JP2002542834A - レトロウイルスベクターでのｉｒｅｓ転写カセットからの異種遺伝子群の発現 - Google Patents
レトロウイルスベクターでのｉｒｅｓ転写カセットからの異種遺伝子群の発現Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、内部リボゾーム侵入部位(IRES; internal ribosome entry site)の翻訳制御下で、例えば治療に使用する遺伝子および/またはウイルス由来の遺伝子を発現するレトロウイルスベクターに関する。
Description
【０００１】 本発明は、内部リボゾーム進入部位(IRES; internal ribosomal entry site)
の転写制御下で、例えば治療的使用のための、および/またはウイルス起源の遺
伝子を発現して、当該遺伝子の効率的な翻訳をもたらすレトロウイルスベクター
に関する。
の転写制御下で、例えば治療的使用のための、および/またはウイルス起源の遺
伝子を発現して、当該遺伝子の効率的な翻訳をもたらすレトロウイルスベクター
に関する。
【０００２】
レトロウイルスは、様々な細胞に感染する能力を有している。そのほか、レト
ロウイルスは、ゲノムRNA転写物として、彼らの遺伝子を産生細胞から標的細胞
へ転移させる。このゲノムRNAは感染そして逆転写後に、標的細胞のDNAゲノムに
組込まれる。感染性のウイルスの増殖において、すべての複製能正常なレトロウ
イルスは、必須の遺伝子として5’LTRのU3領域に座位する転写制御領域から転写
される、いわゆるgag, polおよびenvをコードする。この転写は5’LTRのR領域と
U3の境界部位で開始され、そして成熟した転写は３’LTRのR領域終端のポリアデ
ニル化部位で終了する。結果として生じるRNA転写産物は、スプライシングされ
たレトロウイルスRNAに加えて、全長レトロウイルスRNAを含んでいる。スプライ
シングされたレトロウイルスRNA並びに全長RNAの5’端は、いわゆるキャッピン
グ基の付加により修飾されている。この構造はリボゾームの付着に重要であり、
それゆえにRNAの翻訳に重要である。翻訳には、リボゾームに対するこの結合シ
グナルのほかに、いわゆるオープンリーディングフレーム ORFが必要とする。OR
Fとはすなわち、ATG/AUG翻訳開始シグナルと停止コドン間のDNAもしくはRNAの配
列である。通常のレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターでのRNA転写物
は、ただ一つのORF（いわゆるモノシストロン性RNA）のみを含んでいる。このモ
ノシストロン性RNAはキャッピングキャッピングされ、そしてORFの翻訳はキャッ
ピング基に続く最初の翻訳開始コドン（たとえばATG）から開始され、停止コド
ンで停止する。結果として、上述の停止コドンより下流のどのようなコーディン
グ領域も蛋白質には翻訳されないであろう。単一の蛋白質をコードするスプライ
シングされキャッピングされたRNA転写物の一例は、envをコードするRNAである
。例えば、インテグラーゼ、逆転写酵素、蛋白質分解酵素そしてキャプシッド蛋
白質などの他のレトロウイルスでの必須蛋白質は、キャッピングされた全長RNA
転写物から１つのポリペプチドとして翻訳される。翻訳後、このポリペプチドは
、蛋白質分解により別々の蛋白質に分解処理される。従って、このRNAはやはり
モノシストロン性である。
ロウイルスは、ゲノムRNA転写物として、彼らの遺伝子を産生細胞から標的細胞
へ転移させる。このゲノムRNAは感染そして逆転写後に、標的細胞のDNAゲノムに
組込まれる。感染性のウイルスの増殖において、すべての複製能正常なレトロウ
イルスは、必須の遺伝子として5’LTRのU3領域に座位する転写制御領域から転写
される、いわゆるgag, polおよびenvをコードする。この転写は5’LTRのR領域と
U3の境界部位で開始され、そして成熟した転写は３’LTRのR領域終端のポリアデ
ニル化部位で終了する。結果として生じるRNA転写産物は、スプライシングされ
たレトロウイルスRNAに加えて、全長レトロウイルスRNAを含んでいる。スプライ
シングされたレトロウイルスRNA並びに全長RNAの5’端は、いわゆるキャッピン
グ基の付加により修飾されている。この構造はリボゾームの付着に重要であり、
それゆえにRNAの翻訳に重要である。翻訳には、リボゾームに対するこの結合シ
グナルのほかに、いわゆるオープンリーディングフレーム ORFが必要とする。OR
Fとはすなわち、ATG/AUG翻訳開始シグナルと停止コドン間のDNAもしくはRNAの配
列である。通常のレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターでのRNA転写物
は、ただ一つのORF（いわゆるモノシストロン性RNA）のみを含んでいる。このモ
ノシストロン性RNAはキャッピングキャッピングされ、そしてORFの翻訳はキャッ
ピング基に続く最初の翻訳開始コドン（たとえばATG）から開始され、停止コド
ンで停止する。結果として、上述の停止コドンより下流のどのようなコーディン
グ領域も蛋白質には翻訳されないであろう。単一の蛋白質をコードするスプライ
シングされキャッピングされたRNA転写物の一例は、envをコードするRNAである
。例えば、インテグラーゼ、逆転写酵素、蛋白質分解酵素そしてキャプシッド蛋
白質などの他のレトロウイルスでの必須蛋白質は、キャッピングされた全長RNA
転写物から１つのポリペプチドとして翻訳される。翻訳後、このポリペプチドは
、蛋白質分解により別々の蛋白質に分解処理される。従って、このRNAはやはり
モノシストロン性である。
【０００３】 さらなるベクターの開発のために、これまで異種遺伝子に先行する翻訳制御因
子を有したカセットを具備するレトロウイルスベクターが構築された（４４；３
；４５；２６）。これらのケースでは、キャッピング基に近接する１つのORFの
翻訳が（上述のように）、キャッピング基に続く最初の翻訳開始コドン（ATGも
しくはAUG）から開始され、停止コドンで停止する。そのようなレトロウイルスR
NA転写物にコードされるさらなるORFの翻訳には、例えば内部リボゾーム進入部
位（IRES; internal ribosome entry site)のような付加的な転写制御因子が必
要である。
子を有したカセットを具備するレトロウイルスベクターが構築された（４４；３
；４５；２６）。これらのケースでは、キャッピング基に近接する１つのORFの
翻訳が（上述のように）、キャッピング基に続く最初の翻訳開始コドン（ATGも
しくはAUG）から開始され、停止コドンで停止する。そのようなレトロウイルスR
NA転写物にコードされるさらなるORFの翻訳には、例えば内部リボゾーム進入部
位（IRES; internal ribosome entry site)のような付加的な転写制御因子が必
要である。
【０００４】 “内部リボゾーム進入部位”（IRES）という用語は、mＲＮＡ内部配列上のそ
のモティーフに対して、リボゾームの付着を促進させるような配列モティーフを
定義するものである。さらに、上述のIRESに続くAUG開始コドンでの効率的な翻
訳の開始のために必要なすべての因子は、この配列モチーフに付着する。結果的
に、例えばIRESのような翻訳制御因子の配列モティーフを有するmＲＮＡは、２
つの翻訳物の産生をもたらし、１つはｍＲＮＡの５’端から開始されるもので、
そして他はIRESの媒介による内部での転写機構によるものである。
のモティーフに対して、リボゾームの付着を促進させるような配列モティーフを
定義するものである。さらに、上述のIRESに続くAUG開始コドンでの効率的な翻
訳の開始のために必要なすべての因子は、この配列モチーフに付着する。結果的
に、例えばIRESのような翻訳制御因子の配列モティーフを有するmＲＮＡは、２
つの翻訳物の産生をもたらし、１つはｍＲＮＡの５’端から開始されるもので、
そして他はIRESの媒介による内部での転写機構によるものである。
【０００５】 従って、レトロウイルスゲノム中での、ＯＲＦに機能的にリンクするIRESのよ
うな翻訳制御因子の導入は、ウイルスＲＮＡ転写物から付加的なＯＲＦの翻訳を
許容する。そのような、２つもしくはそれ以上のＯＲＦの転写を許容する能力を
もつＲＮＡ転写物は、それぞれ２シストロン性または多シストロン性ＲＮＡ転写
物と呼称される。
うな翻訳制御因子の導入は、ウイルスＲＮＡ転写物から付加的なＯＲＦの翻訳を
許容する。そのような、２つもしくはそれ以上のＯＲＦの転写を許容する能力を
もつＲＮＡ転写物は、それぞれ２シストロン性または多シストロン性ＲＮＡ転写
物と呼称される。
【０００６】 レトロウイルスベクターは、ベクター配列に加えて異種核酸配列を取り込める
能力と、受容体に当該配列を転移する能力により特徴づけられる。しかしながら
、以下に述べる理由によって、レトロウイルスの複製能は、ヌクレオチド配列が
ベクターに付加される場合に度々失われる。大抵のレトロウイルスは、可能な限
り小さいＲＮＡを具備する方向性で適応しており、それ故に必須の遺伝子のみを
保持している。これは特に、基本的にウイルス蛋白質をコードする遺伝子のみを
有するＭＭＴＶやＭＬＶのような単純なレトロウイルスに対してあてはまる。従
って、何らかの遺伝子への異種配列の挿入、そしてそれによるウイルス遺伝子の
不活性化は、複製能の損失をもたらす。加えて、上述したように、ＲＮＡ転写物
は、異なる蛋白質をコードする核酸配列がときおりオーバーラップするような様
式で、殆どの場合２つ以上の蛋白質をコードする。従って、異種配列もまた２つ
の遺伝子間で、コーディング領域を破壊することなく付加することはできない。
さらに、レトロウイルスの複製機構により効率的に複製される核酸配列は、その
長さが厳密に限定されていること、すなわち、ウイルスゲノムの制御遺伝子は付
加される異種配列に対して十分な領域を確保するために、削除されなければなら
ないことが知られている。ウイルス配列の削除はまた、複製能の損失をもたらす
。最後に、特にプロモーターのような転写を制御する配列、またはＩＲＥＳカセ
ットような翻訳を制御する配列の挿入は、たびたび制御におけるトラブルを生じ
ることになる。レトロウイルスは転写、ＲＮＡプロセッシングおよび翻訳の全て
の過程において、いくつかのホスト細胞の機構を利用する。それゆえ、コーディ
ング領域または非コーディング領域のどちらかで、様々なシスに作用する配列が
異なるレトロウイルスゲノムに対して記載されている。これらのシス作用をもつ
配列は、遺伝子発現、ＲＮＡプロセッシング（１５）、ポリアデニル化（２４）
、安定性（４６；４７）、またはウイルスＲＮＡの核外輸送などを制御するため
、様々なホスト細胞の蛋白質に結合する。従って、そのようなシス作用領域の破
壊は、それぞれウイルスの複製と感染性のウイルス粒子の生産的な生成を著しく
害することが予想されるに違いない。この見解は、ウイルスゲノムへの翻訳カセ
ットの挿入がウイルスの繁殖に著しく影響し、または破壊できることを見つけた
Ｙｉｎ＆Ｈｕの報告（４５）と一致する。Ｙｉｎ＆Ｈｕは、ＬＴＲとウイルス体
のenvをコードする配列の間への、異種遺伝子に付けられたＩＲＥＳを含むカセ
ットの挿入が（おそらくスプライシングの干渉によるとおもわれるが（４５））
、使用されたレトロウイルスベクターの粒子産生を破壊できることを示した。従
って、この領域もしくは少なくともこの領域の一部はウイルスの複製に必須であ
り、改変に非常に敏感である。
能力と、受容体に当該配列を転移する能力により特徴づけられる。しかしながら
、以下に述べる理由によって、レトロウイルスの複製能は、ヌクレオチド配列が
ベクターに付加される場合に度々失われる。大抵のレトロウイルスは、可能な限
り小さいＲＮＡを具備する方向性で適応しており、それ故に必須の遺伝子のみを
保持している。これは特に、基本的にウイルス蛋白質をコードする遺伝子のみを
有するＭＭＴＶやＭＬＶのような単純なレトロウイルスに対してあてはまる。従
って、何らかの遺伝子への異種配列の挿入、そしてそれによるウイルス遺伝子の
不活性化は、複製能の損失をもたらす。加えて、上述したように、ＲＮＡ転写物
は、異なる蛋白質をコードする核酸配列がときおりオーバーラップするような様
式で、殆どの場合２つ以上の蛋白質をコードする。従って、異種配列もまた２つ
の遺伝子間で、コーディング領域を破壊することなく付加することはできない。
さらに、レトロウイルスの複製機構により効率的に複製される核酸配列は、その
長さが厳密に限定されていること、すなわち、ウイルスゲノムの制御遺伝子は付
加される異種配列に対して十分な領域を確保するために、削除されなければなら
ないことが知られている。ウイルス配列の削除はまた、複製能の損失をもたらす
。最後に、特にプロモーターのような転写を制御する配列、またはＩＲＥＳカセ
ットような翻訳を制御する配列の挿入は、たびたび制御におけるトラブルを生じ
ることになる。レトロウイルスは転写、ＲＮＡプロセッシングおよび翻訳の全て
の過程において、いくつかのホスト細胞の機構を利用する。それゆえ、コーディ
ング領域または非コーディング領域のどちらかで、様々なシスに作用する配列が
異なるレトロウイルスゲノムに対して記載されている。これらのシス作用をもつ
配列は、遺伝子発現、ＲＮＡプロセッシング（１５）、ポリアデニル化（２４）
、安定性（４６；４７）、またはウイルスＲＮＡの核外輸送などを制御するため
、様々なホスト細胞の蛋白質に結合する。従って、そのようなシス作用領域の破
壊は、それぞれウイルスの複製と感染性のウイルス粒子の生産的な生成を著しく
害することが予想されるに違いない。この見解は、ウイルスゲノムへの翻訳カセ
ットの挿入がウイルスの繁殖に著しく影響し、または破壊できることを見つけた
Ｙｉｎ＆Ｈｕの報告（４５）と一致する。Ｙｉｎ＆Ｈｕは、ＬＴＲとウイルス体
のenvをコードする配列の間への、異種遺伝子に付けられたＩＲＥＳを含むカセ
ットの挿入が（おそらくスプライシングの干渉によるとおもわれるが（４５））
、使用されたレトロウイルスベクターの粒子産生を破壊できることを示した。従
って、この領域もしくは少なくともこの領域の一部はウイルスの複製に必須であ
り、改変に非常に敏感である。
【０００７】 さらに、組み換え型レトロウイルスもしくはレトロウイルスＬＴＲの5’端に
、ＳＶ４０プロモーターと引き続くジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ
）を導入した発現カセットを保持しているレトロウイルスベクター（３６，３７
）において、ウイルスの複製能の混乱（おそらくシス作用配列の破壊、異常転写
物もしくはプロモーター干渉による）が報告されている。
、ＳＶ４０プロモーターと引き続くジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ
）を導入した発現カセットを保持しているレトロウイルスベクター（３６，３７
）において、ウイルスの複製能の混乱（おそらくシス作用配列の破壊、異常転写
物もしくはプロモーター干渉による）が報告されている。
【０００８】 それゆえに、これまで報告されたすべてのＩＲＥＳカセットを有するレトロウ
イルスベクターは、通常の細胞で複製するための能力を失っている。Murakami等
のみが、癌遺伝子であるsrcを欠失させた部位にＩＲＥＳ翻訳カセットを含む鳥
類レトロウイルスベクター構築物を報告している、それは２〜３回の継代接種の
間は複製能を保持している。しかしながら、このベクターは減弱した異種遺伝子
の発現レベルを示した（２６）。
イルスベクターは、通常の細胞で複製するための能力を失っている。Murakami等
のみが、癌遺伝子であるsrcを欠失させた部位にＩＲＥＳ翻訳カセットを含む鳥
類レトロウイルスベクター構築物を報告している、それは２〜３回の継代接種の
間は複製能を保持している。しかしながら、このベクターは減弱した異種遺伝子
の発現レベルを示した（２６）。
【０００９】 いままでのところ、シス作用因子がどのようにしてウイルスの生活環に影響し
、制御するかについては完全に理解されていない。しかしながら、組み換え型レ
トロウイルスゲノム内へのランダムなカセットの挿入によるシス作用因子の破壊
は、プロモータ干渉（９）、スプライシングバランスの乱れ（４６）もしくはパ
ッケージング効率の不足（８）という結果を生じ、最終的にはウイルス複製の欠
損もしくはウイルスタイターの減少にいきつくことは明らかであろう。
、制御するかについては完全に理解されていない。しかしながら、組み換え型レ
トロウイルスゲノム内へのランダムなカセットの挿入によるシス作用因子の破壊
は、プロモータ干渉（９）、スプライシングバランスの乱れ（４６）もしくはパ
ッケージング効率の不足（８）という結果を生じ、最終的にはウイルス複製の欠
損もしくはウイルスタイターの減少にいきつくことは明らかであろう。
【００１０】
本発明の目的は、組み換え型レトロウイルス、もしくは標的細胞への遺伝子導
入のためのレトロウイルスベクターを改善することである。とりわけ、本発明の
目的としては、それぞれウイルスの複製とウイルス粒子の産生を妨げることなく
、レトロウイルスゲノムに翻訳カセットを導入することである。
入のためのレトロウイルスベクターを改善することである。とりわけ、本発明の
目的としては、それぞれウイルスの複製とウイルス粒子の産生を妨げることなく
、レトロウイルスゲノムに翻訳カセットを導入することである。
【００１１】
前述のそしてその他の目的を達成するために、本発明はレトロウイルスに特徴
的なすべての遺伝子、そして付加的に１つの異種性の内部リボゾーム進入部位（
ＩＲＥＳ）から構成されるレトロウイルスベクターを提供する。従って、本発明
では、完全なウイルス遺伝子から削除によりベクターに異種遺伝子の挿入のため
の空き領域を作成することなしに、ＩＲＥＳがレトロウイルスベクターに導入さ
れた。ある程度の長さの異種性配列が付加的にレトロウイルスゲノムに挿入され
たにもかかわらず、生成した構築物はレトロウイルスの複製機構により効率的に
複製された。この驚くべき効果は、ＩＲＥＳに加えてさらなるヌクレオチド配列
、とりわけ一以上の異種遺伝子がベクターに挿入されたときでさえも同様に認め
られた。そのうえ、たとえ異種遺伝子を加えたさらなるIRESから構成される付加
的なＩＲＥＳカセット、或いはプロモーターおよび/またはエンハンサー因子が
上流に組み込まれている付加的な異種遺伝子がベクターに挿入されたとしても、
生成したレトロウイルスは複製能を保持している。
的なすべての遺伝子、そして付加的に１つの異種性の内部リボゾーム進入部位（
ＩＲＥＳ）から構成されるレトロウイルスベクターを提供する。従って、本発明
では、完全なウイルス遺伝子から削除によりベクターに異種遺伝子の挿入のため
の空き領域を作成することなしに、ＩＲＥＳがレトロウイルスベクターに導入さ
れた。ある程度の長さの異種性配列が付加的にレトロウイルスゲノムに挿入され
たにもかかわらず、生成した構築物はレトロウイルスの複製機構により効率的に
複製された。この驚くべき効果は、ＩＲＥＳに加えてさらなるヌクレオチド配列
、とりわけ一以上の異種遺伝子がベクターに挿入されたときでさえも同様に認め
られた。そのうえ、たとえ異種遺伝子を加えたさらなるIRESから構成される付加
的なＩＲＥＳカセット、或いはプロモーターおよび/またはエンハンサー因子が
上流に組み込まれている付加的な異種遺伝子がベクターに挿入されたとしても、
生成したレトロウイルスは複製能を保持している。
【００１２】 さらに、ＩＲＥＳが上流に組み込まれている１つもしくはそれ以上の異種遺伝
子から構成されるＩＲＥＳカセットがベクターに組み込まれた場合に、レトロウ
イルスベクターによる標的細胞の感染後、そして標的細胞ゲノムへのプロウイル
スＤＮＡの組込み後に上流に位置するＩＲＥＳから開始される異種遺伝子の発現
は内部の干渉もしくはアンバランスなＲＮＡスプライシング活性によりネガティ
ブに影響されないことも示された。さらに上述の発現は、たとえリードスローＲ
ＮＡ（細胞のＤＮＡとプロウイルスのＤＮＡの両方を含む）を転写する細胞のプ
ロモーターが活性化してなくとも引き起こされる。
子から構成されるＩＲＥＳカセットがベクターに組み込まれた場合に、レトロウ
イルスベクターによる標的細胞の感染後、そして標的細胞ゲノムへのプロウイル
スＤＮＡの組込み後に上流に位置するＩＲＥＳから開始される異種遺伝子の発現
は内部の干渉もしくはアンバランスなＲＮＡスプライシング活性によりネガティ
ブに影響されないことも示された。さらに上述の発現は、たとえリードスローＲ
ＮＡ（細胞のＤＮＡとプロウイルスのＤＮＡの両方を含む）を転写する細胞のプ
ロモーターが活性化してなくとも引き起こされる。
【００１３】 “特徴的な遺伝子”という用語はレトロウイルスゲノム中に自然発生的に生じ
たすべての遺伝子を含み、特にgagやpolのようなウイルス蛋白質をコードする遺
伝子だけでなく、例えばsagやsrcのような付加的な遺伝子をも含む。しかしなが
ら、それらの遺伝子もまた相同な遺伝子、即ち６０−７９％、好ましくは８０−
８９％、より好ましくは９０−９９％のヌクレオチド同一性がある遺伝子、もし
くは近縁なウイルスの遺伝子により置き換えることができる。特徴的な遺伝子の
ヌクレオチド配列の一部でさえも、遺伝子機能の損失なしに削除されるであろう
。
たすべての遺伝子を含み、特にgagやpolのようなウイルス蛋白質をコードする遺
伝子だけでなく、例えばsagやsrcのような付加的な遺伝子をも含む。しかしなが
ら、それらの遺伝子もまた相同な遺伝子、即ち６０−７９％、好ましくは８０−
８９％、より好ましくは９０−９９％のヌクレオチド同一性がある遺伝子、もし
くは近縁なウイルスの遺伝子により置き換えることができる。特徴的な遺伝子の
ヌクレオチド配列の一部でさえも、遺伝子機能の損失なしに削除されるであろう
。
【００１４】 “異種”という用語は、以下においては、通常は自然界で密接に関連して認め
られない核酸配列の任意の組み合わせについて使用される。本発明による異種遺
伝子は、好ましくは、例えば抗ウイルス遺伝子、抗腫瘍遺伝子、サイトカインも
しくはケモカイン遺伝子のような治療的な遺伝子、例えば大腸菌のシトシンヂア
ミナーゼ遺伝子、タイプ１単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子もし
くは哺乳類のチトクロームｐ４５０遺伝子（ＣＹＰ２Ｂ１）のような自殺遺伝子
、または例えばパチュストキシン遺伝子もしくはテタヌストキシン遺伝子のよう
な毒性のある遺伝子から選択され、マーカー遺伝子群には限定されない。
られない核酸配列の任意の組み合わせについて使用される。本発明による異種遺
伝子は、好ましくは、例えば抗ウイルス遺伝子、抗腫瘍遺伝子、サイトカインも
しくはケモカイン遺伝子のような治療的な遺伝子、例えば大腸菌のシトシンヂア
ミナーゼ遺伝子、タイプ１単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子もし
