JP2013542913A - サンフィリポ症候群ｂ型の処置 - Google Patents

Abstract

特に本発明は、例えば、Ｎａｇｌｕタンパク質を髄腔内（ＩＴ）に投与することでサンフィリポ症候群Ｂ型（サンフィリポＢ）の治療方法および組成物を提供する。好適なＮａｇｌｕタンパク質は、組換えタンパク質、遺伝子活性化タンパク質または天然タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、組換えＮａｇｌｕタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＮａｇｌｕタンパク質は、Ｎａｇｌｕドメインと、リソソーム標的化部分とを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、ＩＧＦ−ＩＩ残基である。
【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／３５８，８５７号（２０１０年６月２５日出願）；第６１／３６０，７８６号（２０１０年７月１日出願）；第６１／３８７，８６２号（２０１０年９月２９日出願）；第６１／４３５，７１０号（２０１１年１月２４日出願）；第６１／４４２，１１５号（２０１１年２月１１日出願）；第６１／４７６，２１０号（２０１１年４月１５日出願）；および第６１／４９５，２６８号（２０１１年６月９日出願）に対する優先権を主張し、これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に援用される。

本願は、米国特許出願 表題「治療薬のＣＮＳ送達」（同日出願）；「ヘパランＮ−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「イズロン酸−２−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「β−ガラクトセレブロシダーゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「アリールスルファターゼＡのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に援用される）と関連する。
技術分野

酵素補充療法（ＥＲＴ）は、対象への天然または組換え的に得られるタンパク質および／または酵素の全身投与を伴う。認可療法は、典型的には、対象に静脈内投与され、一般的には、根元的酵素欠乏の身体症候を処置するのに有効である。中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞および組織中への静脈内投与タンパク質および／または酵素の限定的分布の結果として、静脈内投与タンパク質および／または酵素は血液−脳関門（ＢＢＢ）を適切に横断しないため、ＣＮＳ病因を有する疾患の処置は特に挑戦的であった。

血液−脳関門（ＢＢＢ）は、ＢＢＢを横切って、根元的脳脊髄液（ＣＳＦ）およびＣＮＳ中に、血流中の有害物質、例えば細菌、高分子物質（例えばタンパク質）およびその他の親水性分子が分散するのを制限することにより、このような物質から中枢神経系（ＣＮＳ）を保護するよう機能する内皮細胞からなる構造系である。

直接脳内注射、ＢＢＢの一過性透過処理ならびに組織分布を変更するための活性作用物質の改質を含めて、治療薬の脳送達を増強するためにＢＢＢを迂回するいくつかの方法がある。脳組織中への治療薬の直接注射は血管系を完全に迂回するが、しかし、頭蓋内注射により背負い込まれる合併症（感染、組織損傷、免疫応答性）、ならびに投与部位からの活性作用物質の不十分な拡散の危険を主に蒙る。今までのところ、脳物質中へのタンパク質の直接投与は、拡散バリアおよび投与され得る治療薬の用量限定のため、有意の治療効果を達成していない。緩徐長期注入を用いた脳実質中に配置されるカテーテルによる対流拡散（非特許文献１；非特許文献２）が研究されてきたが、しかし長期療法のためにこのアプローチを一般に用いる認可療法はない。さらに、脳内カテーテルの配置は、非常に侵襲性であり、臨床的代替法として余り望ましくない。

くも膜下腔内（ＩＴ）注射または脳脊髄液（ＣＳＦ）へのタンパク質の投与も試みられてきたが、しかし未だに治療的成功を見ていない。この処置における大きな挑戦は、脳室の上衣内張りを非常に堅く結合する活性作用物質の傾向であって、これがその後の拡散を妨げた。一般に、ＣＳＦへの直接的投与による脳遺伝子疾患の処置のための認可物質はない。
実際、脳の表面での拡散に対するバリア、ならびに有効且つ便利な送達方法の欠如は、任意の疾患に関する脳における適切な治療効果を達成するには大きすぎる障害物である、と多くの人々が考えた。

Ｂｏｂｏ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９１，２０７６−２０８０（１９９４） Ｎｇｕｙｅｎ，ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９８，５８４−５９０（２００３）

サンフィリポ症候群、すなわちムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩＩ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する酵素の欠乏によって特徴付けられる稀な遺伝性疾患である。酵素が不在の場合、部分的に分解したＧＡＧ分子は、体から除去されることができなく、種々の組織のリソソーム内に蓄積し、進行性の広範な体性機能障害を生じさせる（Ｎｅｕｆｅｌｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｚｅｒ， ２００１）。

ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型と名付けられたＭＰＳ ＩＩＩの４つの異なる型が同定されている。各型は、ＧＡＧヘパラン硫酸の分解に関与する４種類の酵素のうちの１つの欠損を表す。すべての型には、特徴的な粗い顔つき、肝脾腫大、角膜薄濁および骨格の変形を含む同じ臨床症状が様々な程度で含まれる。しかし、中でも注目すべきは、重度でかつ進行性の認識能力の喪失である。これは、ニューロン内のヘパラン硫酸の蓄積だけでなく、ＧＡＧの一次的蓄積に起因するガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３およびＧＤ２のその後の上昇にも関係している（Ｗａｌｋｌｅｙ １９９８）。

ムコ多糖体症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ；サンフィリポ症候群Ｂ型）は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）酵素の欠損によって特徴付けられる常染色体劣性遺伝障害である。この酵素の不在下では、ＧＡＧヘパラン硫酸は、ニューロンおよびグリア細胞のリソソーム内に蓄積し、脳の外側での蓄積はより少ない。今までのところ、サンフィリポ症候群Ｂ型に起因するＣＮＳ症状は、利用可能ないずれの方法による処置が成功していない。

したがって、脳に治療薬を有効に送達する必要性が依然として大いに存在する。さらに特定的には、サンフィリポ症候群Ｂ型の処置のために中枢神経系に治療剤をより有効に送達することが大いに必要とされている。

本発明は、サンフィリポ症候群Ｂ型の有効な処置のための組成物および方法を提供する。本発明は、動物疾患モデルへのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質（例えば、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質）の髄腔内投与が、種々の脳細胞内でのＧＡＧの大量蓄積を含むサンフィリポ症候群Ｂ型の種々の症状を治療する（例えば、寛解させる、抑制する、または発症を遅らせる）際に、予想外に有効であるという発見に一部は基づいている。

本発明の前に、組換えで生成されたＮａｇｌｕタンパク質が、典型的にリソソーム標的化に必要とされるマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を欠くことが報告された。したがって、サンフィリポ症候群Ｂ型に対する酵素補充療法は、ＣＮＳにおける主な徴候およびＭ６Ｐ残基の欠如のために、ユニークな挑戦を提示する。後述するように、本発明者らは、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの髄腔内注射が、脳内のＧＡＧ蓄積の減少、脳組織内のリソソーム貯蔵の回復およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの脳実質への浸透を驚くほど有効にもたらしたことを示した。いかなる特定の理論にも制約されることを望むことなく、ＩＧＦＩＩ部分などのリソソーム標的化部分が、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の欠如を克服し得、標的組織においてＭ６Ｐ非依存的なリソソーム標的化を生じさせると考えられる。これらの結果は、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質などのＮａｇｌｕタンパク質のＩＴ内投与を用いて、サンフィリポ症候群Ｂ型を有効に処置することができることを示している。このように、本発明は、サンフィリポ症候群Ｂ型の酵素補充療法において著しいブレイクスルーを表す。

髄腔内投与を下記の実施例で記述しているが、本発明によるＮａｇｌｕ融合タンパク質は、例えば、これらに限定されるものではないが、実質内投与、側脳室内（ＩＣＶ）投与、髄腔内（例えば、ＩＴ−腰椎内、ＩＴ−大槽）投与、ならびにＣＮＳおよび／またはＣＳＦへの直接的または間接的な注射のための他の技術と経路を含む種々の技術および経路で直接的にまたは間接的にＣＮＳに送達されることが考えられる。

一態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質を髄腔内投与するステップを含む、サンフィリポ症候群Ｂ型（サンフィリポＢ）の治療方法を提供する。本明細書で用いる場合、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、合成タンパク質、組換えタンパク質、遺伝子活性化タンパク質または天然タンパク質であり得る。

いくつかの実施形態では、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、組換えＮａｇｌｕタンパク質である。一部の実施形態では、組換えＮａｇｌｕタンパク質は、Ｎａｇｌｕドメインと、リソソーム標的化部分とを含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、Ｎａｇｌｕドメインは、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｎａｇｌｕドメインは、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｎａｇｌｕドメインは、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と同一のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、リソソームターゲッティング部分は、ＩＧＦ−ＩＩ残基である。特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ残基は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ残基は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ残基は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号２）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ残基は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）の８〜６７の残基を含むアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎａｇｌｕドメインとリソソーム標的化部分との間にリンカーをさらに含む。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）のうちの１以上のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）のアミノ酸配列は、タンデム反復で存在する。

いくつかの実施形態では、リンカーは、１以上のＧＡＰ配列をさらに含む。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、ＮａｇｌｕドメインのＣ末端に、直接的にまたはリンカーを介して融合する。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、ＮａｇｌｕドメインのＮ末端に、直接的にまたはリンカーを介して融合する。

いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト細胞から生成する。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、ＣＨＯ細胞から生成する。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、１以上の標的脳組織内にＮａｇｌｕタンパク質の送達を生じさせる。特定の実施形態では、１以上の標的脳組織は、灰白質、白質、室周囲領域、軟膜クモ膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または髄質の深部およびその組合せの組織からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕタンパク質は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞に送達される。いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕタンパク質は、脊髄内のニューロンにさらに送達される。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、末梢標的組織におけるＮａｇｌｕタンパク質の全身送達をさらに生じさせる。特定の実施形態では、末梢標的組織は、肝臓、腎臓、脾臓および／または心臓から選択される。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でリソソーム局在化を生じさせる。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でリソソーム貯蔵（例えば、酵素基質の蓄積）を減少させる。特定の実施形態では、リソソーム貯蔵は、ＬＡＭＰ−１染色法で決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍または２倍減少する。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、ニューロン内の空胞化を減少させる。特定の実施形態では、ニューロンはプルキンエ細胞を含む。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でＮａｇｌｕ酵素活性を増加させる。特定の実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性は、対照（例えば、対象における処置前の内在酵素活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する。特定の実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性の増加は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。本明細書で用いる場合、ｎｍｏｌ／時・ｍｇは、酵素の比活性を定義し、酵素１ｍｇあたり１時間ごとに加水分解する基質ｎｍｏｌを測定する。

いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性は、腰部領域で増加する。特定の実施形態では、腰部領域におけるＮａｇｌｕ酵素活性の増加は、少なくとも約５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、サンフィリポ症候群Ｂ型の少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度もしくは頻度の低下または発症の遅延を生じさせる。いくつかの実施形態では、サンフィリポＢ疾患の少なくとも１つの症状または特徴は、難聴、発達性言語障害、運動能力の欠損、多動、知能障害、攻撃性および／または睡眠障害である。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、２週間に１回実施される実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、１ヶ月に１回実施される実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、２ヶ月に１回実施される実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、静脈内投与と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、毎週１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、２週に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、１ヶ月に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、２ヶ月に１回以下の頻度である。特定の実施形態では、静脈内投与は、毎週２回、毎週１回、隔週ごとに１回または毎月２回などの、月１回の投与よりも高い頻度である。

いくつかの実施形態では、静脈内およびくも膜下腔内投与は、同日に実施される。いくつかの実施形態では、静脈内およびくも膜下腔内投与は、互いに一定時間内、例えば少なくとも２日以内、少なくとも３日以内、少なくとも４日以内、少なくとも５日以内、少なくとも６日以内、少なくとも７日以内または少なくとも１週間以内には実施されない。いくつかの実施形態では、静脈内およびくも膜下腔内投与は、交互スケジュールで、例えば週１回、隔週、月２回または月１回、交互投与で実施される。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、例えば週１回、隔週、月２回または月１回の静脈内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第３または第４または第５投与毎に、静脈内投与の代わりにくも膜下腔内投与に取り替えられ得る。

いくつかの実施形態では、静脈内およびくも膜下腔内投与は、逐次的に実施され、例えば先ず、静脈内投与を実施し（例えば週１回、隔週、月２回または月１回の用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）、その後、ＩＴ投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回の用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）を実施する。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与を先ず実施し（例えば週１回、隔週、月２回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回の用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）、その後、静脈内投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）を実施する。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、静脈内投与なしで用いられる。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、同時免疫抑制療法を併用せずに用いられる。

いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質は、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で投与される。

別の態様では、本発明は、Ｎａｇｌｕドメイン；リソソーム標的化部分を含む治療用融合タンパク質を提供する。一旦投与されると、該治療用融合タンパク質は、リソソームを標的にして、ｉｎ ｖｉｖｏで治療的に活性になる。

いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕドメインは、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕドメインは、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、ＩＧＦ−ＩＩ残基である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ残基は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩ残基は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）の８〜６７の残基を含むアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎａｇｌｕドメインとリソソーム標的化部分との間にリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、ＮａｇｌｕドメインのＣ末端に直接またはリンカーを介して融合する。いくつかの実施形態では、

さらに別の態様では、本発明は、配列番号６（全長のＮａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）同一のアミノ酸配列を含む治療用融合タンパク質を提供する。一旦投与されると、該治療用融合タンパク質は、リソソームを標的にして、ｉｎ ｖｉｖｏで治療的に活性になる。

本願で用いる場合、「約」および「およそ」という用語は、同意義で用いられる。本願で用いられる任意の数字は、約／およそを伴う場合も伴わない場合も、関連業界の当業者に理解される任意の正常変動を網羅するよう意図される。

本発明のその他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明で明らかになる。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示して入るが、例証のために示されたものであって、本発明を限定するものではない、と理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変更および修正は、詳細な説明を読めば当業者に明らかになる。

