JP5925187B2 - リソソーム蓄積症酵素 - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２０１０年４月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／３４３，１７７号、２０１０年５月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／３９６，３７６号、２０１０年９月９日に出願された米国特許仮出願第６１／４０３，０１１号、２０１０年１０月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／４５６，０１４号、２０１１年１月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／４３２，３７２号の利益を主張する。上記出願の教示はすべて参照により本明細書に組み込まれる。

リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症は、酵素の欠損によるリソソーム内でのコレステリルエステル（ＣＥ）およびトリグリセリド（ＴＡＧ）の分解の不全を特徴とする、極めて稀なリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。ＬＡＬ欠損症は、数多くの組織および細胞型内に基質が蓄積される他のリソソーム蓄積障害と類似している。ＬＡＬ欠損症では、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞、脾臓の組織球および小腸の固有層を含めた細網内皮系の細胞内での基質の蓄積が最も著しい。細網内皮細胞はマクロファージマンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン受容体（マクロファージマンノース受容体すなわちＭＭＲ、ＣＤ２０６としても知られる）を発現し、この受容体はＧｌｃＮＡｃまたはマンノース末端のＮ−グリカンを有するタンパク質の結合、細胞内取込みおよびリソソーム内への移行を仲介し、上記の鍵となる細胞型における酵素欠損の潜在的な矯正のための経路をもたらす。

ＬＡＬ欠損症は、最も多くは胃腸管、肝臓および心血管の合併症を伴って発症し、罹患率および死亡率の高い多系統疾患である。ＬＡＬ欠損症の臨床的影響は、多数の組織におけるリソソーム内での大量の脂質物質の蓄積、ならびに肝コレステロール合成の大幅な増加を含めたコレステロールおよび脂質の恒常性維持機構の重度の攪乱によるものである。ＬＡＬ欠損症には、ウォルマン病（ＷＤ）およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の少なくとも２つの表現型がある。

ウォルマン病はＬＡＬ欠損症の最も悪性の症状である。この表現型は、成長不全、吸収不良、脂肪便、重度の体重減少および肝腫大を含めた、胃腸管および肝臓での発症を特徴とする。ウォルマン病は急速進行性であり、通常は生後１年以内に致命的となる。生後１年以内にＬＡＬ欠損症による成長不全を示す患者が１２か月齢よりも長く生存することは非常に稀であることが、症例報告レビューで示されている。この最も悪性の型では、成長不全が最も顕著な臨床上の特徴であり、かつ早期死亡率の鍵となる要因である。肝腫大およびトランスアミナーゼ上昇により明らかである肝合併症も乳児でよく見られる。身体所見としては肝腫大および脾腫による腹部膨張が挙げられ、また放射線検査で副腎の石灰化が明らかになることが多い。実験室評価では通常、血中トランスアミナーゼレベルの上昇およびＬＡＬ酵素活性の欠損または顕著な減少が明らかとなる。コレステロールおよびトリグリセリドの血中濃度の上昇も患者において見られる。

ウォルマン病に対する現在の治療選択は極めて限られたものである。発熱および／または感染の証拠が見られれば、抗生物質を乳児に投与する。副腎機能不全に対するステロイド補充療法および特殊な栄養補給を処方する場合もあるが、こうした介入が死亡を防ぐという証拠はなく、またこれらが短期間の生存に影響を与えるか否かも現在のところ不明である。骨髄移植の治療を受けた４人の一連のＬＡＬ欠損症患者では、全４患者が治療の合併症により移植の数か月以内に死亡した。

またＬＡＬ欠損症の患者は、後年に顕著な肝臓および心血管の合併症を発症する場合もあり、これは多くの場合コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）と呼ばれる。ＣＥＳＤでは、著しい肝腫大、肝細胞の壊死、トランスアミナーゼ上昇、肝硬変および線維症により、肝臓が重篤な影響を受ける。またＬＡＬ欠損症では、ＣＥおよびＴＧレベルの上昇により、高脂血症および進行性アテローム性動脈硬化症も見られる。具体的には、生後間もなく動脈壁に脂肪性沈着物が蓄積することが記載されている。この沈着物により動脈内腔が狭まり、血管閉塞が生じて、心筋梗塞および脳卒中を含めた重篤な心血管事象危険性が高まる可能性がある。ＣＥＳＤの症候は極めて多様であり、患者によっては、成人後期に合併症が発症するまで診断されない場合もあれば、早期幼児期に肝障害が発症する場合もあり得る。ＣＥＳＤは短命と関連する重篤な健康障害であり、ＣＥＳＤ患者の平均余命は併発する合併症の重症度によって異なる。

ＣＥＳＤ表現型に対する現在の治療選択は、コレステロールおよびトリグリセリドの多い食物を排除した食事による脂質蓄積の制御、ならびにコレステロール低下薬の投与によるコレステロール合成およびアポリポタンパク質Ｂ産生の抑制に重点を置いたものである。臨床改善が見られる場合もあるが、基礎疾患の発症は持続し、依然として疾患は進行する。

多くの場合、ＬＡＬ欠損症の治療法では生涯にわたる治療が必要とされる。さらに、タンパク質療法の費用が高いため、最小有効量の治療剤を投与してＬＡＬ欠損症を治療することが望ましい。しかし現在のところ、ＬＡＬ欠損症、特にウォルマン病およびＣＥＳＤ罹患している患者を治療する有効な治療法は存在しない。したがって、患者の生活に質を改善するために投与頻度を最小限にした有効な治療法が大いに必要とされている。また、安定であり、かつ患者の罹患組織細胞内のリソソーム区画に対して効率的に標的化されたＬＡＬタンパク質を産生することができる、高発現で堅固なタンパク質産生プラットフォームも必要とされている。

例えばＬＡＬ欠損症に関連する状態を治療する治療法での使用に特に適した、ＬＡＬの組成物が本明細書に開示される。本明細書に記載のＬＡＬ分子は、対象、例えばヒト対象に投与した場合に細胞のリソソーム内への効率的かつ迅速な取り込みを生じる、特定のグリカン構造を含む。

一態様では、本明細書に開示される組成物はヒトＬＡＬを含み、かなりの割合のヒトＬＡＬが、例えば肝細胞上に見られる細胞表面上のマンノース−６−リン酸受容体による内部移行のためのリガンドとして働き得る、少なくとも１つのマンノース−６−リン酸グリカン部分を含む。一実施形態では、組成物中に含まれるＬＡＬの３０％以上、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％が、少なくとも１つのマンノース−６−リン酸部分を含む。マンノース−６−リン酸部分は、例えば、配列番号２のＡｓｎ^１５、Ａｓｎ^５１、Ａｓｎ^８０、Ａｓｎ^１４０、Ａｓｎ^２５２およびＡｓｎ^３００からなる群より選択される１つ以上の残基に位置するＮ−グリカン構造上に見ることができる。

別の態様では、本明細書に開示される組成物はヒトＬＡＬを含み、かなりの割合のヒトＬＡＬが、そのＮ−グリカン構造のいずれにも、細胞内への酵素の内部移行に干渉し得るシアル酸部分を含まない。一実施形態では、組成物中のＬＡＬの１５％以下、例えば、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下がそのＮ−グリカン構造にシアル酸部分を含むか、または実質的にすべてのＬＡＬがシアル酸部分を含まない。

別の態様では、本明細書に開示される組成物はヒトＬＡＬを含み、かなりの割合のヒトＬＡＬが、そのＮ−グリカン構造のいずれにもフコース部分を含まない。一実施形態では、組成物中に含まれるＬＡＬの５０％以下、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下がそのＮ−グリカン構造にフコース部分を含むか、または実質的にすべてのＬＡＬがフコース部分を含まない。

さらに別の態様では、ＬＡＬ含有組成物を産生するのに適したベクター、宿主細胞、発現系および関連する方法が記載される。

一般に、本明細書で述べられ開示される本発明のＬＡＬはヒトＬＡＬである。一実施形態では、ＬＡＬを含む組成物は以下のアミノ酸配列を有する成熟ＬＡＬを含む：
ＳＧＧＫＬＴＡＶＤＰＥＴＮＭＮＶＳＥＩＩＳＹＷＧＦＰＳＥＥＹＬＶＥＴＥＤＧＹＩＬＣＬＮＲＩＰＨＧＲＫＮＨＳＤＫＧＰＫＰＷＦＬＱＨＧＬＬＡＤＳＳＮＷＶＴＮＬＡＮＳＳＬＧＦＩＬＡＤＡＧＦＤＶＷＭＧＮＳＲＧＮＴＷＳＲＫＨＫＴＬＳＶＳＱＤＥＦＷＡＦＳＹＤＥＭＡＫＹＤＬＰＡＳＩＮＦＩＬＮＫＴＧＱＥＱＶＹＹＶＧＨＳＱＧＴＴＩＧＦＩＡＦＳＱＩＰＥＬＡＫＲＩＫＭＦＦＡＬＧＰＶＡＳＶＡＦＣＴＳＰＭＡＫＬＧＲＬＰＤＨＬＩＫＤＬＦＧＤＫＥＦＬＰＱＳＡＦＬＫＷＬＧＴＨＶＣＴＨＶＩＬＫＥＬＣＧＮＬＣＦＬＬＣＧＦＮＥＲＮＬＮＭＳＲＶＤＶＹＴＴＨＳＰＡＧＴＳＶＱＮＭＬＨＷＳＱＡＶＫＦＱＫＦＱＡＦＤＷＧＳＳＡＫＮＹＦＨＹＮＱＳＹＰＰＴＹＮＶＫＤＭＬＶＰＴＡＶＷＳＧＧＨＤＷＬＡＤＶＹＤＶＮＩＬＬＴＱＩＮＬＶＦＨＥＳＩＰＥＷＥＨＬＤＦＩＷＧＬＤＡＰＷＲＬＹＮＫＩＩＮＬＭＲＫＹＱ（配列番号２）。

別の実施形態では、成熟ＬＡＬは以下のアミノ酸配列を有する：
ＧＫＬＴＡＶＤＰＥＴＮＭＮＶＳＥＩＩＳＹＷＧＦＰＳＥＥＹＬＶＥＴＥＤＧＹＩＬＣＬＮＲＩＰＨＧＲＫＮＨＳＤＫＧＰＫＰＷＦＬＱＨＧＬＬＡＤＳＳＮＷＶＴＮＬＡＮＳＳＬＧＦＩＬＡＤＡＧＦＤＶＷＭＧＮＳＲＧＮＴＷＳＲＫＨＫＴＬＳＶＳＱＤＥＦＷＡＦＳＹＤＥＭＡＫＹＤＬＰＡＳＩＮＦＩＬＮＫＴＧＱＥＱＶＹＹＶＧＨＳＱＧＴＴＩＧＦＩＡＦＳＱＩＰＥＬＡＫＲＩＫＭＦＦＡＬＧＰＶＡＳＶＡＦＣＴＳＰＭＡＫＬＧＲＬＰＤＨＬＩＫＤＬＦＧＤＫＥＦＬＰＱＳＡＦＬＫＷＬＧＴＨＶＣＴＨＶＩＬＫＥＬＣＧＮＬＣＦＬＬＣＧＦＮＥＲＮＬＮＭＳＲＶＤＶＹＴＴＨＳＰＡＧＴＳＶＱＮＭＬＨＷＳＱＡＶＫＦＱＫＦＱＡＦＤＷＧＳＳＡＫＮＹＦＨＹＮＱＳＹＰＰＴＹＮＶＫＤＭＬＶＰＴＡＶＷＳＧＧＨＤＷＬＡＤＶＹＤＶＮＩＬＬＴＱＩＮＬＶＦＨＥＳＩＰＥＷＥＨＬＤＦＩＷＧＬＤＡＰＷＲＬＹＮＫＩＩＮＬＭＲＫＹＱ（配列番号３）。

別の実施形態では、成熟ＬＡＬは以下のアミノ酸配列を有する：
ＴＡＶＤＰＥＴＮＭＮＶＳＥＩＩＳＹＷＧＦＰＳＥＥＹＬＶＥＴＥＤＧＹＩＬＣＬＮＲＩＰＨＧＲＫＮＨＳＤＫＧＰＫＰＷＦＬＱＨＧＬＬＡＤＳＳＮＷＶＴＮＬＡＮＳＳＬＧＦＩＬＡＤＡＧＦＤＶＷＭＧＮＳＲＧＮＴＷＳＲＫＨＫＴＬＳＶＳＱＤＥＦＷＡＦＳＹＤＥＭＡＫＹＤＬＰＡＳＩＮＦＩＬＮＫＴＧＱＥＱＶＹＹＶＧＨＳＱＧＴＴＩＧＦＩＡＦＳＱＩＰＥＬＡＫＲＩＫＭＦＦＡＬＧＰＶＡＳＶＡＦＣＴＳＰＭＡＫＬＧＲＬＰＤＨＬＩＫＤＬＦＧＤＫＥＦＬＰＱＳＡＦＬＫＷＬＧＴＨＶＣＴＨＶＩＬＫＥＬＣＧＮＬＣＦＬＬＣＧＦＮＥＲＮＬＮＭＳＲＶＤＶＹＴＴＨＳＰＡＧＴＳＶＱＮＭＬＨＷＳＱＡＶＫＦＱＫＦＱＡＦＤＷＧＳＳＡＫＮＹＦＨＹＮＱＳＹＰＰＴＹＮＶＫＤＭＬＶＰＴＡＶＷＳＧＧＨＤＷＬＡＤＶＹＤＶＮＩＬＬＴＱＩＴＮＬＶＦＨＥＳＩＰＥＷＥＨＬＤＦＩＷＧＬＤＡＰＷＲＬＹＮＫＩＩＮＬＭＲＫＹＱ（配列番号４）。

別の実施形態では、成熟ＬＡＬは以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＶＤＰＥＴＮＭＮＶＳＥＩＩＳＹＷＧＦＰＳＥＥＹＬＶＥＴＥＤＧＹＩＬＣＬＮＲＩＰＨＧＲＫＮＨＳＤＫＧＰＫＰＷＦＬＱＨＧＬＬＡＤＳＳＮＷＶＴＮＬＡＮＳＳＬＧＦＩＬＡＤＡＧＦＤＶＷＭＧＮＳＲＧＮＴＷＳＲＫＨＫＴＬＳＶＳＱＤＥＦＷＡＦＳＹＤＥＭＡＫＹＤＬＰＡＳＩＮＦＩＬＮＫＴＧＱＥＱＶＹＹＶＧＨＳＱＧＴＴＩＧＦＩＡＦＳＱＩＰＥＬＡＫＲＩＫＭＦＦＡＬＧＰＶＡＳＶＡＦＣＴＳＰＭＡＫＬＧＲＬＰＤＨＬＩＫＤＬＦＧＤＫＥＦＬＰＱＳＡＦＬＫＷＬＧＴＨＶＣＴＨＶＩＬＫＥＬＣＧＮＬＣＦＬＬＣＧＦＮＥＲＮＬＮＭＳＲＶＤＶＹＴＴＨＳＰＡＧＴＳＶＱＮＭＬＨＷＳＱＡＶＫＦＱＫＦＱＡＦＤＷＧＳＳＡＫＮＹＦＨＹＮＱＳＹＰＰＴＹＮＶＫＤＭＬＶＰＴＡＶＷＳＧＧＨＤＷＬＡＤＶＹＤＶＮＩＬＬＴＱＩＴＮＬＶＦＨＥＳＩＰＥＷＥＨＬＤＦＩＷＧＬＤＡＰＷＲＬＹＮＫＩＩＮＬＭＲＫＹＱ（配列番号１９）。

別の実施形態では、成熟ＬＡＬは、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号１９からなる群より選択される少なくとも２つのポリペプチドの混合物である。

また本発明は、本明細書に開示されるタンパク質のような個々の種類の有用なタンパク質分子の、単離された混合物を含有する組成物を提供し、混合物中に含有される１つ以上のタンパク質分子には、特定のオリゴ糖構造、具体的には本明細書に開示されるオリゴ糖構造が結合している。例えば、本発明は、１つ以上の以下の構造Ａ−ｎ〜Ｏ−ｎによりグリコシル化されたＬＡＬ分子を含有するＬＡＬ分子、例えばヒトＬＡＬ分子の単離された混合物を提供する：

四角＝Ｎ−アセチルグルコサミン
黒四角＝マンノース−６−リン酸
○＝マンノース
黒丸＝ガラクトース
黒三角＝フコース。

本発明の一態様では、組成物は任意の単離された個々の上記ポリペプチドまたは上記ポリペプチドの組合せを含む。一実施形態では、組成物は医薬組成物、例えば、組成物が、例えば対象（例えばヒト、特に、ある状態に罹患しているまたは状態を有すると診断された患者）への投与に適するように、薬学的に許容される担体をさらに含む製剤であり得る。組成物は、静脈内投与を含めた様々な方法で投与することができる。別の実施形態では、組成物は第二の薬剤をさらに含むことができる。このような薬剤は、薬物、または対象に投与されたときに生物学的過程に影響を与え得るもしくはそれを調節し得る薬剤であり得る。例えば、第二の薬剤は免疫調節剤であり得る。このような免疫調節剤としては、本明細書に記載の任意のＬＡＬ組成物とともに投与された場合（すなわち、同時に、または直前もしくは直後に投与された場合）に、対象におけるＬＡＬ組成物の免疫原性を低減する作用を有し得る任意の薬剤（例えば、リツキシマブ、または他の任意のＢ細胞枯渇抗体）を挙げることができる。

