CN105214076B - 溶酶体贮积病酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有特定糖基化模式以内化至靶细胞中的重组人溶酶体酸性脂酶的组合物，包含编码人溶酶体酸性脂酶的核酸的载体，用所述载体转化的宿主细胞，包含重组人溶酶体酸性脂酶的药物组合物，和治疗与溶酶体酸性脂酶缺乏相关的病况的方法。

Description

溶酶体贮积病酶
本申请是申请日为2011年4月23日、申请号为201180031009.3、发明名称为“溶酶体贮积病酶”的中国发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2010年4月23日提交的美国临时申请No.61/343,177、2010年5月26日提交的美国临时申请No.61/396,376、2010年9月9日提交的美国临时申请No.61/403,011、2010年10月29日提交的美国临时申请No.61/456,014、2011年1月13日提交的美国临时申请No.61/432,372的权益。将上述申请的全部教导通过引用并入本文。
发明背景
溶酶体酸性脂酶(LAL)缺乏是极罕见的溶酶体贮积病(LSD)，其特征在于因该酶的缺乏而不能在溶酶体中分解胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TAG)。LAL缺乏与在许多组织和细胞类型具有底物积累的其它溶酶体贮积症相似。在LAL缺乏中，底物积累在网状内皮系统的细胞(包括肝中的肝巨噬细胞、脾中和小肠的粘膜固有层中的组织细胞)中是最显著的。网状内皮细胞表达巨噬细胞甘露糖/N-乙酰葡糖胺受体(也称为巨噬细胞甘露糖受体或MMR、CD206)，其介导具有以GlcNAc或甘露糖终止的N-聚糖的蛋白质的结合、细胞摄取和溶酶体内化，并且提供此类至关重要的细胞类型的酶缺乏的潜在校正的途径。
LAL缺乏是多系统疾病，其最常见地表现出胃肠、肝和心血管并发症，并且与显著的发病率或死亡率相关。LAL缺乏的临床效应因脂质材料在许多组织的溶酶体中大量积累以及胆固醇和脂质动态平衡机制的深度扰乱(包括肝胆固醇合成的显著增加)而引起。LAL缺乏呈现至少两种表型沃尔曼病(Wolman disease)(WD)和胆固醇酯沉积病(CESD)。
沃尔曼病是LAL缺乏的最具侵袭性的呈现。该表型的特征在于胃肠和肝表现，包括生长不足、吸收不良、脂肪泻、严重的体重减轻和肝肿大。沃尔曼病进展迅速并且在生命的第一年内通常是致命的。案例报告综述显示超过12月龄的存活对于在生命的第一年中呈现因LAL缺乏而引起的生长不足的患者是极罕见的。在该最具侵袭性的形式中，生长不足是主要临床特征并且是早期死亡率的主要促因(contributor)。如通过肝增大和转氨酶的升高证明的肝损害在婴儿中也是常见的。身体检查发现(Physical finding)包括具有肝肿大和脾肿大的腹胀，并且放射照相检查通常显示肾上腺的钙化。实验室评估典型地显示升高的血清转氨酶的水平及缺乏或显著减小的LAL酶活性。还可在患者中看到胆固醇和甘油三酯的升高的血液水平。
沃尔曼病的目前治疗选择极其有限。向具有发热和/或感染迹象的婴儿施用抗生素。可处方肾上腺功能减退的类固醇替代疗法和专门化营养支持，然而无证据表明这些干预能预防死亡，目前还不清楚它们是否对短期存活具有影响。在一系列4名利用骨髓移植治疗的具有LAL缺乏的患者中，所有4名患者在移植的数月内死于该过程的并发症。
具有LAL缺乏的患者还可在以后的生活中呈现显著的肝和心血管损害，这通常称为胆固醇酯沉积病(CESD)。在CESD中，肝严重地受到显著的肝肿大、肝细胞坏死、转氨酶的升高、肝硬化和纤维化的影响。由于CE和TG的水平升高，高脂血症和加速的动脉粥样硬化也见于LAL缺乏。特别地，脂肪沉积物在动脉壁上的积累在生命早期已被描述。沉积使动脉腔变窄，并且可导致血管阻塞，从而增加包括心肌梗塞和中风的重大心血管事件的风险。CESD的表现是高度可变的，一些患者一直未确诊直至在成人晚期表现出并发症，然而其他患者在儿童早期已呈现肝功能障碍。CESD与缩短的寿命和明显的不健康相关；患有CESD的患者的预期寿命取决于相关并发症的严重度。
用于CESD表型的目前治疗选择聚焦在通过排除富含胆固醇和甘油三酯的食物的饮食和通过施用降胆固醇药抑制胆固醇合成和载脂蛋白B产生来控制脂质积累。虽然可见一些临床改善，但潜在的疾病表现继续存在并且疾病进展仍然存在。
在大多数案例中，LAL缺乏的疗法需要终身治疗。此外，由于蛋白质治疗剂的高成本，期望施用最少的有效量的治疗剂来治疗LAL缺乏。然而，迄今为止，还没有治疗LAL缺乏，特别地患有沃尔曼病和CESD的患者的有效疗法。因此，存在对利用具有最低的施用频率以改善患者的生活质量的有效疗法的强烈需要。还存在对高表达且强劲的蛋白质生产平台的需要，所述蛋白质生产平台可产生稳定的并且高效地靶向患者的患病组织细胞中的溶酶体区室的LAL蛋白。
发明概述
本文公开了特别适合用于疗法、例如用于与LAL缺乏相关的病况的治疗的LAL的组合物。本文中描述的LAL分子包含特定的聚糖结构，当施用至受试者例如人受试者时该结构提供至细胞的溶酶体内的高效且快速的摄取。
在一个方面，本文中公开的组合物包含人LAL，其中相当高百分比的人LAL包含至少一个甘露糖-6-磷酸聚糖部分，其可用作为用于通过在例如肝细胞上发现的细胞表面上的甘露糖-6-磷酸受体内化的配体。在一个实施方案中，组合物中包含的LAL的30％或更多，例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％包含至少一个甘露糖-6-磷酸部分。甘露糖-6-磷酸部分可见于例如位于选自SEQ ID NO:2的Asn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300的一个或多个残基上的N-聚糖结构上。
在另一个方面，本文中公开的组合物包含人LAL，其中相当高百分比的人LAL在任何其N-聚糖结构中不包含唾液酸部分，这有时可干扰酶至细胞中的内化。在一个实施方案中，15％或更少，例如10％或更少，5％或更少，2％或更少，1％或更少或基本上无包含于组合物中的LAL在任何其N-聚糖结构中包含唾液酸部分。
在另一个方面，本文中公开的组合物包含人LAL，其中相当高百分比的人LAL在任何其N-聚糖结构中不包含岩藻糖部分。在一个实施方案中，包含于组合物中的LAL中的50％或更少，例如，50％或更少，40％或更少，30％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，2％或更少，1％或更少包含岩藻糖部分，或包含于组合物中的LAL基本上在任何其N-聚糖结构中不包含岩藻糖部分。
在另一个方面，描述了适用于产生含LAL的组合物的载体、宿主细胞、表达系统和相关方法。
通常，本文中讨论的和公开的本发明的LAL为人LAL。在一个实施方案中，包含LAL的组合物包括具有如下氨基酸序列的成熟LAL：
SGGKLTAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPVVFLQHGL
LADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPAS
INFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDH
LIKDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTS
VQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNIL
LTQITNLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ(SEQ ID NO：2).
在另一个实施方案中，成熟LAL具有氨基酸序列：
GKLTAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPVVFLQHGLLA
DSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASIN
FILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLI
KDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQ
NMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLT
QITNLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ(SEQ ID NO：3).
在另一个实施方案中，成熟LAL具有氨基酸序列：
TAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPVVFLQHGLLADSS
NWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFIL
NKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDL
FGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNML
HWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQIT
NLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ(SEQ ID NO：4).
在另一个实施方案中，成熟LAL具有氨基酸序列：
AVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPVVFLQHGLLADSSN
WVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILN
KTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLF
GDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLH
WSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQITN
LVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ(SEQIDNO：19).
在另一个实施方案中，成熟LAL为选自：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19的至少2种多肽的混合物。
本发明还提供了下述组合物，其包含各类型的有用的蛋白质分子例如本文中公开的那些蛋白质的分离的混合物，其中混合物中包含的蛋白质分子的一种或多种具有连接的特殊寡糖结构，特别地，本文中公开的寡糖结构。例如，本发明提供了LAL分子的分离的混合物，例如包含利用下列结构A-n至O-n的一种或多种糖基化的LAL分子的人LAL分子：
Figure BDA0000779217090000051
正方形＝N-乙酰葡糖胺
实心正方形＝甘露糖-6-磷酸
圆圈＝甘露糖
实心圆圈＝半乳糖
实心三解形＝岩藻糖
根据本发明的一个方面，组合物包含任何分离的单一上述多肽或所述多肽的组合。在一个实施方案中，组合物可以是药物组合物，例如，还包含药学上可接受的载体的制剂，以便组合物例如适用于向受试者(例如，人，特别地患有或经诊断患有病况的患者)施用。可以以许多方式(包括通过静脉内施用)来施用组合物。在另一个实施方案中，组合物还包含第二试剂。这样的试剂可以是药剂，或当施用至受试者时可影响或改变生物过程的试剂。例如，第二试剂可以是免疫调节剂。此类免疫调节剂可包括下述任何试剂，所述试剂当与本文中描述的任何LAL组合物一起施用(即，同时或之前或之后立即施用)时，可具有减小LAL组合物在受试者中的免疫原性的作用(例如，利妥昔单抗或任何其它耗尽B细胞的抗体)。
在最后的方面，公开了用于治疗与LAL缺乏相关的症状的方法和组合物。
本发明的方案如下各项列出：
1.一种组合物，其包含分离的、含有一种或多种N-聚糖结构的人重组溶酶体酸性脂酶(LAL)。
2.根据项1所述的组合物，其中所述LAL基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
3.根据项2所述的组合物，其中所述LAL由SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列组成。
4.根据项3所述的组合物，其中所述LAL在选自SEQ ID NO:2的Asn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300的至少一个位置上被N-连接糖基化。
5.根据项4所述的组合物，其中所述LAL在SEQ ID NO:2的Asn15、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300上被N-连接糖基化。
6.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在SEQ ID NO:2的Asn80、Asn140或Asn252上包含磷酸化甘露糖的N-聚糖结构。
7.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn80上包含磷酸化甘露糖的N-聚糖结构。
8.根据项5所述的组合物，其中与Asn80连接的N-聚糖结构中的至少30％具有磷酸化甘露糖。
9.根据项5所述的组合物，其中与Asn80连接的N-聚糖结构中的至少50％具有磷酸化甘露糖。
10.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn80上包含双磷酸化甘露糖的N-聚糖结构。
11.根据项5所述的组合物，其中与Asn80连接的N-聚糖结构中的至少50％包含双磷酸化甘露糖。
12.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn140上包含磷酸化甘露糖(M6P)的N-聚糖结构。
13.根据项5所述的组合物，其中与Asn140连接的N-聚糖结构中的约10％至约50％包含M6P。
14.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn252上包含磷酸化甘露糖(M6P)的N-聚糖结构。
15.根据项14所述的组合物，其中Asn252上的N-聚糖结构中的至少50％包含M6P。
16.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn80或Asn252上包含高-甘露糖基团的N-聚糖结构。
17.根据项16所述的组合物，其中所述高甘露糖基团包含6、7、8、9或10个甘露糖。
18.根据项17所述的组合物，其中所述高甘露糖-基团包含7、8或9个甘露糖。
19.根据项18所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn80上包含7、8或9个甘露糖的N-聚糖结构。
20.根据项18所述的组合物，其中Asn80上的N-聚糖结构中的至少80％包含7、8或9个甘露糖。
21.根据项18所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn252上包含7、8或9个甘露糖的N-聚糖结构。
22.根据项18所述的组合物，其中Asn252上的N-聚糖结构中的至少70％包含7、8或9个甘露糖。
23.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含在Asn15、Asn140或Asn300上包含末端半乳糖的N-聚糖结构。
24.根据项5所述的组合物，其中与Asn15连接的N-聚糖结构中的约2％至约10％包含末端半乳糖。
25.根据项5所述的组合物，其中与Asn140连接的N-聚糖结构中的低于5％包含末端半乳糖。
26.根据项5所述的组合物，其中与Asn300连接的N-聚糖结构中的低于100％包含末端半乳糖。
27.根据项5所述的组合物，其中所述LAL的Asn51未被糖基化或实质上未被糖基化。
28.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含不具有木糖的N-聚糖结构并且N-聚糖结构中的低于15％包含唾液酸。
29.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含不具有木糖的N-聚糖结构并且N-聚糖结构中的低于10％包含唾液酸。
30.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含不具有木糖的N-聚糖结构并且N-聚糖结构中的低于5％包含唾液酸。
31.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含不具有木糖的N-聚糖结构并且N-聚糖结构中的低于1％包含唾液酸。
32.根据项1所述的组合物，其中所述LAL基本上不包含唾液酸和木糖。
33.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含N-聚糖结构，其中N-聚糖结构中的低于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％包含岩藻糖。
34.根据项1所述的组合物，其中所述LAL不包含岩藻糖。
35.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含N-聚糖结构，其中N-聚糖结构中的至少30％、50％、60％、70％、80％、90％和95％包含磷酸化甘露糖(M6P)。
36.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含N-聚糖结构，其中N-聚糖结构中的至少90％包含磷酸化甘露糖(M6P)。
37.根据项5所述的组合物，其中所述LAL包含如下N-连接糖基化谱：
g)在Asn15上，GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2；
h)在Asn80上，Phos2Man7GlcNAc2；
i)在Asn140上，Phos1Man6GlcNAc2，
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2；
Man3GlcNAc2；
GlcNAc2Man3GlcNAc2；
GlcNAc3Man3GlcNAc2；
GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2；
j)在Asn252上，Man7GlcNAc2，
Man8GlcNAc2，
Man9GlcNAc2，
Phos1Man8GlcNAc2，或
Phos1Man9GlcNAc2；和