図面は例証に過ぎず、本発明を限定するものではない。
代表的なｒｈＮａｇｌｕ、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴとＮａｇｌｕ Ｋｉｆ、および概念実証（ＰＯＣ）試験の結果を表す。（ａａ数／理論．ｍｗ−アミノ酸の数と理論的分子量） 代表的なＰｅｒＴ−ＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＡｐｏＥを表す。ｒｈＮａｇｌｕのこれらの２つの修飾型は、ＢＢＢを通って酵素を輸送することを調べるために作製した。 （図３Ａ）ＩＧＦＩＩ受容体への結合配列としてアミノ配列８〜６７（緑色）を示す代表的なＩＧＦＩＩ分子を表す（図はＨａｓｈｉｍｏｔｏ１９９５，２０の図を修正した）。（図３Ｂ）代表的なＭ６Ｐ／ＩＧＦＩＩ受容体とその１５個のドメインを表す。ドメイン３と９（緑色）は、マンノース−６−リン酸に結合し、一方ドメイン５は、マンノース−６−リン酸ジエステルに結合する。ドメイン１１（黄色）は、ＩＧＦＩＩに結合する（Ｂｏｈｎｓａｃｋ ２００９，２２の図を修正した）。 Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩクローン４７ｄｚ２〜１５の代表的な産生推移をグラフで表す。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの平均産生は、０．５ｐｃｄ（１日あたり、１００万細胞あたりのピクトグラム）であった。ＧＨ、増殖収集；Ｈ１〜Ｈ８、収集１〜８。 図２〜５における産生推移のグラフからの収集についての代表的なウエスタンブロット分析を表す。レーンを培地の量で規準化した。 ＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化前後のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩについての代表的なウエスタンブロット分析を表す。ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化前のバンドの分散は、グリコシル化したときのリソソームタンパク質の典型的な様相である。ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化後、リソソームタンパク質のバンドは、くっきりと濃くなり、その様相は、同様のポリペプチド鎖のそれと一致する。抗ヒトＮａｇｌｕおよび抗ＩＧＦＩＩ抗体によるウエスタンブロット分析で、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのインタクトな分子だけがクローン４７ｄｚ２−１５によって発現したことを確認した。「−」は、ＰＮＧａｓｅ Ｆの消化前の収集物質を示す。「＋」は、ＰＮＧａｓｅ Ｆの消化後の収集物質を示す。 Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの代表的な精製スキームを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、条件培地からのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの段階的精製を表す。 Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆタンパク質の代表的な結晶を表す。 模式図で表したＮａｇｌｕの代表的な結晶構造を示す。３つのドメインをドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩとして示す。グリカンを細枝として示す。触媒残基は、Ｅ３１６とＥ４４６である。 Ｎａｇｌｕの代表的な三量体構造を表す。３つの活性部位を示す。 ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞内在化の試験に関して用いた正常ヒト由来の代表的な一次線維芽細胞を示す。ｒｈＮａｇｌｕの細胞取り込みは最小度であったが、一方、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞取り込みは大いに顕著であった。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ内在化の飽和曲線は、受容体媒介性取り込みを示した。この取り込みは、ＩＧＦＩＩにより抑制されたが、しかしマンノース−６−リン酸によっては抑制されなかった。 サンフィリポＢ患者の線維芽細胞（ＧＭ０１４２６）を用いた代表的な共焦点顕微鏡試験の結果を表す。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの広範囲にわたる内在化、およびにＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩとＬａｍｐ−１との共局在化が観察された。 野生型（ＷＴ）、Ｎａｇｌｕ−／−（ＫＯ）および異種接合体Ｎａｇｌｕ＋／−（Ｈｅｔ）のマウスにおける代表的なＮａｇｌｕ活性を示す。サンフィリポＢマウスにおけるＮａｇｌｕの完全欠損は、脳、肝臓および脾臓で観察された。 ＩＣ注射の部位および組織学的分析のための切断面を示すためのマウス脳の上面および側面図を表す。中央の写真はマウス脳の横断面で、倍率は１倍である。ボックスで囲んだ部分は、下部顕微鏡写真の倍率４倍の顕微鏡像の視野を示す。下部写真は、組織学的スライドの倍率４倍の画像である。ボックスＡおよびＢは、図１５および図１６の倍率４０倍の顕微鏡写真の視野を示す。 ＩＣ注射の７日後のサンフィリポＢマウスにおける大脳皮質の代表的な免疫組織化学知見を表す。倍率４０倍。ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩはともに、ニューロンならびにグリア細胞における広範囲の細胞取り込みを示し、その分布と細胞取り込みのパターンは２つのタンパク質間で非常によく似ていた（抗ヒトＮａｇｌｕモノクローナル抗体）。 代表的なＬＡＭＰ−１免疫染色した大脳皮質を表す（４０倍）。野生型マウスの脳と比較して、ＬＡＭＰ−１免疫染色陽性スポットの増加により実証されるように、溶媒処置サンフィリポＢマウスの脳では、リソソーム貯蔵の増加が観察された。ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置サンフィリポＢマウスの両方の脳が、ｗｔマウスと非常によく似たリソソーム貯蔵の減少を示した。 （図１７Ａ）溶媒を投与された同一Ｎａｇｌｕ欠損マウスに比較して、ＮａｇｌｕをＩＴ投与されたＮａｇｌｕ欠損マウスの白質組織中の細胞空胞形成の広範な減少を示す。（図１７Ｂ）溶媒を投与された同一Ｎａｇｌｕ欠損マウスに比較して、Ｎａｇｌｕをくも膜下腔内投与されたＮａｇｌｕ欠損マウスの白質組織中のリソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）免疫染色における顕著な減少を示す。 野生型マウスおよび溶媒を投与されたＮａｇｌｕ欠損マウスの療法と比較した場合の、Ｎａｇｌｕを投与されたＮａｇｌｕ欠損マウスの大脳皮質、尾状核および被殻（ＣＰ）、視床（ＴＨ）、小脳（ＣＢＬ）および白質（ＷＭ）で測定されたＬＡＭＰの濃度を定量的に示し、比較する。分析された脳組織の各領域のＬＡＭＰ陽性域は、２週間過程の間の２投与量のＮａｇｌｕ（図１８Ｂ）と比較して、７日過程にわたる３投与量のＮａｇｌｕのくも膜下腔内投与後、さらに減少した（図１８Ａ）。 カニューレ処置ｗｔラットにおけるＩＴ注射の部位を実証するために、この図で参照として用いたヒトＣＮＳの代表的な正中矢状断面の模式図である。青い矢印は、脊髄内のＩＴ注射の近似の解剖学的位置を示し、赤い矢印は、免疫組織化学試験のために組織を採取した大脳皮質領域を示す。 ＩＴ注射後の脳における代表的なＮａｇｌｕ活性を示す。Ｎａｇｌｕ活性は、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ注射ｗｔラットの脳において有意に高かった。 ＩＴ注射から２４時間後のｒｈＮａｇｌｕ、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴ、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ｋｉｆおよびＰｅｒＴ−Ｎａｇｌｕで処置した、カニューレ処置ｗｔラットの大脳皮質の代表的なＮａｇｌｕ免疫染色を表す。倍率２０倍。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩは、脳の実質組織中への広範囲の分布を良好に示した唯一のタンパク質であった。ニューロンおよびグリア細胞中への細胞内取り込みも、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置ラットで明らかであった。他方で、ｒｈＮａｇｌｕ、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴ、Ｎａｇｌｕ ｋｉｆおよびＰｅｒＴ−Ｎａｇｌｕ処置群では、タンパク質は髄膜（Ｍ）内だけに残存した。 図２１からの選択スライドの代表的な高出力倍率画像を表す。上段パネル：ｒｈＮａｇｌｕ処置したカニューレ処置ｗｔラットにおいて、ｒｈＮａｇｌｕは髄膜（Ｍ）のみに残存し、脳の実質組織中に陽性染色は認められなかった。下段パネル：Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置したカニューレ処置ｗｔラットでは、脳の実質組織中への広範囲の分布が良好に観察され、細胞取り込みはニューロンおよびグリア細胞において観察された。 最終ＩＴ注射から２４時間後の脳および肝臓内の代表的なＮａｇｌｕ活性を示す。３つの処置群の間で、脳内のＮａｇｌｕ活性は有意差を示さず、肝臓内での活性に関しても同じである。この結果は、脳および肝臓で検出されたＮａｇｌｕ活性が、屠殺の２４時間前に行われた最終注射に主に起因することを意味した。脳内と比較して、肝臓内でのＮａｇｌｕ活性が著しく高かった理由については、この時点で不明である。ＩＴ注射後に徹底的な薬物動態試験を行えば、この差異の解明に役立つであろう。 Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ注射後の脳および肝臓における代表的な総ＧＡＧレベルを示す。溶媒処置サンフィリポＢマウスの脳における総ＧＡＧは、漸進的増加を示し、サンフィリポＢマウスのとともに蓄積の影響を反映した。脳におけるＧＡＧの統計的に有意の減少は、３×注射群において観察された（Ｐ＜０．０５）。肝臓におけるＧＡＧの統計学的に有意の減少も、２×および３×注射群で観察された（Ｐ＜０．０５）。脳よりも肝臓におけるＧＡＧレベルのより迅速且つより激烈な変化は、ハンター症候群などの他のリソソーム貯蔵障害マウスモデル（内部伝達系）で観察されている現象である。 ＩＴ注射後のサンフィリポＢマウスの脳におけるＮａｇｌｕの代表的な生体分布を表す。Ｎａｇｌｕの免疫蛍光染色は、髄膜（Ｍ）および脳の実質組織におけるＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩタンパク質を明示した。細胞取り込みは、２×および３×注射群で観察された。Ｇ：グリア細胞。 マウス脳の冠状切片を示す代表的な図である。ボックスは、ＬＡＭＰ−１免疫染色のための写真が撮られた場所を示す。タンパク質分布および効力の程度を実証するために、大脳皮質および皮質下組織、例えば尾状核、視床および白質が、ＬＡＭＰ１免疫染色のために選択された。 大脳皮質のＬＡＭＰ１免疫染色を示す代表的な図である（倍率４０倍）。野生型マウスの脳と比較して、ＬＡＭＰ１免疫染色陽性スポットの増加が示すように、溶媒処置サンフィリポＢマウスの脳においてリソソーム貯蔵の増加が観察された。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ注射後のリソソーム貯蔵の減少は、２×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズの減少、および３×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズと数の減少により明らかであった。 皮質下核である尾状核のＬＡＭＰ−１免疫染色を示す代表的な図である（倍率４０倍）。大脳皮質において観察されたものと同様に、ＬＡＭＰ−１免疫染色陽性スポットの増加が示すように、溶媒処置サンフィリポＢマウスの脳において、リソソーム貯蔵の増加が観察された。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ ＩＴ注射後のリソソーム貯蔵の減少は、２×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズの減少により、および３×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズと数の減少により、明らかであった。 間脳核である視床のＬＡＭＰ−１免疫染色を示す代表的な図である（倍率４０倍）。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ ＩＴ注射後のリソソーム貯蔵の減少は、２×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズの減少により、および３×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズと数の減少により、明らかであった。 白質のＬＡＭＰ−１免疫染色を示す代表的な図である（倍率４０倍）。ニューロン軸索線維の軸筋は、図２６〜２９に示したように白質を灰白質と区別する。それでも、野生型マウスと比較した場合、リソソーム貯蔵の同じ増加パターンが、溶媒処置サンフィリポＢマウスの脳で観察できた。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ ＩＴ注射後のリソソーム貯蔵の減少は、２×および３×注射処置サンフィリポＢマウス脳の陽性スポットのサイズと数の減少により明らかであった。 小脳皮質の代表的なＬＡＭＰ−１免疫染色を示す。脳の他の部分におけるようにリソソーム貯蔵の減少の同様の効果が、小脳皮質で観察された。小脳皮質の形態は、密に集合した顆粒状ニューロン、低細胞性分子層、および顆粒状ニューロンと分子層との間の単層のプルキンエニューロンにより明らかであった。プルキンエニューロンは、大型細胞質と、分子層内に突出する偶発的な樹状突起とにより確認された。 脳、脊髄および肝臓におけるＮａｇｌｕ染色を示す代表的な図である。脳および脊髄において、注射されたＮａｇｌｕは、ＩＨＣによって髄膜（Ｍ）中のみに検出され、任意の他の領域でＮａｇｌｕ陽性染色は検出されなかった。肝臓では、洞様細胞（Ｓ）はＮａｇｌｕ陽性であったが、肝細胞（Ｈ）中にＮａｇｌｕ取り込みは見出されなかった。 肝臓および脊髄のＬＡＭＰ免疫染色およびＨ＆Ｅ染色を示す代表的な図である。溶媒処置動物と比較すると、ＬＡＭＰ染色は、Ｎａｇｌｕで処置された肝臓および脊髄の両方において全体にわたって減少した。Ｈ＆Ｅ染色は、肝細胞における細胞空胞形成は、溶媒処置動物と比較して、処置動物において明らかに減少したことを示した。 粘着性のないＮａｇｌｕのＩＴ注射を、３か月間、隔週ごとに６回行った後の脳の形態改善を示す、代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。処置された脳内では、試験したすべての領域において細胞空胞化（矢印）は、溶媒群と比較して減少した。 粘着性のないＮａｇｌｕのＩＴ注射を、３か月間、隔週ごとに６回行った後の脳の形態改善を示す、代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。処置された脳内では、試験したすべての領域において細胞空胞化（矢印）は、溶媒群と比較して減少した。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＬＡＭＰ免疫染色を示す。溶媒処置群と比較して、サンフィリポＢマウスへのＮａｇｌｕ ＩＴ投与は、ＬＡＭＰ免疫染色により明示されたすべての実験領域においてリソソーム活性の減少を生じた。この減少は、ＬＡＭＰ陽性細胞の数の減少、より小さな細胞サイズおよびより薄い染色により特性化された。他の脳領域と比較して、脊髄に近い脳の尾状核部に位置する小脳および脳幹において、顕著な減少が見出された。明らかな減少は、白質、海馬および視床を含む深部脳領域においても見出された。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＬＡＭＰ免疫染色を示す。溶媒処置群と比較して、サンフィリポＢマウスへのＮａｇｌｕ ＩＴ投与は、ＬＡＭＰ免疫染色により明示されたすべての実験領域においてリソソーム活性の減少を生じた。この減少は、ＬＡＭＰ陽性細胞の数の減少、より小さな細胞サイズおよびより薄い染色により特性化された。他の脳領域と比較して、脊髄に近い脳の尾状核部に位置する小脳および脳幹において、顕著な減少が見出された。明らかな減少は、白質、海馬および視床を含む深部脳領域においても見出された。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＬＡＭＰ免疫染色を示す。溶媒処置群と比較して、サンフィリポＢマウスへのＮａｇｌｕ ＩＴ投与は、ＬＡＭＰ免疫染色により明示されたすべての実験領域においてリソソーム活性の減少を生じた。この減少は、ＬＡＭＰ陽性細胞の数の減少、より小さな細胞サイズおよびより薄い染色により特性化された。他の脳領域と比較して、脊髄に近い脳の尾状核部に位置する小脳および脳幹において、顕著な減少が見出された。明らかな減少は、白質、海馬および視床を含む深部脳領域においても見出された。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＩｂａ ＩＨＣを示す。これは、ミクログリア細胞の活性化を明示した。溶媒処置群と比較して、Ｎａｇｌｕ処置群においては、陽性細胞の数および染色強度の減少は観察されなかった。しかしながら、陽性ミクログリア細胞の細胞形態は、溶媒群の大型で空胞化したもの（挿入図）と比較して、すべての実験脳領域において、細胞サイズの減少に伴って変化した。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＩｂａ ＩＨＣを示す。これは、ミクログリア細胞の活性化を明示した。溶媒処置群と比較して、Ｎａｇｌｕ処置群においては、陽性細胞の数および染色強度の減少は観察されなかった。しかしながら、陽性ミクログリア細胞の細胞形態は、溶媒群の大型で空胞化したもの（挿入図）と比較して、すべての実験脳領域において、細胞サイズの減少に伴って変化した。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＧＦＡＰ ＩＨＣを示す。これは星状細胞活性化を明示した。溶媒処置群と比較して、ＧＦＡＰ陽性染色は、小脳および脳幹において減少し、他の実験領域においてわずかに減少した。 ３か月間６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の種々の脳領域における代表的なＧＦＡＰ ＩＨＣを示す。これは星状細胞活性化を明示した。溶媒処置群と比較して、ＧＦＡＰ陽性染色は、小脳および脳幹において減少し、他の実験領域においてわずかに減少した。 代表的な髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。 代表的なＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）低プロファイル髄腔内埋込型アクセスシステムを示す。 代表的な髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。 ＣＮＳ酵素補充療法（ＥＲＴ）のための在宅投与を可能にする代表的な髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ］）を示す。 安全機構を含む髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）の代表的な略図を示す。 ＩＤＤＤを留置し得る患者の体内の代表的な部位を示す。 髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）の種々の部品を示す。 ＩＴ−腰椎内注射のための患者の体内の代表的な挿入部位を示す。

定義
本発明をより容易に理解するために、一定の用語を先ず以下で定義する。以下の用語および他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。

「およそまたは約」：本明細書で用いる場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の当該値に適用される場合、記述参照値と類似する値を指す。ある実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別記しない限り、あるいはそうでない場合は本文から明らかな記述参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下内にある一連の値を指す（このような数が考え得る値の１００％を超える場合を除く）。

「寛解」：本明細書で用いる場合、「寛解」という用語は、ある状態の予防、軽減もしくは緩和、または対象の状態の改善を意味する。寛解は、疾患状態（例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型）の完全な回復または完全な予防を含むが、必ずしも必要とするわけではない。いくつかの実施形態では、寛解は、関連する疾患組織で欠損している関連タンパク質（例えば、Ｎａｇｌｕ）の濃度またはその活性の増加を含む。

「生物学的に活性な」：本明細書で用いる場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系において、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物体に投与された場合、その生物体に及ぼす生物学的作用を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的活性」部分として言及される。

「陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」：本明細書で用いる場合、「陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」という用語は、リソソームへの輸送を定められているゴルジ装置における酸加水分解酵素の前駆体上でマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）タグを結合する細胞受容体を指す。マンノース−６−リン酸のほかに、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩも結合する。ＣＩ−ＭＰＲは、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」または「ＩＧＦ２受容体」としても既知である。これらの用語およびその略語は、本明細書で互換的に用いられる。

「同時免疫抑制薬療法」：本明細書で用いる場合、「同時免疫抑制薬療法」という用語は、前処置、前状態調節として、またはある処置方法と平行して用いられる任意の免疫抑制薬療法を包含する。

「希釈剤」：本明細書で用いる場合、「希釈剤」という用語は、再構成処方物の調整のために有用な製薬上許容可能な（例えば、ヒトへの投与のために安全且つ非毒性の）希釈物質を指す。希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。

「剤形」：本明細書で用いる場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、処置されるべき患者のための治療用タンパク質の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医により決定される、と理解される。

「酵素補充療法（ＥＲＴ）」：本明細書で用いる場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、欠損した酵素を提供することにより酵素欠損症を補正する任意の治療戦略を指す。いくつかの実施形態では、欠損した酵素は、くも膜下腔内投与により提供される。いくつかの実施形態では、欠損した酵素は、血流中への注入により提供される。一旦投与されると、酵素は細胞に取り込まれ、リソソームに運ばれて、そこで酵素は、酵素欠損のためにリソソーム中に蓄積された物質を除去するよう作用する。典型的には、有効であるべきリソソーム酵素補充療法に関して、治療用酵素は、貯蔵欠陥が著しい標的組織内の適切な細胞中のリソソームに送達される。

「改善する、増加するまたは減少する」：本明細書で用いる場合、「改善する」、「増加する」または「減少する」という用語、または文法的同義語は、基線測定値、例えば本明細書に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書に記載される処置の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値と比較した場合の値を示す。「対照個体」は、処置されている個体と同一型のリソソーム貯蔵疾患（例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型）に罹患している個体であって、処置されている個体とほぼ同年齢である（処置個体と対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。

「個体、対象、患者」：本明細書で用いる場合、「対象」、「個体」または「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を指す。処置されている個体（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は、疾患に罹患している個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。

「くも膜下腔内投与」：本明細書で用いる場合、「くも膜下腔内投与」または「くも膜下腔内注射」という用語は、脊柱管（脊髄周囲のくも膜下腔内空隙）への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔あるいは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による「くも膜下腔内投与」または「くも膜下腔内送達」は、腰椎域または領域を介したＩＴ投与または送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与または送達を指す。本明細書で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎域」という用語は、第三および第四腰椎（背中下部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。

「リンカー」：本明細書で用いる場合、「リンカー」という用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質中の特定位置に出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、一般的に、柔軟性であるよう、または２つのタンパク質部分の間の構造物、例えばα−ヘリックスを間に置くよう意図される。リンカーは、スペーサーとも呼ばれる。

「リソソーム酵素」：本明細書で用いる場合、「リソソーム酵素」という用語は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を還元し得るか、あるいは１つ以上のリソソーム貯蔵疾患症候を救出するかまたは改善し得る任意の酵素を指す。本発明に適しているリソソーム酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成され得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。

「リソソーム酵素欠損症」：本明細書で用いる場合、「リソソーム酵素欠損症」は、高分子物質（例えば酵素基質）をリソソーム中でペプチド、アミノ酸、単糖、拡散および脂肪酸に分解するために必要とされる酵素のうちの少なくとも１つにおける欠損に起因する遺伝子障害の一群を指す。その結果、リソソーム酵素欠損症に罹患している個体は、種々の組織（例えば、ＣＮＳ、肝臓、脾臓、腸、血管壁およびその他の器官）中に物質を蓄積している。

「リソソーム蓄積症」：本明細書で用いる場合、「リソソーム蓄積症」という用語は、天然高分子物質を代謝するために必要な１つ以上のリソソーム酵素の欠損に起因する任意の疾患を指す。これらの疾患は、典型的には、リソソーム中に非分解分子の蓄積を生じて、貯蔵顆粒（貯蔵小胞とも呼ばれる）の数が増加する。これらの疾患および種々の例は、以下で詳細に記載される。

「ポリペプチド」：本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、概して、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の紐である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その各々が少なくとも１つのペプチド結合により他のものと結合される少なくとも３〜５つのアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、時として、「非天然」アミノ酸、あるいはそれでも任意にポリペプチド鎖に一体化し得る他の実体を包含する、と当業者は理解する。

「補充酵素」：本明細書で用いる場合、「補充酵素」という用語は、処置されるべき疾患において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、「補充酵素」という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を減少し得るし、あるいは１つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。本発明に適している補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成し得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。

「可溶性の」：本明細書で用いる場合、「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成する治療薬の能力を指す。いくつかの実施形態では、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。いくつかの実施形態では、本発明による治療薬は、その対応する薬学的組成物中で可溶性である。非経口投与薬のためには等張溶液が一般的に好ましいが、等張溶液の使用は、いくつかの治療薬、特にいくつかのタンパク質および／または酵素に関する適切な溶解度を制限し得る、と理解される。わずかに高張性の溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に１７５ｍＭまでの塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に２％までのスクロース）は、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。例えば、最も一般に認可されたＣＮＳボーラス処方物組成物は、生理食塩水（水中１５０ｍＭのＮａＣｌ）である。

「安定性」：本明細書で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間にわたってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大部分）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間にわたって査定され得る（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）。概して、本明細書に記載される薬学的組成物は、それらが、一緒に処方される１つ以上の治療薬（例えば、組換えタンパク質）を安定化し、あるいはそれらの分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。一処方物の状況では、安定処方物は、貯蔵時、および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）中に、その中の治療薬が本質的にその物理的および／または化学的完全性および生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の喪失、ペプチド断片の生成および電荷プロファイルの移動により測定され得る。