最後の態様では、ＬＡＬ欠損症に関連した症状を治療する方法および組成物が開示される。

以下の詳細な記載を添付の図面および配列と合わせて再考すれば、本発明のさらなる目的および態様がより明らかになるであろう。

ヒトＬＡＬのアミノ酸配列を表す図である。組換えｈＬＡＬのアミノ酸配列は、天然ヒトＬＡＬの配列と１００％の相同性を示す。成熟型のｈＬＡＬに下線が施してある。 ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのｒｈＬＡＬ導入遺伝子である組換えｈＬＡＬのヌクレオチド配列を表す図である。 図３Ａおよび３Ｂ。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡおよびそのプロウイルス領域の略図である。図３Ａは、形質導入粒子の作製に使用したヒトＬＡＬレトロウイルス発現ベクターを表す略図である（プラスミドのＤＮＡ配列は添付書類Ａにある）。図３Ａは、ゲノム内に組み込まれたｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのプロウイルス領域の図である。ＳＩＮ ＬＴＲは自己活性化型の長い末端反復配列；ＯＶ ＤＨＳＩＩＩエンハンサーはオボアルブミン遺伝子のＤＮアーゼ高感受性部位ＩＩＩ；ＯＶイントロンはオボアルブミン５’非翻訳領域およびイントロン１；ｈＬＡＬはヒトＬＡＬ ｃＤＮＡ；ＯＶ３’ＵＴＲはオボアルブミン遺伝子３’非翻訳領域；部分的ｇａｇは部分的ｇａｇ遺伝子；ＬＴＲは長い末端反復配列である。 図４。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのヌクレオチド配列を表す図である。 図４。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのヌクレオチド配列を表す図である。 図４。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのヌクレオチド配列を表す図である。 図４。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのヌクレオチド配列を表す図である。 図５。ゲノム内に組み込まれたｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡプロウイルス領域のヌクレオチド配列を表す図である。 図５。ゲノム内に組み込まれたｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡプロウイルス領域のヌクレオチド配列を表す図である。 図５。ゲノム内に組み込まれたｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡプロウイルス領域のヌクレオチド配列を表す図である。 図６。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉベクターのヌクレオチド配列を表す図である。 図６。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉベクターのヌクレオチド配列を表す図である。 図６。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉベクターのヌクレオチド配列を表す図である。 図６。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉベクターのヌクレオチド配列を表す図である。 ｒｈＬＡＬアダプターのヌクレオチド配列を表す図である。 部分的オボアルブミンプロモーターを含むｒｈＬＡＬのヌクレオチド配列を表す図である。 ＯＶＲ１プロモーターのヌクレオチド配列を表す図である。 ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡベクターを構築するために使用した段階の略図である。 ＸＬＬ１０９のヘミ接合性トランスジェニックＧ１子孫由来の血液ＤＮＡ試料のリアルタイムＰＣＲ解析を表す図である。ヘミ接合性Ｇ１子孫である１ＬＬ７４６６の複製ＤＮＡ試料由来のシグナルは、サイクル２２の前にデルタＲｎの増加が始まる曲線により示される。２つの非トランスジェニック子孫の曲線が示されているが、これらの曲線は少なくとも３４サイクルの間はベースライン付近にとどまっている。 図１２Ａ〜１２Ｄ。ＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ導入遺伝子を担持するＧ１ニワトリのサザン解析を表す図である。図１２Ａは組み込まれた導入遺伝子の略図を示し、隣接ゲノム領域が、導入遺伝子ＢｌｐＩ部位の既知の位置および隣接ゲノムＢｌｐＩ部位の予測位置とともに示されている。ＯＶプロモータープローブおよびｈＬＡＬコード配列プローブ（ｈＬＡＬプローブ）の位置が黒線で示されている。サザン解析で検出された４．３ｋｂおよび１０．６ｋｂの位置が、４．３ｋｂおよび１０．６ｋｂバンドのゲノム遺伝子および導入遺伝子部分の予測サイズとともに示されている。図１２Ｂは、ＢｌｐＩで消化しＯＶプローブでプローブしたゲノムＤＮＡのサザンブロットを図示している。ＷＴ ＣＴＲＬは非トランスジェニックニワトリから単離されたゲノムＤＮＡである。レーンの上にはＧ１トランスジェニックのＩＤ番号が示されている。ブロットの左側には分子量マーカーの位置およびサイズ（ｋｂ）が示されている。ブロットの右側には検出された導入遺伝子フラグメント（４．３ｋｂ）および内在性オボアルブミン遺伝子（４．１ｋｂ）の位置およびサイズが示されている。図１２ＣはｈＬＡＬプローブでプローブしたサザンブロットを表す図である。ブロットの右側には検出された導入遺伝子フラグメント（１０．６ｋｂ）の位置およびサイズが示されている。図１２Ｄは、４．１ｋｂおよび４．３ｋｂバンドの存在を示すために、図１２Ｂで示される図の一部分を縮尺を拡大して図示したものである。 図１３Ａ。ＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ導入遺伝子の略図である。ＯＶプローブおよびｈＬＡＬプローブにより検出されることが予測されるＡｐａＬＩバンドのサイズも示してある。図１３Ｂは、導入遺伝子サイズ確認のためのＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ導入遺伝子のサザンブロット解析の略図である。ゲノムＤＮＡのサザンブロットでは、ＡｐａＬＩで消化し、ＯＶプローブ（左パネル）またはｈＬＡＬプローブ（右パネル）でプローブした。ＷＴ ＣＴＲＬは非トランスジェニックニワトリから単離されたゲノムＤＮＡである。各レーンの上にはＧ１のＩＤ番号が示されている。ブロットの左側には分子量マーカーの位置およびサイズ（ｋｂ）が示されている。ブロットの右側には、検出された導入遺伝子フラグメント（ＯＶプロモータープローブ、３．６ｋｂ；ｈＬＡＬプローブ、３．８ｋｂ）および内在性オボアルブミン遺伝子（７．７ｋｂ）の位置およびサイズが示されている。 トランスジェニックニワトリの系統を表す図である。各ニワトリの世代数（Ｇ０、Ｇ１またはＧ２）、識別番号、性別および孵化日が示されている。他のＧ１ニワトリは他系統のものである。 卵白からのｈＬＡＬの精製段階を表す図である。 本発明に従って産生されたＬＡＬ中にＮ−結合グリコシル化構造として見られるＮ−グリカンを表す図である。四角はＮ−アセチルグルコサミン；黒四角はマンノース−６−リン酸；丸はマンノース；黒丸はガラクトース；黒三角はフコースを表す。 配列番号１で記述されるＬＡＬポリペプチド（矢印）上に予測Ｎ−グリカン部位の相対的位置を示した図である。各部位で検出されたＮ−グリカンの代表的な構造が示されている。四角はＮ−アセチルグルコサミン；黒四角はマンノース−６−リン酸；丸はマンノース；黒丸はガラクトース；黒三角はフコースである。 ＰＮＧアーゼにより解離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより解析したリン酸化Ｎ−グリカンを表す図である。構造が示されている。 Ｎ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ保持時間に対するＬＡＬの脱リン酸化の効果を表す図である。本発明に従って産生されたＬＡＬを、細菌アルカリホスファターゼで脱リン酸化する（上パネル）か、または未処理のままにした（下パネル）。解離されたＮ−グリカンをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより解析した。 共焦点蛍光顕微鏡により連続スキャンモードを用いて調べた細胞のリソソーム内での組換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）とリソソームマーカーの共局在を表す図である。 マクロファージ細胞系のＮＲ８３８３を用いた競合結合アッセイにより評価した、組換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）のＧｌｃＮＡｃ／マンノース受容体に対する結合特異性を表す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの正常およびＬＡＬ欠損細胞における細胞中の組換えヒトＬＡＬの活性を表す図である。 ＬＡＬ欠損ラットの内部臓器質量に対する組換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）処置の効果を表す図である。臓器サイズは、ＬＡＬ^−／−ラットおよびＬＡＬ^＋／＋ラットにおいて、溶剤またはＳＢＣ−１０２を５ｍｇ／ｋｇで週１回、４週間投与した後に、８週齢で決定された体重のパーセントとして表されている。 溶剤またはＳＢＣ−１０２を５ｍｇ・ｋｇ^−１で週１回、４週間投与した後の野生型およびＬＡＬ欠損ラットの体重を表す図である。Ｘ軸上には、投与を行ったことが４週目から始まるひし形で強調してある。 ＷＴおよびＬＡＬ欠損ラットにおいて、溶剤または組換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）を５ｍｇ・ｋｇ^−１で週１回、４週間投与した後に８週齢で決定された、肝臓のコレステロール、コレステリルエステルおよびトリグリセリドレベルを示す図である。 ＬＡＬ欠損ラットにおいて、組換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）を示されたレベルおよびスケジュールで４週間投与した後に８週齢で決定された、体重増加のパーセントを表す図である。 ＬＡＬ欠損ラットにおいて、ＳＢＣ−１０２を示されたレベルおよびスケジュールで４週間投与した後に８週齢で決定された、体重のパーセントとして表した肝臓重量を示す図である。 ＳＢＣ−１０２を示されたレベルおよびスケジュールで４週間投与した後に８週齢で決定された、組織のコレステリルエステルレベルを表す図である。 １週間当たり１ｍｇ／ｋｇのＬＡＬ、１週間当たり５ｍｇ／ｋｇのＬＡＬまたは２週間当たり５ｍｇ／ｋｇのＬＡＬを投与したラットの毎日の体重増加の経過を示す図である。 処置個体の肉眼的病理検査を表す図であり、上側パネルの解剖に見られるように、肝臓のサイズおよび色がかなり正常化したこと示している。また下側パネルは肝臓組織の組織病理学検査であり、処置ラットのＬＡＬの肝臓組織は正常な肝臓組織像を示し、泡沫状のマクロファージがかなり蓄積しているプラセボ処置ラットとは極めて対照的である。

定義
本明細書において本発明を記載するのに使用される各種用語の意味および範囲を説明および定義するために、ある特定の定義を本明細書にここに記載する。

本明細書で使用される製剤、組成物または成分に関する「許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、治療される対象の全般的健康状態に対して持続的な有害作用を有さないことを意味する。

本明細書で使用される「投与」という用語は、治療を必要とする対象に本発明の組換えヒトリソソーム酸リパーゼを与えることを指す。

「核酸」または「ポリヌクレオチド配列」は、特に限定されないが、天然のヌクレオシド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む、真核ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびに合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を包含する。またこの用語は、１つ以上の修飾塩基を有する配列も包含する。

本明細書で使用される「トリ」という用語は、分類学上のａｖａ綱の生物であるあらゆる種、亜種または品種、例えば、特に限定されないがニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ならびにダチョウ、エミューおよびヒクイドリを含めた走禽類などを指す。この用語は、ニワトリ（Ｇａｌ１ｕｓ Ｇａｌ１ｕｓ）（例えば、白色レグホン、褐色レグホン、横斑ロック（Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ）、オーストラロープ（Ａｕｓｔｒａｌｏｒｐ）、ミノルカ（Ｍｉｎｏｒｃａ）、アムロックス（Ａｍｒｏｘ）、カリフォルニアグレイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｇｒａｙ）、ならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび商業量で一般的に飼育されているその他の家禽の種々の既知の系統を包含する。また、胚および胎仔の段階を含めたすべての発生段階の個々のトリ生物体もこの用語に包含される。

「治療用タンパク質」または「医薬タンパク質」は、薬物の全体または一部を占めるアミノ酸配列を包含する。

「コード配列」または「オープンリーディングフレーム」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写されてポリペプチドへ翻訳され得る（ＤＮＡの場合）か、またはポリペプチドへ翻訳され得る（ｍＲＮＡの場合）ポリヌクレオチド配列または核酸配列を指す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の翻訳開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより定められる。転写終止配列は通常、コード配列の３’側に位置する。コード配列の５’末端および／または３’末端には非翻訳領域が隣接し得る。

「エクソン」は、核転写物へ転写される際に、核スプライシングによるイントロンまたは介在配列の除去後に細胞質ｍＲＮＡ中に「発現される」遺伝子の部分を指す。

核酸「制御配列」または「調節配列」は、定められた宿主細胞内の所与のコード配列の転写および翻訳に必要かつ十分なプロモーター配列、翻訳開始および停止コドン、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを指す。真核細胞に適した制御配列の例は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーである。所望の遺伝子の転写および翻訳に必要かつ十分な制御配列が存在する限り、組換えベクター中にこれらの制御配列がすべて存在しなければならないわけではない。

「作動可能に連結されている」は、所望の機能が遂行されるようにコード配列と制御配列が配置されていることを指す。したがって、コード配列と作動可能に連結されている制御配列は、コード配列の発現をもたらすことができる。ＤＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合して、コードタンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡへコード配列を転写すれば、そのコード配列は細胞内で転写調節領域と作動可能に連結されている、またはその制御下にあることになる。制御配列がコード配列の発現を指令するように機能する限り、制御配列がコード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されていないが転写されている介在配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在していてもよく、それでもプロモーター配列はコード配列と「作動可能に連結されている」と見なすことができる。

コード配列および制御配列のような核酸配列に関連した「異種性」および「外来性」という用語は、組換え構築物の領域もしくは特定の染色体遺伝子座とは通常関連しない、および／または特定の細胞とは通常関連しない配列を表す。したがって、核酸構築物の「外来性」領域は、天然では一緒には見られない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに結合している、特定可能な核酸のセグメントである。例えば、構築物の外来性領域は、天然ではコード配列と一緒には見られない配列が隣接しているコード配列を含み得る。外因性コード配列のもう１つの例は、コード配列自体が天然に見られない（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、宿主細胞内に通常存在しない構築物または核酸により形質転換された宿主細胞は、本発明の目的のために外来性と見なされる。

本明細書で使用される「Ｎ−グリカン」、「オリゴ糖」、「オリゴ糖構造」、「グリコシル化パターン」、「グリコシル化プロファイル」および「グリコシル化構造」という用語は実質的に同義であり、それぞれ糖残基から形成されグリコシル化タンパク質と結合している１つ以上の構造を指す。

本明細書で使用される「外来性タンパク質」は、特定の組織もしくは細胞中に天然には存在しないタンパク質、外来性発現構築物もしくは導入遺伝子の発現産物であるタンパク質、または特定の組織もしくは細胞中に所与の量で天然には存在しないタンパク質を指す。卵に対して外来性のタンパク質とは、卵中には通常見られないタンパク質のことである。例えば、卵に対して外来性のタンパク質は、その卵を産む動物の導入遺伝子中に存在するコード配列の発現の結果として卵中に存在するタンパク質であり得る。

「内因性遺伝子」は、特定の細胞に通常関連する天然の遺伝子またはそのフラグメントを指す。

「ＬＡＬ」は、「ヒトリソソーム酸リパーゼ」、「ＳＢＣ−１０２」または「ヒトリソソーム酸リパーゼ分子」を意味し、これらの用語は本明細書全体を通して互換的に使用される。

本明細書に記載の発現産物は、定められた化学構造を有するタンパク質性物質から構成され得る。しかし、詳細な構造は多数の因子、特にタンパク質に共通の化学修飾によって決まる。例えば、すべてのタンパク質はイオン化可能なアミノ基とカルボキシル基とを含んでいるため、タンパク質は酸性または塩基性の塩形態または中性形態をとり得る。一次アミノ酸配列は、糖分子を用いて（グリコシル化）、または多くの場合は糖類との結合により生じる、例えば脂質、リン酸、アセチル基などとの共有結合もしくはイオン結合を含む他の化学的誘導体化により、誘導体化され得る。これらの修飾はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生じ得るが、後者は宿主細胞により翻訳後プロセシング系を通して行われる。このような修飾は分子の生物学的活性を増加または減少させる場合があり、このような化学修飾された分子も本発明の範囲内にあるものとする。

クローニング、増幅、発現および精製の代替方法が当業者には明らかであろう。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に代表的な方法が開示されている。

「ベクター」は、一本鎖の、二本鎖の、環状の、またはスーパーコイル化されたＤＮＡまたはＲＮＡで構成されるポリヌクレオチドを意味する。典型的なベクターは、機能的な遺伝子発現を可能にする適切な距離で作動可能に連結された以下の要素で構成され得る：複製起点、プロモーター、エンハンサー、５’ｍＲＮＡリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終止およびポリアデニル化部位、ならびに選択マーカー配列。特定の用途では上記要素の１つ以上がなくてもよい。核酸カセットは、発現される核酸配列を挿入するための制限部位を含み得る。機能性ベクターでは、核酸カセットは、翻訳開始および終止部位を有する、発現される核酸配列を含む。任意に構築物中に、例えばコード配列の５’側にイントロンが含まれていてもよい。特定のコード配列が適当な調節配列とともにベクター中に配置され、コード配列が制御配列に対して、制御または調節配列の「制御」下でコード配列が転写される位置および方向であるようにベクターを構築する。このような結果を得るために、特定の目的タンパク質をコードする配列を改変することが望ましい場合がある。例えばいくつかの場合には、適当な方向で制御配列と結合し得るように配列を改変すること、またはリーディングフレームを維持することが必要な場合がある。ベクターに挿入する前に、制御配列および他の調節配列をコード配列と連結させてもよい。あるいは、制御配列と、制御配列を有しその調節制御下にあるリーディングフレーム内にある適当な制限部位とを既に含んでいる発現ベクター中に、コード配列を直接クローニングしてもよい。

「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始する、ＤＮＡ上の部位のことである。いくつかの実施形態では、プロモーターを、配列の付加もしくは削除により改変するか、または天然配列および合成配列ならびに合成配列と天然配列の組合せであり得る配列を含めた別の配列に置き換えることができる。多くの真核プロモーターは２種類の認識配列、すなわちＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター要素を含んでいる。前者は転写開始部位の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼが正確な部位で転写を開始するよう指令することに関与し、後者は転写速度を決定すると考えられ、ＴＡＴＡボックスの上流にある。またエンハンサー要素も、連結したプロモーターからの転写を刺激し得るが、多くのものは特定の細胞型においてのみ機能する。多くのウイルス由来のエンハンサー／プロモーター要素、例えば、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターはすべて広範な細胞型において活性であり、「偏在する」と呼ばれる。あるいは、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターのような非構成的プロモーターも本発明で使用し得る。クローニング部位に挿入された核酸配列は目的ポリペプチドをコードする任意のオープンリーディングフレームを有し得るが、ただしコード配列が目的ポリペプチドをコードする場合、それは適切なｍＲＮＡ分子の産生を阻止し得る、および／または異常にスプライスされたもしくは異常なｍＲＮＡを産生し得る、潜在的スプライス部位を欠いているべきである。

本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の化合物と、他の化学成分、例えば担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤および／または賦形剤などとの混合物を指す。

「家禽由来」または「トリ由来」という用語は、家禽により産生される、または家禽から得られる組成物または物質を指す。「家禽」は、特に限定されないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラおよび走禽類を含めた、家畜として飼育され得るトリを指す。例えば、「家禽由来」はニワトリ由来、シチメンチョウ由来および／またはウズラ由来を指し得る。

「レトロウイルス粒子」または「形質導入粒子」は、細胞内に非ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡを形質導入することができる複製欠損型または複製型ウイルスを指す。特に有用な一実施形態では、本発明に従ってトランスジェニックトリを作製するために使用するレトロウイルス粒子を、２００９年４月２８日に発行された米国特許第７，５２４，６２６号に開示されている通りに作製する。前述特許の開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」という用語はいずれも、トリ胚盤葉細胞にポリヌクレオチドを導入することを表す。「筒部」とは、漏斗と峡部の間にあり、卵の卵白タンパク質を合成および分泌する管状腺細胞を含む、輸卵管の部分のことである。

「導入遺伝子」という用語は、本発明に従ってトリゲノム内に挿入された異種性ヌクレオチド配列を指す。「導入遺伝子」は、外来性コード配列、外来性のプロモーターまたは他の調節配列と連結した外来性コード配列、２つのレトロウイルスＬＴＲの間にあるすべてのヌクレオチド配列および／またはレトロウイルスＬＴＲ、ならびに導入遺伝子を導入するために使用されるレトロウイルスのＬＴＲの間にあるヌクレオチド配列を特定的に指すことがある。