k)在Asn300上，GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
GlcNAc4Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2，
GlcNAc5Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2，
GlcNAc6Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2，
其中Man＝甘露糖，
GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，
Phos＝磷酸，
Gal＝半乳糖。
38.根据项1所述的组合物，其中所述LAL在SEQ ID NO:2的Asn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300上被N-连接糖基化。
39.根据项1所述的组合物，其中所述LAL包含选自下列结构的N-聚糖：
Figure BDA0000779217090000091
正方形＝N-乙酰葡糖胺
实心正方形＝甘露糖-6-磷酸
圆圈＝甘露糖
实心圆＝半乳糖
实心三角形＝岩藻糖
40.根据项39所述的组合物，其中所述LAL在种系转基因禽类中产生。
41.根据项40所述的组合物，其中所述LAL从所述种系转基因禽类的输卵管细胞产生。
42.根据项1所述的组合物，其中所述寡糖结构为禽类来源的。
43.根据项42所述的组合物，其中所述禽类为鸡。
44.一种组合物，其包含重组人溶酶体酸性脂酶(LAL)的混合物，所述混合物包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19的至少两种人LAL。
45.根据项44所述的组合物，其中所述人LAL的混合物包含选自下列结构的N-聚糖
Figure BDA0000779217090000101
正方形＝N-乙酰葡糖胺
实心正方形＝甘露糖-6-磷酸
圆圈＝甘露糖
实心圆＝半乳糖
实心三角形＝岩藻糖
46.根据项44所述的组合物，其中所述LAL包含如下N-连接糖基化谱：
a)GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2，分别在SEQ ID NO:2、3、4和19的Asn15、Asn13、Asn10和Asn9上；
b)Phos2Man7GlcNAc2
分别在SEQ ID NO:2、3、4和19的Asn80、Asn78、Asn75和Asn74上；
c)Phos1Man6GlcNAc2，
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2，
Man3GlcNAc2，
GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2
分别在SEQ ID NO:2、3、4和19的Asn140、Asn138、Asn135和Asn134上；
d)Man7GlcNAc2，
Man8GlcNAc2，
Man9GlcNAc2，
Phos1Man8GlcNAc2，或
Phos1Man9GlcNAc2
分别在SEQ ID NO:2、3、4和19的Asn252、Asn250、Asn247和Asn246上；和
e)GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
GlcNAc4Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2，
GlcNAc5Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2，
GlcNAc6Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2
分别在SEQ ID NO:2、3、4和19的Asn300、Asn298、Asn295和Asn294上。
47.一种包含分离的溶酶体酸性脂酶(LAL)分子的组合物，其中所述LAL产生于转基因鸡输卵管细胞中，并且分离自包含编码所述LAL的转基因的转基因鸡的卵清。
48.根据项47所述的组合物，其中所述LAL为人LAL。
49.根据项48所述的组合物，其中所述输卵管细胞为管腺细胞。
50.根据项49所述的组合物，其中所述分离的人LAL包含鸡来源的糖基化模式。
51.一种治疗患有与LAL缺乏相关的病况的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的包含重组人LAL的组合物。
52.根据项51所述的方法，其中所述重组人LAL为如根据项1-33中的一项所述的组合物。
53.根据项51所述的方法，其中所述病况为胆固醇酯贮积病(CESD)。
54.根据项51所述的方法，其中所述病况为沃尔曼病。
55.根据项51所述的方法，其中向所述患者施用约0.35mg/kg至约5.0mg/kg的所述LAL组合物。
56.根据项51所述的方法，其中向所述患者施用约0.35mg/kg至约3.0mg/kg的所述LAL组合物。
57.根据项51所述的方法，其中每7天一次至每45天一次向所述患者施用。
58.根据项51所述的方法，其中每3天一次，每5天一次，每周一次，每两周一次，每20天一次，每28天一次，每30天一次或每1月一次向所述患者施用。
59.根据项51所述的方法，其中每两周一次向所述患者施用约1.0mg/kg至3.0mg/kg的有效剂量。
60.一种制备糖基化人溶酶体酸性脂酶(LAL)的方法，其包括产生包含编码可操作地连接于启动子的人LAL的转基因并且在输卵管细胞中表达所述人LAL的种系转基因禽类，其中所述LAL在所述输卵管细胞中被糖基化并且被储存至由所述转基因禽类所产的硬壳卵中。
61.一种转基因禽类，其产生糖基化人溶酶体酸性脂酶(LAL)。
62.一种卵，其由根据项61所述的转基因禽类所产。
63.一种卵清，其包含由根据项61所述的转基因禽类产生的人LAL。
64.一种载体，其具有编码根据项1所述的人重组溶酶体酸性脂酶的核酸序列。
65.一种宿主细胞，其用根据项64所述的载体转化。
66.一种治疗患有与LAL缺乏相关的病况的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的包含重组人LAL的组合物和向所述患者施用第二治疗剂。
67.根据项66所述的方法，其中所述第二治疗剂为选自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗舒伐他汀和辛伐他汀的降胆固醇剂。
68.根据项66所述的方法，其中所述第二治疗剂为免疫抑制剂。
69.一种药物制剂，其包含与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的根据项1所述的组合物。
70.根据项69所述的药物制剂，其中所述制剂包含至少一种选自脱水柠檬酸三钠、柠檬酸和人血清白蛋白的试剂。
71.根据项69所述的药物制剂，其中在维持于约5.6至约6.2的pH的水溶液中提供所述制剂。
72.根据项71所述的药物制剂，其中将所述制剂维持在5.7至6.1的pH。
结合附图和序列，根据下文中所示的详细描述，本发明的另外的目的和方面将变得更加显而易见。
附图简述
图1描述了人LAL的氨基酸序列。重组hLAL的氨基酸序列显示与天然人LAL的氨基酸序列具有100％的同源性。hLAL的成熟形式以下划线标示。
图2描述了重组hLAL，pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA的rhLAL转基因的核苷酸序列。
图3A和3B描述了pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA及其原病毒(proviral)区域的简图。图3A描述了用于产生图示的转导颗粒的人LAL逆转录病毒表达载体的简图(质粒的DNA序列位于附录A中)。图3A描述了已被整合入基因组的pALVIN-OVRl-I-hLAL-dSA原病毒区域。SINLTR，自身灭活长末端重复(self-inactivating long terminal repeat)；OV DHSIII增强子，卵清蛋白基因的DNase酶超敏位点III；OV内含子；卵清蛋白5'非翻译区和内含子1；hLAL，人LAL cDNA；OV 3'UTR，卵清蛋白基因3'非翻译区；部分gag，部分gag基因；LTR，长末端重复。
图4描述了pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA的核苷酸序列。
图5描述了已被整合入基因组内的pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA原病毒区域的核苷酸序列。
图6描述了pALVIN-OV-l.1-I载体的核苷酸序列。
图7描述了rhLAL适体的核苷酸序列。
图8描述了包括部分卵清蛋白启动子的rhLAL的核苷酸序列。
图9描述了OVR1启动子的核苷酸序列。
图10描述了用于构建pALVIN-OVRl-I-hLAL-dSA载体的步骤的示意图。
图11描述了XLL109的半合子转基因G1后代的血液DNA样品的实时PCR分析。来自半合子G1后代ILL7466的一式两份DNA样品的信号由在第22个循环之前起始ΔRn的增加的曲线指示。显示了两个非转基因后代的曲线；这些曲线在至少34个循环中停留在基线或基线附近。
图12A-D描述了具有ALVIN-OVRl-I-hLAL-dSA转基因的G1鸡的Southern分析。图12A举例说明了整合的转基因的示意图，并且显示了侧翼基因组区域和转基因BlpI位点的已知位置以及侧翼基因组BlpI位点的预测位置。OV启动子探针和hLAL编码序列探针(hLAL探针)的位置通过黑色条棒标示。显示了Southern分析中检测到4.3kb和10.6kb条带的位置以及4.3kb和10.6kb条带的基因组和转基因部分的预测尺寸。图12B举例说明了利用BlpI降解并且利用OV探针探测的基因组DNA的Southern印迹。WT CTRL为从非转基因鸡分离的基因组DNA。G1转基因的ID号标示于泳道上方。分子量标记物的位置和尺寸(kb)示于印迹的左边。检测到的转基因片段(4.3kb)和内源卵清蛋白基因(4.1kb)的位置和尺寸示于印迹的右边。图12C描述了利用hLAL探针探测的Southern印迹。检测到的转基因片段(10.6kb)的位置和尺寸示于印迹的右边。图12D描述了以更大比例描述图12B中显示的图像的部分以显示4.1和4.3kb条带的存在。
图13A描述了ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA转基因的示意图。还显示了预计可被OV探针和hLAL探针检测的ApaLI条带的尺寸。图13B描述了用于确认转基因尺寸的ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA转基因的Southern印迹分析的示意图。利用ApaLI降解并且利用OV探针(左图)或hLAL探针(右图)探测的基因组DNA的Southern印迹。WT CTRL为从非转基因鸡分离的基因组DNA。G1的ID号标示于每个泳道的上方。分子量标记物的位置和尺寸(kb)示于印迹的左边。检测到的转基因片段(OV启动子探针，3.6kb；hLAL探针，3.8kb)和内源卵清蛋白基因(7.7kb)的位置和尺寸示于印迹的右边。
图14描述了转基因鸡的谱系。显示了每只鸡的代数(G0、G1或G2)、标识号、性别和孵化日期。其它G1鸡为其它谱系的鸡。
图15描述了从卵清纯化hLAL的步骤。
图16描述了作为按照本发明产生的LAL中的N-连接糖基化结构被发现的N-聚糖。正方形，N-乙酰葡糖胺；实心正方形，甘露糖-6-磷酸；圆圈，甘露糖；实心圆，半乳糖；和实心三角形，岩藻糖。
图17描述了在SEQ ID NO:1中所示的LAL多肽(箭头)上标示的预测的N-聚糖位点的相对位置。显示了在结构上代表在每个位点上检测到的N-聚糖。正方形，N-乙酰葡糖胺；实心正方形，甘露糖-6-磷酸；圆形，甘露糖；实心圆圈，半乳糖；和实心三角形，岩藻糖。
图18描述了通过N-糖酰胺酶(PNGase)释放的和通过MALDI-TOF分析的磷酸化的N-聚糖。显示了结构。
图19描述了LAL的去磷酸化对N-聚糖的HPAEC-PAD保留时间的作用。利用细菌碱性磷酸酶对按照本发明产生的LAL进行去磷酸化(上图)或不处理所述LAL(下图)。利用HPAEC-PAD分析分析释放的N-聚糖。
图20描述了重组人LAL(SBC-102)和溶酶体标记在此类细胞的溶酶体中的共定位，所述细胞使用顺序扫描模式通过共聚焦荧光显微镜检查。
图21描述了使用巨噬细胞系NR8383通过竞争性结合检验估量的重组人LAL(SBC-102)对GlcNAc/甘露糖受体的结合特异性。
图22描述了重组人LAL在体外在正常细胞和LAL缺乏细胞中的活性。
图23描述了重组人LAL(SBC-102)处理对LAL缺乏大鼠的内脏质量的作用。器官尺寸表示为8周龄时测定的在每周以5mg/kg施用媒介物或SBC-102进行4周后LAL-/-大鼠和LAL+/+大鼠的体重的百分比。
图24描述了在每周以5mg.kg-1施用媒介物或SBC-102进行4周后野生型和LAL缺乏大鼠的体重。剂量施用从第4周开始以菱形突出显示于X轴上。
图25显示在8周龄时测定的在每周以5mg.kg-1施用媒介物或重组人LAL(SBC-102)进行4周后WT和LAL缺乏大鼠的肝胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯的水平。
图26描述了在8周龄时测定的在以指定的水平和方案施用重组人LAL(SBC-102)四周后的LAL缺乏大鼠的体重的百分比增加。
图27显示在8周龄时测定的在以指定的水平和方案施用SBC-102四周后的LAL缺乏大鼠的肝重量，以体重的百分比表示。
图28显示在8周龄时测定的在以指定的水平和方案施用SBC-102四周后的LAL缺乏大鼠的组织胆固醇酯水平。
图29显示每周施用1mg/kg的LAL或每周施用5mg/kg的LAL或每2周施用5mg/kg的LAL的大鼠的体重增长的每日进展。
图30描述了对处理的动物的总体病理学检查，该检查显示肝尺寸和颜色的大体正常化，如可在上图的解剖中看到的，来自LAL处理的大鼠的肝组织的组织病理学显示正常的肝组织学，与在下图中的安慰剂处理的动物的泡沫状巨噬细胞的大量积累形成鲜明对照。
发明详述
定义
本文中提供了某些定义来举例说明和定义用于在本文中描述本发明的各种术语的含义和范围。
如本文中所用，对于制剂、组合物或成分，术语“可接受的”意指对正在接受治疗的受试者的一般健康没有持久的有害作用。
如本文中所用，术语“施用”或其其它词性形式是指向需要治疗的受试者提供本发明的重组人溶酶体酸性脂酶。
“核酸或多核苷酸序列”包括但不限于包含天然核苷碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶的真核mRNA、cDNA、基因组DNA以及合成的DNA和RNA序列。术语还包括具有一个或多个修饰碱基的序列。
如本文中所用，术语“禽类”是指分类学种类ava的生物的任何种、亚种或种族，例如但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、隼、乌鸦和包括驼鸟、鸸鹋和鹤鸵的平胸禽类。术语包括原鸡或鸡的各种已知品系(例如，白色来亨鸡(White Leghorn)、棕色来亨鸡(Brown Leghorn)、横斑洛克鸡(Barred-Rock)、苏赛克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(NewHampshire)、罗得岛鸡(Rhode Island)、澳洲黑鸡(Australorp)、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox、加利福尼亚灰鸡(California Gray))以及火鸡、雉鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟的品系以及通常商业上大量繁殖的其它禽类。其还包括处于所有发育阶段(包括胚胎期和胎儿期)的单个禽类生物体。
“治疗性蛋白”或“药物蛋白”包括全部或部分组成药物的氨基酸序列。
“编码序列”或“开放阅读框”是指当置于适当的调控序列的控制之下时可在体外或体内被转录并且翻译(在DNA的情况下)或翻译(在mRNA的情况下)成多肽的多核苷酸或核酸序列。编码序列的边界通过5'(氨基)端上的翻译起始密码子和3'(羧基)端上的翻译终止密码子来确定。转录终止序列通常位于编码序列的3'。编码序列可在5'和/或3'末端上侧翼连接非翻译区。
“外显子”是指当转录成细胞核转录物时，在通过细胞核剪接除去内含子或间插序列(intervening sequences)后于细胞质mRNA中“表达”的基因的部分。
核酸“控制序列”或“调控序列”是指启动子序列、翻译起始和终止密码子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节区(upstream regulatory domain)、增强子等，这对于给定的编码序列在确定的宿主细胞中的转录和翻译是必要和充分的。适用于真核细胞的控制序列的实例为启动子、多腺苷酸化信号和增强子。并非所有此类控制序列必需存在于重组载体中，只要对于期望的基因转录和翻译是必要和充分的控制序列存在即可。
“可操作地或操作地连接的”是指为了进行期望的功能而产生的编码序列和控制序列的配置。因此，可操作地连接于编码序列的控制序列能够影响编码序列的表达。当DNA聚合酶结合启动子序列并且将编码序列转录成可被翻译成编码蛋白质的mRNA时，编码序列被可操作地连接于细胞的转录调节区或处于所述转录调节区的控制之下。控制序列不一定与编码序列邻接，只要它们用于指导其表达即可。因此，例如，非翻译但仍转录的间插序列可存在于启动子序列与编码序列之间，并且启动子序列仍然可被认为“可操作地连接于”编码序列。
术语“异源的”和“外源的”，当它们涉及核酸序列例如编码序列和控制序列时，是指通常不与重组构建体的区域或不与特定染色体基因座关联(associate)和/或通常不与特定细胞关联的序列。因此，核酸构建体的“外源”区域为另一个核酸分子内的或连接至其的可鉴定的核酸区段，所述核酸区段经发现在自然界中与所述另一个核酸分子无关联。例如，构建体的外源区域可包括侧翼连接有经发现在自然界中与编码序列无关联的序列的编码序列。外源编码序列的另一个实例为其中编码序列本身为非天然发现的(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)构建体。类似地，就本发明的目的而言，利用通常不存在于宿主细胞中的构建体或核酸转化的宿主细胞可被认为是外源的。
如本文中所用，术语"N-聚糖"、“寡糖”、“寡糖结构”、“糖基化模式”、“糖基化谱”和“糖基化结构”在本质上具有相同的含义并且各自指从糖残基形成的并且连接于糖基化蛋白质的一种或多种结构。
