KR101742346B1 - 리소솜 축적병 효소 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 표적 세포 내로 내재화를 위한 특유한 당화 패턴을 갖는 재조합 인간 리소솜성 산 리파아제의 조성물, 인간 리소솜성 산 리파아제를 인코딩하는 핵산을 내포하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 재조합 인간 리소솜성 산 리파아제를 포함하는 제약학적 조성물, 그리고 리소솜성 산 리파아제 결핍과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제시한다.
Description
관련된 출원
본 출원은 2010년 4월 23일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/343,177호, 2010년 5월 26일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/396,376호, 2010년 9월 9일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/403,011호, 2010년 10월 29일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/456,014호, 2011년 1월 13일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/432,372호에 우선권을 주장한다. 이들 출원의 전체 교시는 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다.
본 발명의 배경 기술
리소솜성 산 리파아제 (Lysosomal Acid Lipase, LAL) 결핍은 상기 효소의 결핍으로 인해 리소솜 내에서 콜레스테릴 에스테르 (CE)와 트리글리세리드 (TAG)를 파괴하지 못함으로 특징되는 매우 희귀한 리소솜 축적병 (lysosomal storage disease, LSD)이다. LAL 결핍은 다수의 조직과 세포 유형에서 기질 (substrate)의 축적으로, 다른 리소솜 축적병과 유사하다. LAL 결핍에서, 기질 축적은 간에서 Kupffer 세포, 비장과 소장의 고유판 (lamina propria)에서 조직구 (histiocyte)를 비롯한 세망내피계 (reticuloendothelial system) 세포에서 가장 두드러진다. 세망내피계 세포는 대식세포 만노오스/N-아세틸글루코사민 수용체 (일명, 대식세포 만노오스 수용체 또는 MMR, CD206)를 발현하고, 이것은 GlcNAc 또는 만노오스 종결된 N-글리칸을 갖는 단백질의 결합, 세포 흡수와 리소솜 내재화를 매개하고, 그리고 이들 핵심 세포 유형에서 효소 결핍의 잠재적 수정을 위한 경로를 제시한다.
LAL 결핍은 가장 일반적으로, 위장, 간과 심혈관 합병증으로 나타나고, 그리고 유의미한 이환율 (morbidity)과 사망률 (mortality)과 연관되는 다기관 질환 (multi-system disease)이다. LAL 결핍의 임상적 효과는 다수의 조직에서 리소솜 내에 지질 물질의 대규모 축적 및 간 콜레스테롤 합성에서 실질적인 증가를 비롯한 콜레스테롤과 지질 항상성 기전 (homeostatic mechanism)에서 현저한 장애에 기인한다. LAL 결핍은 적어도 2가지 표현형, 월만병 (Wolman disease, WD) 및 콜레스테롤 에스테르 축적병 (Cholesteryl Ester Storage Disease, CESD)을 유발한다.
월만병은 LAL 결핍의 가장 공격적인 증상이다. 이러한 표현형은 성장 부진 (growth failure), 흡수 불량 (malabsorption), 지방 병증 (steatorrhea), 현저한 체중 감소 및 간종 (hepatomegaly)을 비롯한 위장과 간 징후로 특징된다. 월만병은 급속 진행성이고, 그리고 통상적으로 출생후 1년 이내에 사망을 유발한다. 증례 보고서 검토는 출생후 1년 이내에 LAL 결핍으로 인한 성장 부진을 나타내는 환자의 경우에 12월령을 초과하는 생존이 매우 드물다는 것을 지시한다. 이러한 가장 공격적 형태에서, 성장 부진은 유력한 임상적 특징이고 조기 사망의 핵심 유인이다. 간 비대 및 아미노기전이효소 (transaminase)의 상승으로 증명되는 간 침범 (hepatic involvement) 역시 영아에서 흔히 나타난다. 신체 검사에서 간종 (hepatomegaly)과 비종 (splenomegaly)을 동반한 복부 팽만 (abdominal distention)이 관찰되고, 그리고 방사선투과 시험 (radiographic examination)은 종종, 부신의 석회화 (calcification)를 드러낸다. 실험실 평가는 전형적으로, 혈청 아미노기전이효소의 상승된 수준 및 부재하거나 현저하게 감소된 LAL 효소 활성을 드러낸다. 콜레스테롤과 트리글리세리드의 상승된 혈액 수준 역시 환자에서 관찰된다.
월만병에 대한 현재의 치료 옵션은 극히 한정된다. 발열 및/또는 감염의 증거를 갖는 영아에 항생제가 투여된다. 부신 부전 (adrenal insufficiency)에 대한 스테로이드 대체 요법 (steroid replacement therapy) 및 특수한 영양적 서포트 (specialized nutritional support)가 처방될 수 있고, 그리고 이들 개입이 사망을 예방한다는 증거가 없긴 하지만, 현 시점에서 이들이 단기 생존 (short term survival)에 영향을 주는 지도 불명확하다. 골수 이식 (bone marrow transplantation) 치료를 받은 4명의 LAL 결핍 환자의 연속에서, 4명 환자 모두 이식후 수개월 이내에 상기 절차의 합병증으로 인하여 사망하였다.
LAL 결핍 환자는 또한, 만년에 유력한 간과 심혈관 침범을 나타낼 수 있는데, 이것은 종종, 콜레스테롤 에스테르 축적병 (CESD)으로 불린다. CESD에서, 간은 현저한 간종, 간세포 괴사, 아미노기전이효소의 상승, 간경변 및 섬유증으로 심각한 영향을 받는다. 증가된 수준의 CE와 TG로 인하여, 고지혈증 (hyperlipidemia) 및 가속화된 동맥경화증 (atherosclerosis) 역시 LAL 결핍에서 관찰된다. 특히, 동맥 벽에서 지방 침착물 (fatty deposit)의 축적이 초년에 보고된다. 이들 침착물은 동맥 내강 (arterial lumen)을 좁게 만들고, 그리고 혈관 폐색 (vessel occlusion)을 유발하여 심근 경색 (myocardial infarction)과 뇌졸중 (stroke)을 비롯한 유의미한 심혈관 사건의 위험을 증가시킬 수 있다. CESD의 증상은 매우 가변적이어서, 일부 환자는 합병증이 성인기 후반에 나타날 때까지 진단이 되지 않는 반면, 다른 환자는 아동기 초반에 간 기능장애가 나타날 수 있다. CESD는 단축된 수명 및 유의미한 병구 (ill health)와 연관된다; CESD 환자의 기대 수명 (life expectancy)은 연관된 합병증의 심각도에 좌우된다.
CESD 표현형에 대한 현재의 치료 옵션은 콜레스테롤과 트리글리세리드가 풍부한 음식물을 배제하는 식이를 통한 지질 축적 제어, 그리고 콜레스테롤 강하 약물의 투여를 통한 콜레스테롤 합성과 아포리포단백질 B 생산의 억제에 집중된다. 비록 일부 임상적 향상이 관찰될 수도 있지만, 기초 질병 징후는 지속되고 질병 진행이 여전히 일어난다.
대부분의 경우에, LAL 결핍에 대한 요법은 일생 동안 치료를 필요로 한다. 이에 더하여, 단백질 치료제의 높은 비용으로 인하여, LAL 결핍을 치료하기 위해 최소 효과량의 치료제를 투여하는 것이 바람직하다. 하지만, 현재까지, LAL 결핍, 특히 월만병과 CESD를 앓는 환자를 치료하는데 효과적인 요법은 없다. 이런 이유로, 환자에 대한 삶의 질을 향상시키기 위해 최소 투여 빈도를 갖는 효과적인 요법이 강하게 요구된다. 또한, 환자 내에 병든 조직 세포에서 안정되고 리소솜 구획으로 유효하게 표적화되는 LAL 단백질을 생산할 수 있는 높은 압출성의 강력한 단백질 생산 플랫폼 역시 요구된다.
본 발명의 요약
본 발명에서는 예로써, LAL 결핍과 연관된 질환의 치료를 위한 요법에 이용하는데 특히 적합한 LAL의 조성물이 개시된다. 본 명세서에서 기술된 LAL 분자는 개체, 예를 들면, 인간 개체 내로 투여될 때, 세포의 리소솜 내로 유효하고 신속한 흡수를 제공하는 특유한 글리칸 구조를 내포한다.
한 가지 양상에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 인간 LAL을 포함하고, 여기서 인간 LAL 중에서 실질적인 비율이 적어도 하나의 만노오스-6-인산염 글리칸 모이어티를 내포하고, 이것은 예로써, 간세포 상에서 발견되는 세포 표면에서 만노오스-6-인산염 수용체에 의한 내재화 (internalization)를 위한 리간드로서 기능할 수 있다.
한 구체예에서, 조성물에 내포된 LAL 중에서 30% 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%가 적어도 하나의 만노오스-6-인산염 모이어티를 내포한다. 만노오스-6-인산염 모이어티는 예로써, 서열 번호:2의 Asn15, Asn51, Asn80, Asn140, Asn252 및 Asn300으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 잔기에 위치하는 N-글리칸 구조 상에서 발견될 수 있다.
다른 양상에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 인간 LAL을 포함하고, 여기서 인간 LAL 중에서 실질적인 비율은 임의의 N-글리칸 구조 내에 시알산 모이어티를 내포하지 않고, 이것은 때때로, 세포 내로 효소의 내재화를 간섭할 수 있다. 한 구체예에서, 조성물에 내포된 LAL 중에서 15% 또는 그 이하, 예를 들면, 10% 또는 그 이하, 5% 또는 그 이하, 2% 또는 그 이하, 1% 또는 그 이하가 임의의 N-글리칸 구조 내에 시알산 모이어티를 내포하거나, 또는 시알산 모이어티가 본질적으로 존재하지 않는다.
다른 양상에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 인간 LAL을 포함하고, 여기서 인간 LAL 중에서 실질적인 비율은 임의의 N-글리칸 구조 내에 푸코스 모이어티를 내포하지 않는다. 한 구체예에서, 조성물에 내포된 LAL 중에서 50% 또는 그 이하, 예를 들면, 50% 또는 그 이하, 40% 또는 그 이하, 30% 또는 그 이하, 20% 또는 그 이하, 10% 또는 그 이하, 5% 또는 그 이하, 2% 또는 그 이하, 1% 또는 그 이하가 임의의 N-글리칸 구조 내에 푸코스 모이어티를 내포하거나, 또는 푸코스 모이어티가 본질적으로 존재하지 않는다.
또 다른 양상에서, LAL-내포 조성물을 생산하는데 적합한 벡터, 숙주 세포, 발현 시스템 및 관련된 방법이 기술된다.
전형적으로, 본 명세서에서 논의되고 개시된 본 발명의 LAL은 인간 LAL이다. 한 구체예에서, LAL을 포함하는 조성물은 하기 아미노산 서열을 갖는 성숙 LAL을 포함한다:
(서열 번호:2).
다른 구체예에서, 성숙 LAL는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
(서열 번호:3).
다른 구체예에서, 성숙 LAL은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
(서열 번호:4).
다른 구체예에서, 성숙 LAL은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
(서열 번호: 19).
다른 구체예에서, 성숙 LAL은 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 그리고 서열 번호: 19로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 폴리펩티드의 혼합물이다.
본 발명에서는 또한, 유용한 단백질 분자의 개별 유형, 예를 들면, 본 명세서에서 개시된 단백질의 단리된 혼합물을 내포하는 조성물을 제시하고, 여기서 혼합물에 내포된 단백질 분자 중에서 하나 또는 그 이상은 특정한 올리고당류 구조, 특히 본 명세서에서 개시된 올리고당류 구조가 부착된다. 가령, 본 발명에서는 LAL 분자, 예를 들면, 하기 구조 A-n 내지 O-n 중에서 하나 또는 그 이상으로 당화된 LAL 분자를 내포하는 인간 LAL 분자의 단리된 혼합물을 제시한다:
정사각형 = N-아세틸 글루코사민
채워진 정사각형 = 만노오스-6-인산염
원 = 만노오스
채워진 원 = 갈락토오스
채워진 삼각형 = 푸코스
본 발명의 한 가지 양상에 따라, 조성물은 앞서 기술된 임의의 단리된 개별 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 제약학적 조성물, 예를 들면, 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 포함하는 제제일 수 있고, 따라서 조성물은 예로써, 개체 (가령, 인간, 구체적으로 질환을 앓거나 질환으로 진단된 환자) 내로 투여에 적합하다. 조성물은 정맥내 투여를 비롯하여, 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 두 번째 작용제를 더욱 포함할 수 있다. 이런 작용제는 약제, 또는 개체 내로 투여될 때 생물학적 과정 (biological process)에 영향을 주거나 이를 변화시킬 수 있는 작용제이다. 가령, 두 번째 작용제는 면역조절제 (immunomodulatory agent)일 수 있다. 이런 면역조절제는 본 명세서에서 기술된 임의의 LAL 조성물과 함께 투여 (즉, 동시에, 또는 직전에 또는 직후에 투여)될 때 개체 내에서 LAL 조성물의 면역원성 (immunogenicity)을 감소시키는 효과를 갖는 임의의 작용제 (가령, 리툭시맙 (Rituximab), 또는 임의의 다른 B-세포 고갈 항체)를 포함할 수 있다.
최종 양상에서, LAL 결핍과 연관된 증상의 치료를 위한 방법과 조성물이 개시된다.
본 발명의 추가적인 목적과 양상은 첨부된 도면 및 서열과 합동될 때, 하기에 진술된 상세한 설명의 검토 시에 더욱 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 인간 LAL의 아미노산 서열을 도시한다. 재조합 hLAL의 아미노산 서열은 자연 인간 LAL의 아미노산 서열과 100% 상동성을 보인다. 성숙 형태의 hLAL은 밑줄로 표시된다.
도 2에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA의 rhLAL 도입유전자인 재조합 hLAL의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 3A와 3B에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 및 이의 프로바이러스 영역의 다이어그램을 도시한다. 도 3A에서는 도해된 형질도입 입자의 생산에 이용되는 인간 LAL 레트로바이러스 발현 벡터의 다이어그램을 도시한다 (플라스미드의 DNA 서열은 부록 A에서 위치된다). 도 3A에서는 유전체 내로 통합된 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 프로바이러스 영역을 도시한다. SIN LTR, 자기-비활성화 긴 말단 반복; OV DHSIII 인핸서, 난백알부민 유전자의 DNase 과민성 부위 III; OV 인트론, 난백알부민 5' 비번역 영역과 인트론 1; hLAL, 인간 LAL cDNA; OV 3' UTR, 난백알부민 유전자 3' 비번역 영역; 부분 gag, 부분 gag 유전자; LTR, 긴 말단 반복.
도 4에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 5에서는 유전체 내로 통합된 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 프로바이러스 영역의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 6에서는 pALVIN-OV-1.1-I 벡터의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 7에서는 rhLAL 어댑터의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 8에서는 부분 난백알부민 프로모터를 포함하는 rhLAL의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 9에서는 OVR1 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 10에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 벡터를 작제하는데 이용된 단계의 개요를 도시한다.
도 11에서는 XLL109의 반접합성 유전자도입 G1 자손으로부터 혈액 DNA 샘플의 실시간 PCR 분석을 도시한다. 반접합성 G1 후손, 1LL7466의 중복 DNA 샘플로부터 신호는 사이클 22에 앞서, Delta Rn의 증가를 시작하는 곡선에 의해 표시된다. 2가지 비-유전자도입 후손에 대한 곡선이 도시된다; 이들 곡선은 적어도 34 사이클까지 기준선에 또는 기준선에 가깝게 머물러 있다.
도 12A-D에서는 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자를 보유하는 G1 닭의 서던 분석을 도시한다. 도 12A에서는 통합된 도입유전자의 개요를 도시하고, 그리고 측면 유전체 영역은 도입유전자 B1pI 부위의 공지된 위치 및 측면 유전체 B1pI 부위의 예측된 위치와 함께 도시된다. OV 프로모터 프로브와 hLAL 코딩 서열 프로브 (hLAL 프로브)의 위치는 검은색 막대로 표시된다. 서던 분석에서 검출된 4.3 kb와 10.6 kb 띠의 위치뿐만 아니라 이들 4.3 kb와 10.6 kb 띠의 유전체와 도입유전자 일부분의 예측된 크기가 도시된다. 도 12B에서는 B1pI로 절단되고 OV 프로브로 탐침된 유전체 DNA의 서던 블롯을 도시한다. WT CTRL은 비-유전자도입 닭으로부터 단리된 유전체 DNA이다. G1 유전자도입의 ID 번호는 레인 위에 표시된다. 분자량 마커의 위치와 크기 (kb)는 블롯의 왼쪽에 도시된다. 검출된 도입유전자 단편 (4.3 kb)과 내인성 난백알부민 유전자 (4.1 kb)의 위치와 크기는 블롯의 오른쪽에 도시된다. 도 12C에서는 hLAL 프로브로 탐침된 서던 블롯을 도시한다. 검출된 도입유전자 단편 (10.6 kb)의 위치와 크기는 블롯의 오른쪽에 도시된다. 도 12D에서는 4.1과 4.3 kb 띠의 존재를 증명하기 위해 더욱 큰 척도에서, 도 12B에 도시된 이미지의 단면을 도시한다.
도 13A에서는 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자의 개요를 도시한다. OV 프로브와 hLAL 프로브에 의해 검출될 것으로 예측되는 ApaLI 띠의 크기 역시 도시된다. 도 13B에서는 도입유전자 크기의 확증을 위한 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자의 서던 블롯 분석의 개요를 도시한다. ApaLI로 절단되고 OV 프로브 (왼쪽 패널) 또는 hLAL 프로브 (오른쪽 패널)로 탐침된 유전체 DNA의 서던 블롯. WT CTRL은 비-유전자도입 닭으로부터 단리된 유전체 DNA이다. 이들 G1의 ID 번호는 각 레인 위에 표시된다. 분자량 마커의 위치와 크기 (kb)는 블롯의 왼쪽에 도시된다. 검출된 도입유전자 단편 (OV 프로모터 프로브, 3.6 kb; hLAL 프로브, 3.8 kb) 및 내인성 난백알부민 유전자 (7.7 kb)의 위치와 크기는 블롯의 오른쪽에 도시된다.
도 14에서는 유전자도입 닭의 계통을 도시한다. 각 닭에 대해 생산 번호 (GO, G1 또는 G2), 식별 번호, 성별 및 부화 일자가 도시된다. 다른 G1 닭은 다른 계통의 닭이다.
도 15에서는 흰자위로부터 hLAL의 정제 단계를 도시한다.
도 16에서는 본 발명에 따라 생산된 LAL 내에서 N-연결된 당화 구조로서 발견되는 N-글리칸을 도시한다. 정사각형, N-아세틸 글루코사민; 채워진 정사각형, 만노오스-6-인산염; 원, 만노오스; 채워진 원; 갈락토오스; 그리고 채워진 삼각형, 푸코스.
도 17에서는 서열 번호: 1에 진술된 LAL 폴리펩티드 상에 지시된 예측된 N-글리칸 부위의 상대적 위치를 도시한다 (화살표). 각 부위에서 검출된 것들의 구조적으로 전형적인 N-글리칸이 도시된다. 정사각형, N-아세틸 글루코사민; 채워진 정사각형, 만노오스-6-인산염; 원, 만노오스; 채워진 원; 갈락토오스; 그리고 채워진 삼각형, 푸코스.
도 18에서는 PNGase에 의해 방출되고 MALDI-TOF에 의해 분석된 인산화된 N-글리칸을 도시한다. 구조가 도시된다.
도 19에서는 N-글리칸의 HPAEC-PAD 체류 시간에 대한 LAL의 탈인산화의 효과를 도시한다. 본 발명에 따라 생산된 LAL는 박테리아 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)로 탈인산화되거나 (위쪽 패널), 또는 처리 없이 남겨진다 (아래쪽 패널). 방출된 N-글리칸은 HPAEC-PAD에 의해 분석되었다.
도 20에서는 순차적 주사 양식 (sequential scanning mode)을 이용한 공초점 형광 검경 (confocal fluorescence microscopy)에 의해 조사된 이들 세포의 리소솜에서 재조합 인간 LAL(SBC-102)과 리소솜 마커의 공동-국한 (co-localization)을 도시한다.
도 21에서는 대식세포 세포주, NR8383을 이용한 경쟁적 결합 분석평가에 의해 평가된, GlcNAc/만노오스 수용체에 대한 재조합 인간 LAL (SBC-102)의 결합 특이성을 도시한다.
도 22에서는 시험관내에서 정상 세포와 LAL-결함성 세포에서, 세포 내에서 재조합 인간 LAL의 활성을 도시한다.
도 23에서는 LAL 결함성 쥐의 내부 장기 크기 (internal organs mass)에 대한 재조합 인간 LAL (SBC-102) 치료의 효과를 도시한다. 장기 크기는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 SBC-102의 주 1회 투여후 LAL-/- 쥐와 LAL +/+ 쥐에서, 8주령에서 측정된 체중의 퍼센트로서 표시된다.
도 24에서는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 SBC-102의 주 1회 투여후 야생형 쥐와 LAL-결함성 쥐에서 체중을 도시한다. 복용량 투여는 4주에서부터 다이아몬드에 의해 X-축에 강조된다.
도 25에서는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 재조합 인간 LAL (SBC-102)의 주 1회 투여후 WT와 LAL 결함성 쥐에서 8주령에서 측정된 간 콜레스테롤, 콜레스테릴 에스테르와 트리글리세리드 수준을 도시한다.
도 26에서는 8주령에서 측정된, 지정된 수준과 일정에서 재조합 인간 LAL (SBC-102)의 4주 투여후 LAL-결함성 쥐에서 체중의 증가 퍼센트를 도시한다.
도 27에서는 8주령에서 측정된, 지정된 수준과 일정에서 SBC-102의 4주 투여후 LAL-결함성 쥐에서 체중의 퍼센트로서 간 중량을 도시한다.
도 28에서는 8주령에서 측정된, 지정된 수준과 일정에서 SBC-102의 4주 투여후 LAL-결함성 쥐에서 조직 콜레스테릴 에스테르 수준을 도시한다.
도 29에서는 매주 1 ㎎/㎏의 LAL 또는 매주 5 ㎎/㎏의 LAL 또는 2주마다 5 ㎎/㎏의 LAL이 투여된 쥐의 체중 증가에서 일일 경과를 도시한다.
도 30에서는 위쪽 패널에서 해부체, 그리고 아래쪽 패널에서 위약-치료된 동물에서 거품 대식세포의 실질적인 축적과 현저하게 대조적으로 정상적인 간 조직구조를 보이는 치료된 쥐의 LAL로부터 간 조직의 조직병리에서 확인할 수 있는 바와 같이, 간 크기와 색깔에서 실질적인 정상화를 보이는 치료된 동물의 육안 병리 검사 (gross pathological examination)를 도시한다.
도 1에서는 인간 LAL의 아미노산 서열을 도시한다. 재조합 hLAL의 아미노산 서열은 자연 인간 LAL의 아미노산 서열과 100% 상동성을 보인다. 성숙 형태의 hLAL은 밑줄로 표시된다.
도 2에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA의 rhLAL 도입유전자인 재조합 hLAL의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 3A와 3B에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 및 이의 프로바이러스 영역의 다이어그램을 도시한다. 도 3A에서는 도해된 형질도입 입자의 생산에 이용되는 인간 LAL 레트로바이러스 발현 벡터의 다이어그램을 도시한다 (플라스미드의 DNA 서열은 부록 A에서 위치된다). 도 3A에서는 유전체 내로 통합된 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 프로바이러스 영역을 도시한다. SIN LTR, 자기-비활성화 긴 말단 반복; OV DHSIII 인핸서, 난백알부민 유전자의 DNase 과민성 부위 III; OV 인트론, 난백알부민 5' 비번역 영역과 인트론 1; hLAL, 인간 LAL cDNA; OV 3' UTR, 난백알부민 유전자 3' 비번역 영역; 부분 gag, 부분 gag 유전자; LTR, 긴 말단 반복.
도 4에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 5에서는 유전체 내로 통합된 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 프로바이러스 영역의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 6에서는 pALVIN-OV-1.1-I 벡터의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 7에서는 rhLAL 어댑터의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 8에서는 부분 난백알부민 프로모터를 포함하는 rhLAL의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 9에서는 OVR1 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 10에서는 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 벡터를 작제하는데 이용된 단계의 개요를 도시한다.
도 11에서는 XLL109의 반접합성 유전자도입 G1 자손으로부터 혈액 DNA 샘플의 실시간 PCR 분석을 도시한다. 반접합성 G1 후손, 1LL7466의 중복 DNA 샘플로부터 신호는 사이클 22에 앞서, Delta Rn의 증가를 시작하는 곡선에 의해 표시된다. 2가지 비-유전자도입 후손에 대한 곡선이 도시된다; 이들 곡선은 적어도 34 사이클까지 기준선에 또는 기준선에 가깝게 머물러 있다.
도 12A-D에서는 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자를 보유하는 G1 닭의 서던 분석을 도시한다. 도 12A에서는 통합된 도입유전자의 개요를 도시하고, 그리고 측면 유전체 영역은 도입유전자 B1pI 부위의 공지된 위치 및 측면 유전체 B1pI 부위의 예측된 위치와 함께 도시된다. OV 프로모터 프로브와 hLAL 코딩 서열 프로브 (hLAL 프로브)의 위치는 검은색 막대로 표시된다. 서던 분석에서 검출된 4.3 kb와 10.6 kb 띠의 위치뿐만 아니라 이들 4.3 kb와 10.6 kb 띠의 유전체와 도입유전자 일부분의 예측된 크기가 도시된다. 도 12B에서는 B1pI로 절단되고 OV 프로브로 탐침된 유전체 DNA의 서던 블롯을 도시한다. WT CTRL은 비-유전자도입 닭으로부터 단리된 유전체 DNA이다. G1 유전자도입의 ID 번호는 레인 위에 표시된다. 분자량 마커의 위치와 크기 (kb)는 블롯의 왼쪽에 도시된다. 검출된 도입유전자 단편 (4.3 kb)과 내인성 난백알부민 유전자 (4.1 kb)의 위치와 크기는 블롯의 오른쪽에 도시된다. 도 12C에서는 hLAL 프로브로 탐침된 서던 블롯을 도시한다. 검출된 도입유전자 단편 (10.6 kb)의 위치와 크기는 블롯의 오른쪽에 도시된다. 도 12D에서는 4.1과 4.3 kb 띠의 존재를 증명하기 위해 더욱 큰 척도에서, 도 12B에 도시된 이미지의 단면을 도시한다.
도 13A에서는 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자의 개요를 도시한다. OV 프로브와 hLAL 프로브에 의해 검출될 것으로 예측되는 ApaLI 띠의 크기 역시 도시된다. 도 13B에서는 도입유전자 크기의 확증을 위한 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자의 서던 블롯 분석의 개요를 도시한다. ApaLI로 절단되고 OV 프로브 (왼쪽 패널) 또는 hLAL 프로브 (오른쪽 패널)로 탐침된 유전체 DNA의 서던 블롯. WT CTRL은 비-유전자도입 닭으로부터 단리된 유전체 DNA이다. 이들 G1의 ID 번호는 각 레인 위에 표시된다. 분자량 마커의 위치와 크기 (kb)는 블롯의 왼쪽에 도시된다. 검출된 도입유전자 단편 (OV 프로모터 프로브, 3.6 kb; hLAL 프로브, 3.8 kb) 및 내인성 난백알부민 유전자 (7.7 kb)의 위치와 크기는 블롯의 오른쪽에 도시된다.
도 14에서는 유전자도입 닭의 계통을 도시한다. 각 닭에 대해 생산 번호 (GO, G1 또는 G2), 식별 번호, 성별 및 부화 일자가 도시된다. 다른 G1 닭은 다른 계통의 닭이다.
도 15에서는 흰자위로부터 hLAL의 정제 단계를 도시한다.
도 16에서는 본 발명에 따라 생산된 LAL 내에서 N-연결된 당화 구조로서 발견되는 N-글리칸을 도시한다. 정사각형, N-아세틸 글루코사민; 채워진 정사각형, 만노오스-6-인산염; 원, 만노오스; 채워진 원; 갈락토오스; 그리고 채워진 삼각형, 푸코스.
도 17에서는 서열 번호: 1에 진술된 LAL 폴리펩티드 상에 지시된 예측된 N-글리칸 부위의 상대적 위치를 도시한다 (화살표). 각 부위에서 검출된 것들의 구조적으로 전형적인 N-글리칸이 도시된다. 정사각형, N-아세틸 글루코사민; 채워진 정사각형, 만노오스-6-인산염; 원, 만노오스; 채워진 원; 갈락토오스; 그리고 채워진 삼각형, 푸코스.
도 18에서는 PNGase에 의해 방출되고 MALDI-TOF에 의해 분석된 인산화된 N-글리칸을 도시한다. 구조가 도시된다.
