JPH09511405A

JPH09511405A - レトロウイルスベクターハイブリッド及びその遺伝子転移のための使用

Info

Publication number: JPH09511405A
Application number: JP8509149A
Authority: JP
Inventors: バウム，クリストファー; ストッキンク−ハーバース，キャロル; オスタータグ，ボルファム
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-08-10
Publication date: 1997-11-18
Also published as: ATE244310T1; DK0781343T3; ES2202368T3; PT781343E; US5858744A; EP0781343B1; WO1996007747A1; EP0781343A1; AU3258295A

Abstract

(57)【要約】ａ）リーダー領域内にＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてMESVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域を含むことを特徴とし、造血幹細胞における効果的な遺伝子転移に特に適した複製欠損レトロウイルスベクターハイブリッド。

Description

【発明の詳細な説明】レトロウイルスベクターハイブリッド及びその遺伝子転移のための使用本発明は、レトロウイルスベクターハイブリッド、及びその遺伝子転移、特に造血幹細胞（ES）内への遺伝子転移のための使用に関する。複製欠損を伴うレトロウイルスベクターは、ヒト血液形成系の細胞への遺伝子転移及び遺伝子療法の適用において、現在標準となっている（A.D.Miller(1992) (1)，R.C.Mulligan(1993)(2)，R.Vile and S.J.Russel.(1994)(3))。それらの主な利点は： −その感染が、それにより転移されたベクター及びDNA配列の、分裂活性細胞の宿主ゲノム内への安定な一体化を導くこと −その宿主ゲノム内への一体化の数が感染条件により制御され得ること −レトロウイルス遺伝子転移の安全な態様が十分に調査されており；ヒトへの多数の適用において合併症はほとんどおきていないことである。レトロウイルスベクターの最もよく言われる利点であるそれらの高遺伝子転移能は、血液形成系への適用に部分的にのみ適用される。遅く成熟した血液形成前駆細胞のみに、好ましくは、Molonyネズミ肉腫ウイルス（MoMuSV）に基づく慣用的ベクターが感染する；これらのベクターが感染した前駆体細胞の30〜95％は、最初のサイレンシング（Silencing）機構（4）のため転移した遺伝子を発現しないか又は不適当な発現を示す；更に、生体内での長い滞留期間の後、レトロウイルスにより制御される遺伝子発現は、第２のサイレンシングのため機能しないところまで最初に発現する細胞の高割合において弱められる（Palmer et al．(1991)(5)，Brenner et al．(1993)(6))。胚の癌細胞（造血幹細胞の骨髄（非リンパ）誘導体）のような胚細胞において、ウイルスは実際に一体化されるが、その一体化されたプロウイルスの発現は阻止されることが示されている。 MoMuSVの変異体及び誘導体は、Stocking et al．(1993)(21)から周知であり、それはこのような細胞においてレトロウイルス遺伝子発現を改良するのに用いられ得る。このようなハイブリッドはLTRにおいて、特にＵ３領域における点変異により得られる。例えば、ECF-1レプレッサーの結合はMoMuLVの−345における点変異により削減され得る。SP-1のための結合部位を形成する点変異（例えば−16 6における点変異（S.Mcknight and R.Tijan(1986)(16))）が同じように有利である。LTR領域の外側に変異を導入することも更に有利である。５′-LTRの直接の下流に隣接する18bp領域が反対制御因子(NRE；サイレンサー（silencer）結合因子)であることが示されている。この因子における点変異はレトロウイルスの転写が改良されることを可能にする（ネズミ胚幹細胞ウイルス、MESV；M.Grez et al．(1990)(22)）。本発明の目的は、特に造血幹細胞及びその骨髄（非リンパ）誘導体においてレトロウイルス遺伝子発現を更に改良するために用いられ得るレトロウイルスベクターハイブリッドを提供することである。本発明は、ａ）Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位として、リーダーペプチド内にMESV及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位を含み、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてフレンド（Friend）ネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域を含むことを特徴とするレトロウイルスベクターハイブリッドに関する。本発明に従うベクターハイブリッドは、好ましくは、リーダー領域としてMESV のリーダー領域を含む。本発明の更なる実施形態において、Ｕ５領域及び／又は好ましくはtRNAプライマー結合部位もMoMuSV由来である。本発明に従うベクターハイブリッドは、好ましくは、３′-LTRとしてフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのLTRも含み、これによりMoMuLV及びMESV からのＵ３及びＲ領域に加えてF-MuLVからのＵ５領域も含む。ベクターハイブリッドは、複製欠損及び複製能をもつものであり得る。複製欠損ベクターは、レトロウイルス遺伝子機能(gag，env，pol）を含まず、それにより独立してウイルス粒子を形成することができないベクターとして理解される。しかしながら、ベクターは、パッケージング機能(psi)を通常含む、感染性レトロウイルス粒子を形成するために、遺伝子機能gag，env及びpolを（エピソームとして又はゲノム内に一体化された）安定な形態において含むパッケージング細胞系は、本発明に従う複製欠損DNAベクターが移入される。gag及びenv 機能のためウイルス粒子内にパッケージされたRNA転写物が形成される。これらのウイルス粒子は、それらの中に含まれるRNAゲノムがレトロウイルス遺伝子機能を有さないため複製欠損である。複製することができるレトロウイルスベクターハイブリッドは、遺伝子領域ga g，pol及びenvを含む。これらの遺伝子領域は、いずれかの要求されるレトロウイルスから得られる。唯一env領域の選択のみが感染する細胞に依存する。しかしながら、このような方法は、当業者に周知である。この様に、複製することができるエコトロピック、ゼノトロピック、アンホトロピック又はデュアルトロピックウイルスを作ることができる。これ及びベクターウイルス粒子及びヘルパー細胞の作製に基づく更なる詳細は M.Kriegler，Gene Ttansfer and Expression，A Laboratory Manual，W.H.Freem an & Co.，New York(1990)，47〜55及び161〜164(31)に記載される。この出版物は、本適用の開示の目的物である。