「対象」：本明細書で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳動物を意味する。本発明のある実施形態では、対象は、成人、若者または幼児である。薬学的組成物の投与、および／または子宮内処置方法の実施も、本発明により意図される。

「実質的相同性」：「実質的相同」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に相同な残基を含有する場合、一般的に「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は、同一残基であり得る。代替的には、相同残基は、ほぼ同様の構造的および／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知であるように、あるアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として分類され、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有するとして分類される。一アミノ酸の、別の同一型のアミノ酸への置換は、しばしば、「相同」置換とみなされ得る。

当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ら，（編），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。

「実質的同一性」：「実質的同一性」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般的に「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ら，（編），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載されている。同一配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。

「合成ＣＳＦ」：本明細書で用いる場合、「合成ＣＳＦ」という用語は、脳脊髄液と一致するｐＨ、電解質組成、グルコース含量および浸透圧を有する溶液を指す。合成ＣＳＦは、人工ＣＳＦとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、合成ＣＳＦはエリオットＢ溶液である。

「ＣＮＳ送達に好適な」：本明細書で用いる場合、「ＣＮＳ送達に好適な」または「くも膜下腔内送達に好適な」という語句は、それが本発明の薬学的組成物に関する場合、一般的に、このような組成物の安定性、耐容性および溶解度特性、ならびに標的送達部位（例えば、ＣＳＦまたは脳）にその中に含有される有効量の治療薬を送達するこのような組成物の能力を指す。

「標的組織」：本明細書で用いる場合、「標的組織」は、処置されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠乏リソソーム酵素が正常に発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹患し易い患者において、検出可能な、または以上に高量の酵素基質が存在する、例えば当該組織の細胞リソソーム中に貯蔵される組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、欠乏リソソーム酵素が高レベルで正常に発現される組織を包含する。本明細書で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載する。

「治療用部分」：本明細書で用いる場合、「治療用部分」という用語は、分子の治療作用を果たす分子の一部分を指す。いくつかの実施形態では、治療的部分は、治療活性を有するポリペプチドである。例えば、本発明による治療用部分は、天然Ｎａｇｌｕタンパク質の代わりになることができるポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用部分は、Ｎａｇｌｕ欠損と付随した１以上の表現型をレスキューすることができるポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用部分は、サンフィリポ症候群Ｂ型患者において、１以上の症状を処置することができる。

「治療有効量」：本明細書で用いる場合、「治療有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な合理的利益／危険比で、処置対象に治療効果を付与する治療用タンパク質（例えば、Ｎａｇｌｕ）の量を指す。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能）または主観的（すなわち、対象は、作用の指示を与えるかまたは作用を感じる）であり得る。特に、「治療有効量」は、例えば疾患に伴う症候を改善し、疾患の開始を防止するかまたは遅延し、および／または疾患の症候の重症度または頻度を下げることにより、所望の疾患または症状を処置し、改善し、または防止するために、あるいは検出可能な治療的または予防的作用を示すために有効な治療用タンパク質または組成物の量を指す。治療有効量は、一般に、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで投与される。任意の特定治療用タンパク質に関して、治療有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者に関する具体的治療有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば処置されている障害、および障害の重症度；用いられる具体的な薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝の速度；処置の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような同様の因子によって決まる。

「耐容可能な」：本明細書で用いる場合、「耐容可能な」および「耐容性」という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。

「処置」：本明細書で用いる場合、「処置」（さらにまた「処置する」または「処置すること」）という用語は、特定の疾患、障害および／または症状（例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型）の１つ以上の症候または特徴を、部分的にまたは完全に、緩和し、改善し、軽減し、抑制し、その発症を遅延し、その重症度を減少させ、および／またはその発生率を減少させる治療用タンパク質（例えば、リソソーム酵素）の任意の投与を指す。このような処置は、関連疾患、障害および／または症状の徴候を示さない対象の、および／または疾患、障害および／または症状の早期徴候のみを示す対象のものであり得る。代替的にまたは付加的に、このような処置は、関連疾患、障害および／または症状の１つ以上の確立された徴候を示す対象のものであり得る。

特に本発明は、例えば、Ｎａｇｌｕｅタンパク質の髄腔内（ＩＴ）投与によるサンフィリポ症候群Ｂ型（サンフィリポＢ）の治療方法および組成物を提供する。好適なＮａｇｌｕタンパク質は、組換えタンパク質、遺伝子活性化タンパク質または天然タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、組換えＮａｇｌｕタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＮａｇｌｕタンパク質は、Ｎａｇｌｕドメインおよびリソソーム標的化部分を含んでいる融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、ＩＧＦ−ＩＩ残基である。

本発明の種々の態様は、以下の節で詳細に記載される。節の記載内容は、本発明を限定するものではない。各説は、本発明の任意の態様に適用し得る。この出願において、「または」は、別記しない限り「および／または」を意味する。
治療用融合タンパク質

本発明によるサンフィリポＢ疾患の処置のために好適な治療用融合タンパク質は、Ｎａｇｌｕドメイン（治療用部分とも呼ばれる）とリソソーム標的化部分とを含み得る。
Ｎａｇｌｕドメイン

本発明による好適なＮａｇｌｕｄメインは、天然起源Ｎａｇｌｕｅのタンパク質活性の代わりになることができる、またはＮａｇｌｕｅ欠損と付随した１以上の表現型もしくは症状をレスキュー救うことができるいずれの分子または分子の一部であり得る。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、Ｎ末端とＣ末端とを有するポリペプチドおよび成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質に実質的に類似のまたは同一のアミノ酸配列である。

典型的には、ヒトＮａｇｌｕは、成熟型にプロセシングされる前駆体分子として生成される。このプロセスは、該タンパク質が小胞体に入ると、２３個のアミノ酸シグナルペプチドを取り除くことによって生じる。典型的には、該前駆体型は、７４３個のアミノ酸を含む全長前駆体または全長Ｎａｇｌｕタンパク質とも呼ばれる。前駆体タンパク質が小胞体に入ると、Ｎ末端の２３個のアミノ酸が切断され、成熟型になる。このように、Ｎ末端の２３個のアミノ酸は、通常、Ｎａｇｌｕタンパク質活性に必要とされないと、考えられる。成熟型（配列番号１）のアミノ酸配列および典型的な野生型または天然起源ヒドＮａｇｌｕタンパク質の全長前駆体（配列番号２）を表１に示す。

このように、いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、好適な治療用部分は、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然起源のＮａｇｌｕタンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含むが、実質的なＮａｇｌｕタンパク質活性を保持している、修飾型成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質であり得る。このように、いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質の断片または一部を含む。

あるいは、本発明に好適な治療用部分は、全長Ｎａｇｌｕタンパク質である。いくつかの実施形態では、好適な治療用部分は、全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然起源の全長Ｎａｇｌｕタンパク質（例えば、配列番号２）と比較して、１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含むが、実質的なＮａｇｌｕタンパク質活性を保持している、修飾型全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質であり得る。このように、いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号２）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用部分は、全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質の断片または一部を含む。本明細書で用いる場合、全長Ｎａｇｌｕタンパク質は、典型的にはシグナルペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、標的化部分（例えば、リソソーム標的化配列）および／または膜透過ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的化配列および／または膜透過ペプチドは、治療用部分の内在部分（例えば、化学結合を介して、融合タンパク質を介して）である。いくつかの実施形態では、標的化配列は、マンノース−６−リン酸残基を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、ＩＧＦ−Ｉ残基を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、ＩＧＦ−ＩＩ残基を含む。
リソソーム標的化ドメイン

いくつかの実施形態では、治療用ドメイン（すなわち、Ｎａｇｌｕドメイン）は、リソソーム標的化を容易にするために修飾される。例えば、好適なＮａｇｌｕドメインは、マンノース−６−リン酸非依存性的様式でリソソームへのＮａｇｌｕドメインを標的とし得るリソソーム標的化部分に融合し得る。好適なリソソーム標的化ドメインは、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ、Ｋｉｆ、ＡｐｏＥ、ＴＡＴ、ＲＡＰおよびｐ９７ペプチドを含むペプチド類由来であってもよいが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、ＩＧＦ−ＩＩ受容体とも呼ばれるＣＩ−ＭＰＲを、マンノース−６−リン酸非依存的様式で結合するタンパク質、ペプチドまたは他の残基である。

いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＧＩＬＴタグは、野生型または天然起源の成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）である。
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）
ＡＹＲＰＳＥＴＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ

いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含んでいる修飾型成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩである。いくつかの実施形態では、ＧＩＬＴタグは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの断片である。特定の実施形態では、リソソーム標的化部分は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）の８〜６７個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失または内部欠失を含む。例えば、リソソーム標的化部分は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）のＮ末端（例えば、ｆｃ．２〜７）にアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、リソソーム標的化部分は、天然起源のヒトＩＧＦ−ＩＩと比較して、ＩＧＦ−Ｉ受容体などの他の受容体への結合親和性が減少した修飾型ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチドである。

種々のさらなるリソソーム標的化部分は、当技術分野で知られており、且つ本発明を実施するのに用いられることができる。例えば、特定のペプチドベースのリソソーム標的化部分は、米国特許第７，３９６，８１１号、同第７，５６０，４２４号および同第７，６２９，３０９号；米国出願公開番号２００３−００８２１７６号、同２００４−０００６００８号、同２００３−００７２７６１号、同２００４０００５３０９号、同２００５−０２８１８０５号、同２００５−０２４４４００号、および国際公開第ＷＯ０３／０３２９１３号、同第ＷＯ０３／０３２７２７号、同第ＷＯ０２／０８７５１０号、同第ＷＯ０３／１０２５８３号、同第ＷＯ２００５／０７８０７７号、同第ＷＯ２００９／１３７７２１号に記載されており、それらの開示全体を参照によって本明細書に組み込む。
リンカーまたはスペーサー

リソソーム標的化部分は、リソソーム酵素をコードするポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合する、または内部に挿入されることができる。リソソーム標的化部分は、リソソーム酵素ポリペプチドに直接融合することができる、またはリンカーもしくはスペーサーによってリソソーム酵素ポリペプチドから分離されることができる。アミノ酸リンカーまたはスペーサーは、通常、可動性であるように、または２つのタンパク質残基の間のα−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計される。リンカーまたはスペーサーは、配列ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＰ（配列番号５）、ＧＧＧＧＧＰ（配列番号６）などのように比較的短いこともあり得、または例えば、１０〜５０個（例えば、１０〜２０個、１０〜２５個、１０〜３０個、１０〜３５個、１０〜４０個、１０〜４５個、１０〜５０個）などの長いアミノ酸長でもあり得る。いくつかの実施形態では、種々の短いリンカー配列は、タンデム反復で存在し得る。例えば、好適なリンカーは、タンデム反復で存在するＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）の配列を構成する１以上のＧＡＰ配列をさらに含み得る。例えば、好適なリンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、好適なリンカーまたはスペーサーは、配列番号５の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を有し得る。

いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用タンパク質は、Ｍ６Ｐ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用タンパク質は、
ＣＩ−ＭＰＲに対してより高い結合親和性を有するビスリン酸化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態では、好適な酵素は、酵素あたりおよそ少なくとも２０％のビスリン酸化オリゴ糖のほぼ平均まで含有する。他の実施形態では、好適な酵素は、酵素あたり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビスリン酸化オリゴ糖を含有し得る。このようなビスリン酸化オリゴ糖は酵素上に天然に存在し得るが、酵素はこのようなオリゴ糖を保有するよう修飾され得る、ということに留意すべきである。例えば、好適な補充酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからリソソーム酵素上のα−１，２−連結マンノースの６’位置へのＮ−アセチルグルコサミン−Ｌ−リン酸の移動を触媒し得るある種の酵素により修飾され得る。このような酵素を産生し、使用するための方法および組成物は、例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄらによる米国特許第６，５３７，７８５号および米国特許第６，５３４，３００号（これらの記載内容を各々参照により本明細書に組み込む）に記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明に好適な治療用タンパク質は、グリコシル化が不十分である。本明細書で用いる場合、「グリコシル化が不十分」とは、その内部で、天然起源の酵素上に通常存在する１以上の糖鎖構造（例えば、Ｍ６Ｐ残基）が、除外、除去、修飾または遮蔽されているタンパク質または酵素を指す。グリコシル化が不十分なリソソーム酵素は、従来の哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）がグリコシル化するようにはタンパク質をグリコシル化しない宿主（例えば、細菌または酵母菌）内で産生され得る。例えば、宿主細胞によって産生されるタンパク質は、マンノース受容体によって認識される、または完全に非グリコシル化され得る末端マンノース、フコースおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン残基が欠けていることもある。いくつかの実施形態では、グリコシル化が不十分なリソソーム酵素は、哺乳類細胞または他の宿主内で産生され得るが、１以上の糖鎖残基（例えば、１以上のＭ６残基）を除去するため、または１以上の糖鎖残基を修飾もしくは遮蔽するために、化学処理または酵素処理され得る。そのような化学処理または酵素処理された酵素は、脱グリコシル化リソソーム酵素とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、タンパク質をグリコシル化する哺乳類細胞または他の細胞内で合成される場合、１以上の潜在的なグリコシル化部位は、リソソーム酵素をコードする核酸の変異によって除去され、それによって酵素のグリコシル化を減少させる。いくつかの実施形態では、酵素のグリコシル化のレベルが減少するおよび／または修飾されるように、リソソーム酵素は、分泌シグナルペプチド（例えば、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチド）を用いて産生され得る。グリコシル化が不十分なリソソソーム酵素または脱グリコシル化リソソーム酵素の例は、米国特許第７，６２９，３０９号および米国出願公開番号２００９００４１７４１号と同２００４０２４８２６２号に記載されており、それらすべての解除位を参照によって本明細書に組み込む。
タンパク質の産生

本発明に好適な治療用タンパク質は、例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）由来細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｃ１０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＶ−１細胞、ＨａＫ細胞、ＮＳ／Ｏ細胞およびＬ−９２９細胞などの細胞培養しやすい、およびポリペプチドを発現しやすい、いずれの哺乳類細胞または細胞型内で産生され得る。具体的な非限定例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞系（２９３細胞または浮遊培養で増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１（１９８０）； マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；Ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト細胞腫細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）。いくつかの実施形態では、酵素は、ＣＨＯ細胞内で産生される。いくつかの実施形態では、酵素は、エンドソームの酸性化欠損細胞系（例えば、ＥＮＤ３相補群由来のＣＨＯ−Ｋ１）などのＣＨＯ由来細胞内で産生される。

酵素は、例えば、昆虫（例えば、Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１、Ｈｉ５）植物（例えば、マメ科、穀類またはタバコ）、酵母（例えば、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および他の桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）または真菌などの種々の非哺乳類宿主細胞内でも発現し得る。

別の実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、それらの乳内でリソソーム酵素を産生することが示された。そのようなトランスジェニック非ヒト哺乳類は、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウシを含み得る。米国特許第６，１１８，０４５号および同第７，３５１，４１０号を参照されたい。各々を、それら全体を参照によって本明細書に組み込む。
くも膜下腔内送達

本発明による、Ｎａｇｌｕドメインを含む治療用タンパク質、すなわち補充酵素は、ＣＮＳに送達される。ＣＮＳ送達のために、これらに限定されるものではないが、実質内投与、側脳室内（ＩＣＶ）投与、髄腔内（例えば、ＩＴ−腰椎内、ＩＴ−大槽）投与、ならびにＣＮＳおよび／またはＣＳＦへの直接的または間接的な注射のための他の技術と経路を含む種々の技術および経路が用いられる。

いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に投与することにより、補充酵素はＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、ＣＳＦ中への所望の補充酵素を送達するために用いられる。本明細書で用いる場合、くも膜下腔内投与（くも膜下腔内注射とも呼ばれる）は、脊柱管（脊髄周囲のくも膜下腔内空隙）への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔あるいは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。代表的方法は、Ｌａｚｏｒｔｈｅｓら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１４３−１９２およびＯｍａｙａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１：１６９−１７９（これらの記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

本発明によれば、酵素は、脊柱管周囲の任意の領域で注射され得る。いくつかの実施形態では、酵素は、腰椎域または大槽中に注射されるか、あるいは脳室空隙中に脳室内注射される。本明細書で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎区域」という用語は、第三および第四腰椎（下方背部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。典型的には、腰部領域または腰椎区域を介したくも膜下腔内注射は、「腰椎ＩＴ送達」または「腰椎ＩＴ投与」としても言及される。「大槽」という用語は、頭蓋骨と脊椎の上部との間の開口部を介した小脳の周囲および下の空隙を指す。典型的には、大槽を介したくも膜下腔内注射は、「大槽送達」とも呼ばれる。「脳室」という用語は、脊髄の中央管と連続している脳中の空洞を指す。典型的には、脳室腔を介した注射は、脳室内大脳（ＩＣＶ）送達と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、本発明による「くも膜下腔内投与」または「くも膜下腔内送達」は、例えば、第三および第四腰椎（下方背部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域の間に送達される腰椎ＩＴ投与または送達を指す。腰椎ＩＴ投与または送達は、本発明による腰椎ＩＴ投与または送達が遠位脊柱管へのより良好な且つより有効な送達を提供するという点で大槽送達を上回って区別されるが、一方、大槽送達は、特に、典型的には遠位脊柱管に良好に送達しない、ということが意図される。
ＩＴ送達のための安定な処方物

いくつかの実施形態では、所望の酵素は、くも膜下腔内送達のために安定処方物中で送達される。本発明のある実施形態は、少なくとも一部は、本明細書に開示される種々の処方物が、ＣＮＳの標的化組織、細胞および／または細胞小器官への１つ以上の治療薬（例えば、酵素）の有効な送達および分布を促す、という発見に基づいている。特に、本明細書に記載される処方物は、高濃度の治療薬（例えば、タンパク質または酵素）を可溶化し得るし、ＣＮＳ構成成分および／または病因を有する疾患の処置のために対象のＣＮＳにこのような治療薬を送達するのに適している。本明細書に記載される組成物は、それを必要とする対象のＣＮＳに（例えばくも膜下腔内に）投与される場合、安定性改善および耐容性改善によりさらに特性化される。

