PT1301201E - Tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo ii - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DA DOENÇA DE ARMAZENAMENTO DE GLICOGÉNIO TIPO II"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de armazenamento de glicogénio tipo II (GSD-IX) {também conhecida como doença de Pompe ou deficiência de maltase ácida) é um distúrbio muscular genético, fatal, causado por uma deficiência da a-glucosidase ácida (GAA), uma enzima lisosomal degradante do glicogénio (Hirschhorn, R„, "Glycogen storage dísease type II: acid a~glucosídase (acid maltase) defíciency" em Scriver, C. R, et al., (eds) The metaholíc and molecular Basís of Inheríted disease, 7th Ed„, McGraw-Hill, Nova Iorque, 1995, pp„ 2443-2464), A deficiência resulta na acumulação de glicogénio lisosomal em quase todos os tecidos do corpo, sendo os músculos cardíaco e interõsseos os mais seriamente afectados, A incidência combinada de todas as formas de GSD-II está estimada em 1:40,000 e a doença afecta todos os grupos sem uma predilecção étnica (Martiniuk, F. et al., Amer. J. Med. Genet. 79:69-72 (1998); Ausems, M. G. EM. et al., Eur, J. Hum, Genet, 7:713-716 (1999)) .

Clinicamente, a GSD-II abrange uma gama de fenótipos que diferem no que diz respeito à idade do aparecimento da doença, os órgãos envolvidos e a gravidade clínica, geralmente em correlação com a quantidade residual da actividade de GAA, Na sua manifestação mais grave (a GSD-II infantil ou doença de Pompe, em que está presente menos de 1% da actividade normal de GAA), as 1 crianças são afectadas por uma cardiomiopatia hipertrófica. fraqueza generalizada dos músculos e hipotomia secundaria a uma maciça acumulação de glicogénio nos músculos cardíaco e interósseos (para análise, ver Hirschhorn, acima). A doença progride rapidamente ocorrendo a morte por insuficiência cardíaca em torno de 1 ano de idade. As formas de aparecimento da doença em jovens (1-10% da actividade normal de GAA) e em adultos (10-40% da actividade normal de GAA) são caracterizadas pela falta de envolvimento cardíaco grave, idade mais tardia do aparecimento da doença, progresso mais lento, mas o eventual envolvimento respiratório ou dos músculos dos membros resulta em morbilidade e mortalidade significativas para os indivíduos afectados.

Estratégias de tratamentos com fãrmacos, manipulações alimentares, e transplante de medula óssea têm sido empregues como meio de tratamento para a GSD-II, sem sucesso significativo (Hug, G. et al., Birth Defects Org. Ser. 9:160-183 (1967); Slonim, A. Ξ. et al., Neurology 33:34 (1983); Watson, J, G. et al., N. Engl. J. Med. 314:385 (1986)), As tentativas iniciais em substituição enzimãtica também não tiveram êxito (Hug, G. e Schubert, W. K,, J. Clin. Invés t. 46:1073 (1967); de Barsy, T. et al., Birth Defects Orig. Art. Ser. lx:184-190 (1973); Williams, J. C. e Murray, A. K,, "Enzyme replacement ín Pompe disease wíth an alpha glucosidase low-density lipoprotein complex", em Desnick, R. J. (ed), Enzyme Theapy in Genetic Diseases: 2, Nova Iorque, Alan R. Liss 1980; pp, 415-423)). Permanece a necessidade de um tratamento eficaz da GSD-II. 0 documento WO 00/34451 descreve a construção de t irsnscjsní cos ρ?.ιγξ 3. produção d,e liGAA oio murcjB.niios geneticamente modificados. O documento apresenta uma estratégia proposta para a terapêutica de substituição enzimática para doentes com a doença de Pompe„

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigia a composições para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo II {com o aparecimento infantil, juvenil ou na idade adulta} num indivíduo, pela administração ao indivíduo duma quantidade terapeuticamente eficaz de a-glucosidase ácida (por exemplo, menos de cerca de 15 mg de enzima por quilograma de peso corporal, preferencialmente, cerca de 1-10 mg de enzima por quilograma de peso corporal, mais preferencialmente, cerca de 10 mg de enzima por quilograma de peso corporal ou cerca de 5 mg de enzima por quilograma de peso corporal) a intervalos regulares (por exemplo, mensalmente, bimensalmente, semanalmente, duas vezes por semana, diariamente). A a-glucosidase ácida é a a-glucosidase ácida humana produzida nas células de ovários de hamster chinês, preferencialmente, a a-glucosidase ácida humana recombinante, mais preferencialmente, a forma precursora da α-glucosidase ácida humana e, ainda mais preferencíalmente, a forma precursora da a-glucosidase ácida humana produzida nas células de ovários de hamster chinês. A α-glucosidase ácida é administrada periodicamente (por exemplo, mensalmente, bimensalmente, semanalmente, duas vezes por semana, diariamente). Nas formas de realização preferidas, a α-glucosidase ácida é 4 administrada por via intravenosa; intramuscular; intratecal; ou por via intraventricular. A presente invenção proporciona o primeiro meio eficaz para tratar um indivíduo com a doença de armazenamento de glicogénio tipo II. 0 medicamento da presente invenção é conforme reivindicado na Reivindicação 1, com as características preferidas nas Reivindicações 2 a 9. A utilização para a preparação de um medicamento da presente invenção é dado na Reivindicação 10 com as características preferidas na Reivindicação 11.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figs. 1A-1C são uma série de representações gráficas que representam dados longitudinais (para os primeiros 16 meses de idade) do desenvolvimento motor conforme avaliado pela Escala Motora Infantil de Alberta (Alberta Infant Motor Scale, AIMS) (diamantes fechados) e titulações de anticorpos para α-glucosidase ácida humana recombinante (rhGAA) {diamantes abertos) em três doentes (doente 1, Fig. IA; doente 2, Fig. 1B; doente 3, Fig. 1C) com a doença de Pompe infantil recebendo a terapêutica de substituição enzimãtica. A seta indica quando a terapêutica enzimãtica foi iniciada, As pontuações de AIMS em doentes normais estão marcadas como curvas tracejadas em função da idade {5o, 10°, 25°, 50°, 75° e 95° percentis, de baixo para cima),