「最適化」という用語は「最適化コード配列」という文脈で使用され、ここでは、卵白タンパク質であるオボアルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンに見られる特定の各アミノ酸に最もよく使用されるコドンが、本発明のベクター内に挿入される最適化ヒトインターフェロン−α２ｂ（ＩＦＮ−α２ｂ）ポリヌクレオチド配列の設計において使用される。より特定的には、最適化ヒトＩＦＮ−α２ｂのためのＤＮＡ配列は、雌ニワトリの輸卵管に最適化されたコドン使用頻度に基づくものであり、ニワトリ（Ｇａｌ１ｕｓ Ｇａｌ１ｕｓ）のオボアルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から収集されたコドン使用頻度表によってＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１のＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）用いて作製される。例えば、４つの卵白タンパク質におけるアミノ酸アラニンの４つのコドンの使用割合は、ＧＣＵが３４％、ＧＣＣが３１％、ＧＣＡが２６％およびＧＣＧが８％である。したがって、最適化コード配列中の大部分のアラニンのコドンとしてＧＣＵを使用する。ヒトタンパク質を最適化するための遺伝子を含んでいるベクターを用いて、トランスジェニック家禽由来のタンパク質を自らの組織および卵内で発現するトランスジェニックトリを作製する。

本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、特に限定されないが、ヒト、チンパンジー、無尾猿類、有尾猿類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられる。

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、その量を服用していない対応する対照と比べて、疾患、障害もしくは副作用の治療、治癒、予防もしくは軽減の向上、または疾患もしくは障害の進行速度の低減をもたらす、化合物の任意の量を指す。また正常な生理機能を増強するのに有効な量も、この用語の範囲内に包含される。

「治療する」、「治療すること」または「治療」という用語は、予防的および／または治療的に、疾患または状態の症状を緩和、寛解もしくは軽減する、さらなる症状を予防する、症状の根本原因を軽減または予防する、疾患もしくは状態を抑制する、疾患もしくは状態の発達を阻止する、疾患もしくは状態を緩和する、疾患もしくは状態を退縮させる、疾患もしくは状態により引き起こされる状態を緩和する、または疾患もしくは状態の症状を停止させる方法を指す。

ＬＡＬ組成物
本発明は概略的には、治療、例えばリソソーム蓄積症の治療に有用な酵素を含む組成物に関する。一態様では、本発明は、分子を特定の細胞型による内部移行を受けやすくするグリコシル化パターンを有するＬＡＬのようなリソソーム蓄積症酵素に関する。また、単離または精製形態のＬＡＬを含む組換えヒトタンパク質も本発明に含まれる。リソソーム蓄積症酵素（ＬＡＬなど）の単離は、タンパク質精製の当業者に容易にわかる方法論により行われ得る。

一実施形態では、本発明は、限定されないが、本明細書に記載のＮ−結合グリコシル化パターンを有する、ＬＡＬを含めたリソソーム蓄積症酵素に関する。

一態様では、本明細書に開示される組成物はヒトＬＡＬを含み、かなりの割合のヒトＬＡＬが、例えば肝細胞上に見られる細胞表面上のマンノース−６−リン酸受容体による内部移行のためのリガンドとして働き得る、マンノース−６−リン酸グリカン部分を含む。一実施形態では、組成物中に含まれるＬＡＬの３０％以上、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％が、少なくとも１つのマンノース−６−リン酸部分を含む。マンノース−６−リン酸部分は、例えば、配列番号２のＡｓｎ^１５、Ａｓｎ^５１、Ａｓｎ^８０、Ａｓｎ^１４０、Ａｓｎ^２５２およびＡｓｎ^３００からなる群より選択される１つ以上の残基に位置するＮ−グリカン構造上に見ることができる。マンノース−６−リン酸部分を含むグリカン構造としては、例えば、図１６に示されるＧ−ｎおよびＨ−ｎが挙げられる

本発明による組換えヒトＬＡＬは、複数のＮ−結合炭水化物鎖（例えば、約５つまたは６つの炭水化物鎖）を含む。５つまたは６つの各部位におけるＮ−結合グリコシル化構造は、図１６に示されるＡ−ｎ、Ｂ−ｎ、Ｃ−ｎ、Ｄ−ｎ、Ｅ−ｎ、Ｆ−ｎ、Ｇ−ｎ、Ｈ−ｎ、Ｉ−ｎ、Ｊ−ｎ、Ｋ−ｎ、Ｌ−ｎ、Ｍ−ｎ、Ｎ−ｎおよびＯ−ｎのうちの１つから選択され得る。

また、ＬＡＬ分子の混合物（例えば、配列番号２、３、４および１９で記述されるＬＡＬ分子のようなＬＡＬ分子が混合物中に２つ以上存在し得る）も本明細書に記載され、ここではＬＡＬ分子のいくつか、またはすべてが、構造Ａ−ｎ、構造Ｂ−ｎ、構造Ｃ−ｎ、構造Ｄ−ｎ、構造Ｅ−ｎ、構造Ｆ−ｎ、構造Ｇ−ｎ、構造Ｈ−ｎ、構造Ｉ−ｎ、構造Ｊ−ｎ、構造Ｋ−ｎ、構造Ｌ−ｎ、構造Ｍ−ｎ、構造Ｎ−ｎおよび構造Ｏ−ｎ（図１６）から選択される１つ以上のグリコシル化構造を有する。一実施形態では、リソソーム酸リパーゼ分子の混合物を精製または単離し、例えば、トランスジェニックトリで産生された卵から単離する、またはトランスジェニックトリで産生された卵白から精製もしくは単離する。

本発明は、構造Ａ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｂ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｃ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｄ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｅ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｆ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｇ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｈ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｉ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｊ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｋ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｌ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｍ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｎ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。本発明は、構造Ｏ−ｎを含む個々のＬＡＬ分子も含む。

本発明によるヒトＬＡＬと結合しているＮ−結合オリゴ糖は、末端シアル酸およびガラクトース残基が不足している。すなわち、少数のＮ−結合オリゴ糖構造のみが末端でシアル酸化されており、ガラクトース残基も少数しか存在しない。さらに、本明細書に記載のＬＡＬのＮ−結合オリゴ糖構造上に末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が広く存在する。したがって、本発明に従って産生されたＬＡＬを単球マクロファージおよびＫｕｐｆｆｅｒ細胞のような細胞に対して標的化することができる。

本発明の一態様では、実質的にシアル酸を有さないＬＡＬの組成物が提供される。別の態様では、本明細書に開示される組成物は組換えヒトＬＡＬを含み、そのＮ−グリカン構造のいずれにも、細胞内への酵素の内部移行に干渉し得るシアル酸部分を含まない。一実施形態では、組成物中に含まれるＬＡＬの１５％以下、例えば、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下がそのＮ−グリカン構造にシアル酸部分を含むか、または実質的にすべてのＬＡＬがシアル酸部分を含まない。

別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約９５％以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約９０％以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約８０％以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約７０％以上がシアル酸を含まない。

さらに別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在する実質的にすべてのＮ−結合オリゴ糖構造タイプがシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子と結合していることがわかっているＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約９０％以上がシアル酸を含まない。例えば、２０のオリゴ糖構造タイプが存在すれば、１８以上の構造タイプがシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子と結合していることがわかっているＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約８０％以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子と結合していることがわかっているＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約７０％以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子と結合していることがわかっているＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約６０％以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子と結合していることがわかっているＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約５０％以上がシアル酸を含まない。

本発明の一態様によれば、本明細書に記載のＬＡＬは高レベルの末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。一態様では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約９５％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約９０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約８０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約７０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約６０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約５０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。

一実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するすべてのＮ−結合オリゴ糖構造タイプが末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約９０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。例えば、２０のオリゴ糖構造タイプが存在すれば、１８以上のオリゴ糖構造タイプが末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約８０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約７０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約６０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約５０％以上が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。

本発明の別の態様では、本明細書に開示される組成物はヒトＬＡＬを含み、かなりの割合のヒトＬＡＬが、そのＮ−グリカン構造のいずれにもフコース部分を含まない。一実施形態では、組成物中に含まれるＬＡＬの５０％以下、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下がそのＮ−グリカン構造にフコース部分を含むか、または実質的にすべてのＬＡＬがフコース部分を含まない。

一実施形態では、本発明に従って産生されたＬＡＬのＮ−結合オリゴ糖構造上にフコースが実質的に存在しない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約９５％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約９０％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約８５％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約８０％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約７０％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約６０％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖の約５０％以上がフコースを含まない。

一実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在する実質的にすべてのＮ−結合オリゴ糖構造タイプがフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約９５％以上がフコースを含まない。例えば、２０のオリゴ糖構造タイプが存在すれば、１９以上の構造タイプがフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約９０％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約８５％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約８０％以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のＬＡＬ分子上に存在するＮ−結合オリゴ糖構造タイプの約７０％以上がフコースを含まない。

上で述べたように、本発明に従って産生されたＬＡＬ分子中には、ある特定の単糖類が多く存在する。分析される全単糖種としては、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、グルコース、マンノース、マンノース−６−リン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸およびＮ−グリコリルノイラミン酸が挙げられる。フコースは、全単糖類組成の約０％〜約１％の間で存在し得る。Ｎ−アセチルガラクトサミンは、全単糖類組成の約０％〜約１％の間で存在し得る。Ｎ−アセチルグルコサミンは、全単糖類組成の約３５％〜約５０％の間で存在し得る。ガラクトースは、全単糖類組成の約１〜１０％の間で存在し得る。グルコースは、全単糖類組成の０％で存在し得る。マンノースは、全単糖類組成の約３２％〜約５０％の間で存在し得る。マンノース−６−リン酸は、全単糖類組成の約１％〜約１１％の間で存在し得る。

一実施形態では、本発明に従って産生されたＬＡＬはキシロースを含まない。さらに、本発明に従って産生されたＬＡＬ中にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）が実質的に全く存在しないため、本発明の一態様は、Ｏ−結合グリコシル化を有さないＬＡＬの組成物を含む。

ＬＡＬは、そのアミノ酸配列中にＮ−結合グリコシル化のための６つの可能性がある部位、例えば、配列番号１のようにＡｓｎ^３６、Ａｓｎ^７２、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１を有する。そのうちの５つ、Ａｓｎ^３６、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１はグリコシル化されているが、Ａｓｎ^７２は非グリコシル化または実質的に非グリコシル化であり得る（実質的に非グリコシル化であるとは、ＬＡＬ分子の混合物中、Ａｓｎ^３６、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１のいずれよりも少ない数のＡｓｎ^７２がグリコシル化されているという意味である）（図１７を参照されたい）。したがって、本発明の一態様は、Ａｓｎ^７２において非グリコシル化および／または実質的に非グリコシル化であるＬＡＬの組成物である。グリコシル化Ａｓｎ^７２を有するＬＡＬは本発明の範囲内である。本明細書に記載のＡｓｎの位置は、配列番号１で記述されるＬＡＬアミノ酸配列に基づくものである。Ａｓｎの番号付け（すなわち、アスパラギンの位置）は個々のＬＡＬ分子によって異なり得るものであり、アミノ酸配列が配列番号２、３、４および１９で記述されるＬＡＬ分子のような他のＬＡＬ分子において容易に決定され得ることが、当業者には明らかであろう。

本発明に従って産生されるＬＡＬは、主要糖としてＮ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を有する二分岐、三分岐および四分岐構造の混合物を含むＮ−グリカン構造を含む（図１６および１７）。本発明の一態様によれば、少なくともＡｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１およびＡｓｎ^２７３にＭ６Ｐ修飾Ｎ−グリカンが存在する。したがって、本発明の一実施形態は、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１またはＡｓｎ^２７３のいずれか１つに存在するＭ６Ｐ修飾Ｎ−グリカンを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^２７３に存在するＭ６Ｐ修飾Ｎ−グリカンを有するＬＡＬの組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１またはＡｓｎ^２７３のいずれか１つに存在する一リン酸化Ｎ−グリカン（Ｍ６Ｐ）を有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^１６１およびＡｓｎ^２７３に存在する一リン酸化Ｎ−グリカンを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^１０１およびＡｓｎ^２７３に存在する一リン酸化Ｎ−グリカンを有するＬＡＬの組成物を含む。特定の一実施形態では、本発明に従って産生されたＬＡＬは、Ａｓｎ^１０１に二リン酸化マンノース（ビス−Ｍ６Ｐ）を含み得る。

本発明に従って産生されるＬＡＬは、減少したレベルのガラクトース（例えば、「Ｇａｌ」）を含み得る。本発明の一態様は、Ａｓｎ^３６、Ａｓｎ^１６１またはＡｓｎ^３２１のいずれか１つに末端ガラクトースを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^３６およびＡｓｎ^１６１に末端ガラクトースを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^１６１およびＡｓｎ^３２１に末端ガラクトースを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^３６およびＡｓｎ^３２１に末端ガラクトースを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^３６、Ａｓｎ^１６１およびＡｓｎ^３２１に末端ガラクトースを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、末端ガラクトースを有さないＬＡＬの組成物を含む。

各種タイプのＮ−グリカンがＬＡＬ中の様々なＮ−結合グリコシル化部位に見られた。Ｎ−グリカン構造は、主要糖としてＮ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を有する二分岐、三分岐および四分岐構造の混合物を含む。具体的には、本発明の一実施形態では、ＬＡＬは、第一のＮ−結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１におけるＡｓｎ^３６）にＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカン構造を含む。別の実施形態では、ＬＡＬは、第二のＮ−結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１におけるＡｓｎ^７２）において、グリコシル化を含まないか、または実質的に非グリコシル化である。さらに別の実施形態では、ＬＡＬは、その第三のＮ−結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１におけるＡｓｎ^１０１）にＰｈｏｓ２Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２を含む。さらに別の実施形態では、ＬＡＬは、その第四のＮ−結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１におけるＡｓｎ^１６１）に、Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ１Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカン構造を含む。さらに別の実施形態では、ＬＡＬは、その第五のＮ−結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１におけるＡｓｎ^２７３）に、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＰｈｏｓ１Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカン構造を含む。さらに別の実施形態では、ＬＡＬは、その第六のＮ−結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１におけるＡｓｎ^３２１）に、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択されるＮ−グリカン構造を含む。

本発明のある特定の態様によれば、ＬＡＬの組成物は、配列番号１のＡｓｎ^３６、Ａｓｎ^７２、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１（または配列番号２、３、４および１９内の対応するアスパラギン残基）においてグリコシル化されたＬＡＬを含み、１つのＮ−グリカンが、以下に示すように指定されたＡｓｎ位置にある：
ａ）Ａｓｎ^３６にＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２または
Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２があり；
ｂ）Ａｓｎ^７２にグリコシル化がなく；
ｃ）Ａｓｎ^１０１にＰｈｏｓ２Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２があり；
ｄ）Ａｓｎ^１６１にＰｈｏｓ１Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ１Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２または
Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２があり；
ｅ）Ａｓｎ^２７３にＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２または
Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２があり；
ｆ）Ａｓｎ^３２１にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２または
Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
があり、式中、
Ｍａｎ＝マンノース
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン
Ｐｈｏｓ＝リン酸エステル
Ｇａｌ＝ガラクトース
である。

一実施形態では、本発明に従って産生されたＬＡＬ中のＡｓｎ^３６、Ａｓｎ^１６１またはＡｓｎ^３２１のいずれか１つにおいて、Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２がグリカン成分として見られる。特定の一実施形態では、Ａｓｎ^３６、Ａｓｎ^１６１およびＡｓｎ^３２１のグリカン成分としてＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が見られる。

本発明のＬＡＬにおいて、Ａｓｎ^１０１およびＡｓｎ^２７３が、主要成分として約６〜約１０個のマンノース分子を有する高マンノースタイプ（本明細書に記載のＭＡＮ６−ＭＡＮ１０）を示す。したがって、本発明の一態様は、Ａｓｎ^１０１またはＡｓｎ^２７３において高マンノース構造を有するＬＡＬの組成物を含む。別の実施形態では、本発明のＬＡＬの組成物は、Ａｓｎ^１０１またはＡｓｎ^２７３に少なくとも６個のマンノースを有するＮ−グリカン構造を含み得る。別の実施形態では、ＬＡＬの組成物は、Ａｓｎ^１０１またはＡｓｎ^２７３に７、８または９個のマンノースを有するＮ−グリカンを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^１０１およびＡｓｎ^２７３に７、８または９個のマンノースを有するＬＡＬの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｓｎ^１０１およびＡｓｎ^２７３に７、８または９個のマンノースを有し、マンノースの１つがリン酸化されているＬＡＬの組成物を含む。

上記グリコシル化部位およびＡｓｎに付随する数字が、配列番号１で記述されるＬＡＬのアミノ酸配列に基づくものであるということ、また対応するＡｓｎの番号付けはＬＡＬ分子によって異なり得るが、配列番号１に関する上記グリコシル化プロファイルが、配列番号２、３、４および１９で記述されるＬＡＬ分子にも当てはまるということが理解されるべきである。例えば、配列番号１のＡｓｎ^３６は、配列番号２のＡｓｎ^１５、配列番号３のＡｓｎ^１３、配列番号４のＡｓｎ^１０および配列番号１９のＡｓｎ^９に対応する。配列番号１のＡｓｎ^７２は、配列番号２のＡｓｎ^５１、配列番号３のＡｓｎ^４９、配列番号４のＡｓｎ^４６および配列番号１９のＡｓｎ^４５に対応する。配列番号１のＡｓｎ^１０１は、配列番号２のＡｓｎ^８０、配列番号３のＡｓｎ^７８、配列番号４のＡｓｎ^７５および配列番号１９のＡｓｎ^７４に対応する。配列番号１のＡｓｎ^１６１は、配列番号２のＡｓｎ^１４０、配列番号３のＡｓｎ^１３８、配列番号４のＡｓｎ^１３５および配列番号１９のＡｓｎ^１３４に対応する。配列番号１の^２７３は、配列番号２のＡｓｎ^２５２、配列番号３のＡｓｎ^２５０、配列番号４のＡｓｎ^２４７および配列番号１９のＡｓｎ^２４６に対応する。配列番号１のＡｓｎ^３２１は、配列番号２のＡｓｎ^３００、配列番号３のＡｓｎ^２９８、配列番号４のＡｓｎ^２９５および配列番号１９のＡｓｎ^２９４に対応する。

例えば、一実施形態では、ＬＡＬは、配列番号２のＡｓｎ^１５、Ａｓｎ^５１、Ａｓｎ^８０、Ａｓｎ^１４０、Ａｓｎ^２５２およびＡｓｎ^３００からなる群より選択される少なくとも１つの位置でＮ−結合グリコシル化されている。別の実施形態では、ＬＡＬは、配列番号２のＡｓｎ^１５、Ａｓｎ^８０、Ａｓｎ^１４０、Ａｓｎ^２５２およびＡｓｎ^３００においてＮ−結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号２のＬＡＬのＮ−グリカン構造はキシロースを有さないが、１５％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がシアル酸を含み；５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がフコースを含み；少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％のＮ−グリカン構造がリン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含む。