本発明の要旨内のサイレンサー蛋白質は、例えば造血幹細胞からの細胞の（例えば変異細胞由来の）核蛋白質であって、好ましくは５′-LTR直後であるMoMuLV 及びMoMuSVの最初の450bp、好ましくは最初の18bpに結合し、プロウイルスのシス制御との相互作用によりレトロウイルスの転写を阻害するものとして理解される。 MESVのリーダー領域は、短い直接の末端の繰返し（Ｒ）、Ｕ５領域及びtRNAプライマー結合部位を含むMESVの５′-LTRに直ちに隣接する配列並びにパッケージング領域（Ψ）からの配列の合計として理解される。最大において、リーダーペプチドは、Ｒから翻訳開始までをウイルス内に含む完全な配列からなり得る。しかしながら、Ｒに加えて端を切りとったリーダー領域を用いることが好ましく、Ｕ５は好ましくは５′-LTR領域の端の下流の約最初の450塩基からなる。Ｕ５領域及びtRNAプライマー結合部位がMESVから排他的又は主要な程度まで得られ、リーダー配列の他の部分がMoMuLV又はMoMuSVから得られることも好ましい。適切な MESV領域は、図（図１〜５）のKpnＩ(約550)〜BalＩ(約729)に示される。 MESVのリーダー領域は、サイレンサー蛋白質の結合を削減又は防止する点変異が挿入されたMoMuLV又はMoMuSVのリーダー領域（MoMu LV及びPCMVのＵ３、Ｕ５及びＲの配列、（22）及び（23）を参照のこと）に相当する。MoMuLV及びPCMVと比較して、MESVのリーダー領域は５′-LTRに直接隣接する18bp領域内に５つの点変異を含む（C.Stocking et al．(1993)(21)）。これは、感染した細胞からの核蛋白質の阻害結合能を激的に削減し、ベクターハイブリッド中に含まれる遺伝子の発現を相当に改良する（R.Petersen et al.，Mol.Cel l．Biol．11（1991）1213〜1221(8)）。これらの点変異のかわりに、（好ましくは５′-LTR領域の端から下流の最初の450塩基内、特に好ましくは18bp領域内の）リーダー領域内の他の（少くとも１つの）点変異も、例えばリーダー領域へのサイレンサー蛋白質の阻害的結合を削減又は防止するのに適している。これにより、先に言及される配列番号：１に記載される配列に加えて、本発明の要旨内の MESVのリーダー領域も配列番号：１のこのセクションに本質的に対応する配列としても理解され、tRNA結合部位及びpsi機能を含み、そして移入のために選択された細胞からのサイレンサー蛋白質の阻害的結合が削減又は防止される様に点変異により修飾される。点変異がリーダー領域へのサイレンサー蛋白質の結合を防ぐのに適するか否かを確認するために、LTR、検査されるべきリーダー領域及び好ましくはCAT遺伝子であるインジケーター遺伝子を含むプラスミドを作製することが普通である。検査されるべき細胞にこのプラスミドを移入させ、CAT活性は、好ましくは48時間後に決定される（過渡的移入）。CAT活性が明らかにあるなら、その点変異はこれらの細胞におけるサイレンサー蛋白質の結合を防ぐのに適している（P.Artelt et al．(1991)(32)）。過渡的移入実験は、シス制御配列が特に初期の多能性骨髄細胞において遺伝子発現に阻害効果を与える（初期のサイレンシング）MoMuSVのリーダー配列内に位置する。ネズミ胚幹細胞ウイルス(MESV (22))のリーダー配列によるこの領域の置換は、骨髄幹細胞における阻害効果を完全に止める。MESVのリーダー配列は内因性マウスレトロウイルスdl-587rev(23 )から初めに得られ、胚幹細胞に見られるMoMuSVリーダーのサイレンシングを止めるためにMESV内に導入された（22）。５′-LTRの３′に直ちに位置したレトロウイルスのプライマー結合部位(PBS)の変異は、サイレンシングを止めるために決定的である。 F-MuLV群のレトロウイルスは当業者に周知であり、例えばD.Linnemeyer et al ．(1981)(7)，J.Friel et al．(1990)(9)，S.P.Clark and T.W.Mak(1982)(10)， L,Wolff et al．(1985)(11)，R.K.Bestwick et al．(1984)(12)，W.Koch et al ．(1984)(13)及びA.Adachi et al．(1984)(14)に記載される。考察はW.Ostertag et al．(1987)(15)に与えられる。悪性組織肉腫ウイルス(MHSV)(9)、SFFVp Lil ly-Steeves(10)、SFFVa(11)、Rauscher SFFV(12)、F-MuLV c157(13)及びフレンドミンク細胞病巣形成ウイルス（F-MCFV FrNx(14)、F-MCFV pFM548(13)）が好ましくは用いられる。本発明によれば、ゲノムベクターRNAの配列はＵ３領域内の先に記載のフレンドウイルス科の３′-LTR領域に高範囲の配列相同性を有する３′-LTR配列として適する。SFFVpのLTR配列は、配列番号：１（ヌクレオチド1707〜2283）に記載される。本発明に従う利点は、ヒト及びマウスの多数の代表的細胞系におけるレポーター遺伝子構成物の過度的移入において示される。驚くことに、MESVのリーダー配列（好ましくはtRNA結合部位）と組み合わせられたフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）のマウスレトロウイルスのＵ３配列が骨髄幹細胞及び前駆体細胞における特に有効な遺伝子発現を可能にすることが判明した。本発明に従うベクターハイブリッドでの遺伝子発現の増加はMoMuSVと比較して10倍超である。これは、顆粒球、マクロファージ及び赤血球の比較的遅い前駆体細体並びに早期の多能性前駆体及び骨髄システムの幹細胞でさえも適用される。本発明に従うベクターハイブリッドは特にMoMuSV-LTRが最初のサイレンシングの促進を示す未成熟の多能性骨髄細胞の場合、有効な遺伝子発現を可能にする。その活性はリンパ系及び繊維芽細胞においても高い。そのLTR配列が配列番号：１（bp2654〜3230）に記載される赤血球増加症誘導性脾臓病巣形成ウイルスSFFVp(7))、及び悪性組織肉腫ウイルス（MHSV(9)、LTR 配列番号：４、bp1707〜2324）が特に好ましい。これらのウイルスのＵ３領域において、SFFVp Lilly-Steeves(10)、SFFVa(11)、Rauscher SFFV(12)、F-MuLV c1 57(13)及びフレンド−ミンク細胞病巣形成ウイルス（F-MCFV FrNx(14)、F-MCFV pFM548(13)）のようなフレンドウイルス科の他の代表的ウイルスに対して高範囲の配列相同性がある。これら及び類似したフレンド関連レイトロウイルスは、Ｕ３領域の配列相同性のためSFFVp及びMHSVと類似した発現パターンを有する。Ｕ３のエンハンサー領域(転写開始の５′側上の340〜140ヌクレオチド(10))における変異は、本発明に従うベクターによる骨髄幹細胞及び前駆体細胞において、遺伝子発現のMoMuSVと比較して大きく増加することが特に有利である。（F-MC FV FrNxに類似した）SFFVp及びMHSVにおけるいわゆる直接的繰返し因子の部分的複製が、重要なものである。骨髄細胞において効果的な遺伝子発現を導く転写因子のための結合部位がここに位置し得る。 SFFVp及びMHSV並びにフレンドMCFVは、直接的繰返しの５′に直接転写因子Sp Ｉ（16）のための結合部位を有する。