くは哺乳類のチトクロームｐ４５０遺伝子（ＣＹＰ２Ｂ１）のような自殺遺伝子
、または例えばパチュストキシン遺伝子もしくはテタヌストキシン遺伝子のよう
な毒性のある遺伝子から選択され、マーカー遺伝子群には限定されない。
【００１５】 本発明の好ましい態様では、ＩＲＥＳもしくはＩＲＥＳに先行された少なくと
も１つの異種遺伝子を含む翻訳カセットは、レトロウイルスベクターのＬＴＲ(L
ong Terminal Repeat)に挿入される。通常の予測に反して、このＬＴＲへの挿入
は、重要なシス作用性のレトロウイルス因子を破壊しないことが見つけられた。
この結果は、多くのレトロウイルスの制御因子を具備するレトロウイルスＬＴＲ
が翻訳カセットの挿入部位として使用できることは予想できなかったので、特に
驚くべきことである。これとは全く対照的に、LTRへのそのような挿入は、シス
作用性配列の破壊によってウイルスの繁殖または粒子産生を強く阻害するだろう
ことが予想されてきたに違いない。しかしながら、本発明によるＬＴＲへの翻訳
カセットの挿入はウイルスの複製もしくは粒子産生を阻害しない。
も１つの異種遺伝子を含む翻訳カセットは、レトロウイルスベクターのＬＴＲ(L
ong Terminal Repeat)に挿入される。通常の予測に反して、このＬＴＲへの挿入
は、重要なシス作用性のレトロウイルス因子を破壊しないことが見つけられた。
この結果は、多くのレトロウイルスの制御因子を具備するレトロウイルスＬＴＲ
が翻訳カセットの挿入部位として使用できることは予想できなかったので、特に
驚くべきことである。これとは全く対照的に、LTRへのそのような挿入は、シス
作用性配列の破壊によってウイルスの繁殖または粒子産生を強く阻害するだろう
ことが予想されてきたに違いない。しかしながら、本発明によるＬＴＲへの翻訳
カセットの挿入はウイルスの複製もしくは粒子産生を阻害しない。
【００１６】 本発明によるＩＲＥＳ因子はマウス脳心筋炎ウイルス(EMCV; murine encephal
omyocarditis virus)、ポリオウイルス(poliovirus)、手足口病(FMDV; food and
mouth disease virus)のようなピコルナウイルス科(picornaviridae)、例えば
マウス白血病ウイルス(MLV)もしくは細網内皮症ウイルス(REV; reticuloendothe
liosis virus)のようなレトロウイルス科(retriviridae)、および/または、例え
ばＶＬ３０のようなレトロポゾンから分離されたＩＲＥＳより選択される（５４
；５５；５６；５７；５８）。
omyocarditis virus)、ポリオウイルス(poliovirus)、手足口病(FMDV; food and
mouth disease virus)のようなピコルナウイルス科(picornaviridae)、例えば
マウス白血病ウイルス(MLV)もしくは細網内皮症ウイルス(REV; reticuloendothe
liosis virus)のようなレトロウイルス科(retriviridae)、および/または、例え
ばＶＬ３０のようなレトロポゾンから分離されたＩＲＥＳより選択される（５４
；５５；５６；５７；５８）。
【００１７】 翻訳カセットのＩＲＥＳ因子と異種遺伝子の開始コドンの間の距離は、変異に
富む。しかしながら、野生型のウイルスゲノムで認められたＩＲＥＳ因子と開始
コドンの距離と同様の距離が選択された際に、最適な結果が得られた。さらに、
翻訳効率の増加が、-３の位置（翻訳開始点の３ヌクレオチド上流の）にアデニ
ンが置かれた際に、翻訳効率の増加が得られた。
富む。しかしながら、野生型のウイルスゲノムで認められたＩＲＥＳ因子と開始
コドンの距離と同様の距離が選択された際に、最適な結果が得られた。さらに、
翻訳効率の増加が、-３の位置（翻訳開始点の３ヌクレオチド上流の）にアデニ
ンが置かれた際に、翻訳効率の増加が得られた。
【００１８】 通常のレトロウイルスベクターは、二つの完全なＬＴＲ（5’と3’のＬＴＲ）
を含んでおり、これらは両方とも亜領域（すなわちＵ３、Ｒ、Ｕ５領域）を含ん
でいる。Ｕ３領域は、レトロウイルスゲノムの転写と翻訳に役割をもつすべての
制御因子および/またはプロモーターを具備する。また、Ｕ３領域の5’端には、
いわゆる逆向き反復配列（ＩＲ）が座位している。ＩＲは標的細胞ゲノムへのプ
ロウイルスＤＮＡの組込み過程に関与する。Ｒ領域は（定義上では）転写開始コ
ドンからはじまり、さらにポリアデニレーションシグナルを含む。しかしながら
、このポリアデニレーションシグナルは3’のＬＴＲのみで活性化しており、そ
れにより成熟したレトロウイルスＲＮＡ転写物の終端をマークする。ＬＴＲのＵ
５領域は、レトロウイルスゲノムのいくつかのパッケージングシグナルのなかの
１つを含むと考えられる。
を含んでおり、これらは両方とも亜領域（すなわちＵ３、Ｒ、Ｕ５領域）を含ん
でいる。Ｕ３領域は、レトロウイルスゲノムの転写と翻訳に役割をもつすべての
制御因子および/またはプロモーターを具備する。また、Ｕ３領域の5’端には、
いわゆる逆向き反復配列（ＩＲ）が座位している。ＩＲは標的細胞ゲノムへのプ
ロウイルスＤＮＡの組込み過程に関与する。Ｒ領域は（定義上では）転写開始コ
ドンからはじまり、さらにポリアデニレーションシグナルを含む。しかしながら
、このポリアデニレーションシグナルは3’のＬＴＲのみで活性化しており、そ
れにより成熟したレトロウイルスＲＮＡ転写物の終端をマークする。ＬＴＲのＵ
５領域は、レトロウイルスゲノムのいくつかのパッケージングシグナルのなかの
１つを含むと考えられる。
【００１９】 細胞のゲノム中へのレトロウイルスベクターの組込みのあと、レトロウイルス
粒子の産生が起こる。このために、組込まれたレトロウイルスベクターＤＮＡは
、レトロウイルスＲＮＡに転写されなければならない。レトロウイルスＲＮＡの
産生のために、転写は5’R領域の転写開始位置から開始され、3’R領域のポリア
デニレーション部位で停止する。それにより、レトロウイルスＲＮＡゲノムは二
つの不完全なＬＴＲ含むことになる。5’のＬＴＲはＲとＵ５領域から構成され
るのに対して、3’のＬＴＲはＵ３とＲ領域を含む。さらなる標的細胞への感染
後、レトロウイルスゲノムはホストの細胞のゲノム中に再び組込まれる。この組
込み過程のために、レトロウイルスＲＮＡは最初にＤＮＡに逆転写されなければ
ならない。レトロウイルスＲＮＡゲノムから、いわゆるプロウイルスＤＮＡへの
逆転写の間に、3’ＬＴＲのＵ３領域は重複され、そして3’ＬＴＲから5’ＬＴ
Ｒへ転移される。加えて、レトロウイルスＲＮＡゲノムの5’ＬＴＲにのみある
Ｕ５領域も逆転写の間に重複され、第二のＬＴＲ（すなわち3’ＬＴＲ）にシフ
トされる。結果的に、逆転写後プロウイルスＤＮＡは再び２つの完全なＬＴＲを
含むことになる。
粒子の産生が起こる。このために、組込まれたレトロウイルスベクターＤＮＡは
、レトロウイルスＲＮＡに転写されなければならない。レトロウイルスＲＮＡの
産生のために、転写は5’R領域の転写開始位置から開始され、3’R領域のポリア
デニレーション部位で停止する。それにより、レトロウイルスＲＮＡゲノムは二
つの不完全なＬＴＲ含むことになる。5’のＬＴＲはＲとＵ５領域から構成され
るのに対して、3’のＬＴＲはＵ３とＲ領域を含む。さらなる標的細胞への感染
後、レトロウイルスゲノムはホストの細胞のゲノム中に再び組込まれる。この組
込み過程のために、レトロウイルスＲＮＡは最初にＤＮＡに逆転写されなければ
ならない。レトロウイルスＲＮＡゲノムから、いわゆるプロウイルスＤＮＡへの
逆転写の間に、3’ＬＴＲのＵ３領域は重複され、そして3’ＬＴＲから5’ＬＴ
Ｒへ転移される。加えて、レトロウイルスＲＮＡゲノムの5’ＬＴＲにのみある
Ｕ５領域も逆転写の間に重複され、第二のＬＴＲ（すなわち3’ＬＴＲ）にシフ
トされる。結果的に、逆転写後プロウイルスＤＮＡは再び２つの完全なＬＴＲを
含むことになる。
【００２０】 上述したレトロウイルスの複製の特殊性、特に逆転写の間のレトロウイルスの
異なる領域の重複性のために、レトロウイルスベクターの異なるタイプが本発明
に含まれる。本発明による第一のタイプのレトロウイルスベクターは、“短期発
現ベクター”とみなされ、今後はそのように明示される。短期発現ベクターでは
、翻訳カセットはレトロウイルスの5’Ｕ３および/または3’Ｕ５領域に挿入さ
れる。そのような短期発現ベクターは、パッケージング細胞での異種遺伝子の発
現に特に有用である：短期発現ベクターでパッケージング細胞の感染後、このベ
クターはパッケージング細胞のゲノム中に組込まれる。次いで、細胞の転写機構
はパーケージされるウイルスＲＮＡゲノムを転写する。更に、翻訳カセットの異
種遺伝子もまた転写され、パッケージング細胞の異種遺伝子の遺伝子産物の合成
がもたらされる。この遺伝子産物は、例えばパッケージング細胞での粒子形成も
しくは生成した粒子の感染性をサポートする。これに加えて、またはその代りに
、この遺伝子産物は、標的細胞への遺伝子産物の転移の伝達手段として使用され
るウイルス粒子に単純に導入されてもよい。しかしながら、そのような粒子にパ
ーケージングされるレトロウイルスＲＮＡゲノムは、異種遺伝子を組込んでいな
い。なぜなら、5’Ｕ３そして3’Ｕ５領域は上記のウイルスＲＮＡゲノムに取り
込まれていないからである。しかし、5’Ｕ３と3’Ｕ５領域は既述のとおりに、
引き続く逆転写の間に重複により新生されるであろう。
異なる領域の重複性のために、レトロウイルスベクターの異なるタイプが本発明
に含まれる。本発明による第一のタイプのレトロウイルスベクターは、“短期発
現ベクター”とみなされ、今後はそのように明示される。短期発現ベクターでは
、翻訳カセットはレトロウイルスの5’Ｕ３および/または3’Ｕ５領域に挿入さ
れる。そのような短期発現ベクターは、パッケージング細胞での異種遺伝子の発
現に特に有用である：短期発現ベクターでパッケージング細胞の感染後、このベ
クターはパッケージング細胞のゲノム中に組込まれる。次いで、細胞の転写機構
はパーケージされるウイルスＲＮＡゲノムを転写する。更に、翻訳カセットの異
種遺伝子もまた転写され、パッケージング細胞の異種遺伝子の遺伝子産物の合成
がもたらされる。この遺伝子産物は、例えばパッケージング細胞での粒子形成も
しくは生成した粒子の感染性をサポートする。これに加えて、またはその代りに
、この遺伝子産物は、標的細胞への遺伝子産物の転移の伝達手段として使用され
るウイルス粒子に単純に導入されてもよい。しかしながら、そのような粒子にパ
ーケージングされるレトロウイルスＲＮＡゲノムは、異種遺伝子を組込んでいな
い。なぜなら、5’Ｕ３そして3’Ｕ５領域は上記のウイルスＲＮＡゲノムに取り
込まれていないからである。しかし、5’Ｕ３と3’Ｕ５領域は既述のとおりに、
引き続く逆転写の間に重複により新生されるであろう。
【００２１】 本発明による別のタイプのレトロウイルスベクターは、以後“長期発現ベクタ
ーと明示される。長期発現ベクターの構築のために、翻訳カセットがレトロウイ
ルスＬＴＲの5’Ｕ５および/または3’Ｕ３領域に挿入される。そのような長期
発現ベクターは、標的細胞にレトロウイルスベクターゲノムを介して異種遺伝子
を転移させるのに特に有用である。なぜなら、これらのベクター構築物では、前
記異種遺伝子を含む翻訳カセットが、レトロウイルスの生活環中でレトロウイル
スゲノムに組込まれたままだからである。転移された遺伝子はその後、標的細胞
のゲノム中に組込まれ、そして長期間にわたって発現する。
ーと明示される。長期発現ベクターの構築のために、翻訳カセットがレトロウイ
ルスＬＴＲの5’Ｕ５および/または3’Ｕ３領域に挿入される。そのような長期
発現ベクターは、標的細胞にレトロウイルスベクターゲノムを介して異種遺伝子
を転移させるのに特に有用である。なぜなら、これらのベクター構築物では、前
記異種遺伝子を含む翻訳カセットが、レトロウイルスの生活環中でレトロウイル
スゲノムに組込まれたままだからである。転移された遺伝子はその後、標的細胞
のゲノム中に組込まれ、そして長期間にわたって発現する。
【００２２】 本発明の好ましい態様では、翻訳カセットは3’ＬＴＲのＵ３領域（好ましく
は逆向き反復配列とＵ３領域の転写制御因子の間）に挿入される（図１）。この
3’ＬＴＲのＵ３領域への挿入は、感染後および逆転写の間に、この挿入された
翻訳カセットを含むＵ３領域が重複し、また5’ＬＴＲへシフトすることを保証
する。このように、結果として生成するプロウイルスＤＮＡは、両端のＬＴＲの
Ｕ３領域に上述の翻訳カセットを含む。
は逆向き反復配列とＵ３領域の転写制御因子の間）に挿入される（図１）。この
3’ＬＴＲのＵ３領域への挿入は、感染後および逆転写の間に、この挿入された
翻訳カセットを含むＵ３領域が重複し、また5’ＬＴＲへシフトすることを保証
する。このように、結果として生成するプロウイルスＤＮＡは、両端のＬＴＲの
Ｕ３領域に上述の翻訳カセットを含む。
【００２３】 続いて、このプロウイルスＤＮＡは感染した細胞のＤＮＡゲノム中にランダム
に組込まれる。この過程は、レトロウイルスのインテグラーゼにより媒介される
。組込みの成功後、プロウイルスＤＮＡはホスト細胞の媒介による転写により、
新規のレトロウイルスＲＮＡゲノムへと転写される。この転写は5’ＬＴＲのＲ
領域で開始され、ウイルス体にそって連続的に転写され、そして最終的に3’Ｌ
ＴＲのＲ領域のポリアデニレーションシグナルで停止する。それゆえ、新規のレ
トロウイルスＲＮＡゲノムは、再び不完全なＬＴＲで構成されることになる。そ
れにもかかわらず、結果として生成したレトロウイルスＲＮＡゲノムは、少なく
とも２つのＯＲＦを含んでいる。１つのＯＲＦはウイルス体の遺伝子をコード、
そして他のＯＲＦは、3’Ｕ３領域に挿入されているＩＲＥＳに機能的に関連し
た異種遺伝子をコードしている。それゆえに、生成されるＲＮＡ分子は２シスト
ロン性もしくは多シストロン性である。
に組込まれる。この過程は、レトロウイルスのインテグラーゼにより媒介される
。組込みの成功後、プロウイルスＤＮＡはホスト細胞の媒介による転写により、
新規のレトロウイルスＲＮＡゲノムへと転写される。この転写は5’ＬＴＲのＲ
領域で開始され、ウイルス体にそって連続的に転写され、そして最終的に3’Ｌ
ＴＲのＲ領域のポリアデニレーションシグナルで停止する。それゆえ、新規のレ
トロウイルスＲＮＡゲノムは、再び不完全なＬＴＲで構成されることになる。そ
れにもかかわらず、結果として生成したレトロウイルスＲＮＡゲノムは、少なく
とも２つのＯＲＦを含んでいる。１つのＯＲＦはウイルス体の遺伝子をコード、
そして他のＯＲＦは、3’Ｕ３領域に挿入されているＩＲＥＳに機能的に関連し
た異種遺伝子をコードしている。それゆえに、生成されるＲＮＡ分子は２シスト
ロン性もしくは多シストロン性である。
【００２４】 本発明のさらなる態様では、翻訳カセットはレトロウイルスベクターの5’Ｌ
ＴＲおよび/または3’ＬＴＲのＲ領域に挿入される。それらのＲ領域のどちらか
１つもしくは両方へのカセットの挿入は、挿入されたカセットがレトロウイルス
の生活環をとおしてレトロウイルスゲノムに組込まれたままであることを保証す
る。5’もしくは3’ＬＴＲのどちらかのＲ領域への組込みは、ただ１つの翻訳カ
セットのコピーをもつレトロウイルスＲＮＡ転写物を生成する、それに対して、
両方のＬＴＲのＲ領域への組込みは、２つのコピーをもつ上述のカセットから構
成されるＲＮＡ転写物を生成する。
ＴＲおよび/または3’ＬＴＲのＲ領域に挿入される。それらのＲ領域のどちらか
１つもしくは両方へのカセットの挿入は、挿入されたカセットがレトロウイルス
の生活環をとおしてレトロウイルスゲノムに組込まれたままであることを保証す
る。5’もしくは3’ＬＴＲのどちらかのＲ領域への組込みは、ただ１つの翻訳カ
セットのコピーをもつレトロウイルスＲＮＡ転写物を生成する、それに対して、
両方のＬＴＲのＲ領域への組込みは、２つのコピーをもつ上述のカセットから構
成されるＲＮＡ転写物を生成する。
【００２５】 翻訳カセットの２つのコピーは、カセットが例えば5’ＬＴＲのＵ５領域への
導入に加えて、3’ＬＴＲのＵ３領域に組込まれる際にも得ることができる。
導入に加えて、3’ＬＴＲのＵ３領域に組込まれる際にも得ることができる。
【００２６】 翻訳カセットの二つのコピーを含むＲＮＡ転写物の使用は、ＲＮＡ分子中で２
回コードされている異種遺伝子の蛋白質の合成量の増大をもたらす。そのような
蛋白質合成量の増加は、特に遺伝子治療および/または癌治療に有用である。
回コードされている異種遺伝子の蛋白質の合成量の増大をもたらす。そのような
蛋白質合成量の増加は、特に遺伝子治療および/または癌治療に有用である。
【００２７】 レトロウイルスＬＴＲでの翻訳カセットの局在とは無関係に、レトロウイルス
ゲノムの転写は常に、5’ＬＴＲのＵ３領域の制御因子および/またはプロモータ
ーにより制御される。本発見のさらなる態様によると、それらの制御因子および
/またはプロモーターは、他のレトロウイルス、ウイルスもしくは細胞の制御因
子および/またはプロモーターにより置き換えることができる。このために、レ
トロウイルスベクターの3’Ｕ３領域は、部分的な削除および/またはオリジナル
の制御因子および/またはプロモーターを望ましい制御因子および/またはプロモ
ーターに置き換えることにより修飾される。好ましくは、そのような制御因子お
よび/またはプロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免
疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルスなどの異なるウイルスもし
くは細胞の遺伝子から選択される。恒常的発現プロモーターに加えて、細胞特異
的もしくは誘導型のプロモーターが使用された。
ゲノムの転写は常に、5’ＬＴＲのＵ３領域の制御因子および/またはプロモータ
ーにより制御される。本発見のさらなる態様によると、それらの制御因子および
/またはプロモーターは、他のレトロウイルス、ウイルスもしくは細胞の制御因
子および/またはプロモーターにより置き換えることができる。このために、レ
トロウイルスベクターの3’Ｕ３領域は、部分的な削除および/またはオリジナル
の制御因子および/またはプロモーターを望ましい制御因子および/またはプロモ
ーターに置き換えることにより修飾される。好ましくは、そのような制御因子お
よび/またはプロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免
疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルスなどの異なるウイルスもし
くは細胞の遺伝子から選択される。恒常的発現プロモーターに加えて、細胞特異
的もしくは誘導型のプロモーターが使用された。
【００２８】 そのような誘導型もしくは細胞特異的制御因子および/またはプロモーターは
、好ましくは下記に列記ものからなる群の一以上であるが、これらに限定される
ｍのではない：ヒトの乳腺腫瘍を標的とする際に使用するホエー酸性蛋白質(WAP
; Whey Acidic Protein)、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、β―ラクトグ
ロブリンもしくはカゼインの制御因子および/またはプロモーター；カルボニッ
クアンヒドラーゼＩＩもしくはβーグルコキナーゼの制御因子とプロモーターを
含む膵臓特異的制御因子；イムノグロブリンそしてリンパ球での特異的制御因子
とプロモーター；グルココルチコイドホルモンへの応答性を与えるもしくは乳腺
での発現を惹起させるＭＭＴＶＰ２のようなＭＭＴＶ特異的制御因子とプロモー
ター、Ｔ細胞受容体遺伝子そしてＣＤ４受容体プロモーターのようなＴ細胞特異
的制御因子とプロモーター；またはイムノグロブリンプロモーターもしくはｍｂ
１のようなＢ細胞特異的制御因子とプロモーター。
、好ましくは下記に列記ものからなる群の一以上であるが、これらに限定される
ｍのではない：ヒトの乳腺腫瘍を標的とする際に使用するホエー酸性蛋白質(WAP
; Whey Acidic Protein)、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、β―ラクトグ
ロブリンもしくはカゼインの制御因子および/またはプロモーター；カルボニッ
クアンヒドラーゼＩＩもしくはβーグルコキナーゼの制御因子とプロモーターを
含む膵臓特異的制御因子；イムノグロブリンそしてリンパ球での特異的制御因子
とプロモーター；グルココルチコイドホルモンへの応答性を与えるもしくは乳腺
での発現を惹起させるＭＭＴＶＰ２のようなＭＭＴＶ特異的制御因子とプロモー
ター、Ｔ細胞受容体遺伝子そしてＣＤ４受容体プロモーターのようなＴ細胞特異
的制御因子とプロモーター；またはイムノグロブリンプロモーターもしくはｍｂ
１のようなＢ細胞特異的制御因子とプロモーター。
【００２９】 本発明によるレトロウイルスベクターは如何なるレトロウイルスに基づくもの
であってもよい。好ましくは鳥類由来ではなく、最適なのはＡｋｖ−マウス白血
病ウイルス(Akv-MLV)に基づくベクターである。Akv-MLVは、例えばMoloneyマウ
ス白血病ウイルス(MoMLV; Moloney murine leukemia virus)と核酸配列で８０％
、蛋白質レベルで９０％の配列相同性を共有している。また、Akv-MLVはSL-3-3-
マウス白血病ウイルス(SL-3-3-MLV)とヌクレオチド配列で９８％という高い相同
性がある。それゆえ、本発明はMoMLV、SL-3-3-MLVに基づくか、もしくは例えば
マウス白血病ウイルス(MLV)のようなさらなる任意の関連ウイルスに基づくレト
ロウイルスベクターの開発に特に有用である。
であってもよい。好ましくは鳥類由来ではなく、最適なのはＡｋｖ−マウス白血
病ウイルス(Akv-MLV)に基づくベクターである。Akv-MLVは、例えばMoloneyマウ
ス白血病ウイルス(MoMLV; Moloney murine leukemia virus)と核酸配列で８０％
、蛋白質レベルで９０％の配列相同性を共有している。また、Akv-MLVはSL-3-3-
マウス白血病ウイルス(SL-3-3-MLV)とヌクレオチド配列で９８％という高い相同
性がある。それゆえ、本発明はMoMLV、SL-3-3-MLVに基づくか、もしくは例えば
マウス白血病ウイルス(MLV)のようなさらなる任意の関連ウイルスに基づくレト
ロウイルスベクターの開発に特に有用である。
【００３０】 また、発明者らはSL-3-3-MLVベクターがリンパ球特異的スプライシング活性を
有していることを発見しているから、SL-3-3-MLVベクターは、リンパ球への感染
に特に有効である。それゆえ、SL-3-3-MLVベクターは、リンパ球特異的な治療目
的での遺伝子の導入、それによる感染症もしくは血球細胞機構の増殖失調への特