一実施形態では、ＬＡＬは、配列番号３のＡｓｎ^１３、Ａｓｎ^４９、Ａｓｎ^７８、Ａｓｎ^１３８、Ａｓｎ^２５０およびＡｓｎ^２９８からなる群より選択される少なくとも１つの位置でＮ−結合グリコシル化されている。別の実施形態では、ＬＡＬは、配列番号３のＡｓｎ^１３、Ａｓｎ^７８、Ａｓｎ^１３８、Ａｓｎ^２５０およびＡｓｎ^２９８においてＮ−結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号３のＬＡＬのＮ−グリカン構造はキシロースを有さないが、１５％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がシアル酸を含み；５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がフコースを含み；少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％のＮ−グリカン構造がリン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含む。

一実施形態では、ＬＡＬは、配列番号４のＡｓｎ^１０、Ａｓｎ^４６、Ａｓｎ^７５、Ａｓｎ^１３５、Ａｓｎ^２４７およびＡｓｎ^２９５からなる群より選択される少なくとも１つの位置でＮ−結合グリコシル化されている。別の実施形態では、ＬＡＬは、配列番号４のＡｓｎ^１０、Ａｓｎ^７５、Ａｓｎ^１３５、Ａｓｎ^２４７およびＡｓｎ^２９５においてＮ−結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号４のＬＡＬのＮ−グリカン構造はキシロースを有さないが、１５％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がシアル酸を含み；５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がフコースを含み；少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％のＮ−グリカン構造がリン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含む。

一実施形態では、ＬＡＬは、配列番号１９のＡｓｎ^９、Ａｓｎ^４５、Ａｓｎ^７４、Ａｓｎ^１３４、Ａｓｎ^２４６およびＡｓｎ^２９４からなる群より選択される少なくとも１つの位置でＮ−結合グリコシル化されている。別の実施形態では、ＬＡＬは、配列番号１９のＡｓｎ^９、Ａｓｎ^７４、Ａｓｎ^１３４、Ａｓｎ^２４６およびＡｓｎ^２９４においてＮ−結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号４のＬＡＬのＮ−グリカン構造はキシロースを有さないが、１５％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がシアル酸を含み；５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満のＮ−グリカン構造がフコースを含み；少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％のＮ−グリカン構造がリン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含む。

本発明による組成物は、トランスジェニックトリ、トランスジェニックサカナ、トランスジェニック哺乳動物、例えばトランスジェニックヤギの使用により、またはタバコおよびコウキクサ（Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ）のようなトランスジェニック植物ならびに特定のタイプの培養細胞においてなど、数多くの方法で産生され得る。

また本発明はペグ化ＬＡＬを含む組成物も企図する。本明細書に記載のＬＡＬ酵素を、例えば、２００７年４月２６日に公表された米国特許出願公開第２００７００９２４８６号に開示されているようにペグ化することができる。上記特許の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、誘導されたグリコシル化パターンを、例えばトリ輸卵管細胞、例えば管状腺細胞由来の発現特化発現系から得る。例えば、本明細書に開示されるグリコシル化パターンは、本発明に従ってニワトリのようなトリの輸卵管細胞中で産生されたリソソーム蓄積症酵素上に存在することが示されている。

本発明に従って産生されるタンパク質を、タンパク質精製の当業者に明らかな方法のような任意の有用な方法で卵白から精製することができる。例えば、本発明に従ってトランスジェニックトリで産生されたヒトＬＡＬ（ｈＬＡＬ）を、タンパク質精製の当業者に明らかな方法により卵白から精製することができる。卵白中に存在するＬＡＬのための精製プロトコルの例を実施例に記載する。

本発明は、本明細書に開示されるグリコシル化構造を１つ以上含む本発明のリソソーム酸リパーゼ分子を含有する、卵および卵白、ならびに卵を産み、卵白を産生するトリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよびウズラ）を含む。

トリでのＬＡＬ発現
トリゲノム内に外来性核酸配列を安定に導入して、マンノース−６−リン酸の付加が有効である（例えば、有効性の増加が得られる）タンパク質、例えば、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）および本明細書に具体的に開示される他のタンパク質を非限定的に含めたリソソーム酵素などのような所望のタンパク質を発現させるためのベクターおよび方法が本明細書に開示される。具体的には、輸卵管内で外来性配列を発現して、卵内に医薬タンパク質のような外来性タンパク質を蓄積するトランスジェニックトリを作製する。このような外来性タンパク質を含有するトリの卵も本明細書に記載される。また、トランスジェニックトリの輸卵管内で効率的に発現されて、トリの卵内に蓄積される新規な形態のＬＡＬも本明細書に開示される。

本発明の一態様はＬＡＬ、すなわち本発明に従って産生されたＬＡＬ分子を含有する組成物に関する。特に有効な実施形態では、ＬＡＬは精製または単離される。例えば、トランスジェニックトリが産んだ硬殻卵の内容物からＬＡＬが取り出されている。特に有効な一実施形態では、ＬＡＬはヒトＬＡＬである。一実施形態では、本発明のＬＡＬは、トリの輸卵管細胞内で産生されるＬＡＬに由来するグリコシル化パターンを有する。例えば、組成物は、本発明に従ってトリ、例えばニワトリにおいて産生され、卵白から単離されたＬＡＬ分子の混合物を含有し得る。有効な一実施形態では、ＬＡＬ含有組成物は医薬製剤である。

一態様では、本発明は単離されたＬＡＬ分子、例えばヒトＬＡＬ分子を含有する組成物に関するものであり、ＬＡＬは、ＬＡＬをコードする導入遺伝子を担持するトリにおいて産生される。一実施形態では、ＬＡＬはトランスジェニックトリ（例えば、トランスジェニックニワトリ）の輸卵管細胞（例えば、管状腺細胞）内で産生され、そのＬＡＬをトランスジェニックトリの卵白から単離する。一実施形態では、ＬＡＬはトリ、例えばニワトリの輸卵管細胞（例えば、管状腺細胞）内でグリコシル化される。

別の態様では、リソソーム蓄積症酵素のような外来性タンパク質、例えばＬＡＬをトリの特定の組織において産生させる方法が提供される。このような外来性タンパク質は、トリの輸卵管、血液ならびに／または他の細胞および組織において発現され得る。一実施形態では、目的タンパク質が輸卵管筒部の管状腺細胞内で発現され、管腔内に分泌されて硬殻卵の卵白中に蓄積されるように、例えば、Ｘ期近くで胚盤葉細胞に導入遺伝子を導入してトランスジェニックトリを作製する。このように作製されたトランスジェニックトリは、その生殖系列中に導入遺伝子を担持して、メンデル方式で外来性導入遺伝子をその子孫に安定に伝達することができる。

本発明は、トリ輸卵管内でＬＡＬのような外来性タンパク質を産生させる方法を包含する。この方法は、コード配列と、コード配列と作動可能に連結されたプロモーターとを含み、プロモーターがトリ輸卵管内での核酸発現もたらし得る、ベクターを提供する第一の段階を含み得る。トランスジェニック細胞および／または組織を作製することができ、ここでは、ベクターを新たに単離された、培養されている、または胚内にあるトリ胚盤葉細胞に導入して、ベクター配列がトリゲノム内に挿入されるようにする。そのトランスジェニック細胞および／または組織から、輸卵管内でＬＡＬのような外来性タンパク質を発現する成熟トランスジェニックトリを得ることができる。

本発明の一態様では、レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に導入遺伝子を担持する複製欠損型または複製型レトロウイルス粒子を用いた胚盤葉細胞の形質導入により、トランスジェニックトリの作製を行う。例えば、プロモーター領域のセグメントの下流に挿入された外来遺伝子を含む改変ｐＮＬＢプラスミドを含む、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクターまたはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターを用い得る。ウイルス粒子内にパッケージされた改変レトロウイルスベクターのＲＮＡコピーを用いて、トランスジェニックトリになる胚盤葉に感染させることができる。

本発明の別の態様では、コード配列とプロモーターとを含み、それらは、コード配列がトリ輸卵管内で発現されるような方向的および位置的関係にある、ベクターが提供される。このようなベクターとしては、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらにベクターは、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのＬＴＲを含む核酸配列であってもよい。プロモーターは、トリ輸卵管内でのコード配列の発現をもたらすのに十分なものである。コード配列は、硬殻卵の卵白中に蓄積される外来性タンパク質をコードする。したがって、コード配列は、トランスジェニック家禽由来のタンパク質、例えばトランスジェニック家禽由来のリソソーム酸リパーゼ（ＴＰＤ ＬＡＬ）などのような外来性タンパク質をコードする。

一実施形態では、本発明の方法で使用するベクターは、特にトリおよびトリの卵内での外来性タンパク質の発現に適したプロモーターを含む。したがって、外来性コード配列の発現は、トランスジェニックトリの輸卵管および血液内ならびにトランスジェニックトリの卵の卵白内で生じ得る。プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、β−アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、オボアルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーターおよびオボトランスフェリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。任意に、プロモーターは少なくとも１つのプロモーター領域のセグメント、例えばオボアルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびオボトランスフェリンプロモーター領域などのセグメントであってよい。一実施形態では、プロモーターは、例えばオボアルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびオボトランスフェリンプロモーターなどのプロモーターの１つ以上の組合せもしくは融合物、または１つ以上のプロモーターの一部分の融合物である。

一実施形態では、ベクターはシグナルペプチドコード配列を含み、このコード配列は、細胞内での翻訳の際に、ベクターにより発現されたヒトＬＡＬのような外来性タンパク質の、硬殻卵の卵白中への分泌をシグナルペプチドが指令するように、コード配列と作動可能に連結されている。

本発明の一態様では、本明細書に開示されるように産生される外来性タンパク質のコード配列が提供され、ここでは、コード配列はトリ、例えばニワトリにおける発現に対してコドン最適化されている。コドン最適化は、トリ細胞（例えば、ニワトリ細胞）内で発現される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のタンパク質のコドン使用頻度から決定され得る。例えば、コドン使用頻度は、ニワトリのタンパク質であるオボアルブミン、リゾチーム、オボムチンおよびオボトランスフェリンをコードする核酸配列から決定され得る。例えば、外来性タンパク質のＤＮＡコード配列は、ニワトリ（Ｇａｌ１ｕｓ Ｇａｌ１ｕｓ）のオボアルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から収集されたコドン使用頻度表により、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１のＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）用いてコドン最適化され得る。

本発明の重要な一態様は、特に限定されないがヒトＬＡＬを含めた外来性のペプチドまたはタンパク質を含有する、トリ硬殻卵（例えば、ニワトリ硬殻卵）に関する。ヒトＬＡＬのような外来性のペプチドまたはタンパク質は、トランスジェニックトリの導入遺伝子によりコードされ得る。多くの場合、外来性のペプチドまたはタンパク質（例えば、ＬＡＬ）はグリコシル化されている。タンパク質は任意の有用量で存在し得る。一実施形態では、タンパク質は１硬殻卵当たり約０．０１μｇ〜１硬殻卵当たり約１グラムの範囲の量で存在する。別の実施形態では、タンパク質は１硬殻卵当たり約１μｇ〜１硬殻卵当たり約１グラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は１硬殻卵当たり約１０μｇ〜１硬殻卵当たり約１グラムの範囲（例えば、１硬殻卵当たり約１０μｇ〜１硬殻卵当たり約４００ミリグラムの範囲）の量で存在し得る。

一実施形態では、本発明の外来性タンパク質は卵の卵白中に存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり約１ｎｇ〜卵白１ミリリットル当たり約０．２グラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり約０．１μｇ〜卵白１ミリリットル当たり約０．２グラムの範囲の量で存在し得る（例えば、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり約１μｇ〜卵白１ミリリットル当たり約１００ミリグラムの範囲の量で存在し得る。一実施形態では、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり約１μｇ〜卵白１ミリリットル当たり約５０ミリグラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり約１μｇ〜卵白１ミリリットル当たり約１０ミリグラムの範囲の量で存在し得る（例えば、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり約１μｇ〜卵白１ミリリットル当たり約１ミリグラムの範囲の量で存在し得る）。一実施形態では、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり０．１μｇを上回る量で存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり０．５μｇを上回る量で存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり１μｇを上回る量で存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白１ミリリットル当たり１．５μｇを上回る量で存在する。

ベクターが導入された胚盤葉細胞から発生した、本明細書に開示される外来性タンパク質（例えば、ＬＡＬ）を産生する本発明のトリはＧ０世代であり、「創始動物」と呼ばれることがある。創始トリは通常、挿入された各導入遺伝子に関してキメラである。つまり、Ｇ０トランスジェニックトリの一部の細胞のみが導入遺伝子（１つまたは複数）を担持する。Ｇ０世代は通常、導入遺伝子（１つまたは複数）に関してヘミ接合性でもある。Ｇ０世代を非トランスジェニック動物と交配して、同様に導入遺伝子に関してヘミ接合性であり、かつ実質的にトリの全細胞中に導入遺伝子（１つまたは複数）を担持するＧ１トランスジェニック子孫を生じ得る。Ｇ１ヘミ接合性子孫を非トランスジェニック動物と交配して、Ｇ２ヘミ接合性子孫を生じ、またＧ１ヘミ接合性子孫同士を交配して、導入遺伝子に関してホモ接合型であるＧ２子孫を生じ得る。Ｇ１子孫に由来する導入遺伝子に関して陽性である実質的にすべてのトリ細胞が導入遺伝子（１つまたは複数）を担持する。一実施形態では、同じ系統由来のヘミ接合性Ｇ２子孫を交配して、導入遺伝子に関してホモ接合型のＧ３子孫を得ることができる。一実施形態では、ヘミ接合性のＧ０またはＧ１個体を、例えば、互いに交配して、個体の各細胞中に２コピーの導入遺伝子（１つまたは複数）を担持するホモ接合型のＧ１子孫を産生することができる。これらはある特定の有効な交配方法の例に過ぎず、本発明は、当業者に公知の方法のような任意の有効な交配方法の使用を企図する。

一実施形態では、本発明は単離されるＬＡＬを提供する。つまり、組成物中に含有されるＬＡＬは単離ＬＡＬであり得る。例えば、ＬＡＬを卵白から単離し得る。単離ＬＡＬは、ＬＡＬ分子内で各種のグリコシル化構造を有するＬＡＬ分子であり得る。

本発明の方法により、トリ胚盤葉細胞に導入遺伝子を導入して、本発明のタンパク質を産生するために生殖系組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持する、トランスジェニックニワトリ、トランスジェニックシチメンチョウ、トランスジェニックウズラおよび他の種のトリを作製することができる。胚盤葉細胞は通常、ＶＩＩ〜ＸＩＩ期の細胞またはそれに相当する細胞であり、一実施形態では、Ｘ期近くの細胞である。

本発明の方法を実施するのに有用なベクターを本明細書にいくつか記載する。一実施形態では、ベクターのコード配列およびプロモーターはともに、胚盤葉細胞に導入する前に５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に位置している。一実施形態では、ベクターはレトロウイルスであり、コード配列およびプロモーターはともに、レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に位置している。有用な一実施形態では、ＬＴＲまたはレトロウイルスベクターは、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス由来である。

一実施形態では、胚盤葉細胞をトランスフェクトして、トリゲノム内への安定な挿入をもたらすために使用されるベクターは、コード配列とプロモーターとを、トリ輸卵管筒部の管状腺細胞内でコード配列が発現されるような方向的および位置的関係で含み、ここでは、リソソーム酵素（例えば、ＬＡＬ）のような外来性タンパク質が硬殻卵の卵白中に蓄積される。

プロモーターは任意選択で、管状腺細胞内でのコード配列の発現を指令するのに十分な大きさであるオボアルブミンプロモーター領域のセグメントであってよい。オボアルブミンプロモーターを切り詰めることおよび／またはオボアルブミンプロモーターの重要な調節要素を集約して、プロモーターが輸卵管筒部の管状腺細胞内での発現に必要な配列を保持し、かつベクターへ容易に組み込まれ得るように十分に小型であるようにさせることは、本発明の範囲内に含まれる。一実施形態では、オボアルブミンプロモーター領域のセグメントを使用し得る。このセグメントはオボアルブミン遺伝子の５’隣接領域を含む。

またプロモーターは、リゾチームプロモーターのような全部ではないが大部分が筒部に特異的なプロモーターであってもよい。またプロモーターはマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターであってもよい。あるいは、プロモーターは構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターなど）であってもよい。一実施形態では、プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＭＤＯＴプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、オボアルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーターおよび／またはオボトランスフェリンプロモーターである。任意に、プロモーターはプロモーター領域の少なくとも１つのセグメント、例えばオボアルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびオボトランスフェリンプロモーター領域のセグメントなどであってよい。

胚盤葉細胞をトランスフェクトする１つの方法では、トリゲノム内に組み込まれるように、パッケージされたレトロウイルス系ベクターを用いて胚盤葉細胞内にベクターを送達する。

トリゲノム内に導入遺伝子を無作為に導入するのに有用なレトロウイルスは、複製欠損型トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）、複製欠損型マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルスである。一実施形態では、レトロウイルスゲノムの５’および３’の長い末端反復配列（ＬＴＲ）の間にオボアルブミンプロモーターと１つ以上の外来性遺伝子とを挿入することにより、ｐＮＬＢベクターを改変する。本発明は、管状腺細胞内で活性なプロモーターの下流にある任意のコード配列が管状腺細胞内で発現され得ることを企図する。例えば、オボアルブミンプロモーターは、オボアルブミンタンパク質の発現を駆動し、輸卵管の管状腺細胞内で活性であるため、輸卵管筒部の管状腺細胞内で発現され得る。

また本明細書に記載の任意のベクターは、ベクターのコード配列により発現されたタンパク質の、輸卵管の管状腺細胞からの分泌を指令するシグナルペプチドをコードするコード配列を任意に含み得る。本態様は、本明細書に記載の方法を用いてトリの卵内に蓄積され得る外来性タンパク質の範囲を効果的に拡大する。外来性タンパク質がそれ無しは分泌されないであろう場所で、コード配列を含むベクターを改変して、リゾチーム遺伝子由来のシグナルペプチドをコードする約６０ｂｐを含むＤＮＡ配列を含ませる。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡによりコードされているタンパク質のＮ末端にそれが位置するようにベクターに挿入される。

本発明の別の態様は、本発明の任意のベクターにおいて、ジシストロニックまたはポリシストロニックなｍＲＮＡからの２種類以上のタンパク質の翻訳を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を使用することを含む。ＩＲＥＳ単位を１つ以上の追加のコード配列の５’末端に融合し、次いでこれをベクター内の元のコード配列の末端に挿入することにより、コード配列がＩＲＥＳにより互いに分離されるようになる。