As Figs. 2A-2F são uma série de representações gráficas que representam medições ecocardiogrãficas bidimensionais do volume ventricular esquerdo (Figs, 2A~ 2C) e massa (Figs. 2D-2F) nos três doentes com a doença de Pompe infantil recebendo a terapêutica de substituição 5 enzimãtica (doente 1, Figs. 2A e 2D; doente 2, Figs, 2B e 2E; doente 3, Ficjs. 2C e 2F) . A. semana 0 representa as medições no momento da iniciação da terapêutica enzimãtica. Os diamantes abertos, representam a medição do volume diastólico terminal; os diamantes fechados representam a medição do volume sistólico terminal.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a composições para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo II (GSD-II) num indivíduo, pela administração da enzima a-glucosidase ácida (GAA) ao indivíduo, bem como a utilização da enzima GAA na preparação de um medicamento para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo II, Conforme aqui descrito, os Requerentes trataram, com sucesso, crianças a sofrer da GSD-ΪΪ pela administração de GAA âs crianças a intervalos regulares as crianças demonstraram melhoria do estado cardíaco, da função pulmonar e neurodesenvolvimento, bem como redução dos níveis de glicogénio nos tecidos.

Como resultado destas verificações, é agora possível, pela primeira vez, tratar a GSD-II, incluindo a GSD-II com aparecimento infantil, juvenil e na idade adulta. Embora os resultados aqui descrito discutam indivíduos com a forma de GSD-II mais severa (GSD-II infantil), espera-se que os métodos sejam igualmente eficazes em indivíduos afectados pelo aparecimento da GSD-II juvenil e na idade adulta e possam, de facto, ser ainda mais eficaz, uma vez que os indivíduos com o aparecimento da GSD-II juvenil e na idade adulta têm níveis mais elevados de actividade de GAA residual (1-10% ou 10-40%, 6 respectivamente) e, portanto, sâo provavelmente ma is tolerantes t!o ponto de vista. imunológico cia. GAA administrada (por exemplo, de um modo geral, eles são material imunoreactivo de reacção cruzada (CRIM) positivo para GAA endógeno, de modo que os seus sistemas írnunológicos não percebem a GAA como uma proteína "estranha" e não desenvolvem anticorpos anti-GAA), A eficácia intensificada em tais indivíduos pode ser vista no doente 3, que era CRIM positivo e não desenvolveu anticorpos anti-GAA e que demonstrou um progresso normal de marcos de desenvolvimento, em contraste com o curso variável que foi observado nos doentes l e 2 que eram CRIM negativos (que desenvolveram anticorpos anti-GAA),

Os termos "tratar" e "tratamento", conforme utilizados neste contexto, referem-se ao melhoramento de um ou mais sintomas associados com a doença, prevenção ou atraso do aparecimento de um ou mais sintomas da doença e/ou a diminuição da gravidade ou frequência de um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, o tratamento pode referir-se à melhoria do estado cardíaco (por exemplo, aumento dos volumes diastólico terminal e/ou sistólico terminal, ou redução, melhora ou prevenção da cardiomiopatia progressiva que é tipicamente encontrada em GSD-II) ou da função pulmonar (por exemplo, aumento da capacidade vital de chorar em relação à capacidade de linha de base e/ou a normalização da dessaturação do oxigénio durante o choro); melhora no neurodesenvolvimento e/ou habilidades motoras (por exemplo, aumento da pontuação de AIMS); redução dos níveis de glicogénio em tecidos do indivíduo afectado pela doença; ou quaisquer combinações destes efeitos. Numa forma de realização 7 preferida, o tratamento inclui melhoras do estado Λ-η"^ί ν-ΐ τ> -i- 5- -r ι Ί ti rman íTi -a r· m rl > ? r* 5 μ Π τ~\ η"· d ΤΓ «d ΐΟ r' S r> /"] n f U4.-A. O .1. V- Ui .L »«Λ «L. I l U— ilux-. Ut .A. S-. i»4 U«. U*. W WU.l U» £/.1.ν-*1_..Αγ·_Λ\_; cardiomiopatia associada à GSD-II. Os termos "melhorar", "aumentar" ou "reduzir", conforme utilizados neste contexto, indicam valores que são relativos a uma medição de uma linha de base, tal como uma medição no mesmo indivíduo antes da iniciação do tratamento aqui descrito ou uma medição num indivíduo de controlo (ou múltiplos indivíduos de controlo) na ausência do tratamento aqui descrito. Um indivíduo de controlo é um indivíduo afligido com a mesma forma de GSD-II (com aparecimento seja infantil, juvenil ou na idade adulta) que o indivíduo a ser tratado, que tem aproximadamente a mesma idade que o indivíduo a ser tratado (para assegurar que os estágios da doença no indivíduo tratado e no(s) indivíduo(s) de controlo sejam comparáveis). 0 indivíduo a ser tratado é um indivíduo (feto, criança, adolescente ou adulto humano) tendo GSD-II (isto é, o aparecimento da GSD-II infantil, GSD-II juvenil ou GSD-II na idade adulta). 0 indivíduo pode ter actividade de GAA residual ou actividade não mensurável, Por exemplo, o indivíduo tendo GSD-II pode ter actividade de GAA que é inferior a cerca de 1% da actividade de GAA normal (GSD-II infantil) ou actividade de GAA que é de cerca de 10-40% da actividade de GAA normal (GSD-II de adulto), o indivíduo pode ser CRIM positivo ou CRIM negativo para a GAA endógena. Numa forma de realização preferida, o indivíduo é CRIiM positivo para a GAA endógena. Numa outra forma de realização preferida, o indivíduo é um indivíduo que tenha sido diagnosticado recentemente com a doença. O tratamento precoce (o tratamento a ter início assim que possível 8 depois do diagnóstico) é importante para minimizar os efeitos da doença a para; maximizar os honof ínínc a.~, tratamento,