異的な治療もしくは予防のために好ましく使用される。最も好ましくは、ＶＩＲ
ＡＧＦＰＭおよび/またはＡＥＮＧＦＭＫ２に基づくベクターが使用される（表
１参照）。
有していることを発見しているから、SL-3-3-MLVベクターは、リンパ球への感染
に特に有効である。それゆえ、SL-3-3-MLVベクターは、リンパ球特異的な治療目
的での遺伝子の導入、それによる感染症もしくは血球細胞機構の増殖失調への特
異的な治療もしくは予防のために好ましく使用される。最も好ましくは、ＶＩＲ
ＡＧＦＰＭおよび/またはＡＥＮＧＦＭＫ２に基づくベクターが使用される（表
１参照）。
【００３１】 本発明のさらに別の態様によると、レトロウイルスベクターは、上述のうちの
任意のレトロウイルス(MoMLV, MLV, Akv-MLV, SL-3-3-MLV)に基づく複製能欠損
型ベクターとして構築され、またはＰｒｏＣｏｎファミリー（ＰＣＴ／ＥＰ９５
／０３４４５に完全に開示されている）、pLXSN-ファミリー（５２）、pBag-フ
ァミリー（５３）のベクターから誘導される。複製能欠損型のレトロウイルスベ
クターの場合は、ウイルスの複製、ウイルスＲＮＡのパッケジングおよび/また
は感染性粒子の形成に必須の１つもしくはそれ以上の遺伝子がレトロウイルスベ
クターから削除されている。したがって、ウイルスの生活環の再構成、およびそ
のような複製能欠損型ベクターを含むウイルス粒子の産生のためには、削除した
遺伝子を供給する特殊化したプロデューサー細胞が必要とされる。そのようなプ
ロデューサー細胞は、細胞に、レトロウイルスベクターゲノムのパッケージング
そしてウイルス粒子の産生に必須であるレトロウイルス蛋白質の遺伝情報をコー
ドしたＤＮＡ構築物を導入することにより作成される。注目すべきことに、レト
ロウイルス蛋白質の遺伝情報の導入により、プロデューサー細胞は、レトロウイ
ルスベクターゲノムの非存在下で、同様に放出されうる空のウイルス粒子を産生
する。これと比較して、レトロウイルスベクターゲノム存在下では、プロデュー
サー細胞はレトロウイルスベクターゲノムを有する感染性のウイルス粒子を産生
する。そのようなプロデューサー細胞は、パッケージング細胞と称される。本発
明によるパッケージング細胞は、好ましくは、例えばＰＡ３１７（４９）、ＢＯ
ＳＣ２３（２９）、ΨもしくはＰＧ１３（５０；５１）からなる群および/また
は付加的に他のレトロウイルスからの表層蛋白質の発現を可能にするさらに別の
構築物で感染された任意の細胞株から選択される（しかし、限定はされない）。
任意のレトロウイルス(MoMLV, MLV, Akv-MLV, SL-3-3-MLV)に基づく複製能欠損
型ベクターとして構築され、またはＰｒｏＣｏｎファミリー（ＰＣＴ／ＥＰ９５
／０３４４５に完全に開示されている）、pLXSN-ファミリー（５２）、pBag-フ
ァミリー（５３）のベクターから誘導される。複製能欠損型のレトロウイルスベ
クターの場合は、ウイルスの複製、ウイルスＲＮＡのパッケジングおよび/また
は感染性粒子の形成に必須の１つもしくはそれ以上の遺伝子がレトロウイルスベ
クターから削除されている。したがって、ウイルスの生活環の再構成、およびそ
のような複製能欠損型ベクターを含むウイルス粒子の産生のためには、削除した
遺伝子を供給する特殊化したプロデューサー細胞が必要とされる。そのようなプ
ロデューサー細胞は、細胞に、レトロウイルスベクターゲノムのパッケージング
そしてウイルス粒子の産生に必須であるレトロウイルス蛋白質の遺伝情報をコー
ドしたＤＮＡ構築物を導入することにより作成される。注目すべきことに、レト
ロウイルス蛋白質の遺伝情報の導入により、プロデューサー細胞は、レトロウイ
ルスベクターゲノムの非存在下で、同様に放出されうる空のウイルス粒子を産生
する。これと比較して、レトロウイルスベクターゲノム存在下では、プロデュー
サー細胞はレトロウイルスベクターゲノムを有する感染性のウイルス粒子を産生
する。そのようなプロデューサー細胞は、パッケージング細胞と称される。本発
明によるパッケージング細胞は、好ましくは、例えばＰＡ３１７（４９）、ＢＯ
ＳＣ２３（２９）、ΨもしくはＰＧ１３（５０；５１）からなる群および/また
は付加的に他のレトロウイルスからの表層蛋白質の発現を可能にするさらに別の
構築物で感染された任意の細胞株から選択される（しかし、限定はされない）。
【００３２】 感染性ウイルス粒子の産生のために、一般的には、パッケージング細胞株（上
述のとおり、すでに遺伝情報および/またはレトロウイルス粒子形成に必須の遺
伝子でトランスフェクションされている）は、レトロウイルスベクターＤＮＡで
スーパートランスフェクションされる。本発明との関連において、“スーパート
ランスフェクション”という用語は、“第二の”トランスフェクション、すなわ
ち、レトロウイルスベクターでのパッケージング細胞のトランスフェクションを
記述する。スーパートランスフェクションされたパッケージング細胞は、続いて
、レトロウイルスベクターＲＮＡゲノムを含む感染性のウイルス粒子を産生する
。パッケージング細胞から放出される、上述の粒子は分離されうるものである。
スーパートランスフェクションされたパッケージング細胞のみが、感染性のウイ
ルス粒子を産生することは注意すべき事項である。従って、形質導入効率は、直
接的に産生された感染性ウイルス粒子の量に比例する。
述のとおり、すでに遺伝情報および/またはレトロウイルス粒子形成に必須の遺
伝子でトランスフェクションされている）は、レトロウイルスベクターＤＮＡで
スーパートランスフェクションされる。本発明との関連において、“スーパート
ランスフェクション”という用語は、“第二の”トランスフェクション、すなわ
ち、レトロウイルスベクターでのパッケージング細胞のトランスフェクションを
記述する。スーパートランスフェクションされたパッケージング細胞は、続いて
、レトロウイルスベクターＲＮＡゲノムを含む感染性のウイルス粒子を産生する
。パッケージング細胞から放出される、上述の粒子は分離されうるものである。
スーパートランスフェクションされたパッケージング細胞のみが、感染性のウイ
ルス粒子を産生することは注意すべき事項である。従って、形質導入効率は、直
接的に産生された感染性ウイルス粒子の量に比例する。
【００３３】 このことは、パッケージング細胞内でのレトロウイルス粒子産生において、上
記で説明した過程の１つの欠点は、パッケージング細胞での限定された導入効率
であることを示している。
記で説明した過程の１つの欠点は、パッケージング細胞での限定された導入効率
であることを示している。
【００３４】 通常のパッケージング培養細胞での別の欠点としては、パッケージング細胞の
ウイルス粒子（例えばパッケージング培養細胞で新規に産生されている）による
感染に対する抵抗性である。この抵抗性は、パッケージング細胞でのレトロウイ
ルスEnv蛋白質の発現によって媒介される。Env蛋白質は、細胞膜受容体に結合す
ることができる。これらの細胞膜受容体は、細胞への感染性ウイルス粒子の接着
に関与する、従って、ウイルス粒子での細胞の感染に関与することになる。それ
ゆえに、細胞膜受容体が細胞内で産生されるレトロウイルスEnv蛋白質と結合し
てしまうパッケージング細胞では、さらなるウイルス粒子の接着は不可能となる
。従って、上述のパッケージング細胞は、どのようなさらなる感染もしくはスー
パーインフェクションのそれぞれに対しても抵抗性がある。本発明との関連にお
いて“スーパーインフェクション”という用語は、すでに形質導入されたパッケ
ージング細胞への、ウイルス粒子での任意の感染を記述するものである。それゆ
え、通常のパッケージング培養細胞中では、パッケージング細胞に対するさらな
るレトロウイルスベクターゲノムの転移は不可能である。従って、形質導入効率
の増加は得られず、従ってウイルス粒子の産生の増加も獲得することはできない
。
ウイルス粒子（例えばパッケージング培養細胞で新規に産生されている）による
感染に対する抵抗性である。この抵抗性は、パッケージング細胞でのレトロウイ
ルスEnv蛋白質の発現によって媒介される。Env蛋白質は、細胞膜受容体に結合す
ることができる。これらの細胞膜受容体は、細胞への感染性ウイルス粒子の接着
に関与する、従って、ウイルス粒子での細胞の感染に関与することになる。それ
ゆえに、細胞膜受容体が細胞内で産生されるレトロウイルスEnv蛋白質と結合し
てしまうパッケージング細胞では、さらなるウイルス粒子の接着は不可能となる
。従って、上述のパッケージング細胞は、どのようなさらなる感染もしくはスー
パーインフェクションのそれぞれに対しても抵抗性がある。本発明との関連にお
いて“スーパーインフェクション”という用語は、すでに形質導入されたパッケ
ージング細胞への、ウイルス粒子での任意の感染を記述するものである。それゆ
え、通常のパッケージング培養細胞中では、パッケージング細胞に対するさらな
るレトロウイルスベクターゲノムの転移は不可能である。従って、形質導入効率
の増加は得られず、従ってウイルス粒子の産生の増加も獲得することはできない
。
【００３５】 従って、本発明はさらなる態様において形質導入効率を増加させ、加えてパッ
ケージング培養細胞でのウイルス粒子産生を増加させるのに有用なレトロウイル
スベクターを提供する。
ケージング培養細胞でのウイルス粒子産生を増加させるのに有用なレトロウイル
スベクターを提供する。
【００３６】 本発明のこの態様によると、複製能欠損型のレトロウイルスベクターが提供さ
れ、当該ベクターは感染を開始する蛋白質をコードする遺伝子を含み、当該遺伝
子は異種ＩＲＥＳの翻訳制御下にある。本発明によると、このレトロウイルスベ
クターは自身でenvをコードしているので、パッケージング細胞はgagおよび/ま
たはpolによりコードされる蛋白質を供給することのみ要求される。gagおよび/
またはpolをコードするＤＮＡコンストラクションを具備するが、envをコードす
るＤＮＡコンストラクションを持たないパッケージング細胞はセミパッケージン
グ細胞と呼ばれる。好都合なことに、このセミパッケージング細胞はスーパーイ
ンフェクションに抵抗性はない、なぜならこの細胞はレトロウイルス粒子でのト
ランスフェクションの前には、Env蛋白質を発現していないからである。結果と
して、Env蛋白質は細胞内受容体と結合せず、従って当該細胞では抵抗性は成立
しない。
れ、当該ベクターは感染を開始する蛋白質をコードする遺伝子を含み、当該遺伝
子は異種ＩＲＥＳの翻訳制御下にある。本発明によると、このレトロウイルスベ
クターは自身でenvをコードしているので、パッケージング細胞はgagおよび/ま
たはpolによりコードされる蛋白質を供給することのみ要求される。gagおよび/
またはpolをコードするＤＮＡコンストラクションを具備するが、envをコードす
るＤＮＡコンストラクションを持たないパッケージング細胞はセミパッケージン
グ細胞と呼ばれる。好都合なことに、このセミパッケージング細胞はスーパーイ
ンフェクションに抵抗性はない、なぜならこの細胞はレトロウイルス粒子でのト
ランスフェクションの前には、Env蛋白質を発現していないからである。結果と
して、Env蛋白質は細胞内受容体と結合せず、従って当該細胞では抵抗性は成立
しない。
【００３７】 それゆえ、レトロウイルスベクターによるパッケージング細胞のトランスフェ
クション後に限り、ウイルス粒子が産生され放出される。これらのウイルス粒子
は機能的なenv遺伝子を含み、培養されたセミパッケージング細胞にさらに感染
することができる。従って、この態様によるレトロウイルスベクターは、セミパ
ッケージング細胞中で複製能があり、それゆえに高力価のレトロウイルス粒子の
簡便で高効率的な産生を可能にさせる。さらに、このレトロウイルスベクターは
、これらのセミパッケージング細胞で感染性のウイルス粒子が産生されるやいな
や、標的細胞（gagおよび/またはpolがなく、レトロウイルスベクターの遺伝情
報のみが移行される）に感染するという利点をもっている。この態様によるこの
ベクターは、gagおよび/またはpolを持たないので、標的細胞でのさらなるレト
ロウイルスベクターの複製は観察されていない。従って、上述の複製能欠損型ベ
クターは、例えば遺伝子治療での使用に対して安全なベクターである。
クション後に限り、ウイルス粒子が産生され放出される。これらのウイルス粒子
は機能的なenv遺伝子を含み、培養されたセミパッケージング細胞にさらに感染
することができる。従って、この態様によるレトロウイルスベクターは、セミパ
ッケージング細胞中で複製能があり、それゆえに高力価のレトロウイルス粒子の
簡便で高効率的な産生を可能にさせる。さらに、このレトロウイルスベクターは
、これらのセミパッケージング細胞で感染性のウイルス粒子が産生されるやいな
や、標的細胞（gagおよび/またはpolがなく、レトロウイルスベクターの遺伝情
報のみが移行される）に感染するという利点をもっている。この態様によるこの
ベクターは、gagおよび/またはpolを持たないので、標的細胞でのさらなるレト
ロウイルスベクターの複製は観察されていない。従って、上述の複製能欠損型ベ
クターは、例えば遺伝子治療での使用に対して安全なベクターである。
【００３８】 “感染を開始する能力を有する蛋白質”という用語は、レトロウイルスにホス
ト細胞の細胞膜に接着させ、および/またはホスト細胞に進入させることを可能
にするすべての蛋白質を含む。上述の蛋白質群はウイルスの表層の蛋白質であり
、好ましくはEnv蛋白質、もしくはEnv蛋白の機能的誘導体である。env遺伝子は
、本発明が準拠するレトロウイルスベクターと同じレトロウイルスに由来するも
のでもよい。しかしながら、env遺伝子は、好ましくはレトロウイルスベクター
に対して異種なものであり、最適なものは異なるウイルス種、亜種、サブタイプ
、クレードに由来するものである。さらに、感染を開始する蛋白質は、自然界で
生成した蛋白質の一部分のみであるか、もしくは自然界で生成した蛋白質のアミ
ノ酸配列の６０−６９％、好ましくは７０−８９％、最適なものは９０−９９％
同一なものである。感染の開始を惹起する、上述蛋白質の変異体のすべては、以
後“env”と呼ばれる。
ト細胞の細胞膜に接着させ、および/またはホスト細胞に進入させることを可能
にするすべての蛋白質を含む。上述の蛋白質群はウイルスの表層の蛋白質であり
、好ましくはEnv蛋白質、もしくはEnv蛋白の機能的誘導体である。env遺伝子は
、本発明が準拠するレトロウイルスベクターと同じレトロウイルスに由来するも
のでもよい。しかしながら、env遺伝子は、好ましくはレトロウイルスベクター
に対して異種なものであり、最適なものは異なるウイルス種、亜種、サブタイプ
、クレードに由来するものである。さらに、感染を開始する蛋白質は、自然界で
生成した蛋白質の一部分のみであるか、もしくは自然界で生成した蛋白質のアミ
ノ酸配列の６０−６９％、好ましくは７０−８９％、最適なものは９０−９９％
同一なものである。感染の開始を惹起する、上述蛋白質の変異体のすべては、以
後“env”と呼ばれる。
【００３９】 本発明によるレトロウイルスベクターは、env遺伝子をもつＩＲＥＳを含むＩ
ＲＥＳカセットに加えて、１つもしくはそれ以上のさらなる遺伝子を含んでいて
もよい。好ましい態様において、このベクターはＩＲＥＳ-envカセットに加えて
gagもしくはpolを具備し、最も好ましくは、付加的なＩＲＥＳがgagもしくはpol
に先行している。
ＲＥＳカセットに加えて、１つもしくはそれ以上のさらなる遺伝子を含んでいて
もよい。好ましい態様において、このベクターはＩＲＥＳ-envカセットに加えて
gagもしくはpolを具備し、最も好ましくは、付加的なＩＲＥＳがgagもしくはpol
に先行している。
【００４０】 もう一つの好ましい態様では、上述のベクターはＩＲＥＳ-envカセットに加え
て、一以上の異種遺伝子を含み、もっとも好ましくは、それがＩＲＥＳ-envカセ
ットの5’に挿入される。自然界で発生しているレトロウイルスと対比して有利
なことは、異種遺伝子とenvが同じ全長ｍＲＮＡから翻訳されることである。ス
プライシングが必要とされないので、異種遺伝子は長期間にわたって発現され、
そして異種遺伝子の削除が妨げられる。従って、本発明によるベクターは、以前
より知られていたenvがスプライスされたｍＲＮＡから発現するベクターと比較
して有利である。例えば、Nouvelら(Virology 204:180-89, 1994)は、異種遺伝
子とenvが通常の複製しているウイルスで産生されたenvＲＮＡと全く同じ構造の
、サブゲノミックなスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳されるレトロウイル
スベクターを作成した。しかしながら、このベクターは、急速に異種遺伝子を欠
失したベクターにより置き換えられる。
て、一以上の異種遺伝子を含み、もっとも好ましくは、それがＩＲＥＳ-envカセ
ットの5’に挿入される。自然界で発生しているレトロウイルスと対比して有利
なことは、異種遺伝子とenvが同じ全長ｍＲＮＡから翻訳されることである。ス
プライシングが必要とされないので、異種遺伝子は長期間にわたって発現され、
そして異種遺伝子の削除が妨げられる。従って、本発明によるベクターは、以前
より知られていたenvがスプライスされたｍＲＮＡから発現するベクターと比較
して有利である。例えば、Nouvelら(Virology 204:180-89, 1994)は、異種遺伝
子とenvが通常の複製しているウイルスで産生されたenvＲＮＡと全く同じ構造の
、サブゲノミックなスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳されるレトロウイル
スベクターを作成した。しかしながら、このベクターは、急速に異種遺伝子を欠
失したベクターにより置き換えられる。
【００４１】 本発明のさらなる態様によれば、特定の細胞種に感染する能力のような新規の
性質を具備したベクターを選択する方法が提出される。本発明のこの態様に従っ
て、env遺伝子の変異体に関する本発明による複製能欠損型ベクターの複合混合
物を含むベクターのライブラリーが作成された。そのようなライブラリーは、例
えばenv遺伝子内の選ばれた部分へのランダムな変異の導入、もしくはenv遺伝子
内へのランダムなcＤＮＡ断片の導入により作成できる。外被遺伝子(envelope g
ene)に直接導入される代わりに、ランダムな配列はまた、足場として利用される
異種蛋白質に導入することによっても提示できる。例えば、ランダムな配列は外
被遺伝子に埋め込まれた単鎖抗体遺伝子に導入してもよい。上述のベクターライ
ブラリーを作成した後、特定の細胞種の細胞が上記ライブラリーのベクターでト
ランスフェクションされる。引き続いて、その細胞はレトロウイルスベクターの
増幅を許容する条件下でインキュベーションされる。それにより、ウイルス粒子
は、それぞれの粒子が１つのenvの変異体をもつように産生される。Envがレトロ
ウイルス粒子の感染特性を決定するので、産生されたレトロウイルス粒子は異な
る感染特性を具備することになる。産生されたウイルス粒子のあるものは、他の
細胞よりも、特定の細胞種に対する感染性が高い。ウイルス粒子のあるものは、
まったくウイルス粒子を形成することができないか、または細胞に感染すること
ができないだろう。このため、産生されたウイルス粒子がまだ感染していない細
胞に更に感染する際には、envの特定の変異体をもつウイルス粒子はより成功度
が高く、上述のウイルス粒子が多くなる結果を生じるであろう。このため、特定
の標的細胞に対する感染においてもっとも成功度の高く、および/または上述の
標的細胞内での増幅においてもっとも成功度の高いウイルス粒子がもっとも多く
なるであろう。その後、ベクターは回収され、特性が調査され、そして別の研究
に使用される。例えば、本発明のこの態様に従って選別された変異した外被蛋白
質をコードする遺伝子は、特定の細胞種のみに感染するウイルス粒子産生を目的
とするパッケージング細胞の作成に使用できるであろう。
性質を具備したベクターを選択する方法が提出される。本発明のこの態様に従っ
て、env遺伝子の変異体に関する本発明による複製能欠損型ベクターの複合混合
物を含むベクターのライブラリーが作成された。そのようなライブラリーは、例
えばenv遺伝子内の選ばれた部分へのランダムな変異の導入、もしくはenv遺伝子
内へのランダムなcＤＮＡ断片の導入により作成できる。外被遺伝子(envelope g
ene)に直接導入される代わりに、ランダムな配列はまた、足場として利用される
異種蛋白質に導入することによっても提示できる。例えば、ランダムな配列は外
被遺伝子に埋め込まれた単鎖抗体遺伝子に導入してもよい。上述のベクターライ
ブラリーを作成した後、特定の細胞種の細胞が上記ライブラリーのベクターでト
ランスフェクションされる。引き続いて、その細胞はレトロウイルスベクターの
増幅を許容する条件下でインキュベーションされる。それにより、ウイルス粒子
は、それぞれの粒子が１つのenvの変異体をもつように産生される。Envがレトロ
ウイルス粒子の感染特性を決定するので、産生されたレトロウイルス粒子は異な
る感染特性を具備することになる。産生されたウイルス粒子のあるものは、他の
細胞よりも、特定の細胞種に対する感染性が高い。ウイルス粒子のあるものは、
まったくウイルス粒子を形成することができないか、または細胞に感染すること
ができないだろう。このため、産生されたウイルス粒子がまだ感染していない細
胞に更に感染する際には、envの特定の変異体をもつウイルス粒子はより成功度
が高く、上述のウイルス粒子が多くなる結果を生じるであろう。このため、特定
の標的細胞に対する感染においてもっとも成功度の高く、および/または上述の
標的細胞内での増幅においてもっとも成功度の高いウイルス粒子がもっとも多く
なるであろう。その後、ベクターは回収され、特性が調査され、そして別の研究
に使用される。例えば、本発明のこの態様に従って選別された変異した外被蛋白
質をコードする遺伝子は、特定の細胞種のみに感染するウイルス粒子産生を目的
とするパッケージング細胞の作成に使用できるであろう。
【００４２】 好ましい態様に従えば、この選択方法は、例えば異なる種、サブタイプ、クレ
ードのウイルス環境下で機能するのに適した異種外被蛋白質の選択に応用される
。異種外被蛋白質がミニウイルス（すなわち、複製能が正常でないウイルス）に
導入される際には、異なるウイルス種のコンポーネントは共同での機能に適して
いないので、生じたウイルスはしばしば感染性が弱い。しかしながら、ミニウイ
ルスの外被蛋白質もしくは遺伝子での変異は、異種性な状況下での機能を改善す
るであろう。従って、適切な領域に変異が生じた場合には、ある種のベクターは
他のベクターよりもより良く機能するであろう。もし、これらの異なる外被蛋白
質をもつミニウイルスが、例えばセミパッケージング細胞株中で複製されるなら
ば、もっとも感染性の高いものがもっとも多く存在するようになり、さらなる分
析と利用のため選択されることができる。