SpＩは遺伝子発現においてかなりの増加を通常導く周りの転写因子と多重に相互作用することができる。MoMuSV誘導体骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV (17)，(18)）及びPCC4-細胞通過MPSV(PCMV(19))の場合、Ｕ３領域におけるSpＩ結合部位の存在も、胚幹細胞（20）及びおそらく血液幹細胞（21）もMoMuSV-LTR のサイレンシングの停止のために必要である。SFFVp、MHSV及びフレンド−MCFウイルスのSpＩ結合部位も同様の機能を有する。本発明の更なる実施形態において、レトロウイルスベクターハイブリッドは３ ′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてMPSVからのＵ３及びＲ領域を含む。MPSVは LTR(21)において点変異によりMoMuSV及びMoMuLVから異なる。この場合、Ａ（-38 1）は削除され、次の置換：Ｃ→Ｔ，−345；Ｔ→Ａ，−326；Ｔ→Ａ；−249及びＡ→Ｃ，−166が行われる（(21)に従う番号）。この場合、レトロウイルスベクターハイブリッドは、Ｕ５領域及びtRNAプライマー結合部位としてリーダー領域内にＵ５領域及びMESVのtRNAプライマー結合部位を含む。（以下ＭＰＥＶとも呼ばれる）このようなMPSV／MESVハイブリッドベクターはMoMuLVに基づくベクターと比較してかなりの利点を有し、体の遺伝子療法において多くの適用のために大きな重要性があることが判明した。いずれかの要求されるＵ３及びＲ領域が５′-LTRにおいて用いられ得る。それは、ウイルスの一体化の後、３′-LTRからのＵ３は、レトロウイルスの生活環の完了後の５′-LTR位置においても標的細胞内に複製され、遺伝子発現をおこすからである。Ｕ３及びＲ領域は例えばMPSV，PCMV及びMESVのような例えばMoMuLV又はMoMuSV誘導体から得られる。F-MuLVからの５′-LTRも５′-LTRとして適している。本発明に従うベクターハイブリッドは、骨髄幹細胞及び前駆体細胞のレトロウイルスのトランスダクションの後に高い組織特異的発現を示す。それゆえ、これらのベクターは、MoMuSVベクターと比較して骨髄幹細胞及び前駆体細胞において遺伝子転移効果をかなり増加させる可能性がある。本発明に従うベクターは、MoMuSVベクターより骨髄細胞においてサイレンシング過程がかなり少い可能性を更に有する。骨髄細胞におけるこれらのベクターの高くかつ可能なだけ規則正しく持続的な遺伝子発現が、ヒトの血液形成系への多くの遺伝子転移プロトコルの成功的適用のための基礎を形成し得る。実施例に記載される構成物は、ベクターにより転移されたcDNAは他の遺伝子により異なることなく置換され得る様に作製される。発現の組織特異性は、慣用的なMoMuSVベクターの場合に観察される骨髄系における最初のサイレンシングを止めるのに適切である。これは骨髄細胞における機能的遺伝子転移比率においてかなりの増加を導く。高い機能的遺伝子転移比率は、骨髄系へのほとんどの遺伝子転移／遺伝子療法の適用において要求されるので、これは本発明に従う構成物の一般的に利用できる利点である。フレンドウイルス関連Ｕ３領域は、生体内遺伝子発現の持続性のためにマウスの骨髄系においても選択される。第２のサイレンシングはMoMuSVベクターでよりもかなり低い程度にこれらのベクターでおこった。MESV配列のための置換による阻害的リーダー配列の排除は、この点における更なる利点の１つである。これは、レトロウイルスにより転移される配列の持続的（可能なら生きている間の）発現が骨髄系（遺伝子マーカー研究、代謝欠損の相関関係）において要求される全ての遺伝子転移／遺伝子療法の適用のために重要なものである。この目的のために本発明に従うベクターハイブリッドは、ウイルスと異種である少くとも１つの遺伝子を含み、真核生物細胞において発現され得る。このような遺伝子は、例えば多重薬物耐性遺伝子(MDR遺伝子)、neo^R遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子、LNGFR 遺伝子、セレブロシダーゼ遺伝子又は単純ヘルペスTK遺伝子である。好ましい実施形態において、いくつか及び好ましくは２又は３の異種遺伝子もベクターハイブリッド内に含まれる。これらの分離した遺伝子の発現を可能にするために、第２又は第３の遺伝子の前にプロモーター、（好ましくはSF7Vpからの）サイレンシング部位又は内部リボソームエントリー部位(好ましくはポリオウイルスからのIRES(I.R.Ghattas et al．(1991)(26))を挿入することが好都合である。フィブロブラストイドパッケージング細胞系における高ウイルスタイターの産生は、骨髄細胞において遺伝子転移のために用いられることが意図されるレトロウイルスベクターのための更に重要な要求である。以下に列記される全ての構成物の例の場合において、繊維芽細胞のレトロウイルスパッケージング細胞系おけるフレンド関連Ｕ３領域の活性は、細胞培養上清のml当り10⁵〜10⁶ベクター転移レトロウイルス粒子の要求されるタイターを産生するのに適する。従って、本発明の目的物は、活性な外来遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入された真核細胞の産生のための方法であって、前記真核細胞が、そのゲノムが、ａ）リーダー領域としてのMESV又はMoMuSVのリーダー領域と、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F- MuLV）からのＵ３及びＲ領域と、ｃ）前記外来遺伝子と、を含む複製欠損したレトロウイルスベクターウイルスで形質導入されることを特徴とする方法でもある。 F-MuLVからのLTRは、好ましくは３′-LTRとして用いられ、そのうえ前記Ｕ３及びＲ領域を含む。本発明の更なる目的物は、そのゲノムがａ）リーダー領域としてMESV及び／又はMoMuSVのリーダー領域と、ｂ）３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域と、を含む複製欠損レトロウイルスベクターウイルスで真核生物を形質導入することにより得られうるレトロウイルスで形質導入された真核生物である。このベクターは、真核細胞において発現され得る１又はいくつか（３まで）の外来遺伝子を任意に含む。哺乳動物細胞は、好ましくは造血細胞であり、特に造血幹細胞が真核細胞として好ましくは用いられる。 F-MuLVからのLTRは、３′-LTRとして好ましくは用いられ、それは前記Ｕ３及びＲ領域を含む。活性外来遺伝子は、外から細胞内に導入され、ゲノム内への一体化の後、この細胞内で発現される（活性である）遺伝子として理解される。外来遺伝子は、細胞ゲノム内に存在しないゲノム（例えば neo^R、LNGFRレセプター（D.Johnson et al．(1986)(33))のような抗生物質耐性遺伝子、セレブロシダーゼ遺伝子又は単純ヘルペスTK遺伝子）又はゲノム内に存在するがそこで発現されないか、又は多重薬物耐性(MDR)遺伝子のような不適切な程度までのみ発現される遺伝子であり得る。本発明の更なる目的物は、ゲノムとしてレトロウイルスRNAを含む複製欠損感染性ウイルス粒子であって、前記ゲノムが、パッケージング機能及びtRNA結合部位を含むMESVからのリーダー領域を含み、真核細胞内で発現され得、その３′端においてフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）を含むが活性なgag，env及び pol配列は含まないウイルスのための異種遺伝子を含むことを特徴とするウイルス粒子である。