CN110522907B - 一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及其制备和应用 - Google Patents
一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及其制备和应用。该三元纳米复合物疫苗由海藻酸钠、穿膜肽和质粒组成，其中，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为1‑5:1，穿膜肽与质粒的质量比为5‑400:1；其可用于制备质粒口服药物，为口服递送质粒提供了新的思路。其制备方法是通过静电吸附介导层层组装得到海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，制备条件温和、制备过程容易控制、制备方法简单，所得复合物的粒径均一稳定，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药复合物技术领域，具体涉及一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及其制备和应用。
背景技术
肿瘤是全球人类第二大死因。近几年来，基于肿瘤疫苗的多种免疫手段已经在研究当中，如抗原特异性肿瘤疫苗、树突状细胞疫苗和全细胞疫苗等，都是比较有前景的治疗手段(Experimental dermatology.2001；10:143-154.)。尽管基于细胞的疫苗是目前临床实验中肿瘤疫苗的主要形式，但抗原特异性疫苗能够产生针对特定肿瘤抗原的免疫应答，从而提供一个更精准的抗肿瘤免疫反应，目前已有少数肿瘤相关抗原表位被识别并进入临床试验阶段，如保守表达黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100、酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1、TRP-2)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)(Nature medicine.1998；4:525-531.)。
在抗原特异性肿瘤疫苗中，编码肿瘤抗原的DNA疫苗由于有着众多优点而受到关注，如在质粒上能够编码多个抗原基因从而表达多个抗原；与其他核酸载体相比，质粒通常不含病毒或细菌抗原；具有结合活减毒疫苗和重组病毒疫苗的优势，没有常见的与活减毒疫苗安全方面和制备相关的问题。目前已有二种DNA疫苗(OSE-2101和VGX-3100)进入III期临床试验(U.S.Patent Application 15/578,721[P].2018-6-21；Gynecologic Oncology；2018,149:225-226.)。但是目前非细菌载体的黑色素瘤DNA疫苗均是通过非口服途径如静脉注射和皮下注射，如脂质体、免疫佐剂复合物，需要外界超声和免疫佐剂的辅助(Molecular pharmaceutics.2011,8:543-554.；Biomaterials.2016,86:83-91.)，导致患者依从性、便利性差；并且注射剂的处方纯化及医护人员的培训等环节增加了成本，不利于DNA疫苗的发展。
口服疫苗是一种理想的给药方式，患者依从性好，而且肠道面积大，固有层中有很多抗原呈递细胞和T淋巴细胞。一旦抗原进入到固有层，被抗原呈递细胞捕获，便能呈递激发后续免疫应答。但是，口服DNA疫苗将会遇到很多生理屏障。首先是质粒在胃酸中的稳定性。然后是肠道粘液层，粘液层厚度从10μm到170μm不等，穿过粘液层需要粒子有着亲水、非阳离子表面。随后是肠上皮细胞层，一般来说表面带正电的粒子能够增加跨膜转运效率。因此，穿透粘液层和肠上皮细胞层需要不同的粒子表面特性，这为口服疫苗的研究带来了难度。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及制备和应用。
如何同时解决粒子的粘液层和肠上皮细胞层跨膜转运效率，是提高DNA疫苗口服效率的关键。细胞穿膜肽(CPP，即穿膜肽)是一类能够携带大分子进入细胞的短肽，为大分子的跨膜转运提供了新的手段。细胞穿膜肽的穿膜作用不依赖于经典胞吞作用，具有亲和力强、穿膜速度高、能较快被降解的特点。本发明发现，由于细胞穿膜肽结构中有较多精氨酸残基，在肠道生理条件下带正电，能够和带负电的质粒相结合形成复合物(即穿膜肽/质粒二元复合物)。但是由于穿膜肽/质粒二元复合物的表面正电性，很难穿过粘液层。海藻酸钠是一种天然多糖，来源于褐藻，由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic，G)按(1→4)键连接而成。本发明发现，海藻酸钠由于结构中含有大量羧基，在生理条件下带负电；在胃中的酸性条件下，羧基电离度降低，亲水性下降，分子链收缩，能够以疏水键作用力紧密结合，采用海藻酸钠层能够保护被包载的穿膜肽/质粒二元复合物；而在肠道的碱性环境下，羧基电离度增加，亲水性增加，分子链舒展，由于海藻酸钠的亲水性及非阳离子的特性，能够在粘液层穿透中发挥重要作用，通过海藻酸钠的包裹使海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物能够穿过粘液层，随后海藻酸钠缓慢溶蚀，及时释放出被包载的穿膜肽/质粒二元复合物，暴露出表面阳离子的穿膜肽/质粒二元复合物，并通过穿膜肽的特殊穿膜机制促进质粒的跨膜转运，最终到达肠道固有层，激活树突状细胞，产生抗原特异性免疫。因此，本发明引入海藻酸钠能够保护穿膜肽/质粒二元复合物在胃中的稳定性；海藻酸钠在该三元复合物中同时发挥胃中保护、粘液层穿透的作用，为口服肿瘤疫苗发挥药效奠定基础。本发明的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗能够同时增强粘液渗透和肠上皮转运效率，最终引发肿瘤抗原特异性免疫应答，可作为一种口服疫苗。
本发明的具体技术方案如下：
一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，由海藻酸钠、穿膜肽和质粒组成，其中，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为1-5:1，穿膜肽与质粒的质量比为5-400:1。所述海藻酸钠与穿膜肽的质量比范围能够得到粒径合适的复合物，比例太大或者太小均会析出大量沉淀。
所述海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗由海藻酸钠层以及穿膜肽/质粒二元纳米复合物(即穿膜肽与质粒的二元纳米复合物)组成，所述海藻酸钠层包裹所述穿膜肽/质粒二元纳米复合物，所述穿膜肽/质粒二元纳米复合物由穿膜肽和质粒复合而成。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
所述海藻酸钠与穿膜肽的质量比优选为1:1。