如本文中所用，“外源蛋白质”是指非天然存在于特定组织或细胞中的蛋白质，为外源表达构建体或转基因的表达产物的蛋白质，或并非以给定的量天然存在于特定组织或细胞中的蛋白质。对于卵为外源的蛋白质是通常未在卵中发现的蛋白质。例如，对于卵是外源的蛋白质可以是作为存在于产卵动物的转基因中的编码序列的表达的结果而存在于卵中的蛋白质。
“外源基因”是指通常与特定细胞相关的天然存在的基因或其片段。
“LAL”意指“人溶酶体酸性脂酶”、“SBC-102”或“人溶酶体酸性脂酶分子”，并且这些术语在整个本说明书中可互换使用。
本文中描述的表达产物可由具有确定的化学结构的蛋白质性质的材料组成。然而，精确的结构取决于许多因素，特别地对于蛋白质是常见的化学修饰。例如，由于所有蛋白质包含可电离的氨基酸和羧基，因此蛋白质可以以酸性或碱性盐形式或以中性形式获得。可使用糖分子(糖基化)或利用其它化学衍生(包括与例如脂质、磷酸、乙酰基等的共价或离子连接)来衍生(通常通过与糖结合来进行)一级氨基酸序列。此类修饰可体外或体内发生，后者由宿主细胞通过翻译后加工系统来进行。此类修饰可增强或减弱分子的生物学活性，并且此类化学修饰分子也意欲在本发明的范围之内。
克隆、扩增、表达和纯化的可选择的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。代表性方法公开于Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning,a LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中。
“载体”意指由单链、双链、环状或超螺旋DNA或RNA组成的多核苷酸。典型的载体可由以适当的距离操作地连接(以允许功能性基因表达)的下列元件组成：复制起点、启动子、增强子、5'mRNA前导序列、核糖体结合位点、核酸盒、终止和多腺苷酸化位点以及可选择标记序列。在具体应用中可省去此类元件的一个或多个。核酸盒可包括用于插入待表达的核酸序列的限制位点。在功能性载体中，核酸盒包含待表达的核酸序列，包括翻译起始和终止位点。内含子任选地可包含在构建体中，例如，编码序列的5'。构建载体以便特定编码序列位于具有适当的调控序列的载体中，编码序列相对于控制序列如此定位和定向使得编码序列在控制或调控序列的“控制”下转录。编码特定目标蛋白质的序列的修饰可期望用于实现该目的。例如，在一些情况下中，可能必须对序列加以修饰以便其可以以适当的方向连接于控制序列；或维持阅读框。可在插入载体之前将控制序列和其它调控序列连接于编码序列。或者，可将编码序列直接克隆入已包含控制序列和适当限制位点的表达载体，所述限制位点与控制序列在读框中和处于控制序列的调控之下。
“启动子”为DNA上RNA聚合酶与其结合以起始基因的转录的位点。在一些实施方案中，启动子可通过添加或缺失序列，或用可选择的序列(包括天然和合成序列以及可以为合成与天然序列的组合的序列)替代来进行修饰。许多真核启动子包含两种类型的识别序列：TATA盒和上游启动子元件。前者，位于转录起始位点的上游，参与指导RNA聚合酶在正确的位点起始转录，而后者似乎决定转录率并且位于TATA盒的上游。增强子元件还可刺激从连接的启动子转录，但许多增强子元件专门地在特定细胞类型中起作用。衍生自病毒的许多增强子/启动子元件例如SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和鼠白血病病毒(MLV)启动子在广泛的细胞类型中都具有活性，并且称为“遍在的”。或者，非组成型启动子例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子也可用于本发明。插入克隆位点的核酸序列可具有任何编码目标多肽的开放阅读框，前提是其中编码序列编码目标多肽，其应当缺乏可阻断适当的mRNA分子产生和/或产生异常剪接的或异常mRNA分子的隐蔽剪接位点。
如本文中所用，术语“药物组合物”是指本文中描述的化合物与其它化学组分例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。
术语“家禽来源的”或“禽类来源的”是指由家禽产生的或从家禽获得的组合物或物质。“家禽”是指可作为家畜饲养的禽类，包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹌鹑和平胸鸟。例如，“家禽来源的”可指鸡来源的、火鸡来源的和/或鹌鹑来源的。
“逆转录病毒颗粒”、“转导颗粒(transducing particle或transductionparticle)”是指能够将非病毒DNA或RNA转导入细胞的复制缺陷型或具有复制能力的病毒。在一个特别有用的实施方案中，可如2009年4月28日发布的美国专利No.7,524,626中公开的制备用于产生根据本发明的转基因禽类的逆转录病毒颗粒，将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文。
术语“转化”、“转导”和“转染”全都指多核苷酸至禽类胚盘细胞中的引入。“膨大部(Magnum)”为漏斗状器官(infundibulum)与峡之间(含有合成和分泌卵的卵清蛋白的管腺细胞)的输卵管的那部分。
术语“转基因”是指插入根据本发明的禽类基因组的异源核苷酸序列。“转基因”可以特别地指外源编码序列，与外源启动子或其它调控序列连接的外源编码序列，两个逆转录病毒LTR之间和/或逆转录病毒LTR与LTR之间的核苷酸序列之间的所有核苷酸序列，其中LTR是逆转录病毒用于引入转基因的部分。
术语“优化的”用于“优化的编码序列”的背景中，其中卵清蛋白卵清蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白和卵转铁蛋白中发现的每个特定氨基酸的最常使用的密码子被用于设计被插入本发明的载体的优化的人干扰素-α2b(IFN-α2b)多核苷酸序列。更具体地，优化的人IFN-α2b的DNA序列基于母鸡输卵管优化的密码子选择，并且利用从鸡(原鸡)卵清蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白和卵转铁蛋白编译的密码子选择表使用Wisconsin Package,9.1版(GeneticsComputer Group Inc.,Madison,Wis.)的BACKTRANSLATE程序来产生。例如，在4种卵清蛋白中氨基酸丙氨酸的4个密码子的百分比使用为34％(对于GCU)、31％(对于GCC)、26％(对于GCA)和8％(对于GCG)。因此，GCU用作为优化的编码序列中针对大部分丙氨酸的密码子。包含优化的人蛋白质的基因的载体用于产生在它们的组织和卵中表达转基因家禽来源的蛋白质的转基因禽类。
如本文中所用，术语“受试者”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于人、黑猩猩、猿猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等。
如本文中所用，术语“治疗有效量”是指与未曾接受这样的量的相应受试者相比较，导致疾病、病症或副作用的改善的治疗、愈合、预防或缓解，或疾病或病症的进展速度的减小的化合物的任何量。术语还在其范围内包括有效地增强正常生理功能的量。
术语“治疗”或其其它词性形式是指减轻、消除或缓解疾病或病症症状，预防另外的症状，缓解或预防症状的潜在原因，抑制疾病或病况，缓解疾病或病况，阻止疾病或病况的发展，缓解疾病或病况，引起疾病或病况的消退，缓解由疾病或病症引起的病况，或预防性和/或治疗性终止疾病或病况的症状。
LAL组合物
本发明总体上涉及包含对于疗法(例如在溶酶体贮积病的治疗中)有用的酶的组合物。在一个方面，本发明涉及溶酶体贮积病酶(lysosomal storage disease enzymes)，例如具有使得分子易于被某些细胞类型内化的糖基化模式的LAL。本发明中还包括重组人蛋白质，包括以分离或纯化形式存在的LAL。溶酶体贮积病酶(例如LAL)的分离可通过对于蛋白质纯化领域中的技术人员来说是显然易见的方法来实现。
在一个实施方案中，本发明涉及溶酶体贮积病酶，包括但不限于具有本文中描述的N-连接糖基化模式的LAL。
在一个方面，本文中公开的组合物包含人LAL，其中相当高百分比的人LAL包含甘露糖-6-磷酸聚糖部分，其可用作通过在例如肝细胞上发现的细胞表面上的甘露糖-6-磷酸受体内化的配体。在一个实施方案中，包含于组合物中的LAL中的30％或更多，例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％包含至少一个甘露糖-6-磷酸部分。甘露糖-6-磷酸部分可见于例如位于选自SEQ ID NO：2的Asn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300的一个或多个残基上的N-聚糖结构上。包含甘露糖-6-磷酸部分的聚糖结构包括例如图16中显示的G-n和H-n。
根据本发明的重组人LAL包含多个N-连接糖链(例如，约5或6个糖链)。5或6个位点的每一个位点上的N-连接糖基化结构可选自图16中显示的A-n、B-n、C-n、D-n、E-n、F-n、G-n、H-n、I-n、J-n、K-n、L-n、M-n、N-n和O-n之一。
本文中还提供了LAL分子的混合物(例如，超过一种LAL分子可存在于混合物中，例如SEQ ID NO:2、3、4和19中所示的的LAL分子)，其中LAL分子中的一些或全部具有一种或多种选自结构A-n、结构B-n、结构C-n、结构D-n、结构E-n、结构F-n、结构G-n、结构H-n、结构I-n、结构J-n、结构K-n、结构L-n、结构M-n、结构N-n和结构O-n的糖基化结构(图16)。在一个实施方案中，纯化或分离溶酶体酸性脂酶分子的混合物，例如从卵分离或从转基因禽类中产生的卵清纯化或分离所述混合物。
本发明还包括包含结构A-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构B-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构C-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构D-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构E-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构F-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构G-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构H-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构I-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构J-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构K-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构L-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构M-n的单种溶酶体酸性脂酶分子。本发明还包括包含结构N-n的单种LAL分子。本发明还包括包含结构O-n的单种LAL分子。
连接于根据本发明的人LAL的N-连接寡糖缺少末端唾液酸和半乳糖残基。即，仅少量N-连接寡核糖结构被末端唾液酸化，并且几乎不存在半乳糖残基。此外，末端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)广泛地存在于本文中描述的LAL的N连接寡糖结构中。这样，根据本发明产生的LAL可被靶向至细胞例如单核巨噬细胞和肝巨噬细胞。
本发明的一个方面提供了基本上无唾液酸的LAL的组合物。在另一个方面，本文中公开的组合物包含重组人LAL，其中相当大百分比的人LAL在任何其N-聚糖结构中不包含唾液酸部分，其可干扰酶至细胞内的内化。在一个实施方案中，15％或更少，例如，10％或更少，5％或更少，2％或更少，1％或更少或基本上无包含于组合物中的LAL在任何其N-聚糖结构中包含唾液酸部分。
在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约95％或更多不包含唾液酸。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约90％或更多不包含唾液酸。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约80％或更多不包含唾液酸。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中多于约70％或更多不包含唾液酸。
在另一个实施方案中，基本上无存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型包含唾液酸。在另一个实施方案中，发现与本发明的LAL分子连接的N-连接寡糖结构类型中的约90％或更多不包含唾液酸。例如，如果存在20个寡糖结构类型，则18个或更多个结构类型不包含唾液酸。在另一个实施方案中，发现与本发明的LAL分子连接的N-连接寡糖结构类型中的约80％或更多不包含唾液酸。在另一个实施方案中，发现与本发明的LAL分子连接的N-连接寡糖结构类型中的约70％或更多不包含唾液酸。在另一个实施方案中，发现与本发明的LAL分子连接的N-连接寡糖结构类型中的约60％或更多不包含唾液酸。在另一个实施方案中，发现与本发明的LAL分子连接的N-连接寡糖结构类型中的约50％或更多不包含唾液酸。
根据本发明的一个方面，本文中描述的LAL包含高水平的末端N-乙酰葡糖胺。在一个方面，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约95％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约90％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约80％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约70％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约60％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约50％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。
在一个实施方案中，所有存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约90％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。例如，如果存在20个寡糖结构类型，那么18个或更多个结构类型不包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约80％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约70％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约60％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约50％或更多包含末端N-乙酰葡糖胺。
在本发明的另一个方面，本文中公开的组合物包含人LAL，其中相当高百分比的人LAL在任何其N-聚糖结构中不包含岩藻糖部分。在一个实施方案中，50％或更少，例如，50％或更少，40％或更少，30％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，2％或更少，1％或更少或基本上无包含于组合物中的LAL在任何其N-聚糖结构中包含岩藻糖部分。
在一个实施方案中，岩藻糖基本上不存在于根据本发明产生的LAL的N-连接寡糖结构上。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约95％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约90％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约85％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约80％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约70％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的单种LAL分子上的N-连接寡糖中的约60％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖中的约50％或更多不包含岩藻糖。
在一个实施方案中，基本上无存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约95％或更多不包含岩藻糖。例如，如果存在20个寡糖结构类型，那么19个或更多个结构类型不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约90％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约85％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约80％或更多不包含岩藻糖。在另一个实施方案中，存在于本发明的LAL分子上的N-连接寡糖结构类型中的约70％或更多不包含岩藻糖。
如上文中所讨论的，某些单糖大量地存在于根据本发明产生的LAL分子上。所分析的总的单糖种类包括岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。岩藻糖可占总单糖组成的约0％至约1％。N-乙酰半乳糖胺可占总单糖组成的约0％至约1％。N-乙酰葡糖胺可占总单糖组成的约35％至约50％。半乳糖可占总单糖组成的约1-10％。葡萄糖占总单糖组成的0％。甘露糖占总单糖组成的约32％至约50％。甘露糖-6-磷酸占总单糖组成的约1％至约11％。
在一个实施方案中，根据本发明产生的LAL不包含任何木糖。此外，因为根据本发明产生的LAL中基本上不存在N-乙酰半乳糖胺(GalNac)，因此本发明的一个方面包括不具有O-连接糖基化的LAL的组合物。
