항 내지 제 22항의 어느 한 항에 있어서, 상기 Naglu 단백질은 상기에 더하여 척수에 있는 뉴런들에 전달되는, 방법.
24. 제 1항 내지 제 23항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 상기에 더하여 말초 표적 조직들에서 Naglu 단백질의 전신적 전달을 유도하는, 방법.
25. 제 24항에 있어서, 상기 말초 표적 조직들은 간, 신장, 및/또는 심장으로부터 선택되는, 방법.
26. 제 1항 내지 제 25항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 리소좀 정착을 유도하는, 방법.
27. 제 1항 내지 제 26항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 리소좀 축적의 감소를 유도하는, 방법.
28. 제 27항에 있어서, 상기 리소좀 축적은 LAMP-1 염색에 의해 결정되는, 방법.
29. 제 28항에 있어서, 상기 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 적어도20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 또는 2배로 감소되는, 방법.
30. 제 1항 내지 제 29항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 뉴런들에서 감소된 공포화를 유도하는, 방법.
31. 제 30항에 있어서, 상기 뉴런들은 퍼킨지 세포들을 포함하는, 방법.
32. 제 1항 내지 제 31항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 증가된 Naglu 효소적 활성을 유도하는, 방법.
33. 제 32항에 있어서, 상기 Naglu 효소적 활성은 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가되는, 방법.
34. 32항 또는 제 33항에 있어서, 상기 증가된 효소적 활성은 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg인, 방법.
35. 제 32항에 있어서, 상기 Naglu 효소적 활성은 요추 부위에서 증가되는, 방법.
36. 제 35항에 있어서, 상기 요추 부위에서 증가된 Naglu 효소적 활성은 적어도 대략 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg인, 방법.
37. 제 1항 내지 제 36항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 산필리포 B형 증후군의 감소된 강도, 중증도, 또는 빈도, 또는 적어도 하나의 증상 또는 특징의 지연된 발병을 유도하는, 방법.
38. 제 37항에 있어서, 상기 산필리포 B형 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 난청, 지연된 언어 발달, 운동 능력들의 결여, 과다활동, 정신지체, 공격성 및/또는 수면 방해들인, 방법.
39. 제1항 내지 제38항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 2주마다 한 번 시행하는, 방법.
40. 제1항 내지 제38항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 매월 한 번 시행하는, 방법.
41. 제1항 내지 제38항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 2개월마다 한 번 시행하는, 방법.
42. 제1항 내지 제38항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 정맥내 투여와 조합하여 사용되는, 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 정맥내 투여는 많아야 매월 한 번의 빈도인, 방법.
44. 제42항에 있어서, 상기 정맥내 투여는 많아야 2개월마다 한 번의 빈도인, 방법.
45. 제 1항 내지 제 44항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 정맥내 투여의 부재 시 사용되는, 방법.
46. 제 1항 내지 제 45항의 어느 한 항에 있어서, 상기 경막내 투여는 동시적인 면역억제 요법의 부재 시 사용되는, 방법.
47. 제 1항 내지 제 46항의 어느 한 항에 있어서, 상기 Naglu 융합 단백질은 대략 20 mg/mL 이상의 농도로 투여되는, 방법.
48. 일단 투여되는 경우 리소좀들로 표적하고 생체내에서 치료적으로 활성을 가지는, Naglu 도메인; 리소좀 표적 분체를 포함하는 치료적 융합 단백질.
49. 제 48항에 있어서, 상기 Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 융합 단백질.
50. 제 48항에 있어서, 상기 Naglu 도메인은 서열번호 1 (성숙한 인간 Naglu 단백질)과 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 융합 단백질.
51. 제 48항 내지 제 50항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 표적 분체는 IGF-II 분체인, 치료적 융합 단백질.
52. 제 51항에 있어서, 상기 IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 2)와 적어도 70% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 융합 단백질.
53. 제 51항에 있어서, 상기 IGF-II 분체는 성숙한 인간 IGF-II (서열번호 3)의 8 내지 67번 잔기들을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 융합 단백질.
54. 제 48항 내지 제 53항의 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기에 더하여 Naglu 도메인 및 리소좀 표적 분체 사이에 링커를 포함하는, 치료적 융합 단백질.
55. 제 54항에 있어서, 상기 링커는
    GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 융합 단백질.
56. 제 54항 또는 제 55항에 있어서, 상기 리소좀 표적 분체는 Naglu 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 링커에 의해 융합되는, 치료적 융합 단백질.
57. 일단 투여되는 경우 치료적 융합 단백질이 리소좀들을 표적하고 생체내에서 치료적으로 활성을 가지고, 서열번호 5 (전장의 Naglu-IGFII 융합 단백질)과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 치료적 융합 단백질.

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