一実施形態では、ＩＲＥＳを使用すると、他のコード配列の産生物を修飾することが可能な酵素を１つのコード配列がコードすることができるため、産生物の翻訳後修飾が容易になる。例えば、第一のコード配列がコラーゲンをコードし、このコラーゲンが第二のコード配列によりコードされている酵素によりヒドロキシル化され活性化され得るが、ここでは当該技術分野において理解されている通りにＩＲＥＳを使用する。

別の態様では、本発明のいずれの方法で使用するベクターのコード配列にも３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を加えて、産生されるＲＮＡを安定にする。３’ＵＴＲをレトロウイルスベクターに付加する場合、３’ＵＴＲの付加が完全長ゲノムＲＮＡの転写に干渉しないように、構築物中でのプロモーター、遺伝子Ｘおよび３’ＵＴＲの方向を逆にしなければならない。一実施形態では、３’ＵＴＲは、オボアルブミンもしくはリゾチーム遺伝子の３’ＵＴＲ、または筒部細胞内で機能する任意の３’ＵＴＲ、すなわちＳＶ４０後期領域であり得る。

一実施形態では、構成的プロモーターを用いて、導入遺伝子のコード配列をトリにおいて発現させる。この場合、発現は筒部に限定されず、トリ内の他の組織（例えば、血液）中でも生じる。構成的プロモーターとコード配列とを含むこのような導入遺伝子の使用は、輸卵管内でのタンパク質発現と、それに続く卵内へのタンパク質の分泌を生じさせるまたは駆動することに特に適している。

形質を導入するための粒子（すなわち、形質導入粒子）をベクター用に作製して力価を測定し、胚に注入するために使用することができる適切な濃度を決定する。Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒの手順（米国特許第５，８９７，９９８号、この開示はその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従ってトリの卵に孔を開け、卵に形質導入粒子を注入する。注入の約２１日後に卵が孵化し、交配用に雄のトリを選別する。精子に導入遺伝子を含むＧ０雄ニワトリをスクリーニングするために、雄ニワトリ精子の試料からＤＮＡを抽出する。精子試料中に導入遺伝子を最も高レベルで含むＧ０雄ニワトリを、人工授精により非トランスジェニック雌ニワトリと交配させる。血液ＤＮＡ試料を導入遺伝子の有無に関してスクリーニングする。外来性タンパク質の有無に関してトランスジェニック雄ニワトリの血清を試験する。外来性タンパク質が確認されれば、そのトランスジェニック雄ニワトリの精子を非トランスジェニック雌ニワトリの人工授精に使用する。その結果、特定の割合の子孫が導入遺伝子を担持する（例えば、５０％を上回る）。本発明に従って産生された卵内に外来性タンパク質が存在すれば、そのタンパク質を単離してよい。またそのタンパク質の生物学的活性を試験してもよい。

トリ輸卵管内での外来性タンパク質の産生および外来性タンパク質を含有する卵の産生を提供する本発明の方法は、適当なベクターを提供し、胚盤葉細胞にベクターを導入することに続いて、そのベクターがトリゲノム内に組み込まれるように、さらなる段階を含む。次の段階は、前段階で作製されたトランスジェニック胚盤葉細胞から成熟トランスジェニックトリを得ることである。成熟トランスジェニックトリは、胚内にベクターが直接トランスフェクトまたは形質導入された胚盤葉胚の細胞から得ることができる。得られた胚を成長させ、ニワトリを成熟させる。

胚盤葉細胞から作製されたトランスジェニックトリは、創始動物として知られる。創始動物の一部は、輸卵管筒部の管状腺細胞内に導入遺伝子を担持している。これらのトリは、導入遺伝子によりコードされた外来性タンパク質を輸卵管内で発現する。また外来性タンパク質は、輸卵管に加えて他の組織（例えば、血液）でも発現され得る。外来性タンパク質が適当なシグナル配列（１つまたは複数）を含んでいれば、そのタンパク質は輸卵管の管腔内に、そして卵の卵白中に分泌される。

創始動物の中には生殖系列の創始動物がある。生殖系列の創始動物とは、生殖系列組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持し、また外来性タンパク質を発現する輸卵管筒部管状腺細胞内にも導入遺伝子を担持し得る創始動物のことである。したがって、本発明に従うと、トランスジェニックトリは外来性タンパク質を発現する管状腺細胞を有し得、またそのトランスジェニックトリの子孫も外来性タンパク質を発現する輸卵管筒部管状腺細胞を有し得る。あるいは、その子孫は、トリの特定組織（１つまたは複数）内での外来性遺伝子の発現により決定される表現型を発現する。一実施形態では、トランスジェニックトリはニワトリまたはシチメンチョウである。

医薬組成物および治療法
本明細書に記載の通りに産生された治療用タンパク質を、未加工の形態で投与して治療に使用することも可能であるが、治療用タンパク質を医薬製剤の一部として投与することが好ましい。したがって、家禽由来のＬＡＬのようなグリコシル化治療用タンパク質またはその薬学的に許容される誘導体を、１つ以上の薬学的に許容される担体と、任意に他の治療および／または予防成分とを一緒に含む医薬製剤、ならびにこのような医薬製剤の投与方法がさらに提供される。担体（１つまたは複数）は、製剤の他の成分と適合性があり、かつその被投与者に有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。本発明の医薬組成物を用いた患者の治療法（例えば、投与する医薬タンパク質の量、投与の頻度、および治療期間の長さ）は、当業者である医師に公知の標準的な方法を用いて決定することができる。

複合分子を含めた担体を含む組成物を、その教示が参照により本明細書に組み込まれる公知の従来の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１４版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．を参照されたい）により製剤化する。担体は希釈剤を含み得る。一実施形態では、医薬担体は液体であり得、組換えヒトＬＡＬは溶液の形態であり得る。医薬担体はロウ、脂肪またはアルコールであり得る。一実施形態では、ロウまたは脂肪ベースの担体はエステルを含有しない。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、粉末、凍結乾燥粉末または錠剤形態の固体であり得る。一実施形態では、担体はリポソームまたはマイクロカプセルを含み得る。

医薬製剤には、筋肉内、皮下および静脈内投与を含めた注射による投与に適したものが含まれる。医薬製剤には、経口、経直腸、経鼻、局所（バッカルおよび舌下を含む）、経膣または非経口に適したものが含まれる。また医薬製剤には、吸入または吹送による投与に適したものも含まれる。製剤は、必要に応じて、都合よく個別の投与単位で提供することができ、製薬分野で公知の任意の方法により調製し得る。医薬製剤の製造方法は通常、治療用タンパク質を液体担体もしくは微粉化した固体担体、またはその両方と混ぜ、次いで必要に応じて、製品を所望の製剤に成形する段階を含む。

経口投与に適した医薬製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤のような個別の単位；粉末もしくは顆粒剤；液剤；懸濁剤；または乳剤として好都合に提供し得る。活性成分を大形丸剤、舐剤またはペースト剤として提供し得る。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、従来の添加剤、例えば結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤を含有し得る。錠剤を当該技術分野で公知の方法によりコーティングし得る。経口液体製剤は、例えば水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得、また使用前に水もしくは他の適当な溶剤で構成する乾燥製品として提供し得る。このような液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤（食用油を含み得る）または保存剤など含有し得る。

またＬＡＬを非経口投与（例えば、注射、例えばボーラス注射または持続注入による）用に調製してもよく、アンプル、予め充填したシリンジ、少量の注入物中の単位用量形態で、または保存剤を添加した多回用量容器中で提供し得る。治療用タンパク質を、例えば、皮下注射、筋肉内注射および静脈内注入または注射により注射することができる。

ＬＡＬは、油性または水性溶剤による懸濁剤、液剤または乳剤の形態であり得、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤用剤を含有し得る。治療用タンパク質が、無菌固体からの無菌単離または溶液からの凍結乾燥によりによる得られる、使用前に適当な溶剤、例えば無菌無発熱物質水で構成するための粉末形態であり得るということも企図される。

静脈内注入または注射用には、本発明に従って産生されたＬＡＬを水性懸濁剤または液剤として製剤することができる。静脈内注入または注射用の製剤に適した添加剤は、クエン酸三ナトリウム脱水和物、クエン酸およびヒト血清アルブミンのうちの１つを含み得る。また医薬製剤は、リソソーム蓄積障害用の他の製品に使用される当該技術分野で公知の他の適当な添加剤も含み得る。本発明に従って産生されたＬＡＬのｐＨを約５．６〜約６．２の間に維持する。好ましくは、ＬＡＬ製剤のｐＨを５．９±０．２に維持する。

皮膚への局所投与用には、本発明に従って産生された本発明の治療用タンパク質を、軟膏剤、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮パッチとして製剤化し得る。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、適当な増粘剤および／またはゲル化剤を加えて水性または油性基剤で製剤化し得る。ローション剤は、水性または油性基剤で製剤化することができ、また１つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤を含有し得る。

口腔内の局所投与に適した製剤としては、風味を加えた基剤、通常はスクロースとアラビアゴムまたはトラガカントに活性成分を含むトローチ剤；ゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアラビアゴムのような不活性な基剤に活性成分を含む香錠剤；および適当な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄剤が挙げられる。

担体が固体である経直腸投与に適した医薬製剤は、単位用量の坐剤であることが最も好ましい。適当な担体としては、カカオバターおよび当該技術分野において一般に使用される他の材料が挙げられ、また坐剤は、活性化合物を軟化または溶解させた担体（１つまたは複数）と混合した後、鋳型に入れて冷却し成形して形成することが好都合であり得る。

経膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該技術分野で公知である担体を含有する、膣坐剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡状剤またはスプレー剤として提供され得る。

鼻腔内投与用には、本発明の治療用タンパク質を液体スプレーもしくは分散粉末として、または滴剤の形態で使用し得る。滴剤は、１つ以上の分散剤、可溶化剤または懸濁化剤も含む水性または非水性基剤で製剤化し得る。液体スプレー剤は、加圧パックから送達するのが好都合である。

吸入による投与用には、本発明による治療用タンパク質を吹入器、噴霧器もしくは加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達するのに都合のよい他の手段から都合よく送達することができる。加圧パックは適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスなどを含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するための弁を備え付けることにより決定され得る。

吸入または吹送による投与用には、本発明による治療用タンパク質は、乾燥粉末組成物、例えば、化合物とラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤との混合粉末の形態をとり得る。粉末組成物を、例えば、カプセルもしくは薬包中の、または例えば、吸入器もしくは吹入器により粉末が投与され得るゼラチンもしくはブリスターパック中の単位投与剤形で提供し得る。

必要に応じて、活性成分を徐放することに適合させた上記製剤を使用し得る。

また本明細書に記載の医薬組成物は、抗菌剤または保存剤のような他の活性成分も含有し得る。

さらに、本明細書に開示される治療用タンパク質を他の治療剤と併用し得ることが企図される。例えば、本発明は、潜在的な注入関連のアナフィラキシー反応を最小化または予防するための薬学的に有効量の抗ヒスタミン剤による前処置の方法を提供する。例えば、抗ヒスタミン剤は、本明細書に開示されるおよび当該技術分野で公知である任意の薬学的に許容される抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン）であり得る。一実施形態では、抗ヒスタミン剤を体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの間の用量で投与する。例えば、抗ヒスタミン剤を体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの用量で投与し得る。一実施形態では、血管アクセスポートと接続された携帯型システムを用いて、抗ヒスタミン剤を、リソソーム酸リパーゼの投与前の約１０分〜約９０分の間、例えば約３０分〜約６０分の間に投与する。一実施形態では、ジフェンヒドラミンの投与により潜在的アナフィラキシー性の注入反応を効果的に抑える。

患者がアナフィラキシー反応または有害な免疫応答を経験する場合、ＬＡＬ投与の前、間または後に免疫抑制剤、例えば抗ヒスタミン剤、副腎皮質ステロイド剤、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、メトトレキサート、ＩＬ−２受容体に対する抗体、Ｔ細胞受容体に対する抗体、ＴＮＦ−αに対する抗体または融合タンパク質（インフリキシマブ、エタネルセプトまたはアダリムマブ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（例えば、アバタセプト）、抗−ＯＸ−４０抗体なども投与することもできる。

また本発明は、１つ以上のコレステロール低化剤（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）を併用するＬＡＬ含有組成物の投与を含む治療法も企図する。このような薬剤の非限定的な例としては、アトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）およびＴｏｒｖａｓｔ（登録商標））、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）、Ａｌｔｏｃｏｒ（登録商標）、Ａｌｔｏｐｒｅｖ（登録商標））、ピタバスタチン（Ｌｉｖａｌｏ（登録商標）、Ｐｉｔａｖａ（登録商標））、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）、Ｓｅｌｅｋｔｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｔａｔ（登録商標））、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標））およびシンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、Ｌｉｐｅｘ（登録商標））が挙げられる。

本明細書に記載の組成物またはタンパク質を用いて各種状態を治療することができる。例えば、その治療法が当業者である医師に公知の状態がある。本発明は、トリ系で産生され、家禽由来のグリコシル化パターンを含有する治療用タンパク質（例えば、ＬＡＬ）を使用して、このような状態を治療し得ることを企図する。つまり、従来の方法で作製された治療用タンパク質により治療可能であることが知られている状態を、本明細書に記載の通りに産生された治療用タンパク質により治療することも企図される。例えば、本明細書に記載の通りに産生されたＬＡＬを用いて、ＬＡＬ欠損症または不全症（合わせて「ＬＡＬ欠損症」と呼ぶ）を原因とするまたはこれと関連する状態、例えばウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）などを治療することができる。本明細書に記載のＬＡＬ欠損症では、ＬＡＬの発現が、体内で産生されるＬＡＬの減少または欠損を生じる状態（例えば、遺伝子突然変異）、生理的因子または環境因子により減少している状態も考慮される。本明細書に記載の通りに産生されたＬＡＬを用いて、他の状態、例えばアテローム性動脈硬化症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および肝硬変なども治療することができる。また本明細書に記載の通りに産生されたＬＡＬを用いて、２００５年２月１日に発行された米国特許第６，８４９，２５７号（この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）；２００９年１２月３日に公開された米国特許出願公開第２００９／０２９７４９６号；２００４年１１月１１日に公開された米国特許出願公開第２００４／０２２３９６０号；２００９年１１月１５日に公開された米国特許出願公開第２００７／０２６４２４９号（これらの開示（すなわち、上記４つの各特許公開）は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている状態のような他の状態も治療することができる。

本明細書に開示される通りに産生されたＬＡＬを用いて、膵炎、例えば慢性膵炎および／または急性膵炎、ならびにアルコール性膵炎のようなアルコールによる膵臓損傷を含めた特定の状態を治療し得ることも企図される。

本明細書に開示される方法のような任意の有用な方法により作製されたＬＡＬを用いて、特に限定されないが、体組織、例えば、特に限定されないが肝臓、脾臓、消化管および心血管組織などに脂質エステルの蓄積を生じるアルコールによる細胞損傷を含めたアルコールによる細胞損傷が原因の疾患を治療することが企図される。また本発明は、ＬＡＬ投与による吸収不良の治療も企図する。

本発明の一態様は、本明細書に記載の組換えヒトＬＡＬを含む治療有効量の組成物を患者に投与することを含む、患者を治療する方法に関する。患者は、ＬＡＬ欠損症に関連した状態を含めたあらゆる状態に罹患しているか、またはそのような状態に罹患し得る。一実施形態では、治療有効量とは、患者の赤血球数を所望の量だけ増加させる量のことである。本発明に従って産生されたＬＡＬを用いて、例えば、組織がリソソーム酸リパーゼの産生を維持することができない慢性腎疾患を治療し得ることが企図される。

また任意の有効な方法により作製されたＬＡＬが、タンジール病および家族性低アルファリポタンパク血症を有する患者の治療に有用であり得ることも企図される。タンジール病／家族性低アルファリポタンパク血症は、マクロファージ内でのコレステロールエステルの蓄積に関連し、肝脾腫大および／またはリンパ節腫脹とともに、ＬＡＬの投与により治療可能な高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低下を伴う。例えば、本発明が特定の作用理論または作用機序に限定されることを望むものではないが、ＬＡＬ活性の障害によりＡＢＣＡ１発現が減少し、逆に、タンジール病／家族性低アルファリポタンパク血症の患者へのＬＡＬの投与により得られたＬＡＬ活性の増加によりＡＢＣＡ１発現が増加し、多型性により機能活性が低下したＡＢＣＡ１遺伝子の影響が克服されると考えられる。

一般に状態の治療では、投与量は既知の要因、例えば被投与者の年齢、健康状態、体重、併用する治療の種類、治療頻度などによって異なり得る。通常、活性成分の用量は体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜約１０ミリグラムの間であり得る。正確な用量、投与頻度および治療期間は、各治療用タンパク質投与の分野において熟練した医師により決定され得る。

さらに、ＬＡＬ欠損症の治療では１ｍｇ／ｋｇ以下が有効であり得ることが見出されている。本発明は、治療有効量のリソソーム酸リパーゼを５日に１回から２５日に１回の間、例えば、７日に１回から１４日に１回の間で哺乳動物（例えば、患者、好ましくはヒト患者）に投与することを含む、状態の治療法を提供する。一実施形態では、投与するリソソーム酸リパーゼの用量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの間であり、例えば、用量は１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜５ｍｇの間であり得る。

特に有用な一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の投薬計画のような任意の治療的に有効な投薬計画に従って、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜１．０ｍｇの間の用量のリソソーム酸リパーゼを投与することによる、状態の治療法を提供する。

本発明は、治療有効量のＬＡＬの投与が有用であり得るＬＡＬ欠損症の任意の合併症を治療する方法を提供する。一実施形態では、本明細書に記載の方法により吸収不良および成長不全を治療し得る。別の実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて、特に限定されないが肝腫大および肝障害を含めた、ＬＡＬ欠損症患者で見られる合併症を治療し得る。

本発明は、当該技術分野において理解されているような任意の有効なタンパク質発現系、例えば、トランスジェニック哺乳動物およびトランスジェニックトリにより産生され得る組換えＬＡＬ（例えば、組換えヒトＬＡＬ）による治療を提供する。他のタンパク質発現系としては、細胞培養系、細菌系および植物系を挙げ得るが、これらに限定されない。

本発明は、組換えＬＡＬを薬学的に許容される組成物の一部として、当該技術分野において熟練した医師により判定される意図した治療効果を達成し得る任意の経路で投与することを包含する。例えば、血管アクセスポート（例えば、留置ポート）と接続された携帯型注入ポンプにより注入が容易になり得る。

また本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）における状態、例えばウォルマン病およびＣＥＳＤの臨床的および病理学的発症の監視も含む。一実施形態では、評価は、特に限定されないが脂質分析、胸部Ｘ線、肝機能検査、大便チャート（ｓｔｏｏｌ ｃｈａｒｔ）、血漿メバロン酸、免疫原性、血漿リソソーム酸リパーゼ、キトトリオシダーゼ、ＰＡＲＣ、門脈圧亢進、身体計測、例えば画像技術を用いた肝臓、膵臓および消化管の体積および特徴付けで構成される。例えば、上記画像技術は、超音波、磁気共鳴画像法および核磁気共鳴分光測定で構成され得る。