도 19에서는 N-글리칸의 HPAEC-PAD 체류 시간에 대한 LAL의 탈인산화의 효과를 도시한다. 본 발명에 따라 생산된 LAL는 박테리아 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)로 탈인산화되거나 (위쪽 패널), 또는 처리 없이 남겨진다 (아래쪽 패널). 방출된 N-글리칸은 HPAEC-PAD에 의해 분석되었다.
도 20에서는 순차적 주사 양식 (sequential scanning mode)을 이용한 공초점 형광 검경 (confocal fluorescence microscopy)에 의해 조사된 이들 세포의 리소솜에서 재조합 인간 LAL(SBC-102)과 리소솜 마커의 공동-국한 (co-localization)을 도시한다.
도 21에서는 대식세포 세포주, NR8383을 이용한 경쟁적 결합 분석평가에 의해 평가된, GlcNAc/만노오스 수용체에 대한 재조합 인간 LAL (SBC-102)의 결합 특이성을 도시한다.
도 22에서는 시험관내에서 정상 세포와 LAL-결함성 세포에서, 세포 내에서 재조합 인간 LAL의 활성을 도시한다.
도 23에서는 LAL 결함성 쥐의 내부 장기 크기 (internal organs mass)에 대한 재조합 인간 LAL (SBC-102) 치료의 효과를 도시한다. 장기 크기는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 SBC-102의 주 1회 투여후 LAL-/- 쥐와 LAL +/+ 쥐에서, 8주령에서 측정된 체중의 퍼센트로서 표시된다.
도 24에서는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 SBC-102의 주 1회 투여후 야생형 쥐와 LAL-결함성 쥐에서 체중을 도시한다. 복용량 투여는 4주에서부터 다이아몬드에 의해 X-축에 강조된다.
도 25에서는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 재조합 인간 LAL (SBC-102)의 주 1회 투여후 WT와 LAL 결함성 쥐에서 8주령에서 측정된 간 콜레스테롤, 콜레스테릴 에스테르와 트리글리세리드 수준을 도시한다.
도 26에서는 8주령에서 측정된, 지정된 수준과 일정에서 재조합 인간 LAL (SBC-102)의 4주 투여후 LAL-결함성 쥐에서 체중의 증가 퍼센트를 도시한다.
도 27에서는 8주령에서 측정된, 지정된 수준과 일정에서 SBC-102의 4주 투여후 LAL-결함성 쥐에서 체중의 퍼센트로서 간 중량을 도시한다.
도 28에서는 8주령에서 측정된, 지정된 수준과 일정에서 SBC-102의 4주 투여후 LAL-결함성 쥐에서 조직 콜레스테릴 에스테르 수준을 도시한다.
도 29에서는 매주 1 ㎎/㎏의 LAL 또는 매주 5 ㎎/㎏의 LAL 또는 2주마다 5 ㎎/㎏의 LAL이 투여된 쥐의 체중 증가에서 일일 경과를 도시한다.
도 30에서는 위쪽 패널에서 해부체, 그리고 아래쪽 패널에서 위약-치료된 동물에서 거품 대식세포의 실질적인 축적과 현저하게 대조적으로 정상적인 간 조직구조를 보이는 치료된 쥐의 LAL로부터 간 조직의 조직병리에서 확인할 수 있는 바와 같이, 간 크기와 색깔에서 실질적인 정상화를 보이는 치료된 동물의 육안 병리 검사 (gross pathological examination)를 도시한다.
본 발명의 상세한 설명
정의
본 발명을 기술하는데 이용된 다양한 용어의 의미와 범위를 예시하고 정의하기 위해 일정한 정의가 여기에 진술된다.
본 명세서에서, 제제, 조성물 또는 성분에 대하여 용어 "허용되는" 은 본 명세서에서, 치료되는 개체의 전반적인 건강에 대한 영속하는 유해한 효과를 갖지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 본 발명의 재조합 인간 리소솜성 산 리파아제를 치료가 필요한 개체에 제공하는 것을 지칭한다.
"핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열"에는 자연 뉴클레오시드 염기 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 그리고 우라실을 포함하는 진핵 mRNA, cDNA, 유전체 DNA, 그리고 합성 DNA와 RNA 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상기 용어는 또한, 하나 또는 그 이상의 변형된 염기를 갖는 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "조류"는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀 및 타조, 에뮤와 화식조를 비롯한 주금류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 해부학적 부류 (taxonomic class) 아바 (ava)의 임의의 종, 아종 또는 생물체 일족을 지칭한다. 상기 용어는 닭 (Gallus gallus, 또는 chicken)의 다양한 공지된 종족 (가령, White Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Minorca, Amrox, California Gray), 그리고 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 상업적 양으로 통상적으로 사육되는 다른 가금류의 종족을 포함한다. 이것은 또한, 배아와 태아 단계를 비롯한 모든 발달 단계에서 개별 조류 생물체를 포함한다.
"치료 단백질" 또는 "제약학적 단백질"은 약물을 전체적으로 또는 부분적으로 구성하는 아미노산 서열을 포함한다.
"코딩 서열" 또는 "개방 해독틀"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치될 때 시험관내에서 또는 생체내에서 전사되고 번역될 수 있는 (DNA의 경우에), 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 (mRNA의 경우에) 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 지칭한다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서 번역 시작 코돈 및 3' (카르복시) 말단에서 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 일반적으로, 코딩 서열의 3'에 위치한다. 코딩 서열은 5' 및/또는 3' 단부에서 비번역 영역과 접할 수도 있다.
"엑손"은 핵 전사체로 전사될 때, 핵 절단접합 (nuclear splicing)에 의한 인트론 또는 개재성 서열의 제거후 세포질 mRNA에서 "발현되는" 유전자의 일부를 지칭한다. 핵산 "제어 서열" 또는 "조절 서열"은 정의된 숙주 세포에서 소정의 코딩 서열의 전사와 번역에 필요하고 충분한 프로모터 서열, 번역 시작과 종결 코돈, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 인핸서 등을 지칭한다. 진핵 세포에 적합한 제어 서열의 실례는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 그리고 인핸서이다. 원하는 유전자의 전사와 번역을 위해 필요하고 충분한 제어 서열이 존재하기만 하면, 이들 제어 서열 모두가 재조합 벡터 내에 존재할 필요는 없다.
"실시가능하게 또는 작동가능하게 연결된"은 원하는 기능을 수행하기 위한, 코딩 서열과 제어 서열의 배열 (configuration)을 지칭한다. 따라서 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 달성할 수 있다. 코딩 서열은 DNA 중합효소가 프로모터 서열에 결합하고 코딩 서열을 mRNA로 전사시키고 상기 mRNA가 인코딩된 단백질로 번역될 수 있을 때, 세포 내에서 전사 조절 영역에 작동가능하게 연결되거나, 또는 전사 조절 영역의 제어 하에 있다. 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 감독하는 기능을 하기만 하면, 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 따라서 가령, 비번역이지만 전사된 개재성 서열이 프로모터 서열 및 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 그리고 프로모터 서열은 여전히, 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
용어 "이형성"과 "외인성"은 핵산 서열, 예를 들면, 코딩 서열 및 제어 서열에 관련되기 때문에, 재조합 구조체의 영역 또는 특유한 염색체 좌위와 정상적으로 연관되지 않는 및/또는 특유한 세포와 정상적으로 연관되지 않는 서열을 의미한다. 따라서 핵산 구조체의 "외인성" 영역은 본성적으로 다른 분자와 결합하여 발견되지 않는 다른 핵산 분자 내에 또는 다른 핵산 분자에 부착된 핵산의 식별가능 분절이다. 가령, 구조체의 외인성 영역은 본성적으로 코딩 서열과 결합하여 발견되지 않는 서열과 측면에서 접하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 외인성 코딩 서열의 다른 실례는 코딩 서열 자체가 본성적으로 발견되지 않는 구조체 (가령, 고유 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 숙주 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 구조체 또는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포는 본 발명에서 외인성으로 간주될 것이다.
본 명세서에서, 용어 "N-글리칸", "올리고당류", "올리고당류 구조", "당화 패턴", "당화 프로필" 및 "당화 구조"는 본질적으로 동일한 의미를 갖고, 그리고 이들 각각은 당 잔기로부터 형성되고 당화된 단백질에 부착되는 하나 또는 그 이상의 구조를 지칭한다.
본 명세서에서, "외인성 단백질"은 특유한 조직 또는 세포 내에 자연적으로 존재하지 않는 단백질, 외인성 발현 구조체 또는 도입유전자의 발현 산물인 단백질, 또는 특유한 조직 또는 세포 내에서 소정의 양으로 자연적으로 존재하지 않는 단백질을 지칭한다. 알에 외인성인 단백질은 알에서 정상적으로 발견되지 않는 단백질이다. 가령, 알에 외인성 단백질은 알을 낳는 동물의 도입유전자 내에 존재하는 코딩 서열의 발현의 결과로써 알 내에 존재하는 단백질일 수 있다.
"내인성 유전자"는 특유한 세포와 정상적으로 연관된 자연 발생 유전자 또는 이의 단편을 지칭한다.
"LAL"은 "인간 리소솜성 산 리파아제", "SBC-102" 또는 "인간 리소솜성 산 리파아제 분자"를 의미하고, 그리고 이들 용어는 명세서 전반에서 교체가능하게 이용된다.
본 명세서에서 기술된 발현 산물은 정의된 화학적 구조를 갖는 단백질성 물질로 구성될 수 있다. 하지만, 정확한 구조는 다수의 인자, 구체적으로 단백질에 공통된 화학적 변형에 좌우된다. 가령, 모든 단백질이 이온화가능 아미노와 카르복실 기를 내포하기 때문에, 단백질은 산성 또는 염기성 염 형태로, 또는 중성 형태로 획득될 수 있다. 일차 아미노산 서열은 당 분자 (당화)를 이용하여, 또는 당류와의 결합을 통해 종종 발생하는, 예로써 지질, 인산염, 아세틸 기 등과의 공유 또는 이온 부착을 수반하는 다른 화학적 유도체화 (derivatization)에 의해 유도체화될 수 있다. 이들 변형은 시험관내에서 또는 생체내에서 발생할 수 있고, 후자는 번역후 가공 시스템 (post-translational processing system)을 통해 숙주 세포에 의해 수행된다. 이런 변형은 분자의 생물학적 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있고, 그리고 이런 화학적으로 변형된 분자 역시 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
클로닝, 증폭, 발현, 그리고 정제의 대안적 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 대표적인 방법은 Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)에서 기술된다.
"벡터"는 단일 가닥, 이중 가닥, 원형, 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적인 벡터는 기능적 유전자 발현을 가능하게 하기 위한 적절한 거리에서 작동가능하게 연결된 하기 요소: 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 5' mRNA 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 핵산 카세트, 종결과 폴리아데닐화 부위, 그리고 선별가능 마커 서열로 구성될 수 있다. 이들 요소 중에서 하나 또는 그 이상이 특정한 적용에서 생략될 수 있다. 핵산 카세트는 발현되는 핵산 서열의 삽입을 위한 제한 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에서, 핵산 카세트는 번역 개시와 종결 부위를 비롯하여, 발현되는 핵산 서열을 내포한다. 인트론은 임의적으로, 구조체 내에, 예를 들면, 코딩 서열의 5'에 포함될 수 있다. 벡터는 특유한 코딩 서열이 적절한 조절 서열을 갖는 벡터 내에 위치하도록 작제되고, 제어 서열에 대하여 코딩 서열의 위치결정과 방향은 코딩 서열이 제어 또는 조절 서열의 "제어" 하에 전사되도록 하는 것이다. 목적되는 특유한 단백질을 인코딩하는 서열의 변형은 이러한 목적을 달성하는데 바람직할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 적절한 방향으로 제어 서열에 부착되거나, 또는 해독틀을 유지하기 위해 서열을 변형하는 것이 필요할 수도 있다. 제어 서열 및 기타 조절 서열은 벡터 내로 삽입에 앞서 코딩 서열에 결찰될 수 있다. 대안으로, 코딩 서열은 제어 서열 및 제어 서열과의 해독틀 내에 및 제어 서열의 조절 제어 하에 적절한 제한 부위를 이미 내포하는 발현 벡터 내로 직접적으로 클로닝될 수 있다.
"프로모터"는 유전자의 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 상에 부위이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 서열의 부가 또는 결실에 의해 변형되거나, 또는 자연과 합성 서열뿐만 아니라 합성과 자연 서열의 조합일 수 있는 서열을 비롯한 대안적 서열로 대체될 수 있다. 많은 진핵 프로모터는 2가지 유형의 인식 서열: TATA 박스 및 상류 프로모터 요소를 내포한다. 전사 개시 부위의 상류에 위치하는 전자는 정확한 부위에서 전사를 개시하도록 RNA 중합효소를 감독하는데 관여하고, 반면 후자는 전사 속도를 결정하는 것으로 생각되고 TATA 박스의 상류에 위치한다. 인핸서 요소 역시 연결된 프로모터로부터 전사를 촉진하지만 많은 수가 특유한 세포 유형에서 배타적으로 기능한다. 바이러스로부터 유래된 많은 인핸서/프로모터 요소, 예를 들면, SV40 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스-육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 그리고 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 프로모터는 모두 폭넓은 범위의 세포 유형에서 활성을 갖고, 그리고 "편재성"으로 명명된다. 대안으로, 비-구조성 프로모터, 예를 들면, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 역시 본 발명에 이용될 수 있다. 클로닝 부위 내에 삽입된 핵산 서열은 코딩 서열이 목적되는 폴리펩티드를 인코딩하는 경우에, 적절한 mRNA 분자의 생산을 차단하고 및/또는 이상하게 절단접합된 또는 비정상적 mRNA 분자를 생산할 수 있는 숨겨진 절단접합 부위가 없어야 한다는 단서를 달고, 목적되는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 개방 해독틀을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "제약학적 조성물"은 다른 화학적 성분, 예를 들면, 담체, 안정제, 희석제, 분산제, 현탁제, 농후제, 및/또는 부형제와 함께 본 명세서에서 기술된 화합물의 혼합물을 지칭한다.
용어 "가금류 유래된" 또는 "조류 유래된"은 가금류에 의해 생산되거나 가금류로부터 획득된 조성물 또는 물질을 지칭한다. "가금류"는 닭, 오리, 칠면조, 메추라기 및 주금류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 가축으로서 사육될 수 있는 조류를 지칭한다. 가령, "가금류 유래된"은 닭 유래되고, 칠면조 유래되고 및/또는 메추라기 유래된다는 것을 지칭한다.
"레트로바이러스 입자", "형질도입성 입자", 또는 "형질도입 입자"는 세포 내로 비-바이러스성 DNA 또는 RNA를 형질도입할 수 있는 복제-결함성 또는 복제-적격성 바이러스를 지칭한다. 한 가지 특히 유용한 구체예에서, 본 발명에 따라서 유전자도입 조류를 생산하는데 이용되는 레트로바이러스 입자는 2009년 4월 28일자 허여된 U.S. Patent No. 7,524,626에서 개시된 바와 같이 만들어지고, 이의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
용어 "형질전환", "형질도입" 및 "형질감염"은 모두 조류 배반엽 세포 (blastodermal cell) 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 의미한다. "매그넘 (magnum)"은 알의 흰자위 단백질을 합성하고 분비하는 관상샘 세포 (tubular gland cell)를 내포하는 누두 (infundibulum)와 지협 (isthmus) 사이에 수란관 (oviduct)의 일부이다.
용어 "도입유전자 (transgene)"는 본 발명에 따라서, 조류 유전체 내로 삽입된 이형성 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "도입유전자"는 특정적으로, 외인성 코딩 서열, 외인성 프로모터 또는 기타 조절 서열에 연결된 외인성 코딩 서열, 2개의 레트로바이러스 LTR 사이에 모든 뉴클레오티드 서열 및/또는 레트로바이러스 LTR과 이들 LTR 사이에 뉴클레오티드 서열 (여기서, LTR은 도입유전자를 도입하는데 이용된 레트로바이러스의 LTR이다)을 지칭한다.
용어 "최적화된"은 "최적화된 코딩 서열"의 문맥에서 이용되고, 여기서 흰자위 단백질 난백알부민, 리소자임, 오보뮤코이드, 그리고 오보트란스페린에서 발견되는 각 특유한 아미노산에 대한 가장 빈번하게 이용되는 코돈은 본 발명의 벡터 내로 삽입되는 최적화된 인간 인터페론-α2b (IFN-α2b) 폴리뉴클레오티드 서열의 설계에 이용된다. 더욱 특정하게는, 최적화된 인간 IFN-α2b에 대한 DNA 서열은 암탉 수란관 최적화된 코돈 사용빈도에 기초되고, 그리고 닭 (Gallus gallus) 난백알부민, 리소자임, 오보뮤코이드, 그리고 오보트란스페린 단백질로부터 수집된 코돈 사용빈도 표와 함께 Wisconsin Package, Version 9.1 (Genetics Computer Group Inc., Madison, Wis.)의 BACKTRANSLATE 프로그램을 이용하여 산출된다. 가령, 이들 4가지 흰자위 단백질 내에서 아미노산 알라닌의 4가지 코돈에 대한 사용빈도 퍼센트는 GCU의 경우에 34%, GCC의 경우에 31%, GCA의 경우에 26%, 그리고 GCG의 경우에 8%이다. 이런 이유로, GCU는 최적화된 코딩 서열 내에서 대다수의 알라닌에 대한 코돈으로서 이용된다. 최적화된 인간 단백질에 대한 유전자를 내포하는 벡터는 조직과 알 내에 유전자도입 가금류 유래된 단백질을 발현하는 유전자도입 조류를 생산하는데 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "개체"는 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 포유동물의 실례에는 인간, 침팬지, 유인원, 소, 말, 양, 염소, 돼지; 토끼, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 기니 피그 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "치료 효과량"은 이런 양이 제공되지 않은 상응하는 개체와 비교하여, 질병, 장애, 또는 부작용의 향상된 치료, 치유, 예방, 또는 개선, 또는 질병 또는 장애의 진행 속도에서 감소를 유발하는 화합물의 임의의 양을 지칭한다. 상기 용어는 또한, 그 범위 내에 정상적인 생리학적 기능을 증강시키는데 효과적인 양을 포함한다.
용어 "치료한다", "치료하는", 또는 "치료"는 질병 또는 질환 증상을 완화하거나, 경감하거나 또는 개선하고, 부가적 증상을 예방하고, 증상의 기초 원인을 개선하거나 예방하고, 질병 또는 질환을 저해하고, 질병 또는 질환의 발달을 중지시키고, 질병 또는 질환을 경감하고, 질병 또는 질환의 퇴행을 유발하고, 질병 또는 질환에 의해 유발된 장애를 경감하고, 또는 질병 또는 질환의 증상을 예방적으로 및/또는 치료적으로 중단시키는 방법을 지칭한다.
LAL 조성물
본 발명은 전반적으로, 예로써 리소솜 축적병의 치료에서 요법에 유용한 효소를 포함하는 조성물에 관계한다. 한 가지 양상에서, 본 발명은 리소솜 축적병 효소, 예를 들면, 일정한 세포 유형에 의한 내재화를 쉽게 받아들이도록 만드는 당화 패턴을 갖는 LAL에 관계한다. 또한, 본 발명에는 단리된 또는 정제된 형태에서 LAL을 포함하는 재조합 인간 단백질이 포함된다. 리소솜 축적병 효소 (가령, LAL)의 단리는 단백질 정제의 분야에 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 N-연결된 당화 패턴을 갖는, LAL이 포함되지만 이에 국한되지 않는 리소솜 축적병 효소에 관계한다.
한 가지 양상에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 인간 LAL을 포함하고, 여기서 인간 LAL 중에서 실질적인 비율은 만노오스-6-인산염 글리칸 모이어티를 내포하고, 이것은 예로써, 간세포 상에서 발견되는 세포 표면에서 만노오스-6-인산염 수용체에 의한 내재화 (internalization)를 위한 리간드로서 기능할 수 있다. 한 구체예에서, 조성물에 내포된 LAL 중에서 30% 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%가 적어도 하나의 만노오스-6-인산염 모이어티를 내포한다. 만노오스-6-인산염 모이어티는 예로써, 서열 번호:2의 Asn15, Asn51, Asn80, Asn140, Asn252 및 Asn300으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 잔기에 위치하는 N-글리칸 구조 상에서 발견될 수 있다. 만노오스-6-인산염 모이어티를 내포하는 글리칸 구조는 예로써, 도 16에 도시된 G-n과 H-n을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 인간 LAL은 복수의 N-연결된 탄수화물 사슬 (가령, 약 5 또는 6개의 탄수화물 사슬)을 내포한다. 5개 또는 6개 부위 각각에서 N-연결된 당화 구조는 도 16에서 도시된 바와 같은 A-n, B-n, C-n, D-n, E-n, F-n, G-n, H-n, I-n, J-n, K-n, L-n, M-n, N-n 및 O-n 중에서 한 가지에서 선택될 수 있다.
또한, LAL 분자의 혼합물 (가령, 서열 번호: 2, 3, 4와 19에 진술된 LAL 분자와 같은 하나 이상의 LAL 분자가 혼합물 내에 존재할 수 있다)이 본 명세서에서 기술되고, 여기서 LAL 분자 중에서 일부 또는 전부는 구조 A-n, 구조 B-n, 구조 C-n, 구조 D-n, 구조 E-n, 구조 F-n, 구조 G-n, 구조 H-n, 구조 I-n, 구조 J-n, 구조 K-n, 구조 L-n, 구조 M-n, 구조 N-n 및 구조 O-n에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 당화 구조를 갖는다 (도 16). 한 구체예에서, 리소솜성 산 리파아제 분자의 혼합물은 정제되거나 단리된다, 예를 들면, 알로부터 단리되거나, 또는 유전자도입 조류에서 생산된 흰자위로부터 정제되거나 단리된다.
본 발명은 또한, 구조 A-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 B-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 C-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 D-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 E-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 F-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 G-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 H-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 I-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 J-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 K-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 L-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 M-n을 포함하는 개별 리소솜성 산 리파아제 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 N-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 구조 O-n을 포함하는 개별 LAL 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 인간 LAL에 부착된 N-연결된 올리고당류는 말단 시알산과 갈락토오스 잔기의 결핍을 갖는다. 다시 말하면, 극히 소량의 N-연결된 올리고당류 구조만 말단 시알화되고, 또한 소수의 갈락토오스 잔기가 존재한다. 게다가, 말단 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc)은 본 명세서에서 기술된 LAL의 N-연결된 올리고당류 구조 상에 광범위하게 존재한다. 따라서 본 발명에 따라서 생산된 LAL은 단핵구 대식세포 및 Kupffer 세포와 같은 세포에 표적화될 수 있다.
본 발명의 한 가지 양상은 본질적으로 시알산이 없는 LAL의 조성물을 제시한다. 다른 양상에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 재조합 인간 LAL을 포함하고, 여기서 인간 LAL 중에서 실질적인 비율은 임의의 N-글리칸 구조 내에 시알산 모이어티를 내포하지 않고, 이것은 세포 내로 효소의 내재화를 간섭할 수 있다. 한 구체예에서, 조성물에 내포된 LAL 중에서 15% 또는 그 이하, 예를 들면, 10% 또는 그 이하, 5% 또는 그 이하, 2% 또는 그 이하, 1% 또는 그 이하가 임의의 N-글리칸 구조 내에 시알산 모이어티를 내포하거나, 또는 시알산 모이어티가 본질적으로 존재하지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 95% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 90% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 80% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 70% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 어느 것도 시알산을 본질적으로 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자와 연관되는 것으로 밝혀진 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 90% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 가령, 20가지 올리고당류 구조 유형이 있으면, 이들 구조 유형 중에서 18가지 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자와 연관되는 것으로 밝혀진 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 80% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자와 연관되는 것으로 밝혀진 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 70% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자와 연관되는 것으로 밝혀진 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 60% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자와 연관되는 것으로 밝혀진 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 50% 또는 그 이상은 시알산을 내포하지 않는다.
본 발명의 한 가지 양상에 따라, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 LAL은 높은 수준의 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 한 가지 양상에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 95% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 90% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 80% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 70% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 60% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 50% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다.
한 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 모든 N-연결된 올리고당류 구조 유형은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 90% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 가령, 20가지 올리고당류 구조 유형이 있으면, 이들 구조 유형 중에서 18가지 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 80% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 70% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 60% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 50% 또는 그 이상은 말단 N-아세틸 글루코사민을 내포한다.
본 발명의 다른 양상에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 인간 LAL을 포함하고, 여기서 인간 LAL 중에서 실질적인 비율은 임의의 N-글리칸 구조 내에 푸코스 모이어티를 내포하지 않는다. 한 구체예에서, 조성물에 내포된 LAL 중에서 50% 또는 그 이하, 예를 들면, 50% 또는 그 이하, 40% 또는 그 이하, 30% 또는 그 이하, 20% 또는 그 이하, 10% 또는 그 이하, 5% 또는 그 이하, 2% 또는 그 이하, 1% 또는 그 이하가 임의의 N-글리칸 구조 내에 푸코스 모이어티를 내포하거나, 또는 푸코스 모이어티가 본질적으로 존재하지 않는다.
한 구체예에서, 푸코스는 본 발명에 따라서 생산된 LAL의 N-연결된 올리고당류 구조 상에 본질적으로 존재하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 95% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 90% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 85% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 80% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 70% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 60% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 개별 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 중에서 약 50% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 어느 것도 푸코스를 본질적으로 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 95% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 가령, 20가지 올리고당류 구조 유형이 있으면, 이들 구조 유형 중에서 19가지 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 90% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 85% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 80% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL 분자 상에 존재하는 N-연결된 올리고당류 구조 유형 중에서 약 70% 또는 그 이상은 푸코스를 내포하지 않는다.
앞서 논의된 바와 같이, 일정한 단당류는 본 발명에 따라서 생산된 LAL 분자 내에 풍부하게 존재한다. 분석된 총 단당류 종류에는 푸코스, N-아세틸 갈락토사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토오스, 글루코오스, 만노오스, 만노오스-6-인산염, N-아세틸 뉴라민산 및 N-글리콜릴 뉴라민산이 포함된다. 푸코스는 총 단당류 조성의 약 0% 내지 약 1%로 존재할 수 있다. N-아세틸 갈락토사민은 총 단당류 조성의 약 0% 내지 약 1%로 존재할 수 있다. N-아세틸 글루코사민은 총 단당류 조성의 약 35% 내지 약 50%로 존재할 수 있다. 갈락토오스는 총 단당류 조성의 약 1 내지 10%로 존재할 수 있다. 글루코오스는 총 단당류 조성의 0%로 존재할 수 있다. 만노오스는 총 단당류 조성의 약 32% 내지 약 50%로 존재할 수 있다. 만노오스-6-인산염은 총 단당류 조성의 약 1% 내지 약 11%로 존재한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따라서 생산된 LAL은 임의의 자일로스를 내포하지 않는다. 이에 더하여, 본 발명에 따라서 생산된 LAL 내에 N-아세틸갈락토사민 (GalNac)이 본질적으로 존재하지 않기 때문에, 본 발명의 한 가지 양상은 O-연결된 당화가 없는 LAL의 조성물을 포함한다.
LAL은 아미노산 서열 내에 N-연결된 당화를 위한 6개의 잠재적 부위, 예를 들면, 서열 번호: 1에서 Asn36, Asn72, Asn101, Asn161, Asn273, 및 Asn321을 갖는다. 이들 중에서 5개, Asn36, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321은 당화되는 반면, Asn72은 당화되지 않거나 실질적으로 당화되지 않는다 ("실질적으로 당화되지 않은"은 LAL 분자의 혼합물 내에서, Asn36, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321 중에서 임의의 한 가지보다 Asn72가 더욱 적게 당화된다는 것을 의미한다) (도 17 참고). 따라서 본 발명의 한 가지 양상은 Asn72에서 당화되지 않은 및/또는 실질적으로 당화되지 않은 LAL의 조성물이다. 당화된 Asn72을 갖는 LAL은 본 발명의 범위 내에 있다. 본 명세서에서 기술된 Asn의 위치는 서열 번호: 1에 진술된 LAL 아미노산 서열에 기초된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, Asn의 넘버링 (즉, 아스파라긴의 위치)은 개별 LAL 분자에 따라 변할 수 있고, 그리고 다른 LAL 분자, 예를 들면, 아미노산 서열이 서열 번호:2, 3, 4와 19에 진술된 것들에서 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 따라서 생산된 LAL 분자는 N-아세틸글루코사민, 만노오스 및 만노오스-6-인산염 (M6P)을 주요 당으로서 갖는 이중-, 삼중- 및 사중 촉각 구조 (antennary structure)의 혼합물을 포함하는 N-글리칸 구조를 내포한다 (도 16과 17). 본 발명의 한 가지 양상에 따라, M6P-변형된 N-글리칸은 적어도 Asn101, Asn161 및 Asn273에 존재한다. 따라서 본 발명의 한 구체예는 Asn101, Asn161 또는 Asn273 중에서 임의의 하나에 존재하는 M6P-변형된 N-글리칸을 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn273에 존재하는 M6P-변형된 N-글리칸을 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn101, Asn161 또는 Asn273 중에서 임의의 하나에 존재하는 단일인산화된 N-글리칸 (M6P)을 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn161 및 Asn273에 존재하는 단일인산화된 N-글리칸을 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn101 및 Asn273에 존재하는 단일인산화된 N-글리칸을 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 한 가지 특정한 구체예에서, 본 발명에 따라서 생산된 LAL은 Asn101에서 비스인산화된 만노오스 (bis-M6P)를 내포할 수 있다.