ードのウイルス環境下で機能するのに適した異種外被蛋白質の選択に応用される
。異種外被蛋白質がミニウイルス（すなわち、複製能が正常でないウイルス）に
導入される際には、異なるウイルス種のコンポーネントは共同での機能に適して
いないので、生じたウイルスはしばしば感染性が弱い。しかしながら、ミニウイ
ルスの外被蛋白質もしくは遺伝子での変異は、異種性な状況下での機能を改善す
るであろう。従って、適切な領域に変異が生じた場合には、ある種のベクターは
他のベクターよりもより良く機能するであろう。もし、これらの異なる外被蛋白
質をもつミニウイルスが、例えばセミパッケージング細胞株中で複製されるなら
ば、もっとも感染性の高いものがもっとも多く存在するようになり、さらなる分
析と利用のため選択されることができる。
【００４３】 標的細胞もしくはプロデューサー細胞株それぞれに、本発明による複製能正常
型、半複製能正常型もしくは複製能欠損型のレトロウイルスベクターを導入後、
組み換え型レトロウイルスゲノムを含むレトロウイルス粒子が産生され、引き続
いて形質導入された細胞から放出される。それゆえ、本発明はまた、本発明によ
るレトロウイルスベクターを具備するホスト細胞、プロデューサー細胞、および
レトロウイルス粒子をも提出する。
型、半複製能正常型もしくは複製能欠損型のレトロウイルスベクターを導入後、
組み換え型レトロウイルスゲノムを含むレトロウイルス粒子が産生され、引き続
いて形質導入された細胞から放出される。それゆえ、本発明はまた、本発明によ
るレトロウイルスベクターを具備するホスト細胞、プロデューサー細胞、および
レトロウイルス粒子をも提出する。
【００４４】 本発明はさらに、本発明によるレトロウイルスベクターから転写された、本発
明によるレトロウイルスプロウイルス、レトロウイルスプロウイルスのｍRNA、
または任意のRNAをも含む。さらに、本発明はレトロウイルス粒子を導入（もし
くは感染）されたホスト細胞を含む。
明によるレトロウイルスプロウイルス、レトロウイルスプロウイルスのｍRNA、
または任意のRNAをも含む。さらに、本発明はレトロウイルス粒子を導入（もし
くは感染）されたホスト細胞を含む。
【００４５】 本発明によれば、レトロウイルスベクター並びにそのRNA、プロデューサー細
胞もしくはホスト細胞、および/またはレトロウイルス粒子は、ヒトを含む哺乳
類での遺伝子治療、またはin vivoおよびin vitroでの遺伝子治療のための薬学
的組成物の生産のために使用される。
胞もしくはホスト細胞、および/またはレトロウイルス粒子は、ヒトを含む哺乳
類での遺伝子治療、またはin vivoおよびin vitroでの遺伝子治療のための薬学
的組成物の生産のために使用される。
【００４６】 本発明の更なる態様は、本発明によるレトロウイルスベクターもしくは本発明
による組み換え型レトロウイルス粒子によるin vivoもしくはin vitroでの標的
細胞集団への形質導入を含む、同種および/または異種のヌクレオチド配列を標
的細胞に導入する方法を提供する。
による組み換え型レトロウイルス粒子によるin vivoもしくはin vitroでの標的
細胞集団への形質導入を含む、同種および/または異種のヌクレオチド配列を標
的細胞に導入する方法を提供する。
【００４７】 この方法は、特に、トランスジェニック動物の作成に資するものである。トラ
ンスジェニック動物系統の確立のためには、最初にそれらの生殖系細胞に適切な
トランス遺伝子が導入された、いわゆる始原動物が樹立されなければならない。
そのような始原動物（生殖系細胞でトランス遺伝子に対してヘテロ接合体である
）は子孫の繁殖のために利用される。“ヘテロ接合体”という用語は、２倍体細
胞ゲノムの染色体の一方に、トランス遺伝子が認められることを示す。それに対
して“ホモ接合体”という用語は、２倍体ゲノムの染色体の両方にトランス遺伝
子を含むことを示す。始原動物の繁殖の結果、遺伝におけるメンデルの法則から
、４匹の子孫のうち１匹にトランス遺伝子についてホモ接合体であることが期待
される。さらに、そのようなホモ接合体のトランスジェニック動物の繁殖の結果
、体のすべての細胞がトランス遺伝子を含むトランスジェニック動物系統が樹立
される。
ンスジェニック動物系統の確立のためには、最初にそれらの生殖系細胞に適切な
トランス遺伝子が導入された、いわゆる始原動物が樹立されなければならない。
そのような始原動物（生殖系細胞でトランス遺伝子に対してヘテロ接合体である
）は子孫の繁殖のために利用される。“ヘテロ接合体”という用語は、２倍体細
胞ゲノムの染色体の一方に、トランス遺伝子が認められることを示す。それに対
して“ホモ接合体”という用語は、２倍体ゲノムの染色体の両方にトランス遺伝
子を含むことを示す。始原動物の繁殖の結果、遺伝におけるメンデルの法則から
、４匹の子孫のうち１匹にトランス遺伝子についてホモ接合体であることが期待
される。さらに、そのようなホモ接合体のトランスジェニック動物の繁殖の結果
、体のすべての細胞がトランス遺伝子を含むトランスジェニック動物系統が樹立
される。
【００４８】 トランスジェニック動物作成上の主な問題点は、始原動物の生殖系細胞での十
分な導入効率の確保である。通常、初期胚に導入することのできる胚性幹細胞（
ES細胞）はin vitroで操作され、トランスジェニック活性を指標に選択され、そ
して引き続いて初期胚に再導入される。そのような胚性幹細胞はいまだ多能性を
保持しているので、それらのなかのある細胞は生殖系細胞にも分化する。この方
法は低い効率で、大変な時間を要するものである。
分な導入効率の確保である。通常、初期胚に導入することのできる胚性幹細胞（
ES細胞）はin vitroで操作され、トランスジェニック活性を指標に選択され、そ
して引き続いて初期胚に再導入される。そのような胚性幹細胞はいまだ多能性を
保持しているので、それらのなかのある細胞は生殖系細胞にも分化する。この方
法は低い効率で、大変な時間を要するものである。
【００４９】 本発明の方法によれば、それぞれ胚性幹細胞もしくは初期胚は、本発明による
レトロウイルス粒子によりin vitroかまたは子宮内(intra utero)で感染される
。感染後、レトロウイルスベクターは胚細胞のゲノム内に組込まれる。一度レト
ロウイルスベクターが胚性幹細胞のゲノムに組込まれると、通常の細胞分裂によ
り、ベクターはすべての子孫細胞に伝達される。随意に使用されたレトロウイル
スベクターは複製能正常型なので、ベクターは感染した胚細胞でさらなる感染性
のレトロウイルス粒子を産生する。これらの粒子はさらに胚細胞に感染し、そし
て生殖系の形質導入を得る確率が潜在的に増加する。従って、本発明による方法
は、生殖系の形質転換を獲得するのに高効率である。生殖系の形質導入の効率は
トランスジェニック動物の最終的な獲得の成功率と一致するので、本発明による
方法はトランスジェニック動物を作成するための、迅速で効率的な技術を提供す
ることとなる。この方法は哺乳類に適用できる、しかし鳥や魚のような種類にも
また適用できる。
レトロウイルス粒子によりin vitroかまたは子宮内(intra utero)で感染される
。感染後、レトロウイルスベクターは胚細胞のゲノム内に組込まれる。一度レト
ロウイルスベクターが胚性幹細胞のゲノムに組込まれると、通常の細胞分裂によ
り、ベクターはすべての子孫細胞に伝達される。随意に使用されたレトロウイル
スベクターは複製能正常型なので、ベクターは感染した胚細胞でさらなる感染性
のレトロウイルス粒子を産生する。これらの粒子はさらに胚細胞に感染し、そし
て生殖系の形質導入を得る確率が潜在的に増加する。従って、本発明による方法
は、生殖系の形質転換を獲得するのに高効率である。生殖系の形質導入の効率は
トランスジェニック動物の最終的な獲得の成功率と一致するので、本発明による
方法はトランスジェニック動物を作成するための、迅速で効率的な技術を提供す
ることとなる。この方法は哺乳類に適用できる、しかし鳥や魚のような種類にも
また適用できる。
【００５０】 哺乳類ゲノムのおよそ９０％以上が非コード領域により占められているので、
レトロウイルスによる生殖系細胞の形質転換は、通常は非コード領域へのベクタ
ーの挿入を導く。このように、組込まれたベクターをもつトランスジェニック細
胞は、通常はレトロウイルスベクター上にコードされる少なくとも１つの付加的
な遺伝子を発現する。ゲノムに組込まれた本発明によるレトロウイルスベクター
から翻訳される付加的な遺伝子は、形質導入された細胞のみならず、潜在的な始
原動物の検出をも本質的に簡易化する。ベクターの挿入は、細胞ゲノムのコード
領域でも生じるであろう。このようなレトロウイルスの導入は、通常細胞のコー
ド領域の損傷にいたる。それゆえ、この方策はいわゆるノックアウトマウスの作
成において特に興味深いものである。
レトロウイルスによる生殖系細胞の形質転換は、通常は非コード領域へのベクタ
ーの挿入を導く。このように、組込まれたベクターをもつトランスジェニック細
胞は、通常はレトロウイルスベクター上にコードされる少なくとも１つの付加的
な遺伝子を発現する。ゲノムに組込まれた本発明によるレトロウイルスベクター
から翻訳される付加的な遺伝子は、形質導入された細胞のみならず、潜在的な始
原動物の検出をも本質的に簡易化する。ベクターの挿入は、細胞ゲノムのコード
領域でも生じるであろう。このようなレトロウイルスの導入は、通常細胞のコー
ド領域の損傷にいたる。それゆえ、この方策はいわゆるノックアウトマウスの作
成において特に興味深いものである。
【００５１】
本発明は、なかんずく下記に示す事項の単独、もしくは組み合わせを含むもの
である。
である。
【００５２】 レトロウイルスに特徴的な遺伝子をすべて具備するレトロウイルスベクターで
あって、レトロウイルスの複製に関して必須のすべての遺伝子が機能を保持して
おり、異種の内部リボゾーム侵入部位(IRES; internal ribosome entry site)を
付加的に含む当該ベクター。
あって、レトロウイルスの複製に関して必須のすべての遺伝子が機能を保持して
おり、異種の内部リボゾーム侵入部位(IRES; internal ribosome entry site)を
付加的に含む当該ベクター。
【００５３】 IRESに先行される異種遺伝子を含み、IRESの制御下で前記異種遺伝子の翻訳に
いたる、前記レトロウイルスベクター。
いたる、前記レトロウイルスベクター。
【００５４】 感染開始を可能にする蛋白質をコードする遺伝子を含む複製能欠損型レトロウ
イルスベクターであって、前記遺伝子が異種の内部リボゾーム侵入部位(IRES)の
翻訳制御下にあるベクター。
イルスベクターであって、前記遺伝子が異種の内部リボゾーム侵入部位(IRES)の
翻訳制御下にあるベクター。
【００５５】 感染開始を可能にする蛋白質をコードする遺伝子がenv遺伝子もしくはそれの
機能的な派生物である、前記レトロウイルスベクター。
機能的な派生物である、前記レトロウイルスベクター。
【００５６】 異種のenv遺伝子を含む、前記レトロウイルスベクター。
【００５７】 envとレトロウイルスベクターが異なる種、亜種、サブタイプ、もしくはクレ
ードに由来する、前記レトロウイルスベクター。
ードに由来する、前記レトロウイルスベクター。
【００５８】 gagが付加的にベクターに組み込まれた、前記レトロウイルスベクター。
【００５９】 polが付加的にベクターに組み込まれた、前記レトロウイルスベクター。
【００６０】 gag もしくはpolが付加的なIRESによって先行されるか、或いはプロモーター
および/またはエンハンサー因子によって先行される、前記レトロウイルスベク
ター。
および/またはエンハンサー因子によって先行される、前記レトロウイルスベク
ター。
【００６１】 １つの付加的な異種遺伝子を含む、前記レトロウイルスベクター。
【００６２】 前記の付加的な異種遺伝子が１つの付加的なIRES、或いはプロモーターおよび
/またはエンハンサー因子の制御下で発現する、前記レトロウイルスベクター。
/またはエンハンサー因子の制御下で発現する、前記レトロウイルスベクター。
【００６３】 IRESがLTR(Long Terminal Repeat)に挿入された、前記レトロウイルスベクタ
ー。
ー。
【００６４】 IRESがLTRのU3領域に挿入された、前記レトロウイルスベクター。
【００６５】 IRESが3’LTRのU3領域に挿入された、前記レトロウイルスベクター。
【００６６】 IRESが逆向き反復配列と転写制御因子の間のU3領域に挿入されている、前記レ
トロウイルスベクター。
トロウイルスベクター。
【００６７】 使用されたIRESがピコルナウイルス科、レトロウイルス科もしくはレトロポゾ
ンから選択された前記レトロウイルスベクター。
ンから選択された前記レトロウイルスベクター。
【００６８】 レトロウイルスベクターがマウス白血病ウイルス(MLV)、Moloney白血病ウイル
ス(MoMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLVもしくは他の近縁ウイルスを基礎とするもので
ある、前記レトロウイルスベクター。
ス(MoMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLVもしくは他の近縁ウイルスを基礎とするもので
ある、前記レトロウイルスベクター。
【００６９】 前記レトロウイルスベクターのRNA。
【００７０】 前記RNAの逆転写過程の際に、標的細胞で産生されるレトロウイルスプロウイ
ルス。
ルス。
【００７１】 前記レトロウイルスプロウイルスのｍRNA。
【００７２】 前記RNAを含むレトロウイルス粒子。
【００７３】 前記レトロウイルスベクターもしくは前記RNAでパッケージング細胞をトラン
スフェクションすることにより得られる前記レトロウイルス粒子。
スフェクションすることにより得られる前記レトロウイルス粒子。
【００７４】 前記レトロウイルスベクターを含むプロデューサー細胞。
【００７５】 前記レトロウイルスベクターを含むホスト細胞。
【００７６】 前記レトロウイルス粒子で感染されたホスト細胞。
【００７７】 遺伝子治療での利用するための、前記レトロウイルスベクター、前記プロデュ
ーサー細胞、前記レトロウイルス粒子および/または前記ホスト細胞。
ーサー細胞、前記レトロウイルス粒子および/または前記ホスト細胞。
【００７８】 遺伝子治療の医薬を製造するための、前記レトロウイルスベクター、前記プロ
デューサー細胞、前記レトロウイルス粒子および/または前記ホスト細胞の使用
。
デューサー細胞、前記レトロウイルス粒子および/または前記ホスト細胞の使用
。
【００７９】 前記レトロウイルスベクター、前記レトロウイルス粒子、前記プロデューサー
細胞、および/または前記ホスト細胞の治療的効果量を含む薬学的組成物。
細胞、および/または前記ホスト細胞の治療的効果量を含む薬学的組成物。
【００８０】 前記レトロウイルス粒子による標的細胞の感染を含む、標的細胞に同種および
/または異種のヌクレオチド配列を導入するための方法。
/または異種のヌクレオチド配列を導入するための方法。
【００８１】 トランスジェニック動物を作出するための前記の方法であって、前記レトロウ
イルス粒子、或いは前記レトロウイルスベクターによる胚細胞の感染または導入
を含む方法。
イルス粒子、或いは前記レトロウイルスベクターによる胚細胞の感染または導入
を含む方法。
【００８２】 特定標的細胞の特異的感染のために、前記レトロウイルスベクターを含むウイ
ルス粒子を選択するための方法であって、 パッケージング細胞が、感染を開始する能力のある蛋白質をコードする遺伝子
の変異体を含む前記レトロウイルスベクターで構成されるベクターライブラリー
で感染され、 当該感染細胞が、当該レトロウイルスベクターの増幅を許容する条件下でイン
キュベーションされ、それぞれが感染を開始する能力のある蛋白質の１つの変異
体を含むウイルス粒子の生成をもたらし、 さらに、まだ未感染の細胞が当該ウイルス粒子により感染されて、前記蛋白質
の変異体の１種類を含む、前記標的細胞を感染するために高度に適応したウイル
ス粒子の富化を生じる方法。
ルス粒子を選択するための方法であって、 パッケージング細胞が、感染を開始する能力のある蛋白質をコードする遺伝子
の変異体を含む前記レトロウイルスベクターで構成されるベクターライブラリー
で感染され、 当該感染細胞が、当該レトロウイルスベクターの増幅を許容する条件下でイン
キュベーションされ、それぞれが感染を開始する能力のある蛋白質の１つの変異
体を含むウイルス粒子の生成をもたらし、 さらに、まだ未感染の細胞が当該ウイルス粒子により感染されて、前記蛋白質
の変異体の１種類を含む、前記標的細胞を感染するために高度に適応したウイル
ス粒子の富化を生じる方法。
【００８３】 感染を開始する能力のある蛋白質をコードする前記遺伝子がenv遺伝子である
前記の方法。
前記の方法。
【００８４】 前記遺伝子が異種のenv遺伝子である前記の方法。
【００８５】 以下、実施例により本発明をさらに詳述する。当業者は、提出された実施例が
、本発明より提供される技術の適用性をこの実施例に制限するようには決して解
釈されないことを十分に理解するであろう。
、本発明より提供される技術の適用性をこの実施例に制限するようには決して解
釈されないことを十分に理解するであろう。
【００８６】
実施例1：LTR部位にIRESカセットを導入した複製能正常型レトロウイルス ベクターの構築 異種遺伝子を発現する複製能正常型マウス白血病ウイルスの構築可能性を検討
するため、EMCV IRES-neoカセットがSL3-3-MLVと Akv-MLVの3'LTR側のCelIIサ
イトに導入された (図 l)。pJD214HyBi+( EMCV map (12) の270からneoの停止コ
ドンまで)からIRES-neoカセット部位がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅さ
れた(1398 bp)。
するため、EMCV IRES-neoカセットがSL3-3-MLVと Akv-MLVの3'LTR側のCelIIサ
イトに導入された (図 l)。pJD214HyBi+( EMCV map (12) の270からneoの停止コ
ドンまで)からIRES-neoカセット部位がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅さ
れた(1398 bp)。
【００８７】 5' プライマー: CAAGCTTAGCGGCCGCCCCCTAACGTTACTG, (配列番号: 1), 3' プライマー: TATGCTAAGCTCGACTCAGAAGAACTCGTCAAG, (配列番号: 2). EMCVのスタートコドン10（EMCV のマップ上の826）からneo のATGスタートコ
ドンまでのリーダー配列はATTGCCGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCCAATATG, (配列番号: 3)である。
ドンまでのリーダー配列はATTGCCGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCCAATATG, (配列番号: 3)である。
【００８８】 さらに、IRES-EGFP (緑色蛍光蛋白質、GFP)カセットが導入されたレトロウイ
ルスベクターの構築のために、IRES-EGFPカセット部位がCMVbipe2-EGFPと呼称さ
れるプラスミッドからPCRにより増幅された。このプラスミッドはpJD214HyBi+プ
ラスミッド(17)に準拠しており、neo遺伝子に代わりEGFP遺伝子配列(ClonTech,
Palo Alto, USA)から構成されている。PCR増幅に以下のプライマーを使用した。
ルスベクターの構築のために、IRES-EGFPカセット部位がCMVbipe2-EGFPと呼称さ
れるプラスミッドからPCRにより増幅された。このプラスミッドはpJD214HyBi+プ
ラスミッド(17)に準拠しており、neo遺伝子に代わりEGFP遺伝子配列(ClonTech,
Palo Alto, USA)から構成されている。PCR増幅に以下のプライマーを使用した。
【００８９】 5' プライマー: GATCGCTTAGCTGCAGATGCATGGCCCATGCGGCCGCCCCCT, (配列番号4),
3'プライマー: (配列番号5) ATGACTGCAGGCTAAGCCATATGACGCGTACGGCCGC TTTACTTGACAGC. EMCVのスタートコドン10からEGFPのATGスタートコドンまでのリーダー配列はA
TTGCCGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCCGCGG TCGACATG, (配列番号6)である。これらから開始し、さらにEMCVのスタートコド
ン10からEGFPのATGスタートコドンまでのリーダー配列のみに差異をもつ、いく
つかのさらなるベクターが構築された。関連のあるリーダー配列は図２に示して
ある。
3'プライマー: (配列番号5) ATGACTGCAGGCTAAGCCATATGACGCGTACGGCCGC TTTACTTGACAGC. EMCVのスタートコドン10からEGFPのATGスタートコドンまでのリーダー配列はA
TTGCCGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCCGCGG TCGACATG, (配列番号6)である。これらから開始し、さらにEMCVのスタートコド
ン10からEGFPのATGスタートコドンまでのリーダー配列のみに差異をもつ、いく
つかのさらなるベクターが構築された。関連のあるリーダー配列は図２に示して
ある。
【００９０】 IRESを含む翻訳カセットが、それぞれpAKV(pPBS-Pro (25)に由来するLTR部位
とリンカー部位を有するpAKV-59 (21, 22))とpSL3-3 (pBR327のEcoRI サイトに
挿入された内在性の配列で挟まれたSL3-3のゲノミッククローン) (GenBank Acce
ssion no: J02549)）の3' LTR側のCelIIサイトに導入され、それぞれ、pAkvBi-n
eo, pAkvBi-EGFPと pSL3-3Bi-neoとなった。
とリンカー部位を有するpAKV-59 (21, 22))とpSL3-3 (pBR327のEcoRI サイトに
挿入された内在性の配列で挟まれたSL3-3のゲノミッククローン) (GenBank Acce
ssion no: J02549)）の3' LTR側のCelIIサイトに導入され、それぞれ、pAkvBi-n
eo, pAkvBi-EGFPと pSL3-3Bi-neoとなった。
【００９１】 選択された導入部位（CelIIサイト）はLTRの5'末端から２７ベースペアの部位
に位置している。組込み過程に関与する逆向き反復配列は、挿入により影響をう