本発明の前に、伝統的非緩衝化等張生理食塩水およびエリオットのＢ溶液（人工ＣＳＦ）が、典型的にはくも膜下腔内送達のために用いられた。エリオットのＢ溶液に対するＣＳＦの組成を表す比較は、以下の表２に含まれている。表２に示されているように、エリオットＢ溶液の濃度は、ＣＳＦの濃度と密接に類似している。しかしながら、エリオットのＢ溶液は、極度に低い緩衝剤濃度を含有し、したがって、特に長期間にわたって（例えば、貯蔵状態の間）、治療薬（例えばタンパク質）を安定化するために必要とされる適切な緩衝能力を提供し得ない。さらに、エリオットのＢ溶液は、いくつかの治療薬、特にタンパク質または酵素を送達するよう意図された処方物と非相溶性であり得るある種の塩を含有する。例えば、エリオットのＢ溶液中に存在するカルシウム塩は、タンパク質沈降を媒介し、それにより処方物の安定性を減少させ得る。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明によるくも膜下腔内送達に適した処方物は、合成または人工ＣＳＦではない。

いくつかの実施形態では、くも膜下腔内送達のための処方物は、それらが、それとともに処方される１つ以上の治療薬（例えば、組換えタンパク質）を安定化し、あるいはその分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。本明細書で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間にわたってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のうちのすべてまたは大多数）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間（例えば、好ましくは少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）にわたって査定され得る。処方物の状況では、安定処方物は、貯蔵時および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）の間、その中の治療薬が本質的にはその物理的および／または化学的完全性ならびに生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成、および電荷プロフィールの移動により測定され得る。

治療薬の安定性は、特別な重要性を有する。治療薬の安定性は、長期間にわたる治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性に関してさらに査定され得る。例えば、所定の時点での安定性は、早期時点（例えば、処方０日目）での安定性に対して、あるいは非処方治療薬に対して比較され得る。この比較の結果は、パーセンテージとして表される。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、長期間にわたって（例えば、室温で、または加速貯蔵条件下で、少なくとも６〜１２ヶ月間にわたって測定）、治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性の少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％または少なくとも５０％を保持する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、所望の酵素）は、本発明の処方物中で可溶性である。「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成するこのような治療薬の能力を指す。好ましくは、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。

したがって、くも膜下腔内投与に適した処方物は、種々の濃度で当該治療薬（例えば、酵素）を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な処方物は、約３００ｍｇ／ｍｌまで（例えば、約２５０ｍｇ／ｍｌまで、２００ｍｇ／ｍｌまで、１５０ｍｇ／ｍｌまで、１００ｍｇ／ｍｌまで、９０ｍｇ／ｍｌまで、８０ｍｇ／ｍｌまで、７０ｍｇ／ｍｌまで、６０ｍｇ／ｍｌまで、５０ｍｇ／ｍｌまで、４０ｍｇ／ｍｌまで、３０ｍｇ／ｍｌまで、２５ｍｇ／ｍｌまで、２０ｍｇ／ｍｌまで、１０ｍｇ／ｍｌまで）の濃度で当該タンパク質または酵素を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な処方物は、約０〜３００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１〜２５０ｍｇ／ｍｌ、約１〜２００ｍｇ／ｍｌ、約１〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約１〜１００ｍｇ／ｍｌ、約１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、約１０〜８０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜７０ｍｇ／ｍｌ、約１〜６０ｍｇ／ｍｌ、約１〜５０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約１〜３０ｍｇ／ｍｌ）の間の範囲の濃度で当該タンパク質または酵素を含有し得る。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内送達に適した処方物は、およそ１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌまたは３００ｍｇ／ｍｌの濃度で、当該タンパク質を含有し得る。

いくつかの実施形態では、等張溶液が用いられる。いくつかの実施形態では、わずかに高張性の溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に、３００ｍＭまで（例えば、２５０ｍＭまで、２００ｍＭ、１７５ｍＭ、１５０ｍＭ、１２５ｍＭまで）の塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に３％まで（例えば、２．４％、２．０％、１．５％、１．０％まで）のスクロース）は、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。いくつかの実施形態では、適切なＣＮＳボーラス処方物組成物は、生理食塩水（水中１５０ｍＭのＮａＣｌ）である。

多数の治療薬、特に本発明のタンパク質および酵素は、本発明の薬学的組成物中でそれらの溶解性および安定性を保持するために、制御されたｐＨおよび特定の賦形剤を要する。以下の表３は、本発明のタンパク質治療薬の溶解性および安定性を保持するために重要であるとみなされるタンパク質処方物のある代表的態様を確認するのに役立つ。

薬学的組成物のｐＨは、水性薬学的組成物中の治療薬（例えば、酵素またはタンパク質）の溶解度を変更し得る付加的因子である。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有する。いくつかの実施形態では、本発明による組成物は、約４．０〜８．０、約５．０〜７．５、約５．５〜７．０、約６．０〜７．０および約６．０〜７．５の間の上記組成物の最適ｐＨを保持するのに十分な量の緩衝剤を含有する。他の実施形態では、緩衝液は、約５０ｍＭまで（例えば、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭまで）のリン酸ナトリウムを含む。適切な緩衝剤としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（“トリス”）が挙げられる。適切な緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および処方物の所望の等張性によって、約１ｍＭから約１００ｍＭまで、または約３ｍＭから約２０ｍＭまでであり得る。いくつかの実施形態では、適切な緩衝剤は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、処方物は、処方物を等張に保つために等張剤を含有する。ＩＴ送達と結びつけて用いられる場合、「等張の」とは、当該処方物が本質的にはヒトＣＳＦと同じ等張性を有することを意味する。等張処方物は、一般的に、約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。等張度は、例えば、蒸気圧または凝固点型浸透圧計を用いて測定され得る。代表的等張剤としては、グリシン、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウムおよびアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、適切な等張剤は、約０．０１〜５重量％（例えば、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０または５．０重量％）の濃度で、処方物中に存在し得る。

いくつかの実施形態では、処方物は、タンパク質を保護するために安定化剤を含有し得る。典型的には、適切な安定化剤は、非還元糖、例えばスクロース、ラフィノース、トレハロース、またはアミノ酸、例えばグリシン、アルギニンおよびメチオニンである。処方物中の安定化財の量は、一般的に、処方物が等張であるような量である。しかしながら、高張処方物も適切であり得る。さらに、安定化剤の量は、治療薬の許容不可能な量の分解／凝集が起きるほど低すぎてはならない。処方物中の安定化剤の濃度の例は、約１ｍＭ〜約４００ｍＭ（例えば、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、および約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、あるいは０．１〜１５重量％（例えば、１〜１０重量％、５〜１５重量％、５〜１０重量％）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約１：１である。他の実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約０．１：１、０．２：１、０．２５：１、０．４：１、０．５：１、１：１、２：１、２．６：１、３：１、４：１、５：１、１０；１、ｏｒ ２０：１であり得る。凍結乾燥に適切であるいくつかの実施形態では、安定化剤はリオプロテクタントでもある。

本発明の薬学的組成物、処方物および関連方法は、対象のＣＮＳに種々の治療薬を（例えば、くも膜下腔内、脳室内または槽内に）送達するために、ならびに関連疾患の処置のために有用である。本発明の薬学的組成物は、リソソーム蓄積症に罹患している対象にタンパク質および酵素を送達するために特に有用である。

いくつかの実施形態では、処方物に界面活性剤を付加することが望ましい。界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタルニドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−または二ナトリウムメチルオフェイル−タウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８等）が挙げられる。典型的には、付加される界面活性剤の量は、それがタンパク質の凝集を減少させ、粒子の形成または泡立ちを最小限にするような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１〜０．５％（例えば、約０．００５〜０．０５％または０．００５〜０．０１％）の濃度で処方物中に存在し得る。特に、界面活性剤は、約０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％等の濃度で処方物中に存在し得る。

いくつかの実施形態では、適切な処方物は、特に凍結乾燥処方物のために、１つ以上のバルク剤をさらに含み得る。「バルク剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する。例えばバルク剤は、凍結乾燥ケークの外観を改良し得る（例えば、本質的に均一な凍結乾燥ケーク）。適切なバルク剤の例としては、塩化ナトリウム、ラクトース、マンニトール、グリシン、スクロース、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。バルク剤の濃度の例は、約１％〜約１０％（例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％および１０．０％）である。

本発明による処方物は、品質分析、再構成時間（凍結乾燥された場合）、再構成の質（凍結乾燥された場合）、高分子量、水分およびガラス転移温度に基づいて査定され得る。典型的には、タンパク質の質および生成物分析は、例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換−ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回析（ＸＲＤ）、変調型示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、蛍光、紫外線吸収、ネフェロメトリー、毛細管電気泳動（ＣＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその組合せ（これらに限定されない）を含めた方法を用いる生成物分解率分析を包含する。いくつかの実施形態では、本発明による生成物の評価は、外観（液体またはケーク外観）を評価するステップを包含する。

一般的に、処方物（凍結乾燥化または水性）は、室温で長期間保存され得る。貯蔵温度は、典型的には、０℃〜４５℃（例えば、４℃、２０℃、２５℃、４５℃等）の範囲であり得る。処方物は、吸うかげる〜数年の間貯蔵され得る。貯蔵時間は、一般的に、２４ヶ月、１２ヶ月、６ヶ月、４．５ヶ月、３ヶ月、２ヶ月または１ヶ月である。処方物は、投与のために用いられる容器中に直接貯蔵されて、移送ステップを排除し得る。

処方物は、凍結乾燥容器（凍結乾燥される場合）中に直接貯蔵され得るが、これは、再構成容器としても機能して、移送ステップを排除し得る。代替的には、凍結乾燥物質処方物は、貯蔵のためにより小さい増分で測定され得る。貯蔵は、一般的に、タンパク質の分解を生じさせる環境、例えば日光、紫外線他の形態の電磁放射線、過剰な熱または寒冷、休息名熱ショック、ならびに機械的衝撃への曝露（これらに限定されない）を避けるべきである。

いくつかの実施形態では、本発明による処方物は、液体または水性形態である。いくつかの実施形態では、本発明の処方物は凍結乾燥される。このような凍結乾燥処方物は、対象への投与の前に、それに１つ以上の希釈剤を付加することにより、再構成され得る。適切な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌性水および滅菌生理食塩溶液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、再構成時、そこに含有される治療薬は安定で、可溶性であり、そして対象への投与時に耐容性を実証する。

本発明の薬学的組成物は、それらの耐容性により特性化される。本明細書で用いる場合、「耐容可能な」および「耐容性」という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。
くも膜下腔内送達のための装置

本発明によるくも膜下腔内送達のために、種々の装置が用いられ得る。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与のための装置は、流体アクセスポート（例えば注射用口）；流体アクセスポートと流体連絡する第一流出口、および脊髄中への挿入のために設計された第二流出口；ならびに脊髄における中空体の挿入を固定するための固定機構を含有する。図４２に示した非限定例として、適切な固定機構は、中空体の表面に載せられる１つ以上のノブ、および１つ以上のノブを覆って、中空体が脊髄から滑り落ちないようにする調整可能な縫合リングを含有する。種々の実施形態では、流体アクセスポートはレザバーを含む。いくつかの実施形態では、流体アクセスポートは、機械的ポンプ（例えば、注入ポンプ）を含む。いくつかの実施形態では、埋込みカテーテルは、レザバー（例えば、ボーラス送達のため）または注入ポンプと連結される。流体アクセスポートは、埋め込まれるかまたは外側に存在し得る。

いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち、緩徐ボーラス投与）により、またはポート・カテーテル送達系（すなわち注入またはボーラス投与）を介して実施され得る。いくつかの実施形態では、カテーテルは腰椎の弓板間に挿入され、尖端は、包膜空隙に所望のレベル（一般的にＬ３〜Ｌ４）に装填される（図４３Ａ〜Ｃ）。

静脈内投与に比して、くも膜下腔内投与に適した単回用量投与容積は典型的に小さい。典型的には、本発明によるくも膜下腔内送達は、ＣＳＦの組成の平衡、ならびに対象の頭蓋内圧を保持する。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内送達は、対象からのＣＳＦの対応する除去がない時に実施される。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、例えば約１０ｍｌ、８ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１．５ｍｌ、１ｍｌまたは０．５ｍｌ未満であり得る。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、約０．５〜５ｍｌ、０．５〜４ｍｌ、０．５〜３ｍｌ、０．５〜２ｍｌ、０．５〜１ｍｌ、１〜３ｍｌ、１〜５ｍｌ、１．５〜３ｍｌ、１〜４ｍｌまたは０．５〜１．５ｍｌであり得る。いくつかの実施形態では、本発明によるくも膜下腔内送達は、所望量のＣＳＦを除去するステップを最初に包含する。いくつかの実施形態では、約１０ｍｌ未満（例えば、約９ｍｌ、８ｍｌ、７ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ未満）のＣＳＦが先ず除去された後、ＩＴ投与がなされる。それらの場合、適切な単回用量投与容積は、例えば約３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌまたは２０ｍｌより大きい。

治療用組成物のくも膜下腔内投与を実行するために、種々の他の装置が用いられ得る。例えば、所望の酵素を含有する処方物は、髄膜癌腫症のための薬剤をくも膜下腔内投与するために一般に用いられるオンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）レザバーを用いて投与され得る（Ｌａｎｃｅｔ ２：９８３−８４，１９６３）。さらに具体的には、この方法では、脳室チューブは前角中に形成される穴を通して挿入され、頭皮下に設置されるオンマヤレザバーに連結され、レザバーは皮下穿刺されて、レザバー中に注入される補充されるべき特定酵素をくも膜下腔内送達する。個体への治療用組成物または処方物のくも膜下腔内投与のための他の装置は、米国特許第６，２１７，５５２号（この記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。代替的には、薬剤は、例えば単回注射または連続注入により、くも膜下腔内投与され得る。投薬処置は、単回用量投与または多数回用量投与の一形態であり得る、と理解されるべきである。

注射のためには、本発明の処方物は、液体溶液中に処方され得る。さらに、酵素は固体形態で処方され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も包含される。注射は、例えば、酵素のボーラス注射または連続注入（例えば、注入ポンプを用いる）の形態であり得る。

本発明の一実施形態では、酵素は、対象の脳への外側脳室注射により投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に作られる穿頭孔を通してなされ得る。別の実施形態では、酵素および／または他の薬学的処方物は、対象の脳室中に外科的に挿入されるシャントを通して投与される。例えば、注射は、より大きい外側脳室中になされ得る。いくつかの実施形態では、より小さい第三および第四脳室への注射もなされ得る。

さらに別の実施形態では、本発明に用いられる薬学的組成物は、対象の大槽または腰椎区域への注射により投与される。

本発明の方法の別の実施形態では製薬上許容可能な処方物は、製薬上許容可能な処方物が対象に投与された後、少なくとも１、２、３、４週間またはそれ以上の間、対象に、本発明で用いられる酵素または他の薬学的組成物の持続性送達、例えば「緩徐放出」を提供する。

本明細書で用いる場合、「持続性送達」という用語は、投与後、長期間にわたって、好ましくは少なくとも数日間、１週間または数週間、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明の薬学的処方物を連続送達することを指す。組成物の持続性送達は、例えば、長時間にわたる酵素の連続治療効果により実証され得る（例えば、酵素の持続性送達は、対象における貯蔵顆粒の量の連続的低減により実証され得る）。代替的には、酵素の持続性送達は、長時間にわたるｉｎ ｖｉｖｏでの酵素の存在を検出することにより実証され得る。
標的組織への送達

上記のように、本発明の意外な且つ重要な特徴の１つは、本発明の方法を用いて投与される治療薬、特に補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）、ならびに本発明の組成物は、脳表面全体に効果的に且つ広範囲に拡散し、脳の種々の層または領域、例えば深部脳領域に浸透し得る、という点である。さらに、本発明の方法および本発明の組成物は、現存するＣＮＳ送達方法、例えばＩＣＶ注射では標的化するのが困難である脊髄の出の組織、ニューロンまたは細胞、例えば腰部領域に補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）を効果的に送達する。さらに、本発明の方法および組成物は、血流ならびに種々の末梢器官および組織への十分量の補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）を送達する。

したがって、いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、対象の中枢神経系に送達される。いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、脳、脊髄および／または末梢期間の標的組織の１つ以上に送達される。本明細書で用いる場合、「標的組織」という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠損リソソーム酵素が正常では発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織としては、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹り易い患者において、例えば組織の細胞リソソーム中に貯蔵される酵素基質が検出可能量でまたは異常に高い量で存在する組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、欠損リソソーム酵素が抗レベルで正常では発現される組織が挙げられる。本明細書で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。
脳標的組織

概して、脳は、異なる領域、層および組織に分けられ得る。例えば、髄膜組織は、脳を含めた中枢神経系を包む膜系である。髄膜は、３つの層、例えば硬膜、くも膜および軟膜を含有する。概して、髄膜の、ならびに脳脊髄液の主な機能は、脳神経系を保護することである。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、髄膜の１つ以上の層に送達される。

脳は、大脳、小脳および脳幹を含めた３つの主な細区画を有する。大脳半球は、ほとんどの他の脳構造の上に位置し、皮質層で覆われている。大脳の下層には脳幹が横たわり、これは茎に似ており、その上に大脳が取り付けられている。脳の後部、大脳の下および脳幹の背後には、小脳が存在する。

脳の正中線近くおよび中脳の上に位置する間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上部、腹側視床および視蓋腹部を含有する。中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）は、ｍｉｄｂｒａｉｎとも呼ばれ、視蓋、外被、ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｅｓｏｃｏｅｌｉａ、ならびに大脳脚、赤核および第三脳神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、警戒および温度調節に関連する。

脳を含めた中枢神経系の組織の領域は、組織の深さに基づいて特性化され得る。ＣＮＳ（例えば脳）組織は、表面または浅在組織、中深部組織および／または深部組織として特性化され得る。

本発明によれば、治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、対象において処置されるべき特定疾患に関連した任意の適切な脳標的組織（単数または複数）に送達され得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、表面および浅在脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、中深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、表面または浅在脳標的組織、中深部脳標的組織および／または深部脳標的組織の組合せに送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、脳の外表面の少なくとも４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍまたはそれより下（または内側）の深部脳組織に送達される。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、大脳の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、フィルヒョー・ロバン腔隙、ＶＲ腔隙内の血管、海馬、脳の下面の視床下部の部分、視神経および視索、嗅球および嗅突起ならびにその組合せから選択される。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、大脳の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍより下（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍ）に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、大脳皮質リボンを包含する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、間脳（例えば、視床下部、視床、腹側視床および視床腹部等）、後脳、レンズ核、基底核、尾状核、被核、扁桃、淡蒼球およびその組合せの１つ以上を包含する。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、小脳の１つ以上の組織に送達される。ある実施形態では、小脳の１つ以上の標的化組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚およびその組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の１つ以上の深部組織、例えばプルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層に比して深部）および深部小脳核組織（これらに限定されない）に送達される。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、脳幹の１つ以上の組織に送達される。いくつかの実施形態では、脳幹の１つ以上の標的化組織は、脳幹白質組織および／または脳幹核組織を包含する。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、種々の脳組織、例えば灰白質、白質、脳室周囲域、軟膜−くも膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または延髄の深部領域、およびその組合せ（これらに限定されない）に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脳中の種々の細胞、例えばニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞（これらに限定されない）に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、深部白質の乏突起グリア細胞に送達される。
脊髄