本発明の更なる目的物は、リーダー領域としてのMESVのリーダー領域及び３′ -LTRとしてのフレンドネズミ白血病ウイルスを含むベクターハイブリッドと共にヘルパー機能gag，env及びpolを有する真核ヘルパー細胞の移入、（例えば細胞のポリメラーゼによる）前記細胞内でのウイルスゲノムとしてのベクターハイブリッドのDNAに相当するRNAの産生、前記細胞内に形成された複製欠損の空のウイルスエンベロープ内への前記RNAのパッケージング、並びに前記ウイルスゲノムを含む感染性ウイルス粒子の単離による複製欠損感染性ウイルス粒子の産生のための方法である。本発明の更なる目的物は、生体外又は生体内遺伝子療法のための医薬剤の製造のための、リーダー領域としてのMESVのリーダー領域並びに３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域を含む本発明に従う複製欠損レトロウイルスベクターハイブリッドの使用である。ベクターハイブリッドは、Ｕ５領域及び／又はtRNA結合部位としてのリーダー領域内のMESV又はMoMuLV／MoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNA結合部位を含む本発明に従う方法及び使用にも適する。適用の範囲Ｉ．骨髄幹細胞及び前駆細胞がレトロウイルスのための標的集団である全ての体の遺伝子転移／遺伝子療法個々のプロトコルにおいて、異なるcDNAがベクター内に一体化される。例は −遺伝子マーカー研究（１）：neoR又は短縮神経成長因子レセプターのような選択可能マーカー遺伝子は、検査される病気／療法の条件下で生物内の標識された細胞集団の運命を監視するために転移される。SFFVp U3及びMHSV U3（MESVリーダー）の制御下にneoRを有するneoRベクターpSF1N及びpMN1Nは、neoR−転移Maloneyベクターと比較してマウス幹細胞系FDCPmixのモデル系における機能的遺伝子転移比率のかなりの増加を示す。それらは、ヒト骨髄幹細胞におけるneoR転移に適している。 −高投与量化学療法（28）の副作用に対する骨髄の保護：MDR1又はアルキルトランスフェラーゼのような化学療法耐性を媒介する遺伝子が転移される。最適化フレンドウイルス関連ベクターによる高転移比率及び発現は、骨髄抑制的副作用を防ぎ、最終的に化学療法の第２の腫瘍の誘導も防ぐ。 −代謝の病気の相関関係：単一遺伝子の遺伝病の場合、欠損遺伝子の完全な複製が、骨髄幹細胞内へのレトロウイルスの遺伝子転移の手段により導入される。適用は、例えばその遺伝子欠損が骨髄系に影響を与える遺伝病（フルラー症候群のような蓄積症；M.Gaucher(29)）の場合に考えられる。： II．複製−コンピテントフレンド関連レトロウイルスのクローニング初期の骨髄幹細胞及び前駆細胞に対するそれらの広範囲の宿主のため、本発明に従うウイルスはこれらの細胞中の挿入変異誘発に特に十分に適している。挿入変異誘発は、骨髄系の生理的成長制御において重要な機能を有する遺伝子がクローンされるのを可能にする。挿入変異誘発としてレトロウイルスを用いる原理は、概にいくつか記載されている(Review：Kung et al．(1991)(34))。レトロウイルスはゲノム内に不特異的にDNA配列と一体化し、この過程において、遺伝子を活性又は不活性化する。複製可能なレトロウイルスは極めて高い効率で組織に感染し、それゆえ一体化による変異を形成する可能性を増加させる。このような変異は、かわりに変異した細胞の退化を導き得る。即ち腫瘍が形成される。調節遺伝子の同定のためのマウス（通常新生マウス；それらは効果的に機能する免疫系をまだ有さず、それゆえレトロウイルスに対して極めてセンシティブであるからである）での生体内実験において、これらにレトロウイルスを感染させ、約３ケ月の潜在期の後、（ウイルスタイプによる）特定の腫瘍を発見し検査することが可能である。クローンレトロウイルスの一体化部位の分析は、その活性化又は不活性化が改良又は退化された表現型の細胞を導き得る遺伝子を表わす。これは、リガンド、レセプター、シグナルトランスデューサー及び転写因子のための遺伝子のような大量の異なる遺伝子型が発見されるのを可能にする。特定のウイルスにより形成され見いだされる腫瘍タイプと活性化／不活性化遺伝子との間の高い相関関係があることが需要である（例えば、フレンド−MuLVにより誘導された赤白血病細胞の場合、約80％の腫瘍はFli-1座における一体化及び転写因子PU-1遺伝子の転写の活性化を示す。トランスジェニックマウスにオンコジーン (例えばmyc)のエストロピックな発現を感染させ、腫瘍形成を観察することにより相互作用するオンコジーンを同定することが可能であった。かなり短い潜在期間の後、第２の変異により腫瘍が形成された(例えばpim-1遺伝子における“第２ヒット”))。しかしながら、先のレトロウイルス構成物を用いて可能性のある遺伝子のいくつかを同定することが可能であるだけである。この細胞の活性化／不活性化及び付随した表現型の改良の試みで同定され得る遺伝子の範囲は特定の細胞型のために用いられるレトロウイルスの特異性に大きく依存する。これにより先に用いられるレトロウイルスは、造血細胞及び胚幹細胞において極めて低い感染性を示すのみである（例えば報告：Stocking et al．(1983)(21)）。これはいくつかの理因による；これは、第１にレトロウイルスのLTRにおける転写調節因子（Stockin g et al．(1985)(18)）、第２にウイルスの複製に必要である細胞及びウイルスの蛋白質の間の蛋白質相互作用のためでもある。複製−コンピテントレトロウイルスは、全体の細胞集団の完全な感染を、そして変異を形成するかなり高い可能性を導く感染によりレトロウイルスを産生する新しい細胞を作る。同様の効果は、標的細胞系とのレトロウイルスパッケージング系の複雑かつ時間のかかる同時培養によってのみ達成され得る。フレンド関連複製−コンピテントウイルスは、更に、血液幹細胞に対する感染性の更なる改良も有する強制通過変異体を作るのに用いられ得る。これらのウイルスのレトロウイルスの構造蛋白質における変異は、骨髄細胞内への遺伝子転移のための最適化パッケージング細胞系を産生するのに用いられ得る。これらのウイルスのシス制御配列における変異は、血液幹細胞遺伝子転移のためのレトロウイルスベクターを更に最適化するのに用いられ得る。本発明の更なる目的物は、MESVの制御因子（リーダー領域）並びに任意に３′ -LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域と組み合わされたMoMuLV又はMoMuSVを含む複製することができるエコトロピック、セツトロピック、アンホトロピック又はデュアルトロピックレトロウイルスであり、これは結果としてネズミ（生体内及び試験管内）又はヒト（試験管内）前駆細胞により効果的に感染して変異を誘発することができる。レトロウイルスは、好ましくは、３′-LTRとしてF-MuLVからのLTRを含む。両方の構成物の組合せは、慣用的に複製可能なレトロウイルスで検出され得ない遺伝子を同定するのに用いられ得る新しい質からなるレトロウイルス挿入変異誘発を導く。