所述穿膜肽与质粒的质量比优选为50:1。
所述海藻酸钠的粘度为1mPa·s-1000mPa·s(1％溶胶(sol)，质量百分比，20℃)，优选为200mPa·s。所述粘度范围内，海藻酸钠水溶液的流动性较好，易于分散，更有利于与穿膜肽/质粒二元纳米复合物形成三元纳米复合物。
所述穿膜肽选用氨基酸序列RKKRRQRR(SEQ ID NO:1)的穿膜肽Tat、氨基酸序列RRRRRRRR(SEQ ID NO:2)的多聚精氨酸R8、氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKC(SEQ ID NO:3)的穿膜素、氨基酸序列VSRRRRRRGGRRRRC(SEQ ID NO:4)的鱼精蛋白中的一种或两种以上。
所述质粒可选用本领域现有的抗原质粒，针对黑色素瘤可选用黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(序列如SEQ ID NO:5所示)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)抗原质粒(序列如SEQ ID NO:6所示)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)抗原质粒(序列如SEQ ID NO:7所示)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)质粒(序列如SEQ ID NO:8所示)等中的一种或两种以上；例如可选用编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒、编码人源酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)抗原质粒、编码人源酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)抗原质粒、编码人源T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)质粒等中的一种或两种以上。由于黑色素瘤保守表达gp100、TRP-1、TRP-2、MART1蛋白，并且内源性抗原所诱导的免疫应答比较微弱，通过引入外源性抗原可以打破内源性抗原造成的免疫耐受，使基因疫苗诱导更强的免疫应答。如果针对其他肿瘤，可选用编码其他肿瘤抗原的质粒。
本发明所用海藻酸钠可采用市售产品或采用现有制备方法制备，本发明所用到的穿膜肽可采用市售产品或通过现有合成方法人工合成，本发明所用质粒可采用市售产品或通过现有方法构建得到。
所述海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)在搅拌状态下，将质粒水溶液滴入穿膜肽水溶液中，混合均匀，得到穿膜肽/质粒二元纳米复合物；
(2)在搅拌状态下，将海藻酸钠水溶液滴入到步骤(1)中的穿膜肽/质粒二元纳米复合物中，混合均匀，得到存在于水环境中的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗；其中，海藻酸钠水溶液与穿膜肽水溶液的体积相等。
本发明制备方法中，将原料按照特定的组装顺序通过静电吸附介导层层组装得到海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，采用了简便的顺序混合方法来构建多功能层层组组装海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，用海藻酸钠包裹穿膜肽/质粒二元纳米复合物，能够保护穿膜肽/质粒二元复合物在胃中的稳定性，通过海藻酸钠的包裹促进三元纳米复合物疫苗穿透粘液层，并逐渐释放出荷正电的穿膜肽/质粒二元纳米复合物疫苗，同时增强粘液渗透和肠上皮转运效率，通过穿膜肽的特殊穿膜机制促进质粒的跨膜转运，最终到达肠道固有层，激活树突状细胞，引发肿瘤抗原特异性免疫应答。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.25mg/mL-2.5mg/mL，进一步优选为0.5mg/mL。
所述穿膜肽水溶液的浓度为0.5mg/mL-2.5mg/mL，进一步优选为0.5mg/mL。
所述质粒水溶液的浓度为0.5mg/mL。
所述海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗可用于制备口服质粒药物例如口服抗肿瘤药物。
本发明具有如下优点：
(1)本发明海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗处方组成简单、复合物的粒径均一稳定，利于工业化生产。
(2)本发明采用天然高分子多糖海藻酸钠作为穿膜肽/质粒二元纳米复合物的包衣，由于海藻酸钠具有酸性条件下不溶的特性，有效保护穿膜肽/质粒二元纳米复合物在胃中的稳定性；同时利用海藻酸钠的亲水性和非阳离子性，帮助穿膜肽/质粒二元纳米复合物穿透肠道粘液层，并逐渐脱落，释放出穿膜肽/质粒二元纳米复合物。
(3)本发明利用细胞穿透肽(即穿膜肽)介导跨转运提高质粒的肠上皮细胞穿透效率，进入肠道固有层，被抗原呈递细胞捕获后表达出肿瘤特异性抗原，产生肿瘤抗原特异性免疫反应，激活的细胞毒性T淋巴细胞有效抑制肿瘤的生长。
(4)本发明的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗为口服递送质粒提供了新的思路。
(5)本发明提供的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及制备方法不仅仅局限于口服肿瘤免疫治疗的应用，而是可根据质粒的特性，实现其口服递送，用于多种疾病的治疗。
(6)本发明通过静电吸附层层组装制备得到海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，处方组成简单、制备条件温和、制备过程容易控制、制备方法简单，所得复合物的粒径均一稳定，有利于工业化生产。
附图说明
图1为不同质量比的穿膜肽/质粒二元纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为体外粘液层穿透实验结果图，采用SPSS17.0软件进行方差分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图3为预防型肿瘤疫苗的B16F10模型肿瘤生长曲线图，采用SPSS17.0软件进行方差分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明作进一步说明。此处描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实验所用原料均为市售产品。
穿膜肽/质粒二元纳米复合物
对比例一