概して、脊髄の領域または組織は、組織の深度に基づいて特性化され得る。例えば、脊髄組織は、表面または浅在組織、中深部組織、および／または深部組織として特性化され得る。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、脊髄の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、軟膜および／または白質路を含有する。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、脊髄の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内部に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄灰白質および／または上衣細胞を含有する。

いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、脊髄のニューロンに送達される。
末梢標的組織

本明細書で用いる場合、末梢器官または組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部ではない任意の器官または組織を指す。末梢標的組織としては、血管系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣および精巣が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、末梢標的組織の１つ以上に送達される。
生体分布および生物学的利用能

種々の態様において、標的組織に一旦送達されると、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、細胞内に局在化される。補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞のようなニューロン）のエクソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリアまたは空胞に局在化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与酵素は、酵素が血管周囲腔隙内に移動するよう（例えば、拍動補助対流機構により）、移動力学を実証する。さらに、投与タンパク質または酵素と神経細繊維との会合に関する活性軸索輸送機構も、中枢神経系の深部組織中への、くも膜下腔内投与タンパク質または酵素の分布に寄与し得るし、そうでなければそれを助長し得る。

いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、本明細書に記載される種々の標的組織において、治療的または臨床的有効レベルまたは活性を達成し得る。本明細書で用いる場合、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織において治療作用を付与するのに十分なレベルまたは活性である。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定）または主観的（すなわち、対象が作用の指標または感覚を提示する）であり得る。例えば、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織における疾患に伴う症候（例えば、ＧＡＧ貯蔵）を改善するのに十分である酵素レベルまたは活性であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、標的組織における対応するリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％である酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、対照（例えば、処置を伴わない内因性レベルまたは活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、標的組織中で、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの酵素レベルまたは活性の増加を達成し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腰部領域を標的化するために特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、少なくとも約５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの腰部領域における酵素レベルまたは活性の増加を達成し得る。

概して、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、ＣＳＦならびに脳、脊髄および末梢器官の標的組織中で十分に長い半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、少なくとも約３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、３日まで、７日まで、１４日まで、２１日まで、または１ヶ月までの半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、投与の１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間または１週間後に、ＣＳＦまたは血流中に検出可能なレベルまたは活性を保持し得る。検出可能なレベルまたは活性は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて決定され得る。

ある実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、投与後（例えば、対象への薬学的組成物のくも膜下腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、対象のＣＮＳ組織および細胞中で、少なくとも３０μｇ／ｍｌの濃度を達成する。ある実施形態では、本発明に従って送達される補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、対象の標的化組織または細胞（例えば、脳組織またはニューロン）中で、このような対象への投与後（例えば、対象へのこのような薬学的組成物のくも膜下腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも０．５μｇ／ｍｌの濃度を達成する。
くも膜下腔内投与によるサンフィリポ症候群の処置

サンフィリポ症候群、すなわちムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰ ＩＩＩ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する酵素の欠乏によって特徴付けられる稀な遺伝性疾患である。酵素が不在の場合、部分的に分解したＧＡＧ分子は、体内から除去されることができなく、種々の組織のリソソーム内に蓄積し、進行性の広範な体性機能障害を生じさせる（Ｎｅｕｆｅｌｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｚｅｒ，２００１）。

ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型と名付けられたＭＰＳ ＩＩＩの４つの異なる型が同定されている。各型は、ＧＡＧヘパラン硫酸の分解に関与する４種類の酵素の１つの欠損を表す。すべての型には、特徴的な粗い顔つき、肝脾腫大、角膜薄濁および骨格の変形を含む同じ臨床症状を様々な程度で含まれる。しかし、中でも注目すべきは、重度でかつ進行性の認識能力の喪失である。これは、ニューロン内のヘパラン硫酸の蓄積だけでなく、ＧＡＧの一次的蓄積に起因するガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３およびＧＤ２のその後の上昇にも関係している（Ｗａｌｋｌｅｙ １９９８）。

ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ；サンフィリポＢ疾患）は、酵素アルファ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）の欠乏により特性化される常染色体劣性障害である。この酵素の非存在下では、ＧＡＧヘパランスルフェートはニューロンおよびグリア細胞のリソソーム中に蓄積するが、脳の外側には余り蓄積しない。

この障害の限定性臨床的特徴は中枢神経系（ＣＮＳ）変性であって、これにより、主要な発達里程標石を失い、あるいはそれを達成できなくなる。進行性認知低下は、痴呆および若年死亡率を最高度に高める。当該疾患は、典型的には、幼児において発現し得、且つ罹患した個体の寿命は、通常、１０代後半から２０代前半を超えることはない。

本発明の組成物および方法を用いて、サンフィリポＢを患う、または同型に感受性の高い個体を有効に処置し得る。本明細書で用いる場合、「処置する」または「処置」という用語は、当該疾患に伴う１つ以上の症候の寛解、当該疾患の１つ以上の症候の発症の予防または遅延、および／または当該疾患の１つ以上の症候の重症度または頻度の低下を指す。

いくつかの実施形態では、処置は、サンフィリポＢ患者における神経学的障害の重症度および／または発生率を部分的にまたは完全に緩和し、寛解し、軽減し、抑制し、発症を遅延し、重症度および／または発生率を減少させることを指す。本明細書で用いる場合、「神経学的障害」という用語は、中枢神経系（例えば、脳および脊髄）の機能障害に伴う種々の症候を包含する。神経学的障害の症候としては、例えば、発育遅延、進行性認知障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠乏、多動性障害、攻撃性および／または睡眠障害等が挙げられ得る。

したがって、いくつかの実施形態では、処置は、種々の組織におけるリソソーム貯蔵（例えば、ＧＡＧ）の減少を指す。いくつかの実施形態では、処置は、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるリソソーム貯蔵の減少を指す。ある実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍減少する。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、ＬＡＭＰ−１染色法によって決定される。

いくつかの実施形態では、処置は、ニューロン（例えば、プルキンエ細胞を含有するニューロン）における空胞形成の減少を指す。ある実施形態では、ニューロンにおける空胞形成は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、空胞形成は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍減少する。

いくつかの実施形態では、処置は、種々の組織内のＮａｇｌｕ酵素活性の増加を指す。いくつかの実施形態では、処置は、脳標的組織、脊髄神経ニューロンおよび／または末梢標的組織内のＮａｇｌｕ酵素活性の増加を指す。いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性は、対照と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４０００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９０００％ １０００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性は、対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する。いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性の増加は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、Ｎａｇｌｕ酵素活性は、腰部領域で増加する。いくつかの実施形態では、腰部領域でのＮａｇｌｕ酵素活性の増加は、少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたはそれ以上である。

ある実施形態では、本発明による処置は、リソソーム蓄積症に関連した１つ以上の病理学的または生物学的マーカーの存在、または代替的にはその蓄積の減少（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上の減少）、または完全排除を生じる。このような減少または排除は、ＣＮＳの細胞および組織（例えば、ニューロンおよび乏突起グリア細胞）において特に明らかであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対象への投与時に、本発明の薬学的組成物は、対象のＣＮＳ細胞および組織において（例えば、大脳皮質、小脳、尾状核および被殻、白質および／または視床において）、バイオマーカーリソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）の蓄積の減少を実証するかまたは達成する。ＬＡＭＰ１は、リソソーム膜において高度に発現される糖タンパク質であり、その存在は、リソソーム蓄積症患者を増加させる（Ｍｅｉｋｌｅ，ら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．（１９９７）４３：１３２５−１３３５）。したがって、リソソーム蓄積症を有する患者におけるＬＡＭＰ１の存在または非存在（例えば、ＬＡＭＰ染色により確定される）は、リソソーム活性の有用な指標、ならびにリソソーム蓄積症の診断およびモニタリングの両方のためのマーカーを提供し得る。

したがって、本発明のいくつかの実施形態は、疾患（例えば、リソソーム蓄積症）に関連する１つ以上の病理学的または生物学的マーカーの存在または蓄積を減少するか、そうでなければ排除する方法に関する。同様に、本発明のいくつかの実施形態は、リソソーム蓄積症に関連した１つ以上の病理学的または生物学的マーカー（例えばＬＡＭＰ）の分解（または分解速度）を増加させる方法に関する。

いくつかの実施形態では、処置は、認知能力の喪失の進行低減を指す。ある実施形態では、認知能力の喪失の進行は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、処置は、発育遅延の減少を指す。ある実施形態では、発育遅延は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上減少する。

いくつかの実施形態では、処置は、生存（例えば、生存時間）増大を指す。例えば、処置は、患者の平均余命増大を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、処置を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約５％より多く、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、処置を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約６か月より長く、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、約１１か月、約１２か月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、患者の長期間生存を生じる。本明細書で用いる場合、「長期間生存」という用語は、約４０年、４５年、５０年、５５年、６０年またはそれより以上の生存時間または平均余命を指す。

「改善する」、「増加する」または「減少する」という用語は、本明細書で用いる場合、対照と対比する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な対照は、基線測定値、例えば、本明細書に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書に記載される処置の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値である。「対照個体」は、処置されている個体とほぼ同一年齢および／または性別である、サンフィリポＢに苦しむ個体である（処置個体および対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。

処置されている個体（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は、サンフィリポＢを有するかまたはサンフィリポＢを発症する可能性を有する個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。個体は、残留内因性Ｎａｇｌｕ発現および／または活性を有し得るし、あるいは測定可能な活性を有さない。例えば、サンフィリポＢを有する個体は、正常Ｎａｇｌｕ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満であるＮａｇｌｕ発現レベルを有し得る。

いくつかの実施形態では、個体は最近、疾患と診断された個体である。典型的には、早期治療（診断後にできるだけ早く開始する治療）は、疾患の影響を最小化して、治療の有益性を最大にするために重要である。
免疫寛容

一般的に、本発明による補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）のくも膜下腔内投与は、対象において重篤な副作用を生じない。本明細書で用いる場合、重症副作用は、実質的免疫応答、毒性または死（これらに限定されない）を誘導する。本明細書で用いる場合、「実質的免疫応答」という用語は、重症または重篤免疫応答、例えば適応Ｔ細胞免疫応答を指す。

したがって、多くの実施形態において、本発明の方法は、同時免疫抑制剤療法（すなわち、前処置／前状態調節として、あるいは当該方法と平行して用いられる任意の免疫抑制剤療法）を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、処置されている対象における免疫寛容誘導を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤を用いる対象の前処置または前状態調節を包含しない。

いくつかの実施形態では、治療薬のくも膜下腔内投与は、これらの作用物質に対する免疫応答を高め得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵素補助療法に対して寛容な補助酵素を患者に接種させることが有用であり得る。免疫寛容は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて誘導され得る。例えば、Ｔ細胞免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）および抗増殖剤、例えばアザチオプリン（Ａｚａ）を、低用量の所望の補充酵素の毎週くも膜下腔内注入と組合せた初期３０〜６０日レジメンが、用いられ得る。

当業者に既知の任意の免疫抑制剤は、本発明の組合せ療法と一緒に用いられ得る。このような免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗ＴＮＦ剤、例えばエタネルセプト（例えば、Ｍｏｄｅｒ，２０００，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４，２８０−２８４；Ｎｅｖｉｎｓ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２，１４６−１５０；Ｋｕｒｌｂｅｒｇら，２０００，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１，２２４−２３０；Ｉｄｅｇｕｃｈｉら，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９５，２１７−２２６；Ｐｏｔｔｅｒら，１９９９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７５，１５９−１７４；Ｓｌａｖｉｋら，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９，１−２４；Ｇａｚｉｅｖら，１９９９，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５，６８９−６９６；Ｈｅｎｒｙ，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３，０９−２２０；Ｇｕｍｍｅｒｔら，１９９９，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０，１３６６−１３８０；Ｑｉら，２０００，ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９， １２７５−１２８３参照）が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＩＬ２受容体（アルファ−サブユニット）抗体ダクリズマブ（例えば、ゼナパックス ＴＭ）（これは、移植患者において有効であることが実証されている）も、免疫抑制剤として用いられ得る （例えば、Ｗｉｓｅｍａｎら，１９９９，Ｄｒｕｇｓ ５８，１０２９−１０４２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら，２０００，Ｎ．Ｅｎｇｌ Ｊ．Ｍｅｄ．３４２，６１３−６１９；Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉら，１９９９，Ｄｒｕｇｓ Ｒ．Ｄ．１，５５−６０；Ｂｅｒａｒｄら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ １９，１１２７−１１３７；Ｅｃｋｈｏｆｆら，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９，１８６７−１８７２；Ｅｋｂｅｒｇら，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．１３，１５１−１５９参照）。付加的免疫抑制剤としては、抗ＣＤ２（Ｂｒａｎｃｏら，１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８，１５８８−１５９６；Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２，４０６６−４０７１）、抗ＣＤ４（Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａら，２０００，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４３，６３８−６４４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２，１３８−１５２）および抗ＣＤ４０リガンド（Ｈｏｎｇら，２０００，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０，１０８−１２５；Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３３４５−３３５２；Ｉｔｏら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，１２３０−１２３５）が挙げられるが、これらに限定されない。
投与

本発明の方法は、本明細書に記載される治療有効量の補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）の単回ならびに反復投与を意図する。補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、対象の状態の性質、重症度および程度によって、一定間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療有効量の補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）は、一定間隔で（例えば、年１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週）、定期的にくも膜下腔内投与され得る。

いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腸管外、経皮的、または経筋肉的に（例えば、経口的または経鼻的に））と組み合わせで用いられ得る。いくつかの実施形態では、他の投与経路（例えば、静脈内投与）は、隔週、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年投与以下の頻度で実施され得る。

本明細書で用いる場合、「治療有効量」という用語は、主として、本発明の薬学的組成物中に含有される治療薬の総量に基づいて確定される。一般的に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益（例えば、根元的疾患または症状を処置し、調整し、治癒し、防止し、および／または改善すること）を達成するのに十分である。例えば、治療有効量は、所望の治療的および／または予防的作用を達成するのに十分な量、例えばリソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調整し、それによりこのようなリソソーム蓄積症またはその症候を処置する（例えば、対象への本発明の組成物の投与後の、「ゼブラ体」の存在または出現の、あるいは細胞空胞形成の減少または排除）ために十分な量であり得る。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療薬（例えば、組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特質によって決まる。このような特質としては、対象の症状、疾患重症度、全身健康状態、年齢、性別および体重が挙げられる。これらのおよびその他の関連因子によって、適切な投与量を、当業者は容易に決定し得る。さらに、最適投与量範囲を同定するために、客観的および主観的検定がともに任意に用いられ得る。

治療有効量は、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで一般に投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関しては、治療有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者のための具体的治療有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば処置されている障害および障害の重症度；用いられる具体的薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食餌；投与時間；投与経路、および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝速度；処置の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような因子によって決まり得る。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜５００ｍｇ／ｋｇ脳重量、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜４００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜３００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜２００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜１００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜９０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜８０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜７０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜６０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜５０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜４０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜３０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜２５ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜２０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜１５ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜１０ｍｇ／ｋｇ脳重量の範囲である。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約０．５ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約１．０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約３ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約５ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約１０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約１５ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約２０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約３０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約４０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約６０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約７０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約８０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約９０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約１００ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約１５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約２００ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約２５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約３００ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約３５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約４００ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約４５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より多く、約５００ｍｇ／ｋｇ脳重量より多い。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、ｍｇ／体重１ｋｇによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重は相関し得る（Ｄｅｋａｂａｎ ＡＳ．“Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｆｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｔｏ ｂｏｄｙ ｈｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔｓ，”Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ １９７８；４：３４５−５６）。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、表４に示されるように換算され得る。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重に基づいた治療有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃに換算され得る。例えば、成人におけるＣＳＦの容積は約１５０ｍＬである（Ｊｏｈａｎｓｏｎ ＣＥ，ら，“Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｒｅｓ．２００８ Ｍａｙ １４；５：１０）。したがって、成人への０．１ｍｇ〜５０ｍｇの単一用量注射は、成人では約０．０１ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃ（５０ｍｇ）用量である。

任意の特定の対象に関して、具体的な投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに酵素補充療法の投与を施すかまたは指図する専門家の判断によって経時的に調整されるべきであり、そして本明細書に記述される投与量範囲は単なる例であって、本発明の範囲または実行を限定するものではない、とさらに理解されるべきである。
キット

本発明はさらに、本発明の処方物を含有するキットまたは他の製品を提供し、そしてその再構成（凍結乾燥された場合）および／または使用のための機器を提供する。キットまたはその他の製品としては、容器、ＩＤＤＤ、カテーテル、ならびにくも膜下腔内投与および関連外科手術に有用な任意のその他の物質、装置または設備が挙げられ得る。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器（薬剤充填済み注射器）、アンプル、カートリッジ、レザバーまたはｌｙｏ−ｊｅｃｔｓが挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから作られ得る。いくつかの実施形態では、容器は薬剤充填済み注射器である。適切な薬剤充填済み注射器としては、ベイクドシリコーン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器またはシリコーンを含有しないプラスチック樹脂注射器が挙げられるが、これらに限定されない。

典型的には、容器は、処方物、ならびに再構成および／または使用に関する指示を示し得る容器上の、または容器に付随したラベルを保持し得る。例えば、ラベルは、処方物が上記のようなタンパク質濃度に再構成される、ということを示し得る。ラベルはさらに、処方物が、例えばＩＴ投与のために有用であるかまたは意図される、ということを示し得る。いくつかの実施形態では、容器は、補充酵素（例えば、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質）を含有する単一用量の安定処方物を含有し得る。種々の実施形態において、単一用量の安定処方物は、約１５ｍｌ未満、１０ｍｌ、５．０ｍｌ、４．０ｍｌ、３．５ｍｌ、３．０ｍｌ、２．５ｍｌ、２．０ｍｌ、１．５ｍｌ、１．０ｍｌまたは０．５ｍｌの容量で存在する。代替的には、処方物を保持するよう基は、多数回使用バイアルであって、これは、処方物の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にし得る。キットまたは他の製品はさらに、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、生理食塩水、緩衝化生理食塩水）を含む第二容器を包含し得る。希釈剤および処方物の混合時に、再構成化処方物中の最終タンパク質濃度は、一般的に、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）である。キットまたは他の製品はさらに、商業的および使用者の見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、ＩＤＤＤ、カテーテル、注射器および使用説明書を伴う添付文書を包含し得る。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。引用文献はすべて、参照により本明細書に組み込む。