それらは、各々の感染した細胞が新しいウイルスのための産生細胞となるので極めて高いタイターで産生され得、ほぼ100％感染比率となる。選択のためにレトロウイルスベクターにおいて用いられるネオマイシン耐性遺伝子はそれらの中から削除され得る。これはneo^Rがサイレンサーとして機能して（Artelt et al．(1991)(32)）、結果として改良された挿入比率を導くので、LTRプロモーターのより高い転写を導く。ネズミ及びヒト造血細胞及び胚幹細胞は、本発明に従うレトロウイルスにより高めて効果的に試験管内に感染され得、変異体はゲノム内への挿入に産生され得る（遺伝子の活性化又は不活性化）。それゆえ、生体内実験の場合も本発明に従うウイルスが早期の造血細胞及び胚細胞により高い効率で感染し、ゲノム内への一体化により遺伝子を活性化又は不活性化するだろうことが予想される。遺伝子活性化はいくつかの方法でおこり得る。これにより遺伝子の上流の一体化が３′-LTRプロモーターの転写制御下でそれを活性化することができる。遺伝子活性化を導き得る負の制御因子の結合部位も不活性され得る。挿入がイントロンの上流及びそれの中の多くの塩基を直接読み飛ばすか又はそのエンハンサー効果のいずれかにより完了した後に５′-LTRプロモーターが遺伝子を活性化し得ることを証明するいくつかの例（Kung et al．(1991)(34)）がある。遺伝子内の又はそれに伴うプロモーター／エンハンサー領域内の一体化も、対応する遺伝子の不活性化を導く。細胞の制御のために重要である遺伝子が影響を受けるなら、細胞が退化する、即ち腫瘍が形成され得ることが可能である。本発明に従うウイルスは、それゆえ他の遺伝子、例えばこのような細胞タイプにおいて複製しないか又は極めて少しだけ複製する慣用的ウイルスにより見い出され得るものと異なる造血又は極幹細胞の細胞制御に含まれる遺伝子を見つけるのに用いられ得る。本発明に従う複製−コンピテントウイルスは、以下の様な例について試験管内にも用いられる。因子依存性前骨髄球細胞系を、レトロウイルス挿入変異誘発により因子非依存的に作った。即ち成長因子遺伝子をレトロウイルス一体化により活性化した。MP SVベクターを産生するパッケージング系と共に標的細胞系を培養することによりレトロウイルス感染を行った。この試験管内の試みは、本発明に従う構成物を用いることによりより効果的に行われ得る。更に、ネズミ又はヒト胚及び造血幹細胞は、本発明に従うウイルスを用いる先の研究にも用いられ得る。更なる適用は、例えば前駆細胞においてより高い感染効果を有するウイルスを産生することができる遺伝子療法のための改良されたベクターウイルスパッケージング系を形成する目的を有する実験においてである。これらの細胞において、レトロウイルスの感染／複製を妨害するいくつかのブロックがある。本発明に従う構成物の使用は、転写ブロックが既に除去された複製可能野生型MoMuLV又はAM 4070を超える利点を有する。感染効果における改良はそれゆえウイルス蛋白質における対応する特異に帰する。本発明に従う構成物の更なる適用は、胚幹細胞における１又はいくつかの遺伝子の挿入不活性化により“ノック・アウト”マウスを形成することである。本発明は、以下の実施例、図面及び配列プロトコルにより更に解明される。配列プロトコルは以下を示す：配列番号：１ pSF1の配列配列番号：２ pSF2の配列配列番号：３ pSF3の配列配列番号：４ pMH1の配列配列番号：５ pSF-MDRの配列配列番号：６ pMP-MDRの配列（その配列のプロウイルスの部分のみを各々の場合に示す）図１Ａ pSF-MDRのプラスミドマップを示す。（制限部位のより正確な詳細）図１Ｂ pSF-MDRのプラスミドマップを示す。（制限部位のより正確な詳細）図２Ａ pSF1の制限マップを示す。図２Ｂ pSF1Nの制限マップを示す。このベクターは、そのneo^R遺伝子が多重クローニング部位(MCS)内に挿入されるpSF1に対応する。図３Ａ pSF2の制限マップを示す。図３Ｂそのneo^R遺伝子の一体化後のpSF2に対応するpSF2Nの制限マップを示す。図４Ａ pSF3の制限マップを示す。図４Ｂそのneo^R遺伝子の一体化後のpSF3に対応するpSF3Nの制限マップを示す。図５Ａ pMH1制限マップを示す。図５Ｂ neo^R遺伝子の一体化後のpMH1対応するpMH1Nの制限マップを示す。図６ベクターpSF-MDR1形成のためのスキームを示す。図７ベクターpSF1N，pSF2N，pSF3N及びpMH1Nの形成のためのスキームを示す。図８標準的なMoMuLVベクターと比較したFMEV及びMPEV-mdr1ベクターによる骨髄細胞の保護を示す。（繊維芽細胞タイター及びクローニング効果について修正された）平均相対形質導入頻度を示す。種々のベクター間の繊維芽細胞タイターは３倍未満で種々である。Ａ：細胞系K-56 2、Ｂ：細胞系TF-1。図９ pMP-MDRの制限マップを示す。実施例１ａ）構造の記載表１は、本発明に従う構成物のクローニングストラテシンを示す。Ｉ．pSF-MDR（図１，６、表１、配列番号：５）このベクターをenv領域の一部分及び３′LTRの完全なＵ３領域をSFFVp配列により置きかえるMESVベクターR224(ベースpVC19)に基づいてクローンした。ベクターpSF5＋３（例えば図６）をこの様に得た。第２のステップにおいて、MDR1をコードする（pMDR2000XS（25）からの）cDNAを多重クローニング部位内に挿入した（NotＩ， XbaＩ，BamHＩ，Hind３）。 II．pSF1N，pSF2N，pSF3N，pMH1N（図２〜５，７、表１）これらのプラスミドの骨格は、５′LTRのXbaＩ切断部位と３′LTR内のKpnＩ切断部位との間で主要な欠失が行われるMESVベクターR224に基づく。その相補的配列を、３つのフラグメント連結反応の手段により挿入した；ベースベクターpSF1 ，pSF2，pSF3N及びpMH1が生ずる（形成スキーム及びクローニングストラテジー、図７、表１、配列番号：１〜４に記載される配列）。３つの連結反応のために用いられるフラグメントを、更にベクターを最適化するために単純な修飾が行われ得る補助的構成物（形成スキームを参照、図６）から得る。タイターを最適化するために他のフレンド関連レトロウイルスの類似配列により、又はリーダーの先に記載の修飾によりSFFVp又はMHS V U3領域を置換することも考えられる。構成物の例pSF1N，pSF2N，pSF3N，pMH1N を(R229からの)neo^RcDNAの挿入後に得た。この構成物例は、転移されるべき遺伝子の交換のために用いられ得る単一の制限切断部位と共にポリリンカーを有する。これらの切断部位において、SFFVpのスプライスアクセプター又はいわゆる内部リボソームエントリー部位をIRES（I.R，Ghattas et al．（1991)(26)）のような必要であり得る第２の遺伝子発現のための制御配列を挿入することが更に可能である。（３′-LTR内の）Ｕ３及びＲのような構造物例中のフレンド関連領域も、レトロウイルスの生活環の完了後に５′-LTR位置にコピーされ、その後標的細胞内で遺伝子発現される。その構成物例は、レトロウイルス遺伝子転移及びレトロウイルス遺伝子発現のために必要な全てのシス制御因子を含む。SFFVp(又はMHSV)、M ESV及びMoMuSVの特性はこれらの構成物において組合わせられる。停止コドンを形成するためのレトロウイルスのgag蛋白質のための開始コドンの点変異（A.D.M iller and G.J.Rosman(1990)(27)及び余分なenv配列（27）の欠失は、pSF1N，pS F2N，pSF3N，pMH1Nにおける安全関連修飾として一体化される。