Nas utilizações da invenção, a α-glucosidase ácida humana (GAA) é administrada ao indivíduo. A GAA é numa forma que, quando administrada, dirige-se a tecidos tais como os tecidos afectados pela doença (por exemplo, coração, músculo), Numa forma de realização preferida, a GAA humana é administrada na sua forma precursora, uma vez que o precursor contém motivos que permitem a eficaz absorção da GAA mediada pelo receptor. Alternativamente, pode ser administrada uma forma madura de GAA humana que tenha sido modificada para conter motivos para permitir a absorção eficaz da GAA, Numa forma de realização particularmente preferida, a GAA é a forma precursora da GAA humana recombinante. A GAA para utilização na invenção e, numa forma de realização particularmente preferida, a a-glucosidase ácida humana recombinante (rhGAA) foi produzida em culturas de células de ovários de hamster chinês (CHO) (ver, por exemplo, Fuller, M. et al., Eur. J. Biochem. 234:903-909 (1995); Van Hove, J. L. K. et al., Proc. Natl. Ãcad, Sei, USA 93:65-70 (1996). A produção de GAA em células CHO parece dar origem a um produto tendo glícosílação que permite a absorção significativa e eficiente da GAA nos tecidos desejados (coração e músculo); supõe~se que a glícosílação difere daquela da GAA que é produzida em murganho geneticamente modificado e leite de coelha (ver, por exemplo, Bijvoet, A. G. A. et 9 al. 7\ IIum. Mo 2 . t al

Genet. 7:1815-1824 (1998); Bijvoet, Md . Gen et- 8:2145· 2153 (i o q ° M

A.. G A GAA tem uma actividade enzimãtica específica na gama de cerca de 1,0-3,5 μπιοΐ/ιτιίπ/ιτ^ de proteína, preferencialmente, na gama de cerca de 2-3,5 /imol/min/mg. Numa forma de realização preferida, a GAA tem actividade enzimãtica específica de pelo menos cerca de 1,0 μπιοΐ/πύη/π^ de proteína; maís preferencialmente, uma actividade enzimãtica específica de pelo menos cerca de 2,0 pmol/min/mg de proteína; ainda mais preferencialmente, uma actividade enzimãtica específica de pelo menos cerca de 2,5 /imol/min/mg de proteína; e, ainda mais preferencialmente, uma actividade enzimãtica específica de pelo menos cerca de 2,75 /imol/min/mg de proteína. A GAA pode ser administrada só, ou em composições ou medicamentos compreendendo a GAA (por exemplo, na preparação de um medicamento para o tratamento da doença), conforme descrito acima. As composições podem ser formuladas com um veículo ou excipiente fiosiologicamente aceitável para preparar uma composição farmacêutico. O veículo e a composição podem ser estéreis. A formulação deve adequar-se ao modo de administração.

Os transportadores adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a água, soluções de sal (por exemplo, NaCl), soro fisiológico, solução salina tamponizada, alcoóis, glicerol, etanol, goma arábica, óleos vegetais, alcoóis benzílicos, polietilenoglicóis, gelatina, hidratos de carbono, tais como lactose, amilose ou amido, açúcares, tais como manitol, sacarose ou outros, dextrose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, ésteres de ácido gordo, hi droxi meti 1 cel ul ose.. pol ivinilpirrolidona , etc., bem como combinações destes, As preparações farmacêuticas, se desejado, podem ser misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes humedecedores, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, substâncias aromatizantes e/ou aromáticas e outras semelhantes que não reagem de forma adversa com os compostos actívos. Numa forma de realização preferida, é utilizado um veículo solúvel em água adequado para a administração intravenosa.

Se desejado, a composição ou medicamento também pode conter pequenas quantidades de agentes humectantes ou emulsionantes, ou agentes tamponizantes do pH. A composição pode ser uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de libertação sustentada ou pó. A composição também pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e transportadores tradicionais, tais como triglicéridos. A formulação oral pode incluir transportadores padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. A composição ou medicamento pode ser formulado de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a administração a seres humanos. Por exemplo, numa forma de realização preferida, uma composição para administração intravenosa, tipicamente, é uma solução em tampão aquoso isotónico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente de solubilização e um anestésico local para melhorar a dor no local da injecção. De um modo r-Ί h ido: ϊ /-3 -ri j i_> «_< _L_ UUU i misturados uns aos outros em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água num recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade do agente activo. Quando a composição é para ser administrada por perfusão, a mesma pode ser dispensada com um frasco para perfusão contendo água de grau farmacêutico, estéril, soro fisiológico ou dextrose/ãgua. Quando a composição é administrada por injecção, pode ser proporcionada uma ampola de agua estéril para a injecção ou soro fisiológico, de modo que os componentes possam ser misturados antes da administração. A GAA pode ser formulada como neutra ou em formas de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres, tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxãlico, tartárico, etc., e aqueles formados com grupos carboxílicos livres tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. A GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) é administrada por uma via apropriada. Numa forma de realização, a GAA é administrada por via intravenosa. Noutras formas de realização, a GAA é administrada pela administração directa a um tecido alvo, tal como o coração ou músculo (por exemplo, intramuscular}, ou sistema nervoso (por exemplo, injecção directa no cérebro,· intraventricular; intratecal),