본 발명에 따라서 생산된 LAL 분자는 감소된 수준의 갈락토오스 (가령, "Gal")를 내포한다. 본 발명의 한 가지 양상은 Asn36, Asn161 또는 Asn321 중에서 임의의 하나에서 말단 갈락토오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn36 및 Asn161에서 말단 갈락토오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn161 및 Asn321에서 말단 갈락토오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn36 및 Asn321에서 말단 갈락토오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn36, Asn161 및 Asn321에서 말단 갈락토오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 말단 갈락토오스가 없는 LAL의 조성물을 포함한다.
다양한 유형의 N-글리칸이 LAL 내에 상이한 N-연결된 당화 부위에서 발견되었다. N-글리칸 구조는 N-아세틸글루코사민, 만노오스 및 만노오스-6-인산염 (M6P)을 주요 당으로서 갖는 이중-, 삼중- 및 사중 촉각 구조 (antennary structure)의 혼합물을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 한 구체예에서, LAL은 첫 번째 N-연결된 당화 부위 (가령, 서열 번호: 1에서 Asn36)에서 GlcNAc4Man3GlcNAc2 또는 Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2에서 선택되는 N-글리칸 구조를 내포한다. 다른 구체예에서, LAL은 당화를 내포하지 않거나, 또는 두 번째 N-연결된 당화 부위 (가령, 서열 번호: 1에서 Asn72)에서 실질적으로 당화되지 않는다. 또 다른 구체예에서, LAL은 세 번째 N-연결된 당화 부위 (가령, 서열 번호: 1에서 Asn101)에서 Phos2Man7GlcNAc2를 내포한다. 또 다른 구체예에서, LAL은 네 번째 N-연결된 당화 부위 (가령, 서열 번호: 1에서 Asn161)에서 Phos1Man6GlcNAc2, GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는 Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2에서 선택되는 N-글리칸 구조를 내포한다. 또 다른 구체예에서, LAL은 다섯 번째 N-연결된 당화 부위 (가령, 번호: 1에서 Asn273 서열)에서 Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, Phos1Man8GlcNAc2, 또는 Phos1Man9GlcNAc2에서 선택되는 N-글리칸 구조를 내포한다. 또 다른 구체예에서, LAL은 여섯 번째 N-연결된 당화 부위 (가령, 서열 번호: 1에서 Asn321)에서 GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2, GlcNAc5Man3GlcNAc2, Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2, GlcNAc6Man3GlcNAc2, 또는 Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2에서 선택되는 N-글리칸 구조를 내포한다.
본 발명의 일정한 양상에 따라, LAL의 조성물은 서열 번호: 1의 Asn36, Asn72, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321 (또는 서열 번호: 2, 3, 4, 그리고 19 내에서 상응하는 아스파라긴 잔기)에서, 하기에 도시된 바와 같이 지정된 Asn 위치에서 하나의 N-글리칸으로 당화된 LAL을 포함한다:
a) Asn36에서, GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는 Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;
b) Asn72에서, 당화 없음;
c) Asn101에서, Phos2Man7GlcNAc2;
d) Asn161에서, Phos1Man6GlcNAc2,
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2;
Man3GlcNAc2;
GlcNAc2Man3GlcNAc2;
GlcNAc3Man3GlcNAc2;
GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;
e) Asn273에서, Man7GlcNAc2,
Man8GlcNAc2,
Man9GlcNAc2,
Phos1Man8GlcNAc2, 또는
Phos1Man9GlcNAc2; 그리고
f) Asn321에서, GlcNAc2Man3GlcNAc2,
GlcNAc3Man3GlcNAc2,
GlcNAc4Man3GlcNAc2,
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2,
GlcNAc5Man3GlcNAc2,
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2,
GlcNAc6Man3GlcNAc2, 또는
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2,
여기서 Man = 만노오스,
GlcNAc = N-아세틸 글루코사민,
Phos = 인산염, 그리고
Gal = 갈락토오스.
한 구체예에서, Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2는 본 발명에 따라서 생산된 LAL 내에 Asn36, Asn161 또는 Asn321 중에서 임의의 하나에서 글리칸 성분으로서 발견될 수 있다. 한 가지 특정한 구체예에서, Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2는 Asn36, Asn161 및 Asn321의 글리칸 성분으로서 발견될 수 있다.
본 발명의 LAL에서, Asn101 및 Asn273은 주요 성분으로서 약 6개 내지 약 10개 만노오스 분자 (본 명세서에서 기술된 바와 같이 MAN6-MAN10)를 갖는 고만노오스-유형을 나타낸다. 따라서 본 발명의 한 가지 양상은 Asn101 또는 Asn273에서 고만노오스 구조를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 LAL의 조성물은 Asn101 또는 Asn273에서 적어도 6개의 만노오스를 갖는 N-글리칸 구조를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, LAL의 조성물은 Asn101 또는 Asn273에서 7, 8 또는 9개의 만노오스를 갖는 N-글리칸을 내포한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn101 및 Asn273에서 7, 8 또는 9개의 만노오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Asn101 및/또는 Asn273에서 7, 8 또는 9개의 만노오스를 갖는 LAL의 조성물을 포함하고, 그리고 만노오스 중에서 적어도 하나는 인산화된다.
앞서 기술된 Asn과 연관된 당화 부위와 숫자는 서열 번호: 1에 진술된 LAL의 아미노산 서열에 기초되고, 그리고 서열 번호: 1의 문맥에서 앞서 기술된 당화 프로필은 비록 상응하는 Asn의 넘버링이 LAL 분자에 따라 변할 수 있긴 하지만, 서열 번호: 2, 3, 4와 19에 진술된 LAL 분자에도 적용되는 것으로 이해된다. 가령, 서열 번호: 1에서 Asn36은 서열 번호:2에서 Asn15, 서열 번호:3에서 Asn13, 서열 번호:4에서 Asn10 및 서열 번호: 19에서 Asn9에 상응한다. 서열 번호: 1에서 Asn72는 서열 번호:2에서 Asn51, 서열 번호:3에서 Asn49, 서열 번호:4에서 Asn46 및 서열 번호:19에서 Asn45에 상응한다. 서열 번호:1에서 Asn101은 서열 번호:2에서 Asn80, 서열 번호:3에서 Asn78, 서열 번호:4에서 Asn75 및 서열 번호: 19에서 Asn74에 상응한다. 서열 번호: 1에서 Asn161은 서열 번호:2에서 Asn140, 서열 번호:3에서 Asn138, 서열 번호:4에서 Asn135 및 서열 번호: 19에서 Asn134에 상응한다. 서열 번호: 1에서 Asn273은 서열 번호:2에서 Asn252, 서열 번호:3에서 Asn250, 서열 번호:4에서 Asn247 및 서열 번호: 19에서 Asn246에 상응한다. 서열 번호: 1에서 Asn321은 서열 번호:2에서 Asn300, 서열 번호:3에서 Asn298, 서열 번호:4에서 Asn295 및 서열 번호: 19에서 Asn294에 상응한다.
가령, 한 구체예에서, LAL은 서열 번호:2의 Asn15, Asn51, Asn80, Asn140, Asn252 및 Asn300으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 부위에서 N-연결된 당화된다. 다른 구체예에서, LAL은 서열 번호:2의 Asn15, Asn80, Asn140, Asn252 및 Asn300에서 N-연결된 당화된다. 또 다른 구체예에서, 서열 번호:2의 LAL의 N-글리칸 구조는 자일로스가 없고, N-글리칸 구조 중에서 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하가 시알산을 내포하고; N-글리칸 구조 중에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이하가 푸코스를 내포하고; 그리고 N-글리칸 구조 중에서 적어도 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%와 95%가 인산화된 만노오스 (M6P)를 내포한다.
한 구체예에서, LAL은 서열 번호:3의 Asn13, Asn49, Asn78, Asn138, Asn250 및 Asn298로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 부위에서 N-연결된 당화된다. 다른 구체예에서, LAL은 서열 번호:3의 Asn13, Asn78, Asn138, Asn250 및 Asn298에서 N-연결된 당화된다. 또 다른 구체예에서, 서열 번호:3의 LAL의 N-글리칸 구조는 자일로스가 없고, N-글리칸 구조 중에서 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하가 시알산을 내포하고; N-글리칸 구조 중에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이하가 푸코스를 내포하고; 그리고 N-글리칸 구조 중에서 적어도 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%와 95%가 인산화된 만노오스 (M6P)를 내포한다.
한 구체예에서, LAL은 서열 번호:4의 Asn10, Asn46, Asn75, Asn135, Asn247 및 Asn295로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 부위에서 N-연결된 당화된다. 다른 구체예에서, LAL은 서열 번호:4의 Asn10, Asn75, Asn135, Asn247 및 Asn295에서 N-연결된 당화된다. 또 다른 구체예에서, 서열 번호:4의 LAL의 N-글리칸 구조는 자일로스가 없고, N-글리칸 구조 중에서 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하가 시알산을 내포하고; N-글리칸 구조 중에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이하가 푸코스를 내포하고; 그리고 N-글리칸 구조 중에서 적어도 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%와 95%가 인산화된 만노오스 (M6P)를 내포한다.
한 구체예에서, LAL은 서열 번호:19의 Asn9, Asn45, Asn74, Asn134, Asn246 및 Asn294로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 부위에서 N-연결된 당화된다. 다른 구체예에서, LAL은 서열 번호:19의 Asn9, Asn74, Asn134, Asn246 및 Asn294에서 N-연결된 당화된다. 또 다른 구체예에서, 서열 번호:19의 LAL의 N-글리칸 구조는 자일로스가 없고, N-글리칸 구조 중에서 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하가 시알산을 내포하고; N-글리칸 구조 중에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이하가 푸코스를 내포하고; 그리고 N-글리칸 구조 중에서 적어도 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%와 95%가 인산화된 만노오스 (M6P)를 내포한다.
본 발명에 따른 조성물은 유전자도입 조류, 유전자도입 어류, 유전자도입 포유동물, 예를 들면, 유전자도입 염소 또는 유전자도입 식물, 예를 들면, 담배와 부초 (duck weed) (Lemna minor) 및 일정한 유형의 세포 배양액의 이용을 비롯하여, 다양한 방법으로 생산될 수 있다.
본 발명에서는 또한, PEG화된 LAL을 포함하는 조성물을 예기한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 LAL 효소는 예로써, 2007년 4월 26일자 공개된 U.S. Patent publication No. 20070092486에서 개시된 바와 같이 PEG화되고, 이의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
한 구체예에서, 유래된 당화 패턴은 예로써, 조류 수란관 세포, 예를 들면, 관상샘 세포로부터 발현 특화된 발현 시스템을 통해 획득된다. 가령, 본 명세서에서 개시된 당화 패턴은 본 발명에 따라서 조류, 예를 들면, 닭의 수란관 세포에서 생산된 리소솜 축적병 효소 상에 존재하는 것으로 증명되었다.
본 발명에 따라서 생산된 단백질은 임의의 유용한 절차, 예를 들면, 단백질 정제의 분야에서 당업자에게 명백한 것들에 의해 흰자위로부터 정제될 수 있다. 가령, 본 발명에 따라서 유전자도입 조류에서 생산된 인간 LAL (hLAL)은 단백질 정제의 분야에서 당업자에게 명백한 방법에 의해 흰자위로부터 정제될 수 있다. 흰자위 내에 존재하는 LAL에 대한 정제 프로토콜의 실례는 실시예에서 기술된다.
본 발명은 알과 흰자위, 그리고 알을 낳고 본 명세서에서 개시된 당화 구조 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 본 발명의 리소솜성 산 리파아제 분자를 내포하는 흰자위를 생산하는 조류 (가령, 닭, 칠면조 및 메추라기)를 포함한다.
조류에서 LAL의 발현
본 명세서에서는 원하는 단백질, 예를 들면, 리소솜성 산 리파아제 (LAL) 및 기타 단백질, 예를 들면, 본 명세서에서 특정하게 개시된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 리소솜 효소와 같은 만노오스-6-인산염의 부가로부터 이익을 얻는 (가령, 증가된 효능을 획득하는) 것들을 발현하기 위해, 조류의 유전체 내로 외인성 핵산 서열의 안정된 도입을 위한 벡터와 방법이 개시된다. 특히, 수란관에서 외인성 서열을 발현하고 외인성 단백질, 예를 들면, 제약학적 단백질을 알 내로 집어넣는 유전자도입 조류가 생산된다. 이런 외인성 단백질을 내포하는 조류 알 역시 본 명세서에서 기술된다. 또한, 본 명세서에서는 유전자도입 조류의 수란관에서 유효하게 발현되고 조류 알 내로 집어넣어지는 신규한 형태의 LAL이 개시된다.
본 발명의 한 가지 양상은 LAL, 다시 말하면, 본 발명에 따라서 생산된 LAL 분자를 내포하는 조성물에 관계한다. 특히 유용한 구체예에서, LAL은 정제되거나 단리된다. 가령, LAL은 유전자도입 조류에 의해 산란된 단단한 껍질 알의 내용물로부터 이전된다. 특히 유용한 구체예에서, LAL은 인간 LAL이다. 한 구체예에서, 본 발명의 LAL은 조류의 수란관 세포에서 생산되는 LAL에 기인하는 당화 패턴을 갖는다. 가령, 조성물은 본 발명에 따라서 조류, 예를 들면, 닭에서 생산되고 흰자위로부터 단리된 LAL 분자의 혼합물을 내포할 수 있다. 한 가지 유용한 구체예에서, LAL 내포 조성물은 제약학적 제제이다.
한 가지 양상에서, 본 발명은 단리된 LAL 분자, 예를 들면, 인간 LAL 분자를 내포하는 조성물에 관계하고, 여기서 LAL은 LAL을 인코딩하는 도입유전자를 내포하는 조류에서 생산된다. 한 구체예에서, LAL은 유전자도입 조류 (가령, 유전자도입 닭)의 수란관 세포 (가령, 관상샘 세포)에서 생산되고, 그리고 LAL은 유전자도입 조류의 흰자위로부터 단리된다. 한 구체예에서, LAL은 조류, 예를 들면, 닭의 수란관 세포 (가령, 관상샘 세포)에서 당화된다.
다른 양상에서, 조류의 특정한 조직 내에서 외인성 단백질, 예를 들면, LAL과 같은 리소솜 축적병 효소를 생산하기 위한 방법이 제시된다. 이런 외인성 단백질은 조류의 수란관, 혈액 및/또는 기타 세포와 조직에서 발현될 수 있다. 한 구체예에서, 도입유전자는 유전자도입 조류를 생산하기 위해 예로써, 거의 X 단계에서 배아 배반엽 세포 내로 도입되고, 따라서 목적되는 단백질이 수란관의 매그넘의 관상샘 세포에서 발현되고, 내강 (lumen) 내로 분비되고, 그리고 단단한 껍질 알의 흰자위 내로 집어넣어진다. 이렇게 생산된 유전자도입 조류는 생식 계열에서 도입유전자를 보유하고 조류의 자손에 대한 외인성 도입유전자의 유전 (transmission)을 멘델 방식 (Mendelian fashion)으로 안정적으로 제공할 수 있다.
본 발명은 조류 수란관에서 외인성 단백질, 예를 들면, LAL을 생산하는 방법을 포함한다. 이들 방법은 프로모터가 조류 수란관에서 핵산의 발현을 실행할 수 있도록, 코딩 서열 및 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 내포하는 벡터를 제공하는 첫 번째 단계를 포함할 수 있다. 유전자도입 세포 및/또는 조직이 생산될 수 있고, 여기서 벡터는 벡터 서열이 조류 유전체 내로 삽입되도록, 조류 배아 배반엽 세포 내로 도입되고 배양액에서 또는 배아에서 새로이 단리된다. 수란관에서 외인성 단백질, 예를 들면, LAL을 발현하는 성숙 유전자도입 조류는 유전자도입 세포 및/또는 조직으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 한 가지 양상에서, 유전자도입 조류의 생산은 레트로바이러스 벡터의 5'와 3' LTR 사이에 도입유전자를 보유하는 복제-결함성 또는 복제-적격성 레트로바이러스 입자로 배아 배반엽 세포의 형질도입에 의해 달성된다. 가령, 프로모터 영역의 분절의 하류에 삽입되는 외인성 유전자를 내포하는 변형된 pNLB 플라스미드를 포함하는 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 레트로바이러스 벡터 또는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 바이러스 입자 내로 패키징 (packaging)된 변형된 레트로바이러스 벡터의 RNA 사본은 유전자도입 조류로 발달하는 배아 배반엽을 감염시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서는 코딩 서열이 조류 수란관에서 발현되도록, 코딩 서열 및 프로모터를 작동적 및 위치적 상관관계로 포함하는 벡터를 제시한다. 이런 벡터에는 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터, 그리고 렌티바이러스 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 벡터는 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터의 LTR을 포함하는 핵산 서열일 수 있다. 프로모터는 조류 수란관에서 코딩 서열의 발현을 수행하는데 충분하다. 코딩 서열은 단단한 껍질 알의 흰자위 내로 집어넣어지는 외인성 단백질을 코딩한다. 따라서 코딩 서열은 외인성 단백질, 예를 들면, 유전자도입 가금류 유래된 단백질, 예를 들면, 유전자도입 가금류 유래된 리소솜성 산 리파아제 (TPD LAL)를 코딩한다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 이용된 벡터는 조류와 그들의 알에서 외인성 단백질의 발현에 특히 적합한 프로모터를 내포한다. 따라서 외인성 코딩 서열의 발현은 유전자도입 조류의 수란관과 혈액, 그리고 조류 알의 흰자위에서 일어날 수 있다. 프로모터에는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스-육종 바이러스 (RSV) 프로모터, β-액틴 프로모터 (가령, 닭 β-액틴 프로모터), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 프로모터, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 난백알부민 프로모터, 리소자임 프로모터, 콘알부민 프로모터, 오보뮤코이드 프로모터, 난자뮤신 프로모터, 그리고 오보트란스페린 프로모터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 임의적으로, 프로모터는 적어도 하나의 프로모터 영역의 분절, 예를 들면, 난백알부민, 리소자임, 콘알부민, 오보뮤코이드, 난자뮤신, 그리고 오보트란스페린 프로모터 영역의 분절일 수 있다. 한 구체예에서, 프로모터는 하나 또는 그 이상의 프로모터의 조합 또는 융합, 또는 하나 또는 그 이상의 프로모터, 예를 들면, 난백알부민, 리소자임, 콘알부민, 오보뮤코이드, 난자뮤신, 그리고 오보트란스페린 프로모터의 일부분의 융합이다.
한 구체예에서, 벡터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 신호 펩티드 코딩 서열을 포함하고, 따라서 세포에서 번역 시에, 신호 펩티드는 단단한 껍질 알의 흰자위 내로 벡터에 의해 발현된 외인성 단백질, 예를 들면, 인간 LAL의 분비를 감독한다.
본 발명의 한 가지 양상에서는 본 명세서에서 개시된 바와 같이 생산된 외인성 단백질에 대한 코딩 서열을 제시하고, 여기서 코딩 서열은 조류, 예를 들면, 닭에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 코돈 최적화는 조류 세포 (가령, 닭 세포)에서 발현된 적어도 하나의, 바람직하게는 하나 이상의 단백질의 코돈 사용빈도로부터 결정될 수 있다. 가령, 코돈 사용빈도는 닭의 단백질 난백알부민, 리소자임, 난자뮤신과 오보트란스페린을 인코딩하는 핵산 서열로부터 결정될 수 있다. 가령, 외인성 단백질에 대한 DNA 코딩 서열은 닭 (Gallus gallus) 난백알부민, 리소자임, 오보뮤코이드, 그리고 오보트란스페린 단백질로부터 수집된 코돈 사용빈도 표와 함께 Wisconsin Package, Version 9.1 (Genetics Computer Group Inc., Madison, Wis.)의 BACKTRANSLATE® 프로그램을 이용하여 코돈 최적화될 수 있다.
본 발명의 한 가지 중요한 양상은 인간 LAL이 포함되지만 이에 국한되지 않는 외인성 펩티드 또는 단백질을 내포하는 조류의 단단한 껍질 알 (가령, 닭의 단단한 껍질 알)에 관계한다. 외인성 펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 인간 LAL은 유전자도입 조류의 도입유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 종종, 외인성 펩티드 또는 단백질 (가령, LAL)은 당화된다. 단백질은 임의의 유용한 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질은 단단한 껍질 알당 약 0.01 ㎍ 내지 단단한 껍질 알당 약 1 그램 범위의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 단백질은 단단한 껍질 알당 약 1 ㎍ 내지 단단한 껍질 알당 약 1 그램 범위의 양으로 존재한다. 가령, 단백질은 단단한 껍질 알당 약 10 ㎍ 내지 단단한 껍질 알당 약 1 그램 (가령, 단단한 껍질 알당 약 10 ㎍ 내지 단단한 껍질 알당 약 400 ㎎) 범위의 양으로 존재할 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 외인성 단백질은 알의 흰자위 내에 존재한다. 한 구체예에서, 단백질은 흰자위 ㎖당 약 1 ng 내지 흰자위 ㎖당 약 0.2 그램 범위의 양으로 존재한다. 가령, 단백질은 흰자위 ㎖당 약 0.1 ㎍ 내지 흰자위 ㎖당 약 0.2 그램 범위의 양으로 존재할 수 있다 (가령, 단백질은 흰자위 ㎖당 약 1 ㎍ 내지 흰자위 ㎖당 약 100 ㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있다). 한 구체예에서, 단백질은 흰자위 ㎖당 약 1 ㎍ 내지 흰자위 ㎖당 약 50 ㎎ 범위의 양으로 존재한다. 가령, 단백질은 흰자위 ㎖당 약 1 ㎍ 내지 흰자위 ㎖당 약 10 ㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있다 (가령, 단백질은 흰자위 ㎖당 약 1 ㎍ 내지 흰자위 ㎖당 약 1 ㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있다). 한 구체예에서, 단백질은 흰자위 ㎖당 0.1 ㎍ 이상의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 단백질은 흰자위 ㎖당 0.5 ㎍ 이상의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 단백질은 흰자위 ㎖당 1 ㎍ 이상의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 단백질은 흰자위 ㎖당 1.5 ㎍ 이상의 양으로 존재한다.
벡터가 도입된 배반엽 세포로부터 발생되는 명세서에서 개시된 외인성 단백질 (가령, LAL)을 생산하는 본 발명의 조류는 GO 세대이고 "창시자"로 지칭될 수 있다. 창시자 조류는 전형적으로, 각 삽입된 도입유전자에 대해 키메라이다. 다시 말하면, GO 유전자도입 조류의 세포 중에서 일부만 도입유전자(들)를 내포한다. GO 세대는 전형적으로, 도입유전자(들)에 대해 반접합성 (hemizygous)이다. GO 세대는 비-유전자도입 동물과 교배되어 G1 유전자도입 자손이 산출될 수 있고, 이들 자손은 도입유전자에 대해 반접합성이고 조류의 본질적으로 모든 세포에서 도입유전자(들)를 내포한다. G1 반접합성 자손은 비-유전자도입 동물에 교배되어 G2 반접합성 자손이 산출되거나, 또는 서로 교배되어 도입유전자에 대해 동종접합성 (homozygous)인 G2 자손이 산출될 수 있다. G1 자손으로부터 유래되는 도입유전자에 양성인 조류의 실질적으로 모든 세포는 도입유전자(들)를 내포한다. 한 구체예에서, 동일한 라인으로부터 반접합성 G2 자손은 교배되어 도입유전자에 대해 동종접합성인 G3 자손을 생산할 수 있다. 한 구체예에서, 반접합성 GO 또는 G1 동물은 예로써, 서로 교배되어 동물의 각 세포에서 도입유전자(들)의 2개 사본을 내포하는 동종접합성 G1 자손이 산출된다. 이들은 일정한 유용한 번식 방법의 단순한 실례이고, 그리고 본 발명에서는 임의의 유용한 번식 방법, 예를 들면, 당업자에게 공지된 것들의 이용을 예기한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 단리되는 LAL을 제시한다. 다시 말하면, 조성물에 내포된 LAL은 단리된 LAL일 수 있다. 가령, LAL은 흰자위로부터 단리될 수 있다. 단리된 LAL은 LAL 분자 사이에 다양한 당화 구조를 갖는 LAL 분자일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 도입유전자는 조류 배아 배반엽 세포 내로 도입되어, 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 생식계열 조직의 유전자 물질 내에 도입유전자를 보유하는 유전자도입 닭, 유전자도입 칠면조, 유전자도입 메추라기 및 기타 조류 종이 생산될 수 있다. 배반엽 세포는 전형적으로, VII-XII 단계 세포, 또는 이의 등가물이고, 그리고 한 구체예에서 X 단계에 가깝다.
본 발명의 방법을 실행하는데 유용한 일부 벡터가 본 명세서에서 기술된다. 한 구체예에서, 벡터의 코딩 서열과 프로모터는 둘 모두 배반엽 세포 내로 도입에 앞서, 5'와 3' LTR 사이에 배치된다. 한 구체예에서, 벡터는 레트로바이러스이고, 그리고 코딩 서열과 프로모터는 둘 모두 레트로바이러스 벡터의 5'와 3' LTR 사이에 배치된다. 한 가지 유용한 구체예에서, LTR 또는 레트로바이러스 벡터는 조류 백혈병 바이러스 (ALV), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 또는 렌티바이러스로부터 유래된다.
한 구체예에서, 배반엽 세포를 형질감염시키고 조류 유전체 내로 안정된 통합을 산출하는데 이용되는 벡터는 조류 수란관의 매그넘의 관상샘 세포에서 코딩 서열을 발현하기 위한 작동적 및 위치적 상관관계로 코딩 서열과 프로모터를 내포하고, 여기서 외인성 단백질, 예를 들면, 리소솜 효소 (가령, LAL)가 단단한 껍질 알의 흰자위 내에 집어넣어진다.
프로모터는 임의적으로, 관상샘 세포에서 코딩 서열의 발현을 감독할 만큼 충분히 큰 난백알부민 프로모터 영역의 분절일 수 있다.
수란관의 매그넘의 관상샘 세포에서 발현에 요구되는 서열을 유지하면서, 벡터 내로 쉽게 통합될 수 있을 만큼 충분히 작도록 난백알부민 프로모터를 절두하고 및/또는 난백알부민 프로모터의 결정적 조절 요소를 응축하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 구체예에서, 난백알부민 프로모터 영역의 분절이 이용될 수 있다. 이러한 분절은 난백알부민 유전자의 5'-측면 영역을 포함한다.
프로모터는 또한, 매그넘에 충분히 특이적이지만, 완전하게 특이적이지는 않은 프로모터, 예를 들면, 리소자임 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터일 수 있다. 대안으로, 프로모터는 구조성 프로모터 (가령, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스-육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 프로모터 등)일 수 있다. 한 구체예에서, 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, MDOT 프로모터, 라우스-육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 프로모터, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 난백알부민 프로모터, 리소자임 프로모터, 콘알부민 프로모터, 오보뮤코이드 프로모터, 난자뮤신 프로모터 및/또는 오보트란스페린 프로모터이다. 임의적으로, 프로모터는 프로모터 영역의 적어도 하나의 분절, 예를 들면, 난백알부민, 리소자임, 콘알부민, 오보뮤코이드, 난자뮤신, 그리고 오보트란스페린 프로모터 영역의 분절일 수 있다.
배반엽 세포를 형질감염시키는 한 가지 방법에서, 벡터가 조류 유전체 내로 통합되도록 벡터를 배아 배반엽 세포 내로 전달하기 위해 패키징된 레트로바이러스-기초된 벡터가 이용된다.