けず、そして転写制御の主決定要因であるU3のエンハンサーではない。明白に、
99 bpの反復配列(20, 22)が挿入配列の110 bp下流から始まる。ベクターのデザ
インによると、例えばIRES-neo (図 1)のような翻訳カセットは、非スプライス
（ゲノミック）型とスプライス型の両方のmRNAに存在していると予想される。
に位置している。組込み過程に関与する逆向き反復配列は、挿入により影響をう
けず、そして転写制御の主決定要因であるU3のエンハンサーではない。明白に、
99 bpの反復配列(20, 22)が挿入配列の110 bp下流から始まる。ベクターのデザ
インによると、例えばIRES-neo (図 1)のような翻訳カセットは、非スプライス
（ゲノミック）型とスプライス型の両方のmRNAに存在していると予想される。
【００９２】 また、同じIRES-neo カセット(17)はpBi-zeo-neoと名づけられた２シストロン
性のzeo と neo(neo はネオマイシン耐性遺伝子を表わす)を発現するベクターの
構築に使用された。このベクターのため、IRES-neoカセットがzeo(Zeocin遺伝子
)をもつAkv-MLVに準拠したベクター(単シストロン型プラスミッドptvAkv-neo (2
8)からM.S.Sorensenにより作成されたMSS5)に導入され、２シストロン型ベクタ
ーpBi-zeo-neoとなった。このベクターはEMCV-IRES の導入により、5'端から翻
訳されるzeo と内部の開始位置から翻訳されるneo をもつ、一つの非スプライス
RNA転写物を生じることが期待され試験された。またpBi-neo-zeoベクターでは、
IRESは正しい位置に置かれているがneo と zeo は交換されている。
性のzeo と neo(neo はネオマイシン耐性遺伝子を表わす)を発現するベクターの
構築に使用された。このベクターのため、IRES-neoカセットがzeo(Zeocin遺伝子
)をもつAkv-MLVに準拠したベクター(単シストロン型プラスミッドptvAkv-neo (2
8)からM.S.Sorensenにより作成されたMSS5)に導入され、２シストロン型ベクタ
ーpBi-zeo-neoとなった。このベクターはEMCV-IRES の導入により、5'端から翻
訳されるzeo と内部の開始位置から翻訳されるneo をもつ、一つの非スプライス
RNA転写物を生じることが期待され試験された。またpBi-neo-zeoベクターでは、
IRESは正しい位置に置かれているがneo と zeo は交換されている。
【００９３】 ウイルス粒子の産生 組み換え型ウイルスの生成とウイルスの産生のため、上記のベクターコンスト
ラクションが以下の示す細胞株にトランスフェクションされた： マウスの繊維芽細胞株NIH3T3が10%(vol/vol)新生児牛血清を含有するDulbecco's modified Eagle's medium中で培養された。Neo耐性のNIH3T3細胞の選択は、600
μg/ml G418 (有効濃度；active concentration, Calbiochem)存在下で行われた
。
ラクションが以下の示す細胞株にトランスフェクションされた： マウスの繊維芽細胞株NIH3T3が10%(vol/vol)新生児牛血清を含有するDulbecco's modified Eagle's medium中で培養された。Neo耐性のNIH3T3細胞の選択は、600
μg/ml G418 (有効濃度；active concentration, Calbiochem)存在下で行われた
。
【００９４】 BOSC23細胞はAd5により形質転換されたヒト胚性腎臓２９３細胞株(29)に由来
する。BOSC23細胞はグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)に対して
、10% (vol/vol)牛胎児血清含有のDulbecco's modified Eagle's medium中で25
μg/ml マイコフェノール酸 (Gibco), 20 μg/ml アミノプテリン (Sigma), 250 μg/ml キサンチン (Sigma) そして60 μg/ml チミジン (Sigma)により選択さ
れた（他の条件はNlH3T3と同じ条件下で培養された）。
する。BOSC23細胞はグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)に対して
、10% (vol/vol)牛胎児血清含有のDulbecco's modified Eagle's medium中で25
μg/ml マイコフェノール酸 (Gibco), 20 μg/ml アミノプテリン (Sigma), 250 μg/ml キサンチン (Sigma) そして60 μg/ml チミジン (Sigma)により選択さ
れた（他の条件はNlH3T3と同じ条件下で培養された）。
【００９５】 すべてのトランスフェクションはリン酸カルシウム法(11)により行われた。新
鮮な培養液が、ハーベスティングの８時間前に供給された24h-BOSC23実験(表 1
, 2行目 (24h))を除き、新鮮な培養液はコンフルエントなウイルス産生細胞にハ
ーベスティングの２４時間前に供給された。ハーベストしたウイルス上清は0.45
-μm口径のフィルターでろ過され、１０倍希釈され6 μg/mlポリブレンをいれた
６ウェル型培養プレート(l05 NlH3T3細胞/12 cm2 ウェル)に加えられた。G418は
形質導入の２４時間後に添加され、12−14日間選択が継続された。
鮮な培養液が、ハーベスティングの８時間前に供給された24h-BOSC23実験(表 1
, 2行目 (24h))を除き、新鮮な培養液はコンフルエントなウイルス産生細胞にハ
ーベスティングの２４時間前に供給された。ハーベストしたウイルス上清は0.45
-μm口径のフィルターでろ過され、１０倍希釈され6 μg/mlポリブレンをいれた
６ウェル型培養プレート(l05 NlH3T3細胞/12 cm2 ウェル)に加えられた。G418は
形質導入の２４時間後に添加され、12−14日間選択が継続された。
【００９６】
【表１】 neo を発現するマキシウイルスの形質導入効率 以下、我々は異種遺伝子発現のための複製能正常型組み換え型ウイルスを表わ
すためにマキシウイルスという用語を使用する。形質導入実験はneoを発現する
マキシウイルス（SL3-3Bi-neoとAkvBi-neo）が通常のレトロウイルスベクターと
同程度の効率でトランジエントトランスフェクションされたパッケージング細胞
株(BOSC23) から導入できるがどうかを検定するために実施された(表１)。neo
を発現しているtvAkv-neo (28), Bi-zeo-neo, Bi-neo-zeoベクターがコントロー
ルとして使用された。タイターはマキシウイルスが5xl05 neo 耐性コロニー/ml
と通常の単シストロン型、２シストロン型ベクターと同程度の効率で導入される
ことを示している。
すためにマキシウイルスという用語を使用する。形質導入実験はneoを発現する
マキシウイルス（SL3-3Bi-neoとAkvBi-neo）が通常のレトロウイルスベクターと
同程度の効率でトランジエントトランスフェクションされたパッケージング細胞
株(BOSC23) から導入できるがどうかを検定するために実施された(表１)。neo
を発現しているtvAkv-neo (28), Bi-zeo-neo, Bi-neo-zeoベクターがコントロー
ルとして使用された。タイターはマキシウイルスが5xl05 neo 耐性コロニー/ml
と通常の単シストロン型、２シストロン型ベクターと同程度の効率で導入される
ことを示している。
【００９７】 これゆえに、IRES-neoカセットが5'端側のLTR部位に挿入されている場合には
、マキシウイルスの導入過程（転写、パッケージング、逆転写、組込み）は阻害
されない。さらに、それらの結果はIRES-neoの導入はこのウイルス設計上機能的
であることを示している。neo が上流に配置されているベクター(ptvAkv, Bi-ne
o-zeo)では内部の開始部位を使用するベクター(Bi-zeo-neo, SL3-3Bi-neo, AkvB
i-neo)よりも若干高い導入効率を示しているようだ。これは我々と他の研究者(3
, 1 7, 3 1 )により、いくつかのIRESによる翻訳をサポートされるコンストラク
ションに関して認められているように、上流部位に設定された遺伝子に比べて、
IRES部位によりサポートされる遺伝子の減弱された内部翻訳効率に起因するので
あろう。AkvBi-neoと SL3-3Bi-neoでの導入効率における明確な減弱の欠如は（R
NAゲノムサイズが1.4 kbに増加しているにもかかわらず）、MLV(6. 36)での以前
の報告と関連している。
、マキシウイルスの導入過程（転写、パッケージング、逆転写、組込み）は阻害
されない。さらに、それらの結果はIRES-neoの導入はこのウイルス設計上機能的
であることを示している。neo が上流に配置されているベクター(ptvAkv, Bi-ne
o-zeo)では内部の開始部位を使用するベクター(Bi-zeo-neo, SL3-3Bi-neo, AkvB
i-neo)よりも若干高い導入効率を示しているようだ。これは我々と他の研究者(3
, 1 7, 3 1 )により、いくつかのIRESによる翻訳をサポートされるコンストラク
ションに関して認められているように、上流部位に設定された遺伝子に比べて、
IRES部位によりサポートされる遺伝子の減弱された内部翻訳効率に起因するので
あろう。AkvBi-neoと SL3-3Bi-neoでの導入効率における明確な減弱の欠如は（R
NAゲノムサイズが1.4 kbに増加しているにもかかわらず）、MLV(6. 36)での以前
の報告と関連している。
【００９８】 ウイルス上清はマキシウイルスにより産生された蛋白質によるタイターに対す
る潜在的なバイアスを調べるために、ptvAkv-neo と SL3-3Bi-neoにより感染さ
れたパッケージング細胞から感染後短時間（２４時間）でハーベストされた。２
４時間後のタイターは、７２時間後と同様に、通常のベクターと複製能正常型ベ
クターとの間で同じ差異を示した。それゆえ、パッケージング細胞株中でのSL3-
3Bi-neoから産生されたウイルス蛋白質（群）の産生はウイルスタイターに影響
しないと思われる。
る潜在的なバイアスを調べるために、ptvAkv-neo と SL3-3Bi-neoにより感染さ
れたパッケージング細胞から感染後短時間（２４時間）でハーベストされた。２
４時間後のタイターは、７２時間後と同様に、通常のベクターと複製能正常型ベ
クターとの間で同じ差異を示した。それゆえ、パッケージング細胞株中でのSL3-
3Bi-neoから産生されたウイルス蛋白質（群）の産生はウイルスタイターに影響
しないと思われる。
【００９９】 レトロウイルスの複製の間、ゲノムRNAのU3領域はプロウイルスDNAの5'端にコ
ピーされる。感染細胞でのゲノムDNAのPCR分析によると、マキシウイルスでの異
種遺伝子挿入部位もまた複製の間にプロウイルスの5'端にコピーされたことがわ
かった。考えられるところでは、5'側のインサートの上流には転写開始部位がな
いので、ほとんどのプロウイルスにとって3'の異種遺伝子のみが遺伝子発現に利
用されるであろう、しかし転写活性化能のある遺伝子中に組込まれたプロウイル
スに細胞中の転写が進行するような場合、5'側の異種遺伝子からの翻訳が起こる
こともまた期待されるでろう。これを検定するために、AGPC法(4)（acid guanid
ium thiocyanate-phenol-chloroform method）により細胞から全RNAが抽出され
、1%アガロースゲル中で通常の手順(33)にてノーザンブロット分析が実施された
。驚くべきことに、G418で選択されたマキシウイルス感染細胞のRNAをneo-のプ
ローブでノーザンブロット分析したところ；どのような異常なRNAも検出できな
かった。マキシウイルスの高い形質導入効率とともにこの結果は、マキシプロウ
イルスが異種遺伝子の発現のためにホストDNAの読み飛ばし（read-through）転
写物には依存していないことを示している。
ピーされる。感染細胞でのゲノムDNAのPCR分析によると、マキシウイルスでの異
種遺伝子挿入部位もまた複製の間にプロウイルスの5'端にコピーされたことがわ
かった。考えられるところでは、5'側のインサートの上流には転写開始部位がな
いので、ほとんどのプロウイルスにとって3'の異種遺伝子のみが遺伝子発現に利
用されるであろう、しかし転写活性化能のある遺伝子中に組込まれたプロウイル
スに細胞中の転写が進行するような場合、5'側の異種遺伝子からの翻訳が起こる
こともまた期待されるでろう。これを検定するために、AGPC法(4)（acid guanid
ium thiocyanate-phenol-chloroform method）により細胞から全RNAが抽出され
、1%アガロースゲル中で通常の手順(33)にてノーザンブロット分析が実施された
。驚くべきことに、G418で選択されたマキシウイルス感染細胞のRNAをneo-のプ
ローブでノーザンブロット分析したところ；どのような異常なRNAも検出できな
かった。マキシウイルスの高い形質導入効率とともにこの結果は、マキシプロウ
イルスが異種遺伝子の発現のためにホストDNAの読み飛ばし（read-through）転
写物には依存していないことを示している。
【０１００】 マキシウイルスの複製効率 培養細胞もしくは動物でのウイルスの伝播のより直接的な試験を可能にするた
めに、上述のようにEGFPを発現するマキシウイルス（AkvBi-EGFP）が作成され、
AkvBi-neo およびSL3-3Bi-neoマキシウイルスと平行して以下の実験に供された
。３つのマキシウイルスの複製および感染効率の分析のために、BOSC23パッケー
ジング細胞で産生されたウイルスストックで形質導入されたNlH 3T3細胞がウイ
ルス産生細胞として使用された。NIH3T3細胞をウイルス産生細胞としたすべての
実験で、少なくとも１０００の形質導入が認められた集団が使用された。ウイル
ス産生細胞は測定に先立ち１４日間G418 存在下で選択されるか(AkvBi-neo, SL3
-3Bi-neo)または７日間培養された(AkvBi-EGFP)。AkvBi-EGFPの感染実験のため
に、１０mlの上清がコンフルエントになったAkvBi-EGFP感染７日目の培養細胞(8
0 cm2 dish)からハーベストされ、ろ過され、そして6 μg/mlポリブレン存在下
の8xl05 NIH3T3 細胞 / 80 cm2の培養細胞に加えられた。感染初日に、AkvBi-EG
FP感染培養細胞は1 μg/mlポリブレンを添加された。これら感染したNlH3T3細胞
集団から得られたタイターはSL3-3Bi-neoで103 感染単位/ml IU/mlであり、一方
AkvBi-neo に対しては１０００倍高い値であった。これらの発見は特に驚くべき
ものである、なぜなら複製能正常の組み換え型レトロウイルスからの外被蛋白質
の良好な発現は哺乳類細胞ではこれまで観察されていないからである。
めに、上述のようにEGFPを発現するマキシウイルス（AkvBi-EGFP）が作成され、
AkvBi-neo およびSL3-3Bi-neoマキシウイルスと平行して以下の実験に供された
。３つのマキシウイルスの複製および感染効率の分析のために、BOSC23パッケー
ジング細胞で産生されたウイルスストックで形質導入されたNlH 3T3細胞がウイ
ルス産生細胞として使用された。NIH3T3細胞をウイルス産生細胞としたすべての
実験で、少なくとも１０００の形質導入が認められた集団が使用された。ウイル
ス産生細胞は測定に先立ち１４日間G418 存在下で選択されるか(AkvBi-neo, SL3
-3Bi-neo)または７日間培養された(AkvBi-EGFP)。AkvBi-EGFPの感染実験のため
に、１０mlの上清がコンフルエントになったAkvBi-EGFP感染７日目の培養細胞(8
0 cm2 dish)からハーベストされ、ろ過され、そして6 μg/mlポリブレン存在下
の8xl05 NIH3T3 細胞 / 80 cm2の培養細胞に加えられた。感染初日に、AkvBi-EG
FP感染培養細胞は1 μg/mlポリブレンを添加された。これら感染したNlH3T3細胞
集団から得られたタイターはSL3-3Bi-neoで103 感染単位/ml IU/mlであり、一方
AkvBi-neo に対しては１０００倍高い値であった。これらの発見は特に驚くべき
ものである、なぜなら複製能正常の組み換え型レトロウイルスからの外被蛋白質
の良好な発現は哺乳類細胞ではこれまで観察されていないからである。
【０１０１】
【表２】 AkvBi-EGFPでのタイターはフローサイトメトリー分析によって測定された。フ
ローサイトメトリー分析では、細胞は回収され、2%牛胎児血清、2mM NaN3を含有
するPBSで２回洗浄された。細胞は１％ホルマリンを含む同じ緩衝液中に懸濁さ
れ、そしてCoulter（登録商標） EPICS XL-MCLサイトメーターで分析された。そ
れぞれのサンプルから５万カウント以上が分析された。Becton Dickinson 社製
のCellQuest（登録商標）ソフトウエアによりリストモードで分析された。
ローサイトメトリー分析では、細胞は回収され、2%牛胎児血清、2mM NaN3を含有
するPBSで２回洗浄された。細胞は１％ホルマリンを含む同じ緩衝液中に懸濁さ
れ、そしてCoulter（登録商標） EPICS XL-MCLサイトメーターで分析された。そ
れぞれのサンプルから５万カウント以上が分析された。Becton Dickinson 社製
のCellQuest（登録商標）ソフトウエアによりリストモードで分析された。
【０１０２】 AkvBi-EGFPで測定されたタイターは104-105 IU/mlに達した。EGFP発現細胞で
の検出の閾値レベルは高いので、上記のタイター実験と比較してAkvBi-EGFPに対
しては減少したタイターが期待された（上記の表を参照）。
の検出の閾値レベルは高いので、上記のタイター実験と比較してAkvBi-EGFPに対
しては減少したタイターが期待された（上記の表を参照）。
【０１０３】 IRESカセットの挿入によるマキシウイルスのスプライスされたRNAの変更され
たレベル。レトロウイルスコンストラクションのスプライシングされたRNAの分
析のため、トータルRNAがマキシウイルスの感染したNIH3T3細胞から抽出され、A
kv-MLV (38)のSmaIによる３３０ｂｐの外被蛋白質（RNA）の断片によるノーザン
ブロット分析が上記のとおりに実施された。マキシウイルスに対して、野生型(w
t) MLV'sで観察されるような、非スプライス型とスプライス型の２つの主なRNA
転写物が期待される。野生型SL3-3では0.4という非スプライス型よりスプライス
型で低い値であったのに対して、野生型Akv はスプライス型/非スプライス型の
比が0.8という2つのｍＲＮＡ種での平均のとれたスプライシングを示した(Phosp
horImager（登録商標）で定量された）。異種の挿入部位により低い移動度を示
すマキシウイルスに対して、IRES-neo またはIRES-EGFPカセットの存在はAkvマ
キシウイルスにおいてスプライス型RNAのレベルをスプライス型/非スプライス型
比率0.2と減少させ、一方SL3-3Bi-neoに対してはスプライス型RNAのレベルは0.0
5付近という検出限界以下なので比について述べられない。露光物をみてみると
、スプライス型RNAに相当するバンドはAkvBi-neoと AkvBi-EGFPでは認識できた
が、一方、スプライス型のSL3-3Bi-neoのバンドは失われており、長時間露光で
も出現しなかった。
たレベル。レトロウイルスコンストラクションのスプライシングされたRNAの分
析のため、トータルRNAがマキシウイルスの感染したNIH3T3細胞から抽出され、A
kv-MLV (38)のSmaIによる３３０ｂｐの外被蛋白質（RNA）の断片によるノーザン
ブロット分析が上記のとおりに実施された。マキシウイルスに対して、野生型(w
t) MLV'sで観察されるような、非スプライス型とスプライス型の２つの主なRNA
転写物が期待される。野生型SL3-3では0.4という非スプライス型よりスプライス
型で低い値であったのに対して、野生型Akv はスプライス型/非スプライス型の
比が0.8という2つのｍＲＮＡ種での平均のとれたスプライシングを示した(Phosp
horImager（登録商標）で定量された）。異種の挿入部位により低い移動度を示
すマキシウイルスに対して、IRES-neo またはIRES-EGFPカセットの存在はAkvマ
キシウイルスにおいてスプライス型RNAのレベルをスプライス型/非スプライス型
比率0.2と減少させ、一方SL3-3Bi-neoに対してはスプライス型RNAのレベルは0.0
5付近という検出限界以下なので比について述べられない。露光物をみてみると
、スプライス型RNAに相当するバンドはAkvBi-neoと AkvBi-EGFPでは認識できた
が、一方、スプライス型のSL3-3Bi-neoのバンドは失われており、長時間露光で
も出現しなかった。
【０１０４】 スプライシングの変化が効率的な複製のための外被蛋白質の欠如に導くのかど
うかを調査するために、env発現プラスミッドと共にpSL3-3Bi-neoがNIH3T3細胞
に一時的にトランスフェクションされ、そしてウイルス産生がタイター実験で測
定された。一時的に発現した外被蛋白質はSL3-3Bi-neoの形質導入効率をenv 発
現なしのコントロールと比較しておよそ３５倍改善した、ということはSL3-3Bi-
neoの低い複製効率は、低いスプライシング効率とそれによる外被蛋白質の低産
生に起因することを示唆する。Akvマキシウイルスでは、スプライスされたRNA量
は減少しているが明らかに複製効率が極端に影響されるレベルまでではない。
うかを調査するために、env発現プラスミッドと共にpSL3-3Bi-neoがNIH3T3細胞
に一時的にトランスフェクションされ、そしてウイルス産生がタイター実験で測
定された。一時的に発現した外被蛋白質はSL3-3Bi-neoの形質導入効率をenv 発
現なしのコントロールと比較しておよそ３５倍改善した、ということはSL3-3Bi-
neoの低い複製効率は、低いスプライシング効率とそれによる外被蛋白質の低産
生に起因することを示唆する。Akvマキシウイルスでは、スプライスされたRNA量
は減少しているが明らかに複製効率が極端に影響されるレベルまでではない。
【０１０５】 複数感染実験間中のAkvBi-EGFPのゲノム中での完全性 遺伝的安定性分析が、感染された初回継代接種でのBOSC23パッケージング細胞
から、そして引き続く継代接種で感染したNIH3T3培養細胞から未感染のNIH3T3培
養細胞へのウイルス上清の供給により実行され、継代接種１から継代接種６まで