LAL在其氨基酸序列中具有6个用于N-连接糖基化的潜在位点，例如，SEQ ID NO:1中的Asn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273和Asn321。这些位点中的5个位点Asn36、Asn101、Asn161、Asn273和Asn321被糖基化，然而Asn72可以未被糖基化或大体上未被糖基化(大体上未糖基化意指在LAL分子的混合物中，比Asn36、Asn101、Asn161、Asn273和Asn321的任一个更少的Asn72被糖基化)(参见图17)。因此，本发明的一个方面是在Asn72上未被糖基化和/或大体上未被糖基化的LAL的组合物。具有糖基化的Asn72的LAL在本发明的范围内。本文中描述的Asn的位置基于SEQ ID NO:1中所示的LAL氨基酸序列。对于本领域技术人员来说很明显，Asn的编号(即，天冬酰胺的位置)可根据单种LAL分子而变化，并且在其它LAL分子例如其氨基酸序列示于SEQ ID NO:2、3、4和19中的那些分子中可容易地被确定。
根据本发明产生的LAL分子包含含有以N-乙酰葡糖胺、甘露醇和甘露糖-6-磷酸(M6P)作为主要糖的二-、三-和四天线结构的混合物的N-聚糖结构(图16和17)。根据本发明的一个方面，M6P-修饰的N-聚糖至少存在于Asn101、Asn161和Asn273上。因此，本发明的一个实施方案包括具有存在于Asn101、Asn161或Asn273的任一个上的M6P-修饰的N-聚糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括具有存在于Asn273上的M6P-修饰的N-聚糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括具有存在于Asn101、Asn161或Asn273的任一个上的单磷酸化的N-聚糖(M6P)的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括具有存在于Asn161和Asn273上的单磷酸化的N-聚糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括具有存在于Asn101和Asn273上的单磷酸化的N-聚糖的LAL的组合物。在一个具体的实施方案中，根据本发明产生的LAL可在Asn101上包含双磷酸化的甘露糖(双-M6P)。
根据本发明产生的LAL分子包含降低的水平的半乳糖(例如，“Gal”)。本发明的一个方面包括在Asn36、Asn161或Asn321的任一个上具有末端半乳糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括在Asn36和Asn161上具有末端半乳糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括在Asn161和Asn321上具有末端半乳糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括在Asn36和Asn321上具有末端半乳糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括在Asn36、Asn161和Asn321上具有末端半乳糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括不具有末端半乳糖的LAL的组合物。
在LAL中在不同N-连接糖基化位点上发现多种类型的N-聚糖。N-聚糖结构包括以N-乙酰葡糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸(M6P)作为主要糖的二-、三-和四天线结构的混合物。具体地，在本发明的一个实施方案中，LAL在第一N-连接糖基化位点(例如，如SEQ IDNO:1中的Asn36)上包含选自G1cNAc4Man3GlcNAc2或Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。在另一个实施方案中，LAL在第二N-连接糖基化位点(例如，如SEQ ID NO:1中的Asn72)上不包含糖基化或大体上未被糖基化。在另一个实施方案中，LAL在其第三N-连接糖基化位点(例如，如SEQ ID NO:1中的Asn101)上包含Phos2Man7GlcNAc2。在另一个实施方案中，LAL在其第四N-连接糖基化位点(例如，如SEQ ID NO:1中的Asn161)上包含选自Phos1Man6GlcNAc2、GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2或Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。在另一个实施方案中，LAL在其第五N-连接糖基化位点(例如，如SEQ ID NO:1中的Asn273)上包含选自Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Phos1Man8GlcNAc2或Phos1Man9GlcNAc2的N-聚糖结构。在另一个实施方案中，LAL在其第六N-连接糖基化位点(例如，如SEQ ID NO:1中的Asn321)上包含选自GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2、GlcNAc6Man3GlcNAc2或Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。
根据本发明的某些方面，LAL的组合物包括在SEQ ID NO:1的Asn36、Asn72、Asn101、Asn161或Asn273和Asn321(或SEQ ID NO:2、3、4和19内的相应天冬酰胺残基)上糖基化的LAL，指定的Asn位置上的一个N-聚糖如下文中显示的：
a)在Asn36上，GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2；
b)在Asn72上，无糖基化；
c)在Asn101上，Phos2Man7GlcNAc2；
d)在Asn161上，Phos1Man6GlcNAc2，
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2；
Man3GlcNAc2；
GlcNAc2Man3GlcNAc2；
GlcNAc3Man3GlcNAc2；
GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2；
e)在Asn273上，Man7GlcNAc2，
Man8GlcNAc2，
Man9GlcNAc2，
Phos1Man8GlcNAc2，或
Phos1Man9GlcNAc2；和
f)在Asn321上，GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
GlcNAc4Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2，
GlcNAc5Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2，
GlcNAc6Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2，
其中Man＝甘露糖，
GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，
Phos＝磷酸，和
Gal＝半乳糖。
在一个实施方案中，可发现Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2为根据本发明产生的LAL的Asn36、Asn161或Asn321的任一个上的聚糖成分。在一个具体的实施方案中，可发现Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2为Asn36、Asn161和Asn321上的聚糖成分。
在本发明的LAL中，Asn101和Asn273展示具有约6至约10个甘露糖分子(如本文中描述的MAN6-MAN10)作为主要组分的的高甘露糖类型。因此，本发明的一个方面包括在Asn101或Asn273上具有高甘露糖结构的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明的LAL的组合物可包含在Asn101或Asn273上具有至少6个甘露糖的N-聚糖结构。在另一个实施方案中，LAL的组合物包含在Asn101或Asn273上具有7、8或9个甘露糖的N-聚糖结构。在另一个实施方案中，本发明包括在Asn101和Asn273上具有7、8或9个甘露糖的LAL的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括在Asn101和/或Asn273上具有7、8或9个甘露糖的LAL的组合物并且至少一个甘露糖被磷酸化。
应当理解，糖基化位点和与上述Asn相关的编号基于SEQ ID NO:1中所示的LAL的氨基酸序列，并且上文中所述的SEQ ID NO:1的上下文中的糖基化谱也用于SEQ ID NO:2、3、4和19中所示的LAL分子，虽然相应Asn的编号可根据LAL分子而变化。例如，SEQ ID NO:1中的Asn36对应于SEQ ID NO:2中的Asn15、SEQ ID NO:3中的Asn13、SEQ ID NO:4中的Asn10和SEQ ID NO:19中的Asn9。SEQ ID NO:1中的Asn72对应于SEQ ID NO:2中的Asn51、SEQ ID NO:3中的Asn49、SEQ ID NO:4中的Asn46和SEQ ID NO:19中的Asn45。SEQ ID NO:1中的Asn101对应于SEQ ID NO:2中的Asn80、SEQ ID NO:3中的Asn78、SEQ ID NO:4中的Asn75和SEQ ID NO:19中的Asn74。SEQ ID NO:1中的Asn161对应于SEQ ID NO:2中的Asn140、SEQ ID NO:3中的Asn138、SEQ ID NO:4中的Asn135和SEQ ID NO:19中的Asn134。SEQ ID NO:1中的Asn273对应于SEQ IDNO:2中的Asn252、SEQ ID NO:3中的Asn250、SEQ ID NO:4中的Asn247和SEQ ID NO:19中的Asn246。SEQ ID NO:1中的Asn321对应于SEQ ID NO:2中的Asn300、SEQ ID NO:3中的Asn298、SEQID NO:4中的Asn295和SEQ ID NO:19中的Asn294。
例如，在一个实施方案中，LAL至少在一个选自SEQ ID NO:2的Asn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300的位置上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，LAL在SEQ ID NO:2的Asn15、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:2的LAL的N-聚糖结构不具有木糖，然而少于15％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含唾液酸；少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含岩藻糖；以及至少30％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的N-聚糖结构包含磷酸化的甘露糖(M6P)。S
在一个实施方案中，LAL至少在选自SEQ ID NO:3的Asn13、Asn49、Asn78、Asn138、Asn250和Asn298的一个位置上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，LAL在SEQ ID NO:3的Asn13、Asn78、Asn138、Asn250和Asn298上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:3的LAL的N-聚糖结构不具有木糖，然而少于15％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含唾液酸；少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含岩藻糖；以及至少30％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的N-聚糖结构包含磷酸化的甘露糖(M6P)。
在一个实施方案中，LAL至少在选自SEQ ID NO:4的Asn10、Asn46、Asn75、Asn135、Asn247和Asn295的一个位置上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，LAL在SEQ ID NO:4的Asn10、Asn75、Asn135、Asn247和Asn295上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:4的LAL的N-聚糖结构不具有木糖，然而少于15％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含唾液酸；少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含岩藻糖；以及至少30％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的N-聚糖结构包含磷酸化的甘露糖(M6P)。
在一个实施方案中，LAL至少在选自SEQ ID NO:19的Asn9、Asn45、Asn74、Asn134、Asn246和Asn294的一个位置上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，LAL在SEQ ID NO:19的Asn9、Asn74、Asn134、Asn246和Asn294上被N-连接糖基化。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:4的LAL的N-聚糖结构不具有木糖，然而少于15％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含唾液酸；少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的N-聚糖结构包含岩藻糖；以及至少30％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的N-聚糖结构包含磷酸化的甘露糖(M6P)。
根据本发明的组合物可以以许多方式产生，包括通过使用转基因禽类、转基因鱼、转基因哺乳动物，例如转基因山羊或在转基因植物中，例如烟草和浮萍(浮萍(Lemnaminor))和某些种类的细胞培养物。
本发明还涵盖包含PEG化的LAL的组合物。可如例如2007年4月26日公布的美国专利公布No.20070092486中所公开的，对本文中描述的LAL酶进行PEG化，将所述专利公布的公开内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，通过例如来自禽类输卵管细胞例如管腺细胞的表达专门化表达系统获得衍生的糖基化模式。例如，已显示本文中公开的糖基化模式存在于根据本发明在禽类例如鸡的输卵管细胞中产生的溶酶体贮积病酶上。
根据本发明产生的蛋白质可通过任何有用的方法例如对于蛋白质纯化领域的技术人员来说是显而易见的那些方法来从卵清纯化。例如，可通过对于蛋白质纯化领域的技术人员来说是显而易见的方法从卵清纯化根据本发明在转基因禽类中产生的人LAL(hLAL)。用于存在于卵清中的LAL的纯化方案的实例描述于实施例中。
本发明包括卵和卵清以及产卵和产生包含本发明的溶酶体酸性脂酶分子的卵清的禽类(例如鸡、火鸡和鹌鹑)，所述溶酶体酸性脂酶包含一种或多种本文中公开的糖基化结构。
LAL在禽类中的表达
本文中公开了载体和用于将外源核酸序列稳定地引入禽类的基因组以表达期望的蛋白质的方法，所述蛋白质是例如从甘露糖-6-磷酸的添加获益(例如，获得增强的功效)的那些蛋白质，例如溶酶体酶，包括但不限于溶酶体酸性脂酶(LAL)和其它蛋白质例如本文中特别地公开的那些蛋白质。具体地，产生转基因禽类，所述转基因禽类在它们的输卵管中表达外源序列并且将外源蛋白质例如药物蛋白储存在它们的卵中。包含此类外源蛋白质的禽类的卵也在本文中进行了描述。本文中还公开了在转基因禽类的输卵管中高效表达并且储存在禽类卵中的LAL的新形式。
本发明的一个方面涉及包含LAL即根据本发明产生的LAL分子的组合物。在特别有用的实施方案中，纯化或分离LAL。例如，已从由转基因禽类产的硬壳卵的内容物取出LAL。在一个特别有用的实施方案中，LAL为人LAL。在一个实施方案中，本发明的LAL具有因禽类的输卵管细胞中产生的LAL而导致的糖基化模式。例如，组合物可包含根据本发明在禽类例如鸡中产生的和从卵清分离的LAL分子的混合物。在一个有用的实施方案中，含LAL组合物为药物制剂。
在一个方面，本发明涉及包含分离的LAL分子例如人LAL分子的组合物，其中LAL在包含编码LAL的转基因的禽类中产生。在一个实施方案中，LAL在转基因禽类(例如，转基因鸡)的输卵管细胞(例如，管腺细胞)中产生并且LAL分离自转基因禽类的卵清。在一个实施方案中，LAL在禽类例如鸡的输卵管细胞(例如，管腺细胞)中被糖基化。
在另一个方面，提供了用于在禽类的特定组织中产生外源蛋白质例如溶酶体贮积病酶例如LAL的方法。可在禽类的输卵管、血液和/或其它细胞和组织中表达此类外源蛋白质。在一个实施方案中，将转基因引入胚部胚盘细胞(例如接近X期)以产生转基因禽类，以便目标蛋白在输卵管的膨大部的管腺细胞中表达，分泌至管腔中，然后储存在硬壳卵的卵清中。所产生的转基因禽类可在其种系中具有转基因，从而将外源转基因以孟德尔方式稳定地传递至禽类的后代。
本发明包括在禽类输卵管中产生外源蛋白质例如LAL的方法。所述方法可包括提供包含编码序列和可操作地连接于编码序列的启动子的载体(以便启动子可在禽类输卵管中实现核酸的表达)的第一步骤。可产生转基因细胞和/或组织，其中将载体引入新分离的、培养中的或胚胎中的禽类胚部胚盘细胞，以便将载体序列插入禽类基因组。在其输卵管中表达外源蛋白质例如LAL的成熟转基因禽类可来源于转基因细胞和/或组织。
在本发明的一个方面，转基因禽类的产生可通过利用在逆转录病毒载体的5'与3'LTR之间具有转基因的复制缺陷型或具有复制能力的逆转录病毒颗粒转导胚部胚盘细胞来实现。例如，可使用禽白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体或鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体，所述载体包含含有被插入启动子区域的区段的下游的外源基因的经修饰的pNLB质粒。可将包装入病毒颗粒的经修饰的逆转录病毒载体的RNA拷贝用于感染发育成转基因禽类的胚部胚盘(embryonic blastoderms)。