実施例２慣用的モロニー(Moloney)ベクターと比較して増加する機能的遺伝子転移比率多重薬剤耐性１（MDR1）遺伝子は、一連の臨床的に重要な細胞静止剤に対する耐性を媒介する膜内に位置する流出ポンプ（Ｐ−糖蛋白質）をコードする(I.Pas tan et al．(1988)(25)))。耐性の範囲はＰ−糖蛋白質の発現のレベルに密接に関連する。骨髄球性幹細胞がレトロウイルスのMDR1転移により細胞静止に対してうまく耐性が与えられるなら、これは腫瘍化学療法において副作用比率を低くするのに大きく寄与し得るだろう。本実験において、K562細胞（ATCC CLL 243）及びTF-1細胞（ヒト骨髄始原細胞系）にSFFV-LTR（MESVリーダー及びMPSV／MESVハイブリッドベクターpMP-MDRで構成物pSF-MDRから生ずるウイルスSF-MDR）の制御下でMDR1を発現するレトロウイルスのベクターを感染させた。 TF１細胞系を、T.Kitamura et al．(1989)(30)により記載されるように赤白血病細胞と共に患者から得た。細胞を、（20％胎児ウシ血清、１mMピルビン酸ナトリウム、４mMグルタミン及び20Ｕ／ml組換えGM-CSFから補給された）RPMI培地中で培養し続ける。 K562細胞及びTF１細胞に、MD Anderson Cancer Center，Houston，TexasのA.D eisseroth教授の指導の下、臨床的遺伝子転移プロトコルに用いられるモロニー( Moloney)−MDR1ベクター(構成物pVMDRから生ずるウイルスV-MDR)を同一混合物中で感染させた。表２に見られ得るように、K562の場合のSF-MDRは、細胞静止剤が投与される時に増殖するコロニーの数により測定されるようにVMDRと比較して遺伝子転移比率の20倍増加を導く（K562について約10倍のLD50）。骨髄細胞における機能的遺伝子転移比率の増加は、形質導入された細胞における遺伝子発現の平均的増加の発現である。これは、その成功が遺伝子発現のレベルにも依存する遺伝子転移の適用において重要である（適用の例：高投与量化学療法における骨髄の保護を参照のこと）。細胞が、先に記載の実験(SFMDR又はV- MDRでのヒト骨髄細胞の感染)における極めて高い投与量の細胞静止剤（TF１について約20倍のLD50）と共に培養されるなら、SF-MDRに感染した細胞のみがコロニーを形成することができる（表２）。細胞にアンホトロピックパッケージング細胞系のレトロウイルスの上清を感染させた。繊維芽細胞のタイターは本実験の時において両方のベクターについて約２×10⁴／mlであった。ベクター／標的細胞の比率は感染の間１未満であった。感染後24時間に、５×10⁴細胞をコルヒチンを含む軟質寒天培地中で培養した。寒天クローニングの８日目に測定を行った。選択のないクローニング効果は両細胞系について約15％であった。本実験は重複して行った。そのＵ３領域がMoMuLV由来であり、そのリーダーかMESV由来であるベクターのためのベクターpV-MDRのものに同様の結果が得られる。 MDR1系において、MESVリーダーを有する構成物は、慣用的MoMuSVベクターと比較して少し減少したタイターを有する。これは、MESVのパッキング領域における変異のためであり得る。MESV及びMoMuSVのリーダー配列はシス−阻害性配列が同時排除されているレトロウイルスのパッケージング細胞系における改良されたパッケージング機能のためより高タイターでベクターを産生する能力を有する。これは、構成物例pSF2N及びpSF3Nをクローニングする時に計数した。注意：プロウイルスベクターは、対応するプラスミドpSF-MDR，pMP-MDR等からそれらを区別するため例えばSF-MDR，MP-MDR等に示される。実施例３本発明に従うフレンド／MESVベクター構成物に基づいて複製することができる挿入変異誘発ベクターの構造複製することができるアンホトロピックフレンド／MESVベクターの構成物例を、フレンド／MESVベクターpSF1及びpSF3内へのレトロウイルスの複製に必要なga g-pol-env遺伝子をクローニングすることにより挿入変異誘発のために作製した（図２Ａ及び４Ａを参照のこと）。これのために、pAM(Miller et al．(1985)(35))からの全体の7.2kb gag-pol-e nv遺伝子カセットを“エキスパンド・ロング・テンプレートPCRシステム”(Boeh ringer Mannheim，W.M.Barns(1994)(36)も参照のこと(36))の助けにより増幅してpSF1及びpSF3内に組み込んだ。 pAMはエコトロピックMoMuLVベクターpMLV-K(gag-pol〜SalＩ切断部位）から、及びアンホトロピックウイルス4070Aベクターp4070A(SalＩ切断部位及びenv^amph ^otropic からのpol)からの融合構成物を表す。上部PCRプライマーを(pstＩ切断部位に直接隣接する）gag開始コドンの60bp上流に置き、下部PCRプライマーをenv^a ^mphotropic 遺伝子の端に直接置いた。7.2kb gag-pol-env^amphotropicPCR増幅物を、オーバーハングを除去するためにPstＩ及びHindIIIで切断され、クレノウ酵素で処理されているベクターpSF1及びpS F3内に、未切断、即ち平滑断端で組み込んだ（Sambrook et al．(1989)(37)）。結果として生ずるベクターをpSF1-AM，pSF3-AMと名づけ、これは主に次の構造である：５′-LTR^MESV-PBS(-)^MESV-gag-pol-env-^amphotropic-3′-LTR^SFFV(pSF1-A M)and５′-LTR^MESV-PBS(-)^MUSV-gag-pol-env^amphotropic-3′-LTR-^SFFV(pSF3-AM )。ヒト又はネズミ細胞内に移入させた後、それらは、造血幹細胞及び始原細胞内の挿入変異に用いられ得る複製−コンピテントレトロウイルス(PCR)を形成することができる。実施例４本発明に従うMPSV／MESVベクター構成物に基づく複製することができる挿入変異誘発ベクターの作製ベクターMoMuLV-TAT（Hilberg，F．et al．Prog．Natl．Acad．Sci．USA 84（ 1987）5232〜5236(38)）において、Nhe-I-KpnＩフラグメントをMPSVの対応するL TRフラグメント（−416〜＋31）により置換した。その結果生ずるベクターをMP- CATと名づけた。このプラスミドはレトロウイルスのLTRフラグメントの制御下でクロロアンフェニコールトランスフェラーゼ(CAT)を発現することによりレポーター遺伝子プラスミドとして用いられ得る。ベクターP50-MをMPSV／MESVベースベクターとして用いる。このベクターは、３′-LTR内にMPSV-U3を含む。それは、dl587revの537bp長のリーダーフラグメントを含むp5Gneoの誘導体である(Grez M．et al.，Proc.Natl．Acad．Sci．USA 8 7(1990)，9202〜9206(39)，Colicelli J.及びGoff S.P.，J．Virol．57（1987） 37〜45(40))。p5GneoのNeoR-envコーディング領域をp Bluescript KS(Stratagen e)からのポリリンカーにより置換し、gagのAUGを点変異により破壊した。mdr-1 cDNAをSacＩ／SspＩフラグメントとしてpMDR2000XS（塩基対−138〜＋3878）から切断した(Cherm C．et al.，Cell 47（1986）381〜389(41))。p BluescriptII KS内にサブクローニングした後、cDNAをBamHＩフラグメントとして単離し、p50-Mを挿入した。この様に作製されたベクターをpMP-MDRと名づける。p-MDR，pMP-MDRの配列を図９及び配列番号：６に示す。