実施例
実施例１：ｒｈＮａｇｌｕタンパク質およびＮａｇｌｕ融合タンパク質の発現
本実施例は、髄腔内注射を通してサンフィリポＢ患者の中枢神経系への直接投与を目的とする組換えヒトＮａｇｌｕタンパク質の開発を示す。

サンフィリポＢ型（サンフィリポＢ）は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）の欠損に起因する常染色体劣性遺伝障害である。Ｎａｇｌｕは、ヘパリン硫酸分解経路でオリゴ糖の非還元末端からα−Ｎ−アセチルグルコサミンを除去する酵素である。Ｎａｇｌｕをコードしているヒト遺伝子は、染色体１７ｑ２１．１上に長さ８．２ｋｂ以上にわたる６個のエクソンを有する。ヒトＮａｇｌｕは、シグナルペプチドを含む７４３個のアミノ酸の前駆体として、細胞内で合成される。Ｎａｇｌｕの全長アミノ酸配列は、以下の表５に示す：

該タンパク質が小胞体に入ると、２３個のアミノ酸シグナルペプチドが除去される。結果として生じる成熟Ｎａｇｌｕタンパク質は、硫酸ヘパリンの酵素の分解が起こるリソソームに分別されるか、または細胞外間隙に分泌される。成熟組換えヒトＮａｇｌｕの分子量は、グリコシル化を含まない８０．２ｋＤａとグリコシル化の付加重量を含む約９３．４ｋＤａである。その中のアミノ酸残基１〜１２３が切断されている成熟Ｎａｇｌｕタンパク質配列は、以下の表６に示す。

組換えヒトＮａｇｌｕ（ｒｈＮａｇｌｕ）を生成するために、ヒトＮａｇｌｕのｃＤＮＡを発現ベクターに挿入して、ＨＴ１０８０細胞系にトランスフェクトした。Ｎａｇｌｕ酵素活性アッセイを用いて、高発現しているＨＴ１０８０クローンをスクリーニングした。Ｎａｇｌｕを発現しているＨＴ１０８０細胞によって産生された分泌タンパク質は、ヒトＮａｇｌｕの成熟型である。ＨＴ１０８０細胞によって産生された組換えヒトＮａｇｌｕをグリコシル化した。ｒｈＮａｇｌｕは、合成基質、４−ＭＵ−Ｎ−アセチルα−Ｄ−グルコサミニドに対して十分に活性である。

組換えＮａｇｌｕと、尿中、胎盤および肝臓のＮａｇｌｕなどの天然源から単離されたＮａｇｌｕｅとの間の最も著しい違いは、マンノース−６−リン酸グリカン（Ｍ６Ｐ）の欠如である。組換えＮａｇｌｕにおけるＭ６Ｐの欠如は、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞由来のｒｈＮａｇｌｕの研究において数人の研究者によって報告されている。ｒｈＮａｇｌｕを発現したＨＴ１０８０も、Ｍ６Ｐグリカンが欠乏していることがわかった。組換えＮａｇｌｕにおけるＭ６Ｐの欠如の機序は、わかっていない。本発明者らは、組換えＮａｇｌｕにおける細胞送達のためにＭ６Ｐへの依存を克服する試みの中で、いくつかの融合タンパク質とグリカン修飾型を開発した（図１〜３）。

Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴ
Ｎａｇｌｕと、ＨＩＶ由来のタンパク質形質導入ドメインとの融合タンパク質をＮａｇｌｕ−ＴＡと名付けた。Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴを設計して、生成し、次いで精製した。ＴＡＴペプチドは、細胞膜を通って細胞質へのタンパク質形質導入を促進することが示された。リソソーム酵素βグルクロニダーゼと融合したＴＡＴペプチド（ＧＵＳ−ＴＡＴ）は、ＭＰＳＶＩＩマウスへの静脈内注射後に、腎臓内のリソソーム貯蔵がＧＵＳよりも大幅な減少をもたらしたことが以前に証明されている（Ｇｒｕｂｂ ＪＨら，Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２，２０１０）。別の実験では、ｒｈＮａｇｌｕと比較して、サンフィリポＢ患者の線維芽細胞においてＮａｇｌｕ−ＴＡＴの細胞取り込みが改善されたことを示した（データ不掲載）。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏ生体分布試験は、髄腔内注射後、ＮａｇｌｕＴＡＴがｒｈＮａｇｌｕと同様の生体分布を示し、且つ細胞取り込みをわずかに改善したことを示した。この試験では、大部分の該タンパク質が髄膜内に残り、脳の実質への浸透は極めて限られていた。この結果は、ＴＡＴペプチドが媒介する送達が、受容体が媒介するＮａｇｌｕ細胞取り込みに取って代わるには十分でなかったことを示した。

Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆ
Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆは、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを培地に添加することによる修飾型細胞培養プロセスを用いて生成した。Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆを計画して生成し、次いで精製した。高マンノースグリカンの産生を高めて、複合糖質の添加を抑制するために、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを添加することで、ｒｈＮａｇｌｕのグリコシル化経路を変更した。Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅは、ゴルジα−マンノシダーゼＩ活性を阻害し、それによって高マンノースグリカンの除去を阻害して、複合グリカンのカップリングの抑制を生じさせる。その結果、Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆは、大部分は高マンノースグリカンを含む。マクロファージ由来の細胞系を用いる細胞取り込みによって、Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆのマンノース受容体依存取り込みを確認した。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、カニューレ処置した野生型ラットの脳脊髄液への髄腔内注射後、Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆは、ｒｈＮａｇｌｕよりも、脳の実質への分布の改善を示さなかった。マンノース受容体が媒介したＮａｇｌｕ−Ｋｉｆの取り込みは、ＣＮＳ内でｒｈＮａｇｌｕ送達を促進しないと結論づけた。

Ｎａｇｌｕ−ＡｐｏＥ
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をＮａｇｌｕの細胞取り込みで利用するために、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）の受容体結合ドメインをＮａｇｌｕのＣ末端に融合した。このアプローチは、ＢＢＢでＬＤＬＲの存在を支持する研究に基づいた（Ｂｅｇｌｅｙ ＤＪら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，２００８，１４，１５６６−１５８０）。予備マウスによるｉｎ ｖｉｖｏ試験は、サンフィリポＢマウスに静脈内投与したＮａｇｌｕ−ＡｐｏＥが脳に輸送されなかったことを示した。

ｒｈＮａｇｌｕの静脈内与
ｉｎ ｖｉｖｏ実験を行って、ＢＢＢを通る輸送におけるｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを調べた。この試験は、サンフィリポＢマウスにｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを静脈内投与すると、脳内でいずれの酵素をもたらさず、かつ処置したマウスの脳に何ら病理組織学的な改善が見られなかったことを示した。
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ

インスリン様増殖因子ＩＩの配列（ａａ８〜６７、８−６７ＩＧＦＩＩ）の一部を、Ｎａｇｌｕ配列のＣ末端に融合することで、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを構築した。全長ＩＧＦＩＩ分子と比較して、８−６７ＩＧＦＩＩは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦＩＩ受容体と２〜１０倍高い親和性で結合するが、ＩＧＦＩ受容体と結合するその能力は、３０倍減少すると報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｒ，ＪＢＣ １９９５ ２７０（３０）：１８０１３−１８０１８）。

Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ分子は、Ｎａｇｌｕと８−６７ＩＧＦＩＩとの間に挿入されたリンカー配列を含む。このリンカー配列は、各端が隣接する２つの「ＧＡＰ」配列と、各反復の間に１つの「ＧＡＰ」配列とを含む、３つのタンデム反復「ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ」からなっていた。リンカーの実際の配列は、以下の表７に示す。

組換えＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合体を生成するために、ｃＤＮＡを発現ベクター、ｐＸＤ６７１に挿入して、ヒト線維芽細胞系にトランスフェクトした。組換えＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質のタンパク質配列は、以下の表８に示す。

Ｎｓｇｌｕ酵素活性アッセイを用いて、高発現しているＨＴ１０８０クローンをスクリーニングした。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの発現をさらに増加させるために、選択した細胞系を、同じ転写単位を担持するさらなる発現プラスミドと再度トランスフェクトした。１回トランスフェクトした細胞系および２回トランスフェクトした細胞系の双方において、分泌されたＮａｇｌｕＩＧＦＩＩは、全長成熟Ｎａｇｌｕ配列と、全長８−６７ＩＧＦＩＩとを含んでいる。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質は、同じ合成基質である４−ＭＵ−Ｎ−アセチルα−Ｄ−グルコサミニドへの酵素活性を示した。図４〜６は、２回トランスフェクトしたＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ細胞系を用いた代表的な産生推移をグラフで示す。図４に示したこのＮａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ細胞系の産生推移は、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの０．５ｐｃｄ（１日あたり、１００万細胞あたりのピクトグラム）を達成した。

ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの精製
ｒｈＮａｇｌｕ、ＮａｇｌｕＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ＡｐｏＥおよびＮａｇｌｕ−Ｋｉｆに対して、同様の精製プロセスを用いた。Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴに対しては、改変型精製プロセスを用いた。ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩタンパク質の精製を以下にまとめる。

ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの精製の場合、３段階のプロセスを用いた（図７）。第一に、条件培地を、限外濾過（ＵＦ）装置を使用して濃縮した。次いで、条件培地をブチルセファロースクロマトグラフィーカラム（ブチル）に、続いてＱセファロースクロマトグラフィーカラム（Ｑ）に適用した。精製したタンパク質を、貯蔵のためにＰＢＳ（リン酸ナトリウム１１．９ｍＭ、リン酸カリウム２．７ｍＭ、ｐＨ７．４の塩化ナトリウム１３７ｍＭ）からなる処方物に緩衝液交換した。逆相高圧液体クロマトグラフィーで調べると、精製したｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの純度は、それぞれ９９％と９５％であった（データ不掲載）。

ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩの生化学的特性
ｒｈＮａｇｌｕ、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴ、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ＫｉｆおよびＮａｇｌｕ−ＡｐｏＥのＮａｇｌｕ変異体のすべては、合成基質、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニドへの同様の生物活性を示した。高速アニオン交換クロマトグラフィーによるグリカン分析および単糖分析によって決定すると、これらの変異体のすべては、リン酸化糖鎖付加に対して陰性であった。

以下の節に、ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩだけの生化学特性をまとめる（表９）。表９に示すように、ｒｈＮａｇｌｕとＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの生化学的比較は、これらの２つの特性間で同様の酵素活性と安定性を示している。示差走査熱量測定で測定した熱安定性の最適ｐＨ値は、ｒｈＮａｇｌｕの場合、ｐＨ５〜ｐＨ６．５であり、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの場合、ｐＨ６〜ｐＨ６．５であった。この結果は、リソソームの酸性環境下で、最適安定性を示すためのリソソーム加水分解産物の要件と一致している。

さらに、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイで決定すると、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩは２６ｍｇ／ｍＬまでうまく濃縮され、４℃で最高３ヶ月間の貯蔵後、凝集または活性の消失の兆候はなかった。ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム５ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、０．００５％のポリソルベート２０からなる処方物（例えば、髄腔内投与用）を、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処方物に対しても検査した。ＰＢＳ処方物でのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩと髄腔内処方物でのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩとの間では、同様の安定性と溶解度が観察された（データ不掲載）。

Ｎａｇｌｕの結晶構造
ｒｈＮａｇｌｕの開発におけるブレイクスルーの１つは、ＰＥＰＲによるＮａｇｌｕの結晶構造の決定であった。この成果は、Ｎａｇｌｕの構造の洞察と、タンパク質の安定性および製剤要件を予測する際の支援をもたらした。サンフィリポＢ患者の変異体をＮａｇｌｕの３Ｄ構造上に並べることで、創薬のための洞察とツールを提供することになると思われる。

結晶（図８）は、マンノシダーゼ−Ｉ阻害剤、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅで処置した培地から精製したｒｈＮａｇｌｕタンパク質から得た。Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆは、ｒｈＮａｇｌｕと同一のタンパク質配列を含んでいるが、グリコシル化パターンは異なっている。Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆの得られた結晶をｐＨ７．５で増殖させて、Ｎａｇｌｕ−Ｋｉｆの構造を２．４Å解像度でＸ線結晶構造解析によって分析した。Ｎａｇｌｕ構造（図９）は、Ｎ末端ドメイン（ドメイン−Ｉ、ａａ２４−１２６）、それに続く触媒グルタミン酸を含む（α／β）８バレルドメイン（ドメイン−ＩＩ、ａａ１２７−４６７）およびＣ末端ヘリックスドメイン（ドメイン−ＩＩＩ、ａａ４６８−７４３）の３つの異なるドメインを有すると確認する。同様のドメイン構造は、Ｎａｇｌｕの細菌相同体である、別の糖質分解酵素のファミリー−８９タンパク質（ｃｐＧＨ８９）で観察されている（Ｆｉｃｋｏ−Ｂｌｅａｎ Ｅ，ら，ＰＮＡＳ Ｍａｙ ６，２００８ ｖｏｌ．１０５ ｎｏ．１８ ６５６０−６５６５）。その活性部位は、ドメイ−ンＩＩとドメイン−ＩＩＩの間の間隙であり、触媒残基は、ドメイン−ＩＩ上に位置するＥ３１６とＥ４４６として確認する。

Ｎａｇｌｕ分子の最密対称三量体配列は、結晶構造で見ることができる（図１０）。これは、分析超遠心（ＡＵＣ）実験およびインライン式多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）による分子ふるいクロマトグラフィー実験から観察された天然の会合状態と一致している。ドメイン−ＩＩの疎水性相互作用と水素結合は、タンパク質の三量体立体構造を保持する。Ｈ２２７は、三量体形成の間、隣接する分子のＲ２９７とスタッキング相互作用を形成するように見える。さらに、Ｅ３０２は、Ｋ３０１と分子間水素結合相互作用を形成する。

Ｎａｇｌｕは、６つの潜在的なＮ−グリコシル化部位（Ｎ２６１、Ｎ２７２、Ｎ４３５、Ｎ５０３，Ｎ５２６およびＮ５３２）があり、これらの６部位のすべては、結晶構造内でグリコシル化される。Ｎ２７２７とＮ４３５の各々に付着した２つのＮＡＧ分子およびＮ２６１、Ｎ５０３、Ｎ５２６とＮ５３２の各々に付着した１つのＮＡＧ分子の明確な電子密度は、２．４Å解像度での電子密度図で見られた。残りのグリカン構造は、糖部分が露出した溶媒の柔軟性のため、電子密度図で明瞭に見えない。

Ｎａｇｌｕの構造情報は、Ｎａｇｌｕの安定性分析および分子レベルの特徴付けで役立つ。Ｎａｇｌｕにはシステインが８個あり、そのうちの４個は、２つのジスルフィド架橋（Ｃｙｓ２７３−Ｃｙｓ２７７とＣｙｓ５０４−Ｃｙｓ５０９）を形成する。他の４個（Ｃ９７、Ｃ９９、Ｃ１３６およびＣ４０５）は、精製および結晶化プロセスの間に還元剤を使用しなくても、結晶構造内に還元したシステインとして現れる。Ｃ９７とＣ９９は、互いに近接しており、表面近くで部分的に露出している。しかし、Ｃ１３６とＣ４０５は、覆われており、構造に基づく分子間ジスルフィド結合を形成することはなさそうである。

現在、利用可能な構造情報に基づいて、サンフィリポＢ患者の変異体をマッピングすることで、小分子シャペロンの合理的設計など、この疾患に対する将来の創薬の可能性に光明を投じることになると思われる。文献（Ｙｏｇａｌｉｎｇａｍ ２００１）で報告されている重度のサンフィリポＢの変異体は、結晶構造上にマッピングされている。変異体の数個のクラスターは、活性部位、ドメイン−ＩＩＩ内に３つのグリコシル化部位を含むループ、および３つのドメイン間の界面など、構造的領域または機能的領域に関連し得る（図１０）。加えて、変異体のクラスターは、Ｎ末端のドメイン−ＩおよびＣ末端のヘリックス束ドメイン−ＩＩＩに見られ得る。変異しているこれらの残基の大部分は、水素結合相互作用および他の非共有結合相互作用の一部であり、且つＮａｇｌｕの構造安定化に関与している。

実施例２：ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
サンフィリポＢ患者線維芽細胞の２種類の株であるＧＭ０２３９１（Ｐ３５９Ｌ）およびＧＭ０１４２６（Ｅ１５３Ｋ）、ならびに正常ヒト線維芽細胞系を用いて、Ｎａｇｌｕの各変異体による細胞内取り込みの機序が研究されてきた。線維芽細胞は、その細胞系でＭ６Ｐ受容体が発現されることを理由に、リソソーム酵素の細胞内取り込み試験のために、研究者により伝統的に使用されている。

線維芽細胞をｒｈＮａｇｌｕまたはＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩとともに３７℃で４時間、インキュベートすることにより、細胞内取り込み試験を行った。インキュベーション後に細胞を洗浄して溶解させ、細胞溶解物中のＮａｇｌｕ酵素活性を測定した。ｒｈＮａｇｌｕと線維芽細胞とのインキュベーションでは、細胞内に検出可能な酵素はほとんど見られなかった。これに対し、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩと線維芽細胞とのインキュベーションでは、細胞内に顕著なレベルの酵素が見られた（図１１）。内部に取り込まれたＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの量は、インキュベーションに用いる酵素の量を増加させるにつれて飽和に達した。用量依存的な取り込みの飽和は、受容体介在型の細胞内取り込みの典型的な結果である。さらに、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの内部取り込みは、外因性のＭ６Ｐによっては阻害されなかったが、外因性のＩＧＦＩＩによって完全に阻害された（図１１）。この結果は、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの線維芽細胞への内部取り込みが、グリコシル化とは無関係にＭ６Ｐ／ＩＧＦＩＩ受容体に依存することを示しいていた。

また、ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのリソソームへの輸送を試験する実験も行った。サンフィリポＢ患者線維芽細胞（ＧＭ０１４２６）を本試験に使用した。最初にタンパク質と細胞とインキュベートした後に、細胞を抗ヒトＮａｇｌｕポリクローナル抗体で染色することにより、ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの検出を調べた。ＬＡＭＰ−１（リソソーム膜タンパク質１）の免疫蛍光染色をリソソームの検出に用いた。ｒｈＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのリソソームとの共局在を共焦点顕微鏡により可視化した（図１２）。

タンパク質と細胞のインキュベーションの４時間後に、広範なＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの内部取り込みが観察され、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩとリソソームの共局在が示された。これに対し、同じ時間内でｒｈＮａｇｌｕの内部取り込みは示されず、リソソームとの共局在は観察されなかった。さらにこの結果は、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩが細胞内に取り込まれ、適切な細胞区画であるリソソームへ輸送されるという証拠を与えるものであった。内部の取り込まれたＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのサンフィリポＢ患者線維芽細胞内での半減期は１．５日であると決定された（データ不掲載）。