本発明を以下の実施例によりさらに例示する。実施例は単なる例示を目的とするものであり、いかなる形でも本発明を限定する意図はなく、また限定するものであると解釈されるべきではない。

実施例１
組換えヒトリソソーム酸リパーゼ（ｒｈＬＡＬ）コード配列を担持するベクター（ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ）の構築
ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡベクター中のｈＬＡＬ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトリソソーム酸リパーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿０００２２６）により産生されるタンパク質のアミノ酸配列と同一のタンパク質をコードする（図１）。この配列の転写と、それに続く得られたｍＲＮＡの翻訳により３９９アミノ酸の前駆体タンパク質が産生され、これがプロセシングされて、配列番号１で記述されるヒトＬＡＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿０００２２６）（図１）と同一の成熟した３７８アミノ酸タンパク質になる。本実施例のｈＬＡＬ遺伝子（ｃＤＮＡ配列に関する図２を参照）の発現は、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、ならびに５’および３’非翻訳配列を含むオボアルブミン遺伝子由来の非コード要素により制御される。オボアルブミン遺伝子は、卵白の主要なタンパク質成分であるオボアルブミンを産生する。ニワトリオボアルブミンプロモーターの活性は、卵白を産生するニワトリ輸卵管内の細胞に極めて特異的であり、他の組織での発現は極めて少ない。

プラスミドベクターｐＡＬＶＩＮ−０ＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ（図３Ａ；ヌクレオチド配列は図４に示されている）を用いて、創始動物（ＸＬＬ１０９）のゲノム内にｈＬＡＬ導入遺伝子を安定に組み込む複製欠損型レトロウイルス（ＲＤＲ）を作製した。このプラスミドベクターは、ウイルスＲＮＡのパッケージング、逆転写および組込みに必要なレトロウイルスヌクレオチド配列を含むが、ウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のためのインタクトな配列は含まない。レトロウイルスベクターを作製するために用いる方法およびそれに続く遺伝子導入手順でのその使用を本明細書に記載する。

ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡのレトロウイルス部分はＡＬＶベクターであるｐＮＬＢに基づく。ＬＴＲが自己不活性となるようにｐＮＬＢを改変した（ＳＩＮ）（図３Ｂ）。これを達成するために、Ｕ３領域のエンハンサーおよびＣＡＡＴボックスを含む２７３ｂｐの３’ＬＴＲを削除した。レトロウイルス配列の３’末端の不活性化されたＵ３領域は、組み込まれたプロウイルスの５’末端に存在する新たなＵ３領域の鋳型として働くため、５’ＬＴＲも通常は不活性化される。ＳＩＮ構築物中にあるＬＴＲ配列の削除により、内部プロモーターに対するＬＴＲからのプロモーターの干渉が低下し、配列組換えによる複製型レトロウイルスの形成の可能性が最小限になる。新たなベクターを、ＡＬＶ不活性化ベクターにちなんでｐＡＬＶＩＮと命名する。

５’ＬＴＲの下流は、ｐＮＬＢベクターから引き継がれた部分的ｇａｇおよびｅｎｖコード配列である。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ中には、ｇａｇタンパク質前駆体配列の小さな一部（１２％）が残り（ｐ１９成熟ペプチド配列の５５％）、またＲＡＶ２のｅｎｖ前駆体配列の小さな一部（１．７％）が残っている（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＦ０３３８０８）。これらの切り詰められたｇａｇおよびｅｎｖ領域は、複製型レトロウイルスを生じるのに必要な機能性タンパク質を産生することができない（Ｃｏｓｓｅｔ、１９９１）。

ニワトリオボアルブミン遺伝子の転写制御要素および翻訳制御要素をｐＡＬＶＩＮに挿入して、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ（配列は図６に示されている；配列番号８）を作製した。ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉの第一の部分は、１．１ｋｂの近位プロモーター領域、第一エクソン、第一イントロンおよび第二エクソンの一部を含むニワトリオボアルブミン遺伝子の連続した部分で構成されている。次の部分は、オボアルブミンタンパク質コード配列の代わりとなるスタッファー挿入フラグメントである。スタッファーの後には、ポリアデニル化を含めたｍＲＮＡの適切なプロセシングを促進する配列を含む、ニワトリオボアルブミン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が続いている。一般にスタッファーフラグメントは、所望のタンパク質、この場合はｈＬＡＬをコードするＤＮＡフラグメントに置き換えられる。その結果、トランスジェニックニワトリ輸卵管内でのｍＲＮＡの制御された転写発現および翻訳を促進する特定の要素を有し、内因性オボアルブミンｍＲＮＡの調節を忠実に模倣し、卵白での目的タンパク質の高度な発現を可能にするベクターが得られる。

ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉベクターはオボアルブミン遺伝子の第一イントロンを含む。イントロンはレトロウイルスＲＮＡゲノムの生成およびパッケージングの間にスプライシングを受けやすいため、本発明者らはＬＴＲに対して逆方向に発現カセットを挿入した。このようにして、イントロンはレトロウイルスＲＮＡ内で認識されなくなり、スプライシングされずにパッケージされる。便宜上、本明細書のすべてのマップは、ＬＴＲを反対方向にし、発現カセットを正方向または時計回りの方向にして描いてある。

ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉを基本ベクターにして、そこにｈＬＡＬのコード配列（ＣＤＳ）を挿入した。ｈＬＡＬ ＣＤＳおよびｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉとの適合性のために必要とされる配列を構成するｈＬＡＬアダプターおよびＳｙｎ ｈＬＡＬの２つのＤＮＡフラグメントをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）において合成した（図７および８を参照されたい；配列番号９および１０）。ｈＬＡＬアダプターの２２９ｂｐのＨｐａｌ／ＢａｍＨＩフラグメントおよびＳｙｎ ｈＬＡＬの１１１３ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｓｔＢＩフラグメントをｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉの７８８２ Ｈｐａｌ／ＢｓｔＢＩフラグメントに挿入することによりスタッファー領域をｈＬＡＬ ＣＤＳに置き換えて、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ−ｈＬＡＬを作製した。

インタクトなレトロウイルスＲＮＡのパッケージングを妨げる不可解なスプライス部位がｈＬＡＬ ＣＤＳのアンチセンス鎖内に存在するということが明らかになった。この不可解なスプライス部位を、ｈＬＡＬのアミノ酸配列を変化させずにＤＮＡ配列を改変することにより取り除いた。この改変をプライマー５’−ＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＡＴ−３’（配列番号１２）およびプライマー５’−ＴＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１３）を用いたｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ−ｈＬＡＬの領域２３２〜５３４のポリメラーゼ鎖増幅により行い、３２９ｂｐのアンプリコンが作製された。このアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＳｅｘＡＩで消化し、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ−ｈＬＡＬの８９４０ｂｐのＢａｍＨＩ／ＳｅｘＡＩフラグメントに連結して、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡを作製した。

ニワトリオボアルブミン遺伝子のＤＮアーゼ高感受性部位ＩＩＩ（ＤＨＳＩＩＩ）を含む推定プロモーターエンハンサー（ＯＶプロモーター開始部位から−３８１９〜−２１６９の位置）（Ｋａｙｅ、Ｂｅｌｌａｒｄら，１９８４）をｐＡＬＶＩＮ−０Ｖ−１．１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡに挿入して、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡを作製した。これは以下のように行った。ＤＨＳＩＩＩエンハンサーと１．１ｋｂのＯＶＲ１プロモーターと呼ばれる近位ＯＶプロモーターとを含むＤＮＡフラグメント（図９を参照されたい；配列は配列番号１１）をＸｈｏＩおよびＢｌｐＩでの消化により単離した。サブクローニングを容易にするために、プライマー５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴ−３’（配列番号１４）および５’−ＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡ−３’（配列番号１５）を用いたｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉの領域６７５２〜７９７４のＰＣＲ増幅、次いでＮｇｏＭＩおよびＸｈｏＩでの消化により、アダプターフラグメントであるｐＳＩＮ−ＯＶ−１．１−ＩのＰＣＲを作製した。ＯＶＲ１プロモーターの２７７２ｂｐのＸｈｏＩ／ＢｌｐＩフラグメントおよびｐＳＩＮ−ＯＶ−１．１−ＩのＰＣＲの１０６７ｂｐのＮｇｏＭＩ／ＸｈｏＩフラグメントをｐＡＬＶＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡの７０４３ｂｐのＮｇｏＭＩ／ＢｌｐＩフラグメントに挿入して、ｐＡＬＶＩＮ−０ＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡを作製した（ｐＡＬＶＩＮ−０ＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡの構築の略図に関する図１０を参照されたい）。ｐＡＬＶＩＮと呼ばれる（ｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ３９５．２２．３．１−ＫＭまたはｐＡＬＶ−ＳＩＮとしても知られる）ベクターのレトロウイルスベクターセグメントの構築は、米国特許出願第２００８／００６４８６２号に記載されている。

さらに、２００８年３月１３日に公開された米国特許出願公開第２００８／００６４８６２号（この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているプロモーターおよび／またはベクターを用いた、本発明によるＬＡＬの産生が含まれる。

実施例２
ウイルス粒子作製
レトロウイルス遺伝子導入法を以下のように用いて、Ｇ０創始動物である、ｈＬＡＬ導入遺伝子をゲノム中に担持するトランスジェニック雄のＸＬＬ１０９を作製した。不死化したニワトリ線維芽細胞系の一過性トランスフェクションにより、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡベクターを担持する複製欠損型ウイルス粒子を作製した。これらのニワトリ線維芽細胞を、ｐＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ、ｐＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｏｌおよびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇの３つのプラスミドで同時にトランスフェクトした。ｐＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｏｌはトリ白血症ウイルスのＲＡＶＩ株のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現する。ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇは水疱性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質を発現する。トランスフェクションの４時間後に、培地を、１０％のウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭに置き換えた。トランスフェクションの４８時間後に培地を回収し、０．４５ミクロンのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、超遠心分離により濃縮した。濃縮したＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ導入遺伝子を担持するレトロウイルスを収集し、初期段階の胚の形質導入に使用した。「ｐ」はプラスミド型のベクターの記号であるため、導入遺伝子が一度、パッケージされたベクターまたは組み込まれた導入遺伝子の形態になれば、その導入遺伝子の名称には「ｐ」が付かないことに留意されたい。

実施例３
胚への遺伝子導入
胚ゲノム内へのＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ発現カセットの組込みを、初期段階の胚の形質導入により行った（ＳｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒおよびＩｖａｒｉｅ，２０００）。産んだばかりの白色レグホンの受精した卵を繁殖コロニーから入手した。胚に接触できるように殻に孔を開けた。上記ＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ発現カセットを担持する濃縮された複製欠損型レトロウイルス粒子を胚の胚下腔に７マイクロリットル注入した。熱接着剤で卵を密封し、次いで標準条件下でインキュベートして孵化させた。識別し追跡できるように、上記注入により作製された子孫に個体識別マーカーを孵化時に付けた。子孫の血液試料を、ｈＬＡＬコード配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによりｈＬＡＬ導入遺伝子を解析したところ、これらは導入遺伝子に関して陽性であった（以下に記載する）。これにより、遺伝子導入手順が成功したことが示された。ｈＬＡＬ導入遺伝子のリアルタイムＰＣＲアッセイでは、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）化学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる。順方向および逆方向プライマーは、それぞれ５’−ＡＣＧＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）であった。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ配列は５’−ＣＣＧＧＡＡＴＧＣＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡ−３’（配列番号１８）であり、５’末端がＦＡＭで（エミッターとして）、３’末端がＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ で（クエンチャーとして）標識されていた。プライマー、プローブおよび１μｌの抽出ＤＮＡを３０μｌのＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に加えた。対照反応には、ｈＬＡＬ配列と野生型ニワトリ由来ＤＮＡとを有するプラスミドの各種希釈物が含まれていた（データ不掲載）。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに標準的なサイクリングパラメータを用いた。

実施例４
Ｇ０創始動物の同定
性成熟した雄から精液を採取してＤＮＡを抽出し、ｈＬＡＬリアルタイムＰＣＲアッセイを用いてアッセイした。負の対照の精液ＤＮＡと混合した既知の基準物質（ｈＬＡＬ遺伝子を有するプラスミド）を用いて、各試料中の導入遺伝子コピー数を推定した。リアルタイムＰＣＲによる推定では、雄ＸＬＬ１０９の導入遺伝子カセットＤＮＡの含有量は、その子孫に導入遺伝子を伝達することが可能なレベルであった。このＸＬＬ１０９雄をＧ０トランスジェニック創始動物とし、非トランスジェニックニワトリと交配させて、Ｇ１ヘミ接合性トランスジェニックニワトリを産ませた。

実施例５
ヘミ接合性Ｇ１ヘトリの繁殖および特徴付け
トランスジェニック創始動物ＸＬＬ１０９を親として産まれた子孫を、血液細胞ＤＮＡ中の導入遺伝子の有無に関して、ｈＬＡＬリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて試験した。１〜２週齢の子孫から血液を採取し、ハイスループット技術を用いてＤＮＡを抽出した（Ｈａｒｖｅｙら，２００２）。ハイスループットスクリーニングを容易にするために、Ｔａｑｍａｎアッセイの前にＤＮＡ溶液を定量化しなかった。通常、１μｌのＤＮＡ溶液には、陽性増幅シグナルを生じるのに十分な５０〜４００ｎｇのＤＮＡが含まれる。ＸＬＬ１０９を親とする合計１，３２２羽のニワトリを試験し、陽性子孫から再び採血して確認のための試験を行った。ＰＣＲの結果から、２２羽の子孫がＡＬＶＩＮ−ＯＶＲ１−Ｉ−ｈＬＡＬ−ｄＳＡ導入遺伝子に関して陽性であった。Ｔａｑｍａｎの結果の例を図１１に示す。

実施例６
高発現系統の同定および特徴付け
Ｇ１ニワトリの１羽である１ＬＬ７４６６が、卵白中に他のＧ１ニワトリに比べて有意に高いレベルのｒｈＬＡＬタンパク質を含む卵を産んだ。１ＬＬ７４６６および同胞のＧ１雄に関してサザンブロット解析を行って、高発現ニワトリと同じ組込み部位を有する同胞雄を同定した。導入遺伝子内で１回だけ切断する制限酵素（ＢｌｐＩ）により消化を行い、サザンブロットをオボアルブミンプロモーターのセグメントまたはｈＬＡＬコード配列でプローブした（図１２Ａ〜１２Ｄ）。第二制限部位の位置は隣接ゲノム領域内にあり、組み込みの部位によって異なる。したがって、ＯＶプローブまたはｈＬＡＬプローブにより検出されるＢｌｐＩバンドのサイズは、生じた各系統に固有のものである。

ＯＶプローブにより、野生型ニワトリ由来のＢｌｐＩ消化ＤＮＡにおいて４．１ｋｂの単一バンドが検出され、これはニワトリゲノムの内因性オボアルブミン遺伝子のＢｌｐＩセグメントの予測サイズに相当するものであった（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。ニワトリ１ＬＬ７４６６で４．３ｋｂの第二のバンドが検出され、これは導入遺伝子バンドに相当するものであった。３羽の追加の雌同胞１ＬＬ１０４０９、１ＬＬ１０６８６および１ＬＬ１２０５８、ならびに３羽の追加の雄同胞１ＬＬ８９２２、１ＬＬ９３３０およびＩＬＬ１１２１７が４．３ｋｂのバンドを示したが、このことは、これらの同胞が同じ系統であり得ることを示している（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。

ニワトリリソソーム酸リパーゼ遺伝子のＤＮＡ配列および組換えヒトリソソーム酸リパーゼのコード配列が、上記サザンアッセイで使用する条件下でハイブリダイゼーションが起こらないように十分に分化しているため、予想どおり、野生型ニワトリ由来のＤＮＡではｈＬＡＬプローブによりバンドが検出されなかった（図１２Ｃ）。ＯＶプローブにより検出された４．３ｋｂバンドに関して陽性であった同じニワトリ由来のＢｌｐＩ消化ゲノムＤＮＡにおいて、ｈＬＡＬプローブにより約１０．６ｋｂの単一バンドが検出されたが、このことは、これら７羽のＧ１ニワトリが同じ組込み部位を有し、したがって同じ系統であることを示している。

他のバンドが検出されなかったので、１ＬＬ７４６６、１ＬＬ１０４０９、１ＬＬ１０６８６、１ＬＬ１２０５８、１ＬＬ８９２２、１ＬＬ９３３０および１ＬＬ１１２１７はすべて単一の組込み部位を有することが示された。

ＯＶおよびｈＬＡＬプローブにより検出されたバンドはサイズが異なり、また単独の導入遺伝子由来のバンドよりもサイズが大きいことから、導入遺伝子が組み込まれたということもサザン解析により示された。隣接ゲノム領域内での組込み導入遺伝子の予想される構造およびＢｌｐＩ部位の位置を表すマップを図１２Ａに示す。

導入遺伝子がインタクトであることを、２つの段階を踏んで確認した。最初に、ＰＣＲによりｈＬＡＬコード配列を１ＬＬ７４６６から単離した。ＰＣＲ産物の両鎖に関して、ｈＬＡＬ開始コドンから停止コドンまで配列決定を行った。ＤＮＡ配列は全く予想どおりであり、このことは導入遺伝子内のコード領域のＤＮＡ配列が全く変化していないことを示していた。次に、インタクトな導入遺伝子を２つのセグメントである３．６ｋｂおよび３．８ｋｂに消化する制限酵素ＡｐａＬＩを用いて、サザンブロット解析を行った（図１３Ａ）。Ｇ１由来のＡｐａＬＩ消化ゲノムＤＮＡにおいて３．６ｋｂおよび３．８ｋｂのバンドがともに検出され、これにより、導入遺伝子が完全にインタクトな形で組み込まれたことが示された（図１３Ｂ）。

実施例７
Ｇ２の繁殖および特徴付け
単一のＧ０創始動物ＸＬＬ１０９に由来するｈＬＡＬＧ２の系統を図１４に示す。Ｇ１の段階では、コピー数、整合性、ｈＬＡＬ配列および組込み部位に関して導入遺伝子の特徴付けを行い、７羽のＧ１トランスジェニックが同定され特徴付けされた（４羽のニワトリおよび３羽の雄ニワトリ）。Ｇ１雄親１ＬＬ８９２２、１ＬＬ９３３０および１ＬＬ１１２１７から採取した精液で非トランスジェニックニワトリを人工授精してＧ２の繁殖を行った（図１４）。受精させた各ニワトリ、その卵および次の子孫を他の子孫と隔離して飼育した。孵化した子孫を、ｈＬＡＬ導入遺伝子の有無に関してｈＬＡＬリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて試験した。Ｇ１創始動物は導入遺伝子に関してヘミ接合性であるため、子孫の半数がトランスジェニックＧ２であることが予想された。これまでに解析した６１０羽のＧ２子孫のうち、３３０羽すなわち５４％がトランスジェニックであった。