Se desejado, pode-se A GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) pode ser administrada só ou em associação com outros agentes, tais como anti-histaminas (por exemplo, difenhidramina) ou imunossupressores ou outros agentes imunoterapêuticos que neutralizam os anticorpos anti-GAA. 0 termo "em associação com" indica que o agente é administrado aproximadamente ao mesmo tempo que a GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA). Por exemplo, o agente pode ser misturado a uma composição contendo GAA e, deste modo, ser administrado simultaneamente com a GAA; alternativamente, o agente pode ser administrado simultaneamente, sem misturar (por exemplo, a administração "de boleia" do agente na linha intravenosa pela qual o GAA é também administrado, ou vice versa) . Noutro exemplo, o agente pode ser administrado separadamente (por exemplo, não misturado), mas a um curto período de tempo (por exemplo, em 24 horas) da administração da GAA. Numa forma de realização preferida, se o indivíduo for CRIM negativo para a GAA endógena, a GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) é administrada em associação com um regime imunossupressor ou imunoterapêutico concebido para reduzir as quantidades ou evitar a produção de anticorpos anti-GAA. Por exemplo, um protocolo semelhante àqueles utilizados em doentes com hemofilía (Nilsson, I, M, et al,, N, Engl. J. Med. 318:947-50 (1988)) pode ser utilizado para reduzir os anticorpos anti-GAA, Tal regime também pode ser utilizado em indivíduos que são CRIM positivos para a GAA endógena mas que têm ou estão em risco de terem anticorpos anti- GAA- Numa forma de realização particularmente p

i ; i r 1 r r , , i r w i - r · ι ι π r1 r;^ < ^ r ’ r> . X IU·— x HIUUVúO Uyi wgtJVJ irr A Ι'-.ΠίΙ 1 I- -I Λ p** ''»* Ui S»*· »»U l*^*' antes da primeira administração de GAA, com a de minimizar a possibilidade de produção de anti-GAA. referida, o finalidade anticorpos A GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) é administrada numa quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, uma posologia que, quando administrada a intervalos regulares, seja suficiente para tratar a doença, tal como melhorar os sintomas associados com a doença, evitar ou retardar o aparecimento da doença e/ou também diminuir a severidade ou frequência dos sintomas da doença, conforme descrito acima), A quantidade que será terapeuticamente eficaz no tratamento da doença irã depender da natureza e extensão dos efeitos da doença e pode ser determinada por meio de técnicas clínicas padrão. Além disso, podem opcionalmente ser utilizados ensaios in vivo ou in vitro para auxiliar a identificar as gamas de dosagem óptimas. A dose precisa a ser utilizada dependerá também da via de administração e a gravidade da doença e deve ser decidida de acordo com o julgamento de um médico e as circunstâncias de cada doente. As doses eficazes podem ser extrapoladas das curvas de resposta a dose derivadas de sistemas in vitro ou teste em modelo animal. Numa forma de realização preferida, a quantidade terapeuticamente eficaz é inferior a cerca de 15 mg de enzima/kg de peso corporal, preferencialmente, na gama de cerca de 1-10 mg de enzima/kg de peso corporal e, ainda mais preferencialmente, cerca de 10 mg de enzima/kg de peso corporal ou 5 mg de enzima/kg de peso corporal. A dose efectiva para um indivíduo em particular pode ser variada 14 (por exemplo, aumentada, ou diminuída) ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo em tempos de doença física ou tensão, ou se anticorpos anti-GAA tornam-se presentes ou aumentam, ou se os sintomas da doença pioram, a quantidade pode ser aumentada, A quantidade terapeuticamente eficaz de GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) é administrada a intervalos regulares, dependendo da natureza e da extensão dos efeitos da doença, e de forma continuada, A administração a um "intervalo regular", conforme utilizado nestes contexto, índica que a quantidade terapeuticamente eficaz é administrada periodicamente (como diferente de uma dose única), 0 intervalo pode ser determinado por meio de técnicas clínicas padrão. Em formas de realização preferidas, a GAA é administrada mensalmente, bimensalmente; semanalmente; duas vezes por semana; ou diariamente. 0 intervalo de administração para um único indivíduo não necessita ser um intervalo fixo, mas pode variar ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo, em tempos de doença física ou tensão, ou se anticorpos anti-GAA tornam-se presentes ou aumentam, ou se os sintomas da doença pioram, o intervalo entre as doses pode se ser diminuído

Numa forma de realização preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de 10 mg de enzima/kg de peso corporal é administrada semanalmente. Noutra fox'ma de realização preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de 5 mg de enzima/kg de peso corporal é administrada duas vezes por semana. 15

Adicionalmente, a invenção relaciona-se com uma composição farmacêutica compreendendo a-ylueosidasé acida humana, conforme aqui descrito, num recipiente {por exemplo, um frasco, garrafa, bolsa para administração intravenosa, seringa, etc.) com um rótulo contendo instruções para a administração da composição para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo II, tal como por meio dos métodos aqui descritos, A invenção será ainda e, mais especificamente, descrita pelos seguintes exemplos: EXEMPLIFICAÇÃO: Ensaio de Fase I/II da Utilização de α-glucosidase Ácida Humana Recombinante

MATERIAL E MÉTODOS

Doentes: Os critérios de inclusão foram crianças afectadas com GSD-II infantil tendo actividade de GAA virtualmente ausente (>1% do normal em fibroblastos da pele e/ou biópsia de músculo) e menos de um ano de idade. Os critérios de exclusão incluíram insuficiência cardiorespiratória grave na linha de base e/ou outros estados médicos passíveis de diminuir a sobrevivência. Devido â limitada expectatíva de vida da doença a seguir ao diagnóstico, não se utilizou controlo com placebo. Os dados de controlo histórico indicaram que virtualmente todos os doentes morreram antes de 1 ano de idade (Tabela 1) .