本发明的另一个方面提供了载体，所述载体以使编码序列在禽类输卵管中表达的操作和位置关系包括编码序列和启动子。此类载体包括但不限于禽白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体和慢病毒载体。此外，载体可以为包括禽白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体或慢病毒载体的LTR的核酸序列。启动子对于实现编码序列在禽类输卵管中的表达是足够的。编码序列编码储存至硬壳卵的卵清中的外源蛋白质。这样，编码序列编码外源蛋白质例如转基因禽类来源的蛋白质例如转基因禽类来源的溶酶体酸性脂酶(TPD LAL)。
在一个实施方案中，本发明的方法中使用的载体包含特别适用于在禽类和它们的卵中表达外源蛋白质的启动子。这样，外源编码序列的表达可在转基因禽类的输卵管和血液中以及其禽类卵的卵清中发生。启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、β-肌动蛋白启动子(例如，鸡β-肌动蛋白启动子)、鼠白血病病毒(MLV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、卵清蛋白启动子、溶菌酶启动子、伴清蛋白启动子、卵类粘蛋白启动子、卵粘蛋白启动子和卵转铁蛋白启动子。任选地，启动子可以为至少一个启动子区域的区段，例如卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和卵转铁蛋白启动子区域的区段。在一个实施方案中，启动子为一种或多种启动子的组合或融合物或一种或多种启动子例如卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和卵转铁蛋白启动子的部分的融合物。
在一个实施方案中，载体包括可操作地连接于编码序列的信号肽，以便在细胞中翻译后，信号肽指导由载体表达的外源蛋白质例如人LAL分泌至硬壳卵的卵清中。
本发明的一个方面提供了如本文中所公开的产生的外源蛋白质的编码序列，其中编码序列经密码子优化以用于在禽类中例如在鸡中表达。可根据至少一种，优选超过一种在禽类细胞(例如，鸡细胞)中表达的蛋白质的密码子选择来确定密码子优化。例如，可根据编码鸡的蛋白质卵清蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白和卵转铁蛋白的核酸序列来确定密码子选择。例如，编码外源蛋白质的序列的DNA可使用Wisconsin Package,9.1版(Genetics ComputerGroup,Inc.,Madison,WI)的
Figure BDA0000779217090000351
程序，利用从鸡(原鸡)卵清蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白和卵转铁蛋白编译的密码子选择表来进行密码子优化。
本发明的一个重要方面涉及禽类硬壳卵(例如，鸡硬壳卵)，其包含外源肽或蛋白质，包括但不限于人LAL。外源肽或蛋白质例如人LAL可由转基因禽类的转基因编码。通常，外源肽或蛋白质(例如，LAL)被糖基化。蛋白质可以以任何有用的量的存在。在一个实施方案中，蛋白质以在约0.01μg/硬壳卵至约1克/硬壳卵的范围内的量存在。在另一个实施方案中，蛋白质以在约1μg/硬壳卵至约1克/硬壳卵的范围内的量存在。例如，蛋白质可以以在约10μg/硬壳卵至约1克/硬壳卵的范围内(例如，约10μg/硬壳卵至约400毫克/硬壳卵的范围)的量存在。
在一个实施方案中，本发明的外源蛋白质存在于卵的卵清中。在一个实施方案中，蛋白质以在约1ng/毫升的卵清至约0.2克/毫升的卵清的范围内的量存在。例如，蛋白质可以以在约0.1μg/毫升的卵清至约0.2克/毫升的卵清的范围内的量存在(例如，蛋白质可以以在约1μg/毫升的卵清至约100毫克/毫升的卵清的范围内的量存在)。在一个实施方案中，蛋白质可以以在约1μg/毫升的卵清至约50毫克/毫升的卵清的范围内的量存在。例如，蛋白质可以以在约1μg/毫升的卵清至约10毫克/毫升的卵清的范围内的量存在(例如，蛋白质可以以在约1μg/毫升的卵清至约1毫克/毫升的卵清的范围内的量存在)。在一个实施方案中，蛋白质以超过0.1μg/毫升的卵清的量存在。在一个实施方案中，蛋白质以超过0.5μg/毫升的卵清的量存在。在一个实施方案中，蛋白质以超过1μg/毫升的卵清的量存在。在一个实施方案中，蛋白质以超过1.5μg/毫升的卵清的量存在。
从已向其中引入了载体的胚盘细胞发育的产生本文中公开的外源蛋白质(例如，LAL)的本发明的禽类为G0代并且可被称为“建立者”。建立者禽类通常是每个插入的转基因的嵌合体。即，G0转基因禽类仅有一些细胞包含转基因。G0代通常也是转基因的半合子。可将G0代与非转基因动物交配以产生对于转基因也是半合子的并且在基本上所有禽类细胞中包含转基因的G1转基因后代。可将G1半合子后代与非转基因动物交配，从而产生G2半合子后代或可将它们自已相互交配，从而产生对于转基因是纯合的G2后代。从G1后代产生的对于转基因为阳性的禽类的大体上所有细胞包含转基因。在一个实施方案中，可将来自相同品系的半合子G2后代交配以产生对于转基因是纯合的G3后代。在一个实施方案中，将半合子G0或G1动物自已相互交配以产生在动物的每个细胞中包含两个拷贝的转基因的纯合G1后代。这些仅仅为某些有用的育种方法的实例，并且本发明包括使用任何有用的育种方法例如，对于本领域技术人员来说是已知的那些方法。
在一个实施方案中，本发明提供了待分离的LAL。即，包含于组合物中的LAL可以是分离的LAL。例如，LAL可分离自卵清。分离的LAL可以是在LAL分子间具有多种糖基化结构的LAL分子。
通过本发明的方法，可将转基因引入禽类胚部胚盘细胞以产生转基因鸡、转基因火鸡、转基因鹌鹑和其它禽类物种，所述转基因动物在其种系组织的遗传物质中具有转基因以产生本发明的蛋白质。胚盘细胞通常是VII-XII期细胞，或其等同物，在一个实施方案中，为接近X期。
本文中描述了一些用于进行本发明的方法的载体。在一个实施方案中，编码序列和载体的启动子在被引入胚盘细胞之前都位于5'与3'LTR之间。在一个实施方案中，载体是逆转病毒并且编码序列和启动子都位于逆转录病毒载体的5'与3'LTR之间。在一个有用的实施方案中，LTR或逆转录病毒载体来源于禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。
在一个实施方案中，用于转染胚盘细胞和产生至禽类基因组的稳定整合的载体以使编码序列在禽类输卵管的膨大部的管腺细胞中表达的操作和位置关系包含编码序列和启动子，其中外源蛋白质例如溶酶体酶(例如，LAL)被储存在硬壳卵的卵清中。
启动子可任选地为卵清蛋白启动子区域中的区段，该区段足够大以指导编码序列在管腺细胞中表达。截短卵清蛋白启动子和/或压缩(condensing)卵清蛋白启动子的关键调控元件(以便其保留在输卵管的膨大部的管腺细胞中表达所需的序列，同时又足够小以使其可容易地整合入载体)包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，可使用卵清蛋白启动子区域的区段。该区段包含卵清蛋白基因的5'-侧翼区域。
启动子还可为很大程度上但非完全地对于膨大部是特异性的启动子，例如溶菌酶启动子。启动子还可以是小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子。或者，启动子可以是组成型启动子(例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、鼠白血病病毒(MLV)启动子等)。在一个实施方案中，启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子、MDOT启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、鼠白血病病毒(MLV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、卵清蛋白启动子、溶菌酶启动子、伴清蛋白启动子、卵类粘蛋白启动子、卵粘蛋白启动子和/或卵转铁蛋白启动子。任选地，启动子可以为启动子区域的至少一个区段，例如卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和卵转铁蛋白启动子区域的区段。
在转染胚盘细胞的一种方法中，将包装的基于逆转录病毒的载体用于将载体递送入胚部胚盘细胞，以便载体被整合入禽类基因组。
用于将转基因随机引入禽类基因组的有用逆转录病毒为复制缺陷型禽类白血病病毒(ALV)、复制缺陷型鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒。在一个实施方案中，pNLB载体通过将卵清蛋白启动子的区域和一种或多种外源基因插入逆转录病毒基因组的5'与3'长末端重复(LTR)之间来进行修饰。本发明涉及：置于在管腺细胞中具有活性的启动子的下游的任何编码序列可在管腺细胞中表达。例如，卵清蛋白启动子可在输卵管膨大部的管腺细胞中表达，因为卵清蛋白启动子驱动卵清蛋白的表达并且在输卵管管腺细胞中具有活性。
本文中描述的任何载体还可任选地包括编码指导由载体的编码序列表达的蛋白质从输卵管的管腺细胞分泌的信号肽的编码序列。该方面有效地扩展了可使用本文中描述的方法将其储存在禽类卵中的外源蛋白质的范围。在外源蛋白质本来不被分泌的情况下，修饰包含编码序列的载体以包含下述DNA序列，所述DNA序列包含来自溶菌酶基因的约60bp的编码信号肽。将编码信号肽的DNA序列插入载体，以便其位于由DNA编码的蛋白质的N端。
本发明的另一个方面包括在本发明的任何载体中使用内部核糖体进入位点(IRES)元件以使得能够从双顺反子或多顺反子mRNA翻译两种或更多种蛋白质。将IRES单元融合至一个或多个另外的编码序列的5'末端，随后将其在原始编码序列的末端插入载体，以便可编码序列可通过IRES彼此分隔。
在一个实施方案中，当使用IRES时，有助于产物的翻译后修饰，因为一个编码序列可编码能够修饰其它编码序列产物的酶。例如，第一编码序列可编码可被羟基化并且可被由第二编码序列编码的酶激活的胶原蛋白，其中如在本领域中所理解的那样使用IRES。
在另一个方面，提供了具有3'非翻译区(3'UTR)(以向产生的RNA赋予稳定性)的用于本发明的任一方法的载体的编码序列。当将3'UTR添加至逆转录病毒载体时，启动子、基因X和3'UTR的取向在构建体中是反向的，以便3'UTR的添加不干扰全长基因组RNA的转录。在一个实施方案中，3'UTR可以为卵清蛋白或溶菌酶基因的3'UTR，或在哺乳动物细胞中具有功能的任何3'UTR，即SV40晚期区域。
在一个实施方案中，组成型启动子用于在禽类中表达转基因的编码序列。在该情况下，表达不限于膨大部(magnum)；表达还可在禽类的其它组织(例如，血液)中发生。这样的转基因(其包括组成型启动子和编码序列)的使用特别适合于实现或驱动蛋白质在输卵管中表达，并且随后将蛋白质分泌至卵中。
产生用于载体的转导颗粒(transducing particle，即，transductionparticle)，对其进行滴定以确定可用于注射胚胎的适当浓度。按照Speksnijder方法(美国专利No.5,897,998，将其公开内容通过引用整体并入本文)给禽卵开口，用转导颗粒注射卵。注射后将卵孵育约21天，选择雄性禽类用于交配。为了筛选在其精子中包含转基因的G0公鸡，从公鸡精子样品提取DNA。通过人工授精将在其精子样品中具有最高转基因水平的G0公鸡与非转基因母鸡交配。筛选血液DNA样品的转基因的存在。测试转基因公鸡的血清的外源蛋白质的存在。如果外源蛋白质得到确认，则转基因公鸡的精子用于非转基因母鸡的人工授精。一定百分比的后代则包含转基因(例如，超过50％)。当外源蛋白质存在于根据本发明的产生的卵中时，可分离蛋白质。还可测试蛋白质的生物学活性。
在禽类输卵管中产生外源蛋白质和产生包含外源蛋白质的卵的本发明的方法包括随后提供适当的载体和将所述载体引入胚部胚盘细胞以便载体被整合入禽类基因组的另外的步骤。随后的步骤包括从在先前步骤中产生的转基因胚盘细胞获得成熟转基因禽类。成熟转基因禽类可获自已用载体直接在胚胎内对其进行转染或转导的胚盘胚胎的细胞。使所得的胚胎发育并且使小鸡长大成熟。
从胚盘细胞产生的转基因禽类称为建立者(founder)。一些建立者将在它们的输卵管的膨大部的管腺细胞中具有转基因。此类禽类将在它们的输卵管中表达由转基因编码的外源蛋白质。外源蛋白质还可在除了输卵管以外的其它组织(例如，血液)中表达。如果外源蛋白质包含适当的信号序列，其可被分泌至输卵管的管腔中和卵的卵清中。
一些建立者为种系建立者。种系建立者为在其种系组织的遗传物质中具有转基因，以及还可在表达外源蛋白质的输卵管膨大部管腺细胞中具有转基因的建立者。因此，根据本发明，转基因禽类可具有表达外源蛋白质的管腺细胞，并且转基因禽类的后代还可具有表达外源蛋白质的输卵管膨大部管腺细胞。或者，后代表达通过外源基因在禽类的特定组织中表达决定的表型。在一个实施方案中，转基因禽类为鸡或火鸡。
药物组合物和治疗方法
虽然可能就疗法中的用途而言，可以以粗制形式施用如本文中所述产生的治疗性蛋白质，但优选将治疗性蛋白质作为药物制剂的一部分来进行施用。因此，还提供了包含家禽来源的糖基化治疗性蛋白质例如LAL或其药学上可接受的衍生物与一种或多种其药学上可接受的载体以及任选地，其它治疗性和/或预防性成分的药物制剂，和施用此类药物制剂的方法。载体在与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。使用本发明的药物组合物治疗患者的方法(例如，施用的药物蛋白质的量，施用频率和治疗期的持续时间)可使用本领域技术人员已知的标准方法来确定。
利用公知的常规方法(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第14版.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，将其整个教导通过引用并入本文)配制包含载体，包括复合分子(composite molecules)的组合物。载体可包括赋形剂。在一个实施方案中，药物载体可以是液体并且重组人LAL可以以溶液的形式存在。药物载体可以为蜡、脂肪或酒精。在一个实施方案中，基于蜡或脂肪的载体不包含酯。在另一个实施方案中，药学上可接受的载体可以是以粉剂、冻干粉剂或片剂形式存在的固体。在一个实施方案中，载体可包含脂质体或微胶囊。
药物制剂包括适合通过注射(包括肌内、皮下和静脉内施用)施用的那些制剂。药物制剂包括适合于口服、经直肠、经鼻、局部(包括含服和舌下)、经阴道或胃肠外施用的那些制剂。药物制剂还包括用于通过吸入或吹入施用的那些制剂。在适当的情况下，制剂可以方便地以分开的剂量单位提供，以及可利用制药领域内公知的任何方法来制备。产生药物制剂的方法通常包括步骤：将治疗性蛋白质与液体载体或精细固体载体或两者结合，随后，需要时，将产品塑造成期望的形式。
适用于口服施用的药物制剂可方便地以分开的单位形式例如胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂提供，所述单位各自包含预定量的活性成分；以粉剂或颗粒剂形式；以溶液形式；以悬浮液形式；或以乳剂形式提供。活性成分还可以以大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂形式提供。用于口服施用的片剂和胶囊剂可包含常规赋形剂例如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。可按照本领域公知的方法包被片剂。口服液体制剂可以以例如水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式存在，或可以以干燥产品(以在使用之前用水或其它适当的媒介物构建)提供。此类液体制剂可包含常规添加剂例如悬浮剂、乳化剂、非水性媒介物(其可包括食用油)或防腐剂。
LAL还可被配制用于胃肠外施用(例如，通过注射，例如快速推注注射(bolusinjection)或连续输注)，以及可以在安瓿、预装注射器、小体积输注中以单位剂量形式提供或在添加有防腐剂的多剂量容器中提供。可以通过例如皮下注射、肌内注射和静脉内输注或注射来注射治疗性蛋白质。
LAL可采取如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂等形式，以及可包含配制剂(formulatory agent)例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。还涉及：治疗性蛋白质可以以粉剂形式存在，通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液冻干(用于在使用之前利用适当的媒介物例如无菌无热原水构建)获得的。
关于静脉内输注或注射，可将根据本发明产生的LAL配制为水性悬浮液或溶液。适用于用于静脉内输注或注射的制剂的赋形剂可包括下列试剂之一：脱水柠檬酸三钠、柠檬酸和人血清白蛋白。药物制剂还可包括本领域公知的用于溶酶体贮积症的其它产品的其它适当的赋形剂。将根据本发明产生的LAL的pH维持在约5.6与约6.2之间。优选地，将LAL制剂的pH维持在5.9±0.2。
关于至表皮的局部施用，可将按照本发明产生的本发明的治疗性蛋白质配制为软膏、乳膏剂或洗剂，或配制为透皮贴剂。软膏和乳膏剂可以例如利用添加有适当的增稠剂和/或胶凝剂的水性或油性基质来配制。洗剂可利用水性或油性基质来配制，并且还可包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
适用于口中局部施用的制剂包括在调味基质(通常蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中包含活性成分的锭剂；在惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中包含活性成分的软锭剂(pastille)；和在适当的液体载体中包含活性成分的漱口药。
适用于直肠施用的药物制剂(其中载体为固体)最优选地以单位剂量栓剂的形式提供。适当的载体包括可可脂和本领域通常使用的其它材料，并且栓剂可通过将活性化合物与软化的或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和塑形来方便地形成。
适用于阴道施用的制剂可以以阴道栓、止血栓(tampon)、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂形式提供，所述制剂除活性成分外还包含这样的载体如在本领域内已知是适当的载体。