の結果を得た。AkvBi-EGFPウイルスで感染された細胞は７日間培養され、そして
上清は未感染の細胞に移行された。上清がBOSC23パッケージング細胞から移行さ
れる初回継代接種で、60-70%のNIH3T3細胞が２日後に顕微鏡下で陽性と判定され
た。この観察のため、細胞はガラス製のチャンバー(Nunc社製)にまかれ、そして
蛍光顕微鏡で分析された。顕鏡の直前に細胞はリン酸緩衝液(PBS)で洗浄され、P
BSが新たに加えられた。細胞はオリンパスHQ:F801蛍光フィルターが取り付けら
れた、オリンパス蛍光顕微鏡で顕鏡された（倍率２００倍）。継代接種１でのEG
FPを発現しているNIH3T3細胞での60-70%という割合は95-100%の細胞が陽性とカ
ウントされる５日後までに徐々に増加した。継代接種２から継代接種５の間に、
40-50%の陽性細胞が２日後に検出され、そして80-90%という最適の発現割合に６
日後に達した。継代接種６で20-30%のEGFP発現細胞が２日後に観察され、50%の
最適の割合に６日後に達した。これらの観察により、我々はそれぞれの継代接種
で１から３回（２回の複製サイクルを平均とする）の複製サイクルが実行された
と推測する。
から、そして引き続く継代接種で感染したNIH3T3培養細胞から未感染のNIH3T3培
養細胞へのウイルス上清の供給により実行され、継代接種１から継代接種６まで
の結果を得た。AkvBi-EGFPウイルスで感染された細胞は７日間培養され、そして
上清は未感染の細胞に移行された。上清がBOSC23パッケージング細胞から移行さ
れる初回継代接種で、60-70%のNIH3T3細胞が２日後に顕微鏡下で陽性と判定され
た。この観察のため、細胞はガラス製のチャンバー(Nunc社製)にまかれ、そして
蛍光顕微鏡で分析された。顕鏡の直前に細胞はリン酸緩衝液(PBS)で洗浄され、P
BSが新たに加えられた。細胞はオリンパスHQ:F801蛍光フィルターが取り付けら
れた、オリンパス蛍光顕微鏡で顕鏡された（倍率２００倍）。継代接種１でのEG
FPを発現しているNIH3T3細胞での60-70%という割合は95-100%の細胞が陽性とカ
ウントされる５日後までに徐々に増加した。継代接種２から継代接種５の間に、
40-50%の陽性細胞が２日後に検出され、そして80-90%という最適の発現割合に６
日後に達した。継代接種６で20-30%のEGFP発現細胞が２日後に観察され、50%の
最適の割合に６日後に達した。これらの観察により、我々はそれぞれの継代接種
で１から３回（２回の複製サイクルを平均とする）の複製サイクルが実行された
と推測する。
【０１０６】 ノーザンブロットによる判定では、AkvBi-EGFPウイルスの大多数は何回かの複
製にわたって遺伝的に安定である。この検定のために、６つの継代接種について
ウイルス粒子（をコードするプローブにより）によるノーザンブロット分析（上
記のように）が行われた。RNAはそれぞれ継代接種の終了時（感染後７日後の）
の細胞から抽出された。最初の２回の継代接種では、ノーザンブロット分析は全
長ウイルスゲノムのみを検出した、一方、３回目の継代接種では、かすかなバン
ド強度を呈する欠失変異体が出現した。野生型AkvBi-EGFPと比較して欠失変異体
の割合は、継代接種４と継代接種５の間に増加し、そして継代接種６で優勢なウ
イルス集団となった。これらの変異体はIRES-EGFP配列中に大きな欠損があり、
そして安定したスプライシングを再獲得した。欠失変異体の繁殖に対する進化の
駆動力は安定したスプライシングまたはAkvBi-EGFPの複製に関与する他の因子の
欠如であるかどうかは我々の実験からでは結論づけられない。
製にわたって遺伝的に安定である。この検定のために、６つの継代接種について
ウイルス粒子（をコードするプローブにより）によるノーザンブロット分析（上
記のように）が行われた。RNAはそれぞれ継代接種の終了時（感染後７日後の）
の細胞から抽出された。最初の２回の継代接種では、ノーザンブロット分析は全
長ウイルスゲノムのみを検出した、一方、３回目の継代接種では、かすかなバン
ド強度を呈する欠失変異体が出現した。野生型AkvBi-EGFPと比較して欠失変異体
の割合は、継代接種４と継代接種５の間に増加し、そして継代接種６で優勢なウ
イルス集団となった。これらの変異体はIRES-EGFP配列中に大きな欠損があり、
そして安定したスプライシングを再獲得した。欠失変異体の繁殖に対する進化の
駆動力は安定したスプライシングまたはAkvBi-EGFPの複製に関与する他の因子の
欠如であるかどうかは我々の実験からでは結論づけられない。
【０１０７】 興味深いことには、２つの近縁なウイルスであるAkv と SL3-3はSL3-3Bi-neo
ベクターの低い複製効率に影響しているスプライシング制御において差異がある
ようである。これは使用した特定のコンストラクションの変異に起因するもので
はないらしい、なぜなら培養中に生じた欠失変異体は野生型SL3-3ウイルスと同
効率に複製するからである。Akv と SL3-3でのスプライス供与体部位とスプライ
ス受容体部位はよく似ていて、ただポリピリミジン領域のAkv 3'のスプライス受
容体部位での１つのピリミジンの欠如のみで分けられる、これはウイルスゲノム
中の他のcis-因子が、スプライス効率で認められた差異の原因であることを示し
ている。
ベクターの低い複製効率に影響しているスプライシング制御において差異がある
ようである。これは使用した特定のコンストラクションの変異に起因するもので
はないらしい、なぜなら培養中に生じた欠失変異体は野生型SL3-3ウイルスと同
効率に複製するからである。Akv と SL3-3でのスプライス供与体部位とスプライ
ス受容体部位はよく似ていて、ただポリピリミジン領域のAkv 3'のスプライス受
容体部位での１つのピリミジンの欠如のみで分けられる、これはウイルスゲノム
中の他のcis-因子が、スプライス効率で認められた差異の原因であることを示し
ている。
【０１０８】 AkvBi-EGFPが感染したNIH3T3細胞(継代接種 1, 5, 6 と NIH3T3 のコントロー
ル細胞)でのフローサイトメーター分析は何代かの複製にわたってゲノムの完全
性を確認した。フローサイトメーターのプロファイルから継代接種１はNlH3T3の
未感染のコントロールと比べてほんの小数のみがオーバーラップすることが分析
された、これは実際上この集団のすべての細胞がバックグランドを超えてEGFPを
発現していることを示している。継代接種２から継代接種５までは多くの細胞が
バックグランドレベルを超えてEGFPを発現するという、ほとんど同一のフローサ
イトメーター上のプロファイルを示した。欠失型AkvBi-EGFPウイルスが、継代接
種中に段々と多くなり継代接種６の時点で優勢になるというノーザンブロット分
析のデータと関連して、継代接種６では半分程度の細胞がEGFPを発現している。
ル細胞)でのフローサイトメーター分析は何代かの複製にわたってゲノムの完全
性を確認した。フローサイトメーターのプロファイルから継代接種１はNlH3T3の
未感染のコントロールと比べてほんの小数のみがオーバーラップすることが分析
された、これは実際上この集団のすべての細胞がバックグランドを超えてEGFPを
発現していることを示している。継代接種２から継代接種５までは多くの細胞が
バックグランドレベルを超えてEGFPを発現するという、ほとんど同一のフローサ
イトメーター上のプロファイルを示した。欠失型AkvBi-EGFPウイルスが、継代接
種中に段々と多くなり継代接種６の時点で優勢になるというノーザンブロット分
析のデータと関連して、継代接種６では半分程度の細胞がEGFPを発現している。
【０１０９】 実施例２ 付加的にIRES-env翻訳カセットを具備するレトロウイルスベクターの構築 パッケージング培養細胞内で複製が成立するために、スーパーインフェクショ
ンに対する抵抗性は回避されなければならない。この抵抗性はウイルス粒子の接
着を防ぐ細胞膜受容体に結合するEnv蛋白質により成立する。新規のベクターシ
ステムは、env を２シストロン性ベクターに含めることでこの抵抗性を回避する
。
ンに対する抵抗性は回避されなければならない。この抵抗性はウイルス粒子の接
着を防ぐ細胞膜受容体に結合するEnv蛋白質により成立する。新規のベクターシ
ステムは、env を２シストロン性ベクターに含めることでこの抵抗性を回避する
。
【０１１０】 最初に新規ベクターの構築のためにAkv-env がzeo-IRESを含むベクターのIRES
因子の下流に挿入され、実施例１に記載したBi-zeo-env ベクタとなる。IRES と
env の間のスペーサーはEMCVでのものと同じ長さであるように構築されたが、N
ot I (図2参照)制限酵素認識部位がある変更された配列をもつ。このIRES-env
カセットの翻訳効率はGagPol発現コンストラクションでの補償実験で分析された
。Bi-zeo-env と GagPolベクターで一時的にトランスフェクションされたNIH3T3
培養細胞からの上清の移行はいかなる形質導入も認められず、それはBi-zeo-env
からのenvの翻訳効率が非常に低く検出が困難であることを暗示している。スペ
ーサー配列が翻訳効率に影響をもつかどうかを試験するため、さらに別のベクタ
ーが構築された。
因子の下流に挿入され、実施例１に記載したBi-zeo-env ベクタとなる。IRES と
env の間のスペーサーはEMCVでのものと同じ長さであるように構築されたが、N
ot I (図2参照)制限酵素認識部位がある変更された配列をもつ。このIRES-env
カセットの翻訳効率はGagPol発現コンストラクションでの補償実験で分析された
。Bi-zeo-env と GagPolベクターで一時的にトランスフェクションされたNIH3T3
培養細胞からの上清の移行はいかなる形質導入も認められず、それはBi-zeo-env
からのenvの翻訳効率が非常に低く検出が困難であることを暗示している。スペ
ーサー配列が翻訳効率に影響をもつかどうかを試験するため、さらに別のベクタ
ーが構築された。
【０１１１】 Akv-env の発現のため、Bi-zeo-neo (実施例lに記載されているような)を基本
としてzeo を env で置き換えたさらなる２シストロン性のベクターが構築され
た。IRES-env カセットからの効率的発現がIRES-neo(実施例lに記載されている
ような)の構築に使用したようなスペーサー配列を使用して引き続き試みられた
。この新規のIRES-env コンストラクションはneoを発現しているAkv-MLVベクタ
ーに挿入されBi-neo-envとなる。挿入されたスペーサーはIRES-neoスペーサーと
比べて、長さで３ヌクレオチドそして配列に若干の変更がある点で異なる(図２
のBi-zeo-neo と Bi-neo-env のスペーサー配列を参照)。Bi-neo-env がGagPol
発現コンストラクションによる補償実験で試験され、機能的envの翻訳を供給す
る形質導入が検出された。
としてzeo を env で置き換えたさらなる２シストロン性のベクターが構築され
た。IRES-env カセットからの効率的発現がIRES-neo(実施例lに記載されている
ような)の構築に使用したようなスペーサー配列を使用して引き続き試みられた
。この新規のIRES-env コンストラクションはneoを発現しているAkv-MLVベクタ
ーに挿入されBi-neo-envとなる。挿入されたスペーサーはIRES-neoスペーサーと
比べて、長さで３ヌクレオチドそして配列に若干の変更がある点で異なる(図２
のBi-zeo-neo と Bi-neo-env のスペーサー配列を参照)。Bi-neo-env がGagPol
発現コンストラクションによる補償実験で試験され、機能的envの翻訳を供給す
る形質導入が検出された。
【０１１２】 これらのベクターのウイルス粒子産生には特殊化したパッケージング細胞の供
給するGag/Pol蛋白質が必要とされる、それによってウイルスベクター上の構造
遺伝子の欠如を補償できる。
給するGag/Pol蛋白質が必要とされる、それによってウイルスベクター上の構造
遺伝子の欠如を補償できる。
【０１１３】 それゆえ、この新規ベクターシステムは、マーカー/機能遺伝子および機能的e
nv 遺伝子を発現している２シストロン性のレトロウイルスベクターとGagPol蛋
白質を発現しているセミパッケージング細胞株と名づけられた（遺伝子機能を）
補償する細胞株から構成される。env がパッケージング細胞から発現される通常
の形質導入システムと対比して、ベクターからenv を発現することにより、スー
パーインフェクションの干渉は避けられ、そしてそれにより２シストロン性のベ
クターはセミパッケージング細胞株内で複製能正常になる。新規のベクターシス
テムは、野生型レトロウイルスと通常の形質導入システムのように異種の遺伝子
を同時に含み、野生型ウイルスのように複数回の感染の実施を可能にしているこ
とによる単回（感染）での形質導入システムでの魅力的な特性を組み合わせた。
nv 遺伝子を発現している２シストロン性のレトロウイルスベクターとGagPol蛋
白質を発現しているセミパッケージング細胞株と名づけられた（遺伝子機能を）
補償する細胞株から構成される。env がパッケージング細胞から発現される通常
の形質導入システムと対比して、ベクターからenv を発現することにより、スー
パーインフェクションの干渉は避けられ、そしてそれにより２シストロン性のベ
クターはセミパッケージング細胞株内で複製能正常になる。新規のベクターシス
テムは、野生型レトロウイルスと通常の形質導入システムのように異種の遺伝子
を同時に含み、野生型ウイルスのように複数回の感染の実施を可能にしているこ
とによる単回（感染）での形質導入システムでの魅力的な特性を組み合わせた。
【０１１４】 セミパッケージング細胞株の構築 セミパッケージング細胞でのGagPol発現はMoloneyに準拠したCeB構築物(43)か
ら獲得された。CeBの翻訳制御はMoloneyのLTRで行われる。CeBは5'非翻訳領域に
大きな欠失があり、パッケージングに欠陥のあるRNA転写物を作る(42)。pol の
停止コドンの７４ヌクレオチド下流に、ブラスティシジンS(blasticidin S)への
抵抗性を与えるbsr 選択マーカーが挿入されている。著者らによると、bsrは上
流のgagpol が発現した後に、翻訳の再開により発現される。ブラスティシジンS
でのCeBがトランスフェクションされた培養細胞の選択は、GagPolの高発現をも
たらすはずである。
ら獲得された。CeBの翻訳制御はMoloneyのLTRで行われる。CeBは5'非翻訳領域に
大きな欠失があり、パッケージングに欠陥のあるRNA転写物を作る(42)。pol の
停止コドンの７４ヌクレオチド下流に、ブラスティシジンS(blasticidin S)への
抵抗性を与えるbsr 選択マーカーが挿入されている。著者らによると、bsrは上
流のgagpol が発現した後に、翻訳の再開により発現される。ブラスティシジンS
でのCeBがトランスフェクションされた培養細胞の選択は、GagPolの高発現をも
たらすはずである。
【０１１５】 CeBはマウスNIH3T3細胞とヒトTE671細胞にトランスフェクションされ、そして
最初5μg/mlブラスティシジンSにて12日間選択された。引き続き、保存されたク
ローンの中から高産生細胞を選択するために、選択のレベルが10μg/mlで９日間
、20μg/mlで７日間、そして最終的に40μg/mlで１０日間と段階的に増強された
。NlH/CeB と TE/CeBと名づけられた、選択により生成した細胞集団が以下の分
析で使用された。
最初5μg/mlブラスティシジンSにて12日間選択された。引き続き、保存されたク
ローンの中から高産生細胞を選択するために、選択のレベルが10μg/mlで９日間
、20μg/mlで７日間、そして最終的に40μg/mlで１０日間と段階的に増強された
。NlH/CeB と TE/CeBと名づけられた、選択により生成した細胞集団が以下の分
析で使用された。
【０１１６】 補償分析 互いに（機能を）補償するセミパッケージング細胞株および２シストロン性の
Bi-neo-env ベクターの性能が、NIH3T3細胞を標的細胞としたタイター実験で分
析された。この領域中の5'端（必須の被嚢配列を含む）のみ含んだベクターと比
較した場合に、この領域中の3'端の導入はRNA発現レベルのほとんど３倍の増加
を促進することがわかっていたので、Bi-neo-envはAkv-MLVの5'非翻訳領域の全
長を保持している。ベクター中に、この非翻訳領域を含めることは、CeBがMolon
eyの3'部分の非翻訳領域をもっているので、パッケージングコンストラクション
(CeB)と２シストロン性ベクターとの間の組み換えのリスクの増大を提供するこ
とになるだろう。3xl05 と 4x105 CFU/mlのタイターが得られ、この結果は２つ
のコンストラクションが互いに補償できること、そして２シストロン性ベクター
が標的細胞に効率的に転移されたことを追認している。以下のすべての分析はNI
H/CeB 細胞で同種指向性なEnv-蛋白質を発現する２シストロン性ベクターの組み
合わせでをすることにより実施された。新規ベクターシステムでのTE/CeBセミパ
ッケージング細胞株の使用は、ヒトの細胞表面受容体への結合が可能な異種リガ
ンドを提示する両種指向性Envまたは機能的なキメラ型同種指向性外被のような
、ヒト細胞への感染を媒介させる能力のある外被蛋白質の発現を要求する。
Bi-neo-env ベクターの性能が、NIH3T3細胞を標的細胞としたタイター実験で分
析された。この領域中の5'端（必須の被嚢配列を含む）のみ含んだベクターと比
較した場合に、この領域中の3'端の導入はRNA発現レベルのほとんど３倍の増加
を促進することがわかっていたので、Bi-neo-envはAkv-MLVの5'非翻訳領域の全
長を保持している。ベクター中に、この非翻訳領域を含めることは、CeBがMolon
eyの3'部分の非翻訳領域をもっているので、パッケージングコンストラクション
(CeB)と２シストロン性ベクターとの間の組み換えのリスクの増大を提供するこ
とになるだろう。3xl05 と 4x105 CFU/mlのタイターが得られ、この結果は２つ
のコンストラクションが互いに補償できること、そして２シストロン性ベクター
が標的細胞に効率的に転移されたことを追認している。以下のすべての分析はNI
H/CeB 細胞で同種指向性なEnv-蛋白質を発現する２シストロン性ベクターの組み
合わせでをすることにより実施された。新規ベクターシステムでのTE/CeBセミパ
ッケージング細胞株の使用は、ヒトの細胞表面受容体への結合が可能な異種リガ
ンドを提示する両種指向性Envまたは機能的なキメラ型同種指向性外被のような
、ヒト細胞への感染を媒介させる能力のある外被蛋白質の発現を要求する。
【０１１７】
【表３】 Bi-neo-envでの複数回感染実験 Bi-neo-envベクターがNIH/CeBセミパッケージング培養細胞内で複製能正常か
を分析するために、２つの異なる複数回感染実験が実施された。最初の操作手順
で、Bi-neo-envを含むウイルス上清がNIH/CeB細胞(80 cm2 培養皿中に8xl05 細
胞)に移され、そして２４時間後にG418が加えられた。セミパッケージング細胞
はG418で５−７日間選択され、ひき続き上清(G418なしのコンフルエントな細胞
集団からの未精製物)が未感染のNIH/CeB細胞に加えられた。この手順は６回の感
染実験に連続的に施され、継代接種１から継代接種６の結果を得た。他の操作手
順では、Bi-neo-env はneo発現の選択なしに、５回の感染実験に継代接種された
（継代接種１から継代接種５）。この操作手順で感染されたNIH/CeB細胞は、2μ
g/mlポリブレン存在下で７日間培養され、そして引き続きこれらの感染したNIH/
CeB細胞は未感染のNIH/CeB細胞と1:10の比(〜5xl04 細胞と〜5xl05細胞の混合)
で混合され、引き続く継代接種に引き継がれる。両方の手順はBi-neo-env で一
時的にトランスフェクションされたBOSC23パッケージング細胞株(Pear等1993)か
らの未精製上清により開始される。それぞれの継代接種後に、RNAが培養細胞か
ら抽出され、そしてノーザンブロット分析が実施された。
を分析するために、２つの異なる複数回感染実験が実施された。最初の操作手順
で、Bi-neo-envを含むウイルス上清がNIH/CeB細胞(80 cm2 培養皿中に8xl05 細
胞)に移され、そして２４時間後にG418が加えられた。セミパッケージング細胞
はG418で５−７日間選択され、ひき続き上清(G418なしのコンフルエントな細胞
集団からの未精製物)が未感染のNIH/CeB細胞に加えられた。この手順は６回の感
染実験に連続的に施され、継代接種１から継代接種６の結果を得た。他の操作手
順では、Bi-neo-env はneo発現の選択なしに、５回の感染実験に継代接種された
（継代接種１から継代接種５）。この操作手順で感染されたNIH/CeB細胞は、2μ
g/mlポリブレン存在下で７日間培養され、そして引き続きこれらの感染したNIH/
CeB細胞は未感染のNIH/CeB細胞と1:10の比(〜5xl04 細胞と〜5xl05細胞の混合)
で混合され、引き続く継代接種に引き継がれる。両方の手順はBi-neo-env で一
時的にトランスフェクションされたBOSC23パッケージング細胞株(Pear等1993)か
らの未精製上清により開始される。それぞれの継代接種後に、RNAが培養細胞か
ら抽出され、そしてノーザンブロット分析が実施された。
【０１１８】 ノーザンブロット分析はBi-neo-env がセミパッケージング培養細胞内で複製
能正常であることを確認した。env- と neo-のプローブでのハイブリダイゼーシ
ョンは、ベクターサイズに相当する明瞭なバンドを示した。このバンドはG４１
８耐性細胞が選択中に出現すると期待され、G418が添加されたすべての継代接種
中で認められた。未選択の継代接種（G418なし）では、ベクターのバンドはすべ
ての５回の継代接種で対等な強度と認識され、このことは継代接種１の細胞内に
含まれるミニウイルスが、共培養中にただ希釈されたのではなく未感染の細胞に
伝播し、そしてそのことによって複数回の感染が成立したことを示している。En
vのプローブでハイブリダイズされたノーザンブロットは、両方の実験手順にお
いて最後の２回の継代接種でベクターのバンドとは離れた位置に別のバンドの存
在を示した。２つの種類のバンドが確認された；すなわち(1)野生型のAkvのスプ
ライスされた転写物と同様の移動度を示すバンド、(2)野生型Akvの非スプライス
型転写物より若干高い移動度を示すバンド、である。CeBプローブでの同じノー
ザンブロットの分析により、予想された非スプライス型とスプライスされたCeB