Tabela 1 - Dados de controlo histórico da doença de armazenamento de glicogénio infantil, tipo II 16 | Aparecimento Morte (meses) Duração do curso Ca CÍ rtQii.nçíi ^ fii ííi £ r» \ Duke University Medicai Center (n=30)* Média ± DP 5,1 ± 1,5 5,6 ± 2,4 3,5 ± 2,3 Gama 2,4 - 10,3 3,3 - 12,4 O O 1 UD O Slonim et al. (n= 10)** Média + DP 2,25 ± 1,0 7,2 ± 2,8 4,7 + 2,4 Gama 1,0 ~ 4,0 4,0 - 12,0 2,0 - 9,0 * Dados do Registo da Doença de Pompe da Duke university ** Dados de Slonim et al., J P&áiatr. 137:283-285 (2000)

Três crianças afectadas com GSD-II infantil, conforme comprovado pela reduzida actividade da a-glucosidase ácida foram inscritos no estudo, Ao nível da proteína, tanto o doente 1 como o doente 2 não tinham proteína GAA detectãvel, enquanto o doente 3 tinha níveis reduzidos de proteína GAA detectada por análise imunoblot. Os dados clínicos de linha de base antes do início da terapêutica estão resumidos na Tabela 2.

Tabela 2 - Dados Clínicos de Linha de Base em 3 Doentes com Doença de Pompe Infantil

OJ TJ m N 3 u υ o irtí í> u rd Θ U QJ TJ 0 > H 4J U ΠΙ Qj Jh 0 d 3 £ Ή -H 0> u S SI S H 18 0 doente 1 apresentou aos 2 meses de idade com parada cardíaca durante a reparação cirúrgica eiectiva de uma hérnia inguinal.. A avaliação subsequente quando tinha 4 meses de idade demonstrou evidência de uma hipotonia grave, com uma idade de desenvolvimento motor estimada como sendo equivalente a 3 semanas de idade. Ele também tinha profunda cardiomiopatia e cardiomegalia grave com compressão do brônquio principal esquerdo resultando em atelectasia parcial do pulmão esquerdo e dificuldades de alimentação e falta de desenvolvimento. Os doentes 2 e 3 foram diagnosticados antes do nascimento com a doença de Pompe; além disso, cada um tinha tido um irmã/o que tinha morrido de sintomas tipicamente atribuíveis â GSD-II infantil. Ambos os doentes apresentavam evidência de atraso motor; além disso, o doente 2 tinha dificuldades de alimentação, falta de desenvolvimento e cardiomiopatia.

Projecto Básico: 0 estudo foi concebido como um estudo de segurança e eficácia de rhGAA, open-label Fase I/II, de dose única, administrado duas vezes por semana nos 3 doentes com a doença de Pompe infantil. 0 estudo foi aprovado pela comissão de selecção institucional e foi obtido o consentimento dos pais, por escrito. 0 estudo consistia numa Fase de Selecção inicial, uma Fase de Tratamento de 13 semanas e uma Fase de Acompanhamento do Tratamento. Durante a Fase de Selecção, foi avaliado o estado clínico inicial dos doentes; além disso, foram determinados os níveis de GAA e glicogénio em amostras de biópsia de músculos interósseos. Durante a Fase de tratamento, os doentes receberam perfusões intravenosas de rhGAA (5 mg/kg) dua.s vezes por semana. Os doentes foram 19 cuidadosamente monitorizados para a verificação de

QlIclX3CJU.G1T ITOSpOGL-CÍG Ct^/ClTSíiS 33 pOirL^iGCCS CnZXITlcl^ LC0G1 íD01u como para qualquer impacto que as administrações de rhGAA tinha no progresso clinico da GSD-II infantil. As avaliações clínicas genéricas incluíam exames físicos de rotina, suplementados por análises químicas e clínicas completas de urina, hematológica (electrólitos, glucose, creatinina, BUN, C02, proteína, albumina, ALT, AST, bilirrubina, fosfatase alcalina, CK e isozima, ácido úrico), Exaustivas avaliações neurológicas e da função motora incluíam teste da força muscular, teste de desenvolvimento de Denver, e AIMS (Escala Motora Infantil de Alberta; ver Piper, M. C. e Darrah, J., Motor Assessment o£ de Developíng Infant, WB Sanders Company, Filadélfia, 1994). Foram utilizados ecocardiografia bidimensional em Modo-M e Doppler para avaliar a massa ventricular esquerda, a espessura da parede e as funções sistólicas, bem como as diastólicas. Além disso, uma variedade de funções pulmonares (capacidade vital de choro, tendência da oximetria de pulso e a medição da pressão expiratõria final do dióxido de carbono, bem como a manobra de força inspiratória negativa) foram monitorizadas por toda a duração do estudo. No final da fase de tratamento de 13 semanas, foram determinadas a actividade da GAA, os níveis de glicogénio e a histopatologia das biópsias dos músculos obtidas dos músculos quadríceps da coxa contra-lateral das biópsias pré-tratamento. As biópsias dos músculos foram realizadas 3 dias depois da perfusão com rhGAA.

Fonte de enzima: a rhGAA purificada do meio de cultura de células CHO que segregam rhGAA (Van Hove, J. L. K, et al ., Proc. Natl. Acad. Scí. EUA 93:6570 (1996)) foi 20 fornecida como uma solução incolor O ·» cri v» a r-' l C' s ί-/-^ "1 y“i ^ r*\ 7v7r\ ·»- o \ T rn r* A-tf'w'-*- W s- / f O* * J.^ " f , estéril, grau GMP, O O 7\ 1 <::» v ci n ri ιϋ ί--· Ή ·ν ·ί a y iii i Λ _L v J L V*· i i —í. A. Is J_ _J_ V -s., í pela C.ri t-p NW20, Research Triangle Parle, Carolina do Norte 27709. A rhGAA foi inicialmente purificada como a proteína precursora 110-kD com actividade enzimática específica de 2,77-3,02 μmol/min/mg de proteína. ELISA para anticorpos anti-rhGAA: o ELISA para anticorpos anti-rhGAA foi um ensaio "sanduíche" padrão realizado pela Phoenix International Life Sciences, Inc. (Saint-Laurent, Quebeque). Em resumo, placas de microtitulação foram revestidas com rhGAA a 2,0 pg/mL de um dia para o outro e depois bloqueadas com IgG bovino. O soro do doente, diluído a 1:100 e depois diluído serialmente a 1:2 foi feito reagir com a rhGAA na placa. A quantidade de anticorpo ligado foi detectada com uma peroxidase do rábano silvestre conjugada com anticorpo secundário anti-humano de cabra e substrato de tetrametilbenzidina medindo as absorvâncias a 450 nm. As amostras positivas foram definidas como tendo uma absorvância que era superior ao limiar negativo. Isto foi definido como duas vezes o valor A450 do controlo negativo do soro humano normal. A titulação foi definida como a diluição do soro que ainda tinha uma leitura de A450 acima do valor limiar negativo.