称取1mg穿膜肽Tat(氨基酸序列RKKRRQRR)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到0.5mg/mL的穿膜肽Tat水溶液。磁力搅拌下，将5μL0.5mg/mL编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(序列如SEQ ID NO:5所示)水溶液缓慢滴入穿膜肽Tat水溶液中，常温磁力搅拌五分钟，得到存在于水环境中的穿膜肽/质粒二元纳米复合物。穿膜肽与质粒的质量比为400:1，测得该穿膜肽/质粒二元纳米复合物的平均粒径(强度积平均粒径，即强均)为170.3nm，电位为+19.6mV。
海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物
实施例一
称取1mg穿膜肽Tat(氨基酸序列RKKRRQRR)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到0.5mg/mL的穿膜肽Tat水溶液。磁力搅拌下，将40μL0.5mg/mL编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(序列如SEQ ID NO:5所示)水溶液缓慢滴入穿膜肽Tat水溶液中，常温磁力搅拌五分钟，得到穿膜肽/质粒二元纳米复合物，备用；其中，穿膜肽与质粒的质量比为50:1。将5mg海藻酸钠(粘度200mPa·s，1％溶胶(sol)，质量百分比，20℃)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到2.5mg/mL的海藻酸钠水溶液。磁力搅拌下，将海藻酸钠水溶液缓慢滴加到上述穿膜肽/质粒二元纳米复合物中，常温磁力搅拌五分钟，得到存在于水环境中的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为5:1，穿膜肽与质粒的质量比为50:1，测得平均粒径(强均)为2712.7nm，电位为-48.3mV。
实施例二
称取1mg穿膜肽Tat(氨基酸序列RKKRRQRR)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到0.5mg/mL的穿膜肽Tat水溶液。磁力搅拌下，将40μL0.5mg/mL编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(序列如SEQ ID NO:5所示)水溶液缓慢滴入穿膜肽Tat水溶液中，常温磁力搅拌五分钟，得到穿膜肽/质粒二元纳米复合物，备用；其中，穿膜肽与质粒的质量比为50:1。将2mg海藻酸钠(粘度200mPa·s)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到1mg/mL的海藻酸钠水溶液。磁力搅拌下，将海藻酸钠水溶液缓慢滴加到上述穿膜肽/质粒二元纳米复合物中，常温磁力搅拌五分钟，得到存在于水环境中的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为2:1，穿膜肽与质粒的质量比为50:1，测得平均粒径(强均)为881.2nm，电位为-43.7mV。
实施例三
称取1mg穿膜肽Tat(氨基酸序列RKKRRQRR)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到0.5mg/mL的穿膜肽Tat水溶液。磁力搅拌下，将40μL0.5mg/mL编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(序列如SEQ ID NO:5所示)水溶液缓慢滴入穿膜肽Tat水溶液中，常温磁力搅拌五分钟，得到穿膜肽/质粒二元纳米复合物，备用；其中，穿膜肽与质粒的质量比为50:1。将1mg海藻酸钠(粘度200mPa·s)溶于2mL纯化水中，溶解均匀后制备得到0.5mg/mL的海藻酸钠水溶液。磁力搅拌下，将海藻酸钠水溶液缓慢滴加到上述穿膜肽/质粒二元纳米复合物中，常温磁力搅拌五分钟，得到存在于水环境中的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为1:1，穿膜肽与质粒的质量比为50:1，测得平均粒径(强均)为190.5nm，电位为-30.1mV。
实施例四
称取1mg穿膜肽Tat(氨基酸序列RKKRRQRR)溶于0.4mL纯化水中，溶解均匀后制备得到2.5mg/mL的穿膜肽Tat水溶液。磁力搅拌下，将40μL 0.5mg/mL编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(序列如SEQ ID NO:5所示)水溶液缓慢滴入穿膜肽Tat水溶液中，常温磁力搅拌五分钟，得到穿膜肽/质粒二元纳米复合物，备用；其中，穿膜肽与质粒的质量比为50:1。将1mg海藻酸钠(粘度200mPa·s)溶于0.4mL纯化水中，溶解均匀后制备得到2.5mg/mL的海藻酸钠水溶液。磁力搅拌下，将海藻酸钠水溶液缓慢滴加到上述穿膜肽/质粒二元纳米复合物中，常温磁力搅拌五分钟，得到存在于水环境中的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为1:1，穿膜肽与质粒的质量比为50:1，测得平均粒径(强均)为2143.5nm，电位为-24.5mV。
按文献方法建立了体外粘液穿透模型(ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,25444-25453)，为了便于检测复合物的透过量，通过商业化的Label 
TrackerTM CyTM3试剂盒对质粒进行了Cy3荧光标记，采用Cy3标记的质粒制备纳米复合物，随后对游离编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒、对比例一、实施例一、实施例二、实施例三、实施例四进行了粘液层穿透考察，如图2所示。游离编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒无法穿透粘液层，基本没有荧光累积量；对比例一由于是穿膜肽/质粒二元纳米复合物，表面带正电，与粘液层中粘蛋白相互作用导致复合物较难穿透粘液层，正电性高导致相互作用大，导致较低的荧光累积量。实施例一、实施例二、实施例三、实施例四是海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，由于海藻酸钠亲水层的屏蔽作用，促进实施例一、实施例二、实施例三、实施例四中海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物透过粘液层中的粘蛋白构成的交联网格结构，有效穿透粘液层；其中，实施例三的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物有效穿透粘液层效果最优。