転写物に相当するバンドが認められた。これらのバンドから離れて、付加的なバ
ンド（env-プローブとともに見られる）がCeB-プローブで認識され、これらのRN
A転写物が、CeBコンストラクション中に含まれる配列を含むことを示している。
能正常であることを確認した。env- と neo-のプローブでのハイブリダイゼーシ
ョンは、ベクターサイズに相当する明瞭なバンドを示した。このバンドはG４１
８耐性細胞が選択中に出現すると期待され、G418が添加されたすべての継代接種
中で認められた。未選択の継代接種（G418なし）では、ベクターのバンドはすべ
ての５回の継代接種で対等な強度と認識され、このことは継代接種１の細胞内に
含まれるミニウイルスが、共培養中にただ希釈されたのではなく未感染の細胞に
伝播し、そしてそのことによって複数回の感染が成立したことを示している。En
vのプローブでハイブリダイズされたノーザンブロットは、両方の実験手順にお
いて最後の２回の継代接種でベクターのバンドとは離れた位置に別のバンドの存
在を示した。２つの種類のバンドが確認された；すなわち(1)野生型のAkvのスプ
ライスされた転写物と同様の移動度を示すバンド、(2)野生型Akvの非スプライス
型転写物より若干高い移動度を示すバンド、である。CeBプローブでの同じノー
ザンブロットの分析により、予想された非スプライス型とスプライスされたCeB
転写物に相当するバンドが認められた。これらのバンドから離れて、付加的なバ
ンド（env-プローブとともに見られる）がCeB-プローブで認識され、これらのRN
A転写物が、CeBコンストラクション中に含まれる配列を含むことを示している。
【０１１９】 Bi-neo-env の複製の潜在的可能性が複数回感染での各手順の間に維持されて
いるかを分析するため、最初の培養細胞（継代接種１）と最終の培養細胞（G418
なしの継代接種５とG418を添加した継代接種６）によるタイター実験が行われた
。驚くことに、最初そして最終の継代接種の両方でG418選択なしの細胞により提
示された形質導入効率は、7xl06 CFU/ml前後という同様に高いレベルであるのに
、G418での選択をしたもので３０倍改善された形質導入効率が認められた(2xl05 から 6xl06 CFU/ml)。
いるかを分析するため、最初の培養細胞（継代接種１）と最終の培養細胞（G418
なしの継代接種５とG418を添加した継代接種６）によるタイター実験が行われた
。驚くことに、最初そして最終の継代接種の両方でG418選択なしの細胞により提
示された形質導入効率は、7xl06 CFU/ml前後という同様に高いレベルであるのに
、G418での選択をしたもので３０倍改善された形質導入効率が認められた(2xl05 から 6xl06 CFU/ml)。
【０１２０】
【表４】 複製能正常型のベクター？ 得られた結果から考慮して、複製能正常型ベクターが感染操作手順中に生成し
たことが推測される。野生型Akv-MLVと似たスプライシングのパターンをもった
組み換え型ウイルスは、ノーザンブロットでの付加的な転写物の存在を説明する
だろう。しかしながら、ノーザンブロットから判断すると、これらの潜在的な複
製能正常型ベクターのRNA転写物は野生型RNA転写物よりも高い移動度をもつので
、これらのウイルスは野生型Akv-MLVより小さいゲノムサイズをもつであろう。I
RES−スペーサー配列が適正でないために、Bi-neo-envからのenv の発現は最適
レベル以下であることが推測されるので、効率的なスプライシング（それにより
高いenv の発現を提供する）を行う組み換え型ウイルスの存在が、G418添加によ
る改善された形質導入効率を説明するだろう。Bi-neo-env のように同じセミパ
ッケージング細胞内で高いenv-発現をもつ組み換え型ウイルスの存在は、そのこ
とによりenv-産生を救済し、Bi-neo-envの高い形質導入効率にいたるのであろう
。培養細胞内での潜在的な複製能正常型ベクターの存在は、未精製の上清をNIH3
T3細胞 (8xl05 細胞を80 cm2 培養皿中で培養)に移すことで確認された、すなわ
ち細胞を７日間培養し、そして引き続きこれらのNIH3T3培養細胞からの未精製の
上清が新しい未感染のNIH3T3細胞へ移された。もし複製能正常型ベクターが継代
接種の間に生じたのであれば、それらは最初のNIH3T3培養細胞(救済実験 1)のみ
ならず２番目の細胞(救済実験 2)にも感染することが期待されるであろう。救済
実験での細胞のRNAはノーザンブロティングで分析された。
たことが推測される。野生型Akv-MLVと似たスプライシングのパターンをもった
組み換え型ウイルスは、ノーザンブロットでの付加的な転写物の存在を説明する
だろう。しかしながら、ノーザンブロットから判断すると、これらの潜在的な複
製能正常型ベクターのRNA転写物は野生型RNA転写物よりも高い移動度をもつので
、これらのウイルスは野生型Akv-MLVより小さいゲノムサイズをもつであろう。I
RES−スペーサー配列が適正でないために、Bi-neo-envからのenv の発現は最適
レベル以下であることが推測されるので、効率的なスプライシング（それにより
高いenv の発現を提供する）を行う組み換え型ウイルスの存在が、G418添加によ
る改善された形質導入効率を説明するだろう。Bi-neo-env のように同じセミパ
ッケージング細胞内で高いenv-発現をもつ組み換え型ウイルスの存在は、そのこ
とによりenv-産生を救済し、Bi-neo-envの高い形質導入効率にいたるのであろう
。培養細胞内での潜在的な複製能正常型ベクターの存在は、未精製の上清をNIH3
T3細胞 (8xl05 細胞を80 cm2 培養皿中で培養)に移すことで確認された、すなわ
ち細胞を７日間培養し、そして引き続きこれらのNIH3T3培養細胞からの未精製の
上清が新しい未感染のNIH3T3細胞へ移された。もし複製能正常型ベクターが継代
接種の間に生じたのであれば、それらは最初のNIH3T3培養細胞(救済実験 1)のみ
ならず２番目の細胞(救済実験 2)にも感染することが期待されるであろう。救済
実験での細胞のRNAはノーザンブロティングで分析された。
【０１２１】 いくつかの継代接種からのRNAでのノーザンブロット(env-プローブ)によると
、セミパッケージング培養細胞内にはどのような複製能正常型ベクターもないこ
とが示された。救済実験１の培養細胞では、対応するセミパッケージング培養細
胞でのパターンと似たenv転写物のパターンが検出できた、この現象はこれらの
細胞がパッケージング細胞の能力により細胞株から産生されたウイルス粒子で形
質導入されるので、予期されていたものである。救済実験２の細胞ではenvを発
現する転写物はなく、それはNIH3T3細胞が組み換え型ウイルスにより感染されな
かったことを示している。
、セミパッケージング培養細胞内にはどのような複製能正常型ベクターもないこ
とが示された。救済実験１の培養細胞では、対応するセミパッケージング培養細
胞でのパターンと似たenv転写物のパターンが検出できた、この現象はこれらの
細胞がパッケージング細胞の能力により細胞株から産生されたウイルス粒子で形
質導入されるので、予期されていたものである。救済実験２の細胞ではenvを発
現する転写物はなく、それはNIH3T3細胞が組み換え型ウイルスにより感染されな
かったことを示している。
【０１２２】 env発現救済ベクター。複数回感染実験中の最終継代接種で認められた付加的
なバンドは、env発現救済ベクターの存在により説明されるであろう。おそらくe
nv発現は、２シストロン性のBi-neo-env ベクターでは最適以下のものであり、
そしてそれゆえに改善されたEnv産生をもつベクターはBi-neo-envより高い複製
効率をもつであろうことを示唆する。当初のベクターより高い複製効率をもつベ
クターは、複数の継代接種の間に細胞集団内で優勢になることが期待され、そし
てそれにより当初のベクターの伝播を抑制する。G418選択での感染手順では、こ
の仮説的なenv発現救済ベクターは、G418抵抗性を供給するBi-neo-envと伴に細
胞内に存在しなければならないので、neoを発現することなしにはベクター集団
中でまったくの優勢状態にはならないだろう。G418の添加なしの感染実験では、
仮定の組み換え型ベクターの転写物の猛烈な増加は継代接種４から継代接種５で
観察されるので（それゆえにその増大は継代接種６でも継続するであろう）、も
し継代接種が継代接種５を越えて続けられたならば、このベクターは優勢なもの
となるだろう。
なバンドは、env発現救済ベクターの存在により説明されるであろう。おそらくe
nv発現は、２シストロン性のBi-neo-env ベクターでは最適以下のものであり、
そしてそれゆえに改善されたEnv産生をもつベクターはBi-neo-envより高い複製
効率をもつであろうことを示唆する。当初のベクターより高い複製効率をもつベ
クターは、複数の継代接種の間に細胞集団内で優勢になることが期待され、そし
てそれにより当初のベクターの伝播を抑制する。G418選択での感染手順では、こ
の仮説的なenv発現救済ベクターは、G418抵抗性を供給するBi-neo-envと伴に細
胞内に存在しなければならないので、neoを発現することなしにはベクター集団
中でまったくの優勢状態にはならないだろう。G418の添加なしの感染実験では、
仮定の組み換え型ベクターの転写物の猛烈な増加は継代接種４から継代接種５で
観察されるので（それゆえにその増大は継代接種６でも継続するであろう）、も
し継代接種が継代接種５を越えて続けられたならば、このベクターは優勢なもの
となるだろう。
【０１２３】 このモデルは、２回の組み換えがセミパッケージングコンストラクションと２
シストロン性のベクターの間で発生し、env遺伝子をコードするスプライスされ
た転写物をもつ機能的レトロウイルスベクターの生成に至ったことを仮定する。
スプライスされた転写物からのEnv産生はおそらく最適条件以下のIRES-env転写
カセット由来のものより一層効率的であり、それによりBi-neo-envと比べて有利
となる組み換え型ベクターを提供する。２つのコンストラクションの間の組み換
えは逆転写過程の間か、もしくは細胞機能（DNA組み換え）により媒介されたか
のどちらかである。Patience 等(1998)はCeB転写物が低い頻度でウイルス粒子の
なかに包み込まれ、この現象がそれら転写物を逆転写の間の潜在的な組み換えの
源泉にすることを発見した。Moloneyに準拠したCeBコンストラクションは、Bi-n
eo-envの相当する領域に55%の配列相同性があるgagの上流の５３ヌクレオチドの
配列をもっている。しかし、疑わしい組み換え型ベクターすべてのゲノムサイズ
は野生型のAkvより小さく、そしてどのようなベクターもNlH3T3細胞で複製能正
常ではないので、Bi-neo-env と CeBの間で5'-neo の付近からgag内のどこかで5
'の組み換えが生じてgag欠損の表現形が表出したことが示唆されるであろう。Mo
loney-polの3'端は5'-Akv-envと88%の配列相同性をもっている。これらの相同性
配列間の、もしくはスプライスアクセプター部位の下流のMoloney pol配列とIRE
S配列の間の組み換えは両方のスプライス部位の再生によりスプライス型の表現
系を提示させ、これにより効率的なenv発現を供給する。G418添加による感染実
験で、６回の継代接種後の形質導入効率で３０倍の改善が観察された。プロデュ
ーサー細胞でのより高いEnv発現レベルは、おそらくウイルス粒子の増強された
産生を示すので、Envを発現している救済ベクターは上昇した効率性を説明する
ことができる。G418の添加なしの感染操作では、同様の高い形質導入効率レベル
が、最初と最後の継代接種で観察されている。実施された分析は、この結果を説
明できないが、同種指向性受容体の飽和に対する長期にわたる潜在性（適正以下
のIRES-env翻訳カセットに起因する）と共同した隣り合う細胞からの連続的な再
感染という現象が結果の解釈に寄与するであろう。
シストロン性のベクターの間で発生し、env遺伝子をコードするスプライスされ
た転写物をもつ機能的レトロウイルスベクターの生成に至ったことを仮定する。
スプライスされた転写物からのEnv産生はおそらく最適条件以下のIRES-env転写
カセット由来のものより一層効率的であり、それによりBi-neo-envと比べて有利
となる組み換え型ベクターを提供する。２つのコンストラクションの間の組み換
えは逆転写過程の間か、もしくは細胞機能（DNA組み換え）により媒介されたか
のどちらかである。Patience 等(1998)はCeB転写物が低い頻度でウイルス粒子の
なかに包み込まれ、この現象がそれら転写物を逆転写の間の潜在的な組み換えの
源泉にすることを発見した。Moloneyに準拠したCeBコンストラクションは、Bi-n
eo-envの相当する領域に55%の配列相同性があるgagの上流の５３ヌクレオチドの
配列をもっている。しかし、疑わしい組み換え型ベクターすべてのゲノムサイズ
は野生型のAkvより小さく、そしてどのようなベクターもNlH3T3細胞で複製能正
常ではないので、Bi-neo-env と CeBの間で5'-neo の付近からgag内のどこかで5
'の組み換えが生じてgag欠損の表現形が表出したことが示唆されるであろう。Mo
loney-polの3'端は5'-Akv-envと88%の配列相同性をもっている。これらの相同性
配列間の、もしくはスプライスアクセプター部位の下流のMoloney pol配列とIRE
S配列の間の組み換えは両方のスプライス部位の再生によりスプライス型の表現
系を提示させ、これにより効率的なenv発現を供給する。G418添加による感染実
験で、６回の継代接種後の形質導入効率で３０倍の改善が観察された。プロデュ
ーサー細胞でのより高いEnv発現レベルは、おそらくウイルス粒子の増強された
産生を示すので、Envを発現している救済ベクターは上昇した効率性を説明する
ことができる。G418の添加なしの感染操作では、同様の高い形質導入効率レベル
が、最初と最後の継代接種で観察されている。実施された分析は、この結果を説
明できないが、同種指向性受容体の飽和に対する長期にわたる潜在性（適正以下
のIRES-env翻訳カセットに起因する）と共同した隣り合う細胞からの連続的な再
感染という現象が結果の解釈に寄与するであろう。
【０１２４】 Bi-EGFP-envでの複数回感染実験 セミパッケージング細胞でのウイルスの伝播のより直接的な試験を可能にする
ために、EGFPを発現する２シストロン性のベクター(Bi-EGFP-env)が研究に含め
られた。複数回感染実験はBi-EGFP-envで一時的にトランスフェクションされたB
OSC23の上清をNIH/CeB ( 80 cm2 培養容器中に8xl05 細胞)に供給することによ
り実施される、すなわち2μg/mlポリブレン存在下で１４日間細胞を培養し、そ
して引き続き未精製の上清を未感染のNIH/CeB細胞に移行する。３回のみの継代
接種が、引き続くそれぞれの継代接種で急激に減少したEGFP発現細胞の一部分で
実施された。３回の継代接種すべてに対して、蛍光顕微鏡によるEGFPの発現につ
いての試験は、定常なEGFP非発現細胞に対するEGFP発現細胞の割合が観察された
後で、７−１０日後まで緑色蛍光を発する細胞の増加を示した。
ために、EGFPを発現する２シストロン性のベクター(Bi-EGFP-env)が研究に含め
られた。複数回感染実験はBi-EGFP-envで一時的にトランスフェクションされたB
OSC23の上清をNIH/CeB ( 80 cm2 培養容器中に8xl05 細胞)に供給することによ
り実施される、すなわち2μg/mlポリブレン存在下で１４日間細胞を培養し、そ
して引き続き未精製の上清を未感染のNIH/CeB細胞に移行する。３回のみの継代
接種が、引き続くそれぞれの継代接種で急激に減少したEGFP発現細胞の一部分で
実施された。３回の継代接種すべてに対して、蛍光顕微鏡によるEGFPの発現につ
いての試験は、定常なEGFP非発現細胞に対するEGFP発現細胞の割合が観察された
後で、７−１０日後まで緑色蛍光を発する細胞の増加を示した。
【０１２５】 ３回の継代接種実験からの細胞で実施されたフローサイトメトリー分析は、継
代接種１で50%程度、継代接種２で１0%以下、継代接種３で１%以下のEGFP発現細
胞集団の存在を示した。EGFP発現細胞の割合が継代接種の間に急激に減少するこ
とが見つけられている。
代接種１で50%程度、継代接種２で１0%以下、継代接種３で１%以下のEGFP発現細
胞集団の存在を示した。EGFP発現細胞の割合が継代接種の間に急激に減少するこ
とが見つけられている。
【０１２６】 複数回の継代接種間でのBi-EGFP-env ベクターのゲノム内での完全性を検査す
るために、RNAがそれぞれの継代接種の終了後に抽出され、そしてenvプローブで
ノーザンブロット分析が実施された。全長のBi-EGFP-env に相当するRNA転写物
が、継代接種１と継代接種２で非常に弱いながらも検出され、同時に高い移動度
をもつバンド１つが、３回のすべての継代接種で明瞭に検出された。継代接種３
でもまた、Bi-neo-env実験での仮定上の組み換えベクターを含むバンドに相当し
たサイズの明瞭なバンドが認められた。
るために、RNAがそれぞれの継代接種の終了後に抽出され、そしてenvプローブで
ノーザンブロット分析が実施された。全長のBi-EGFP-env に相当するRNA転写物
が、継代接種１と継代接種２で非常に弱いながらも検出され、同時に高い移動度
をもつバンド１つが、３回のすべての継代接種で明瞭に検出された。継代接種３
でもまた、Bi-neo-env実験での仮定上の組み換えベクターを含むバンドに相当し
たサイズの明瞭なバンドが認められた。
【０１２７】 EGFP発現のデータとともにノーザンブロット分析は、セミパッケージング細胞
中でBi-EGFP-envが不十分にしか複製しないことを示した。ベクターRNAはノーザ
ンブロットではほとんど検出できない、ところが小サイズのベクターに相当する
RNAは高い強度で出現する。これはBi-EGFP-envベクターが、複製効率を損なう不
安定性因子を含むことを示唆する。ゲノムサイズがBi-EGFP-env より小さく1-kb
付近である想定上のベクターは、３つのすべての継代接種実験で多量に見つけら
れた。このベクターはEGFP-IRES領域の大きな欠損のあとに生成し、その欠損がe
nv が5'の位置から翻訳されるベクターの生成に帰結したとおもわれ、それによ
り効率的なenv の翻訳を提供する。継代接種３での付加的なバンドに対する解釈
は、Bi-neo-env 実験で認められた類似のバンドへのものと同様なものであろう
。
中でBi-EGFP-envが不十分にしか複製しないことを示した。ベクターRNAはノーザ
ンブロットではほとんど検出できない、ところが小サイズのベクターに相当する
RNAは高い強度で出現する。これはBi-EGFP-envベクターが、複製効率を損なう不
安定性因子を含むことを示唆する。ゲノムサイズがBi-EGFP-env より小さく1-kb
付近である想定上のベクターは、３つのすべての継代接種実験で多量に見つけら
れた。このベクターはEGFP-IRES領域の大きな欠損のあとに生成し、その欠損がe
nv が5'の位置から翻訳されるベクターの生成に帰結したとおもわれ、それによ
り効率的なenv の翻訳を提供する。継代接種３での付加的なバンドに対する解釈
は、Bi-neo-env 実験で認められた類似のバンドへのものと同様なものであろう
。
【０１２８】 新規ベクターシステムでの２アミノ酸をランダム化した外被ライブラリーのin
vivo選択 ミニウイルスはPCR法で処理しうるサイズであり、それゆえ、PCRにてランダム
化した配列の導入は、見込みのある方法である。PCRで構築されたゲノムライブ
ラリーは、必然的に直線化されたDNA断片から構成され、この特徴が環状DNAと比
較して形質導入効率を減少させるかどうかについて分析するために、一時的な形
質導入実験が実施された。この分析は形質導入効率にどのような差もないことを
示した。
vivo選択 ミニウイルスはPCR法で処理しうるサイズであり、それゆえ、PCRにてランダム
化した配列の導入は、見込みのある方法である。PCRで構築されたゲノムライブ
ラリーは、必然的に直線化されたDNA断片から構成され、この特徴が環状DNAと比
較して形質導入効率を減少させるかどうかについて分析するために、一時的な形
質導入実験が実施された。この分析は形質導入効率にどのような差もないことを
示した。
【０１２９】
【表５】 表層蛋白質の可変性領域Aドメインのいくつかのアミノ酸が、受容体の結合性
に関与していることが知られており、このドメインのペプチド配列中でのマイナ
ーな変更でさえ非機能の外被蛋白質にすることが示されている(39, 40)。MacKre
ll等(1996)はとりわけMo-Envでのアルギニンとアスパラギン酸(83番目と84番目
の)が、外被蛋白質が媒介する感染性に非常に重要であることを示した。新規ベ
クターシステムの可能性を証明するために、これらの２つのアミノ酸が重複拡張
処理によりランダム化され、新規ベクターシステムによって選択される。２つの
アミノ酸のランダム化は400 (202)の異なる表現形を含むベクターライブラリー
を提供するであろう。およそ500ngのベクターライブラリー構築物が、BOSC２３
パッケージング細胞中に一時的にトランスフェクションされた（10μgのサケ精
子DNAとともに）。未精製の上清がトランスフェクションの48、60、72時間後にN
IH/CeB培養細胞(175 cm2 容器に1.8x106 細胞)に加えられた。形質導入されたNI
H/CeB細胞(最後の上清添加の２４時間後に開始された)のG418選択で、およそ６
００コロニーが出現し、おそらくライブラリーの多くの部分を含んでいる。もし
これらの形質導入された細胞がただ１つのベクターゲノムを含んでいるならば、
ウイルス粒子をコートする変異したEnv蛋白質は、粒子に被覆されるenvをコード
するベクター配列に反映し、そして遺伝子型はそれゆえ表現形に従う。
に関与していることが知られており、このドメインのペプチド配列中でのマイナ
ーな変更でさえ非機能の外被蛋白質にすることが示されている(39, 40)。MacKre
ll等(1996)はとりわけMo-Envでのアルギニンとアスパラギン酸(83番目と84番目
の)が、外被蛋白質が媒介する感染性に非常に重要であることを示した。新規ベ
クターシステムの可能性を証明するために、これらの２つのアミノ酸が重複拡張
処理によりランダム化され、新規ベクターシステムによって選択される。２つの
アミノ酸のランダム化は400 (202)の異なる表現形を含むベクターライブラリー
を提供するであろう。およそ500ngのベクターライブラリー構築物が、BOSC２３
パッケージング細胞中に一時的にトランスフェクションされた（10μgのサケ精