実施例８
ｈＬＡＬトリの遺伝子解析
各Ｇ２ニワトリを血液ＤＮＡのｈＬＡＬリアルタイムＰＣＲアッセイにより同定した後、産生系統に対して以下の遺伝子アッセイを行った：血液ＤＮＡからｈＬＡＬ遺伝子をＰＣＲ増幅して配列決定を行い、ヒト配列との１００％同一性を確認し；上記のように組込み部位ＰＣＲにより導入遺伝子組込み部位を確認した。ＰＣＲ配列決定および組込み部位解析を以下のニワトリに対して行った：１０羽未満のニワトリ産生系統の各ニワトリ；１１〜１００羽のニワトリ産生系統の１０％のニワトリ（最低１０羽）；１０１〜１０００羽のニワトリ産生系統の５％のニワトリ（最低１０羽）；１００１〜１０，０００羽のニワトリ産生系統の１％のニワトリ（最低５０羽）；１０，００１を超えるニワトリ産生系統の０．１％のニワトリ（最低１００羽）。成長および産生の段階ごとに詳細な記録を続けた。

実施例９
卵白からのｈＬＡＬの精製
ＬＡＬを含有する卵白（ＥＷ）をｐＨ６で一晩可溶化し、０．２μｍろ過を用いた遠心分離（または深層ろ過）により清澄化した。ＥＷを１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）でｐＨ６に調整した。

清澄化したＥＷを、２０ｍＭリン酸／１３７ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６）で平衡化したフェニル−ＨＩＣカラム（ＥＷ：カラムサイズ＝２：１）に負荷した。負荷完了後、平衡化緩衝液および５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）でカラムを洗浄した。５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．２）を含む３０％プロピレングリコールでＬＡＬを溶出させた。

溶出したＬＡＬ画分を１Ｍの酸でｐＨ５に調整した後、ＧｉｇａＣａｐ Ｓカラム（ＥＷ：カラムサイズ＝１０：１）に負荷した。カラムを５０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）で平衡化した。負荷完了後、平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。５０ｍＭ ＮａＯＡｃ／６０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）でＬＡＬを溶出させた。

ＧｉｇａＣａｐ ＳカラムからのＬＡＬ画分を１Ｍトリス緩衝液でｐＨ６に調整した後、ブチル−ＨＩＣカラム（ＥＷ：カラムサイズ＝１０：１）に負荷した。２０ｍＭリン酸／１３７ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６）でカラムを平衡化した。負荷完了後、平衡化緩衝液および５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）でカラムを洗浄した。５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．２）を含む５０％プロピレングリコールで純粋なＬＡＬを溶出させた。卵白からのｈＬＡＬの精製段階を図１５に図示する。

実施例１０
トランスジェニックトリ由来ｈＬＡＬの炭水化物分析
当業者に公知の以下の分析技術を用いて、トリ由来ヒトＬＡＬのオリゴ糖構造を決定した。

２００マイクログラムを、１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）中、３７℃で１８時間、トリプシンおよびキモトリプシンにより消化した。Ｃ１８カートリッジカラムにより、消化産物を濃縮し夾雑物を除去した。濃縮後、グリコペプチドを５０μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中、３７℃で１８時間、２μｌのＰＮＧアーゼＦ（７．５単位／ｍｌ）により消化した。解離したオリゴ糖をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジカラムに通してペプチドおよび酵素から分離した。

グリカン画分をジメチルスルホキシドに溶解させた後、ＡｎｕｍｕｌａおよびＴａｙｌｏｒの方法によりペルメチル化した（ＡｎｕｍｕｌａおよびＴａｙｌｏｒ，１９９２）。水を加えて反応を停止させ、ジクロロメタンでペル−Ｏ−メチル化炭水化物を抽出した。ペル−Ｏ−メチル化グリカンを窒素流下で乾燥させた。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法）を、マトリックスとしてα−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ、５０％メタノール：水に溶かした２０ｍｇ／ｍＬ溶液）を用いて、反射装置陽イオンモードで行った。Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＲＦ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて全スペクトルを得た。

ペプチド主鎖からの解離および精製の後、オリゴ糖に関してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析およびＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析）を当該技術分野において理解されている通りに行った。また個々の多糖種の試料を特定の酵素で消化し、消化産物を当該技術分野において理解されている通りにＨＰＬＣで分析した。

ヒトＬＡＬ上には約６個のＮ−結合グリコシル化部位が存在すると考えられている。Ｚｓｃｈｅｎｋｅｒら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ１３７，ｐ３８７−３９４を参照されたい（この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。またこの参照文献は、ヒトＬＡＬ上にはＯ−結合グリコシル化部位が存在し得るということも示唆している。同定されたＮ−結合オリゴ糖構造を図１６に示す。

多くのまたはすべてのこれらの構造が、本発明に従って産生されたＬＡＬにおいてはＮ−結合グリコシル化構造として見られるということが、データから明らかになった（図１６）。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬにはＡ−ｎが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬにはＯ−ｎが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬには、Ｂ−ｎ、Ｃ−ｎおよびＤ−ｎのうちの少なくとも１つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬには、Ｅ−ｎおよびＦ−ｎのうちの少なくとも１つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬには、Ｉ−ｎおよびＪ−ｎのうちの少なくとも１つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬには、Ｋ−ｎおよびＬ−ｎのうちの少なくとも１つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬには、Ｍ−ｎおよびＮ−ｎのうちの少なくとも１つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬにはＧ−ｎが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたＬＡＬにはＨ−ｎが結合していることが見出される。

実施例１１
トランスジェニックトリ由来ＬＡＬのＮ−グリカン種
トランスジェニックトリ由来ｈＬＡＬの精製試料（６００μｇ／試料）を、Ｔｕｂｅ−Ｏ−Ｄｉａｌｙｚｅｒ（４．０ｋＤａカットオフ膜；Ｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で約２４時間、超純水（ｎａｎｏｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）に対して透析し、塩およびその他の夾雑物を除去した。全透析時間の間に超純水を４回交換した。

透析後、各試料を３つのアリコートに、すなわち、試料重量の約１／４を中性およびアミノ糖分析用に、試料重量の約１／４をマンノース−６−リン酸分析用に、試料重量の約１／２をオリゴ糖プロファイリング用に分けた。中性およびアミノ糖分析用のアリコートを１００℃で４時間、２Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により加水分解し、マンノース−６−リン酸分析用のアリコートを１００℃で１．５時間、６．７５Ｎ ＴＦＡにより加水分解した。次いで、加水分解物をＮ_２下で乾燥させ、５０μＬのＨ_２０に再び溶解させ、氷中で７分間超音波処理し、注入バイアルに移した。ただし、中性およびアミノ糖試料は、元の溶解加水分解物から得られたピークが大き過ぎたため、希釈を２回行った。

中性およびアミノ糖用の標準品とマンノース−６−リン酸用の標準品との既知のモル数の混合物を、試料と同じ方法で同じ時間だけ加水分解した。４種類の濃度の中性およびアミノ糖標準品混合物（１０μｌ当たり０．２、０．４、０．８および１．６ナノモルのＦｕｃとＧａｌＮＡｃ；１０μｌ当たり０．５、１．０、２．０および４．０ナノモルのＧｌｃＮＡｃ；１０μｌ当たり０．３、０．６、１．２および２．４ナノモルのＧａｌとＭａｎ；ならびに１０μｌ当たり０．１、０．２、０．４および０．８ナノモルのＧｌｃ）ならびにマンノース−６−リン酸（ｌ０μｌ当たり６４０、１２８０、２５６０、５１２０ピコモル）を調製し、較正方程式を確立した。試料中の各糖のモル数を直線補間により較正方程式から定量化した。

中性およびアミノ糖ならびにマンノース−６−リン酸を、グラジエントポンプと、電気化学検出器と、オートサンプラーとを備えたＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ３０００システムを用いて、ＨＰＡＥＣにより分析した。アミノトラップを有するＤｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０（３×１５０ｍｍ）分析カラムにより、個々の中性およびアミノ糖ならびにマンノース−６−リン酸を分離した。グラジエントプログラムには、中性およびアミノ糖に溶離液Ａ（脱気したナノピュア水）と溶離液Ｂ（２００ｍＭ ＮａＯＨ）、マンノース−６−リン酸に溶離液Ｃ（１００ｍＭ ＮａＯＨ）と溶離液Ｄ（１００ｍＭ ＮａＯＨ中１Ｍの酢酸ナトリウム）を用いた。注入（１０μＬ／注入）を中性およびアミノ糖測定では４０分毎に、マンノース−６−リン酸測定では３５分毎に行った。すべての方法は、ＨａｒｄｙおよびＴｏｗｎｓｅｎｄ（Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．およびＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，”Ｈｉｇｈ−ｐＨ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３０：２０８−２２５）により記載されているプロトコルを基にした。機器制御およびデータ収集はＤｉｏｎｅｘ ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて行った。結果を下の表１に示す。対照試料はＥＷから精製したオボムコイドである。

ＬＡＬの構造的特徴
ＬＡＬは、そのアミノ酸配列中にＮ−結合グリコシル化のための６つの可能性のある部位、すなわちＡｓｎ^３６、Ａｓｎ^７２、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１を有する。このうちの５つ、すなわちＡｓｎ^３６、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１がグリコシル化されているのに対し、Ａｓｎ^７２は非グリコシル化または実質的に非グリコシル化である（実質的に非グリコシル化であるとは、ＬＡＬ分子の混合物中、Ａｓｎ^３６、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１、Ａｓｎ^２７３およびＡｓｎ^３２１のいずれよりも少ないＡｓｎ^７２がグリコシル化されているという意味である）ことがわかった。したがって、本発明の一態様は、Ａｓｎ^７２において非グリコシル化および／または実質的に非グリコシル化であるＬＡＬ（例えば、ヒトＬＡＬ）、ならびにそのようなＬＡＬの産生および使用である。ただし、グリコシル化Ａｓｎ^７２を有するＬＡＬは本発明の範囲内にある。Ｎ−グリカン構造は主として、主要糖としてＮ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を有する二分岐、三分岐および四分岐構造の混合物で構成されている。各部位は、本発明の一態様である有利な一式の構造（表２および図１７）を有すると思われる。例えば、Ｍ６Ｐ修飾Ｎ−グリカンは、Ａｓｎ^１０１、Ａｓｎ^１６１およびＡｓｎ^２７３に存在する。非リン酸化構造は、内因性卵白タンパク質に見られるＮ−グリカンの典型である。Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）がないことから判断されるように、Ｏ−結合グリカンは検出されなかった。シアル酸は検出されず、これは、本発明に従って産生された他の内因性および外来性タンパク質のすでに決定されているＮ−グリカン構造と一致する。本発明は、１つ以上の本明細書に開示されるオリゴ糖構造でグリコシル化されたＬＡＬを含む。

方法
中性糖、アミノ糖およびＭ６Ｐを含めた単糖組成を、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー−パルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いて定性的および定量的に決定した。

いくつかの質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＮＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびグリコペプチドＬＣ−ＭＳ）のデータを用いて優勢なグリカンの構造を決定した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは中性Ｎ−グリカンの決定に有効であり、リン酸化Ｎ−グリカンを検出することができた（図１８）。ＮＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル中の微小ピークの性質を決定したが、そのうちのいくつかはリン酸化Ｎ−グリカンによるものであった（図１９）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのリン酸化Ｎ−グリカン検出能力を向上させる努力は実らなかった。

グリコペプチドのＬＣ／ＭＳでは、中性およびリン酸化構造を決定することができ、またＬＡＬのアミノ酸配列中での特定の構造の位置を決定することができた（図１７および表２にデータをまとめる）。

ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムのどのピークがリン酸化Ｎ−グリカンによるものかを決定するために、ＬＡＬをホスファターゼで処理して分析した（図３）。グループＣおよびＤのピークは曲線下面積（ＡＵＣ）が減少したのに対し、グループＡのピークはより顕著になった。グループＢのピークは他のピークに比べて変化がなかった。保持時間が荷電（リン酸化またはシアリル化によるもの）の程度に比例するという知識に基づけば、グループＣは１つのリン酸を有するＮ−グリカン（モノＭ６Ｐ）で構成され、グループＤは２つのリン酸を有するＮ−グリカン（ビス−Ｍ６Ｐ）で構成されていると考えられる。

また保持時間は、中性およびアミノ単糖の組成および相対的な構造上の位置にも影響された。このような例としては、ガラクトースの存在、二分岐ＧｌｃＮａｃの存在およびＧｌｃＮａｃ置換の程度が挙げられる。このような要素はＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムにおけるピークの多様性の一因となる。

実施例１２
卵白中のトランスジェニックトリ由来ｈＬＡＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性解析
卵白中のリソソーム酸リパーゼの活性を、基本的にはＹａｎら（２００６），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６９，Ｎｏ．３，ｐ９１６−９２６（この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通りに蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリルオレアートアッセイを用いて決定した。

４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中２．５ｍＭの４−ＭＵＯからなる４−メチルウンベリフェリルオレアート（４−ＭＵＯ）のストック溶液を調製した。各ウェルが０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０中０．２Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）６２．５μｌ、１２．５μｌの卵白試料および２５μｌの２．５ｍＭ ４−ＭＵＯを含むマイクロタイタープレートでアッセイを行った。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ蛍光測定マイクロプレートリーダー（励起３６０ｎｍおよび発光４６０ｎｍ）を用いて３７℃で３０分間、蛍光の変化をモニターした。アッセイ前に、ｈＬＡＬを含有する卵白を、直線的に少なくとも３０分間続く反応を生じる酵素濃度になるまで希釈した。５０μｌの０．７５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）により反応を停止させ、上で使用したものと同じプレートリーダー（励起３６０ｎｍおよび発光４６０ｎｍ）でエンドポイント蛍光シグナルを測定した。

標準として４−メチルウンベリフェリルを用いて活性単位を決定した。１単位（Ｕ）は、上記アッセイ条件下で１分間当たり１μｍｏｌの４−メチルウンベリフェリルの形成を生じる酵素量と定義される。ｈＬＡＬを含有しない卵白を負の対照として使用した。

ｈＬＡＬに関して陽性の卵白試料は、卵白１ｍＬ当たり１Ｕ〜１００Ｕの間の活性を有していた。２１羽のＧ１ニワトリの卵白を解析した。１０羽のニワトリの卵白が、ｈＬＡＬ活性の試験で陽性であった。

実施例１３
トランスジェニックトリ由来ＬＡＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析
トランスジェニックトリの輸卵管細胞内で産生されたＬＡＬ（本明細書では「ＳＢＣ−１０２」、「トリ由来ＬＡＬ」、「ＬＡＬ」または「ｈＬＡＬ」と呼ぶ）が細胞と結合する能力およびリソソーム区画へ内部移行する能力を、マクロファージおよび線維芽細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで調べた。マクロファージ細胞とインキュベートした場合、蛍光標識されたＳＢＣ−１０２がリソソームに局在していた。この作用はマンノース多糖競合物を用いて弱めることができたが、このことは、認識機序としてのＮ−アセチルグルコサミン／マンノース（ＧｌｃＮＡｃ／マンノース）受容体およびこれらの細胞による取込みを示唆している。ＳＢＣ−１０２はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、インキュベーション後にＬＡＬ欠損ヒト線維芽細胞および正常マウス線維芽細胞の細胞結合型ＬＡＬ活性を増加させたが、このことは、ＳＢＣ−１０２への曝露が、欠損した酵素活性の実質的な置き換えを生じ得ることを示している。

マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）は、遍在するＭ６Ｐ受容体を介した多種多様な細胞型へのリソソーム酵素送達に関与することが示されているＳＢＣ−１０２のオリゴ糖構造内に存在する。

ＬＡＬを雌ニワトリトランスジェニックの卵白から精製した。Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＮＨＳをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（＃０−１０２４１）から入手した。ラット肺胞マクロファージ系ＮＲ８３８３およびマウス線維芽細胞系ＮＩＨ−３Ｔ３をＡＴＣＣから入手した。ＬＡＬ欠損Ｗｏｌｍａｎ病線維芽細胞をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手し、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）から入手した。

酵素標識：ＰＢＳ中の４ｍｇのトランスジェニックトリ由来ＬＡＬを、製造者の推奨に従ってＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎで標識し、次いで反応物をＰＢＳに対して透析した後、濃縮した。

マクロファージによる取込み：蛍光標識したトランスジェニックトリ由来ＬＡＬ（５μｇ／ｍＬ）およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄをＮＲ８３８３細胞とともに２時間インキュベートした。細胞を共焦点蛍光顕微鏡により、４８８ｎｍ、次いで５１４ｎｍにおいて連続スキャンモードを用いて調べた。

マンナンによる競合阻害：蛍光標識したＳＢＣ−１０２（５μｇ／ｍＬ）およびマンナンをＮＲ８３８３細胞とともに２時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、エンドポイントとして中央値の蛍光強度を用いた蛍光標示式細胞分取法により、ＬＡＬ取込みを測定した。

トランスジェニックトリ由来ＬＡＬが取り込まれた後、標的細胞のリソソーム内に取り込まれる能力を、マクロファージ細胞系ＮＲ８３８３を用いて調べた。蛍光標識したトランスジェニックトリ由来ＬＡＬおよびリソソームマーカー「ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を細胞とともに２時間インキュベートした。次いで、連続スキャンモードを用いた共焦点蛍光顕微鏡により、上記細胞のリソソーム内でのトランスジェニックトリ由来ＬＡＬとリソソームマーカーの共局在を調べた（図２０）。ＬＡＬはリソソームへの局在を示したが、このことは、各種入手源由来のｒｈＬＡＬを用いた同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と一致する。

ＧｌｃＮＡｃ／マンノース受容体に対するトランスジェニックトリ由来ＬＡＬの結合特異性を、マクロファージ細胞系ＮＲ８３８３を用いた競合結合アッセイにより評価した（図２１）。５μｇ／ｍＬの蛍光標識した（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）トランスジェニックトリ由来ＬＡＬおよび各種濃度のマンノース含有オリゴ糖であるマンナンを細胞とともに２時間、共インキュベートした。無マンナン対照と比較した、トランスジェニックトリ由来ＬＡＬ取込みのマンナンによる相対的阻害を、エンドポイントとして中央値の蛍光強度を用いた蛍光標示式細胞分取解析により定量化した。トランスジェニックトリ由来ＬＡＬの結合／取込みにおけるマンノース用量依存的な阻害が観察されたが、このことは、トランスジェニックトリ由来ＬＡＬ：ＧｌｃＮＡｃＲ相互作用と一致する。