조류 유전체 내로 도입유전자를 무작위로 도입하는데 유용한 레트로바이러스는 복제-결함성 조류 백혈병 바이러스 (ALV), 복제-결함성 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 또는 렌티바이러스이다. 한 구체예에서, pNLB 벡터는 레트로바이러스 유전체의 5'와 3' 긴 말단 반복 (LTR) 사이에 난백알부민 프로모터의 영역 및 하나 또는 그 이상의 외인성 유전자를 삽입함으로써 변형된다. 본 발명에서는 관상샘 세포에서 활성을 갖는 프로모터의 하류에 배치된 임의의 코딩 서열이 관상샘 세포에서 발현될 수 있다는 것을 예기한다. 가령, 난백알부민 프로모터는 수란관 매그넘의 관상샘 세포에서 발현될 수 있는데, 그 이유는 난백알부민 프로모터가 난백알부민 단백질의 발현을 주동하고 수란관 관상샘 세포에서 활성을 갖기 때문이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 벡터는 또한, 수란관의 관상샘 세포로부터 벡터의 코딩 서열에 의해 발현된 단백질의 분비를 감독하는 신호 펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 임의적으로 포함한다. 이러한 양상은 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 조류 알 내에 집어넣어질 수 있는 외인성 단백질의 스펙트럼을 효과적으로 확대한다. 외인성 단백질이 달리 분비되지 않는 경우에, 코딩 서열을 내포하는 벡터는 리소자임 유전자로부터 신호 펩티드를 인코딩하는 약 60개 bp를 포함하는 DNA 서열을 포함하도록 변형된다. 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 상기 DNA에 의해 인코딩된 단백질의 N-말단에 위치하도록 벡터 내에 삽입된다.
본 발명의 다른 양상은 디시스트론성 (dicistronic) 또는 폴리시스트론성 (polycistronic) mRNA로부터 2개 또는 그 이상의 단백질의 번역을 가능하게 하기 위해 본 발명의 임의의 벡터에서 내부 리보솜 결합 부위 (internal ribosome entry site, IRES) 요소의 이용을 수반한다. IRES 단위는 하나 또는 그 이상의 부가적 코딩 서열의 5' 단부에 융합되고, 이들 코딩 서열은 이후, 본래 코딩 서열의 단부에서 벡터 내로 삽입되고, 따라서 이들 코딩 서열은 IRES에 의해 서로 분리된다.
IRES를 이용하는 한 구체예에서, 산물의 번역후 변형이 용이한데, 그 이유는 한 코딩 서열이 다른 코딩 서열 산물을 변형할 수 있는 효소를 인코딩할 수 있기 때문이다. 가령, 첫 번째 코딩 서열은 콜라겐을 인코딩할 수 있고, 콜라겐은 두 번째 코딩 서열에 의해 인코딩된 효소에 의해 수산화되어 활성을 갖게 될 것이고, 여기서 IRES는 당분야에서 알려진 바와 같이 이용된다.
다른 양상에서, 본 발명의 임의의 방법에 이용된 벡터의 코딩 서열은 생산된 RNA에 안정성을 공여하기 위해 3' 비번역 영역 (3' UTR)이 제공된다. 3' UTR이 레트로바이러스 벡터에 부가될 때, 프로모터, 유전자 X 및 3' UTR의 방향은 3' UTR의 부가가 전장 유전체 RNA의 전사를 간섭하지 않도록 구조체 내에서 반전되어야 한다. 한 구체예에서, 3' UTR은 난백알부민 또는 리소자임 유전자의 3' UTR, 또는 매그넘 세포에서 기능적인 임의의 3' UTR, 다시 말하면, SV40 후기 영역일 수 있다.
한 구체예에서, 조류에서 도입유전자의 코딩 서열을 발현하기 위해 구조성 프로모터가 이용된다. 이러한 경우에, 발현은 매그넘에 한정되지 않는다; 발현은 또한, 조류 내에 다른 조직 (가령, 혈액)에서 발생한다. 구조성 프로모터와 코딩 서열을 포함하는 이런 도입유전자의 이용은 수란관에서 단백질의 발현 및 알 내로 단백질의 차후 분비를 수행하거나 주동하는데 특히 적합하다.
형질도입성 입자 (즉, 형질도입 입자)는 벡터에 대해 생산되고, 그리고 배아를 주입하는데 이용될 수 있는 적절한 농도를 결정하기 위해 적정된다. 조류 알은 Speksnijder 절차에 따라 창문이 만들어지고 (U.S. Pat. No. 5,897,998, 이의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다), 그리고 알은 형질도입 입자가 주입된다. 알은 주입후 약 21일 시점에 부화하고, 그리고 수컷 조류는 번식을 위해 선별된다. 정액 내에 도입유전자를 내포하는 GO 수탉 (rooster)을 스크리닝하기 위해, 수탉 정액 샘플로부터 DNA가 추출된다. 정액 샘플 내에 최고 수준의 도입유전자를 갖는 GO 수탉은 인공 수정 (artificial insemination)에 의해 비-유전자도입 암탉과 교배된다. 혈액 DNA 샘플은 도입유전자의 존재에 대해 스크리닝된다. 유전자도입 수탉의 혈청은 외인성 단백질의 존재에 대해 조사된다. 외인성 단백질이 확인되면, 유전자도입 수탉의 정액은 비-유전자도입 암탉의 인공 수정에 이용된다. 자손 중에서 일정한 퍼센트는 이후, 도입유전자 (가령, 50% 이상)를 내포한다. 외인성 단백질이 본 발명에 따라서 생산된 알 내에 존재할 때, 상기 단백질은 단리될 수 있다. 단백질은 또한, 생물학적 활성에 대해 조사될 수 있다.
조류 수란관에서 외인성 단백질의 생산 및 외인성 단백질을 내포하는 알의 생산을 제공하는 본 발명의 방법은 적절한 벡터를 제공하고, 그리고 벡터가 조류 유전체 내로 통합되도록 벡터를 배아 배반엽 세포 내로 도입하는 단계의 차후에 부가적 단계를 수반한다. 차후 단계는 이전 단계에서 생산된 유전자도입 배반엽 세포로부터 성숙 유전자도입 조류를 끌어내는 것을 수반한다. 성숙 유전자도입 조류는 배아 내에서 직접적으로 벡터로 형질감염 또는 형질도입된 배반엽 배아의 세포로부터 획득될 수 있다. 결과의 배아는 발달할 수 있고, 그리고 닭은 성숙할 수 있다.
배반엽 세포로부터 생산된 유전자도입 조류는 창시자로서 알려져 있다. 일부 창시자는 그들의 수란관의 매그넘 내에 관상샘 세포에서 도입유전자를 보유할 것이다. 이들 조류는 그들의 수란관 내에 도입유전자에 의해 인코딩된 외인성 단백질을 발현할 것이다. 외인성 단백질은 또한, 수란관 이외에 다른 조직 (가령, 혈액)에서 발현될 수도 있다. 만약 외인성 단백질이 적절한 신호 서열(들)를 내포한다면, 이것은 수란관의 내강 및 알의 흰자위 내로 분비될 것이다.
일부 창시자는 생식계열 창시자이다. 생식계열 창시자는 생식계열 조직의 유전자 물질 내에 도입유전자를 보유하고, 또한 외인성 단백질을 발현하는 수란관 매그넘 관상샘 세포에서 도입유전자를 보유할 수도 있는 창시자이다. 이런 이유로, 본 발명에 따라서, 유전자도입 조류는 외인성 단백질을 발현하는 관상샘 세포를 가질 수 있고, 그리고 유전자도입 조류의 자손 역시 외인성 단백질을 발현하는 수란관 매그넘 관상샘 세포를 가질 수 있다. 대안으로, 자손은 조류의 특정한 조직(들) 내에 외인성 유전자의 발현에 의해 결정된 표현형을 발현한다. 한 구체예에서, 유전자도입 조류는 닭 또는 칠면조이다.
제약학적 조성물 & 치료 방법
요법에서 이용을 위해, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 치료 단백질이 원래 형태로 투여될 수 있긴 하지만, 제약학적 제제의 일부로서 치료 단백질을 투여하는 것이 바람직하다. 이런 이유로, 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 가금류 유래된 당화된 치료 단백질, 예를 들면, LAL 또는 이의 제약학적으로 허용되는 유도체 및 임의적으로, 다른 치료제 및/또는 예방적 성분을 포함하는 제약학적 제제, 그리고 이런 제약학적 제제를 투여하는 방법이 더욱 제시된다. 담체(들)는 제제의 다른 성분과 양립하고 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 본 발명의 제약학적 조성물을 이용하여 환자를 치료하는 방법 (가령, 투여된 제약학적 단백질의 양, 투여 빈도 및 치료 기간의 지속 기간)은 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
복합 분자를 비롯하여 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 전통적인 방법에 의해 조제된다 (참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, 14th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 이의 전체 교시는 본 발명에 참고문헌으로 편입된다). 담체는 희석제를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 제약학적 담체는 액체이고, 그리고 재조합 인간 LAL은 용액 형태일 수 있다. 제약학적 담체는 왁스, 지방, 또는 알코올일 수 있다. 한 구체예에서, 왁스- 또는 지방-기초된 담체는 에스테르를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 담체는 분말, 동결 건조된 분말, 또는 정제 형태의 고체일 수도 있다. 한 구체예에서, 담체는 리포좀 또는 미소캡슐을 포함할 수 있다.
제약학적 제제에는 근육내, 피하와 정맥내 투여를 비롯한 주사에 의한 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제약학적 제제에는 경구, 직장, 코, 국소 (경구점막과 설하), 질 또는 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제약학적 제제에는 또한, 흡입 (inhalation) 또는 통기 (insufflation)에 의한 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 적절한 경우에, 별개의 투약 단위 (discrete dosage unit)로 편의하게 제공될 수 있고, 그리고 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약학적 제제를 생산하는 방법은 전형적으로, 치료 단백질을 액상 담체 또는 미세하게 분열된 고형 담체 또는 둘 모두와 결합시키고, 이후 필요하면, 산물을 원하는 제제로 형상화하는 단계를 포함한다.
경구 투여에 적합한 제약학적 제제는 별개의 단위 (discrete unit), 예를 들면, 미리 결정된 양의 활성 성분을 각각 내포하는 캡슐, 교갑 또는 정제; 분말 또는 과립; 용액; 현탁액; 또는 에멀젼으로서 편의하게 제공될 수 있다. 활성 성분은 또한, 환약, 연질약 또는 풀 모양 연고로서 제공될 수도 있다. 경구 투여를 위한 정제와 캡슐은 전통적인 부형제, 예를 들면, 결합제, 충전제, 윤활제, 붕해제, 또는 습윤제를 내포할 수 있다. 정제는 당분야에 널리 공지된 방법에 따라 코팅될 수 있다. 경구 액상 제조물은 예로써, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르의 형태이거나, 또는 이용에 앞서 물 또는 다른 적절한 운반제로 구성을 위한 건성 산물로서 제공될 수 있다. 이런 액상 제조물은 전통적인 첨가제, 예를 들면, 현탁제, 유화제, 비-수성 운반제 (여기에는 식용 오일이 포함될 수 있다) 또는 보존제를 내포할 수 있다.
LAL은 또한, 비경구 투여 (가령, 주사, 예를 들면, 일시 주사 또는 연속 주사에 의한) 용으로 조제될 수 있고, 그리고 앰풀, 미리-채워진 주사기, 적은 부피 주사 또는 보존제가 첨가된 다중-복용량 용기에서 단위 제형으로 제공될 수 있다. 치료 단백질은 예로써, 피하 주사, 근육내 주사, 그리고 정맥내 주입 또는 주사에 의해 주사될 수 있다.
LAL은 현탁액, 용액, 또는 유성 또는 수성 운반제에서 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 그리고 조제 약품 (formulatory agent), 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 또한, 치료 단백질은 이용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 무균 무-발열원 물로 구성을 위해, 무균 고체의 멸균 분리 (aseptic isolation) 또는 용액으로부터 동결 건조 (lyophilization)에 의해 획득되는 분말 형태일 수 있는 것으로 예기된다.
정맥내 주입 또는 주사를 위해, 본 발명에 따라서 생산된 LAL은 수성 현탁액 또는 용액으로서 조제될 수 있다. 정맥내 주입 또는 주사를 위한 제제에 적합한 부형제는 하기 중에서 한 가지를 포함할 수 있다: 구연산나트륨 이수화물, 구연산 및 인간 혈청 알부민. 제약학적 제제는 또한, 리소솜 축적병에 대한 다른 산물에 이용되는 당분야에 널리 공지된 다른 적절한 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서 생산된 LAL의 pH는 약 5.6 내지 약 6.2에 유지된다. 바람직하게는, LAL 제제의 pH는 5.9 ± 0.2에 유지된다.
표피에 국소 투여를 위해, 본 발명에 따라 생산된 본 발명의 치료 단백질은 연고, 크림 또는 로션, 또는 경피 패치 (transdermal patch)로서 조제될 수 있다. 연고와 크림은 예로써, 적절한 농후제 및/또는 겔화제가 첨가된 수성 또는 유성 기부로 조제될 수 있다. 로션은 수성 또는 유성 염기로 조제될 수 있고, 또한 하나 또는 그 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 농후제 또는 착색제를 내포할 수 있다.
입에서 국소 투여에 적합한 제제에는 풍미가 있는 기부, 통상적으로 수크로오스와 아카시아 또는 트래거캔스에서 활성 성분을 포함하는 마름모꼴정제; 비활성 기부, 예를 들면, 젤라틴과 글리세린 또는 수크로오스와 아카시아에서 활성 성분을 포함하는 향정; 그리고 적절한 액상 담체에서 활성 성분을 포함하는 구강 청결제가 포함된다.
직장 투여에 적합한 제약학적 제제 (여기서 담체는 고체이다)는 가장 바람직하게는, 단위 복용량 좌약으로 대표된다. 적절한 담체에는 코코아 버터 및 당분야에 통상적으로 이용되는 기타 물질이 포함되고, 그리고 좌약은 활성 화합물과 연화된 또는 용해된 담체(들)의 혼합, 그 이후에 냉각 및 주형에서 형상화에 의해 편의하게 형성될 수 있다.
질 투여에 적합한 제제는 활성 성분 이외에, 적절한 것으로 당분야에 공지된 담체를 내포하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 풀 모양 연고, 거품 또는 스프레이로서 제공될 수 있다.
코내 투여를 위해, 본 발명의 치료 단백질은 액상 스프레이 또는 분산가능 분말로서, 또는 액적의 형태로 이용될 수 있다. 액적은 하나 또는 그 이상의 분산제, 용해화제 또는 현탁제를 또한 포함하는 수성 또는 비-수성 기부로 조제될 수 있다. 액상 스프레이는 가압된 팩 (pressurized pack)으로부터 편의하게 전달된다.
흡입 투여를 위해, 본 발명에 따른 치료 단백질은 취입기, 분무기 또는 가압된 팩 또는 에어로졸 스프레이를 전달하는 다른 편의한 수단으로부터 편의하게 전달될 수 있다. 가압된 팩은 적절한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄 (dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오르메탄 (trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오르에탄 (dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 포함할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.
흡입 또는 통기에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 치료 단백질은 건성 분말 조성물, 예를 들면, 화합물 및 적절한 분말 기부, 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물의 형태를 취할 수 있다. 분말 조성물은 예로써, 분말이 흡입기 또는 취입기의 도움으로 투여될 수 있는 캡슐 또는 카트리지, 또는 예로써, 젤라틴 또는 블리스터 팩에서 단위 제형으로 제공될 수 있다.
원하는 경우에, 활성 성분의 지속된 방출을 제공하도록 개조된 앞서 기술된 제제가 이용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 제약학적 조성물은 또한, 다른 활성 성분, 예를 들면, 항균제, 또는 보존제를 내포할 수 있다.
이에 더하여, 본 명세서에서 개시된 치료 단백질은 다른 치료제와 공동으로 이용될 수 있는 것으로 예기된다. 가령, 본 발명에서는 잠재적 주사-관련된 과민성 반응을 최소화 또는 예방하기 위해 항히스타민제의 제약학적 효과량으로 사전 치료를 위한 방법을 제시한다. 가령, 항히스타민제는 본 명세서에서 개시되고 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 제약학적으로 허용되는 항히스타민제 (가령, 디펜히드라민)일 수 있다. 한 구체예에서, 항히스타민제는 체중 ㎏당 약 1 mg 내지 약 10 mg의 복용량으로 투여된다. 가령, 항히스타민제는 ㎏당 약 5 mg의 복용량으로 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 항히스타민제는 혈관 접근 포트 (vascular access port)에 연결된 이동성 시스템 (ambulatory system)을 이용하여, 리소솜성 산 리파아제의 투여에 앞서 약 10분 내지 약 90분, 예를 들면, 약 30분 내지 약 60분 시점에 투여된다. 한 구체예에서, 디펜히드라민의 복용량은 잠재적 과민성 주사 반응을 효과적으로 상쇄시킨다.
면역억제제, 예를 들면, 항히스타민제, 코르티코스테로이드, 시롤리무스, 보클로스포린, 시클로스포린, 메토트렉사테, IL-2 수용체 지향된 항체, T-세포 수용체 지향된 항체, TNF-α 지향된 항체 또는 융합 단백질 (인플릭시맙 (infliximab), 에타네르셉트 (etanercept) 또는 아달리무맙 (adalimumab)), CTLA4-Ig (가령, 아바타셉트 (abatacept)), 항-OX-40 항체 역시 환자가 과민성 반응 또는 유해한 면역 반응을 경험하면, LAL 투여 이전에, 동안 또는 이후에 투여될 수 있다.
본 발명에서는 또한, 하나 또는 그 이상의 콜레스테롤 강하제 (가령, HMG-CoA 환원효소 저해제)와 공동으로 LAL-내포 조성물의 투여를 수반하는 요법을 예기한다. 이런 작용제의 무제한적 실례에는 아토르바스타틴 (Lipitor® 및 Torvast®), 플루바스타틴 (Lescol®), 로바스타틴 (Mevacor®, Altocor®, Altoprev®), 피타바스타틴 (Livalo®, Pitava®), 프라바스타틴 (Pravachol®, Selektine®, Lipostat®), 로수바스타틴 (Crestor®) 및 심바스타틴 (Zocor®, Lipex®)이 포함된다.
본 명세서에서 기술된 조성물 또는 단백질은 다양한 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 치료 요법이 당업자에게 공지되어 있는 질환이 있다. 본 발명에서는 가금류 유래된 당화 패턴을 내포하는 조류 시스템에서 생산된 치료 단백질 (가령, LAL)이 이런 질환을 치료하는데 이용될 수 있는 것으로 예기한다. 다시 말하면, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 치료 단백질을 이용함으로써, 전통적으로 생산된 치료 단백질에 의해 치료가능한 것으로 알려진 질환의 치료 역시 예기된다. 가령, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 LAL은 LAL 결핍 또는 부족 (집합적으로, "LAL 결핍")에 기인하거나 이와 연관된 질환, 예를 들면, 월만병 및 콜레스테롤 에스테르 축적병 (CESD)을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, LAL 결핍은 또한, LAL의 발현이 장애 (가령, 유전자 돌연변이), 체내에서 생산된 LAL의 감소 또는 결핍을 유발하는 생리학적 또는 환경적 인자로 인하여 감소되는 질환을 예기한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 LAL은 다른 질환, 예를 들면, 동맥경화증, 지방 간 질환, 비-알코올성 지방 간 질환, 비알코올성 지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH) 및 간경변을 치료하는 데에도 이용될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이 생산된 LAL은 다른 질환, 예를 들면, 2005년 2월 1일자 허여된 U.S. Patent No. 6,849,257, 2009년 12월 3일자 공개된 U.S. publication No. 2009/0297496; 2004년 11월 11일자 공개된 US publication No. 2004/0223960; 2009년 11월 15일자 공개된 US publication No. 2007/0264249에서 개시된 것들을 치료하는 데에도 이용될 수 있고, 이들 4개의 특허 출원 각각의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로서 편입된다.
또한, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 생산된 LAL은 췌장염, 예를 들면, 만성 췌장염 및/또는 급성 췌장염, 그리고 알코올 유도된 췌장 손상, 예를 들면, 알코올 유도된 췌장염을 비롯한 일정한 특정 질환을 치료하는데 이용될 수 있는 것으로 예기된다.
임의의 유용한 방법, 예를 들면, 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생산된 LAL은 간, 비장, 장과 심혈관 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 신체 조직 내에 지질 에스테르의 축적을 유발하는 알코올 유도된 세포 손상이 포함되지만 이에 국한되지 않는 알코올 유도된 세포 손상에 기인한 질환을 치료하는데 유용한 것으로 예기된다. 본 발명에서는 또한, LAL을 투여함으로써 흡수 불량의 치료를 예기한다.
본 발명의 한 가지 양상은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 재조합 인간 LAL을 포함하는 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법에 관계한다. 환자는 LAL 결핍과 연관된 질환을 비롯한 임의의 다양한 질환으로 고통받거나 진단될 수 있다. 한 구체예에서, 치료 효과량은 환자에서 적혈구 수를 원하는 양으로 증가시키는 양이다. 본 발명에 따라서 생산된 LAL은 예로써, 조직이 리소솜성 산 리파아제의 생산을 유지하지 못하는 만성 신장 질병을 치료하는데 이용될 수 있을 것으로 예기된다.
또한, 임의의 유용한 방법에 의해 생산된 LAL은 탄지에르병 및 가족성 저알파지질단백혈증을 앓는 환자의 치료에 유용할 수 있는 것으로 예기된다. 탄지에르병/가족성 저알파지질단백혈증은 낮은 수준의 고-밀도 지질단백질 (HDL)과 함께 간비장비대 및/또는 림프절증을 동반하는 대식세포에서 콜레스테롤 에스테르의 축적과 연관되고, 이것은 LAL의 투여에 의해 치료될 수 있다. 가령, 임의의 특정 이론 또는 작용 기전으로 본 발명의 한정됨 없이, 손상된 LAL 활성은 ABCA1 발현을 감소시키고, 그리고 역으로 탄지에르병/가족성 저알파지질단백혈증을 앓는 환자에 LAL의 투여에 의해 획득된 증가된 LAL 활성은 ABCA1 발현을 증가시켜 다형성 (polymorphism)의 결과로써 감소된 기능적 활성을 갖는 ABCA1 유전자의 효과를 극복할 것으로 생각된다.
질환의 치료를 위해, 일반적으로, 투여되는 용량은 공지된 인자, 예를 들면, 수용자의 연령, 건강과 체중, 동시 치료의 유형, 치료 빈도 등에 따라 변할 수 있다. 통상적으로, 활성 성분의 용량은 체중 ㎏당 약 0.0001 내지 약 10 ㎎일 수 있다. 정확한 용량, 투여 빈도 및 치료 기간은 개별 치료 단백질의 투여 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
이에 더하여, 1 ㎎/㎏ 및 그 이하의 용량이 LAL 결핍을 치료하는데 효과적일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서는 5일마다 1회 내지 25일마다 1회, 예를 들면, 7일마다 1회 내지 14일마다 1회, 리소솜성 산 리파아제의 치료 효과량을 포유동물 (가령, 환자, 바람직하게는 인간 환자)에게 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 투여된 리소솜성 산 리파아제의 복용량은 체중 ㎏당 약 0.1 mg 내지 약 50 mg이다, 예를 들면, 복용량은 체중 ㎏당 약 1 mg 내지 5 mg일 수 있다.
특히 유용한 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 것들과 같은 임의의 치료적으로 효과적인 투약 섭생 (dosage regime)에 따라서 체중 ㎏당 약 0.1 mg 내지 1.0 mg의 리소솜성 산 리파아제의 복용량을 투여함으로써 질환을 치료하는 방법을 제시한다.
본 발명에서는 LAL의 치료 효과량을 투여하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 LAL 결핍의 임의의 합병증을 치료하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 흡수 불량 및 성장 부진이 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 치료될 수 있다. 다른 구체예에서, 간종 및 간 기능장애가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 LAL 결핍 환자에서 관찰된 합병증이 본 명세서에서 제시된 방법을 이용하여 치료될 수 있다.
본 발명에서는 당분야에 알려져 있는 임의의 유용한 단백질 발현 시스템, 예를 들면, 유전자도입 포유동물과 조류에 의해 생산될 수 있는 재조합 LAL (가령, 재조합 인간 LAL)로 치료를 제시한다. 다른 단백질 발현 시스템에는 세포 배양액, 박테리아, 그리고 식물 시스템이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명은 당업자에 의해 결정된 바와 같이, 의도된 치료 효과를 달성할 수 있는 임의의 루트에 의해, 제약학적으로 허용되는 조성물의 일부로서 재조합 LAL의 투여를 포함한다. 한 구체예에서, LAL은 약 5시간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 가령, 주입은 혈관 접근 포트 (vascular access port)에 연결된 이동성 주입 펌프 (ambulatory infusion pump) (가령, Port-a-Cath)에 의해 조장될 수 있다.
본 발명은 또한, 포유동물 (가령, 인간 환자)에서 질환, 예를 들면, 월만병과 CESD의 임상적 및 병리학적 증상을 모니터링하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 평가는 지질 분석, 흉부 x-선, 간 기능 검사, 대변 도표 (stool chart), 혈장 메발론산, 면역원성, 혈장 리소솜성 산 리파아제, 키토트리오시다아제 (chitotriosidase), PARC, 문맥압항진, 인체 측정 (anthropometry), 예로써 이미지화 기술을 이용한 간, 비장과 위장관의 크기와 특징으로 구성되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 전술한 이미지화 기술은 초음파, 자기 공명 영상 (magnetic resonance imaging), 그리고 핵 자기 공명 분광법 (nuclear magnetic resonance spectroscopy)으로 구성될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 예증된다. 이들 실시예는 설명을 목적으로 하고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지도 간주되지도 않는다.
실시예 1
재조합 인간 리소솜성 산 리파아제 (rhLAL) 코딩 서열을 보유하는 벡터 (pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA)의 작제
pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 벡터에서 hLAL 유전자의 뉴클레오티드 서열은 인간 리소솜성 산 리파아제 유전자에 의해 생산된 단백질의 아미노산 서열 (GenBank Accession, NP 000226)과 일치하는 단백질을 인코딩한다 (도 1). 이러한 서열의 전사 및 결과의 mRNA의 차후 번역은 399개 아미노산 전구체 단백질을 생산하고, 이것은 서열 번호: 1에 진술된 바와 같은 인간 LAL에 동일한 성숙 378개 아미노산 단백질 (GenBank Accession, NP 000226) (도 1)로 가공된다. 본 실시예에서 hLAL 유전자 (cDNA 서열에 대해 도 2를 참고한다)의 발현은 인핸서, 프로모터, 인트론, 그리고 5'와 3' 비번역 서열을 비롯한, 난백알부민 유전자로부터 유래된 비-코딩 요소에 의해 제어된다. 난백알부민 유전자는 흰자위의 주요 단백질 요소인 난백알부민을 생산한다. 닭 난백알부민 프로모터의 활성은 흰자위를 생산하는 닭 수란관 내에 세포에 매우 특이적이다; 다른 조직에서 발현은 극미하다.
플라스미드 벡터 pALVIN-0VR1-I-hLAL-dSA (도 3A; 이의 뉴클레오티드 서열은 도 4에 도시된다)는 창시자 (XLL109)의 유전체 내로 hLAL 도입유전자를 안정적으로 통합하는 복제-결함성 레트로바이러스 (RDR)를 생산하는데 이용되었다. 이러한 플라스미드 벡터는 바이러스 RNA 패키징, 역전사와 통합에 요구되는 레트로바이러스 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 바이러스 gag, pol과 env 유전자에 대한 본래 서열을 내포하지 않는다. 레트로바이러스 벡터를 산출하는데 이용되는 방법 및 차후 유전자도입 절차에서 이들의 이용은 본 명세서에서 기술된다.
pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA의 레트로바이러스 일부분은 ALV 벡터, pNLB에 기초된다. pNLB는 LTR이 자기-비활성화 (SIN) 되도록 변형되었다 (도 3B). 이를 달성하기 위해, U3 영역의 인핸서와 CAAT 박스를 포함하는 3' LTR의 273개 bp가 결실되었다. 레트로바이러스 서열의 3' 단부에서 비활성화된 U3 영역이 통합된 프로바이러스의 5' 단부에 존재하는 새로운 U3 영역에 대한 주형으로서 기능하기 때문에, 5' LTR 역시 정상적으로 비활성화된다. SIN 구조체 내에서 LTR 서열의 결실은 LTR로부터 내부 프로모터에 대한 프로모터 간섭을 감소시키고, 그리고 복제 적격성 레트로바이러스를 형성하는 서열의 재조합의 가능성을 최소화시킨다. 이러한 새로운 벡터는 ALV 비활성화 벡터에 대해 pALVIN으로 명명된다.
5' LTR의 하류는 부분 gag와 env 코딩 서열이고, 이들은 pNLB 벡터로부터 운반되었다. pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA에서, gag 단백질 전구체 서열 중에서 적은 일부 (12%)가 남아있고 (p19 성숙 펩티드 서열의 55%), 그리고 RAV2의 env 전구체 서열 중에서 적은 일부 (1.7%)가 남아있다 (GenBank Accession, AF033808). 이들 절두된 gag와 env 영역은 복제 적격성 레트로바이러스를 산출하는데 필요한 기능적 단백질을 생산할 수 없다 (Cosset, 1991).