在体外通过用模拟胃液和模拟肠液孵育海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物表征了胃中稳定性和肠道溶蚀性。为了便于观察复合物形态，通过商业化的Label
TrackerTM CyTM3试剂盒对编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒进行了Cy3荧光标记，通过文献方法合成了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的海藻酸钠(Eur J PharmBiopharm 49(2000)1–9)。使用Cy3标记的gp100和FITC标记的海藻酸钠制备二元复合物和三元复合物。当实施例三中海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物在模拟胃液中孵育2小时后，粒子形态没有发生变化，呈规整球形，粒径在200nm。实施例一、实施例二和实施例四中海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物在模拟胃液中孵育2小时后，粒子形态均没有发生变化，呈规整球形。当实施例一、实施例二、实施例三和实施例四中海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物在模拟肠液中孵育2小时后，由于碱性条件下海藻酸钠层电离度增加，亲水性增加，逐渐开始溶蚀，形态发生了变化，但是此时仍未释放出被包裹的穿膜肽/质粒二元纳米复合物；继续孵育，在4小时的时间点，可以看到弥散的绿色荧光(FITC标记的海藻酸钠)和红色荧光(Cy3标记的gp100)，可知此时的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物已经解体，海藻酸钠层解离，释放出被包载的穿膜肽/质粒二元纳米复合物。
由上述实验可知，天然高分子多糖海藻酸钠作为穿膜肽/质粒二元纳米复合物的包衣，由于海藻酸钠具有酸性条件下不溶的特性，有效保护穿膜肽/质粒二元纳米复合物在胃中的稳定性；同时利用海藻酸钠的亲水性和非阳离子性，帮助穿膜肽/质粒二元纳米复合物穿透肠道粘液层，海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物在2小时可完成粘液层的穿透，随后海藻酸钠层逐渐脱离，释放出穿膜肽/质粒二元纳米复合物；最后在穿膜肽的协助下，使质粒透过肠上皮细胞层，到达肠道固有层，为后续免疫应答打下基础。
建立了预防型口服肿瘤疫苗模型，考察了纳米复合物的体内抗肿瘤效率。具体步骤如下：C57BL/6小鼠随机分成八组，每组五只。在第-21、-14、-7天时，分别对第一组里的每一只小鼠口服给予生理盐水、对第二组里的每一只小鼠口服给予编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒(50μg)、对第三组里的每一只小鼠口服给予对比例一中的穿膜肽/质粒二元纳米复合物(含有50μg编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒)、对第四组里的每一只小鼠口服给予本发明中实施例一的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物(含有50μg编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒)、对第五组里的每一只小鼠口服给予本发明中实施例二的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物(含有50μg编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒)、对第六组里的每一只小鼠口服给予本发明中实施例三的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物(含有50μg编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒)、对第七组里的每一只小鼠口服给予本发明中实施例四的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物(含有50μg编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒)。在第0天时，建立荷黑色素瘤B16F10细胞模型。第六天开始测量肿瘤体积大小，每两天测量肿瘤体积大小。
由图3可知，与生理盐水组(第一组)相比，口服编码人源黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒组(第二组)肿瘤没有被抑制。对比例一为穿膜肽/质粒二元纳米复合物，穿膜肽与质粒的质量为400:1，肿瘤抑制生长率为6.7％。实施例一、实施例二、实施例三、实施例四为海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物，海藻酸钠与穿膜肽的质量比分别为5:1、2:1、1:1、1:1，穿膜肽与质粒的质量为50:1，肿瘤抑制生长率分别为4.5％、8.2％、46.8％、10.1％，与对照组相比，实施例一、实施例二、实施例三、实施例四均有一定的抑瘤作用，药效实验表明，本发明提供的口服海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物可以诱导体内免疫，有效抑制肿瘤生长。而其中，实施例三与对比例一、实施例一、实施例二、实施例四分别进行比较均为p<0.01，表明实施例三与对比例一、实施例一、实施例二、实施例四比较均有显著性差异，实施例三的肿瘤抑制效果最显著。
本发明制备方法中参数的变化并不影响三元纳米复合物的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现三元纳米复合物的制备。在此不再赘述。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及其制备和应用
<130> 20190813
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus type 1
<400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Cys
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 8890
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800
taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860
aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga 1920
tactagtatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1980
gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 2040
tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 2100
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 2160
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 2220
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag attctagagc 2280
tagcgaattc ggtgatcagg gtatacggct cgaggggata tcgggtttaa acggggcgcg 2340
ccgggcgatc gcggttcgaa ggttaattaa ggggatccgc ccctctccct cccccccccc 2400
taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgtgatt 2460
ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt 2520
gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt 2580
cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct 2640
ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt 2700
ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt 2760
ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa 2820
ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta 2880
gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa 2940
aacacgatga taagcttgcc acaaccagat ctcgccacca tggatctggt gctaaaaaga 3000
tgccttcttc atttggctgt gataggtgct ttgctggctg tgggggctac aaaagtaccc 3060
agaaaccagg actggcttgg tgtctcaagg caactcagaa ccaaagcctg gaacaggcag 3120
ctgtatccag agtggacaga agcccagaga cttgactgct ggagaggtgg tcaagtgtcc 3180
ctcaaggtca gtaatgatgg gcctacactg attggtgcaa atgcctcctt ctctattgcc 3240
ttgaacttcc ctggaagcca aaaggtattg ccagatgggc aggttatctg ggtcaacaat 3300
accatcatca atgggagcca ggtgtgggga ggacagccag tgtatcccca ggaaactgac 3360
gatgcctgca tcttccctga tggtggacct tgcccatctg gctcttggtc tcagaagaga 3420
agctttgttt atgtctggaa gacctggggc caatactggc aagttctagg gggcccagtg 3480
tctgggctga gcattgggac aggcagggca atgctgggca cacacaccat ggaagtgact 3540
gtctaccatc gccggggatc ccggagctat gtgcctcttg ctcattccag ctcagccttc 3600
accattactg accaggtgcc tttctccgtg agcgtgtccc agttgcgggc cttggatgga 3660
gggaacaagc acttcctgag aaatcagcct ctgacctttg ccctccagct ccatgacccc 3720
agtggctatc tggctgaagc tgacctctcc tacacctggg actttggaga cagtagtgga 3780
accctgatct ctcgggcact tgtggtcact catacttacc tggagcctgg cccagtcact 3840
gcccaggtgg tcctgcaggc tgccattcct ctcacctcct gtggctcctc cccagttcca 3900
ggcaccacag atgggcacag gccaactgca gaggccccta acaccacagc tggccaagtg 3960
cctactacag aagttgtggg tactacacct ggtcaggcgc caactgcaga gccctctgga 4020
accacatctg tgcaggtgcc aaccactgaa gtcataagca ctgcacctgt gcagatgcca 4080
actgcagaga gcacaggtat gacacctgag aaggtgccag tttcagaggt catgggtacc 4140
acactggcag agatgtcaac tccagaggct acaggtatga cacctgcaga ggtatcaatt 4200
gtggtgcttt ctggaaccac agctgcacag gtaacaacta cagagtgggt ggagaccaca 4260
gctagagagc tacctatccc tgagcctgaa ggtccagatg ccagctcaat catgtctacg 4320
gaaagtatta caggttccct gggccccctg ctggatggta cagccacctt aaggctggtg 4380
aagagacaag tccccctgga ttgtgttctg tatcgatatg gttccttttc cgtcaccctg 4440
gacattgtcc agggtattga aagtgccgag atcctgcagg ctgtgccgtc cggtgagggg 4500
gatgcatttg agctgactgt gtcctgccaa ggcgggctgc ccaaggaagc ctgcatggag 4560
atctcatcgc cagggtgcca gccccctgcc cagcggctgt gccagcctgt gctacccagc 4620