关于鼻内施用，本发明的治疗性蛋白质可用作液体喷雾剂或飞散性散剂或以滴剂的形式存在。滴剂可利用水性或非水性基质(还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂)来配制。液体喷雾剂可从加压包(Pressurized pack)方便地进行递送。
关于通过吸入的施用，根据本发明的治疗性蛋白质可从吹入器、喷雾器或加压包或递送气雾喷雾剂的其它方便的工具来方便地递送。加压包可包含适当的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀门以递送计量的量来确定。
关于通过吸入或吹入的施用，根据本发明的治疗性蛋白质可采取干燥粉末组合物的形式，例如，化合物与适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以在例如胶囊或药筒或例如明胶或泡罩包装(blister pack)(可借助于吸入器或吹入器从其施用粉剂)中以单位剂量形式提供。
需要时，可使用适合于提供活性成分的持续释放的上述制剂。
本文中描述的药物组合物还可包含其它活性成分例如抗微生物剂或防腐剂。
此外，本发明涉及，可将本文中公开的治疗性蛋白质与其它治疗剂组合使用。例如，本发明提供了用于利用药物有效剂量的抗组织胺预处理以使潜在的输注相关过敏反应降至最低或防止所述过敏反应的方法。例如，抗组织胺可以是本文中公开的和本领域已知的任何药学上可接受的抗组织胺(例如，苯海拉明)。在一个实施方案中，以约1mg至约10mg/千克体重的剂量施用抗组织胺。例如，可以以约5mg/千克的剂量施用抗组织胺。在一个实施方案中，施用抗组织胺，进行约10分钟至约90分钟，例如约30分钟至60分钟，然后使用与血管进入口(vascular access port)连接的移动系统(ambulatory system)施用溶酶体酸性脂酶。在一个实施方案中，苯海拉明的剂量有效地抵消了潜在的过敏性输注反应。
如果患者将经历过敏反应或不利的免疫反应，则还可在LAL施用之前、期间或之后施用免疫抑制剂例如抗组织胺、皮质类固醇、西罗莫司、伏环孢素、环孢素、甲氨蝶呤、针对IL-2受体的抗体、针对T细胞受体的抗体、针对TNF-α的抗体或融合蛋白(英夫利昔单抗、依那西普或阿达木单抗)、CTLA4-Ig(例如，阿巴他塞)、抗-OX-40抗体。
本发明还涉及包括将含LAL的组合物与一种或多种降胆固醇试剂(例如，HMG-CoA还原酶抑制剂)组合施用的疗法。此类试剂的非限定性实例包括：阿托伐他汀
Figure BDA0000779217090000431
和
Figure BDA0000779217090000432
氟伐他汀
Figure BDA0000779217090000433
洛伐他汀
Figure BDA0000779217090000434
匹伐他汀
Figure BDA0000779217090000435
普伐他汀
Figure BDA0000779217090000436
罗舒伐他汀
Figure BDA0000779217090000437
和辛伐他汀
Figure BDA0000779217090000438
本文中描述的组合物或蛋白质可用于治疗多种病况。例如，存在用于其的治疗性疗法对于本领域技术人员来说是已知的病况。本发明涉及：在禽类系统中产生的包含家禽来源的糖基化模式的治疗性蛋白质(例如，LAL)可用于治疗此类疾病。即，还涉及通过使用如本文中所述产生的治疗性蛋白质治疗已知可利用常规产生的治疗性蛋白质治疗的病况。例如，如本文中所述产生的LAL可用于治疗因LAL缺乏或不足(统称“LAL缺乏”)而引起的或与其相关的病况，例如沃尔曼病和胆固醇酯沉积病(CESD)。如本文中所描述的，LAL缺乏还涉及其中LAL的表达因导致体内产生的LAL的减少或不足的状况(例如，基因突变)、生理或环境因素而减少的病况。如本文中所述产生的LAL还可用于治疗其它病况例如动脉粥样硬化、脂肪肝病、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。如本文中所述产生的LAL还可用于治疗其它病况例如2005年2月1日发布的美国专利No.6,849,257(将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)；2009年12月3日公布的美国公布No.2009/0297496；2004年11月11日公布的美国公布No.2004/0223960；2009年11月15日公布的美国公布No.2007/0264249(将所述公布的公开内容(即，这4个专利公布的每一个的公开内容)通过引用整体并入本文)中公开的病况。
还涉及：本文中公开的产生的LAL可用于治疗某些特殊病况，包括胰腺炎例如慢性胰腺炎和/或急性胰腺炎以及酒精诱导的胰腺损伤例如酒精诱导的胰腺炎。
本发明涉及：通过任何有用的方法(例如本文中公开的方法)产生的LAL用于治疗因酒精诱导的细胞损伤(包括但不限于导致脂质酯(lipid ester)在身体组织包括但不限于肝、脾、肠和心血管组织中积累的那些酒精诱导的细胞损伤)而引起的疾病。本发明还涉及通过施用LAL治疗吸收不良。
本发明的一个方面涉及治疗患者的方法，包括向患者施用治疗有效量的包含本文中描述的重组人LAL的组合物。患者可患有或经诊断患有许多病况，包括与LAL缺乏相关的病况。在一个实施方案中，治疗有效量为使患者的红细胞计数增加期望量的量。本发明涉及：根据本发明产生的LAL可用于治疗慢性肾病，例如，当组织不能支持溶酶体酸性脂酶的产生时。
还涉及通过任何有用的方法产生的LAL可用于治疗患有丹吉尔病和家族性低α脂蛋白血症的患者。丹吉尔病/家族性低α脂蛋白血症与胆固醇酯在巨噬细胞中的积累相关，伴随肝脾肿大和/或淋巴结病以及低水平的高密度脂蛋白(HDL)，其可通过施用LAL来治疗。例如，不希望将本发明限定于任何特定的操作理论或机制，据认为受损的LAL活性减少ABCAl表达，相反地通过向患有丹吉尔病/家族性低α脂蛋白血症的患者施用LAL获得的增强的LAL活性将增加ABCAl表达以克服因多态性而具有减小的功能活性的ABCA1基因的作用。
关于病况的治疗，一般而言，取决于已知的因素例如接受者的年龄、健康和体重、现有治疗的类型、治疗的频率等，施用的剂量可变化。通常，活性成分的剂量可为约0.0001至约10毫克/千克体重。治疗的精确剂量、施用频率和时间跨度可由施用各自治疗性蛋白质的领域内的医生来确定。
此外，已发现1mg/kg和更少的剂量在治疗LAL缺乏中可以是有效的。本发明提供了治疗病况的方法，包括每5天一次和每25天一次，例如每7天一次和每14天一次向哺乳动物(例如患者，优选人患者)施用治疗有效剂量的溶酶体酸性脂酶。在一个实施方案中，施用的溶酶体酸性脂酶的剂量为约0.1mg至约50mg/千克体重，例如剂量可以为约1mg至5mg/千克。
在一个特别有用的实施方案中，本发明提供了通过按照任何治疗有效给药方案例如本文中描述的给药方案施用约0.1mg至1.0mg/千克体重的溶酶体酸性脂酶的剂量治疗病况的方法。
本发明提供了用于治疗LAL缺乏的任何并发症的方法，所述并发症可从施用治疗有效剂量的LAL受益。在一个实施方案中，可按照本文中描述的方法治疗吸收不良和生长不足。在另一个实施方案中，可使用本文中提供的方法治疗LAL缺乏患者中看见的并发症包括但不限于肝肿大和肝功能障碍。
本发明提供了利用重组LAL(例如，重组人LAL)的治疗，所述重组LAL可利用任何有用的蛋白质表达系统例如转基因哺乳动物和禽类(如本领域中所理解的)来产生。其它蛋白质表达系统可包括但不限于细胞培养物、细菌和植物系统。
本发明包括将重组LAL作为药学上可接受的组合物的一部分通过任何途径进行的施用，所述途径可获得期望的疗效，如由本领域医生测定的。在一个实施方案中，可在约5小时的时间段内通过静脉内输注施用LAL。例如，可利用连接于血管进入口(例如，一个端口-一个导管(a Port-a-Cath))的移动输注泵(ambulatory infusion pump)帮助输注。
本发明还包括监测哺乳动物(例如，人患者)的病况例如沃尔曼病和CESD的临床和病理学表现。在一个实施方案中，评估由(但不限于)如下方面组成：脂质分析、胸部X光检查、肝功能试验、粪便记录(stool chart)、血浆甲羟戊酸(plasma mevalonic acid)、免疫原性、血浆溶酶体酸性脂酶、壳丙糖酶、PARC、门静脉高压、人体测量术(anthropometry)、肝、脾和胃肠道的体积和表征(使用例如成像技术)。例如，上述成像技术可由超声、磁共振成像以及核磁共振光谱学组成。
实施例
本发明还可通过下列实施例进一步举例说明。所述实施例仅用于举例说明目的，而并非旨在也不应当将它们解释为以任何方式限定本发明。
实施例1
具有重组人溶酶体酸性脂酶(rhLAL)编码序列的的载体(pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA)的构建
pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA载体中的hLAL基因的核苷酸序列编码与由人溶酶体酸性脂酶基因产生的蛋白质的氨基酸序列相同的蛋白质(GenBank登录号,NP_000226)(图1)。该序列的转录以及所得mRNA的随后翻译产生399个氨基酸的前体蛋白质，其被加工成与SEQID NO:1中所示的人LAL(GenBank登录号,NP_000226)(图1)相同的成熟的378个氨基酸的蛋白质。通过来源于卵清蛋白基因的非编码元件(包括增强子、启动子、内含子以及5'和3'非翻译序列)来控制本实施例中的hLAL基因(关于cDNA序列参见图2)的表达。卵清蛋白基因产生卵清蛋白，卵清的主要蛋白质组分。鸡卵清蛋白启动子的活性对于鸡输卵管内产生卵清的细胞的特异性极高；在其它组织中的表达是最小程度的。
质粒载体pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA(图3A；其核苷酸序列示于图4中)用于产生将hLAL转基因稳定地整合入建立者(XLL109)的基因组的复制缺陷型逆转录病毒(RDR)。该质粒载体包括病毒RNA包装、逆转录和整合所需的逆转录病毒核苷酸序列，但不包含病毒gag、pol和env基因的完整序列。本文中描述了用于产生逆转录病毒载体的方法及其在随后转基因(transgenesis)法中的用途。
pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA的逆转录病毒部分基于ALV载体pNLB。对pNLB进行修饰以便LTR可自身灭活(self-inactivating)(SIN)(图3B)。为了实现该目的，缺失3’LTR的273bp，其包括U3区域的增强子和CAAT盒。因为逆转录病毒序列的3’末端上的灭活的U3区域用作存在于整合的原病毒的5’末端上的新的U3区域的模板，所以5’LTR通常也被灭活。SIN构建体的LTR序列的缺失减小了启动子对来自LTR的内部启动子的干扰，并且使序列重组以形成具有复制能力的逆转录病毒的概率降至最低。新的载体称为pALVIN(对于ALV灭活载体)。
5’LTR的下游是部分gag和env编码序列，所述序列皆转自pNLB载体。在pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA中，gag蛋白前体序列的小部分(12％)保留(55％的p19成熟肽序列)以及RAV2的env前体序列的小部分(1.7％)保留(GenBank登录号，AF033808)。这些截短的gag和env区域不能产生用于产生具有复制能力的逆转录病毒所必需的功能性蛋白质(Cosset,1991)。
将鸡卵清蛋白基因的转录和翻译控制元件插入pALVIN以产生pALVIN-OV-1.1-I(其序列示于图6中；SEQ ID NO:8)。pALVIN-OV-1.1-I的第一部分由鸡卵清蛋白基因的连续部分组成，所述连续部分包括1.1kb近端启动子区、第一外显子、第一内含子以及第二外显子的一部分。下一部分为填充插入物片段，其替代了卵清蛋白编码序列。填充片段之后是鸡卵清蛋白基因的3'非翻译区(UTR)，其包括有利于mRNA正确加工(包括多腺苷酸化)的序列。一般地，填充片段被编码期望的蛋白质(在该情况下hLAL)的DNA片段替代。结果为具有特殊元件的载体，所述元件在转基因鸡的输卵管中促进mRNA的受控转录表达和翻译，密切模拟内源卵清蛋白mRNA的调节，以及使目标蛋白质能够在卵清中高表达。
pALVIN-OV-1.1-I载体包括卵清蛋白基因的第一内含子。因为内含子在逆转录病毒RNA基因组的产生和包装过程中对剪接易感，因此我们以相对于LTR相反的取向插入表达盒。这样，内含子在逆转录病毒RNA中不能被识别，从而在无剪接的情况下被包装。为了方便起见，绘制本说明书中的所有图谱，LTR以相反取向绘制，表达盒以向前或顺时针方向取向绘制。
pALVIN-OV-1.1-I为其中已插入了hLAL的编码序列(CDS)的基本载体。在Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa合成组成hLAL CDS和与pALVIN-OV-1.1-I相容的所需的序列的两个DNA片段hLAL适体和Syn hLAL，(参见图7和8；SEQ ID NO:9和10)。将hLAL适体的229 bp HpaI/BamHI片段和Syn hLAL的1113bp BamHI/BstBI片段插入pALVIN-OV-1.1-I的7882HpaI/BstBI片段，从而用hLAL CDS替代填充片段区域，产生pALVIN-OV-1.1-I-hLAL。
已发现，在hLAL CDS的反义链中存在阻止完整逆转录病毒RNA包装的隐蔽剪接位点。通过改变hLAL的DNA序列而不改变其氨基酸序列来除去隐蔽剪接位点。该改变通过用引物5'-AGAAACTGAGAGTGTCTTAT-3'(SEQ ID NO:12)和引物5'-TGACAGCTGTGGATCCAGAAACAAACATG-3'(SEQ ID NO:13)对pALVIN-OV-1.1-I-hLAL的区域232至534进行聚合酶链式扩增来进行，产生329 bp扩增子。用BamHI和SexAI降解该扩增子，将其与pALVIN-OV-1.1-I-hLAL的8940 bp BamHI/SexAI片段连接以产生pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dS A。
将包含鸡卵清蛋白基因的DNase酶超敏位点III(DHSIII)(相对于OV启动子起始位点-3819至-2169)的假定的启动子增强子(Kaye,Bellard等人，1984)插入pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSA以产生pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA。如下所述进行该过程：通过用XhoI和BlpI降解分离包括DHSIII增强子和称为OVR1启动子的1.1kb近端OV启动子(关于序列参见图9；和SEQ ID NO:11)的DNA片段。为了有利于亚克隆，利用引物5'-GCCGCTCGAGCGAGGAATATAAAAAAATT-3'(SEQ ID NO:14)和5'-TCCGCGCACATTTCCCCGAA-3'(SEQ ID NO:15)通过PCR扩增pALVIN-OV-1.1-I的区域6752至7974，然后用NgoMI和XhoI降解来产生适体片段，pSIN-OV-1.1-I的PCR。将OVR1启动子的2772 bp XhoI/BlpI片段和pSIN-OV-1.1-I的PCR的1067 bp NgoMI/XhoI片段插入pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSA的7043bp NgoMI/BlpI片段，从而产生pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA(关于pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA的构建示意图参见图10)。在美国专利申请2008/0064862中描述了称为pALVIN(aka pAVIJCR-A395.22.3.1-KM或pALV-SIN)的载体的逆转录病毒载体区段的构建。
此外，还包括使用2008年3月13日公布的美国专利公布No.2008/0064862(将其公开内容通过引用整体并入本文)中公开的启动子和/或载体产生根据本发明的LAL。
实施例2
病毒颗粒的产生
通过如下使用逆转录病毒转基因法产生在其基因组中具有hLAL转基因的G0建立者转基因雄性XLL109。通过永生化的鸡成纤维细胞系的瞬时转染产生具有pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA载体的复制缺陷型病毒颗粒。用三种质粒pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA、pCMV-gag-pol和pCMV-VSV-G同时转染此类鸡成纤维细胞。pCMV-gag-pol表达禽白血病病毒的RAV1株的gag和pol基因。pCMV-VSV-G表达水疱性口炎病毒的包膜蛋白。转染后4小时，用补充有10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM替换培养基。转染后48小时收获培养基，将其通过0.45微米过滤器(Millipore)进行过滤，然后通过超速离心进行浓缩。收集浓缩的具有ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA转基因的逆转录病毒，将其用于早期胚胎的转导。注意：因为“p”是载体的质粒形式的标记符(notation)，因此一旦转基因以包装的载体或整合的转基因的形式存在，“p”就不存在于转基因名称中。
实施例3
胚胎转基因
通过早期胚胎的转导实现ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA表达盒至胚胎基因组的整合(Speksnijder和Ivarie,2000)。从繁殖集落(breeding colony)获得新产的受精白色来亨鸡的卵。在壳上产生开口以提供至胚胎的通路。将7微升浓缩的具有上述ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA表达盒的复制缺陷型逆转录病毒颗粒注射入胚胎的胚下腔。用热胶密封卵，随后将其在标准条件下进行孵育和孵化。从这些注射产生的后代在孵化时被赋予单个鉴定标志以进行鉴定和跟踪。当使用对于hLAL编码序列特异性的PCR引物，通过对hLAL转基因进行实时PCR来进行分析(如下文中所述)时，来自后代的血液样品是转基因阳性的。这表明转基因法是成功的。hLAL转基因的实时PCR测定利用
Figure BDA0000779217090000501
化学制品(AppliedBiosystems)。正向和反应引物分别为5'-ACGACTGGCTTGCAGATGTCT-3'(SEQ ID NO:16)和5'-CCCCAAATGAAGTCAAGATGCT-3'(SEQ ID NO:17)。
Figure BDA0000779217090000502