닭 난백알부민 유전자의 전사와 번역 제어 요소는 pALVIN 내로 삽입되어 pALVIN-OV-1.1-I (이의 서열은 도 6에 도시된다; 서열 번호: 8)가 산출되었다. pALVIN-OV-1.1-I의 첫 번째 섹션은 1.1 kb 근위 프로모터 영역, 첫 번째 엑손, 첫 번째 인트론 및 2번째 엑손의 일부를 포함하는 닭 난백알부민 유전자의 연속 섹션으로 구성된다. 그 다음 섹션은 난백알부민 단백질 코딩 서열을 대신하는 충전물 (stuffer) 삽입 단편이다. 충전물에 뒤이어 닭 난백알부민 유전자의 3' 비번역 영역 (UTR)이 위치하고, 이것은 폴리아데닐화를 비롯한 mRNA의 적절한 가공을 용이하게 하는 서열을 포함한다. 일반적으로, 충전물 단편은 원하는 단백질, 본 발명의 경우에 hLAL를 인코딩하는 DNA 단편에 의해 대체된다. 결과는 내인성 난백알부민 mRNA의 조절을 가깝게 모방하고, 그리고 흰자위 내에서 목적되는 단백질의 높은 발현을 가능하게 하는, 유전자도입 닭의 수란관 내에서 mRNA의 조절된 전사 발현과 번역을 촉진하는 특정한 요소를 갖는 벡터이다.
pALVIN-OV-1.1-I 벡터는 난백알부민 유전자의 첫 번째 인트론을 포함한다. 상기 인트론은 레트로바이러스 RNA 유전체의 생산과 패키징 동안 절단접합에 민감하기 때문에, LTR과 관련하여 반대 방향으로 발현 카세트가 삽입되었다. 이러한 방식으로, 상기 인트론은 레트로바이러스 RNA에서 인식되지 않고 절단접합 없이 패키징된다. 편의를 위하여, 본 명세서에서 모든 지도는 LTR이 역방향으로, 그리고 발현 카세트가 전방 또는 시계바늘 방향으로 작성된다.
pALVIN-OV-1.1-I는 hLAL의 코딩 서열 (CDS)이 삽입된 염기 벡터이다. hLAL CDS를 구성하는 2개의 DNA 단편, hLAL 어댑터와 Syn hLAL, 그리고 pALVIN-OV-1.1-I과의 양립성 (compatibility)을 위해 요구되는 서열은 Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)에서 합성되었다 (도 7과 8 참고; 서열 번호: 9와 10). hLAL 어댑터의 229개 bp Hpal/BamHI 단편 및 Syn hLAL의 1113개 bp BamHI/BstBI 단편은 pALVIN-OV-1.1-I의 7882 Hpal/BstBI 단편 내로 삽입되고, 따라서 충전물 영역을 hLAL CDS로 대체하고 pALVIN-OV-1.1-I-hLAL을 산출하였다.
본래 레트로바이러스 RNA의 패키징을 방해하는 hLAL CDS의 안티센스 가닥 (antisense strand) 내에 숨겨진 절단접합 부위가 있는 것으로 밝혀졌다. 숨겨진 절단접합 부위는 hLAL의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 DNA 서열의 변경에 의해 제거되었다. 이러한 변화는 프라이머 5'-AGAAACTGAGAGTGTCTTAT-3' (서열 번호: 12) 및 프라이머 5'-TGACAGCTGTGGATCCAGAAACAAACATG-3' (서열 번호: 13)로 pALVIN-OV-1.1-I-hLAL의 영역 232 내지 534의 중합효소 연쇄 증폭에 의해 수행되어 329개 bp 앰플리콘이 산출되었다. 이러한 앰플리콘은 BamHI와 SexAI로 절단되고, 그리고 pALVIN-OV-1.1-I-hLAL의 8940개 bp BamHI/SexAI 단편과 결찰되어 pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSA가 산출되었다.
닭 난백알부민 유전자의 DNase 과민성 부위 III (DHSIII)을 내포하는 추정 프로모터 인핸서 (OV 프로모터 시작 부위와 관련하여 -3819 내지 -2169) (Kaye, Bellard et al. 1984)가 pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSA 내로 삽입되어 pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA가 산출되었다. 이것은 하기와 같이 수행되었다: DHSIII 인핸서 및 OVR1 프로모터로 명명된 1.1 kb 근위 OV 프로모터를 포함하는 DNA 단편 (도 9 참고; 그리고 서열에 대해 서열 번호: 11)는 XhoI와 B1pI로 절단에 의해 단리되었다. 서브클로닝를 용이하게 하기 위해, 어댑터 단편, pSIN-OV-1.1-I의 PCR은 프라이머 5'-GCCGCTCGAGCGAGGAATATAAAAAAATT-3' (서열 번호: 14) 및 5'- TCCGCGCACATTTCCCCGAA-3'(서열 번호: 15)으로 pALVIN-OV-1.1-I의 영역 6752 내지 7974의 PCR 증폭, 그 이후에 NgoMI와 XhoI로 절단으로 산출되었다. OVR1 프로모터의 2772개 bp XhoI/BlpI 단편 및 pSIN-OV-1.1-I의 PCR의 1067개 bp NgoMI/XhoI 단편은 pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSA의 7043개 bp NgoMI/BlpI 단편 내로 삽입되어 pALVIN-0VR1-I-hLAL-dSA가 산출되었다 (pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA의 작제 전략을 위해 도 10을 참고한다). pALVIN으로 명명된 벡터의 레트로바이러스 벡터 분절 (aka p AVIJCR-A395.22.3.1-KM 또는 pALV-SIN)의 작제는 United States Patent Application 2008/0064862에서 기술된다.
이에 더하여, 2008년 3월 13일자 공개된 US patent publication No. 2008/0064862에서 개시된 프로모터 및/또는 벡터를 이용한, 본 발명에 따른 LAL의 생산이 포함되고, 상기 문헌의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
실시예 2
바이러스 입자 생산
유전체 내에 hLAL 도입유전자를 보유하는 GO 창시자 유전자도입 수컷, XLL109은 하기와 같이 레트로바이러스 유전자도입 방법을 이용함으로써 산출되었다. pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 벡터를 보유하는 복제-결함성 바이러스 입자는 영속화된 닭 섬유아세포 세포주의 일시적인 형질감염에 의해 생산되었다. 이들 닭 섬유아세포는 3가지 플라스미드, pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA, pCMV-gag-pol 및 pCMV-VSV-G로 동시에 형질감염되었다. pCMV-gag-pol은 조류 백혈병 바이러스의 RAVI 균주의 gag와 pol 유전자를 발현한다. pCMV-VSV-G는 수포성 구내염 바이러스의 외피 단백질을 발현한다. 형질감염후 4시간 시점에, 배지는 10% 소 태아 혈청, 100 단위/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM으로 대체되었다. 배지는 형질감염후 48시간 시점에 수확되고, 0.45 마이크론 필터 (Millipore)를 통해 여과되고, 그리고 초원심분리 (ultracentrifugation)에 의해 농축되었다. ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자를 보유하는 농축된 레트로바이러스는 수집되고 초기 단계 배아의 형질도입에 이용되었다. "p"가 벡터의 플라스미드 형태에 대한 기호이기 때문에, 일단 도입유전자가 패키징된 벡터 또는 통합된 도입유전자의 형태로 있으면, "p"는 도입유전자 명칭으로부터 빠진다는 점에 주의한다.
실시예 3
배아 유전자도입
배아의 유전체 내로 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 발현 카세트의 통합은 초기 단계 배아의 형질도입에 의해 달성된다 (Speksnijder and Ivarie, 2000). 새로 산란된 수정된 White Leghorn 알은 번식 콜로니로부터 획득되었다. 배아에 접근을 제공하기 위해 껍질에 구멍이 만들어졌다. 앞서 기술된 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 발현 카세트를 보유하는 7 ㎕의 농축된 복제 결함성 레트로바이러스 입자는 배아의 배하강 (subgerminal cavity) 내로 주입되었다. 알은 뜨거운 접착제로 밀봉되고, 이후 표준 조건 하에 배양되고 부화되었다. 이들 주입으로부터 생산된 후손은 식별 및 추적을 위해 부화 시점에 개별 식별 마커가 부여되었다. 후손으로부터 혈액 샘플은 hLAL 코딩 서열에 특정한 PCR 프라이머를 이용한, hLAL 도입유전자에 대한 실시간 PCR에 의해 분석될 때, 도입유전자 양성이었다 (하기에 기술된 바와 같음). 이것은 상기 유전자도입 절차가 성공적이라는 암시를 제공하였다. hLAL 도입유전자에 대한 실시간 PCR 분석평가는 Taqman® 화학 (Applied Biosystems)을 이용한다. 전방과 후방 프라이머는 각각, 5'-ACGACTGGCTTGCAGATGTCT-3' (서열 번호: 16) 및 5'-CCCCAAATGAAGTCAAGATGCT-3' (서열 번호: 17)이었다. Taqman® 프로브 서열은 5'-CCGGAATGCTCTCATGGAACACCAA-3'(서열 번호: 18)이고 5' 단부에서 FAM (방사체 (emitter)로서) 및 3' 단부에서 Iowa Black (소멸자 (quencher)로서)로 표지되었다. 프라이머, 프로브 및 1 ㎕의 추출된 DNA는 30 ㎕ Taqman® Universal Master Mix (Applied Biosystems)에 첨가되었다. 대조 반응은 야생형 닭으로부터 hLAL 서열과 DNA를 보유하는 플라스미드의 다양한 희석액을 포함하였다 (데이터 제시되지 않음). Applied Biosystems 7500 Fast 실시간 PCR System에서 표준 사이클링 파라미터 (standard cycling parameter)가 이용되었다.
실시예 4
GO 창시자의 확인
정액은 성적으로 성숙한 수컷으로부터 수집되고, 그리고 DNA는 추출되고 hLAL 실시간 PCR 분석평가를 이용하여 시험되었다. 각 샘플 내에서 도입유전자 사본의 숫자는 음성 대조 정액 DNA와 혼합된 공지된 표준 (hLAL 유전자를 보유하는 플라스미드)을 이용하여 평가되었다. 수컷 XLL109에서 도입유전자 카세트 DNA 함량은 실시간 PCR에 의한 평가에서, 자손에 도입유전자의 유전을 가능하게 하는 수준에 있었다. 이러한 XLL109 수컷은 GO 유전자도입 창시자이고, 그리고 비-유전자도입 닭과 교배되어 G1 반접합성 유전자도입 닭이 산출되었다.
실시예 5
반접합성 G1 조류의 번식과 특성화
유전자도입 창시자 XLL109에 의해 종모된 자손은 hLAL 실시간 PCR 분석평가를 이용하여 혈액 세포 DNA 내에 도입유전자의 존재에 대해 조사되었다. 혈액은 1-2주령 후손으로부터 수집되고, 그리고 DNA는 고처리량 기술을 이용하여 추출되었다 (Harvey et al, 2002). DNA 용액은 고처리량 스크린을 용이하게 하기 위해 Taqman 분석평가에 앞서 정량되지 않았다. 전형적으로, 1 ㎕의 DNA 용액은 50 내지 400 ng의 DNA를 내포하고, 이것은 양성 증폭 신호를 산출하는데 충분하다. XLL109에 의해 종모된 총 1,322마리의 닭이 조사되고, 그리고 양성 후손은 재-교배되고 확증을 위해 조사되었다. PCR 결과에 따라, 22개의 후손은 ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA 도입유전자에 대해 양성이었다. Taqman 결과의 실례는 도 11에 도시된다.
실시예 6
높은-발현 라인의 확인과 특성화
G1 닭 중에서 한 가지, 1LL7466은 다른 G1 닭과 비교하여, 흰자위 내에 훨씬 높은 수준의 rhLAL 단백질을 갖는 알을 산란하였다. 서던 블롯 분석은 어떤 형제 수컷이 높은 발현 닭과 동일한 통합 부위를 갖는 지를 확인하기 위해, 1LL7466 및 형제 G1 수컷에서 실행되었다. 절단은 도입유전자 (B1pI) 내에서 단지 한 곳만을 절단하는 제한 효소로 수행되고, 그리고 서던 블롯은 난백알부민 프로모터의 분절 또는 hLAL 코딩 서열로 탐침되었다 (도 12A-D). 측면 유전체 영역 내에 존재하는 두 번째 제한 부위의 위치는 통합 부위에 따라 달라진다. 따라서 OV 프로브 또는 hLAL 프로브에 의해 검출된 B1pI 띠의 크기는 산출된 각 라인에 독특하다.
OV 프로브는 야생형 닭으로부터 B1pI-절단된 DNA에서 4.1 kb의 단일 띠를 검출하였는데, 이것은 닭 유전체의 내인성 난백알부민 유전자 내에서 B1pI 분절의 예측된 크기에 상응하였다 (도 12B와 12D). 4.3 kb의 두 번째 띠는 닭 1LL7466에서 검출되었는데, 이것은 도입유전자 띠에 상응하였다. 3가지 부가적 암컷 형제, 1LL 10409, 1LL10686과 1LL12058, 그리고 3가지 부가적 수컷 형제, 1LL8922, 1LL9330과 1LL11217은 4.3 kb 띠를 나타냈는데, 이것은 이들 형제가 동일한 라인일 지도 모른다는 것을 지시하였다 (도 12B와 12D).
예측된 바와 같이, hLAL 프로브는 야생형 닭으로부터 DNA에서 띠를 검출하지 못했는데, 그 이유는 닭 리소솜성 산 리파아제 유전자의 DNA 서열 및 재조합 인간 리소솜성 산 리파아제에 대한 코딩 서열이 이들 서던 분석평가에 이용된 조건 하에 혼성화 (hybridization)가 허용되지 않을 만큼 차별되었기 때문이다 (도 12C). hLAL 프로브는 OV 프로브에 의해 검출된 4.3 kb 띠에 양성인 동일한 닭으로부터 B1pI-절단된 유전체 DNA에서 ~10.6 kb의 단일 띠를 검출하였는데, 이것은 이들 7마리 G1 닭이 동일한 통합 부위를 갖고, 따라서 동일한 라인이라는 것을 지시하였다.
어떤 다른 띠도 검출되지 않았는데, 이것은 1LL7466, 1LL10409, 1LL10686, 1LL12058, 1LL8922, 1LL9330과 1LL11217 모두 단일 통합 부위를 갖는다는 것을 지시하였다.
서던 분석은 또한, 도입유전자가 통합되었다는 것을 지시하였는데, 그 이유는 OV와 hLAL 프로브에 의해 검출된 띠가 도입유전자 단독으로부터 상이하고 더욱 큰 크기를 가졌기 때문이다. 측면 유전체 영역 내에서 통합된 도입유전자의 예측된 구조 및 B1pI 부위의 위치를 보여주는 지도는 도 12A에 도시된다.
도입유전자가 본래대로인 지를 확인하기 위해, 2 단계가 취해졌다. 먼저, hLAL 코딩 서열은 1LL7466으로부터 PCR에 의해 단리되었다. PCR 산물은 hLAL 시작 코돈에서부터 종결 코돈까지 양쪽 가닥에서 염기서열분석되었다. DNA 서열은 예측된 바와 정확하게 일치하였는데, 이것은 도입유전자 내에 코딩 영역의 DNA 서열에서 변화 없음을 지시하였다. 둘째, 본래 도입유전자를 2개의 분절, 3.6과 3.8 kb로 절단하는 제한 효소 ApaLI를 이용하여 서던 블롯 분석이 실행되었다 (도 13A). 3.6과 3.8 kb 띠 둘 모두 G1로부터 ApaLI-절단된 유전체 DNA에서 검출되었는데, 이것은 도입유전자가 완전하게 본래 형태로 통합되었다는 것을 지시하였다 (도 13B).
실시예 7
G2의 번식과 특성화
도 14에서는 단일 GO 창시자, XLL109의 자손인 hLAL G2의 계통을 보여준다. G1 단계에서, 도입유전자는 사본 수, 완전성, hLAL 서열 및 통합 부위에 대해 특성화되고, 그리고 7마리의 G1 유전자도입체가 확인되고 특성화되었다 (4마리 암탉 및 3마리 수탉). G2의 번식은 G1 종모 1LL8922, 1LL9330과 1LL11217로부터 수집된 정액으로 비-유전자도입 닭의 인공 수정에 의해 달성되었다 (도 14). 각 인공 수정된 암탉, 이의 알 및 차후 후손은 다른 후손과 격리되어 사육되었다. 부화된 후손은 hLAL 실시간 PCR 분석평가를 이용하여 hLAL 도입유전자의 존재에 대해 조사되었다. G1 창시자가 도입유전자에 대해 반접합성이기 때문에, 후손 중에서 절반은 유전자도입 G2일 것으로 예측되었다. 현 시점까지 분석된 610마리의 G2 후손 중에서, 330마리 또는 54%는 유전자도입이었다.
실시예 8
hLAL 조류의 유전자 분석
혈액 DNA의 hLAL 실시간 PCR 분석평가에 의한 각 G2 닭의 확인후, 생산 라인은 하기 유전자 분석평가에 종속되었다: hLAL 유전자는 인간 서열과의 100% 상동성을 확인하기 위해 혈액 DNA로부터 PCR-증폭되고 염기서열분석되었다; 도입유전자 통합 부위는 앞서 기술된 바와 같이, 통합 부위 PCR에 의해 확증되었다. PCR 염기서열분석과 통합 부위 분석은 <10마리 닭 생산 라인에서 각 닭; 11-100마리 닭 생산 라인의 경우에 10%의 닭 (최소 10마리); 101-1000마리 닭 생산 라인의 경우에 5%의 닭 (최소 10마리); 1001-10,000마리 닭 생산 라인의 경우에 1%의 닭 (최소 50마리); >10,001마리 닭 생산 라인의 경우에 0.1%의 닭 (최소 100마리)에서 실행되었다. 상세한 기록은 성장과 생산 기 (phase)의 각 단계에서 유지되었다.
실시예 9
흰자위로부터 hLAL의 정제
LAL을 내포하는 흰자위 (EW)는 하룻밤동안 pH 6에서 용해되고, 그리고 0.2 ㎛ 여과와 함께 원심분리 (또는 심층 여과)를 통해 정화되었다. EW는 1 M NaOAc 완충액 (pH 4)으로 pH 6으로 조정되었다.
정화된 EW는 20 mM 인산염/137 mM NaCl 완충액 (pH 6)으로 평형화된 페닐-HIC 칼럼 (EW:칼럼 크기=2:1) 위에 적하되었다. 적하의 완결후, 칼럼은 평형 완충액 및 5 mM 인산염 완충액 (pH 6)으로 세척되었다. LAL은 5 mM Tris 완충액 (pH 7.2)과 함께 30% 프로필렌 글리콜로 용리되었다. 용리된 LAL 분획물은 1 M 아세트산으로 pH 5로 조정되고, 이후 GigaCap S 칼럼 (EW:칼럼 크기=10:1) 위에 적하되었다. 칼럼은 50 mM NaOAc 완충액 (pH 5)으로 평형화되었다. 적하의 완결후, 칼럼은 평형 완충액으로 세척되었다. LAL은 50 mM NaOAc/60 mM NaCl (pH 5)로 용리되었다.
GigaCap S 칼럼으로부터 LAL 분획물은 1 M Tris 완충액으로 pH6으로 조정되고, 이후 부틸-HIC 칼럼 (EW:칼럼 크기=10:1) 위에 적하되었다. 칼럼은 20 mM 인산염/137 mM NaCl 완충액 (pH 6)으로 평형화되었다. 적하의 완결후, 칼럼은 평형 완충액 및 5 mM 인산염 완충액 (pH 6)으로 세척되었다. 순수한 LAL은 5 mM Tris 완충액 (pH 7.2)과 함께 50% 프로필렌 글리콜로 용리되었다. 도 15에서는 흰자위로부터 hLAL의 정제 단계를 도시한다.
실시예 10
유전자도입 조류 유래된 hLAL의 탄수화물 분석
올리고당류 구조는 당업자에게 널리 공지된 하기 분석 기술을 이용함으로써 조류 유래된 인간 LAL에 대해 결정되었다.
200 마이크로그램은 1 mM CaCl2를 내포하는 0.1 M Tris-HCl, pH 8.2에서 37℃에서 18시간 동안 트립신과 키모트립신으로 절단되었다. 절단 산물은 Sep-Pak C18 카트리지 칼럼에 의해 농축되고 오염물질이 제거되었다. 농축후, 당펩티드는 37℃에서 18시간 동안, 50 ㎕의 20 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5에서 2 ㎕의 PNGaseF (7.5 단위/㎖)로 절단되었다. 방출된 올리고당류는 Sep-Pak C18 카트리지 칼럼에 통과에 의해 펩티드와 효소로부터 분리되었다.
글리칸 분획물은 디메틸설폭시드에 용해되고, 이후 Anumula와 Taylor (Anumula and Taylor, 1992)의 방법에 기초하여 퍼메틸화 (permethylation)되었다. 반응은 물의 첨가에 의해 진정되고, 그리고 퍼-O-메틸화된 탄수화물은 디클로로메탄으로 추출되었다. 퍼-O-메틸화된 글리칸은 질소 흐름 하에 건조되었다.
MALDI/TOF-MS (매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행 시간형 질량분석, Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)은 α-디히드록시벤조산 (DHBA, 50% 메탄올:물에서 20 mg/㎖ 용액)을 매트릭스로서 이용하여, 반사경 양성 이온 양식 (reflector positive ion mode)으로 실행되었다. 모든 스펙트럼은 Microflex LRF (Bruker)를 이용함으로써 획득되었다.
MALDI-TOF-MS 분석 및 ESI MS/MS (전자분무 이온화 탠덤 질량분석, electrospray ionization tandem mass spectrometry)는 당분야에 알려져 있는 바와 같이, 펩티드 골격으로부터 방출 및 정제후 올리고당류에서 실행되었다. 개별 다당류 종류의 샘플은 또한, 일정한 효소로 절단되고, 그리고 절단 산물은 당분야에 알려져 있는 바와 같이 HPLC에 의해 분석되었다. 인간 LAL 상에 약 6개의 N-연결된 당화 부위가 존재하는 것으로 생각된다 (참고: Zschenker, et al (2005) J. Biochem., Vol 137, p 387-394, 이의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다). 상기 참고문헌은 또한, 인간 LAL 상에 O-연결된 당화 부위가 존재할 수도 있다는 것을 지시한다. 확인된 N-연결된 올리고당류 구조는 도 16에 도시된다.
데이터는 이들 구조 중에서 많은 또는 모든 구조가 본 발명에 따라서 생산된 LAL 내에서 N-연결된 당화 구조로서 발견된다는 것을 드러냈다 (도 16). 가령, A-n은 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, O-n은 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, B-n, C-n과 D-n 중에서 적어도 하나는 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, E-n과 F-n 중에서 적어도 하나는 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, I-n과 J-n 중에서 적어도 하나는 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, K-n과 L-n 중에서 적어도 하나는 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, M-n과 N-n 중에서 적어도 하나는 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, G-n은 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다. 가령, H-n은 본 발명에 따라서 생산된 LAL에 부착된 상태로 발견된다.
실시예 11
유전자도입 조류 유래된 LAL의 N-글리칸 종류
유전자도입 조류 유래된 hLAL의 정제된 샘플 (600 ㎍/샘플)은 염과 기타 오염물질을 제거하기 위해, 4℃에서 약 24시간 동안 나노퓨어 물 (nanopure water)에 대해 Tube-O-Dialyzer (4.0 kDa 컷-오프 막; G Biosciences)를 이용하여 투석되었다. 나노퓨어 물은 전체 투석 기간 동안 4회 교체되었다.
투석후, 각 샘플은 3개의 분취량 (aliquot)으로 분할되었다: 중성 당과 아미노 당 분석을 위한 샘플 중량의 ~1/4, 만노오스-6-인산염 분석을 위한 샘플 중량의 ~1/4, 그리고 올리고당류 프로파일링을 위한 샘플 중량의 ~1/2. 중성 당과 아미노 당 분석에 의도되는 분취량은 100℃에서 4시간 동안 2 N 트리플루오르아세트산 (TFA)으로 가수분해되고, 그리고 만노오스-6-인산염 분석을 위한 분취량은 100℃에서 1.5시간 동안 6.75 N TFA로 가수분해되었다. 가수분해물은 이후, N2 하에 건조되고, 50 ㎕ H20로 재용해되고, 얼음에서 7분 동안 초음파처리되고, 그리고 주사 바이알로 이전되었다. 하지만, 중성 당과 아미노 당 샘플은 2회 희석되었는데, 그 이유는 최초 용해된 가수분해물로부터 생산된 피크가 너무 컸기 때문이었다.
중성 당과 아미노 당에 대한, 그리고 공지된 몰수를 갖는 만노오스-6- 인산염에 대한 표준의 혼합물은 상기 샘플에서와 동일한 방식으로 및 동일한 시점에서 가수분해되었다. 4가지 농도의 중성 당과 아미노 당 표준 혼합물 (Fuc & GalNAc, 10㎕당 0.2, 0.4, 0.8, 그리고 1.6 nmole; GlcNAc, 10㎕당 0.5, 1.0, 2.0, 그리고 4.0 nmole; Gal & Man, 10㎕당 0.3, 0.6, 1.2, 그리고 2.4 nmole; 그리고 Glc, 10㎕당 0.1, 0.2, 0.4, 그리고 0.8 nmole) 및 만노오스-6-인산염 (10㎕당 640, 1280, 2560, 5120 picomole)은 보정식 (calibration equation)을 확립하기 위해 제조되었다. 샘플 내에 각 당의 몰수는 보정식 (calibration equation)으로부터 선형 보간법 (linear interpolation)에 의해 정량되었다.
중성 당과 아미노 당, 그리고 만노오스-6-인산염은 구배 펌프 (gradient pump), 전기화학적 검출기, 그리고 자동시료주입기가 구비된 Dionex ICS3000 시스템을 이용한 HPAEC에 의해 분석되었다. 개별 중성 당과 아미노 당, 그리고 만노오스-6-인산염은 아미노 트랩 (amino trap)을 갖는 Dionex CarboPac PA20 (3 x 150 mm) 분석 칼럼에 의해 분리되었다. 구배 프로그램 (gradient program)은 용리액 A, 탈기된 나노퓨어 물과 B, 중성 당과 아미노 당에 대한 200 mM NaOH, 그리고 C, 100 mM NaOH 및 D, 만노오스-6-인산염에 대한 100 mM NaOH에서 1 M 아세트산나트륨을 이용하였다. 주입 (10㎕/주입)은 중성 당과 아미노 당 결정의 경우에 40분마다, 그리고 만노오스-6-인산염 결정의 경우에 35분마다 이루어졌다. 모든 방법은 Hardy와 Townsend (Hardy, M. R., 그리고 Townsend, R. R., "High-pH anion-exchange chromatography of glycoprotein-derived carbohydrates", 1994, Methods Enzymol. 230: 208-225)에 의해 기술된 프로토콜에 기초되었다. 기구 제어 및 데이터 획득은 Dionex chromeleon 소프트웨어를 이용하여 달성되었다. 결과는 하기 표 1에 도시된다. 대조 샘플은 EW로부터 정제된 오보뮤코이드이다.
샘플 ID | 분석물 | nanomole | nanomole/㎍ | mole % |
대조 | 푸코스 | nd | - | - |
N-아세틸 갈락토사민 | 5.066 | 0.020 | 9.6 | |
N-아세틸 글루코사민 | 26.947 | 0.108 | 51.4 | |
갈락토오스 | 3.876 | 0.016 | 7.4 | |
글루코오스 | nd | - | - | |
만노오스 | 16.565 | 0.066 | 31.6 | |
만노오스-6-인산염 | nd | - | - | |
N-아세틸 뉴라민산 | ndm | - | - | |
N-글리콜릴 뉴라민산 | ndm | - | - | |
유전자도입 조류 유래된 hLAL |
푸코스 | nd | - | - |
N-아세틸 갈락토사민 | nd | - | - | |
N-아세틸 글루코사민 | 17.932 | 0.120 | 37.6 | |
갈락토오스 | 0.879 | 0.006 | 1.8 | |
글루코오스 | nd | - | - | |
만노오스 | 23.290 | 0.155 | 48.8 | |
만노오스-6-인산염 | 5.642 | 0.038 | 11.8 | |
N-아세틸 뉴라민산 | ndm | - | - | |
N-글리콜릴 뉴라민산 | ndm | - | - |
nd= 검출되지 않음; ndm= 결정되지 않음.