実施例３：マウスモデルでのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
野生型（ｗｔ）カニューレ処置ラット
ｉｎ ｖｉｖｏでの分子スクリーニングには、サンフィリポＢマウスモデルに加え、欠損動物モデルではないｗｔカニューレ処置ラットも用いた。カニューレ処置ラットでは、脊髄の上腰部および下位胸部にカニューレを外科手術によりに埋入し、カニューレからＣＳＦへ３５μｌの単回注射を行った。この動物モデルを用いた分子スクリーニングで評価した基準は、脳および脊髄のＮａｇｌｕ活性アッセイおよび免疫組織化学であった。

サンフィリポＢマウスモデル
サンフィリポＢのマウスモデル（Ｎａｇｌｕ−／−マウス、サンフィリポＢマウス）はＥ．Ｎｅｕｆｅｌｄらにより作製された（Ｌｉ ＨＨら，ＰＮＡＳ ９６（２５）：１４５０５−１４５１０；１９９９）。マウスＮａｇｌｕ遺伝子のエクソン６を、選択マーカーのネオマイシン耐性遺伝子の挿入により破壊する。得られたホモ接合体Ｎａｇｌｕ−／−マウスは完全にＮａｇｌｕ欠損であり（図１３）、全ＧＡＧが肝臓および腎臓に蓄積される。Ｎａｇｌｕが完全に欠損しているにもかかわらず、このマウスは全般的に健康であり、寿命が８〜１２か月ある。約５か月齢で他のリソソーム酵素発現の変化が起こり、このような変化としては、肝臓および脳におけるｓ−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼの代償性増加、肝臓におけるα−Ｌ−イズロニダーゼの上昇（脳では見られない）、ならびに肝臓および脳におけるノイラミニダーゼの減少が挙げられる。通常、尿閉および尿路感染症の結果、死亡する。サンフィリポＢの病理変化を叙述するために、サンフィリポＢマウスモデルが文献中で広く研究されてきた。Ｎａｇｌｕ−／−マウスのＣＮＳ病理に関連する表現型に関しては、４．５か月齢での活動性低下が報告されているが、他の年齢での活動亢進も観察されている。

Ｎａｇｌｕ−／−マウス神経病理変化に関しては、ＥＭ（電子顕微鏡）によるニューロン、マクロファージおよび上皮細胞の空胞および封入体が記載されている。これらの病理変化は通常、３３日齢から始まり、マウスの年齢が上がるとともに徐々に悪化する。アストロサイトおよびミクログリア細胞の活性化も組織病理学的解析により示されている。２種類のガングリオシドＧＭ２およびＧＭ３の生化学的分析では、脳における５倍および９倍の増加が示されている（ＧＭ２およびＧＭ３はＮａｇｌｕの直接の基質ではなく、短時間のＥＲＴ後に有意な減少を示すことが困難であり得るため、ＰＯＣのエンドバイオマーカーとして使用されなかった）。

Ｎａｇｌｕ酵素活性およびＧＡＧレベルの測定による生化学的分析を行い、また抗ヒトＮａｇｌｕ抗体、抗ＬＡＭＰ−１抗体、抗Ｉｂａ−１抗体および抗ＧＦＡＰ抗体の免疫組織化学による組織学的解析を行った。本試験で使用した抗ヒトＮａｇｌｕ抗体は、ｗｔマウスの内因性マウスＮａｇｌｕまたはサンフィリポＢマウスの変異Ｎａｇｌｕとは結合しないマウスモノクローナル抗体であった。ＬＡＭＰ−１免疫染色では、リソソーム膜タンパク質であるリソソーム膜タンパク質−１と結合する抗体を使用した。Ｉｂａ−１染色では、ミクログリア細胞およびマクロファージ細胞に特異的なイオン化カルシウム結合アダプタータンパク質と結合する抗体を使用した。ＧＦＡＰ染色では、アストロサイトに特異的なグリア線維性酸性タンパク質と結合する抗体を使用した。

サンフィリポＢマウスへの頭蓋内（ＩＣ）注射によるｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性スクリーニング
本試験の目的は、Ｎａｇｌｕ酵素の生物活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価することであった。本試験では、サンフィリポＢマウスの脳へのＩＣ注射によりタンパク質を投与した。本試験のためのサンフィリポＢマウスの年齢を８週齢に厳密に一致させた。ＩＣ注射経路が、分子の有効性を評価するための最良の計画であった。神経細胞内に取り込まれてリソソーム蓄積を減少させる能力により、Ｎａｇｌｕタンパク質を評価した。免疫組織化学を用いて生体内分布を評価した。そして、リソソーム蓄積を、ＬＡＭＰ−１免疫染色法の陽性染色の数および大きさにより特徴付けた。

サンフィリポＢマウスの頭蓋から右側大脳皮質への直接注射によりＩＣ注射を行った。各個体に２マイクロリットルまたは３５μｇのＮａｇｌｕタンパク質を注射した。注射の７日後にマウスを屠殺した。注射の３、７および１４日後にマウスを屠殺する予備試験で、屠殺時間を予め定めた。予備試験から、免疫組織化学試験には注射の７日後が最適な時間であることが決定された。脳切片を横断面で切り（図１４）、ＮａｇｌｕおよびＬａｍｐ−１による免疫染色を行った。ｒｈＮａｇｌｕ処置およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置サンフィリポＢマウスにおけるニューロンおよびグリア細胞の両方への細胞内取り込みが、抗ヒトＮａｇｌｕ抗体を用いた免疫組織化学により示された（図１４〜１６）。細胞内取り込みに関して、ｒｈＮａｇｌｕ処置したサンフィリポＢマウスとＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置したサンフィリポＢマウスとの間に有意な差は見られなかった。さらに、ｒｈＮａｇｌｕ処置およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置マウスの両方の脳組織のＬＡＭＰ−１免疫染色は、リソソーム蓄積の有意なレベルの減少を示している。ｒｈＮａｇｌｕ処置およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置群両方におけるリソソーム蓄積減少のレベルは、正常ｗｔマウスとほぼ同じレベルであった。

またリソソーム蓄積の減少は、ＩＣ注射後にＮａｇｌｕ−ＴＡＴ、Ｎａｇｌｕ−ＫｉｆおよびＰｅｒＴ−Ｎａｇｌｕで試験したサンフィリポＢマウスでも観察された（データ不掲載）。本試験により、Ｎａｇｌｕのすべての変異体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性が示された。

別の試験では、Ｎａｇｌｕ欠損マウスに溶媒を、または代わりに、ＰＢＳに溶かした組換えＮａｇｌｕ−ＩｇＦ−ＩＩ融合タンパク質構築物（Ｎａｇｌｕ）を週１回の投与で１回、２回もしくは３回、ＩＴ投与した。未処置の野生型マウス群を未処置野性型対照として使用し、Ｎａｇｌｕを含まない溶媒を投与した。最後の注射の２４時間後にマウスを屠殺した後、免疫組織化学（ＩＨＣ）および組織病理学解析用に組織標本を作成した。

組換えＮａｇｌｕのＩＴ投与後に、Ｎａｇｌｕ欠損マウス脳組織へのＮａｇｌｕの分布が明らかであった。図１７Ａに示されるように、Ｎａｇｌｕ欠損マウスへの組換えＮａｇｌｕのＩＴ投与では、溶媒をＩＴ投与したＮａｇｌｕ欠損マウスに比べて、白質組織における細胞空胞化の広範な減少がもたらされた。同様に、図１７Ｂに示されるように、形態計測学的解析により、処置マウスの白質組織におけるＬＡＭＰ１免疫染色が、未処置Ｎａｇｌｕ欠損マウスに比べて顕著に減少していることが明らかとなり、これは疾患病態の改善を示すものである。

図１８Ａ〜１８Ｂに示されるように、評価した脳組織の各領域（皮質、尾状核および被殻（ＣＰ）、視床（ＴＨ）、小脳（ＣＢＬ）ならびに白質（ＷＭ））では、Ｎａｇｌｕ処置マウスにおいて、ＬＡＭＰ陽性領域が未処置のＮａｇｌｕ欠損対照マウスに比べて減少し、野性型マウスのＬＡＭＰ陽性領域にほぼ近かった。Ｎａｇｌｕの２回または３回のＩＴ投与（図１８Ｂ）後に、解析した脳組織の各領域のＬＡＭＰ陽性領域が、単回投与に比べてさらに減少していたのは特に注目すべきことである（図１８Ａ）。

これらの結果により、ＩＴ投与したＮａｇｌｕが、Ｎａｇｌｕ欠損マウスモデルにおいてサンフィリポ症候群Ｂ型のようなリソソーム蓄積症の進行を変化させることができることも確認され、さらに、ＩＴ投与したＮａｇｌｕのような酵素が、サンフィリポ症候群Ｂ型のようなリソソーム蓄積症に伴うＣＮＳ発症を治療することができることも確認される。

ｗｔカニューレ処置ラットへの髄腔内（ＩＴ）注射による分子スクリーニング
本試験は、ポートによる薬物投与アプローチを直接模倣するものである。脳実質内への生体内分布を判定するために、Ｎａｇｌｕタンパク質をＩＴ注射によりｗｔカニューレ処置ラットに投与した。

これらのラット内にあるカニューレは、脊髄の上腰部および下位胸部に留置されていた（図１９）。ラットに３５μｌまたは３８５μｇのｒｈＮａｇｌｕ、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴ、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩおよびＰｅｒＴ−Ｎａｇｌｕをカニューレから注射した（溶解度の限度により、Ｎａｇｌｕ Ｋｉｆは３８．５μｇしか注射されなかったが、これは他のＮａｇｌｕの１０倍少ない）。注射の４時間および２４時間後に屠殺を行った。

脳および脊髄の組織を採取し、Ｎａｇｌｕ活性アッセイによる測定を行った。処置個体の脳では、Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置個体が、ｒｈＮａｇｌｕおよび他のすべてのＮａｇｌｕ変異体で処置した個体よりも高い活性を示した（図２０）。全般的な傾向として、全処置個体において、脊髄でのＮａｇｌｕ活性の方が脳での活性よりも有意に高かった（データ不掲載）。この現象は、ＩＴ注射に近い部位ほどタンパク質が多く吸収されたことを示しているのかもしれない。

免疫組織化学解析により、ＩＴ注射の２４時間後のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置群の脳における生体内分布が、他のすべてのＮａｇｌｕ変異体で処置した群よりも広範であることが示された（図２１および図２２）。ｒｈＮａｇｌｕ処置個体では、タンパク質が脳の髄膜でのみ観察された。脊髄切片では、ＩＨＣにより、灰白質ニューロンでのｒｈＮａｇｌｕの細胞内取り込みがいくらか示されたが、その程度は脊髄ニューロンでのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ取り込みに比べれば、はるかに少なかった（データ不掲載）。

Ｎａｇｌｕ−ＴＡＴをＩＴ注射した群では、脳組織において最も高いＮａｇｌｕ活性が生化学的分析により観察されたが、ＩＨＣでは、髄膜に留まっているだけで、脳実質内へのＮａｇｌｕ−ＴＡＴの浸透は示されなかった。ＩＴ注射後の脳でのＮａｇｌｕの細胞内取り込みがＭ６Ｐ／ＩＧＦＩＩ受容体に依存することの有力な証拠である、髄膜を越えた生体内分布が、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを除く他のすべてのＮａｇｌｕ変異体において示されなかった。本試験により、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩがサンフィリポＢのための薬物開発のリード分子であることが示された。

実施例４：ＮＡＧＬＵ−ＩＧＦＩＩを用いた概念実証試験
実験計画
サンフィリポＢマウスにおけるＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ注射後の生体内分布およびリソソーム蓄積の逆転の両方を示すための概念実証試験を計画した。本試験では、３群の８週齢のサンフィリポＢマウスをＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ注射により処置した。各ＩＴ注射は、１０μｌ体積または２６０μｇのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩであった。処置群は、１回注射群、２回注射群および３回注射の３つであった。１回注射群では、０日目にタンパク質の単回投与を行った。注射の２４時間後にマウスを屠殺した。２回注射群では、０日目と７日目に２回のＩＴ注射を行い、最後の注射の２４時間後にマウスを屠殺した。３回注射群では、０日目、７日目および１４日目にＩＴ注射を行い、最後の注射の２４時間後にマウスを屠殺した。３群の溶媒処置マウスも含まれていた。溶媒対照群では、サンフィリポＢマウスに処置群と同じ時間間隔で溶媒を注射し、処置群と同じ方法で屠殺した。

試験結果の評価には、生化学的分析および組織学的解析の両方を適用した。生化学的分析には、組織中の酵素量を測定するＮａｇｌｕ活性アッセイおよびリソソーム蓄積の減少を評価する総ＧＡＧアッセイが含まれていた。肝臓および脳が生化学的分析の２つの対象組織であった（図２３および図２４）。組織学的解析には、形態学的評価のための組織のＨ＆Ｅ染色（データ不掲載）、ならびに抗ヒトＮａｇｌｕ抗体、ＬＡＭＰ、ＩｂａおよびＧＦＡＰによる免疫組織化学染色（ＩｂａおよびＧＦＡＰ染色は不掲載）が含まれていた。

本試験で使用した抗ヒトＮａｇｌｕ抗体は、ｗｔマウスの内因性マウスＮａｇｌｕまたはサンフィリポＢマウスの変異Ｎａｇｌｕと結合しないマウスモノクローナル抗体であった。ＡＭＰ−１免疫染色では、リソソーム膜タンパク質と結合する抗体を使用した。Ｉｂａ−１染色では、ミクログリア細胞およびマクロファージ細胞に特異的なイオン化カルシウム結合アダプタータンパク質と結合する抗体を使用した。ＧＦＡＰ染色では、アストロサイトに特異的なグリア線維性酸性タンパク質と結合する抗体を使用した。

Ｎａｇｌｕ免疫蛍光法の代表的な顕微鏡像を図２５に示す。代表的な脳の断面図を図２６に示す。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩは、髄膜に近い大脳皮質内では検出されたが、尾状核、視床および白質のような皮質下領域では見られなかった（データ不掲載）。同じ皮質下領域におけるＬＡＭＰ−１、Ｉｂａ−１およびＧＦＡＰの免疫染色ではリソソーム蓄積の逆転が確かに示されたことから、深部脳領域においてＮａｇｌｕ免疫染色が陰性であったのは、おそらくＮａｇｌｕ免疫蛍光法の感度が原因である考えられた。

Ｌａｍｐ−１免疫染色の代表的な顕微鏡像を図２７〜図３１に示す。タンパク質の分布および有効性の程度を示すために、大脳皮質、尾状核、視床および白質のような皮質下領域、ならびに小脳皮質を免疫組織化学解析のために選択した。Ｉｂａ−１およびＧＦＡＰ免疫染色の結果から（データ不掲載）、ＬＡＭＰ−１免疫染色で見られたものは、ニューロンに加え、サンフィリポＢマウスモデルにおいて冒されることが報告されている２つの細胞型であるミクログリア細胞およびアストロサイト（Ｌｉ，２００２，Ｏｈｍｉ ２００２）における変化の複合効果であることが示された。技術的限界により、ニューロンにおけるリソソーム蓄積をＬＡＭＰ−１免疫染色で明らかにすることはできなかった。ニューロンで空胞および封入体のようなリソソーム蓄積を最も良好に観察するためには、電子顕微鏡法を通常用いる（本試験にはＥＭは含まれていなかった）。

細胞型の同定がニューロンおよびグリア細胞に限定されていたことが理解されるであろう。ニューロンは一般に、１つ以上の濃染した核小体を含む比較的大型で淡色の核、および頻繁に検出される細胞質により同定された。グリア細胞は一般に、小型で濃い核および目立たない細胞質により同定された。異なる型のグリア細胞、例えばアストロサイト、ミクログリア細胞、上衣細胞およびオリゴデンドロサイトなどの区別は通常、細胞型に特異的なマーカーでの染色により行うのが最も良い。

Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ注射後の大脳皮質、尾状核、視床、白質および小脳において、ＬＡＭＰ−１免疫染色により示されたリソソーム蓄積の減少に加え、ミクログリア細胞の大きさおよび突起の数の減少がＩｂａ−１免疫染色により示され、またアストロサイトの細胞の大きさおよび突起の長さ／数の減少がＧＦＡＰ免疫染色により示された（データ不掲載）。さらに、免疫組織化学で調べたものと同じ領域の脳組織のＨ＆Ｅ染色（ヘマトキシリンおよびエオシン）による組織病理学的解析では、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの３回のＩＴ注射後のグリア細胞内において空胞の減少が示された。また上記の結果はすべて、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ注射用量依存的効果も示していた。

Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ注射後のサンフィリポＢマウスの生化学的分析では、Ｎａｇｌｕ活性が脳および肝臓で検出された。脳および肝臓における総ＧＡＧの減少により、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの有効性が示された。免疫組織化学により、脳の実質におけるＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの生体内分布が示された。脳の大脳皮質領域だけでなく、脳の皮質下領域である白質および小脳皮質においても、リソソーム蓄積の減少、ミクログリア細胞およびアストロサイトの大きさおよび突起の減少がＬＡＭＰ−１、Ｉｂａ−１、ＧＦＡＰの免疫染色、およびＨ＆Ｅ染色による組織病理学的解析により示された。

結論
特に、融合タンパク質のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩが、Ｎａｇｌｕの天然の基質と同様の構造を有する基質に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を示すということが示された。ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞内取り込み試験により、この分子が、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦＩＩ受容体によりＭ６Ｐグリコシル化とは無関係に細胞に取り込まれることが示された。内部に取り込まれたＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩはリソソームと共局在することが示された。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩは、サンフィリポＢマウスへのＩＣ注射後にｉｎ ｖｉｔｒｏでリソソーム蓄積を減少させることが示された。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩは、ｒｈＮａｇｌｕならびに他のＮａｇｌｕ融合型および修飾型に比べて、ＩＴ注射後のｗｔカニューレ処置ラットの脳実質内への浸透において、これらすべてのものよりも優れていた。最後に、サンフィリポＢマウスへのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質のＩＴ注射により、髄膜を十分に越えた広範な分布が示され、また大脳皮質および皮質下領域におけるリソソーム蓄積の逆転が観察された。まとめると、これらのデータは、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩがサンフィリポＢ疾患治療のための候補薬物であることを示している。

実施例５：ＮＡＧＬＵ−ＩＧＦＩＩの毒性、薬物動態（ＰＫ）および組織生体内分布試験
マウスでの概念実証試験
３群（ｎ＝３）のＮａｇｌｕ（−／−）マウスに、２６０μｇのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを含む１０μＬを単回ボーラスＩＴ腰椎注射により投与した。２６０μｇの用量は、５２０ｍｇ／脳重量ｋｇの用量（マウスの脳＝０．０００５ｋｇ）に置き換えられる。１つ目の群では、０日目に注射を行い、注射の２４時間後に屠殺を行った。２つ目の群では、０日目と７日目に注射を行い、最後の注射の２４時間後に屠殺を行った。３つめの群では、０日目、７日目および１４日目に注射を行い、最後の注射の２４時間後に屠殺を行った。各Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ投与群を、年齢／疾患重症度に関する対照となる溶媒対照グループと対にした。