探针序列为5’-CCGGAATGCTCTCATGGAACACCAA-3'(SEQ ID NO:18)并且在5'末端用FAM(作为发射剂)标记以及在3'末端用Iowa黑(作为淬灭剂)标记。将引物、探针和1μl的提取DNA添加至30μl
Figure BDA0000779217090000503
通用预混合物(Applied Biosystems)中。对照反应包括具有hLAL序列和来自野生型鸡的DNA的质粒的不同稀释物(数据未示出)。在Applied Biosystems7500Fast实时PCR系统上使用标准循环参数。
实施例4
G0建立者的鉴定
从性成熟雄性收集精液，提取DNA，使用hLAL实时PCR测定来进行测定。使用与阴性对照精液DNA混合的已知标准物(具有hLAL基因的质粒)估计每一个样品的转基因拷贝的数目。雄性XLL109中的转基因盒DNA含量在允许转基因被传递至其后代的水平上，如通过实时PCR估计的。该XLL109雄性为G0转基因建立者，将其与非转基因鸡交配，以产生G1半合子转基因鸡。
实施例5
半合子G1禽类的繁殖和表征
使用hLAL实时PCR测定测试由转基因建立者XLL109产生的后代的血细胞DNA中转基因的存在。从1-2周龄后代收集血液，使用高通量技术(Harvey等人,2002)提取DNA。在进行Taqman测定以促进高通量筛选之前不定量DNA溶液。通常1μl DNA溶液包含50至400ngDNA，所述DNA足以产生阳性扩增信号。测试总共1,322只由XLL109产生的小鸡，使阳性后代再交配，然后测试以进行确认。根据PCR结果，22个后代对于ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA转基因为阳性。Taqman结果的实例示于图11中。
实施例6
高表达品系的鉴定和表征
G1鸡之一ILL7466产下在卵清中具有与其它G1鸡相比较显著更高的水平的rhLAL蛋白质的卵。对ILL7466和同胞G1雄性进行Southern印迹分析以鉴定具有与所述高表达鸡相同的整合位点的同胞雄性。利用在转基因内仅切割一次的限制性内切酶(BlpI)进行降解，利用卵清蛋白启动子或hLAL编码序列的区段探测Southern印迹(图12A-D)。取决于整合的位点，存在于侧翼基因组区域中的第二限制性位点的位置可变化。因此，通过OV探针或hLAL探针检测到的BlpI条带的尺寸对于产生的每个品系是唯一的。
OV探针在BlpI-降解的野生型鸡的DNA中检测到4.1kb的单个条带，该条带对应于鸡基因组的内源卵清蛋白基因内的BlpI区段的预期尺寸(图12B和12D)。对于鸡ILL7466检测到4.3kb的第二条带，该条带对应于转基因条带。3个另外的雌性同胞ILL10409、ILL10686和ILL12058以及3个另外的雄性同胞ILL8922、ILL9330和ILL11217显示4.3kb的条带，表明这些同胞可能具有相同品系(图12B和12D)。
如所预期的，hLAL探针在野生型的DNA中未检测到条带如鸡溶酶体酸性脂酶基因的DNA序列，并且重组人溶酶体酸性脂酶的编码序列可被充分区分，从而不允许在这些Southern测定中使用的条件下杂交(图12C)。hLAL探针在来自对于通过OV探针检测的4.3kb条带为阳性的相同鸡的BlpI降解的基因组DNA中检测到～10.6kb的单个条带，这表明这7只G1鸡具有相同的整合位点，从而为相同品系。
未检测到其它条带，这表明ILL7466、ILL10409、ILL10686、ILL12058、1LL8922、1LL9330和ILL11217都具有单个整合位点。
Southern分析还表明转基因以被OV检测到的条带被整合，hLAL探针具有不同尺寸并且在尺寸上大于来自单独的转基因的尺寸。显示整合的转基因的预测结构和BlpI位点在侧翼基因区域中的位置的图谱示于图12A中。
为了确认转基因是完整的，采用两个步骤。第一步，通过PCR从ILL7466分离hLAL编码序列。从hLAL起始密码子至终止密码子对PCR产物的两条链进行测序。DNA序列完全如所预期的，这表明转基因中编码区的DNA序列没有改变。第二步，使用限制性内切酶ApaLI进行Southern印迹分析，所述酶将完整转基因降解成2个区段，3.6和3.8kb(图13A)。在ApaLI-降解的G1的基因组DNA中同时检测到3.6和3.8kb条带，这表明转基因以完全完整的形式被整合(图13B)。
实施例7
G2的繁殖和表征
图14显示从单个G0建立者XLL109起源的hLAL G2的谱系。在G1期，表征转基因的拷贝数、完整性、hLAL序列和整合位点-以及鉴定和表征了7个G1转基因(4只小鸡和3只公鸡)。通过用从G1雄亲ILL8922、ILL9330和ILL11217收集的精液对非转基因鸡人工授精来实现G2的繁殖(图14)。将每只授精的鸡、其卵和随后的后代与其它后代分开关养。使用hLAL实时PCR测定测试孵化的后代的hLAL转基因的存在。因为G1建立者对于转基因是半合子，因此一半的后代预期为转基因G2。在迄今为止分析的610个G2后代中，330个或54％为转基因的。
实施例8
hLAL禽类的遗传分析
在通过血液DNA的hLAL实时PCR测定鉴定每只G2鸡后，将生产品系经历下列遗传测定：从血液DNA PCR扩增hLAL基因，对其进行测序以确认与人序列具有100％的同源性；如上所述，通过整合位点PCR确认转基因整合位点。在＜10只鸡的生产品系中对每一只鸡；对于11-100只鸡的生产品系对10％的鸡(最少10只)；对于101-1000只鸡的生产品系而言，对5％的鸡(最少10只)；对于1001-10,000只鸡的生产品系而言，对1％的鸡(最少50只)；对>10,001只鸡的生产品系而言，对0.1％的鸡(最少100只)进行PCR测序和整合位点分析。在生长和生产期的每一个步骤保持详细记录。
实施例9
从卵清纯化hLAL
将含有LAL的卵清(EW)在pH 6下溶解过夜，通过利用0.2um过滤的离心(或深部过滤)进行澄清。用1M NaOAc缓冲液(pH 4)将EW调整至6。
将澄清的EW加载至用20mM磷酸盐/137mM NaCl缓冲液(pH 6)平衡的苯基-HIC柱子(EW:柱尺寸＝2:1)上。在完全加载后，用平衡缓冲液和5mM磷酸盐缓冲液(pH 6)洗涤柱子。用30％丙二醇和5mM Tris缓冲液(pH 7.2)洗脱LAL。
用1M酸将洗脱的LAL级分调整至pH 5，随后将其加载至GigaCap S柱子(EW:柱子尺寸＝10:1)。用50mM NaOAc缓冲液(pH 5)平衡柱子。在完成加载后，用平均缓冲液洗涤柱子。用50mM NaOAc/60mM NaCl(pH 5)洗脱LAL。
用1M Tris缓冲液将脱离GigaCap S柱的LAL级分调整至pH6，随后将其加载至丁基-HIC柱子(EW:柱子尺寸＝10:1)上。用20mM磷酸盐/137mM NaCl缓冲液(pH 6)平衡柱子。在完成加载后，用平均缓冲液和5mM磷酸盐缓冲液(pH 6)洗涤柱子。用50％丙二醇和5mMTris缓冲液(pH 7.2)洗脱纯LAL。图15描述了从卵清纯化hLAL的步骤。
实施例10
转基因禽类来源的hLAL的碳水化合物分析
通过使用下列对于本领域技术人员来说公知的分析技术测定禽类来源的人LAL的寡糖结构。
用蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在37℃下于0.1M Tris-HCl,pH 8.2(含有1mM CaCl2)中降解200微克，进行18小时。富集降解产物，利用Sep-Pak C18筒柱(cartridge column)除去污染物。富集后，用2μl的50μl的20mM磷酸钠缓冲液pH 7.5中的N-糖酰胺酶F(7.5单位/ml)在37℃下降解糖肽18小时。通过将降解物通过Sep-Pak C18筒柱来将释放的寡糖与肽和酶分离。
将聚糖级分溶解在二甲亚砜中，随后基于Anumula和Taylor(Anumula和Taylor,1992)的方法对其进行全甲基化。通过加入水淬灭反应，利用二氯甲烷提取全-O-甲基化(per-O-methylated)碳水化合物。在氮流下干燥全-O-甲基化聚糖。
使用α-二羟苯甲酸(DHBA,50％甲醇:水中的20mg/mL溶液)作为基质以反射体正离子模式(reflector positive ion mode)中进行MALDI/TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)。通过使用Microflex LRF(Bruker)获得所有波谱。
如本领域所理解的，在从肽主链释放和纯化后对寡糖进行MALDI-TOF-MS分析和ESI MS/MS(电喷雾电离串联质谱(electrospray ionization tandem massspectrometry))。也用某些酶降解单个多糖种类的样品，如本领域中所理解的，利用HPLC分析降解产物。
据认为在人LAL上存在约6个N-连接糖基化位点。参见，Zschenker等人(2005)J.Biochem.,第137卷,p 387-394，将所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。该参考资料还显示在人LAL上可存在O-连接糖基化位点。鉴定的N-连接寡糖结构示于图16中。
数据显示在根据本发明产生的LAL中发现这些结构中有许多或全部为N-连接糖基化结构(图16)。例如，发现A-n连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现O-n连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现B-n、C-n和D-n的至少一个连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现E-n和F-n的至少一个连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现I-n和J-n的至少一个连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现K-n和L-n的至少一个连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现M-n和N-n的至少一个连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现G-n连接于根据本发明产生的LAL。例如，发现H-n连接于根据本发明产生的LAL。
实施例11
转基因禽类来源的LAL的N-聚糖种类
使用Tube-O-透析器(4.0kDa截断值的膜；G Biosciences)在4℃下将转基因禽类来源的hLAL的纯化的样品(600μg/样品)针对超纯水(nanopure water)透析24小时以除去盐和其它污染物。在整个透析期间更换超纯水4次。
透析后，将每一个样品分成3等分：～1/4的样品重量用于中性及氨基糖分析，～1/4的样品重量用于甘露糖-6-磷酸分析，以及～1/2的样品重量用于寡糖谱分析。在100℃下用2N三氟乙酸(TFA)水解意欲用于中性及氨基糖分析的等分，进行4小时，在100℃下用6.75N TFA水解用于甘露糖-6-磷酸分析的等分，进行1.5小时。随后在N2下干燥水解物，用50μl H2O将其再溶解，在冰上超声7分钟，随后转移至注射小瓶。然而，将中性及氨基糖样品稀释2次，因为从最初溶解的水解物产生的峰过大。
以与样品相同的方式和在相同的时间水解具有已知摩尔数的用于中性及氨基糖以及用于甘露糖-6-磷酸的标准的混合物。制备4个浓度的中性及氨基糖标准混合物(Fuc&GalNAc，0.2、0.4、0.8和1.6纳摩尔/10μl；GlcNAc，0.5、1.0、2.0和4.0纳摩尔/10μl；Gal&Man，0.3、0.6、1.2和2.4纳摩尔/10μl；和Glc，0.1、0.2、0.4和0.8纳摩尔/10μl)和甘露糖-6-磷酸(640、1280、2560、5120皮摩尔/10μl)以建立校准方程。利用线性插值法，根据校准方程定量样品中每种糖的摩尔数。
使用配备有梯度泵、电化学检测器和自动采样品的Dionex ICS3000系统通过HPAEC分析中性及氨基糖以及甘露糖-6-磷酸。利用具有氨基捕捉器(trap)的DionexCarboPac PA20(3x 150mm)分析柱分离单独的中性及氨基糖与甘露糖-6-磷酸。梯度程序对于中性及氨基糖使用洗脱剂A(脱气超纯水)和B(200mM NaOH)，对于甘露糖-6-磷酸使用C(100mM NaOH)和D(1M的100mM NaOH中的醋酸钠)。对于中性及氨基糖测定，每40分钟进行一次注射(10μl/注射)，对于甘露糖-6-磷酸测定，每35分钟进行一次注射。所有方法基于由Hardy和Townsend描述的方案(Hardy,M.R.,和Townsend,R.R.,"High-pH anion-exchangechromatography of glycoprotein-derived carbohydrates",1994,MethodsEnzymol.230:208-225)。使用Dionex chromeleon软件实现仪器控制和数据获取。结果示于下面表1中。对照样品为从EW纯化的卵类粘蛋白。
表1通过HPAEC分析的对照和LAL的单糖组成
Figure BDA0000779217090000571
nd＝未检测到；ndm＝未测定。
LAL的结构特征
LAL在其氨基酸序列中具有6个潜在的用于N-连接糖基化的位点Asn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273和Asn321。这些位点中有5个Asn36、Asn101、Asn161、Asn273和Asn321经发现被糖基化，然而Asn72未被糖基化或大体上未被糖基化(大体上未被糖基化意指在LAL分子的混合物中，与Asn36、Asn101、Asn161、Asn273和Asn321的任一个相比较更少的Asn72被糖基化)。因此，本发明的一个方面为在Asn72上未被糖基化和/或大体上未被糖基化的LAL(例如，人LAL)，以及这样的LAL的产生和用途。然而，具有糖基化Asn72的LAL在本发明的范围内。N-聚糖结构主要由以N-乙酰葡糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸(M6P)作为主要糖的二-、三-和四天线结构的混合物组成。每个位点似乎具有有利的一组结构(表2和图17)，所述结构为本发明的一个方面。例如，M6P-修饰的N-聚糖至少存在于Asn101、Asn161和Asn273上。非磷酸化结构是内源卵清蛋白质上发现的N-聚糖所具有的特征。未检测到O-连接聚糖，如通过N-乙酰半乳糖胺(GalNac)的缺乏测定的。未检测到唾液酸，这与先前测定的根据本发明产生的其它内源和外源蛋白质的N-聚糖结构一致。本发明包括利用一种或多种本文中公开的寡糖结构糖基化的LAL。
表2.如通过糖肽的LC/MS测定的LAL聚糖结构的存在位置
Figure BDA0000779217090000581
Hex，半乳糖；Phos，磷酸盐；Man，甘露糖；GlcNAc2,N-乙酰葡糖胺
方法
利用高pH阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)定性和定量测定单糖组成，包括中性、氨基和M6P。
利用来自若干质谱法(MALDI-TOF、NSI-MS/MS和糖肽LC-MS)的数据测定占优势的聚糖的结构。
MALDI-TOF对于中性N-聚糖的测定是有用的并且能够检测磷酸化的N-聚糖(图18)。NSI-MS/MS被用于测定MALDI-TOF波谱中的较小的峰的性质，所述性质的一些性质归因于磷酸化的N-聚糖(图19)。提高MALDI-TOF检测磷酸化N-聚糖的能力的努力效果不佳。
糖肽的LC/MS能够检测中性和磷酸化结构并且能够测定特定结构在LAL的氨基酸序列中的位置(数据概述于图17和表2中)。
为了确定HPAEC-PAD色谱图中哪个峰因磷酸化N-聚糖而引起，利用磷酸酶处理LAL，然后进行分析(图3)。组C和D中的峰在曲线下面积(AUC)上减少，然而组A中的峰变得更突出。组B中的峰未与其它峰成比例地改变。基于保留时间与电荷的程度(归因于磷酸化或唾液酸化)成正比的知识，预期组C由具有一个磷酸(单M6P)的N-聚糖组成并且组D由具有两个磷酸(双-M6P)的N-聚糖组成。
保留时间还受到中性和氨基单糖的组成和相对结构位置影响。此类实例包括半乳糖的存在、二等分GlcNAc的存在和GlcNAc置换的程度。此类因素促成了HPAEC-PAD色谱图中峰的多样性。
实施例12
卵清中转基因禽类来源的hLAL的体外酶活性分析
使用基本上如Yan等人(2006),American Journal of Pathology,第169卷,No.3,p 916-926(将其公开内容通过引用整体并入本文)中所述的荧光底物4-甲基伞形酮基-油酸盐测定来测定卵清中的溶酶体酸性脂酶的活性。
制备4-甲基伞形酮基油酸盐(4-MUO)的原液，其由2.5mM的4％Triton X-100中的4-MUO组成。在微量滴定板上进行测定，每个孔包含62.5μl的0.2M的0.01％Tween80中的柠檬酸钠(pH 5.5)、12.5μl的卵清样品和25μl的2.5mM 4-MUO。使用Bio-Tek Synergy HT荧光微量板读数器(激发360nm和发射460nm)在37℃下监测荧光的变化，进行30分钟。在测定之前，将包含hLAL的卵清稀释至导致反应线性持续至少30分钟的酶浓度。用50μl 0.75MTris-HCl,pH 8.0终止反应，在上面使用的相同板读数器中测量终点荧光信号(激发360nm和发射460nm)。
使用4-甲基伞形酮基作为标准测定活性的单位。一个单位(U)定义为在上述测定条件下导致1微摩尔4-甲基伞形酮基/分钟的形成的酶的量。将含非-hLAL的蛋白用作阴性对照。
对于hLAL为阳性的卵清样品包含1U至100U的活性/ml卵清。分析来自21只G1鸡的卵清。来自10只鸡的卵清经测试对于hLAL活性为阳性。
实施例13
转基因禽类来源的LAL的体外分析
使用巨噬细胞和成纤维细胞体外检查转基因禽类的输卵管细胞中产生的LAL(在本文中称为“SBC-102”、“禽类来源的LAL”、“LAL”或“hLAL”)结合细胞和被内化至溶酶体区室的能力。当与巨噬细胞一起孵育时，发现荧光标记的SBC-102定位至溶酶体。可通过使用甘露糖多糖竞争剂减弱该作用，这暗示着N-乙酰葡糖胺/甘露糖(GlcNAc/甘露糖)受体作为被此类细胞识别和摄取的机制。在体外孵育后，SBC-102在LAL-缺乏人成纤维细胞和正常鼠成纤维细胞中增加细胞缔合的LAL活性，这表明对于SBC-102的暴露可导致对不足的酶促活性的充分替代。
甘露糖-6-磷酸(M6P)存在于SBC-102的寡糖结构中，已显示所述寡糖结构通过遍在的M6P受体参与溶酶体酶至多种细胞类型的递送。
从转基因母鸡的卵清纯化LAL。俄勒冈绿NHS获自InvitrogenTM(#0-10241)。大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383和小鼠成纤维细胞系NIH-3T3获自ATCC。LAL-缺陷型沃尔曼成纤维细胞获自Coriell医学研究所(Coriell Institute for Medical Research)以及