LAL의 구조적 특징
LAL은 아미노산 서열 내에 N-연결된 당화를 위한 6개의 잠재적 부위, Asn36, Asn72, Asn101, Asn161, Asn273, 및 Asn321을 갖는다. 이들 중에서 5개, Asn36, Asn101, Asn161, Asn273, 그리고 Asn321은 당화되는 것으로 밝혀진 반면, Asn72는 당화되지 않거나 실질적으로 당화되지 않았다 ("실질적으로 당화되지 않은"은 LAL 분자의 혼합물 내에서, Asn36, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321 중에서 임의의 한 가지보다 더욱 적은 Asn72이 당화된다는 것을 의미한다). 따라서 본 발명의 한 가지 양상은 Asn72에서 당화되지 않은 및/또는 실질적으로 당화되지 않은 LAL (가령, 인간 LAL), 그리고 이런 LAL의 생산과 용도이다. 하지만, 당화된 Asn72를 갖는 LAL는 본 발명의 범위 내에 있다. N-글리칸 구조는 일차적으로, N-아세틸글루코사민, 만노오스 및 만노오스-6-인산염 (M6P)을 주요 당으로서 갖는 이중-, 삼중- 및 사중 촉각 구조 (antennary structure)의 혼합물로 구성된다. 각 부위는 본 발명의 한 가지 양상인 선호되는 일단의 구조 (표 2와 도 17)를 갖는 것으로 보인다. 가령, M6P-변형된 N-글리칸은 적어도 Asn101, Asn161 및 Asn273에 존재한다. 이들 비-인산화된 구조는 내인성 흰자위 단백질 상에서 발견되는 N-글리칸의 전형이다. N-아세틸갈락토사민 (GalNac)의 결핍에 의해 결정된 바와 같이, O-연결된 글리칸은 전혀 검출되지 않았다. 시알산은 전혀 검출되지 않았는데, 이것은 본 발명에 따라서 생산된 다른 내인성과 외인성 단백질의 기존에 결정된 N-글리칸 구조와 일치한다. 본 발명은 본 명세서에서 개시된 올리고당류 구조 중에서 하나 또는 그 이상으로 당화된 LAL을 포함한다.
위치 | 글리칸 구조 |
Asn36 | GlcNAc4Man3GlcNAc2 Hex1GlcNAc4Man3GlcNAc2 |
Asn72 | 검출되지 않음 |
Asn101 | Phos2Man7GlcNAc2 |
Asn161 | Phos1Man6GlcNAc2 GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2 Man3GlcNAc2 GlcNAc2Man3GlcNAc2 GlcNAc3Man3GlcNAc2 GlcNAc4Man3GlcNAc2 Hex1GlcNAc4Man3GlcNAc2 |
Asn273 | Man7GlcNAc2 Man8GlcNAc2 Man9GlcNAc2 Phos1Man8GlcNAc2 Phos1Man9GlcNAc2 |
Asn321 | GlcNAc2Man3GlcNAc2 GlcNAc3Man3GlcNAc2 GlcNAc4Man3GlcNAc2 Hex1GlcNAc4Man3GlcNAc2 GlcNAc5Man3GlcNAc2 Hex1GlcNAc5Man3GlcNAc2 GlcNAc6Man3GlcNAc2 Hex1GlcNAc6Man3GlcNAc2 |
Hex, 갈락토오스; Phos, 인산염; Man, 만노오스; GlcNAc2, N-아세틸글루코사민
방법
중성, 아미노 및 M6P을 비롯한 단당류 조성은 높은 pH 음이온 교환 크로마토그래피-펄스식 전류측정 검출 (high pH anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD)에 의해 정성적으로 및 정량적으로 결정되었다.
유력한 글리칸의 구조는 몇몇 질량 분석 방법 (MALDI-TOF, NSI-MS/MS 및 당펩티드 LC-MS)으로부터 데이터로 결정되었다.
MALDI-TOF는 중성 N-글리칸의 결정에 유용하고 인산화된 N-글리칸을 검출할 수 있었다 (도 18). NSI-MS/MS는 MALDI-TOF 스펙트럼에서 마이너 피크의 성격을 결정하는데 이용되었는데. 이들 중에서 일부는 인산화된 N-글리칸에 기인하였다 (도 19). 인산화된 N-글리칸을 검출하는 MALDI-TOF의 능력을 향상시키려는 노력은 소득이 없었다.
당펩티드의 LC/MS는 중성과 인산화된 구조를 검출할 수 있었고, 그리고 LAL의 아미노산 서열 내에서 특정한 구조의 위치를 결정할 수 있었다 (도 17과 표 2에서 요약된 데이터). HPAEC-PAD 크로마토그램에서 어떤 피크가 인산화된 N-글리칸에 기인하는 지를 결정하기 위해, LAL은 포스파타아제로 처리되고 분석되었다 (도 3). 그룹 C와 D에서 피크는 곡선 아래 면적 (AUC)이 감소하는 반면, 그룹 A에서 피크는 더욱 현저해졌다. 그룹 B에서 피크는 다른 피크에 비하여 변화가 없었다. 체류 시간이 전하 (charge) (인산화 또는 시알화에 따른)의 정도에 비례한다는 지식에 기초하여, 그룹 C는 1개의 인산염을 갖는 N-글리칸 (모노 M6P)으로 구성되고, 그리고 그룹 D는 2개의 인산염을 갖는 N-글리칸 (bis-M6P)으로 구성되는 것으로 예기된다.
체류 시간은 또한, 중성과 아미노 단당류의 조성과 상대적 구조 위치에 의해 영향을 받았다. 이런 실례는 갈락토오스의 존재, 2등분 GlcNac의 존재 및 GlcNac 치환의 정도를 포함한다. 이들 인자는 HPAEC-PAD 크로마토그램에서 피크의 다중도 (multiplicity)에 기여한다.
실시예 12
흰자위 내에 유전자도입 조류 유래된 hLAL의 시험관내 효소 활성 분석
흰자위 내에서 리소솜성 산 리파아제의 활성은 본질적으로 Yan et al. (2006), American Journal of Pathology, Vol. 169, No. 3, p 916-926에서 기술된 바와 같은 형광성 기질 4-메틸움벨리페릴-올레산염 분석평가를 이용하여 결정되었고, 상기 문헌의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
4% Triton X-100에서 2.5 mM 4-MUO로 구성되는 4-메틸움벨리페릴-올레산염 (4-MUO)의 저장 용액 (stock solution)이 제조되었다. 상기 분석평가는 0.01% Tween80에서 62.5 ㎕의 0.2 M 구연산나트륨 (pH 5.5), 12.5 ㎕의 흰자위 샘플 및 25 ㎕의 2.5 mM 4-MUO를 내포하는 마이크로역가 평판의 각 웰에서 실행되었다. 형광에서 변화는 Bio-Tek Synergy HT 형광 마이크로평판 판독기 (여기 360 nm 및 방출 460 nm)를 이용하여 37℃에서 30분 동안 모니터링되었다. 분석평가에 앞서, hLAL을 내포하는 흰자위는 적어도 30분 동안 선형적으로 지속하는 반응을 유발하는 효소 농도로 희석되었다. 반응은 50 ㎕의 0.75 M Tris-HCl, pH 8.0로 중단되고, 그리고 종점 형광 신호는 앞서 이용된 동일한 평판 판독기 (여기 360 nm 및 방출 460 nm)에서 측정되었다. 활성 단위는 4-메틸움벨리페릴을 표준으로서 이용하여 결정되었다. 1 단위 (U)는 앞서 기술된 분석평가 조건 하에 1 umole의 4-메틸움벨리페릴/min의 형성을 유발하는 효소의 양으로서 정의된다. 비-hLAL 내포 흰자위는 음성 대조로서 이용되었다.
hLAL에 대해 양성인 흰자위 샘플은 흰자위 ㎖당 1 U 내지 100 U의 활성을 내포하였다. 21마리 G1 닭으로부터 흰자위가 분석되었다. 이들 닭 중에서 10마리로부터 흰자위는 hLAL 활성에 양성으로 조사되었다.
실시예 13
유전자도입 조류 유래된 LAL의 시험관내 분석
세포에 결합하고 리소솜 구획에 내재화되는 유전자도입 조류의 수란관 세포에서 생산된 LAL (본 명세서에서, "SBC-102", "조류 유래된 LAL", "LAL", 또는 "hLAL")의 능력은 대식세포 및 섬유아세포를 이용하여 시험관내에서 시험되었다. 대식세포와 함께 배양될 때, 형광-표지된 SBC-102는 리소솜에 국한되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 효과는 만노오스 다당류 경쟁자를 이용함으로써 약화될 수 있었는데, 이것은 이들 세포에 의한 인식과 흡수의 기전으로서 N-아세틸글루코사민/만노오스 (GlcNAc/만노오스) 수용체를 암시하였다. SBC-102는 시험관내에서 배양후 LAL-결함성 인간 섬유아세포 및 정상적인 뮤린 섬유아세포 둘 모두에서 세포-연관된 LAL 활성을 증가시켰는데, 이것은 SBC-102에 대한 노출이 결함성 효소 활성의 실질적인 대체를 유발할 수 있다는 것을 지시하였다.
만노오스-6-인산염 (M6P)은 편재성 M6P 수용체를 거쳐 매우 다양한 세포 유형에 리소솜 효소의 전달에 관여하는 것으로 밝혀진 SBC-102의 올리고당류 구조 내에 존재한다.
LAL은 유전자도입 암탉의 흰자위로부터 정제되었다. Oregon Green NHS는 Invitrogen™ (#0-10241)으로부터 획득되었다. 쥐 폐포 대식세포주, NR8383, 그리고 생쥐 섬유아세포 세포주, NIH-3T3은 ATCC로부터 획득되었다. LAL-결함성 월만 섬유아세포는 Coriell Institute for Medical Research로부터 획득되고, 그리고 LysoTracker® Red는 Invitrogen™으로부터 획득되었다.
효소 표지화: PBS에서 4 mg의 유전자도입 조류 유래된 LAL은 제조업체의 권고에 따라 Oregon Green으로 표지되고, 그리고 반응물은 PBS에 대해 차후 투석되고, 이후 농축되었다.
대식세포 흡수: 형광-표지된 유전자도입 조류 유래된 LAL (5 ㎍/㎖) 및 LysoTracker® Red는 2시간 동안 NR8383 세포와 함께 배양되었다. 세포는 488nm와 이후, 514nm에서 순차적 주사 양식을 이용한 공-초점 형광 검경 (co-focal fluorescence microscopy)에 의해 조사되었다.
만난으로 경쟁적 저해: 형광-표지된 SBC-102 (5 ㎍/㎖) 및 만난은 2시간 동안 NR8383 세포와 함께 배양되었다. 세포는 트립신처리되고, 그리고 정중 형광 강도 (median fluorescence intensity)를 종점으로서 이용한 형광-활성 세포 정렬 (florescence-activated cell sorting)에 의해 LAL 흡수가 측정되었다.
표적 세포의 리소솜 내로 흡수되고 차후에 함입되는 유전자도입 조류 유래된 LAL의 능력은 대식세포 세포주, NR8383을 이용하여 조사되었다. 형광-표지된 유전자도입 조류 유래된 LAL 및 리소솜 마커, "LysoTracker® Red" (Invitrogen™)는 2시간 동안 세포와 함께 배양되었다. 이들 세포의 리소솜 내에서 유전자도입 조류 유래된 LAL 및 리소솜 마커의 공동-국한 (co-localization)은 차후에, 순차적 주사 양식을 이용한 공초점 형광 검경에 의해 조사되었다 (도 20). LAL은 리소솜에 국한을 증명하였고, 이것은 다양한 출처로부터 rhLAL을 이용한 유사한 시험관내 연구 결과와 일치한다.
GlcNAc/만노오스 수용체에 대한 유전자도입 조류 유래된 LAL의 결합 특이성은 대식세포 세포주, NR8383을 이용한 경쟁적 결합 분석평가에 의해 평가되었다 (도 21). 5 ㎍/㎖에서 형광-표지된 (Oregon Green) 유전자도입 조류 유래된 LAL 및 다양한 농도의 만노오스-내포 올리고당류, 만난은 2시간 동안 세포와 함께 공동-배양되었다. 만난 없음 대조와 비교하여, 만난에 의한 유전자도입 조류 유래된 LAL 흡수의 상대적 저해는 정중 형광 강도 (median fluorescence intensity)를 종점으로서 이용한 형광-활성 세포 정렬 (florescence-activated cell sorting)에 의해 정량되었다. 유전자도입 조류 유래된 LAL 결합/흡수에서 만노오스 용량 의존성 저해가 관찰되었는데, 이것은 유전자도입 조류 유래된 LAL: GlcNAcR 상호작용과 일치한다.
이에 더하여, 섬유아세포에서 만노오스-6-인산염 매개된 흡수는 만노오스-6-인산염을 이용한 경쟁 실험에 의해 증명되었다 (결과는 제시되지 않음).
세포에서 LAL 활성을 증가시키는 유전자도입 조류 유래된 LAL 노출의 능력은 시험관내에서 정상적인 세포 및 LAL-결함성 세포 둘 모두를 이용하여 조사되었다. 월만 환자로부터 단리된 섬유아세포 및 정상적인 뮤린 섬유아세포 (NIH-3T3)는 0, 0.16 또는 0.5 ㎍/㎖의 농도에서 5시간 동안, 유전자도입 조류 유래된 LAL의 존재에서 배양되었다. 세포는 이후, 비-특정한 신호를 제거하기 위해 세척되고, 그리고 세포 용해물은 4-MUO 기질을 이용하여 LAL 활성에 대해 시험되었다. 내인성 세포-연관된 LAL 활성은 NIH-3T3과 비교하여 월만 섬유아세포에서 더욱 낮았고, 그리고 활성에서 용량-의존성 증가가 유전자도입 조류 유래된 LAL과 함께 배양후 양쪽 세포 유형에서 관찰되었다 (도 22).
실시예 14
유전자도입 조류 유래된 LAL의 생체내 분석
LAL-결함성 Yoshida 쥐 (즉, 동종접합성) (참고: Kuriyama et al. (1990), Journal of Lipid Research, vol. 31, p 1605-1611; Nakagawa et al, (1995) Journal of Lipid Research, vol. 36, p 2212-2218; 그리고 Yoshida and Kuriyama (1990) Laboratory Animal Science, vol. 40, p 486-489)는 4주령에서 시작하여 4주 동안 주 1회, SBC-102 (5 ㎎/㎏, IV) 또는 위약으로 치료되었다. 각 투여를 위해, SBC-102는 30분 간격으로 2회 동등 분량 (2.5 ㎎/㎏)이 쥐 꼬리 정맥 내로 주사되었다. 쥐와 연령-정합된 야생형 대조는 최종 투약후 1주 시점에 조사되었다. 분석은 삼중으로 수행되었다.
SBC-102 치료된 동물의 육안 병리 검사 (Gross pathologic examination)는 장기 크기에서 감소에 더하여 간 색깔에서 정상화를 증명하였다. SBC-102 치료된 쥐는 운반제-치료된 동물에서 거품 대식세포의 실질적인 축적과 현저하게 대조적으로, 본질적으로 정상적인 간 조직구조를 보였다 (데이터 제시되지 않음). LAL-/- 쥐에서 상승하는 혈청 알라닌과 아스파르트산염 전이효소 (aspartate transferase) 수준 역시 SBC-102 치료된 쥐에서 감소하였다 (데이터 제시되지 않음).
내부 장기와 조직의 크기는 각 쥐에 대해 측정되고, 그리고 데이터는 도 23에 도시된다. 장기 크기는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 SBC-102의 주 1회 투여후, LAL-/- 쥐와 LAL+/+ 쥐에서 8주령에 측정된 체중의 퍼센트로서 표시된다.
SBC-102- 또는 운반제-치료된 Yoshida 쥐의 체중은 도 24에서 도시된 바와 같이, 야생형 쥐와 비교되었다. SBC-102 (5 ㎎/㎏) 또는 운반제는 단일 복용량 또는 분할 분량 (split dose) (4시간 기간 내에 제공됨)으로서 LAL-/- 쥐에 IV 주사에 의해 투여되었다. LAL+/+ 쥐는 연령-정합된 한배 새끼 대조이다.
실시예 15
트리글리세리드 분석
트리글리세리드 분석은 야생형, 동종접합성 위약 치료된 동물 및 동종접합성 SBC-102 치료된 동물로부터 간과 비장 조직에서 실행되었다. 트리글리세리드 분석은 표준 방법 (즉, MBL International의 Triglyceride Quantification Kit Catalog # JM-K622-100)을 이용하여 실행되고 삼중으로 수행되었다.
트리글리세리드 (㎍/㎎ 습성 조직) | |||
야생형(n=3) | 위약(n=3) | SBC-102(n=3) | |
간 | 48 | 84 | 57 |
비장 | 3 | 22 | 4 |
간 기질 수준
도 25에서는 4주 동안 운반제 또는 5 ㎎/㎏에서 SBC-102의 주 1회 투여후, WT와 LAL 결함성 쥐에서 8주령에 측정된 간 콜레스테롤, 콜레스테릴 에스테르와 트리글리세리드 수준을 도시한다.
실시예 16
용량 반응 연구
앞서 실행된 연구에 기초하여, LAL ("SBC-102")의 일정한 범위의 용량과 투약 일정 (qw와 qow)의 약역학적 (PD) 효과가 LAL-/- 쥐에서 조사되었다. 이들 연구에서, SBC-102는 4주령에서 시작하여 1개월 동안, 0.2, 1, 3과 5 ㎎/㎏, qow, 또는 0.35, 1과 5 ㎎/㎏, qw의 용량에서 IV 주사에 의해 투여되었다. 결과는 체중 (BW) 증가 (도 26), 장기비대 (도 27), 그리고 조직 기질 수준 (도 28)에서 향상을 증명하였다. 혈청 아미노기전이효소 수준 역시 SBC-102 복용량이 증가함에 따라 감소하였고, 더욱 높은 복용량에서 수준이 본질적으로 야생형 수준에 도달하였다.
실시예 17
쥐 모델에서 재조합 LAL의 투여
체중, 조직 트리글리세리드와 콜레스테롤, 간종, 비종, 림프절증, 장 무게 (intestinal weight), 그리고 기타 파라미터에 대한 재조합 인간 리소솜성 산 리파아제 (LAL)로 반복 투약의 효과는 Yoshida and Kuriyama (1990) Laboratory Animal Science, vol. 40, p 486-489에서 기술된 LAL 결함성 Donryu 쥐에서 평가되었다 (또한 Kuriyama et al. (1990) Journal of Lipid Research, vol. 31, p 1605-1611; Nakagawa et al, (1995) Journal of Lipid Research, vol. 36, p 2212-2218을 참고하고, 이들의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다).
4주령에서, LAL 결실에 대해 동종접합성인 Donryu 쥐 (LAL-/-)는 유전자도입 닭 수란관 시스템에서 생산된 재조합 인간 LAL 또는 염수 위약이 투약되는 군으로 할당되었다. 야생형, 연령-정합된 한배 새끼 쥐는 대조로서 이용되었다. LAL-/- 쥐는 4주 동안 주 1회 (총 4회 투약) 또는 4주 동안 2주마다 1회 (총 2회 투약), 단일 복용량 또는 30분 간격으로 제공되는 2회 동등 분량으로 꼬리-정맥 주사에 의해 투약되었다. LAL의 복용량은 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏이었다. 투약 일정은 표 4에 도시된다. 이들 쥐는 잠재적 과민성 반응을 상쇄하기 위해 디펜히드라민 (5 ㎎/㎏)으로 사전 치료되었는데, 이러한 절차는 리소솜 축적병의 치료를 위한 효소 대체 요법의 동물 모델에서 이전 경험에 기초된다 (Shull et al. (1994) Proceedings of the National Academy of Science, vol. 91, p.12937; Bielicki et al. (1999) The Journal of Biological Chemistry, 274, p.36335; Vogler et al. (1999) Pediatric Research, 45, p.838., 이들의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다).
도 29에서는 주당 1 ㎎/㎏의 LAL 또는 주당 5 ㎎/㎏의 LAL 또는 2주당 5 ㎎/㎏의 LAL이 투여된 쥐의 체중 증가에서 일일 증가를 도시한다. 상기 도면에서 이들 2가지 복용량 크기와 빈도 사이에 치료 효과에서 차이가 거의 또는 전혀 없다는 것을 확인할 수 있다.
출생으로부터 일자 | 수행된 평가/주사 | |
Day 13 | 칭량됨 |
|
Day 14 | ||
Day 20 | ||
Day 21 | 이유(離乳)된 새끼 | |
Day 24 | ||
Day 25 | ||
Day 27 | ||
Day 28 | 주 1회 및 2주마다 1회 투여를 위한 첫 번째 주사 | |
Day 31 | ||
Day 32 | ||
Day 34 | ||
Day 35 | 주 1회 투여를 위한 두 번째 주사 | |
Day 38 | ||
Day 39 | ||
Day 41 | ||
Day 42 | 주 1회 투여를 위한 세 번째 주사; 2주마다 1회 두 번째 투여 | |
Day 45 | ||
Day 48 | ||
Day 49 | 주 1회 투여를 위한 네 번째 주사 | |
Day 55 | ||
Day 56 | 부검 |
재조합 LAL로 치료된 LAL-/- 쥐의 병리학적 검사
실시예 1에서 기술된 연구의 종결 시점에서, 연구 동물은 무통 안락사되고 육안 병리, 조직병리, 그리고 임상적 화학을 조사하기 위해 부검되었다. 육안 부검(gross necropsy)은 신체, 모든 구멍, 그리고 두개강 (cranial cavity), 흉강 (thoracic cavity)과 복강 (abdominal cavity)의 외부 표면 및 그들의 내용물의 검사를 포함하였다. 내부 장기와 조직의 크기는 쥐에 대해 결정되고, 그리고 장기와 조직은 수확되고 10% 중성-완충된 포르말린에 고정되었다. 고정후, 이들 조직은 처리되고, 그리고 헤마톡실린과 에오인-염색된 섹션의 조직 슬라이드가 준비되고 평가되었다.
분석된 치료 동물의 육안 병리 검사는 도 30에 도시된 해부체에서 확인할 수 있는 바와 같이, 간 크기와 색깔에서 실질적인 정상화를 보였다. 장기-대-체중 비율이 측정되고, 그리고 위약 치료된 쥐와 비교하여, 해부된 성공적으로 치료된 동물에서 간, 비장, 장간막 조직, 십이지장, 공장과 회장에 대한 상대적 장기 크기에서 감소를 증명하였다 (도 23). 분석된 치료 쥐의 LAL로부터 간 조직의 조직병리는 위약-치료된 동물에서 거품 대식세포의 실질적인 축적과 현저하게 대조적으로, 본질적으로 정상적인 간 조직구조를 보인다 (도 30).
실시예 18
재조합 LAL의 투여에 의한 월만병 (WD)의 치료
7주령에 1명 여아 환자가 출생후 체중 증가의 어려움 및 불량한 경과로 인하여 병원에 입원한다. 최초 신체검사에서, 환자는 체중이 3.6 kg (출생시 체중 3.7 kg)이고 야위고 피하 지방 (skin fold)이 헐거웠다. 복부는 6 cm의 딱딱한 간종 및 약 4 cm의 딱딱한 비종으로 팽창하였다. 림프절 비대가 샅고랑부위 (groin)에서 관찰되고, 그리고 근육 활성이 약하다.
최초 헤모글로빈 수준은 9.2 gm이고, 혈소판은 506,000개, 그리고 백혈구는 11,550개이다. 검뇨 (urinalysis)는 정상이고, 그리고 골수 도말표본 (bone marrow smear)은 공포 림프구 (vacuolated lymphocyte) 및 다수의 거품 세포를 드러낸다. 혈청 화학적 치수: 총 지질 834 mg/ 100 ㎖, 인지질 176 mg/ 100 ㎖, 트리글리세리드 141 mg/ 100 ㎖, 콜레스테롤 129 mg/ 100 ㎖, 빌리루빈 0.3 mg/ 100 ㎖, 알칼리성 포스파타아제 9.0 BU %, SGOT 90 단위, SGPT 50 단위, 콜린에스테라아제 20 단위, 요소 질소 8.3 mg, 공복시 당 45 mg/ 100 ㎖. 복부의 CT 스캔은 석회화와 함께 간비장비대 및 양측의 대칭적으로 비대해진 부신을 보여준다.
상기 환자는 투약을 위해 정맥 혈관 접근 포트 (venous vascular access port)가 외과적으로 이식된다. 상기 포트를 이동 주사 기계에 연결한 이후, 환자는 잠재적 과민성 주사 반응을 상쇄하기 위해, LAL 주사보다 20분 앞서 1 ㎎/㎏의 디펜히드라민으로 사전 치료된다. 환자는 이후, 5시간에 걸쳐 정맥내 주사에 의해 1 ㎎/㎏의 LAL가 투여된다. 이러한 요법은 7일마다 1회 무기한으로 반복된다.
LAL의 첫 번째 복용량을 투여하고 2주 이내에, 상기 환자는 체중 증가에서 유의미한 향상, 그리고 초음파에 의한 측정에서 핵심 복부 장기의 크기에서 정상화를 경험한다. 실험실 결과는 LAL의 주사가 환자에서 리소솜성 산 리파아제 활성을 복원하고 관련된 비정상의 교정을 유발한다는 것을 증명한다.
실시예 19
재조합 LAL의 투여에 의한 콜레스테롤 에스테르 축적병 (CESD)의 치료
소양성 복부 발진 (pruritic abdominal rash)을 앓는 3세 남아는 의사에 의해 검사된다. 복부 검사 시에, 간종이 의사에 의해 관찰되고 초음파에 의해 확증된다. 이 시점에서, 진단은 이루어지지 않고, 그리고 환자는 주기적으로 모니터링된다.
8세 시점에, 그는 위장염으로 병원에 입원한다. 간 생검의 광 검경은 간세포에서 증가된 세포질내 글리코겐과 작은 지질 비말을 보여준다. 전자 검경은 작은 전자 과립을 갖는 막-결합된 지질 비말을 보여준다. 당원병 타입 III (탈분지 질환)의 작업 진단이 이루어지지만, 피부 섬유아세포 탈분지 활성이 정상적이다.
10세 시점에, 간종이 지속하고 두 번째 간 생검이 채취된다. 광 검경은 경미한 문맥주위 섬유증과 함께 세포질 과립과 액포를 내포하는 비대해진 간세포를 갖는 간 유조직의 변화된 소엽 구조 (lobular architecture)를 보여준다. 섬유아세포 산 리파아제 활성은 정상의 7%인 것으로 관찰되는데, 이것은 CESD의 진단을 확증한다. 총 콜레스테롤 (TC), 트리글리세리드 (TG), 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDL-C)의 혈장 농도는 각각, 7.51, 3.24와 5.58 mmol/L로 연령과 성별에 대한 95번째 백분위수 (percentile)를 초과하는 반면, 혈장 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C)은 0.47 mmol/L로 5번째 백분위수보다 낮다; 그는 복합 고지혈증 (고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 저알파지질단백질혈증 및 고베타지질단백질혈증)을 앓는다.
상기 환자는 투약을 위해 정맥 혈관 접근 포트 (venous vascular access port)가 외과적으로 이식된다. 상기 포트를 이동 주사 기계에 연결한 이후, 환자는 잠재적 과민성 주사 반응을 상쇄하기 위해, LAL 주사보다 20분 앞서 5 ㎎/㎏의 디펜히드라민으로 사전 치료된다. 환자는 이후, 5시간에 걸쳐 정맥내 주사에 의해 5 ㎎/㎏의 LAL가 투여된다. 이러한 요법은 14일마다 1회 무기한으로 반복된다.
LAL의 첫 번째 복용량을 투여하고 2주 이내에, 상기 환자는 체중 증가에서 유의미한 향상, 그리고 초음파에 의한 측정에서 핵심 장기의 크기에서 정상화를 경험한다. 실험실 결과는 LAL의 주사가 환자에서 리소솜성 산 리파아제 활성을 복원하고 관련된 비정상의 교정을 유발한다는 것을 증명한다.
실시예 20
의약 산물의 설명과 조성
본 명세서에서 기술된 LAL의 약물 물질 ("SBC-102")은 유전자도입 닭 (Gallus)으로부터 생산된 흰자위로부터 정제된 재조합 인간 리소솜성 산 리파아제 (rhLAL)이다. SBC-102에 이용된 부형제는 현재 시판 중인 리소솜 축적병 (LSD)에 대한 다른 산물에 이용되는 것들과 유사하고, 그리고 약물 산물의 안정성을 유지하도록 선택된다.