ccagcctgcc agctggttct gcaccagata ctgaagggtg gctcggggac atactgcctc 4680
aatgtgtctc tggctgatac caacagcctg gcagtggtca gcacccagct tatcatgcct 4740
ggtcaagaag caggccttgg gcaggttccg ctgatcgtgg gcatcttgct ggtgttgatg 4800
gctgtggtcc ttgcatctct gatatatagg cgcagactta tgaagcaaga cttctccgta 4860
ccccagttgc cacatagcag cagtcactgg ctgcgtctac cccgcatctt ctgctcttgt 4920
cccattggtg agaacagccc cctcctcagt gggcagcagg tctgaagcgg ccctagaggt 4980
cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 5040
tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 5100
ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 5160
gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 5220
cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 5280
ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 5340
gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct 5400
gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 5460
cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 5520
tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctggtac 5580
ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg 5640
ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaaaataaga tctgcttttt gcttgtactg 5700
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 5760
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 5820
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 5880
gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag 5940
agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 6000
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 6060
tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc tatcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 6120
ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 6180
ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag acttttgcag 6240
agacggccca aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 6300
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 6360
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 6420
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 6480
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 6540
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 6600
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 6660
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 6720
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 6780
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 6840
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 6900
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 6960
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 7020
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 7080
gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 7140
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 7200
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 7260
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 7320
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 7380
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 7440