子DNAとともに）。未精製の上清がトランスフェクションの48、60、72時間後にN
IH/CeB培養細胞(175 cm2 容器に1.8x106 細胞)に加えられた。形質導入されたNI
H/CeB細胞(最後の上清添加の２４時間後に開始された)のG418選択で、およそ６
００コロニーが出現し、おそらくライブラリーの多くの部分を含んでいる。もし
これらの形質導入された細胞がただ１つのベクターゲノムを含んでいるならば、
ウイルス粒子をコートする変異したEnv蛋白質は、粒子に被覆されるenvをコード
するベクター配列に反映し、そして遺伝子型はそれゆえ表現形に従う。
【０１３０】 機能的な表現形を探しあてるために、保存されたコロニーからの上清が、未感
染のNIH/CeB細胞に添加され、G418選択が施された。G418選択は４つのコロニー
を出現させ、それらは分離されそしてタイター実験とランダム化した配列の同定
に使用された。コロニー中２つはどのような形質導入もサポートしなかった、一
方、他の２つは8x100 と 1x101 CFU/mlのタイターを示した。４つのコロニーの
シークエンス分析はまだ実施されていない。この結果は新規のベクターシステム
がランダム化ライブラリーの進化的研究への使用に適していることを立証した。
染のNIH/CeB細胞に添加され、G418選択が施された。G418選択は４つのコロニー
を出現させ、それらは分離されそしてタイター実験とランダム化した配列の同定
に使用された。コロニー中２つはどのような形質導入もサポートしなかった、一
方、他の２つは8x100 と 1x101 CFU/mlのタイターを示した。４つのコロニーの
シークエンス分析はまだ実施されていない。この結果は新規のベクターシステム
がランダム化ライブラリーの進化的研究への使用に適していることを立証した。
【０１３１】 実施例３：動物実験 適切な翻訳開始機能を備えた構築物が選択された。供試動物はVIRAGFPMコンス
トラクションで感染され、感染した細胞数とEGFP陽性の細胞数がカウントされた
。VIRAGFPMが高率で細胞に感染したことが示された。
トラクションで感染され、感染した細胞数とEGFP陽性の細胞数がカウントされた
。VIRAGFPMが高率で細胞に感染したことが示された。
【０１３２】 3.1 IRES EMCV IRES因子と異種遺伝子の翻訳開始部位間の先行配列適正化 EMCV IRES因子からの内部翻訳開始を適正化するために、いくつかの異なる先
行配列（表１参照）が、複製能正常のAkvマウス白血病ウイルスベクターに関連
したEGFPの発現に対して分析された。VlRAGFPC と VIRAEGFP （表１参照）の２
つのコンストラクションで、都合のよい制限酵素切断部位をもつポリリンカーが
Clontech のコンストラクションである pIRES-EGFPに由来するVIRAGFPCのポリリ
ンカーとともに挿入された。両方のウイルスは、試験された最適のコンストラク
ション（VlRAGFPM）と比較してフローサイトメトリー分析による蛍光強度での十
分の一への減少を示した。このリーダー配列は異種遺伝子の翻訳開始部位にNcoI
サイトを含んでいる。残りのリーダー配列は、オリジナルのEMCV IRES因子での
翻訳開始コドン１０での１つの点突然変異を除いてEMCウイルスからのオリジナ
ルなリーダー配列と類似している（配列の表を参照のこと）。リーダー配列はMo
rgan等(1992)によって以前に報告されている：Nucl.Acids Res. 20(6): 1293-9
。
行配列（表１参照）が、複製能正常のAkvマウス白血病ウイルスベクターに関連
したEGFPの発現に対して分析された。VlRAGFPC と VIRAEGFP （表１参照）の２
つのコンストラクションで、都合のよい制限酵素切断部位をもつポリリンカーが
Clontech のコンストラクションである pIRES-EGFPに由来するVIRAGFPCのポリリ
ンカーとともに挿入された。両方のウイルスは、試験された最適のコンストラク
ション（VlRAGFPM）と比較してフローサイトメトリー分析による蛍光強度での十
分の一への減少を示した。このリーダー配列は異種遺伝子の翻訳開始部位にNcoI
サイトを含んでいる。残りのリーダー配列は、オリジナルのEMCV IRES因子での
翻訳開始コドン１０での１つの点突然変異を除いてEMCウイルスからのオリジナ
ルなリーダー配列と類似している（配列の表を参照のこと）。リーダー配列はMo
rgan等(1992)によって以前に報告されている：Nucl.Acids Res. 20(6): 1293-9
。
【０１３３】
【表６】 3.1 VIRAGFPMのin vivo実験での成績 100 マイクロリッターあたり104感染単位が腹腔内に注射された。供試動物は1
, 4, 7, 14, 33, 60日後に分析された。小さいサイズの個体なので、６個体の脾
臓が１日目に、そして３個体が４、７日目に混合された。14, 33, 60日目に１個
体の供試動物が、それぞれの実験で分析された。
, 4, 7, 14, 33, 60日後に分析された。小さいサイズの個体なので、６個体の脾
臓が１日目に、そして３個体が４、７日目に混合された。14, 33, 60日目に１個
体の供試動物が、それぞれの実験で分析された。
【０１３４】 １日目：EGFP陽性細胞なし ４日目：EGFP陽性細胞50 から 75% ７日目：GFP陽性細胞50 から 80% １４日目：GFP陽性細胞0.5% ３３日目そして６０日目には22% のGFP陽性細胞を示した１匹の個体を除いては
陽性細胞は認められなかった。
陽性細胞は認められなかった。
【０１３５】 タイター実験 血中のウイルスは、２つの分析方法で調査された。１番目の方法では、Mus du
nniの細胞が血液サンプルを連続希釈することにより感染され、EGFP陽性細胞が
カウントされた。この方法は非組み換え型のマキシウイルスの分析を可能にする
。２番目の方法では、Mus dunni 細胞が、同様に血液を連続希釈することにより
感染されるが、ウイルスは抗envモノクローナル抗体83A25(Evans et al.. J. Vi
rol. 64, 6176-83, 1990)による蛍光抗体法によりカウントされる。この方法は
非組み換え型ベクターとEGFPが削除されたベクターの両方の分析を可能にする。
nniの細胞が血液サンプルを連続希釈することにより感染され、EGFP陽性細胞が
カウントされた。この方法は非組み換え型のマキシウイルスの分析を可能にする
。２番目の方法では、Mus dunni 細胞が、同様に血液を連続希釈することにより
感染されるが、ウイルスは抗envモノクローナル抗体83A25(Evans et al.. J. Vi
rol. 64, 6176-83, 1990)による蛍光抗体法によりカウントされる。この方法は
非組み換え型ベクターとEGFPが削除されたベクターの両方の分析を可能にする。
【０１３６】
【表７】 ７日目以降のEGFP陽性細胞数の減退は、おそらくVIRAGFPMでのIRES-EGFP因子
の部分的欠失の結果であろう。これらの復帰変異体ウイルスは培養細胞中でVIRA
GFPMに対して特性が分析され、そしてこれらの復帰変異体ウイルスは挿入された
IRES-EGFP断片中の５０から１００ヌクレオチドが、挿入部位に残っているウイ
ルスを含んでいる。このIRES-EGFP断片の大きな欠失は、スプライス型と非スプ
ライス型ウイルスRNA間のバランスの回復に帰結する(Jespersen等 1999)。これ
は83A25抗体がVIRAGFPMと同様に復帰変異体の外被も検出するタイター実験に反
映される。この実験でEGFPのタイターは7日後に下降したが、外被を認識する抗
体で推定されるタイターは実験を通して高く維持される。
の部分的欠失の結果であろう。これらの復帰変異体ウイルスは培養細胞中でVIRA
GFPMに対して特性が分析され、そしてこれらの復帰変異体ウイルスは挿入された
IRES-EGFP断片中の５０から１００ヌクレオチドが、挿入部位に残っているウイ
ルスを含んでいる。このIRES-EGFP断片の大きな欠失は、スプライス型と非スプ
ライス型ウイルスRNA間のバランスの回復に帰結する(Jespersen等 1999)。これ
は83A25抗体がVIRAGFPMと同様に復帰変異体の外被も検出するタイター実験に反
映される。この実験でEGFPのタイターは7日後に下降したが、外被を認識する抗
体で推定されるタイターは実験を通して高く維持される。
【０１３７】 結果として、VIRAGFPMは接種後初日の間に高い感染率を確立した（7日後に80
％のEGFP陽性脾臓細胞にまで）。７日目後、VIRAGFPMは、おそらくは復帰変異体
に生育の有利性を付与するスプライシングを復活させた、VIRAGFPMの復帰変異体
により凌駕される。以前の結果はVIRAGFPMに加えてAENGFMK2も機能することを示
している。
％のEGFP陽性脾臓細胞にまで）。７日目後、VIRAGFPMは、おそらくは復帰変異体
に生育の有利性を付与するスプライシングを復活させた、VIRAGFPMの復帰変異体
により凌駕される。以前の結果はVIRAGFPMに加えてAENGFMK2も機能することを示
している。
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
【表9】
【０１４０】
1 . Barnier J.V., M. Marx, P. Dezelee, D. Laugier, F. Poirier. G. Caloth
y, J. Hillova, and M. Hill. 1990. Transformation-defective mutants with 5' del
etions of the src gene are frequently generated during replication of Ro
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ells by a Rous sarcoma virus-based retroviral vector with the host range
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a bicistronic retroviral vector composed of the swine vesicular disease
virus internal ribosome entry site. J. Virol. 67:2142-2148. 4. Chomczynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isol
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odeficiency virus type 1 tat transactivator protein. J. Virol. 65:4490-4
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and properties of replication-competent murine retroviral vectors encodi
ng methotrexate resistance. Mol. Cell. Biol. 9:100-108. 37. Stuhlmann, H., R. Jaenisch, and R. C. Mulligan. 1989. Transfer of a
mutant dihydrofolate reductase gene into pre- and postimplantation mous
e embryos by a replication-competent retrovirus vector. J. Virol. 63:485
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Virol. 67: 7125-7130. 41. Bae et al. 1997, Functional dissection of the Moloney murine leukem
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t retroviruses resistant to human serum. J. Virol. 69: 7430-7436. 44. Adam et al., 1991, Internal initiation of translation in retroviral
vectors carrying picornavirus 5' nontranslated regions. J. Virol. 65:49
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ion of a replication-competent spleen necrosis virus vector disrupts env
gene expression. Arch Virol 144, 73-87; 46. Barker et al., 199l, Nonsense codons within the RSV gag gene decrea
se the stability of unspliced viral RNA. Mol Cell Biol 11: 2760-2768; 47. Barker et al, 1994, RSV RNA stability requires an open reading fram
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t retroviruses resistant to human serum. J. Virol. 69: 7430-7436. 44. Adam et al., 1991, Internal initiation of translation in retroviral
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【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２６日（２００１．４．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 7/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93 7/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/569 5/00 Ｅ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デューヒ、モーゲンス デンマーク国、ディーケー − 8240 リ スコフ、エルメベイ ４ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA12 DA02 EA02 FA02 FA06 FA07 FA10 GA11 HA12 HA17 4B065 AA91X AA93X AA97X AA97Y AB01 AC14 BA02 BA14 BD14 CA24 CA44 CA45 4C084 AA13 ZB212 4C087 AA02 BB65 BC83 ZB21
Claims (33)
- 【請求項１】 レトロウイルスに特徴的な遺伝子をすべて具備するレトロウ
イルスベクターであって、レトロウイルスの複製に関して必須のすべての遺伝子
が機能を保持しており、異種の内部リボゾーム侵入部位(IRES; internal riboso
me entry site)を付加的に含む当該ベクター。 - 【請求項２】 IRESに先行される異種遺伝子を含み、IRESの制御下で前記異
種遺伝子の翻訳にいたる、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項３】 感染開始を可能にする蛋白質をコードする遺伝子を含む複製
能欠損型レトロウイルスベクターであって、前記遺伝子が異種の内部リボゾーム
侵入部位(IRES)の翻訳制御下にあるベクター。 - 【請求項４】 感染開始を可能にする蛋白質をコードする遺伝子がenv遺伝
子もしくはそれの機能的な派生物である、請求項３に記載のレトロウイルスベク
ター。 - 【請求項５】 異種のenv遺伝子を含む、請求項４に記載のレトロウイルス
ベクター。 - 【請求項６】 envとレトロウイルスベクターが異なる種、亜種、サブタイ
プ、もしくはクレードに由来する、請求項５に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項７】 gagが付加的にベクターに組み込まれた、請求項３〜６の何
れかに1項に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項８】 polが付加的にベクターに組み込まれた、請求項３〜６の何
れかに1項に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項９】 gag もしくはpolが付加的なIRESによって先行されるか、或
いはプロモーターおよび/またはエンハンサー因子によって先行される、請求項
７または８に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項１０】 １つの付加的な異種遺伝子を含む、請求項２〜９の何れか
1項に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項１１】 前記の付加的な異種遺伝子が１つの付加的なIRES、或いは
プロモーターおよび/またはエンハンサー因子の制御下で発現する、請求項１０
に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項１２】 IRESがLTR(Long Terminal Repeat)に挿入された、請求項
１〜１１の何れか1項に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項１３】 IRESがLTRのU3領域に挿入された、請求項１２に記載のレ
トロウイルスベクター。 - 【請求項１４】 IRESが3’LTRのU3領域に挿入された、請求項１３に記載の
レトロウイルスベクター。 - 【請求項１５】 IRESが逆向き反復配列と転写制御因子の間のU3領域に挿入
されている、請求項１３または１４に記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項１６】 使用されたIRESがピコルナウイルス科、レトロウイルス科
もしくはレトロポゾンから選択された請求項１〜１５の何れか1項に記載のレト
ロウイルスベクター。 - 【請求項１７】 レトロウイルスベクターがマウス白血病ウイルス(MLV)、M
oloney白血病ウイルス(MoMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLVもしくは他の近縁ウイルス
を基礎とするものである、請求項１〜１６の何れか1項に記載のレトロウイルス
ベクター。 - 【請求項１８】 請求項１〜１７の何れか1項に記載のレトロウイルスベク
ターのRNA。 - 【請求項１９】 請求項１８に記載のRNAの逆転写過程の際に、標的細胞で
産生されるレトロウイルスプロウイルス。 - 【請求項２０】 請求項１９に記載のレトロウイルスプロウイルスのｍRNA
。 - 【請求項２１】 請求項１８に記載のRNAを含むレトロウイルス粒子。
- 【請求項２２】 請求項３〜９の何れか1項に記載のレトロウイルスベクタ
ーまたは請求項１８に記載のRNAでパッケージング細胞をトランスフェクション
することにより得られる、請求項２１に記載のレトロウイルス粒子。 - 【請求項２３】 請求項１〜１７の何れか1項に記載のレトロウイルスベク
ターを含むプロデューサー細胞。 - 【請求項２４】 請求項１〜１７の何れか1項に記載のレトロウイルスベク
ターを含むホスト細胞。 - 【請求項２５】 請求項２１または２２に記載のレトロウイルス粒子で感染
されたホスト細胞。 - 【請求項２６】 遺伝子治療での利用するための、請求項１〜１７の何れか
1項に記載のレトロウイルスベクター、請求項２３に記載のプロデューサー細胞
、請求項２１もしくは２２に記載のレトロウイルス粒子および/または請求項２
４に記載のホスト細胞。 - 【請求項２７】 遺伝子治療の医薬を製造するための、請求項１〜１７の何
れか1項に記載のレトロウイルスベクター、請求項２３に記載のプロデューサー
細胞、請求項２１または２２に記載のレトロウイルス粒子および/または請求項
２４に記載のホスト細胞の使用。 - 【請求項２８】 請求項１〜１７の何れか1項に記載のレトロウイルスベク
ター、請求項２１または２２に記載のレトロウイルス粒子、請求項２３に記載の
プロデューサー細胞、および/または請求項２４もしくは２５に記載のホスト細
胞の治療的効果量を含む薬学的組成物。 - 【請求項２９】 請求項２１または２２に記載のレトロウイルス粒子による
標的細胞の感染を含む、標的細胞に同種および/または異種のヌクレオチド配列
を導入するための方法。 - 【請求項３０】 トランスジェニック動物を作出するための請求項２９に記
載の方法であって、請求項２１または２２に記載のレトロウイルス粒子、或いは
請求項１〜１７の何れか1項に記載のレトロウイルスベクターによる胚細胞の感
染または導入を含む方法。 - 【請求項３１】 特定標的細胞の特異的感染のために、請求項３〜１７の何
れか1項に記載のレトロウイルスベクターを含むウイルス粒子を選択するための
方法であって、 パッケージング細胞が、感染を開始する能力のある蛋白質をコードする遺伝子
の変異体を含む前記レトロウイルスベクターで構成されるベクターライブラリー
で感染され、 当該感染細胞が、当該レトロウイルスベクターの増幅を許容する条件下でイン
キュベーションされ、それぞれが感染を開始する能力のある蛋白質の１つの変異
体を含むウイルス粒子の生成をもたらし、 そしてさらに、まだ未感染の細胞が当該ウイルス粒子により感染されて、前記
蛋白質の変異体の１種類を含む、前記標的細胞を感染するために高度に適応した
ウイルス粒子の富化を生じる方法。 - 【請求項３２】 感染を開始する能力のある蛋白質をコードする前記遺伝子
がenv遺伝子である、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記遺伝子が異種のenv遺伝子である請求項３２に記載の
方法。
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|---|---|---|---|
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