【手続補正書】【提出日】１９９７年３月１７日【補正内容】請求の範囲１．ａ）Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてリーダー領域内に MESV及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位を含み、ｂ）３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてフレンドネズミ白血病ウイルス（ F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域を含むことを特徴とするレトロウイルスベクターハイブリッド。２．活性外来遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入された真核細胞を産生するための方法であって、そのゲノムが、ａ）リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてMESV 又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてフレンドネズミ白血病ウイルス（F-Mu LV）からのＵ３及びＲ領域と、ｃ）前記外来遺伝子と、を含むレトロウイルスのベクターウイルスで真核細胞が形質導入されることを特徴とする方法。３．レトロウイルスで形質導入された真核細胞であって、そのゲノムが、ａ）リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてMESV 及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F- MuLV）からのＵ３及びＲ領域と、を含むレトロウイルスのベクターウイルスで前記真核細胞を形質導入することにより得られうることを特徴とする真核細胞。４．そのゲノムとしてレトロウイルスのRNAを含む複製欠損感染性ウイルス粒子であって、前記ゲノムが、Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESV及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、パッケージング機能と、前記ウイルスに対して異種であり真核細胞内で発現され得る遺伝子と、を含み、フレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲを含むが３′端において活性gag，env及びpol配列を含まないことを特徴とするウイルス粒子。５．ａ）リーダー領域におけるＵ５領域及びtRNAプライマー結合部位としての MESVのＵ５領域及びtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としての骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV ）からのＵ３及びＲ領域と、を含むことを特徴とするレトロウイルスベクターハイブリッド。６．そのゲノムとしてレトロウイルスのRNAを含む複製欠損感染性ウイルス粒子であって、前記ゲノムが、Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、パッケージング機能と、前記ウイルスに対して異種であり真核細胞内で発現され得る遺伝子と、を含み、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）からのＵ３及びＲを含むが３′端において活性gag，env及びpol配列を含まないことを特徴とするウイルス粒子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オスタータグ，ボルファムドイツ連邦共和国，デー−22397 ハンブルク，カケンハネルベク 147

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてリーダー領域内に MESV及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位を含み、ｂ）３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としてフレンドネズミ白血病ウイルス（ F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域を含むことを特徴とするレトロウイルスベクターハイブリッド。２．３′-LTRとしてF-MuLVからのLTRを含むことを特徴とする請求項１に記載のレトロウイルスベクターハイブリッド。３．リーダー領域としてMESVのリーダー領域を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のベクターハイブリッド。４．悪性組織肉腫ウイルス（MHSV），SFFVp Lilly-Steeves，SFFVa，Rauscher SFFV，F-MuLV c157又はフレンド−ミンク細胞病巣形成ウイルス（F-MCFV FrNx ，F-MCFV pFM548の）３′-LTRが用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のベクターハイブリッド。５．MPSV，MESV又はPCMVからのＵ３及びＲ領域が５′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域として用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のベクターハイブリッド。６．フレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのLTRが５′-LTRとして用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。７．配列番号：１からのbp142〜657が５′-LTRとして用いられ、及び／又は配列番号：１からの1707〜2283が３′-LTRとして用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のベクターハイブリッド。８．前記ウイルスと異種である少くとも１の遺伝子を含み、真核細胞内で発現され得ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のベクターハイブリッド。９．多重薬剤耐性遺伝子（MDR遺伝子）、neo^R遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子、LNGFR遺伝子、セレプロシダーゼ遺伝子又は単純ヘルペスTK遺伝子を異種遺伝子として含むことを特徴とする請求項８に記載のベクターハイブリッド。 10．ベクターハイブリッドpSF1，pSF2，pSF3，pHM1。 