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 7500
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 7560
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 7620
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 7680
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 7740
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 7800
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 7860
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 7920
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 7980
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 8040
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 8100
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 8160
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 8220
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 8280
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 8340
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 8400
ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 8460
taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 8520
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 8580
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 8640
atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 8700
aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 8760
gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 8820
gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 8880
tgccaagctg 8890
<210> 6
<211> 4079
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaacgcggcc gccagctgaa gcttaaggcg cgccagatct gtttagcttg cctcgtcccc 60
gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc ctccttgaca gtcttgacgt 120
gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt tagcccatac atccccatgt 180
ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg cgaagcaaaa attacggctc 240
ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca gacgcgttga attgtcccca 300
cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg ccactgaggt tcttctttca 360
tatacttcct tttaaaatct tgctaggata cagttctcac atcacatccg aacataaaca 420
accatgggta cccggggatc ctctagacaa tcaatcaaaa agccaaatga tttagcatta 480
tctttacatc ttgttatttt acagatttta tgtttagatc ttttatgctt gcttttcaaa 540
aggcctgcag gcaagtgcac aaacaatact taaataaata ctactcagta ataacctatt 600
tcttagcatt tttgacgaaa tttgctattt tgttagagtc ttttacacca tttgtctcca 660
cacctccgct tacatcaaca ccaataacgc catttaatct aagcgcatca ccaacatttt 720
ctggcgtcag tccaccagct aacataaaat gtaagctttc ggggctctct tgccttccaa 780
cccagtcaga aatcgagttc caatccaaaa gttcacctgt cccacctgct tctgaatcaa 840
acaagggaat aaacgaatga ggtttctgtg aagctgcact gagtagtatg ttgcagtctt 900
ttggaaatac gagtctttta ataactggca aaccgaggaa ctcttggtat tcttgccacg 960
actcatctcc atgcagttgg acgatatcaa tgccgtaatc attgaccaga gccaaaacat 1020
cctccttagg ttgattacga aacacgccaa ccaagtattt cggagtgcct gaactatttt 1080
tatatgcttt tacaagactt gaaattttcc ttgcaataac cgggtcaatt gttctctttc 1140
tattgggcac acatataata cccagcaagt cagcatcgga atctagagca cattctgcgg 1200
cctctgtgct ctgcaagccg caaactttca ccaatggacc agaactacct gtgaaattaa 1260