Figure BDA0000779217090000611
红获自InvitrogenTM。
酶标记：按照制造商的推荐，用俄勒冈绿标记4mg PBS中的转基因禽类来源的LAL，随后将反应物对PBS进行透析，随后浓缩。
巨噬细胞摄取：将荧光标记的转基因禽类来源的LAL(5μg/mL)和
Figure BDA0000779217090000612
红与NR8383细胞一起孵育2小时。利用共聚焦荧光显微镜在488nm和随后514nm使用连续扫描模式检查细胞。
与甘露聚糖的竞争性抑制：将荧光标记的SBC-102(5ug/mL)和甘露聚糖与NR8383细胞一起孵育2小时。对细胞进行胰蛋白酶处理，使用中位荧光强度作为终点利用荧光活化细胞分选术测量LAL摄取。
使用巨噬细胞系NR8383检查转基因禽类来源的LAL被摄取和随后整合入靶细胞的溶酶体的能力。将荧光标记的转基因禽类来源的LAL和溶酶体标记“
Figure BDA0000779217090000613
红”(InvitrogenTM)与细胞一起孵育2小时。随后利用共聚焦荧光显微镜，使用连续扫描模式检查转基因禽类来源的LAL和溶酶体标记在这些细胞中的共定位(图20)。LAL显示至溶酶体的定位，这与使用来自多种来源的rhLAL的类似体外研究一致。
已使用巨噬细胞系NR8383通过竞争性结合测定评估转基因禽类来源的LAL对GlcNAc/甘露糖受体的结合特异性(图21)。将5μg/mL的荧光标记的(俄勒冈绿(OregonGreen))转基因禽类来源的LAL和不同浓度的含甘露糖寡糖、甘露聚糖与细胞共孵育2小时。使用中位荧光强度作为终点，利用荧光活化细胞分选分析定量与无甘露聚糖对照相比较的转基因禽类来源的LAL摄取的相对抑制。观察到转基因禽类来源的LAL结合/摄取的甘露聚糖剂量依赖性抑制，这与转基因禽类来源的LAL：GlcNAcR相互作用一致。
此外，通过利用甘露糖-6-磷酸的竞争性实验显示成纤维细胞中甘露糖-6-磷酸介导的摄取(结果未示出)。
已使用正常和LAL缺乏细胞在体外检查了转基因禽类来源的LAL暴露增强细胞中LAL活性的能力。在浓度为0、0.16或0.5μg/mL的转基因禽类来源的LAL存在的情况下孵育从沃尔曼患者分离的成纤维细胞和正常鼠成纤维细胞(NIH-3T3)，进行5小时。随后洗涤细胞以除去非特异性信号，使用4-MUO底物测定细胞裂解物的LAL活性。内源性细胞-缔合的LAL活性在沃尔曼成纤维细胞中更低(与在NIH-3T3中相比较)，在用转基因禽类来源的LAL孵育后，在两种细胞类型中都观察到活性的剂量依赖性增强(图22)。
实施例14
转基因禽类来源的LAL的体内分析
始于4周龄，每周一次用SBC-102(5mg/kg,IV)或安慰剂处理LAL-缺乏Yoshida大鼠(即，纯合的)(参见Kuriyama等人(1990),Journal of Lipid Research,第31卷,p 1605-1611；Nakagawa等人,(1995)Journal of Lipid Research,第36卷,p 2212-2218；以及Yoshida和Kuriyama(1990)Laboratory Animal Science,第40卷,p 486-489)，进行4周。对于每次施用，以两个相同的剂量(2.5mg/kg)间隔30分钟将SBC-102注射入大鼠尾静脉。在最终给药后1周检查大鼠和年龄匹配的野生型对照。以一式三份重复进行分析。
SBC-102处理的动物的总体病理学检查显示除器官尺寸减小外肝的颜色正常化。SBC-102处理的小鼠显示基本上正常的肝组织学，与媒介物处理的动物的泡沫状巨噬细胞的大量积累(数据未示出)形成鲜明对照。在LAL-/-大鼠中升高的血清丙氨酸和天冬氨酸转移酶水平在SBC-102处理的大鼠中也下降了(未示出)。
测定每只大鼠的内脏和组织的质量，数据示于图23中。在每周以5mg/kg施用一次媒介物或SBC-102，进行4周后，LAL-/-和LAL+/+大鼠的器官尺寸表示为8周龄时测定的体重的百分比。
将SBC-102处理的或媒介物处理的Yoshida大鼠的体重与野生型大鼠相比较，这示于图24中。以单次剂量或以分份剂量(在4小时的时间段内给出)通过IV注射给LAL-/-大鼠施用SBC-102(5mg/kg)或媒介物。LAL+/+大鼠为年龄匹配的同窝对照。
实施例15
甘油三酯分析
对来自野生型动物、纯合安慰剂处理的动物和纯合SBC-102处理的动物的肝和脾组织进行甘油三酯分析。使用标准方法(即，MBL国际甘油三酯定量试剂盒，Catalog#JM-K622-100)进行甘油三酯分析，以一式三份重复进行该分析。
表3：野生型和LAL缺乏大鼠的肝和脾甘油三酯的水平
Figure BDA0000779217090000631
肝底物水平
图25显示在每周以5mg·kg-1施用一次媒介物或SBC-102，进行4周后，在8周龄时测定的WT和LAL缺乏大鼠的肝胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯水平。
实施例16
剂量反应研究
基于上面进行的研究，在LAL-/-大鼠中检查许多LAL("SBC-102")的给药和给药安排(qw和qow)的药代动力学(PD)效应。在这些研究中，始于4周龄，以0.2、1、3和5mg/kg,qow的剂量，或0.35、1和5mg/kg,qw的剂量，通过IV注射施用SBC-102，进行1个月。结果显示体重(BW)增加(图26)、器官巨大症(图27)和组织底物水平(图28)的改善。血清转氨酶水平也随着SBC-102剂量增加而降低，在更高的剂量上水平基本上达到野生型水平。
实施例17
大鼠模型中重组LAL的施用
在于Yoshida和Kuriyama(1990)Laboratory Animal Science,第40卷,p 486-489中描述的LAL缺乏Donryu大鼠中评估利用重组人溶酶体酸性脂酶(LAL)的重复给药对体重、组织甘油三酯和胆固醇、肝肿大、脾肿大、淋巴结病、肠重量以及其它参数的作用(也参见Kuriyama等人，(1990)Journal of Lipid Research,第31卷,p 1605-1611；Nakagawa等人，(1995)Journal of Lipid Research,第36卷,p 2212-2218)，将所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。
在4周龄时，将对于LAL缺失是纯合的Donryu大鼠(LAL-/-)分配至待用在转基因鸡输卵管系统中产生的重组人LAL或盐水安慰剂给药的组中。野生型年龄匹配的同窝出生大鼠用作对照。每周一次进行4周(总共4个剂量)或每2周一次进行4周(总共两个剂量)以单次剂量或以分份剂量(相隔30分钟给出的)通过尾-静脉注射向LAL-/-大鼠给药。LAL的剂量为1mg/kg或5mg/kg。给药方案示于表4中。用苯海拉明(5mg/kg)预处理大鼠以抵消潜在的过敏反应，基于先前在用于治疗溶酶体贮积病的酶替代疗法的动物模型中的经验的方法(Shull等人，(1994)Proceedings of the National Academy of Science，第91卷,p.12937；Bielicki等人，(1999)The Journal of Biological Chemistry,274,p.36335；Vogler等人，(1999)Pediatric Research,45,p.838.)，将所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。
图29显示每周施用1mg/kg的LAL或每周施用5mg/kg的LAL或每2周施用5mg/kg的LAL的大鼠的体重增长的日进展。可在图中看到在两个剂量大小和频率之间几乎不存在或不存在疗效的差异。
表4：称重和给药方案
Figure BDA0000779217090000641
Figure BDA0000779217090000651
用重组LAL处理的LAL-/-大鼠的病理学检查
在实施例1描述的研究结束时，人道地使研究动物安乐死，进行尸检以检查总体病理学、组织病理学和临床化学。肉眼尸检包括身体的外表面、所有孔口以及颅腔、胸腔和腹腔以及它们的内容物的检查。测定大鼠的内脏和组织的质量，采集器官和组织，将其在10％中性缓冲福尔马林中进行固定。固定后，处理组织，制备和评估苏木精和伊红染色的切片的组织学载片。
分析的处理的动物的总体病理学检查显示肝尺寸和颜色大体正常化，如可在图30中显示的解剖中看到的。测定器官体重比，所述器官体重比显示与安慰剂处理的大鼠相比较，被解剖的成功处理的动物的肝、脾、肠系膜组织、十二指肠、空肠和回肠的相对器官尺寸减小(图23)。来自分析的LAL处理的大鼠的肝组织的组织病理学显示基本上正常的肝组织学，与安慰剂处理的动物的泡沫状巨噬细胞的大量积累形成鲜明对照(图30)。
实施例18
通过施用重组LAL治疗沃尔曼病(WD)
在7周龄时，由于自出生以来体重增长的困难和不良进展，女性患者被医院接收。在最初体格检查时，患者称重为3.6kg(出生体重3.7kg)并且非常瘦，皮肤松弛皱褶。腹部膨胀，具有6cm的坚硬肝肿大和约4cm的坚硬脾肿大。在腹股沟中淋巴结肿大非常明显并且肌肉活动非常弱。
初血红蛋白水平为9.2gm，血小板506,000以及白细胞11,550。尿分析是正常的，骨髓穿刺涂片显示形成空泡的淋巴细胞和许多泡沫细胞。血清化学测量：总脂质834mg/100ml，磷脂176mg/100ml，甘油三酯141mg/100ml，胆固醇129mg/100ml，胆红素0.3mg/100ml，碱性磷酸酶9.0BU％，SGOT 90个单位，SGPT 50个单位，胆碱酯酶20个单位，尿素氮8.3mg，空腹血糖(fasting sugar)45mg/100ml。腹部的CT扫描显示肝脾肿大和具有钙化的双侧对称肾上腺增大。
通过手术向患者植入静脉血管进入口(venous vascular access port)以便给药。在将进入口连接至移动输注机器后，在LAL输注前20分钟用1mg/kg苯海拉明预处理患者以抵消潜在的过敏性输注反应。随后在5个小时的过程中通过静脉内输注以1mg/kg向患者施用LAL。无限期地每7天重复该疗法一次。
在施用LAL的第一剂量的2周内，患者经历体重增长的显著改善和关键腹部器官尺寸的正常化，如通过超声测定的。实验室结果显示LAL的输注恢复了患者的溶酶体酸性脂酶活性并且导致相关异常的校正。
实施例19
通过施用重组LAL治疗胆固醇酯沉积病(CESD)
一名3岁男孩由其儿科医生检查患有腹部皮疹搔痒。在腹部检查后，医生注意到肝肿大，并且通过超声得到确认。此刻未进行诊断，定期监测患者。
在8岁时，他因胃肠炎而被医院接收。肝脏活组织光学显微镜检查显示肝细胞中增加的胞质内糖原和小脂滴。电子显微镜显示具有小的电子致密颗粒的膜结合脂滴。产生了糖原贮积病III型(DeBrancher病)的工作诊断，但皮肤成纤维细胞Debrancher活性是正常的。
10岁时，肝肿大持续并且进行第二次肝脏活组织检查。光学显微镜显示改变的肝实质的小叶结构，膨胀的肝细胞包含细胞质颗粒和空泡，具有轻度傍门静脉纤维化(mildperiportal fibrosis)。发现成纤维细胞酸性脂酶活性为正常的7％，从而确认了CESD的诊断。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的血浆浓度各自分别高于与年龄和性别匹配的7.51、3.24和5.58mmol/L的第95百分位，然而血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低于0.47mmol/L的第5百分位；他患有混合性高脂血症(高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α-脂蛋白血症和高β-脂蛋白血症)。
通过手术向患者植入静脉血管进入口以便给药。在将进入口连接至移动输注机器后，在LAL输注前20分钟用5mg/kg苯海拉明预处理患者以抵消潜在的过敏性输注反应。随后在5个小时的过程中通过静脉内输注以5mg/kg向患者施用LAL。无限期地每14天重复该疗法一次。
在施用LAL的第一剂量的2周内，患者经历体重增长的显著改善和关键器官尺寸的正常化，如通过超声测定的。实验室结果显示LAL的输注恢复了患者的溶酶体酸性脂酶活性并且导致相关异常的校正。
实施例20
医学产品的描述和组成
本文中描述的LAL的药品("SBC-102")是从从转基因原鸡属产生的卵清纯化的重组人溶酶体酸性脂酶(rhLAL)。用于SBC-102的赋形剂与用于目前市场上用于溶酶体贮积症(LSD)的其它产品的赋形剂相似，并且已被选择来维持药品的稳定性。
SBC-102是在具有非天然胶乳(丁基)
Figure BDA0000779217090000671
-包被的塞子和铝质钳口盖(aluminum crimp seal)的干净的I型硼硅玻璃小瓶中提供的澄清、无色、无菌液体。SBC-102以水溶液形式提供，该溶液由SBC-102(2mg/mL)、柠檬酸三钠二水合物(13.7mg/mL,USP)、柠檬酸一水合物(1.57mg/mL,USP)、人血清白蛋白(10mg/mL,USP)和注射用水(至终体积，USP)组成。SBC-102的pH为5.9±0.2。SBC-102不包含防腐剂并且小瓶仅打算单次使用。
表5 SBC-102(LAL)中的赋形剂
赋形剂 CAS编号 等级 功能
柠檬酸三钠二水合物 6132-04-03 USP 缓冲液
柠檬酸一水合物 5949-29-1 USP 缓冲液
人血清白蛋白 70024-90-7 USP 稳定剂
药品的组分
表6 SBC-102的制剂
组分 浓度
SBC-102(rhLAL) 2mg/mL*
柠檬酸三钠二水合物 13.7mg/mL
柠檬酸一水合物 1.57mg/mL
人血清白蛋白 10mg/mL
注射用水，加至 1.0mL
通过解释本发明(但非限制本发明)来提供上述说明书中的每一个实施例。事实上，对于本领域技术人员来说显而易见是可在不背离本发明的范围或精神的情况下进行各种修饰、组合、添加、缺失和变型。例如，作为一个实施方案的部分举例说明或描述的特征可用于另一个实施方案中来产生另外的实施方案。本发明意欲涵盖此类修饰、组合、添加、缺失和变型。
上述说明书中引用的所有文献(例如，美国专利、美国专利申请、公布)通过引用并入本文。本发明的各种修饰和变型对于本领域技术人员来说是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。
虽然已参考其示例性实施方案特别地显示和描述了本发明，但本领域技术人员将理解，可在不背离由所附权利要求包括的本发明的范围的情况下在其中进行许多形式和内容上的改变。
Figure IDA0000779217160000011
Figure IDA0000779217160000021
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Figure IDA0000779217160000461

Claims (10)

1.一种药物制剂，其包含与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的分离的人重组溶酶体酸性脂酶，所述人重组溶酶体酸性脂酶包含一种或多种N-聚糖结构，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶在对应于SEQ ID NO:2的Asn15、Asn80、Asn140、Asn252和Asn300位置上被N-连接糖基化，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶包含如下N-连接糖基化谱：
a)在Asn15上，GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2；
b)在Asn80上，Phos2Man7GlcNAc2；
c)在Asn140上，Phos1Man6GlcNAc2，
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2；
Man3GlcNAc2；
GlcNAc2Man3GlcNAc2；
GlcNAc3Man3GlcNAc2；
GlcNAc4Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2；
d)在Asn252上，Man7GlcNAc2，
Man8GlcNAc2，
Man9GlcNAc2，
Phos1Man8GlcNAc2，或
Phos1Man9GlcNAc2；和
e)在Asn300上，GlcNAc2Man3GlcNAc2，
GlcNAc3Man3GlcNAc2，
GlcNAc4Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2，
GlcNAc5Man3GlcNAc2，
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2，
GlcNAc6Man3GlcNAc2，或
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2，
其中Man＝甘露糖，
GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，
Phos＝磷酸，
Gal＝半乳糖
并且其中所述药物制剂是pH为5.6至6.2的水溶液。
2.权利要求1的药物制剂，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶的Asn51未被糖基化。
3.权利要求1的药物制剂，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶包含不具有木糖的N-聚糖结构并且N-聚糖结构中的低于15％包含唾液酸。
4.权利要求1的药物制剂，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶不包含岩藻糖。
5.权利要求1的药物制剂，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶是选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽。
6.权利要求1的药物制剂，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶在种系转基因禽类中产生。
7.权利要求6的药物制剂，其中所述人重组溶酶体酸性脂酶从所述种系转基因禽类的输卵管细胞产生。
8.权利要求6或7的药物制剂，其中所述禽类为鸡。
9.权利要求1-7中任一项的药物制剂，其中所述药物制剂的pH为5.9±0.2。
10.权利要求8的药物制剂，其中所述药物制剂的pH为5.9±0.2。
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