Actividade de GAA, teor de glicogénio e análise pela técnica Western blot: a actividade de GAA foi avaliada por meio de medição da clivagem de 4-metil-umbeliferil-a-D-glícosido a um pH 4,3 conforme descrito anteriormente (Reuser, A. J. J. et al. , Anm. J. Hum. Genet. 30:132-143 (1978)). Como padrão interno, a actividade da β-galactosidase ácida foi testada de fornia semelhante com o 21 derivado de 4-metil-umbeliferilo como substrato (Wenger, D. A. 0 Williams, c , Scxs0^7i.nçj Γο.ϊγ J.jrsosoííjíj 1 discr^^r^'1 Hommes, F. A.. (ed,), Technigues in diagnostic human biochemical genetics: a laboratory manual, Wiley Liss, Nova Iorque, 1991, pp. 587-617). 0 teor de glicogénio foi determinado pelo tratamento de extractos de tecido com amiloglucosidase de A. niger e a medição da libertação de glucose (Van Hove, J. L. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 93:65-70 (1996)). A análise pela técnica Western blot foi realizada com anticorpos desenvolvidos em coelhos contra GAA de placenta purificada (Van Hove, J. L, K. et al., supra).

Histologia: Uma amostra de músculo foi montada num mandril com goma de tragacanto e congelada rapidamente em isopentano arrefecido por azoto líquido. Foram obtidas secções de cinco míerones e coradas com hematoxilina e eosina, tricromo de Gomori modificado, ATPase a pH 4,35 e 9,4, nicotinamida-desidrogenase tetrazólio redutase azul e fosforilase. Uma segunda amostra foi fixada in si tu e colocada em glutaraldeído a 2,5%. O tecido foi processado sem coloração en bloe com acetato de uranilo a fim de evitar a perda de glicogénio. Secções de semitina (0,5 míeron) foram coradas com azul de toluídina e secções finas foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e montadas numa grelha de cobre para microscopía electrónica.

RESULTADOS

Reacção do Doente ao Tratamento: Os três doentes dom a doença de Pompe infantil receberam perfusões intravenosas de rhGAA duas vezes por semana durante 21-25 meses. Não ocorreram reacções alérgicas sérias durante a 71 terapêutica enzimãtica, No entanto, três episódios de 'ririipçlío cutclnsci ci c o mp ?. n h. 5. d. o s poi~ urris fetirs susvs -3 irritabilidade aumentada ocorreram em dois dos doentes (o doente 1, dois episódios; o doente 2, um episódio).. Estes sintomas foram prontamente resolvidos depois da administração intravenosa de difenhidramamina. Depois de um segundo episódio de erupção cutânea, o doente 1 foi pré-medícado com difenhidramamina oral imediatamente antes de todas as perfusões subsequentes de rhGAA, sem outros episódios. 0 doente 2 foi igualmente pré-medicado com difenhidramamina oral imediatamente antes de todas as perfusões subsequentes de rhGAA, sem outros episódios. Os parâmetros hematológicos múltiplos, as funções do fígado, as funções renais e a urinãlise estiveram todos na faixa normal durante todo o período da terapêutica em todos os doentes tratados,

Foram detectados anticorpos anti-rhGAA da classe IgG nos doentes 1 e 2 apenas 3 semanas depois do início da terapêutica com enzima (Figs., 1A-1C) „ As titulações de anticorpo anti-rhGAA aumentaram para 1:1600 pela semana 16 no doente 1 (Figura IA) e para 1:6400 - 1:12800 entre as semanas 11-19 no doente 2 (Fig. 1B.) À medida que as titulações de anticorpo anti-rhGAA aumentaram, observamos que as melhoras clínicas (observada anteriormente durante a terapêutica) jã não estavam a progredir. Tampouco foram detectados efeitos inconvenientes ou anticorpos anti-rhGAA no doente 3 (Fig. 1C).