SBC-102는 비-천연 라텍스 (부틸), FluroTec®-코팅된 마개와 알루미늄 봉인 (aluminum crimp seal)을 갖는 투명한 타입 I 붕규산염 유리 바이알에 담겨 제공되는 투명한 무색 무균 액체이다. SBC-102는 SBC-102 (2 mg/㎖), 구연산나트륨 이수화물 (13.7 mg/㎖, USP), 구연산 일수화물 (1.57 mg/㎖, USP), 인간 혈청 알부민 (10 mg/㎖, USP), 그리고 주사용수 (최종 부피까지, USP)로 구성되는 수성 용액으로 제공된다. SBC-102의 pH는 5.9 ± 0.2이다. SBC-102는 보존제를 내포하지 않고, 그리고 바이알은 1회용으로만 의도된다.
부형제 | CAS 번호 | 등급 | 기능 |
구연산나트륨 이수화물 | 6132-04-03 | USP | 완충제 |
구연산 일수화물 | 5949-29-1 | USP | 완충제 |
인간 혈청 알부민 | 70024-90-7 | USP | 안정제 |
약물 산물의 성분
성분 | 농도 |
SBC-102 | 2 mg/㎖* |
구연산나트륨 이수화물 | 13.7 mg/㎖ |
구연산 일수화물 | 1.57 mg/㎖ |
인간 혈청 알부민 | 10 mg/㎖ |
주사용수, QS | 1.0 ㎖ |
상기 명세서에서 각 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되고 본 발명을 한정하지 않는다. 실제로, 본 발명의 범위 또는 기술적 사상을 벗어나지 않는 다양한 변형, 조합, 부가, 결실과 변이가 본 발명에서 만들어 질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 가령, 한 구체예의 일부로서 예시되거나 기술된 특징은 또 다른 구체예를 산출하기 위해 다른 구체예에서 이용될 수 있다. 본 발명은 이런 변형, 조합, 부가, 결실, 그리고 변이를 커버하는 것으로 의도된다.
상기 명세서에서 인용된 모든 문헌 (가령, U.S. 특허, U.S. 특허 출원, 간행물)은 본 발명에 참고문헌으로 편입된다. 본 발명의 범위 또는 기술적 사상을 벗어나지 않는 본 발명의 다양한 변형과 변이는 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명이 예시적 구체예와 관련하여 특정하게 도시되고 기술되긴 했지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는, 형태와 상세에서 다양한 변화가 만들어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> SYNAGEVA BIOPHARMA CORP.
<120> LYSOSOMAL STORAGE DISEASE ENZYME
<130> SYN-079PCT
<140> PCT/US2011/033699
<141> 2011-04-23
<150> US 61/343,177
<151> 2010-04-23
<150> US 61/396,376
<151> 2010-05-26
<150> US 61/403,011
<151> 2010-09-09
<150> US 61/456,014
<151> 2010-10-29
<150> US 61/432,372
<151> 2011-01-13
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 1
Met Lys Met Arg Phe Leu Gly Leu Val Val Cys Leu Val Leu Trp Thr
1 5 10 15
Leu His Ser Glu Gly Ser Gly Gly Lys Leu Thr Ala Val Asp Pro Glu
20 25 30
Thr Asn Met Asn Val Ser Glu Ile Ile Ser Tyr Trp Gly Phe Pro Ser
35 40 45
Glu Glu Tyr Leu Val Glu Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Cys Leu Asn
50 55 60
Arg Ile Pro His Gly Arg Lys Asn His Ser Asp Lys Gly Pro Lys Pro
65 70 75 80
Val Val Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Trp Val
85 90 95
Thr Asn Leu Ala Asn Ser Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly
100 105 110
Phe Asp Val Trp Met Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ser Arg Lys
115 120 125
His Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Asp Glu Phe Trp Ala Phe Ser Tyr
130 135 140
Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Ser Ile Asn Phe Ile Leu
145 150 155 160
Asn Lys Thr Gly Gln Glu Gln Val Tyr Tyr Val Gly His Ser Gln Gly
165 170 175
Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Gln Ile Pro Glu Leu Ala Lys
180 185 190
Arg Ile Lys Met Phe Phe Ala Leu Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Phe
195 200 205
Cys Thr Ser Pro Met Ala Lys Leu Gly Arg Leu Pro Asp His Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Leu Phe Gly Asp Lys Glu Phe Leu Pro Gln Ser Ala Phe Leu
225 230 235 240
Lys Trp Leu Gly Thr His Val Cys Thr His Val Ile Leu Lys Glu Leu
245 250 255
Cys Gly Asn Leu Cys Phe Leu Leu Cys Gly Phe Asn Glu Arg Asn Leu
260 265 270
Asn Met Ser Arg Val Asp Val Tyr Thr Thr His Ser Pro Ala Gly Thr
275 280 285
Ser Val Gln Asn Met Leu His Trp Ser Gln Ala Val Lys Phe Gln Lys
290 295 300
Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Ser Ala Lys Asn Tyr Phe His Tyr
305 310 315 320
Asn Gln Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Asn Val Lys Asp Met Leu Val Pro
325 330 335
Thr Ala Val Trp Ser Gly Gly His Asp Trp Leu Ala Asp Val Tyr Asp
340 345 350
Val Asn Ile Leu Leu Thr Gln Ile Thr Asn Leu Val Phe His Glu Ser
355 360 365
Ile Pro Glu Trp Glu His Leu Asp Phe Ile Trp Gly Leu Asp Ala Pro
370 375 380
Trp Arg Leu Tyr Asn Lys Ile Ile Asn Leu Met Arg Lys Tyr Gln
385 390 395
<210> 2
<211> 378
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 2
Ser Gly Gly Lys Leu Thr Ala Val Asp Pro Glu Thr Asn Met Asn Val
1 5 10 15
Ser Glu Ile Ile Ser Tyr Trp Gly Phe Pro Ser Glu Glu Tyr Leu Val
20 25 30
Glu Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Cys Leu Asn Arg Ile Pro His Gly
35 40 45
Arg Lys Asn His Ser Asp Lys Gly Pro Lys Pro Val Val Phe Leu Gln
50 55 60
His Gly Leu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Trp Val Thr Asn Leu Ala Asn
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Phe Asp Val Trp Met
85 90 95
Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ser Arg Lys His Lys Thr Leu Ser
100 105 110
Val Ser Gln Asp Glu Phe Trp Ala Phe Ser Tyr Asp Glu Met Ala Lys
115 120 125
Tyr Asp Leu Pro Ala Ser Ile Asn Phe Ile Leu Asn Lys Thr Gly Gln
130 135 140
Glu Gln Val Tyr Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe
145 150 155 160
Ile Ala Phe Ser Gln Ile Pro Glu Leu Ala Lys Arg Ile Lys Met Phe
165 170 175
Phe Ala Leu Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Phe Cys Thr Ser Pro Met
180 185 190
Ala Lys Leu Gly Arg Leu Pro Asp His Leu Ile Lys Asp Leu Phe Gly
195 200 205
Asp Lys Glu Phe Leu Pro Gln Ser Ala Phe Leu Lys Trp Leu Gly Thr
210 215 220
His Val Cys Thr His Val Ile Leu Lys Glu Leu Cys Gly Asn Leu Cys
225 230 235 240
Phe Leu Leu Cys Gly Phe Asn Glu Arg Asn Leu Asn Met Ser Arg Val
245 250 255
Asp Val Tyr Thr Thr His Ser Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Met
260 265 270
Leu His Trp Ser Gln Ala Val Lys Phe Gln Lys Phe Gln Ala Phe Asp
275 280 285
Trp Gly Ser Ser Ala Lys Asn Tyr Phe His Tyr Asn Gln Ser Tyr Pro
290 295 300
Pro Thr Tyr Asn Val Lys Asp Met Leu Val Pro Thr Ala Val Trp Ser
305 310 315 320
Gly Gly His Asp Trp Leu Ala Asp Val Tyr Asp Val Asn Ile Leu Leu
325 330 335
Thr Gln Ile Thr Asn Leu Val Phe His Glu Ser Ile Pro Glu Trp Glu
340 345 350
His Leu Asp Phe Ile Trp Gly Leu Asp Ala Pro Trp Arg Leu Tyr Asn
355 360 365
Lys Ile Ile Asn Leu Met Arg Lys Tyr Gln
370 375
<210> 3
<211> 376
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 3
Gly Lys Leu Thr Ala Val Asp Pro Glu Thr Asn Met Asn Val Ser Glu
1 5 10 15
Ile Ile Ser Tyr Trp Gly Phe Pro Ser Glu Glu Tyr Leu Val Glu Thr
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Cys Leu Asn Arg Ile Pro His Gly Arg Lys
35 40 45
Asn His Ser Asp Lys Gly Pro Lys Pro Val Val Phe Leu Gln His Gly
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Trp Val Thr Asn Leu Ala Asn Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gly Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Phe Asp Val Trp Met Gly Asn
85 90 95
Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ser Arg Lys His Lys Thr Leu Ser Val Ser
100 105 110
Gln Asp Glu Phe Trp Ala Phe Ser Tyr Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp
115 120 125
Leu Pro Ala Ser Ile Asn Phe Ile Leu Asn Lys Thr Gly Gln Glu Gln
130 135 140
Val Tyr Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala
145 150 155 160
Phe Ser Gln Ile Pro Glu Leu Ala Lys Arg Ile Lys Met Phe Phe Ala
165 170 175
Leu Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Phe Cys Thr Ser Pro Met Ala Lys
180 185 190
Leu Gly Arg Leu Pro Asp His Leu Ile Lys Asp Leu Phe Gly Asp Lys
195 200 205
Glu Phe Leu Pro Gln Ser Ala Phe Leu Lys Trp Leu Gly Thr His Val
210 215 220
Cys Thr His Val Ile Leu Lys Glu Leu Cys Gly Asn Leu Cys Phe Leu
225 230 235 240
Leu Cys Gly Phe Asn Glu Arg Asn Leu Asn Met Ser Arg Val Asp Val
245 250 255
Tyr Thr Thr His Ser Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Met Leu His
260 265 270
Trp Ser Gln Ala Val Lys Phe Gln Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly
275 280 285
Ser Ser Ala Lys Asn Tyr Phe His Tyr Asn Gln Ser Tyr Pro Pro Thr
290 295 300
Tyr Asn Val Lys Asp Met Leu Val Pro Thr Ala Val Trp Ser Gly Gly
305 310 315 320
His Asp Trp Leu Ala Asp Val Tyr Asp Val Asn Ile Leu Leu Thr Gln
325 330 335
Ile Thr Asn Leu Val Phe His Glu Ser Ile Pro Glu Trp Glu His Leu
340 345 350
Asp Phe Ile Trp Gly Leu Asp Ala Pro Trp Arg Leu Tyr Asn Lys Ile
355 360 365
Ile Asn Leu Met Arg Lys Tyr Gln
370 375
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<211> 373
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 4
Thr Ala Val Asp Pro Glu Thr Asn Met Asn Val Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Tyr Trp Gly Phe Pro Ser Glu Glu Tyr Leu Val Glu Thr Glu Asp Gly
20 25 30
Tyr Ile Leu Cys Leu Asn Arg Ile Pro His Gly Arg Lys Asn His Ser
35 40 45
Asp Lys Gly Pro Lys Pro Val Val Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala
50 55 60
Asp Ser Ser Asn Trp Val Thr Asn Leu Ala Asn Ser Ser Leu Gly Phe
65 70 75 80
Ile Leu Ala Asp Ala Gly Phe Asp Val Trp Met Gly Asn Ser Arg Gly
85 90 95
Asn Thr Trp Ser Arg Lys His Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Asp Glu
100 105 110
Phe Trp Ala Phe Ser Tyr Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala
115 120 125
Ser Ile Asn Phe Ile Leu Asn Lys Thr Gly Gln Glu Gln Val Tyr Tyr
130 135 140
Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Gln
145 150 155 160
Ile Pro Glu Leu Ala Lys Arg Ile Lys Met Phe Phe Ala Leu Gly Pro
165 170 175
Val Ala Ser Val Ala Phe Cys Thr Ser Pro Met Ala Lys Leu Gly Arg
180 185 190
Leu Pro Asp His Leu Ile Lys Asp Leu Phe Gly Asp Lys Glu Phe Leu
195 200 205
Pro Gln Ser Ala Phe Leu Lys Trp Leu Gly Thr His Val Cys Thr His
210 215 220
Val Ile Leu Lys Glu Leu Cys Gly Asn Leu Cys Phe Leu Leu Cys Gly
225 230 235 240
Phe Asn Glu Arg Asn Leu Asn Met Ser Arg Val Asp Val Tyr Thr Thr
245 250 255
His Ser Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Met Leu His Trp Ser Gln
260 265 270
Ala Val Lys Phe Gln Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Ser Ala
275 280 285
Lys Asn Tyr Phe His Tyr Asn Gln Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Asn Val
290 295 300
Lys Asp Met Leu Val Pro Thr Ala Val Trp Ser Gly Gly His Asp Trp
305 310 315 320
Leu Ala Asp Val Tyr Asp Val Asn Ile Leu Leu Thr Gln Ile Thr Asn
325 330 335
Leu Val Phe His Glu Ser Ile Pro Glu Trp Glu His Leu Asp Phe Ile
340 345 350
Trp Gly Leu Asp Ala Pro Trp Arg Leu Tyr Asn Lys Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Met Arg Lys Tyr Gln
370
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<211> 1150
<212> DNA
<213> HOMO SAPIENS
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atgaaaatgc ggttcttggg gttggtggtc tgtttggttc tctggaccct gcattccgag 60
gggtccggag ggaaactgac agctgtggat cctgaaacaa acatgaatgt cagtgaaatt 120
atctcttact ggggattccc tagtgaggaa tacctagttg agacagaaga tggatatatt 180
ctgtgcctta accgaattcc tcatgggagg aagaaccatt ctgacaaagg tcccaaacca 240
gttgtcttcc tgcaacatgg cttgctggca gattctagta actgggtcac aaaccttgcc 300
aacagcagcc tgggcttcat tcttgctgat gctggttttg acgtgtggat gggcaacagc 360
agaggaaata cctggtctcg gaaacataag acactctcag tttctcagga tgaattctgg 420
gctttcagtt atgatgagat ggcaaaatat gacctaccag cttccattaa cttcattctg 480
aataagactg gccaagaaca agtgtattat gtgggtcatt ctcaaggcac cactataggt 540
tttatagcat tttcacagat ccctgagctg gctaaaagga ttaaaatgtt ttttgccctg 600
ggtcctgtgg cttccgtcgc cttctgtact agccctatgg ccaaactggg acgactgcca 660
gatcatctca ttaaggacct ctttggagac aaagaatttc ttccccagag tgcgtttttg 720
aagtggctgg gtacccacgt ttgcactcat gtcatactga aggagctctg tggaaatctc 780
tgttttcttc tgtgtggatt taatgagaga aatttaaata tgtctagagt ggatgtgtat 840
acaacacatt ctcctgctgg aacttctgtg caaaacatgt tacactggag ccaggctgtt 900
aaattccaaa agtttcaagc ctttgactgg ggaagcagtg ccaagaatta ttttcattac 960
aaccagagtt atcctcccac atacaatgtg aaggacatgc ttgtgccgac tgcagtctgg 1020
agcgggggtc acgactggct tgcagatgtc tacgacgtca atatcttact gactcagatc 1080
accaacttgg tgttccatga gagcattccg gaatgggagc atcttgactt catttggggc 1140
ctggatgccc 1150
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<211> 10882
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pALVIN-OVR1-I-SBC102-dSA
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ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 60
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atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 180
ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 240
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 300
taacaaaata ttaacgctta caatttccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 360
gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca 420
aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 480
agtgagcgcg tattccctaa cgatcacgtc ggggtcacca aatgaagcct tctgcttcat 540
gcatgtgctc gtagtcgtca gggaatcaac ggtccggcca tcaacccagg tgcacaccaa 600
tgtggtgaat ggtcaaatgg cgtttattgt atcgagctag gcacttaaat acaatatctc 660
tgcaatgcgg aattcagtgg ttcgtccaat ccgtccccct ccctatgcaa aagcgaaact 720
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tgctattgtc ccctcagtca agccttgccc gttacaaccc gattcgcaag ccttgccctc 840
cccacattat ccgtagcatt atttcctagc agtcatcaga gctacagaag atactctatg 900
ctgtagccaa gtctacaagt ttactattca gcgacctcct atattccgcg tgccagccga 960
tcaattacca atccaaccag ctatcacacg gaatacaaga actcgcctac gctcttcttt 1020
cgggctgctt ataagcctcc tgtaattttt ttatattcct cgctcgagtc tcttcagaat 1080
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gacctgatac ctgattttct tcaaacaggg gaaacaacac aatcccacaa aacagctcag 1200
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tccttcctaa tgttaaaatt gtagtggcaa agaggagaac aaaatctcaa gttctgagta 1440
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tttagggaca gacccacaat gaaatgcctg gcataggaaa gggcagcaga gccttagctg 1620
accttttctt gggacaagca ttgtcaaaca atgtgtgaca aaactatttg tactgctttg 1680
cacagctgtg ctgggcaggg caatccattg ccacctatcc caggtaacct tccaactgca 1740
agaagattgt tgcttactct ctctagaccc ccaagtcaaa ccaactatgc aggtatgctg 1800
acaacactat gatgacagcc tgttctgatc aagatctcat ttgttcatgg acaatttttg 1860
ttgcttgcag ctggtcttcc attgggaaag agtgtagtat atccttctca tctgacagaa 1920
aagcagaaat tctcatgctc cacacttaat ctacattgtt ttaaaccacc ggctacttct 1980
tggagaggaa aaatggcttt tataagactc acaaaacaaa gctctgcaag tcaaatgcat 2040
acaaaactgt tctgtaggtc tggaatcagg acactatgtg gaagtcaaat agagcagctt 2100
taaaaagcct ttgggatcat tctcatctta tatttgcagc acgatactat gacagtgata 2160
actgacataa ctgcatcaat ttccttgata ttttatttgt cttaaagtac aagacataga 2220
gatggacgta aagatggaca tatgactcag gtctggacag gtccgtggtc catgtatgat 2280
aaaagagatg aagggaagga gaattgagac tgtctaagaa gggcttcagg gacgttctga 2340
aggcagattt gactgaatca gatgtactgt ccaagtctca tatgtagcaa tggaaggctg 2400
atattggaga aatataaaga aatggctgtg aactcaaagt gaccctgaac agaaaaggga 2460
tatggagtta aaataatgtc acagaactga ggtttatatg atataccatg ggctgcagag 2520
ggtcagagtg ctccaccatg ggcctctctt gggctgcagg gaacttctgt tctacacctg 2580
gaacacctcc tgccctcctc cgcactgacc tcagtgtcat cagggctgtt tctctcacat 2640
tttctcactc acctctccca actaccattg tacagcagtt gttcttacat attgctcctc 2700
ctgaggtaca tctagcatcg ttaagtcctc agacttggca aggagaatgt agatttccac 2760
agtatatatg ttttcacaaa aggaaggaga gaaacaaaag aaaatggcac tgactaaact 2820
tcagctagtg gtataggaaa gtaattctgc ttaacagaga ttgcagtgat ctctatgtat 2880
gtcctgaaga attatgttgt acttttttcc cccattttta aatcaaacag tgctttacag 2940
aggtcagaat ggtttcttta ctgtttgtca attctattat ttcaatacag aacaatagct 3000
tctataactg aaatatattt gctattgtat attatgattg tccctcgaac catgaacact 3060
cctccagctg aatttcacaa ttcctctgtc atctgccagg ccattaagtt attcatggaa 3120
gatctttgag gaacactgca agttcatatc ataaacacat ttgaaattga gtattgtttt 3180
gcattgtatg gagctatgtt ttgctgtatc ctcagaataa aagtttgtta taaagcattc 3240
acacccataa aaagatagat ttaaatattc caactatagg aaagaaagtg tgtctgctct 3300
tcactctagt ctcagttggc tccttcacat gcacgcttct ttatttctcc tattttgtca 3360
agaaaataat aggtcaagtc ttgttctcat ttatgtcctg tctagcgtgg ctcagatgca 3420
cattgtacat acaagaagga tcaaatgaaa cagacttctg gtctgttact acaaccatag 3480
taataagcac actaactaat aattgctaat tatgttttcc atctccaagg ttcccacatt 3540
tttctgtttt cttaaagatc ccattatctg gttgtaactg aagctcaatg gaacatgagc 3600
aatatttccc agtcttctct cccatccaac agtcctgatg gattagcaga acaggcagaa 3660
aacacattgt tacccagaat taaaaactaa tatttgctct ccattcaatc caaaatggac 3720
ctattgaaac taaaatctaa cccaatccca ttaaatgatt tctatggtgt caaaggtcaa 3780
acttctgaag ggaacctgtg ggtgggtcac aattcagact atatattccc cagggctcag 3840
ccagtgtctg tacatacagc tagaaagctg tattgccttt agcagtcaag ctcgaaaggt 3900
aagcaactct ctggaattac cttctctcta tattagctct tacttgcacc taaactttaa 3960
aaaattaaca attattgtgc tatgtgttgt atctttaagg gtgaagtacc tgcgtgatac 4020
cccctataaa aacttctcac ctgtgtatgc attctgcact attttattat gtgtaaaagc 4080
tttgtgtttg ttttcaggag gcttattctt tgtgcttaaa atatgttttt aatttcagaa 4140
catcttatcc tgtcgttcac tatctgatat gctttgcagt ttgcttgatt aacttctagc 4200
cctacagagt gcacagagag caaaatcatg gtgttcagtg aattctgggg agttatttta 4260
atgtgaaaat tctctagaag tttaattcct gcaaagtgca gctgctgatc actacacaag 4320
ataaaaatgt ggggggtgca taaacgtata ttcttacaat aatagataca tgtgaactta 4380
tatacagaaa agaaaatgag aaaaatgtgt gtgtgtatac tcacacacgt ggtcagtaaa 4440
aacttttgag gggtttaata cagaaaatcc aatcctgagg ccccagcact cagtacgcat 4500
ataaagggct gggctctgaa ggacttctga ctttcacaga ttatataaat ctcaggaaag 4560
caactagatt catgctggct ccaaaagctg tgctttatat aagcacactg gctatacaat 4620
agttgtacag ttcagctctt tataatagaa acagacagaa caagtataaa tcttctattg 4680
gtctatgtca tgaacaagaa ttcattcagt ggctctgttt tatagtaaac attgctattt 4740
tatcatgtct gcatttctct tctgtctgaa tgtcaccact aaaatttaac tccacagaaa 4800
gtttatacta cagtacacat gcatatcttt gagcaaagca aaccatacct gaaagtgcaa 4860
tagagcagaa tatgaattac atgcgtgtct ttctcctaga ctacatgacc ccatataaat 4920
tacattcctt atctattctg ccatcaccaa aacaaaggta aaaatacttt tgaagatcta 4980
ctcatagcaa gtagtgtgca acaaacagat atttctctac atttattttt agggaataaa 5040
aataagaaat aaaatagtca gcaagcctct gctttctcat atatctgtcc aaacctaaag 5100
tttactgaaa tttgctcttt gaatttccag ttttgcaagc ctatcagatt gtgttttaat 5160
cagaggtact gaaaagtatc aatgaattct agctttcact gaacaaaaat atgtagaggc 5220
aactggcttc tgggacagtt tgctacccaa aagacaactg aatgcaaata cataaataga 5280
tttatgaata tggttttgaa catgcacatg agaggtggat atagcaacag acacattacc 5340
acagaattac tttaaaacta cttgttaaca tttaattgcc taaaaactgc tcgtaattta 5400
ctgttgtagc ctaccataga gtaccctgca tggtactatg tacagcattc catccttaca 5460
ttttcactgt tctgctgttt gctctagaca actcagagtt caccatgaaa atgcggttct 5520
tggggttggt ggtctgtttg gttctctgga ccctgcattc cgaggggtcc ggagggaaac 5580
tgacagctgt ggatccagaa acaaacatga atgtcagtga aattatctct tactggggat 5640
tccctagtga ggaataccta gttgagacag aagatggata tattctgtgc cttaaccgaa 5700
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tcgccttctg tactagccct atggccaaac tgggacgact gccagatcat ctcattaagg 6180
acctctttgg agacaaagaa tttcttcccc agagtgcgtt tttgaagtgg ctgggtaccc 6240
acgtttgcac tcatgtcata ctgaaggagc tctgtggaaa tctctgtttt cttctgtgtg 6300
gatttaatga gagaaattta aatatgtcta gagtggatgt gtatacaaca cattctcctg 6360
ctggaacttc tgtgcaaaac atgttacact ggagccaggc tgttaaattc caaaagtttc 6420
aagcctttga ctggggaagc agtgccaaga attattttca ttacaaccag agttatcctc 6480
ccacatacaa tgtgaaggac atgcttgtgc cgactgcagt ctggagcggg ggtcacgact 6540
ggcttgcaga tgtctacgac gtcaatatct tactgactca gatcaccaac ttggtgttcc 6600
atgagagcat tccggaatgg gagcatcttg acttcatttg gggcctggat gccccttgga 6660
ggctttataa taagattatt aatctaatga ggaaatatca gtgattcgaa gcggccgcaa 6720
gaagaaagct gaaaaactct gtcccttcca acaagaccca gagcactgta gtatcagggg 6780
taaaatgaaa agtatgttat ctgctgcatc cagacttcat aaaagctgga gcttaatcta 6840
gaaaaaaaat cagaaagaaa ttacactgtg agaacaggtg caattcactt ttcctttaca 6900
cagagtaata ctggtaactc atggatgaag gcttaaggga atgaaattgg actcacagta 6960
ctgagtcatc acactgaaaa atgcaacctg atacatcagc agaaggttta tgggggaaaa 7020
atgcagcctt ccaattaagc cagatatctg tatgaccaag ctgctccaga attagtcact 7080
caaaatctct cagattaaat tatcaactgt caccaaccat tcctatgctg acaaggcaat 7140
tgcttgttct ctgtgttcct gatactacaa ggctcttcct gacttcctaa agatgcatta 7200
taaaaatctt ataattcaca tttctcccta aactttgact caatcatggt atgttggcaa 7260
atatggtata ttactattca aattgttttc cttgtaccca tatgtaatgg gtcttgtgaa 7320
tgtgctcttt tgttccttta atcataataa aaacatgttt aagcaaacac ttttcacttg 7380
tagtatttga aggtaccgga tctcgagccg ccttcaatgc ccccaaaacc aatccccagg 7440
tttttaactc tcccgatttt ccaagtacca tagcccgctg agagagcgcc gcggtaatgg 7500
gatcccagga ccccggggaa tataagtctg agggggacgt aagcaaccct tccttttgta 7560
acagggacaa catagcccct atttccttct tagaaggaga ggttttcccg caataggtct 7620
tacacgcgga cgaaatcacc tttatgacgg cttccatgct tgatccaccg ggcgaccgga 7680
atcacgcaga gcaaccggaa tcacgcctgg ggtggaccgc tcagtcgtcg ggcttccttc 7740
ccgtcttcca acgactctct gagttctcgg tagggtatgt tggccccctg cagtagggct 7800
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gtccgctccc cgaataagcg agacggatga ggacaggatc gccacgccgc ctgtggccga 7920
ccactattcc ctaacgatca cgtcggggtc accaaatgaa gccttctgct tcatgcatgt 7980
gctcgtagtc gtcagggaat caacggtccg gccatcaacc caggtgcaca ccaatgtggt 8040
gaatggtcaa atggcgttta ttgtatcgag ctaggcactt aaatacaata tctctgcaat 8100
gcggaattca gtggttcgtc caatccgtgt tagacccgtc tgttgccttc ctaacaaggc 8160
acgatcatac cacgatcata ccaccttact cccaccaatc ggcatgcacg gtgctttttc 8220
tctccttata aggcatgttg ctaactcatc gttacataag catgttgcaa gactacaaga 8280
gtattgcata agactacatt tccccctccc tatgcaaaag cgaaactact atatcctgag 8340
gggactccta accgcgtaca accgaagccc cgcttttcgc ctaaacatgc tattgtcccc 8400
tcagtcaagc cttgcccgtt acaacccgat tcgcaagcct tgccctcccc acattatccg 8460
tagcattatt tcctagcagt catcagagct acagaagata ctctatgctg tagccaagtc 8520
tacaagttta ctattcagcg acctcctata ttccgcgtgc cagccgatca attaccaatg 8580
cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 8640
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 8700
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 8760
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acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 9000
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 9060
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 9120
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 9180
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actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 9360
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 9420
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gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 9600
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 9660
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 9720
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 9780
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 9840
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 9900
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 9960
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 10020
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 10080
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 10140
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 10200
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 10260
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 10320
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 10380
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cctttctcgc cacgttcgcc gg 10882
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<211> 7780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Proviral sequence of pALVIN-OVR1-I-SBC102-dSA
<400> 7
aatgaagcct tctgcttcat gcatgtgctc gtagtcgtca gggaatcaac ggtccggcca 60
tcaacccagg tgcacaccaa tgtggtgaat ggtcaaatgg cgtttattgt atcgagctag 120
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cttaaagtac aagacataga gatggacgta aagatggaca tatgactcag gtctggacag 1740
gtccgtggtc catgtatgat aaaagagatg aagggaagga gaattgagac tgtctaagaa 1800
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gaacttctgt tctacacctg gaacacctcc tgccctcctc cgcactgacc tcagtgtcat 2100
cagggctgtt tctctcacat tttctcactc acctctccca actaccattg tacagcagtt 2160
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aggagaatgt agatttccac agtatatatg ttttcacaaa aggaaggaga gaaacaaaag 2280
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ttgaaattga gtattgtttt gcattgtatg gagctatgtt ttgctgtatc ctcagaataa 2700
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pALVIN-OV-1.1-I
<220>
<221> misc_feature
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cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 5160
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 5220