さらに、マンノース−６−リン酸を用いた競合実験により、線維芽細胞でのマンノース−６−リン酸仲介による取り込みが示された（結果は不掲載）。

トランスジェニックトリ由来ＬＡＬへの曝露が細胞内のＬＡＬ活性を増加させる能力を、正常細胞およびＬＡＬ欠損細胞の両方を用いてｖｉｔｒｏで調べた。Ｗｏｌｍａｎ病患者から分離された線維芽細胞および正常マウス線維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を、０、０．１６または０．５μｇ／ｍＬの濃度のトランスジェニックトリ由来ＬＡＬの存在下で５時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して非特異的シグナルを除去し、４−ＭＵＯ基質を用いて、細胞溶解物をＬＡＬ活性に関してアッセイした。内因性の細胞結合型ＬＡＬ活性は、ＮＩＨ−３Ｔ３に比べてＷｏｌｍａｎ病線維芽細胞で低く、またトランスジェニックトリ由来ＬＡＬとのインキュベーション後に、両細胞型で活性の用量依存的増加が見られた（図２２）。

実施例１４
トランスジェニックトリ由来ＬＡＬのｉｎ ｖｉｖｏ解析
ＬＡＬ欠損Ｙｏｓｈｉｄａラット（すなわち、ホモ接合型）（Ｋｕｒｉｙａｍａら（１９９０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１，ｐ１６０５−１６１１；Ｎａｋａｇａｗａら（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３６，ｐ２２１２−２２１８；ならびにＹｏｓｈｉｄａおよびＫｕｒｉｙａｍａ（１９９０），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４０，ｐ４８６−４８９を参照されたい）を、４週齢から始めて週１回で４週間、ＳＢＣ−１０２（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）またはプラセボで処置した。各投与では、ＳＢＣ−１０２を３０分おきに２つの等しい用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）でラット尾静脈内に注射した。最終投与の１週間後にラットおよび同齢野生型対照を調べた。三重反復で解析を行った。

ＳＢＣ−１０２処置個体の肉眼的病理検査では、臓器サイズの減少に加えて、肝臓の色の正常化が示された。ＳＢＣ−１０２処置ラットは、泡沫状のマクロファージがかなり蓄積している溶剤処置ラットとは極めて対照的に、実質的に正常な肝臓組織増を示した。ＬＡＬ^−／−ラットにおいて上昇する血中アラニントランスフェラーゼおよびアスパラギン酸トランスフェラーゼレベルもＳＢＣ−１０２処置ラットでは減少していた（不掲載）。

各ラットの内部臓器および組織の質量を決定した。そのデータを図２３に示す。臓器サイズは、ＬＡＬ^−／−ラットおよびＬＡＬ^＋／＋ラットにおいて、溶剤またはＳＢＣ−１０２を５ｍｇ／ｋｇで週１回、４週間投与した後に、８週齢で決定された体重のパーセントとして表されている。

図２４に示すように、ＳＢＣ−１０２処置または溶剤処置Ｙｏｓｈｉｄａラットの体重を野生型ラットのものと比較した。ＬＡＬ^−／−ラットには、ＳＢＣ−１０２（５ｍｇ／ｋｇ）または溶剤を単回用量または分割用量（４時間以内に投与）として、ＩＶ注射により投与した。ＬＡＬ^＋／＋ラットは同齢の同腹子対照である。

実施例１５
トリグリセリド解析
野生型、ホモ接合型プラセボ処置およびホモ接合型ＳＢＣ−１０２処置のラットの肝臓および脾臓組織に関してトリグリセリド解析を行った。トリグリセリド解析は標準的な方法（すなわち、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号ＪＭ−Ｋ６２２−１００）を用いて、三重反復で行った。

肝臓の基質レベル
図２５は、ＷＴおよびＬＡＬ欠損ラットにおいて、溶剤またはＳＢＣ−１０２を５ｍｇ・ｋｇ^−１で週１回、４週間投与した後に８週齢で決定された、肝臓のコレステロール、コレステリルエステルおよびトリグリセリドレベルを示している。

実施例１６
用量反応実験
上で行った研究に基づき、ＬＡＬ（「ＳＢＣ−１０２」）の用量範囲および投与計画（週１回および隔週）の薬力学的（ＰＤ）効果をＬＡＬ^−／−ラットで調べた。これらの実験では、ＳＢＣ−１０２を０．２、１、３および５ｍｇ／ｋｇで隔週または０．３５、１および５ｍｇ／ｋｇで週１回の用量で、４週齢から始めて１か月間、ＩＶ注射により投与した。結果は、体重（ＢＷ）増加（図２６）、臓器肥大（図２７）および組織基質レベル（図２８）の改善を示した。血中トランスアミナーゼレベルもＳＢＣ−１０２用量の増加に伴って減少し、高用量ではそのレベルは実質的に野生型のレベルに達した。

実施例１７
ラットモデルにおける組換えＬＡＬの投与
体重、組織中トリグリセリドおよびコレステロール、肝腫大、脾腫、リンパ節腫脹、腸重量、ならびに他のパラメーターに対する組換えヒトリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）反復投与の効果を、ＹｏｓｈｉｄａおよびＫｕｒｉｙａｍａ（１９９０），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４０，ｐ４８６−４８９に記載されているＬＡＬ欠損Ｄｏｎｒｙｕラット（Ｋｕｒｉｙａｍａら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１，ｐ１６０５−１６１１；Ｎａｋａｇａｗａら（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３６，ｐ２２１２−２２１８も参照されたい）（この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）において評価した。

ＬＡＬ欠失に関してホモ接合型（ＬＡＬ^−／−）の４週齢のＤｏｎｒｙｕラットを、トランスジェニックニワトリ輸卵管系で産生された組換えヒトＬＡＬまたは生理食塩水プラセボを投与する群に振り分けた。野生型で同齢の同腹子ラットを対照として用いた。ＬＡＬ ＬＡＬ^−／−ラットには、週１回で４週間（合計で４用量）または隔週で４週間（合計で２用量）、単回用量として、または３０分おきに投与する２つの等しい用量で尾静脈注射により投与した。ＬＡＬの用量は１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇであった。投与計画を表４に示す。潜在的なアナフィラキシー反応を抑えるために、リソソーム蓄積症治療のための酵素置換療法の動物モデルにおける以前の実験（Ｓｈｕｌｌら（１９９４），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．９１，ｐ．１２９３７；Ｂｉｅｌｉｃｋｉら（１９９９），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，ｐ．３６３３５；Ｖｏｇｌｅｒら（１９９９），Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５，ｐ．８３８）（この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく手順で、ラットにジフェンヒドラミン（５ｍｇ／ｋｇ）を前処置した。

図２９は、１週間当たり１ｍｇ／ｋｇのＬＡＬ、１週間当たり５ｍｇ／ｋｇのＬＡＬまたは２週間当たり５ｍｇ／ｋｇのＬＡＬを投与したラットの毎日の体重増加の経過を示している。図では、２つの用量サイズおよび頻度の間で治療効果にほとんどまたは全く差がないことがわかる。

組換えＬＡＬで処置したＬＡＬ^−／−ラットの病理学検査
実施例１に記載されている実験の終わりに、実験動物を人道的に安楽死させて剖検を行い、肉眼的病理、組織病理および臨床化学の検査を行った。肉眼的剖検には、体の外表面、すべての開口部、ならびに頭蓋腔、胸腔、腹腔およびそれらの内容物の検査が含まれていた。ラットの内部臓器および組織の質量を決定し、臓器および組織を採取して、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。固定後、組織を処理してヘマトキシリン／エオシン染色切片のスライドを作製し、評価した。

分析した処置個体の肉眼的病理検査では、図３０の解剖で見られるように、肝臓のサイズおよび色がかなり正常化しているが示された。器官対体重の重量比を決定し、これにより、プラセボ処置ラットに比べて、治療が成功した解剖個体の肝臓、脾臓、腸間膜組織、十二指腸、空腸および回腸の相対的な臓器サイズの減少が示された（図２３）。分析した処置ラットのＬＡＬの肝臓組織の組織病理は、基本的に正常な肝臓組織像を示し、泡沫状のマクロファージがかなり蓄積しているプラセボ処置ラットとは極めて対照的であることを示している（図３０）。

実施例１８
組換えＬＡＬ投与によるウォルマン病（ＷＤ）の治療
生後の体重増加が困難で発育が悪いため、女児患者を生後７週間で入院させる。最初の身体検査で、患者は体重が３．６ｋｇ（出生時体重が３．７ｋｇ）で痩せており、弛緩性皮膚によるしわが見られる。腹部は膨張し、６ｃｍの硬い肝腫大および約４ｃｍの硬い脾腫大が見られる。鼠径部にリンパ節肥大が認められ、筋肉活動が弱い。

最初のヘモグロビンレベルが９．２ｇｍ、血小板数が５０６，０００および白血球が１１，５５０である。尿検査は正常であり、骨髄塗抹標本では空胞のあるリンパ球および多数の泡状細胞が見られる。血化学測定値は、総脂質が８３４ｍｇ／１００ｍｌ、リン脂質が１７６ｍｇ／１００ｍｌ、トリグリセリドが１４１ｍｇ／１００ｍｌ、コレステロールが１２９ｍｇ／１００ｍｌ、ビリルビンが０．３ｍｇ／１００ｍｌ、アルカリホスファターゼが９．０ＢＵ％、ＳＧＯＴが９０単位、ＳＧＰＴが５０単位、コリンエステラーゼが２０単位、尿素窒素が８．３ｍｇ、空腹時血糖が４５ｍｇ／１００ｍｌである。腹部ＣＴスキャンでは、肝脾腫大および石灰化を伴った左右相称の副腎肥大が見られる。

患者に投薬用の静脈アクセスポートを外科手術により埋め込む。ポートを携帯型注入機に接続した後、発生し得るなアナフィラキシー性の注入反応を抑えるために、ＬＡＬ注入の２０分前に患者を１ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンで前処置する。次いで、静脈内注入によりＬＡＬを１ｍｇ／ｋｇで５時間にわたって患者に投与する。この治療法を７日に１回、無期限で繰り返す。

最初のＬＡＬ投与の２週間以内に、患者は体重増加および超音波により判定される重要な腹部臓器のサイズの正常化における著しい改善を経験する。検査結果は、ＬＡＬの注入により、患者のリソソーム酸リパーゼ活性が回復し、関連する異常が修正されたことを示す。

実施例１９
組換えＬＡＬ投与によるコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の治療
そう痒性の腹部発疹を有する３歳男児をかかりつけの小児科医が検査する。腹部の検査では、医師により肝腫大が認められ、超音波により確認される。この時点で診断は下されず、患者は定期的にモニターされる。

８歳で患者は胃腸炎で入院する。肝生検の光学顕微鏡検査では、肝細胞の細胞質内グリコーゲンおよび小脂肪滴の増加が見られる。電子顕微鏡検査では、小型で高電子密度の顆粒を有する、膜で囲まれた脂肪滴が見られる。ＩＩＩ型グリコーゲン蓄積症（脱分枝酵素欠損症）の作業診断（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）が下されるが、皮膚線維芽細胞の脱分枝酵素活性は正常である。

１０歳で肝腫大は続き、２回目の肝生検を行う。光学顕微鏡検査では肝臓実質の小葉構造の変化が見られ、肝細胞が細胞質顆粒および空胞を含んで腫脹し、軽度の門脈周囲線維症を伴っている。線維芽細胞の酸リパーゼ活性は正常の７％であることがわかり、ＣＥＳＤの診断が確定される。総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の各血漿中濃度はそれぞれ７．５１、３．２４および５．５８ｍｍｏｌ／Ｌで、その年齢・性別の９５パーセンタイルを上回り、また血漿中高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は０．４７ｍｍｏｌ／Ｌで５パーセンタイルを下回っており、患者は複合型の高脂血症（高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低アルファリポタンパク血症および高ベータリポタンパク血症）である。

患者に投薬用の静脈アクセスポートを外科手術により埋め込む。ポートを携帯型注入機に接続した後、発生し得るアナフィラキシー性の注入反応を抑えるために、ＬＡＬ注入の２０分前に患者を５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンで前処置する。次いで、静脈内注入によりＬＡＬを５ｍｇ／ｋｇで５時間にわたって患者に投与する。この治療法を１４日に１回、無期限で繰り返す。

最初のＬＡＬ投与の２週間以内に、患者は体重増加および超音波により判定される重要な腹部臓器のサイズの正常化における著しい改善を経験する。検査結果は、ＬＡＬの注入により、患者のリソソーム酸リパーゼ活性が回復し、関連する異常が修正されることを示す。

実施例２０
医薬品の説明および組成
本明細書に記載のＬＡＬ（「ＳＢＣ−１０２」）の原薬は、トランスジェニックニワトリにより産生された卵白から精製された組換えヒトリソソーム酸リパーゼ（ｒｈＬＡＬ）である。ＳＢＣ−１０２で使用される添加剤は、現在市販されているリソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）用の他の製品で使用されているものと同様であり、製剤の安定性を維持するように選択されている。

ＳＢＣ−１０２は無色透明で無菌の液体であり、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）でコーティングした非天然ラテックス（ブチル）製ストッパーとアルミニウム製クリンプシールとを備えた透明なＩ型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れて提供される。ＳＢＣ−１０２は、ＳＢＣ−１０２（２ｍｇ／ｍＬ）、クエン酸三ナトリウム二水和物（１３．７ｍｇ／ｍＬ、ＵＳＰ）、クエン酸一水和物（１．５７ｍｇ／ｍＬ、ＵＳＰ）、ヒト血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ、ＵＳＰ）および注射用水（最終体積分、ＵＳＰ）で構成される水溶液として提供される。ＳＢＣ−１０２のｐＨは５．９±０．２である。ＳＢＣ−１０２は保存剤を含まず、バイアルは単回使用が意図される。

製剤の成分

上記明細書の各例は本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。実際、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、本発明におおける種々の修正、組合せ、追加、削除および変更が可能であることが、当業者には明らかであろう。例えば、１つの実施形態の一部として説明または記載されている特徴を別の実施形態で用いて、さらなる実施形態をもたらすことが可能である。本発明は、このような修正、組合せ、追加、削除および変更を包含するものとする。

上記明細書に引用されている文献（例えば、米国特許、米国特許出願、刊行物）はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の種々の修正および変更は、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。

本発明は、その例となる実施形態に触れながら具体的に示され、記載されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本発明において形態および詳細の種々の変更を行い得るということを理解するであろう。

Claims (22)

1. １つ以上のＮ−グリカン構造を含む単離ヒト組換えリソソーム酸リパーゼ（ｒｈＬＡＬ）を、薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とともに含む、医薬製剤であって、前記ｒｈＬＡＬが、配列番号２のＡｓｎ^１５、Ａｓｎ^８０、Ａｓｎ^１４０、Ａｓｎ^２５２およびＡｓｎ^３００に対応する位置においてＮ−結合グリコシル化されており、そして、前記医薬製剤が、５．９±０．２のｐＨを有する水溶液である、医薬製剤。
2. 前記ｒｈＬＡＬが、リン酸化マンノースを含むＮ−グリカン構造を配列番号２のＡｓｎ^８０、Ａｓｎ^１４０またはＡｓｎ^２５２において含む、請求項１に記載の医薬製剤。
3. 前記ｒｈＬＡＬが、リン酸化マンノースを含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^８０において含む、請求項２に記載の医薬製剤。
4. Ａｓｎ^８０に関連したＮ−グリカン構造の少なくとも３０％がリン酸化マンノースを有するか、または、前記ｒｈＬＡＬが、二リン酸化マンノースを含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^８０において含む、請求項３に記載の医薬製剤。
5. 前記ｒｈＬＡＬが、リン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^１４０において含む、請求項２に記載の医薬製剤。
6. Ａｓｎ^１４０に関連したＮ−グリカン構造の１０％〜５０％がＭ６Ｐを含む、請求項５に記載の医薬製剤。
7. 前記ｒｈＬＡＬが、リン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^２５２において含む、請求項２に記載の医薬製剤。
8. Ａｓｎ^２５２におけるＮ−グリカン構造の少なくとも５０％がＭ６Ｐを含む、請求項７に記載の医薬製剤。
9. 前記ｒｈＬＡＬが、高マンノース基を含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^８０またはＡｓｎ^２５２において含む、請求項１に記載の医薬製剤。
10. 前記高マンノース基が６、７、８、９または１０個のマンノースを含む、請求項９に記載の医薬製剤。
11. 前記ｒｈＬＡＬが、７、８または９個のマンノースを含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^８０またはＡｓｎ^２５２において含む、請求項１０に記載の医薬製剤。
12. 前記ｒｈＬＡＬが、末端ガラクトースを含むＮ−グリカン構造をＡｓｎ^１５、Ａｓｎ^１４０またはＡｓｎ^３００において含む、請求項１に記載の医薬製剤。
13. Ａｓｎ^１５に関連したＮ−グリカン構造の２％〜１０％が末端ガラクトースを含む、請求項１２に記載の医薬製剤。
14. Ａｓｎ^１４０に関連したＮ−グリカン構造の５％未満が末端ガラクトースを含むか、または、Ａｓｎ^１４０に関連したＮ−グリカン構造は末端ガラクトースを有さない、請求項１２または１３に記載の医薬製剤。
15. 前記ｒｈＬＡＬが、Ａｓｎ^３００において末端ガラクトースを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
16. 前記ｒｈＬＡＬのＡｓｎ^５１が非グリコシル化である、請求項１に記載の医薬製剤。
17. 前記ｒｈＬＡＬが、キシロースを有さないＮ−グリカン構造を含み、かつ前記Ｎ−グリカン構造の１５％未満がシアル酸を含むか、または、Ｎグリカン構造はシアル酸を有さない、請求項１に記載の医薬製剤。
18. 前記ｒｈＬＡＬがフコースを含まない、請求項１に記載の医薬製剤。
19. 前記ｒｈＬＡＬが、以下のＮ−結合グリコシル化プロファイルを含む、請求項１に記載の医薬製剤：
    ａ）Ａｓｎ^１５において、
    ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２または
    Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；
    ｂ）Ａｓｎ^８０において、
    Ｐｈｏｓ２Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２；
    ｃ）Ａｓｎ^１４０において、
    Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ１Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、
    Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２または
    Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；
    ｄ）Ａｓｎ^２５２において、
    Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、
    Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、
    Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、
    Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２または
    Ｐｈｏｓ１Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２；および
    ｅ）Ａｓｎ^３００において、
    ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
    ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２または
    Ｇａｌ１ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
    （式中、
    Ｍａｎ＝マンノース、
    ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、
    Ｐｈｏｓ＝リン酸、
    Ｇａｌ＝ガラクトース
    である）。
20. 前記ｒｈＬＡＬがトランスジェニックトリにおいて産生される、請求項１に記載の医薬製剤。
21. 前記ｒｈＬＡＬが前記トランスジェニックトリの輸卵管細胞から産生される、請求項２０に記載の医薬製剤。
22. 前記トリがニワトリである、請求項２０または２１に記載の医薬製剤。