Estado cardíaco: Antes do início da terapêutica enzimãtíca, os doentes 1 e 2 tinham cardiomiopatia hipertrófica grave associada com uma massa ventricular esquerda (LV) aumentada, espessamento concêntrico da parede 23 ventricular e uma redução em tamanho da cavidade vem ( 1? ‘1 rr ^ D ti r* ·=! '< -! =) H (ÍSI H r-v í-í /Λ r-t +- rfS O rtS r* f- *1-Ϊ r t. r-M ι ? i*i ríj \ Λ, ria ^ *1 ώ* J fn>\ '•«•Λ V lHb· A. (4 ^aa-V W >Ίι»- & J U? **y«* |â«* ’w* ^a Ι*·1 V ÍrL lW^ Lí ^a·^ hU \a*· obliterada no final da sístole). Todas estas características são tipicamente observadas no doente não tratado portador da doença de Pompe na forma infantil., Além disso, observou-se que o doente 2 tinha uma fracção de ejecção do ventrículo esquerdo (LV> aumentada (fracção de encurtamento, 84%) que reflecte um encurtamento hiperdinâmico.. No entanto, nenhum do doentes tinha qualquer evidência de obstrução do tracto de fluxo de saída ventricular, Os dados ecocardiogrãficos longitudinais avaliados nos doentes durante os 3 primeiros meses da terapêutica com rhGAA estão apresentados nas Figs, 2A-2C, Durante o período de tratamento, tanto no doente 1 como no doente 2, os volumes diastólicos terminais e sistólicos terminais do LV (medições em 2-D) aumentaram progressivamente e até a quase 2-3 vezes no final de 3 meses de terapêutica, em comparação com aqueles medidos durante a frase de pré-tratamento (Figs. 2A e 2B, respectivamente). Aumentos similares foram observados por análise em modo-M (dados não apresentados). As medições bidimensionais de massa do LV (Figs. 2D-2F) inicialmente aumentaram à medida que os volumes do LV diminuíram, mas, em seguida diminuíram de forma constante durante a terapêutica, a um volume que era inferior ao da massa de LV do pré-tratamento (reduzido a 60-70% dos níveis de pré-tratamento da linha de base) O aumento inicial em massa foi muito provavelmente devido a um aumento no volume do LV, sem quaisquer mudanças na espessura da parede do LV. Estas melhoras como um todo nos parâmetros cardíacos foram sustentadas pela avaliação de acompanhamento mais recente, embora o doente 1 necessitasse de uma perfusão intensa u.xciiic* uc 6Πώ1 iuci GUl*cinL.c _l u \xxao ^u.ai.iú.G ct maooa vuvJ u v u j.hiiu aumentado mais e a função cardíaca comprometida na altura de uma pneumonia virai- Caso contrário, a função ventricular de ambos os doentes tinha sido normal e permaneceu normal até um acompanhamento mais recente. Deste modo, a morbilidade cardíaca progressiva normalmente observada em doença de Pompe infantil não tratada foi claramente evitada. 0 doente 3 tinha uma massa de LV de 64 g/β2 (limites normais superiores de 65) mas ao contrário da avaliação cardíaca de linha de base normal no início da terapêutica e tem continuado a ser normal (com massa de LV agora de 33 g/β2) desde os 7 meses após a terapêutica.

Função pulmonar: Nos primeiros 2 meses de terapêutica, a melhora da função pulmonar era evidente na capacidade vital do choro (melhoras superiores a 28% e 70% nos doentes 1 e 2, respectivamente) em relação às capacidades da linha de base, e a normalização da desnaturação de 02 durante o choro (desnaturação de 02 de 70% no doente 1 e de 81% no doente 2 durante o choro máximo). A força muscular respiratória diminuída era também evidente no doente 1 antes da terapêutica por uma manobra de força inspiratória negativa (NIFM) de -45 cm de H20. Com o tratamento a NIFM aumentou para -55 cm de H20, As melhoras iniciais observadas nas funções pulmonares de ambos os doentes, no entanto, culminaram, durante os próximos 2-3 meses e declinaram subsequentemente, concomitantemente com a subida dos anticorpos anti-rhGAA.. Ambos os doentes subsequentemente tornaram-se dependentes 25 de ventiladores depois de episódios de pneumonia virai que v·*, * T ,**, , > £ ·> r*l' A, »-\ /“1 "ϊ Ί·'·* “> »“*, Ί·“ Ί ^ jy i- c. v-- j- jy J* L- \-i ct x. c o y i j. u l· u i, i ti ί 0 doente 3 tinha uma função pulmonar normal no início da terapêutica e continuou a demonstrar função pulmonar normal no teste do acompanhamento mais recente.

Avaliação do desenvolvimento neurológico e motor: A Escala Motora Infantil de Alberta (AIMS) foi utilizada para avaliar o desenvolvimento motor destas crianças. As pontuações AIMS para todos os 3 doentes começaram no 5o percentil por idade (Figs, 1A-1C), 0 doente 1 permaneceu abaixo do 5o percentil mas apresentou aumentos nesta faixa antes de começar a declinar na semana 13 da terapêutica (Fig. IA) . 0 doente 2 aumentou para o 25° percentil pela semana 5, caiu para permanecer abaixo do 5° percentil depois da semana 7 apesar de melhorar as habilidades, em seguida apresentou um rápido declínio e perda de habilidades entre a semana 13 e 17 (Fig. 1B} . 0 aparecimento dos declínios clínicos, uma vez mais, foi concomitante com a elevação dos anticorpos anti-rhGAA (Figs. ΙΑ, 1B).

Avaliações neurológicas e de Desenvolvimento de Denver administradas simultaneamente ao doente 1 mostraram domínios de desenvolvimento pessoal-social e de linguagem normais e bom desenvolvimento motor com atraso total em curso mas a melhorar até a semana 10 quando culmina e a subsequente regressão torna-se evidente. Além disso, as habilidades motoras totais tinham apresentado um progresso significativo até a semana 10 mas nunca alcançaram o normal. 0 doente 2 apresentou um ligeiro atraso de desenvolvimento na esfera motor total apenas com a retenção 26 de habilidades de desenvolvimento normal nos domínios ΠΙΟ £ ΟΙΓ, pS S SOOi SOC X oi 0 cis 1 1. P± Cf 1_i 0. Cj 0 ni ^ t- á O, r·^ ^pman.3C! 1 Ί 1 ^ quando ocorreu a regressão. Actualmente, ambos os doentes têm desenvolvimento pessoal-social normal para a idade, mas atraso em todos os outros domínios, 0 doente 3 apresentou um aumento regular na pontuação AIMS, elevando acima do 10° percentil pela semana 11 da terapêutica e elevando acima do 25° percentil pela semana 20 (Fig. 1C) e 90° percentil no acompanhamento mais recente. Aos 9 meses de idade, ficava sentado sozinho, gatinhava com a barriga reciprocamente para mobilidade e mantinha-se de pé seguro pelas mãos. Extraordinariamente, ele tem caminhado independentemente desde os 12 meses de idade e tem sido capas de mover-se entre agachar e ficar de pé sem o uso das mãos desde os 14 meses de idade.