11．請求項1〜10のいずれかに記載の複製欠損ベクターハイブリッド。 12．請求項１〜７のいずれかに記載の複製コンピテントベクターハイブリッド。 13．活性外来遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入された真核細胞を産生するための方法であって、そのゲノムが、ａ）リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてMESV 又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてフレンドネズミ白血病ウイルス（F-Mu LV）からのＵ３及びＲ領域と、ｃ）前記外来遺伝子と、を含むレトロウイルスのベクターウイルスで真核細胞が形質導入されることを特徴とする方法。 14．前記レトロウイルスのベクターウイルスが３′-LTRとしてF-MuLVからのLT Rを含むことを特徴とする請求項12に記載の産生するための方法。 15．前記MESVのリーダー領域がリーダー領域として用いられることを特徴とする請求項12又は14に記載の方法。 16．複製欠損のレトロウイルスのベクターウイルスが用いられることを特徴とする請求項12〜15のいずれかに記載の方法。 17．レトロウイルスで形質導入された真核細胞であって、そのゲノムが、ａ）リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてMESV 及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F- MuLV）からのＵ３及びＲ領域と、を含むレトロウイルスのベクターウイルスで前記真核細胞を形質導入することにより得られうることを特徴とする真核細胞。 18．前記レトロウイルスのベクターウイルスがそのゲノム内に３′-LTRとして F-MuLVからのLTRを含むことを特徴とする請求項17に記載の細胞。 19．MESVのリーダー領域がリーダー領域として用いられることを特徴とする請求項17又は18に記載の細胞。 20．複製欠損のレトロウイルスのベクターウイルスが用いられることを特徴とする請求項17〜19のいずれかに記載の細胞。 21．造血幹細胞が真核細胞として用いられることを特徴とする請求項13〜16のいずれかに記載の方法。 22．そのゲノムとしてレトロウイルスのRNAを含む複製欠損感染性ウイルス粒子であって、前記ゲノムが、Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESV及び／又はMoMuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、パッケージング機能と、前記ウイルスに対して異種であり真核細胞内で発現され得る遺伝子と、を含み、フレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲを含むが３′端において活性gag，env及びpol配列を含まないことを特徴とするウイルス粒子。 23．複製欠損感染性ウイルス粒子を産生するための方法であって、リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESV及び／又はMoMu SVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域と、を含むベクターハイブリッドを、ヘルパー機能gag，env及びpolを有する真核ヘルパー細胞に移入するステップと、前記細胞内でウイルスゲノムとしてベクターハイブリッドのDNAに対応するRNAを産生するステップと、前記細胞内に形成された複製欠損の空のウイルスエンベロープ内にウイルスゲノムをパッケージングするステップと、前記ウイルスゲノムを含む前記感染性ウイルス粒子を単離するステップと、によることを特徴とする方法。 24．F-MuLVからのLTRが３′-LTRとして用いられることを特徴とする請求項23 に記載の方法。 25．MESVのリーダー領域がリーダー領域として用いられることを特徴とする請求項23又は24に記載の方法。 26．生体外又は生体内遺伝子療法のための医薬剤を製造するための、リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESV及び／又はMo MuSVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としてのフレンドネズミ白血病ウイルス（F-MuLV）からのＵ３及びＲ領域と、を含む複製欠損レトロウイルスベクターハイブリッドの使用。 27．F-MuLVからのLTRが３′-LTRとして用いられることを特徴とする請求項26 に記載のベクターハイブリッドの使用。 28．MESVのリーダー領域がリーダー領域として用いられることを特徴とする請求項26又は27に記載の使用。 29．ａ）リーダー領域におけるＵ５領域及びtRNAプライマー結合部位としての MESVのＵ５領域及びtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTRにおけるＵ３及びＲ領域としての骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV ）からのＵ３及びＲ領域と、を含むことを特徴とするレトロウイルスベクターハイブリッド。 30．活性外来遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入された真核細胞を産生するための方法であって、前記真核細胞が、そのゲノムが、ａ）リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのME SVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、ｂ）３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としての骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）からのＵ３及びＲ領域と、ｃ）前記外来遺伝子と、を含むレトロウイルスベクターで形質導入されることを特徴とする方法。 30．そのゲノムとしてレトロウイルスのRNAを含む複製欠損感染性ウイルス粒子であって、前記ゲノムが、Ｕ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、パッケージング機能と、前記ウイルスに対して異種であり真核細胞内で発現され得る遺伝子と、を含み、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）からのＵ３及びＲを含むが３′端において活性gag，env及びpol配列を含まないことを特徴とするウイルス粒子。 31．生体外又は生体内遺伝子療法のための医薬剤を製造するための、リーダー領域内のＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位としてのMESVのＵ５領域及び／又はtRNAプライマー結合部位と、３′-LTR内のＵ３及びＲ領域としての骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV ）からのＵ３及びＲ領域と、を含む複製欠損レトロウイルスベクターハイブリッドの使用。