taacagacat actccaagct gcctttgtgt gcttaatcac gtatactcac gtgctcaata 1320
gtcaccaatg ccctccctct tggccctctc cttttctttt ttcgaccgaa ttctagagtc 1380
gacctgcagg catgccctgc ccctaatcag tactgacaat aaaaagattc ttgttttcaa 1440
gaacttgtca tttgtatagt ttttttatat tgtagttgtt ctattttaat caaatgttag 1500
cgtgatttat attttttttc gcctcgacat catctgccca gatgcgaagt taagtgcgca 1560
gaaagtaata tcatgcgtca atcgtatgtg aatgctggtc gctatactgc tgtcgattcg 1620
atactaacgc cgccatccag tgtcgaaaac gagctcgaat tcatcgatga tatcagatcc 1680
actagtggcc tatgcggccg cggatctgcc ggtctcccta tagtgagtcg tattaatttc 1740
gataagccag gttaacctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 1800
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 1860
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 1920
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 1980
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 2040
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 2100
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 2160
cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 2220
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 2280
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 2340
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gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 8700
atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 8760
tcacatcttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 8820
gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 8880
agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 8940
cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 9000
gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 9060
gtgtggaatt gtgagc 9076
Claims (8)
1.一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，其特征在于，由海藻酸钠、穿膜肽和质粒组成，其中，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为1-5:1，穿膜肽与质粒的质量比为5-400:1；
所述海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗由海藻酸钠层以及穿膜肽/质粒二元纳米复合物组成，所述海藻酸钠层包裹所述穿膜肽/质粒二元纳米复合物，所述穿膜肽/质粒二元纳米复合物由穿膜肽和质粒复合而成；
所述穿膜肽为氨基酸序列RKKRRQRR的穿膜肽Tat、氨基酸序列RRRRRRRR的多聚精氨酸R8、氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKC的穿膜素、氨基酸序列VSRRRRRRGGRRRRC的鱼精蛋白中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，所述海藻酸钠的粘度为1mPa·s-1000mPa·s。
3.根据权利要求1所述的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，其特征在于，所述质粒选用黑色素瘤前黑素小体蛋白gp100抗原质粒、酪氨酸酶相关蛋白1抗原质粒、酪氨酸酶相关蛋白2抗原质粒、T细胞识别的黑色素瘤抗原质粒中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗，其特征在于，海藻酸钠与穿膜肽的质量比为1:1，穿膜肽与质粒的质量比为50:1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在搅拌状态下，将质粒水溶液滴入穿膜肽水溶液中，混合均匀，得到穿膜肽/质粒二元纳米复合物；
(2)在搅拌状态下，将海藻酸钠水溶液滴入到步骤(1)中的穿膜肽/质粒二元纳米复合物中，混合均匀，得到存在于水环境中的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗；其中，海藻酸钠水溶液与穿膜肽水溶液的体积相等。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.25mg/mL-2.5mg/mL；所述穿膜肽水溶液的浓度为0.5mg/mL-2.5mg/mL；所述质粒水溶液的浓度为0.5mg/mL。
7.根据权利要求1-4任一项所述的海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗在制备口服药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的口服药物为口服抗肿瘤药物。
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