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 5280
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 5340
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 5400
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 5460
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 5520
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 5580
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 5640
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 5700
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 5760
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 5820
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 5880
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 5940
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 6000
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 6060
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 6120
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 6180
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 6240
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 6300
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 6360
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 6420
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 6480
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 6540
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 6600
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 6660
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 6720
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 6780
ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 6840
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 6900
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 6960
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 7020
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 7080
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 7140
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 7200
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 7260
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 7320
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 7380
taaaacgacg gccagtgagc gcgtattccc taacgatcac gtcggggtca ccaaatgaag 7440
ccttctgctt catgcatgtg ctcgtagtcg tcagggaatc aacggtccgg ccatcaaccc 7500
aggtgcacac caatgtggtg aatggtcaaa tggcgtttat tgtatcgagc taggcactta 7560
aatacaatat ctctgcaatg cggaattcag tggttcgtcc aatccgtccc cctccctatg 7620
caaaagcgaa actactatat cctgagggga ctcctaaccg cgtacaaccg aagccccgct 7680
tttcgcctaa acatgctatt gtcccctcag tcaagccttg cccgttacaa cccgattcgc 7740
aagccttgcc ctccccacat tatccgtagc attatttcct agcagtcatc agagctacag 7800
aagatactct atgctgtagc caagtctaca agtttactat tcagcgacct cctatattcc 7860
gcgtgccagc cgatcaatta ccaatccaac cagctatcac acggaataca agaactcgcc 7920
tacgctcttc tttcgggctg cttataagcc tcctgtaatt tttttatatt cctcgttaag 7980
tcctcagact tggcaaggag aatgtagatt tccacagtat atatgttttc acaaaaggaa 8040
ggagagaaac aaaagaaaat ggcactgact aaacttcagc tagtggtata ggaaagtaat 8100
tctgcttaac agagattgca gtgatctcta tgtatgtcct gaagaattat gttgtacttt 8160
tttcccccat ttttaaatca aacagtgctt tacagaggtc agaatggttt ctttactgtt 8220
tgtcaattct attatttcaa tacagaacaa tagcttctat aactgaaata tatttgctat 8280
tgtatattat gattgtccct cgaaccatga acactcctcc agctgaattt cacaattcct 8340
ctgtcatctg ccaggccatt aagttattca tggaagatct ttgaggaaca ctgcaagttc 8400
atatcataaa cacatttgaa attgagtatt gttttgcatt gtatggagct atgttttgct 8460
gtatcctcag aataaaagtt tgttataaag cattcacacc cataaaaaga tagatttaaa 8520
tattccaact ataggaaaga aagtgtgtct gctcttcact ctagtctcag ttggctcctt 8580
cacatgcacg cttctttatt tctcctattt tgtcaagaaa ataataggtc aagtcttgtt 8640
ctcatttatg tcctgtctag cgtggctcag atgcacattg tacatacaag aaggatcaaa 8700
tgaaacagac ttctggtctg ttactacaac catagtaata agcacactaa ctaataattg 8760
ctaattatgt tttccatctc caaggttccc acatttttct gttttcttaa agatcccatt 8820
atctggttgt aactgaagct caatggaaca tgagcaatat ttcccagtct tctctcccat 8880
ccaacagtcc tgatggatta gcagaacagg cagaaaacac attgttaccc agaattaaaa 8940
actaatattt gctctccatt caatccaaaa tggacctatt gaaactaaaa tctaacccaa 9000
tcccattaaa tgatttctat ggtgtcaaag gtcaaacttc tgaagggaac ctgtgggtgg 9060
gtcacaattc agactatata ttccccaggg ctcagccagt gtctgtacat acagctagaa 9120
agctgtattg cctttagcag tcaagctcga aaggtaagca actctctgga attaccttct 9180
ctctatatta gctcttactt gcacctaaac tttaaaaaat taacaattat tgtgctatgt 9240
gttgtatctt taagggtgaa gtacctgcgt gataccccct ataaaaactt ctcacctgtg 9300
tatgcattct gcactatttt attatgtgta aaagctttgt gtttgttttc aggaggctta 9360
ttctttgtgc ttaaaatatg tttttaattt cagaacatct tatcctgtcg ttcactatct 9420
gatatgcttt gcagtttgct tgattaactt ctagccctac agagtgcaca gagagcaaaa 9480
tcatggtgtt cagtgaattc tggggagtta ttttaatgtg aaaattctct agaagtttaa 9540
ttcctgcaaa gtgcagctgc tgatcactac acaagataaa aatgtggggg gtgcataaac 9600
gtatattctt acaataatag atacatgtga acttatatac agaaaagaaa atgagaaaaa 9660
tgtgtgtgtg tatactcaca cacgtggtca gtaaaaactt ttgaggggtt taatacagaa 9720
aatccaatcc tgaggcccca gcactcagta cgcatataaa gggctgggct ctgaaggact 9780
tctgactttc acagattata taaatctcag gaaagcaact agattcatgc tggctccaaa 9840
agctgtgctt tatataagca cactggctat acaatagttg tacagttcag ctctttataa 9900
tagaaacaga cagaacaagt ataaatcttc tattggtcta tgtcatgaac aagaattcat 9960
tcagtggctc tgttttatag taaacattgc tattttatca tgtctgcatt tctcttctgt 10020
ctgaatgtca ccactaaaat ttaactccac agaaagttta tactacagta cacatgcata 10080
tctttgagca aagcaaacca tacctgaaag tgcaatagag cagaatatga attacatgcg 10140
tgtctttctc ctagactaca tgaccccata taaattacat tccttatcta ttctgccatc 10200
accaaaacaa aggtaaaaat acttttgaag atctactcat agcaagtagt gtgcaacaaa 10260
cagatatttc tctacattta tttttaggga ataaaaataa gaaataaaat agtcagcaag 10320
cctctgcttt ctcatatatc tgtccaaacc taaagtttac tgaaatttgc tctttgaatt 10380
tccagttttg caagcctatc agattgtgtt ttaatcagag gtactgaaaa gtatcaatga 10440
attctagctt tcactgaaca aaaatatgta gaggcaactg gcttctggga cagtttgcta 10500
cccaaaagac aactgaatgc aaatacataa atagatttat gaatatggtt ttgaacatgc 10560
acatgagagg tggatatagc aacagacaca ttaccacaga attactttaa aactacttgt 10620
taacatttaa ttgcctaaaa actgctcgta atttactgtt gtagcctacc atagagtacc 10680
ctgcatggta ctatgtacag cattccatcc ttacattttc actgttctgc tgtttgctct 10740
agacaactca gagttcacca tg 10762
<210> 9
<211> 242
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adaptor sequence
<400> 9
cccgggttgt taacatttaa ttgcctaaaa actgctcgta atttactgtt gtagcctacc 60
atagagtacc ctgcatggta ctatgtacag cattccatcc ttacattttc actgttctgc 120
tgtttgctct agacaactca gagttcacca tgaaaatgcg gttcttgggg ttggtggtct 180
gtttggttct ctggaccctg cattccgagg ggtccggagg gaaactgaca gctgtggatc 240
ct 242
<210> 10
<211> 1575
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Syn SBC102
<400> 10
ccattatctg gttgtaactg aagctcaatg gaacatgagc aatatttccc agtcttctct 60
cccatccaac agtcctgatg gattagcaga acaggcagaa aacacattgt tacccagaat 120
taaaaactaa tatttgctct ccattcaatc caaaatggac ctattgaaac taaaatctaa 180
cccaatccca ttaaatgatt tctatggtgt caaaggtcaa acttctgaag ggaacctgtg 240
ggtgggtcac aattcagact atatattccc cagggctcag ccagtgtctg tacatacagc 300
tagaaagctg tattgccttt agcagtcaag ctcgaaagac aactcagagt tcaccatgaa 360
aatgcggttc ttggggttgg tggtctgttt ggttctctgg accctgcatt ccgaggggtc 420
cggagggaaa ctgacagctg tggatcctga aacaaacatg aatgtcagtg aaattatctc 480
ttactgggga ttccctagtg aggaatacct agttgagaca gaagatggat atattctgtg 540
ccttaaccga attcctcatg ggaggaagaa ccattctgac aaaggtccca aaccagttgt 600
cttcctgcaa catggcttgc tggcagattc tagtaactgg gtcacaaacc ttgccaacag 660
cagcctgggc ttcattcttg ctgatgctgg ttttgacgtg tggatgggca acagcagagg 720
aaatacctgg tctcggaaac ataagacact ctcagtttct caggatgaat tctgggcttt 780
cagttatgat gagatggcaa aatatgacct accagcttcc attaacttca ttctgaataa 840
gactggccaa gaacaagtgt attatgtggg tcattctcaa ggcaccacta taggttttat 900
agcattttca cagatccctg agctggctaa aaggattaaa atgttttttg ccctgggtcc 960
tgtggcttcc gtcgccttct gtactagccc tatggccaaa ctgggacgac tgccagatca 1020
tctcattaag gacctctttg gagacaaaga atttcttccc cagagtgcgt ttttgaagtg 1080
gctgggtacc cacgtttgca ctcatgtcat actgaaggag ctctgtggaa atctctgttt 1140
tcttctgtgt ggatttaatg agagaaattt aaatatgtct agagtggatg tgtatacaac 1200
acattctcct gctggaactt ctgtgcaaaa catgttacac tggagccagg ctgttaaatt 1260
ccaaaagttt caagcctttg actggggaag cagtgccaag aattattttc attacaacca 1320
gagttatcct cccacataca atgtgaagga catgcttgtg ccgactgcag tctggagcgg 1380
gggtcacgac tggcttgcag atgtctacga cgtcaatatc ttactgactc agatcaccaa 1440
cttggtgttc catgagagca ttccggaatg ggagcatctt gacttcattt ggggcctgga 1500
tgccccttgg aggctttata ataagattat taatctaatg aggaaatatc agtgattcga 1560
agcggccgcc ccggg 1575
<210> 11
<211> 2789
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OVR1 promoter
<400> 11
ctcgagtctc ttcagaatgg cacagcaccg ctgcagaaaa atgccaggtg gactatgaac 60
tcacatccaa aggagcttga cctgatacct gattttcttc aaacagggga aacaacacaa 120
tcccacaaaa cagctcagag agaaaccatc actgatggct acagcaccaa ggtatgcaat 180
ggcaatccat tcgacattca tctgtgacct gagcaaaatg atttatctct ccatgaatgg 240
ttgcttcttt ccctcatgaa aaggcaattt ccacactcac aatatgcaac aaagacaaac 300
agagaacaat taatgtgctc cttcctaatg ttaaaattgt agtggcaaag aggagaacaa 360
aatctcaagt tctgagtagg ttttagtgat tggataagag gctttgacct gtgagctcac 420
ctggacttca tatccttttg gataaaaagt gcttttataa ctttcaggtc tccgagtctt 480
tattcatgag actgttggtt tagggacaga cccacaatga aatgcctggc ataggaaagg 540
gcagcagagc cttagctgac cttttcttgg gacaagcatt gtcaaacaat gtgtgacaaa 600
actatttgta ctgctttgca cagctgtgct gggcagggca atccattgcc acctatccca 660
ggtaaccttc caactgcaag aagattgttg cttactctct ctagaccccc aagtcaaacc 720
aactatgcag gtatgctgac aacactatga tgacagcctg ttctgatcaa gatctcattt 780
gttcatggac aatttttgtt gcttgcagct ggtcttccat tgggaaagag tgtagtatat 840
ccttctcatc tgacagaaaa gcagaaattc tcatgctcca cacttaatct acattgtttt 900
aaaccaccgg ctacttcttg gagaggaaaa atggctttta taagactcac aaaacaaagc 960
tctgcaagtc aaatgcatac aaaactgttc tgtaggtctg gaatcaggac actatgtgga 1020
agtcaaatag agcagcttta aaaagccttt gggatcattc tcatcttata tttgcagcac 1080
gatactatga cagtgataac tgacataact gcatcaattt ccttgatatt ttatttgtct 1140
taaagtacaa gacatagaga tggacgtaaa gatggacata tgactcaggt ctggacaggt 1200
ccgtggtcca tgtatgataa aagagatgaa gggaaggaga attgagactg tctaagaagg 1260
gcttcaggga cgttctgaag gcagatttga ctgaatcaga tgtactgtcc aagtctcata 1320
tgtagcaatg gaaggctgat attggagaaa tataaagaaa tggctgtgaa ctcaaagtga 1380
ccctgaacag aaaagggata tggagttaaa ataatgtcac agaactgagg tttatatgat 1440
ataccatggg ctgcagaggg tcagagtgct ccaccatggg cctctcttgg gctgcaggga 1500
acttctgttc tacacctgga acacctcctg ccctcctccg cactgacctc agtgtcatca 1560
gggctgtttc tctcacattt tctcactcac ctctcccaac taccattgta cagcagttgt 1620
tcttacatat tgctcctcct gaggtacatc tagcatcgtt aagtcctcag acttggcaag 1680
gagaatgtag atttccacag tatatatgtt ttcacaaaag gaaggagaga aacaaaagaa 1740
aatggcactg actaaacttc agctagtggt ataggaaagt aattctgctt aacagagatt 1800
gcagtgatct ctatgtatgt cctgaagaat tatgttgtac ttttttcccc catttttaaa 1860
tcaaacagtg ctttacagag gtcagaatgg tttctttact gtttgtcaat tctattattt 1920
caatacagaa caatagcttc tataactgaa atatatttgc tattgtatat tatgattgtc 1980
cctcgaacca tgaacactcc tccagctgaa tttcacaatt cctctgtcat ctgccaggcc 2040
attaagttat tcatggaaga tctttgagga acactgcaag ttcatatcat aaacacattt 2100
gaaattgagt attgttttgc attgtatgga gctatgtttt gctgtatcct cagaataaaa 2160
gtttgttata aagcattcac acccataaaa agatagattt aaatattcca actataggaa 2220
agaaagtgtg tctgctcttc actctagtct cagttggctc cttcacatgc acgcttcttt 2280
atttctccta ttttgtcaag aaaataatag gtcaagtctt gttctcattt atgtcctgtc 2340
tagcgtggct cagatgcaca ttgtacatac aagaaggatc aaatgaaaca gacttctggt 2400
ctgttactac aaccatagta ataagcacac taactaataa ttgctaatta tgttttccat 2460
ctccaaggtt cccacatttt tctgttttct taaagatccc attatctggt tgtaactgaa 2520
gctcaatgga acatgagcaa tatttcccag tcttctctcc catccaacag tcctgatgga 2580
ttagcagaac aggcagaaaa cacattgtta cccagaatta aaaactaata tttgctctcc 2640
attcaatcca aaatggacct attgaaacta aaatctaacc caatcccatt aaatgatttc 2700
tatggtgtca aaggtcaaac ttctgaaggg aacctgtggg tgggtcacaa ttcagactat 2760
atattcccca gggctcagcc agtgtctgt 2789
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 12
agaaactgag agtgtcttat 20
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 13
tgacagctgt ggatccagaa acaaacatg 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 14
gccgctcgag cgaggaatat aaaaaaatt 29
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 15
tccgcgcaca tttccccgaa 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 16
acgactggct tgcagatgtc t 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 17
ccccaaatga agtcaagatg ct 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 18
ccggaatgct ctcatggaac accaa 25
<210> 19
<211> 372
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 19
Ala Val Asp Pro Glu Thr Asn Met Asn Val Ser Glu Ile Ile Ser Tyr
1 5 10 15
Trp Gly Phe Pro Ser Glu Glu Tyr Leu Val Glu Thr Glu Asp Gly Tyr
20 25 30
Ile Leu Cys Leu Asn Arg Ile Pro His Gly Arg Lys Asn His Ser Asp
35 40 45
Lys Gly Pro Lys Pro Val Val Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Asp
50 55 60
Ser Ser Asn Trp Val Thr Asn Leu Ala Asn Ser Ser Leu Gly Phe Ile
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ala Gly Phe Asp Val Trp Met Gly Asn Ser Arg Gly Asn
85 90 95
Thr Trp Ser Arg Lys His Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Asp Glu Phe
100 105 110
Trp Ala Phe Ser Tyr Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Ser
115 120 125
Ile Asn Phe Ile Leu Asn Lys Thr Gly Gln Glu Gln Val Tyr Tyr Val
130 135 140
Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Gln Ile
145 150 155 160
Pro Glu Leu Ala Lys Arg Ile Lys Met Phe Phe Ala Leu Gly Pro Val
165 170 175
Ala Ser Val Ala Phe Cys Thr Ser Pro Met Ala Lys Leu Gly Arg Leu
180 185 190
Pro Asp His Leu Ile Lys Asp Leu Phe Gly Asp Lys Glu Phe Leu Pro
195 200 205
Gln Ser Ala Phe Leu Lys Trp Leu Gly Thr His Val Cys Thr His Val
210 215 220
Ile Leu Lys Glu Leu Cys Gly Asn Leu Cys Phe Leu Leu Cys Gly Phe
225 230 235 240
Asn Glu Arg Asn Leu Asn Met Ser Arg Val Asp Val Tyr Thr Thr His
245 250 255
Ser Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Met Leu His Trp Ser Gln Ala
260 265 270
Val Lys Phe Gln Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Ser Ala Lys
275 280 285
Asn Tyr Phe His Tyr Asn Gln Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Asn Val Lys
290 295 300
Asp Met Leu Val Pro Thr Ala Val Trp Ser Gly Gly His Asp Trp Leu
305 310 315 320
Ala Asp Val Tyr Asp Val Asn Ile Leu Leu Thr Gln Ile Thr Asn Leu
325 330 335
Val Phe His Glu Ser Ile Pro Glu Trp Glu His Leu Asp Phe Ile Trp
340 345 350
Gly Leu Asp Ala Pro Trp Arg Leu Tyr Asn Lys Ile Ile Asn Leu Met
355 360 365
Arg Lys Tyr Gln
370
<210> 20
<211> 399
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 20
Met Lys Met Arg Phe Leu Gly Leu Val Val Cys Leu Val Leu Trp Thr
1 5 10 15
Leu His Ser Glu Gly Ser Gly Gly Lys Leu Thr Ala Val Asp Pro Glu
20 25 30
Thr Asn Met Asn Val Ser Glu Ile Ile Ser Tyr Trp Gly Phe Pro Ser
35 40 45
Glu Glu Tyr Leu Val Glu Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Cys Leu Asn
50 55 60
Arg Ile Pro His Gly Arg Lys Asn His Ser Asp Lys Gly Pro Lys Pro
65 70 75 80
Val Val Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Trp Val
85 90 95
Thr Asn Leu Ala Asn Ser Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly
100 105 110
Phe Asp Val Trp Met Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ser Arg Lys
115 120 125
His Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Asp Glu Phe Trp Ala Phe Ser Tyr
130 135 140
Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Ser Ile Asn Phe Ile Leu
145 150 155 160
Asn Lys Thr Gly Gln Glu Gln Val Tyr Tyr Val Gly His Ser Gln Gly
165 170 175
Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Gln Ile Pro Glu Leu Ala Lys
180 185 190
Arg Ile Lys Met Phe Phe Ala Leu Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Phe
195 200 205
Cys Thr Ser Pro Met Ala Lys Leu Gly Arg Leu Pro Asp His Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Leu Phe Gly Asp Lys Glu Phe Leu Pro Gln Ser Ala Phe Leu
225 230 235 240
Lys Trp Leu Gly Thr His Val Cys Thr His Val Ile Leu Lys Glu Leu
245 250 255
Cys Gly Asn Leu Cys Phe Leu Leu Cys Gly Phe Asn Glu Arg Asn Leu
260 265 270
Asn Met Ser Arg Val Asp Val Tyr Thr Thr His Ser Pro Ala Gly Thr
275 280 285
Ser Val Gln Asn Met Leu His Trp Ser Gln Ala Val Lys Phe Gln Lys
290 295 300
Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Ser Ala Lys Asn Tyr Phe His Tyr
305 310 315 320
Asn Gln Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Asn Val Lys Asp Met Leu Val Pro
325 330 335
Thr Ala Val Trp Ser Gly Gly His Asp Trp Leu Ala Asp Val Tyr Asp
340 345 350
Val Asn Ile Leu Leu Thr Gln Ile Thr Asn Leu Val Phe His Glu Ser
355 360 365
Ile Pro Glu Trp Glu His Leu Asp Phe Ile Trp Gly Leu Asp Ala Pro
370 375 380
Trp Arg Leu Tyr Asn Lys Ile Ile Asn Leu Met Arg Lys Tyr Gln
385 390 395
Claims (72)
- 하나 또는 그 이상의 N-글리칸 구조를 포함하는 단리된 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 (rhLAL)를 포함하는 제약학적 조성물에 있어서, rhLAL은 서열 번호:2의 Asn15, Asn80, Asn140, Asn252 및 Asn300에서 N-연결된 당화되는 것을 특징으로 하는, 리소솜성 산 리파아제 결핍 치료용 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 서열 번호:2의 Asn80, Asn140 또는 Asn252에서 인산화된 만노오스를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서, LAL은 Asn80에서 인산화된 만노오스를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 3에 있어서, Asn80과 연관된 N-글리칸 구조 중에서 적어도 30%는 인산화된 만노오스를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서, LAL은 Asn80에서 비스인산화된 만노오스를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서, LAL은 Asn140에서 인산화된 만노오스 (M6P)를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 6에 있어서, Asn140과 연관된 N-글리칸 구조 중에서 10% 내지 50%는 M6P을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서, LAL은 Asn252에서 인산화된 만노오스 (M6P)를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 8에 있어서, Asn252에서 N-글리칸 구조 중에서 적어도 50%는 M6P를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 Asn80 또는 Asn252에서 고만노오스 기를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 고만노오스-기는 6, 7, 8, 9 또는 10개의 만노오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, LAL은 Asn80에서 7, 8 또는 9개의 만노오스를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, LAL은 Asn252에서 7, 8 또는 9개의 만노오스를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 Asn15, Asn140 또는 Asn300에서 말단 갈락토오스를 포함하는 N-글리칸 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 14에 있어서, Asn15와 연관된 N-글리칸 구조 중에서 2% 내지 10%는 말단 갈락토오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 15에 있어서, Asn140과 연관된 N-글리칸 구조 중에서 5% 이하는 말단 갈락토오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 16에 있어서, LAL은 Asn300에서 말단 갈락토오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL의 Asn51은 당화되지 않은 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 자일로스가 없는 N-글리칸 구조를 포함하고, 그리고 N-글리칸 구조 중에서 15% 이하는 시알산을 내포하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 19에 있어서, LAL은 자일로스가 없는 N-글리칸 구조를 포함하고, 그리고 N-글리칸 구조 중에서 10% 이하는 시알산을 내포하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 20에 있어서, LAL은 자일로스가 없는 N-글리칸 구조를 포함하고, 그리고 N-글리칸 구조 중에서 5% 이하는 시알산을 내포하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 시알산 및 자일로스를 내포하지 않는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 푸코스를 내포하지 않는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 하기와 같은 N-연결된 당화 프로필을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:
a) Asn15에서, GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는 Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;
b) Asn80에서, Phos2Man7GlcNAc2;
c) Asn140에서, Phos1Man6GlcNAc2,
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2;
Man3GlcNAc2;
GlcNAc2Man3GlcNAc2;
GlcNAc3Man3GlcNAc2;
GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;
d) Asn252에서, Man7GlcNAc2,
Man8GlcNAc2,
Man9GlcNAc2,
Phos1Man8GlcNAc2, 또는
Phos1Man9GlcNAc2; 그리고
e) Asn300에서, GlcNAc2Man3GlcNAc2,
GlcNAc3Man3GlcNAc2,
GlcNAc4Man3GlcNAc2,
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2,
GlcNAc5Man3GlcNAc2,
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2,
GlcNAc6Man3GlcNAc2, 또는
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2
여기서 Man = 만노오스,
GlcNAc = N-아세틸 글루코사민
Phos = 인산염
Gal = 갈락토오스. - 청구항 1에 있어서, LAL은 생식계열 유전자도입 조류에서 생산되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 25에 있어서, LAL은 생식계열 유전자도입 조류의 수란관 세포로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 조류는 닭인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LAL은 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 19로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 인간 LAL을 포함하는 혼합물인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 따른 당화된 인간 리소솜성 산 리파아제 (LAL)를 생산하는 유전자도입 조류.
- 청구항 31에 따른 유전자도입 조류에 의해 산란된 알.
- 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 공동으로 청구항 1에 따른 조성물을 포함하는 제약학적 제제.
- 청구항 33에 있어서, 제제는 구연산나트륨 이수화물 (trisodium citrate dihydrate), 구연산 및 인간 혈청 알부민으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 제제.
- 청구항 34에 있어서, 제제는 5.6 내지 6.2의 pH에 유지된 수성 용액에 담겨 제공되는 것을 특징으로 하는 제약학적 제제.
- 단리된 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질(rhLAL)에 있어서, 서열 번호: 1의 Asn36, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321에 대응되는 아스파라긴(Asn) 잔기에 연결된 N-글리칸을 가지고, N-글리칸은 푸코스는 포함하지 않으며, rhLAL이 O-글리칸을 포함하지 않고, 서열 번호: 2, 3, 4 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 2인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 3인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 4인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 19인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 추가로 N-글리칸은 자일로스를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 추가로 N-글리칸은 시알산을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 36에 있어서, 조류 세포에서 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 43에 있어서, 상기 조류 세포는 닭의 수란관 세포인 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 단리된 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질(rhLAL)에 있어서, 서열 번호: 1의 Asn36, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321에 대응되는 아스파라긴(Asn) 잔기에 연결된 N-글리칸을 가지고, N-글리칸은 푸코스는 포함하지 않으며, rhLAL이 O-글리칸을 포함하지 않고, 서열 번호: 2, 3, 4 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 필수적으로 구성되며, 서열 번호: 1의 Asn36, Asn101, Asn161, Asn273 및 Asn321에 대응되는 아스파라긴(Asn) 잔기에 연결된 N-글리칸이 하기와 같은, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질:
a) Asn36에서, GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는 Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;
b) Asn101에서, Phos2Man7GlcNAc2;
c) Asn161에서, Phos1Man6GlcNAc2,
GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2;
Man3GlcNAc2;
GlcNAc2Man3GlcNAc2;
GlcNAc3Man3GlcNAc2;
GlcNAc4Man3GlcNAc2, 또는
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;
d) Asn273에서, Man7GlcNAc2,
Man8GlcNAc2,
Man9GlcNAc2,
Phos1Man8GlcNAc2, 또는
Phos1Man9GlcNAc2; 그리고
e) Asn321에서, GlcNAc2Man3GlcNAc2,
GlcNAc3Man3GlcNAc2,
GlcNAc4Man3GlcNAc2,
Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2,
GlcNAc5Man3GlcNAc2,
Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2,
GlcNAc6Man3GlcNAc2, 또는
Gal1GlcNAc6Man3GlcNAc2
여기서 Man = 만노오스,
GlcNAc = N-아세틸 글루코사민
Phos = 인산염
Gal = 갈락토오스. - 청구항 45에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 2인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 45에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 3인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 45에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 4인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 45에 있어서, 상기 rhLAL의 아미노산 서열이 서열 번호: 19인 것인, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 45에 있어서, 추가로 N-글리칸은 자일로스를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 45에 있어서, 추가로 N-글리칸은 시알산을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 45에 있어서, 조류 세포에서 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 청구항 52에 있어서, 상기 조류 세포는 닭의 수란관 세포인 것을 특징으로 하는, 인간 재조합 리소솜성 산 리파아제 당 단백질.
- 하기 수성 용액으로 필수적으로 구성되는 리소솜성 산 리파아제 결핍 치료용 제약학적 조성물:
a) 청구항 36 내지 53 중 어느 한 항에 따른 인간 리소솜성 산 리파아제 2 mg/mL;
b) 구연산나트륨 이수화물 13.7 mg/mL;
c) 구연산 일수화물 1.57 mg/mL;
d) 인간 혈청 알부민의 10 mg/mL; 상기 제약학적 조성물의 pH가 5.9 ± 0.2임. - 삭제
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