脳および肝臓におけるＮａｇｌｕ酵素活性は、３つのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ投与群とも同等であった。ＮＡＧＬＵ酵素活性を肝臓と脳で比較すると、肝臓において１０倍以上のｒｈＮａｇｌｕ酵素活性が見られた。ラットおよび幼若ザルでのピボタルな毒性試験における投与の１か月、３か月および６か月後のｒｈＨＮＳ酵素活性のレベルが、脳および肝臓において同等であったことから、Ｎａｇｌｕ（−／−）マウスに投与したｒｈＮａｇｌｕ用量の一部は、ＩＴではなく全身に送達されたということが考えられた。それでも、３回のＩＴ注射後には、脳における総ＧＡＧレベルが統計的に有意な減少を示した（ｐ＜０．０５）。肝臓においては、総ＧＡＧレベルが減少するという用量依存的傾向が見られ、これは２回または３回投与した群において統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

ＩＴ注射後のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの生体内分布が、髄膜を十分に越えた脳実質内で観察されたが、深部皮質下領域は抗Ｎａｇｌｕ抗体による免疫染色で陰性であった。リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ）免疫染色によるリソソーム活性の減少が、２回または３回投与した群でのみ観察された。リソソーム活性が減少した領域には、大脳皮質ならびに尾状核、視床および白質の深部皮質下領域が含まれていた。したがって、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ投与個体での各種免疫染色パラメータの減少は、抗ＮＡＧＬＵ免疫染色が見られないにもかかわらず、治療レベルのＮＡＧＬＵが存在し得ることを示していた。２回または３回投与した群においてのみ、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫染色の減少およびミクログリア細胞／マクロファージのイオン化カルシウム結合アダプター分子（Ｉｂａ）染色の減少により、炎症性応答の減弱が明らかとなった。解析した領域には、大脳皮質ならびに尾状核、視床および白質の深部皮質下領域が含まれていた。

ラットでの試験
ＩＴ投与したＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの毒性学的評価のためのげっ歯類として、Ｓ−Ｄラットを選択した。その結果、１６匹のラット（雌雄それぞれ８匹）に、組換えＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを３日おきに、最大投与可能用量（ＭＦＤ）ならびにＭＦＤの約１／４および１／２（それぞれ低用量レベルおよび中用量レベル）で、合計８回投与した。

単回投与でのＰＫ／生体内分布試験をＳ−Ｄラットで行い、雌雄の個体にＩＴ−Ｌ投与した後、ＣＳＦおよび血清中濃度または組織分布をそれぞれ決定した。

Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ−Ｌ投与を、毒性学および安全性薬理学（神経、呼吸器および心血管の安全性）の観点から雌雄両方の個体で評価するための毒性学試験を計画した。本試験の毒性学的評価には、臨床観察、体重、摂餌量、臨床病理学、適切な安全性薬理学的評価（身体検査および心電図検査による）、肉眼的組織評価および顕微鏡評価が含まれる。限られた数のＣＳＦおよび血清試料を採取し、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩに関して、および被検試料に対する抗体に関して解析する。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの組織分布および細胞内局在を、それぞれ酵素活性アッセイおよび免疫組織化学により定量化する。さらに、選択した試験には、あらゆる重要で顕著な毒性学的所見の可逆性、または遅発性出現の可能性を評価する回復期間が含まれる。

サルにおける試験
カニクイザルが遺伝的および解剖学的にヒトに類似しており、より適切な種であると考えられたため、ＩＴ投与したＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの毒性学的評価のためのげっ歯類以外の種としてこれを選択した。サンフィリポＢの臨床試験で計画されている患者集団が小児であるため、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）による投与に関する慢性の６か月間の毒性学試験を幼若カニクイザルで行う。幼若カニクイザルは一般に、試験開始時の年齢が１歳未満（約７〜９か月齢）であり、試験開始時の体重が９００ｇ〜１，５００ｇの間である。１か月間の反復投与による幼若カニクイザル毒性試験から得られたデータを、用量レベルの選択および６か月間の幼若ザル試験の計画の指針とする。反復投与毒性学試験は、予想される１〜６か月の期間にわたる臨床適用経路（ＩＴ−Ｌボーラス）および投与頻度（隔週；ＥＯＷ）を模倣するように計画されている。

上記のように、毒性学試験は、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＩＴ−Ｌ投与を、毒性学および安全性薬理学（神経、呼吸器および心血管の安全性）の観点から雌雄両方の個体で評価するために計画されている。本試験の毒性学的評価には、臨床観察、体重、摂餌量、臨床病理学、適切な安全性薬理学的評価（身体検査および心電図検査による）、肉眼的組織評価および顕微鏡評価が含まれる。限られた数のＣＳＦおよび血清試料を採取し、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩに関して、および被検試料に対する抗体に関して解析する。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの組織分布および細胞内局在を、それぞれ酵素活性アッセイおよび免疫組織化学により定量化する。さらに、選択した試験には、あらゆる重要で顕著な毒性学的所見の可逆性、または遅発性出現の可能性を評価する回復期間が含まれる。

実施例６：ＮＡＧＬＵ−ＩＧＦＩＩのＥＯＷ髄腔内投与
本実施例は、Ｎａｇｌｕ−／−マウスモデルにおいて、ＥＯＷで６回の注射でのＩＴ腰椎投与（３か月間の試験）の実現可能性を判定するために計画されたものである。本投与レジメンは、週１回の投与よりも臨床的に適切であり得る。

８週齢のＮａｇｌｕ−／−雌雄マウスを以下の実験計画に従って調べた：

肝臓、脳および血清でのＮａｇｌｕ活性アッセイ、血清での抗Ｎａｇｌｕ抗体アッセイ、ならびに肝臓および脳でのＢＣＡアッセイを含む生理学的試験を行った。脳、脊髄および肝臓でのＮａｇｌｕ ＩＨＣ、ならびに脳および脊髄でのＬａｍｐ染色を含む組織学的試験を行った。

脳、脊髄および肝臓を採取し、１０％ＮＢＦで固定した。５μｍのパラフィン切片を組織学的染色用に作成した。Ｎａｇｌｕの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を用いて、注射したタンパク質の細胞内取り込みを検出した。Ｈ＆Ｅ染色を用いて形態学的変化を観察した。リソソームの活性および病的状態の指標であるＬＡＭＰ、活性化したアストロサイトおよびミクログリア細胞に対する２つのＣＮＳ病理マーカーであるＧＦＡＰおよびＩｂａ−１を、組織病理学的改善の評価に用いた。

溶媒処置およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置マウスの脳、脊髄および肝臓におけるＮａｇｌｕ免疫染色では、脳および脊髄において、注射したＮａｇｌｕが髄膜（Ｍ）でのみＩＨＣで検出され、Ｎａｇｌｕ陽性染色は他のどの領域でも検出されないことが示された（図３２）。肝臓においては、類洞細胞（Ｓ）がＮａｇｌｕ陽性であり、肝細胞（Ｈ）ではＮａｇｌｕ取り込みが見られなかった。

溶媒処置およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置マウスの肝臓および脊髄におけるＬＡＭＰ免疫染色およびＨ＆Ｅ染色では、溶媒処置個体に比べ、Ｎａｇｌｕで処置した肝臓および脊髄の両方の全体にわたりＬＡＭＰ染色が減少していることが示された。Ｈ＆Ｅ染色により、処置群では溶媒処置個体に比べ、肝細胞における細胞空胞化が明らかに減少していることが示された（図３３および図３４）。

溶媒処置およびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置マウスの脳におけるＨ＆Ｅ染色では、３か月間のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの６回の隔週ＩＴ注射後に、脳における形態学的改善が示された。処置群の脳では、全検査領域の細胞空胞化（矢印）が溶媒群に比べて減少していた（図３５）。

３か月間の６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の各種脳領域におけるＬＡＭＰ ＩＨＣでは、ＳＦＢマウスへのＮａｇｌｕ ＩＴ投与により、溶媒処置群に比べ、全検査領域においてリソソーム活性が減少していることがＬＡＭＰ免疫染色で明らかに示された（図３５）。この減少は、ＬＡＭＰ陽性細胞の数が減少していること、細胞の大きさが小さいこと、および染色が明るいことを特徴とした。他の脳領域に比べて、脊髄に近い脳の尾状核の位置にある小脳および脳幹において顕著な減少が見られた。また、白質、海馬および視床を含めた深部脳領域でも明らかな減少が見られた。

３か月間の６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の各種脳領域におけるＩｂａ ＩＨＣでは、ミクログリア細胞の活性化が明らかとなった（図３６）。Ｎａｇｌｕ処置群において、溶媒処置群と比べて、陽性細胞数および染色強度の減少は見られなかった。しかし、検査したすべての脳領域において、陽性ミクログリア細胞の細胞形態が、溶媒群の大型で空胞のある細胞に比べて細胞の大きさが小さくなって変化していた（挿入図）。

３か月間の６回のＩＴ Ｎａｇｌｕ注射後の各種脳領域におけるＧＦＡＰ ＩＨＣでは、アストロサイトの活性化が明らかとなった（図３７）。溶媒処置群に比べて、ＧＦＡＰ陽性染色が小脳および脳幹では減少し、他の検査領域ではわずかに減少していた。

細胞内取り込みに関しては、これらのデータは、脳および脊髄において、３か月間の６回の隔週Ｎａｇｌｕ ＩＧＦＩＩ ＩＴ注射の後のみでＮａｇｌｕが髄膜細胞で検出されたことを示している。脳および脊髄の他のどの領域でも、ＮａｇｌｕはＩＨＣにより検出されなかった。肝臓では、Ｎａｇｌｕ陽性染色が類洞細胞で見られた。

脳および脊髄において、３か月間のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの６回の隔週ＩＴ注射後に、ＩＨＣでは注射したＮａｇｌｕが検出されなかったが、脳および脊髄全体にわたり組織病理学的改善が見られた。Ｈ＆Ｅ染色では、検査したすべての脳領域で細胞空胞化の減少が示された。処置群の脊髄の全体にわたり、および深部脳領域である白質、海馬および視床を含む評価したすべての脳領域で、ＬＡＭＰ染色が減少し、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ処置群の小脳および脳幹では顕著な減少が見られた。アストロサイトに対するＧＦＡＰ染色の染色減少パターンは、ＬＡＭＰほど劇的な減少ではなかったが、ＬＡＭＰ染色と一致していた。Ｉｂａ−１染色により、検査したすべての脳領域において、ミクログリア細胞の大きさの減少が示された。肝臓では、Ｈ＆Ｅ染色により細胞空胞化の減少が示され、Ｎａｇｌｕ処置群においてはＬＡＭＰ染色の顕著な減少が見られた。

実施例７：サンフィリポＢ患者の治療
例えばＩＴ送達による、ＣＮＳへの直接投与を用いて、サンフィリポ症候群Ｂ型（サンフィリポＢ）患者を効果的に治療することができる。本実施例は、サンフィリポＢの患者に対して、隔週（ＥＯＷ）、全４０週で、髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）により投与する、３用量レベルまでのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩおよび／またはｒｈＮａｇｌｕの安全性を評価するために計画された、多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を、図３８〜４１に図示する。

最大２０患者まで登録：
コホート１：５患者（最低用量）
コホート２：５患者（中間用量）
コホート３：５患者（最高用量）
無作為に５患者を無治療とする。

以下の基準を含むか否かに基づき、試験する患者を選択する：

サンフィリポＡの患者において、４０週間、用量を漸増してＩＴ注射により投与するＮａｇｌｕの安全性を判定する。さらに、認知機能に対するＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩおよび／またはｒｈＮａｇｌｕの臨床活性、ならびに単回および反復投与の血清中薬物動態および脳脊髄液（ＣＳＦ）中濃度を評価する。

本明細書に記載の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、後の実施例は単に本発明の化合物を例示するためのものであり、これらを限定することを意図するものではない。

本明細書および特許請求の範囲で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが明記されない限り、複数形の指示対象を含むということを理解するべきである。あるグループの１つ以上の要素の間に「または（もしくは、あるいは）」が含まれる請求項または記載事項は、そうでないことが明記されるかまたは文脈から明らかでない限り、１つ、２つ以上またはすべてのグループの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する場合に満たされるものとする。本発明は、グループの中の正確に１つの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態を含む。また本発明は、グループの２つ以上の要素または全要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態も含む。さらに本発明は、別途明記されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙されている１つ以上の請求項の１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、基本請求項に従属する別の請求項に（または関連する他の任意の請求項として）組み込まれるすべての変更、組合せおよび置換を包含するということを理解するべきである。要素が列挙されている場合（例えば、マーカッシュ群またはこれと同様の形式において）、要素の各下位グループも開示され、任意の要素（１つまたは複数）がそのグループから除外され得ることを理解するべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の特定の実施形態または本発明の特定の態様は、このような要素、特徴などからなる、またはこのような要素、特性などから本質的になるということを理解するべきである。簡潔にするために、これらの実施形態があらゆる場合に正確に本明細書に具体的に記載されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様が、本明細書において具体的に除外されることが記載されているか否かにかかわらず、請求項から明確に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明するために、および本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において参照される刊行物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (57)

1. サンフィリポ症候群Ｂ型（サンフィリポＢ）の治療方法であって、治療を必要とする対象に組換えα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質を髄腔内投与するステップを含む、方法。
2. 前記組換えＮａｇｌｕタンパク質が、Ｎａｇｌｕドメインと、リソソーム標的化部分とを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｎａｇｌｕドメインが、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記Ｎａｇｌｕドメインが、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記Ｎａｇｌｕドメインが、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記リソソーム標的化部分が、ＩＧＦ−ＩＩ残基である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ＩＧＦ−ＩＩ残基が、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＩＧＦ−ＩＩ残基が、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記ＩＧＦ−ＩＩ残基が、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
10. 前記ＩＧＦ−ＩＩ残基が、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）の８〜６７の残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
11. 前記融合タンパク質が、Ｎａｇｌｕドメインと、リソソーム標的化部分との間にリンカーをさらに含む、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記リンカーが、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）のうちの１以上のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号４）のアミノ酸配列が、タンデム反復で存在する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記リンカーが１以上のＧＡＰ配列をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記リンカーが、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記リソソーム標的化部分が、ＮａｇｌｕドメインのＣ末端に直接または前記リンカーを介して融合する、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記リソソーム標的化部分が、ＮａｇｌｕドメインのＮ末端に直接または前記リンカーを介して融合する、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記組換えタンパク質が、ヒト細胞から産生される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記組換えタンパク質が、ＣＨＯ細胞から産生される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記髄腔内投与が、１以上の標的脳組織内にＮａｇｌｕタンパク質の送達を生じさせる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記１以上の標的脳組織が、灰白質、白質、室周囲領域、軟膜クモ膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または髄質の深部およびその組合せの組織からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記Ｎａｇｌｕタンパク質が、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞に送達される、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記Ｎａｇｌｕタンパク質が、脊髄内のニューロンにさらに送達される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記髄腔内投与が、末梢標的組織においてＮａｇｌｕタンパク質の全身送達をさらに生じさせる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記末梢標的組織が、肝臓、腎臓および／または心臓から選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でリソソーム局在化を生じさせる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記髄腔内投与が、前記脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でリソソーム貯蔵を減少させる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記リソソーム貯蔵が、ＬＡＭＰ−１染色によって決定される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記リソソーム貯蔵が、対照と比較して少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍または２倍減少する、請求項２８に記載の方法。
30. 前記髄腔内投与が、ニューロン内で空胞化を減少させる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記ニューロンがプルキンエ細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記髄腔内投与が、前記脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でＮａｇｌｕ酵素活性を増加させる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記Ｎａｇｌｕ酵素活性が、対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する、請求項３２に記載の方法。
34. ＨＮＳ酵素活性の増加が、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、請求項３２または３３に記載の方法。
35. 前記Ｎａｇｌｕ酵素活性が腰部領域で増加する、請求項３２に記載の方法。
36. 前記腰部領域でのＮａｇｌｕ酵素活性の増加が、少なくとも約５００ｎｍｏｎ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｎ／時・ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。請求項３５に記載の方法。
37. 前記髄腔内投与が、サンフィリポ症候群Ｂ型の少なくとも１つの症状または特徴の強度の減少、重症度もしくは頻度の低下または発症の遅延を生じさせる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. サンフィリポＢ疾患の少なくとも１つの症状または特徴が、難聴、発達性言語障害、運動能力の欠損、多動、知能障害、攻撃性および／または睡眠障害である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記髄腔内投与が、２週間に１回実施される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記髄腔内投与が、１ヶ月に１回実施される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記髄腔内投与が、２ヶ月に１回実施される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記髄腔内投与が、静脈内投与と組み合わせて用いられる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記静脈内投与が、１ヶ月に１回以下の頻度である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記静脈内投与が、２ヶ月に１回以下の頻度である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記髄腔内投与が、静脈内投与の不在で用いられる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記髄腔内投与が、同時免疫抑制療法を併用せずに用いられる、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記Ｎａｇｌｕ融合タンパク質が、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で投与される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 治療用融合タンパク質であって、
    Ｎａｇｌｕドメインと、
    リソソームターゲティング部分とを含み、
    該治療用融合タンパク質は一旦投与されると、リソソームを標的にして、ｉｎ ｖｉｖｏで治療的に活性になる、治療用融合タンパク質。
49. 前記Ｎａｇｌｕドメインが、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の治療用融合タンパク質。
50. 前記Ｎａｇｌｕドメインが、配列番号１（成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質）と同一のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の治療用融合タンパク質。
51. 前記リソソーム標的化部分が、ＩＧＦ−ＩＩ残基である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の治療用融合タンパク質。
52. 前記ＩＧＦ−ＩＩ残基が、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号２）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の治療用融合タンパク質。
53. 前記ＩＧＦ−ＩＩ残基が、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号２）の８〜６７の残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の治療用融合タンパク質。
54. 前記融合タンパク質が、前記Ｎａｇｌｕドメインと、前記リソソーム標的化部分との間にリンカーをさらに含む、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の治療用融合タンパク質。
55. 前記リンカーが、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の治療用融合タンパク質。
56. 前記リソソーム標的化部分が、ＮａｇｌｕドメインのＣ末端に直接または前記リンカーを介して融合する、請求項５４または５５に記載の治療用融合タンパク質。
57. 治療用融合タンパク質であって、配列番号５（全長Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、該治療用融合タンパク質は一旦投与されると、リソソームを標的にして、ｉｎ ｖｉｖｏで治療的に活性になる、治療用融合タンパク質。