Actualmente, ele tem também avaliações de desenvolvimento neurológico e de Denver normais para a idade, em todos os domínios,

Actívidade de GAA no músculo e teor de glicogénio: As biópsias dos músculos foram realizadas na linha de base 1 semana antes do início da terapêutica com rhGAA, excepto no doente 1 que teve uma biópsia realizada na altura do diagnóstico, que foi 2 meses antes do início da terapêutica com rhGAA. Depois de 4 meses de terapêutica com rhGAA, foram obtidas biópsias dos músculos do quadríceps contra-lateral 3 dias depois da perfusão com enzima {nível mínimo). Com o tratamento com rhGAA a actívidade de GAA aumentou 2-3 vezes em relação aos níveos do pré-tratamento da linha de base tanto no doente 1 como no doente 2, e 18 vezes no doente 3 (Tabela 3}. 27

Tabela 3 - Actividade de u-glucosidase Ácida em Músculo e Teor de Glicogénio em Pompe Infantil

Doentes com a Doença Tratados com rhGAA

Actividade de GAA nmole/hr/mg de Proteína Teor de Glicogénio % em peso húmido Doente 1 Pré-terapêutica 0,41 5,90% Pós-terapêutica 0,95 7,50% Doente 2 Pré-terapêutica 0,67 5,68% Pós-terapêutica 1,97 4,43% Doente 3 Pré-terapêutica 0,1 5,13% Pós-terapêutica 1,34 1,43% Controlo 23,92+/-8,63 0,94+/-0,55% (limite normal superior; 1,5%) 0 nível absoluto da actividade de GAA aproximou·-se de 8% observado em músculos normais. Não houve alterações apreciáveis no teor de glicogénio no músculo nos doentes 1 e 2, mas os níveis de glicogénio foram reduzidos para a gama normal no doente 3.

Histologia: As biópsias do pré-tratamento de todos os doentes apresentaram uma vacuolização acentuada das fibras do músculo nas secções congeladas. A avaliação das secções de semitina demonstrou que as fibras expandiram peio giicogénio com a formação de lagos de glicogénio. Em algumas fibras podiam ser discernidos perfis fracos de membranas residuais. A microscopia electrónica confirmou a presença de glicogénio tanto nos lisosomas expandidos como soltos no citoplasma, A biópsia do doente 3 tinha mais glicogénio restante no interior dos lisosomas do que os outros dois doentes (dados não ilustrados).

As biópias de 4 meses após o tratamento dos doentes 1 e 2 eram semelhantes às biópsias do pré-tratamento em termos de acumulação de glicogénio. No entanto, a biópsia do pós-tratamento do doente 3 tinha uma diminuição acentuada em glicogénio visível e essencialmente uma histologia normal ma maioria das fibras de músculo. A microscopia electrónica mostrou que muitos lisosomas distendidos remanescentes eram empobrecidos de glicogénio. Permaneceram alguns lagos de lisosomas e glicogénio rico em lisosomas„

Análise pelo método Western blot A fim de investigar porque os anticorpos anti-rhGAA desenvolveram nos doentes 1 e 2, mas não no doente 3, realizamos uma análise pelo método Western blot específica para a detecção da proteína de GAA expressa (mas não funcional) em fibroblastos derivados de cada um dos doentes. Não foi detectada a proteína GAA nos fibroblastos dos doentes 1 e 2, ao passo que foi encontrada uma forma de precursor prontamente detectãvel da proteína de GAA (110 kD) no doente 3. Estes padrões foram anteriormente observados em outros doentes com GSD-II infantil (Van der Ploeg, A. 1, et al,, Am. J, Hum. Genet. 44:787-793 (1989)). 29

Espera-se que os fibroblastos normais tenham a proteína GAA predominantemente de 95 kD e 76 kD.

ESTUDOS ADICIONAIS

Mais três doentes foram inscritos num estudo adicional. Todos os três são CRIM positivo. Depois do tratamento (10 mg/quilograma de peso corporal, perfusão intravenosa semanal de rhGAA) durante 3-6 semanas, foram observadas melhoras na função do coração, na força muscular e no desenvolvimento motor.

Lisboa 28/02/2007

Claims (11)

1. reivindicações 1. α-glucosidase ácida humana produzida em cultura de células de ovário de hamster chinês como um medicamento para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo II, ou para o tratamento de cardiomiopatia associada com a doença de armazenamento de glicogénio tipo II.
2. 2. Medicamento de acordo com a reivindicação 1, em que a doença de armazenamento de glicogénio tipo II é a doença de armazenamento de glicogénio tipo II infantil, doença de armazenamento de glicogénio tipo II juvenil ou doença de armazenamento de glicogénio tipo II de aparecimento na idade adulta.
3. 3. Medicamento de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que α-glucosidase ácida humana é proporcionada numa forma adequada de administração de menos de 15 mg de α-glucosidase ácida por quilograma de peso corporal.
4. 4. Medicamento de acordo com a reivindicação 3, em que a α-glucosidase ácida humana é proporcionada numa forma adequada de administração de menos de 1 a 10 mg de α-glucosidase ácida por quilograma de peso corporal.
5. 5. Medicamento de acordo com a reivindicação 4, em que a α-glucosidase ácida humana é a α-glucosidase ácida humana recombinante.
6. 6. Medicamento de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o medicamento é administrado a um intervalo regular, que é, por exemplo, 7 mensalmente, bimensalmente, semanalmente, duas vezes por semana, diariamente.
7. 7. Medicamento de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o medicamento é preparado para ser administrado por meio de uma via seleccionada de intravenosa, intramuscular, intratecal e intraventricular,
8. 8. Medicamento de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o medicamento compreende ainda um imunossupressor.
9. 9. Medicamento de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o medicamento é uma preparação associada da α-glucosidase ácida humana e um imunossupressor para administração da α-glucosidase ácida humana em associação com ou subsequente ao imunossupressor.
10. 10. Utilização da α-glucosidase ácida humana produzida em cultura de células de ovário de hamster chinês para a preparação de um medicamento para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo 11, ou para o tratamento de cardiomiopatia associada com a doença de armazenamento de glicogénio tipo II num indivíduo.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o medicamento é de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9. Lisboa, 28/02/2007